DK165792B - Fremgangsmaade til modificering af polymeroverflader, modificeret polymer, fremgangsmaade til immobilisering af et molekyle paa en fast overflade og fremgangsmaade til bestemmelse af tilstedevaerelse af et molekyle i en proeve - Google Patents

Description

i

DK 165792B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til modificering af en polymeroverflade, en modificeret polymer, en fremgangsmåde til immobilisering af et molekyle på en fast overflade, fortrinsvis af polystyren, polyvi-5 nylchlorid eller polyethylenglycolterephthalat, og en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af et molekyle i en prøve.

Baggrund for opfindelsen 10

Immobilisering af biomolekyler på faste faser er vidt benyttede i adskillige teknikker såsom f.eks. chromatogra-fi, i biosensorer, i bioreaktorer f.eks. fastfase-enzym-oparbejdning, kemisk syntese af peptider, oligonucleoti-15 der eller andre forbindelser og i såkaldte heterogene im-munassay.

I de heterogene immunassay kan antigener eller antistof være covalent koblet til bærere, såsom cellulose, agarose 20 eller polyacrylamid. Når forbindelserne imidlertid skal bindes på en fast fase, sædvanligvis polystyren-, polypropylen- eller polyvinylchlorid-reagensglas eller mikro-titerplader, har fysisk adsorption af forbindelserne været den normale koblingsfremgangsmåde i heterogen immun-25 assay (Engvall og Pearlmann, J. Immunol., 1972, s. 109-129).

Passiv fysisk adsorption er imidlertid ikke irreversibel (Lehtonen et al., J. Immunol. Methods, 1980, s. 34-61), 30 hvilket kan påvirke reproducerbarheden af immunassayet, især når den antigen/antistof-dækkede faste fase opbevares på tør form. Ligeledes, fastfase-adsorberet antigen vil ikke altid blive erkendt ved dets tilsvarende antistof på grund af denaturering (rekonformation) af antige-35 nets tertiære struktur (Kurki og Virtanen, J. Immunol. Methods, 1984, s. 67-22). Antigenet kan også udvise nye antigene determinanter, når det er denatureret, såsom i

DK 165792 B

2 tilfældet af DNA.

Evnen til passiv binding til plast er ydermere begrænset til et afgrænset antal molekyler, såsom f.eks. proteiner, 5 eller enkeltstrenget-DNA. Nogle proteiner og nucleinsyrer såvel som polysaccharider og mindre molekyler kan imidlertid ikke adsorberes direkte til visse plasttyper.

I modsætning til simpel fysisk binding orienterer cova-10 lent binding alle immobiliserede forbindelser på en veldefineret måde på den faste fase, hvorved definerede arealer på f.eks. antigener, antistoffer eller enzymkatalytiske sites udsættes for væskefasen, der til sidst ud-hældes på fastfase-overfladen. Antigen-epitoper eller ak-15 tive sites på disse forbindelser kan på denne måde forblive funktionelle. Irreversibel immobilisering af molekyler kan ydermere have nogle fordele i relation til opbevaringen af fastfase-immobiliserede forbindelser på tør form, idet passiv fysisk binding delvis denaturerer 20 f.eks. visse proteiner og nucleinsyrer.

Af alle disse grunde vil det være fordelagtigt, hvis det er muligt at immobilisere antigener, antistof eller andre molekyler covalent til den faste fase.

25

Covalent-fastfase binding af visse typer af forbindelser til polystyren har været kendt i adskillige år. Fastfasepeptid- og oligonucleotid-syntese udføres f.eks. ved benyttelse af modificerede polystyrenpartikler som den fas-30 te bærer. Disse modifikationsfremgangsmåder involverer imidlertid hyppigt meget farlige kemikalier og adskillige tidsrøvende proceduretrin. Et eksempel på dette er forberedelsen af Merrifields peptidharpiks, som er meget benyttet i peptidsyntese. Forberedelsen af denne harpiks 35 involverer det extremt carcinogene reagens chlormethylme-thylether og dette og andre organiske opløsningsmidler resulterer ofte i en turbid overflade fordi plasten er

DK 165792B

3 letopløselig i reagenserne. Dette er besværligt, hvis en efterfølgende spektrofotometrisk detektion ønskes.

Præmodificerede polystyrener med f.eks. -OH, -SOgH eller 5 -NHg-grupper er til rådighed. Når disse præmodificerede polystyrener benyttes, er en separat fremstilling af partikler til hver type af modificeret polystyren nødvendig.

En fremgangsmåde til at indføre aminogrupper på plast-10 overflader til benyttelse i mikrotiterplader er blevet beskrevet (J. Virol. Methods 3, 1981, s. 155-165). Denne procedure, som kræver de farlige kemikalier methansulfonsyre, iseddikesyre og rygende salpetersyre, kræver to dage og behøver et velfungerende stinkskab. Sådanne be-15 tingelser kan næppe benyttes i storskalaproduktion på grund af miljømæssige hensyn. Ydermere, er disse fremgangsmåder generelt set tidsrøvende og det er vanskeligt at opnå en ensartet overflademodifikation.

20 Kemisk modificering af polymermaterialer resulterer sædvanligvis i en heterogen blanding af produkter på polymeroverfladen, idet det ikke er muligt at adskille de vigtigste fastfase-bundne funktionelle grupper fra de uønskede reaktionsprodukter. Dette resulterer mere eller 25 mindre i en blanding af forskellige aktive grupper med forskellig bindingsspecificiteter til f.eks. proteiner.

En anden fremgangsmåde til kemisk modificering eller aktivering af polymeroverflader ved indførelse af funktio-30 nelle grupper såsom OH, NHg, COOH, CHO, NCO eller SCO er foreslået i EP patentansøgning nr. 155 252.

Ifølge denne ansøgning aktiveres en fast polymeroverflade ved strålingspodning af vinylmonomere, der har mindst én 35 funktionel gruppe, som er i stand til at binde til biologisk aktive molekyler. Polymeroverfladen podes i opløsning i et kædeoverførselsreducerende opløsningsmiddel ved

DK 165792 B

4 en meget lav monomerkoncentration, der ikke overskrider 3 vægt-%, når vinylmonomeren er 1-mono-, eller 1,1-disub-stitueret, for at forhindre homopolymerisation og ukon-trollerede autokatalytiske reaktioner. Såfremt vinylmono-5 meren er 1,2-substitueret, kan højere koncentrationer på ca. 10 vægt-% blive benyttet.

Som anvendelig vinylmonomere nævnes crotonsyre, acrylsy-re, acrylsyreester, acrylamid, bisacrylamid, methylol-10 acrylamid, acrylerede aminer, acrylerede epoxider, acry-lerede ethere, acrylerede polyestere, acrylerede poly-ethaner, acrylerede acrylater, acrylerede siliconer, acrylerede silaner, acrylerede phosphater og acrylerede titanater, acrolein, phenyl-substitueret styren-derivater 15 såsom p-aminostyren, tiglinsyre, senecioinsyre, angelin-syre og cinnaminsyre.

Denne fremgangsmåde er vanskelig at kontrollere på grund af den indbyggede risiko for overskudspolymerisation af 20 vinylmonomeren. Dette er den mest sandsynlige grund til den beskrevne høje bindingskapacitet. 5-7 ug protein pr. brønd kan sandsynligvis ikke blive immobiliseret som et monolag i en enkel mikrotiterbrønd. Det er derfor væsentligt, at vinylmonomeren er til stede i et kædeoverfør-25 selsreducerende opløsningsmiddel, der er defineret som et opløsningsmiddel, som danner radikaler, der ikke er i stand til at påbegynde polymerisation, når det bestråles.

Som eksempler på egnede opløsningsmidler er nævnt methanol, pyridin, vand og blandinger af methanol og vand. I 30 praksis benyttes 1:1 methanol/vand-blandinger.

Den kendte fremgangsmåde er således baseret på den erkendelse, at vinylmonomere, som er kendte for at være poly- . meriserbare på polymeroverflader ved podningspolymerisa-35 tion med bestråling eller frie radikaler kan blive bestrålingsbehandlet under betingelser, som forhindrer en polymerisation og er bundet til polymeroverfladen som et

DK 165792B

5 tyndt podningslag tæt ved et monomolekylært lag, der efterlader reaktive grupper, som er i stand til at binde med biologisk aktive molekyler.

5 Den kendte fremgangsmåde besidder imidlertid en række ulemper. For det første er podningsprocessen meget tidsrøvende. Selv ved r-bestråling, som er den eneste afprøvede strålingskilde, tager reaktionstiden 10-12 timer, r-stråling stiller alvorlige helsefysiske krav og der er en 10 tendens til misfarvning af plasten, hvilket gør den uklar og derfor uegnet til optiske målinger.

Processen kræver endvidere en oxygenfri atmosfære og en friradikalinitiator f.eks. benzophenon.

15

Dokumentationen, der er tilvejebragt i eksemplerne, viser ikke overbevisende, at immobilisering af proteiner er blevet opnået på grund af covalent binding til den podede polymer. Endvidere benyttes et standardkoblingsmiddel så-20 som glutaraldehyd eller et carbodiimidreagens i de fleste af eksemplerne. Disse midler frembringer alment en tværbinding af proteinmolekylerne, hvilke fører til en forstærket binding uafhængigt af overfladens karakter.

25 r-stråling er ligeledes kendt for at aktivere polymeroverflader og derved forbedre deres proteinbindingsegenskaber.

Sammenfattende kan det siges, at det ikke utvetydigt er 30 godtgjort, at de rapporterede proteinbindingsresultater skyldes en aktivering af polymeroverfladen og ikke er et resultat af r-strålingen og benyttelsen af koblingsmidler. 1

Det er tidligere blevet beskrevet, at bifunktionelle reagenser, der indeholder arylazider, kan bindes til polymeroverflader (DE A 34 35 744). Dette blev eksemplifice-

DK 165792 B

6 ret ved at tilsætte protein A til en fastfase og dernæst tilsætte den bifunktionelle forbindelse: N-succinimidyl- 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat. Dette resulterer i binding af arylazidderivatet til protein A's amino-5 grupper. Dette kon j ugat· blev dernæst udsat for lys og det blev postuleret, at der blev etableret en covalent binding til fastfase-polymeren. Der er imidlertid ingen beviser for en covalent binding mellem polymeroverfladen og protein A, da ingen data i den ovennævnte patentansøgning 10 viser protein A's evne til at binde til polymeroverfalden uden tilførsel af arylazidforbindelsen.

Ydermere, må det under fotolysen forventes at azidgrup-pens nedbrydningsprodukter mere sandsynligt vil bindes 15 til de adskillige nucleofile grupper, der er tilstede på protein A, og således danne aggregater af dette protein. Ydermere, er arylazid kendt for at reagere med nucleofi-ler som f.eks. vand, hvorved sandsynligheden for en mulig reaktion med polymeroverfladen yderligere reduceres.

20

Undersøgelser er blevet udført for at biotinylere polystyren fotokemisk ved benyttelse af det kommercielt tilgængelige reagens: N-(4-azido-2-nitrophenyl)-N'-(3-bioti-nylaminopropyl)-N'-methyl-1,3-propandiamin), [photobio- 25 tin, Sigma Cat. No. A 7667]. Dette reagens indeholder en arylazid-gruppe, der er forbundet til en sammenlignelig kemisk koblingsforbindelse som den, der er benyttet ifølge Eksempel 1. Det samme optimeringseksperiment blev udført som i dette Eksempel, men ingen biotinylering af den 30 faste polystyren-fase kunne detekteres.

Med hensyn til forening af en nucleinsyre til et fast substrat har det ligeledes tidligere (EP-A-0 130 523) været beskrevet at reagere en fælles koblingsforbindelse 35 såsom CNBr eller 1,4-butandiol-diglycidyl-ether med både et fast substrat, der har reaktive grupper, som kunne være carboxylgrupper, aminogrupper eller lignende, for-

DK 165792 B

7 trinsvis hydroxylgrupper således som de forefindes på cellulose, og et specifikt koblingsreagens, der er en funktionaliseret fotokemisk reaktiv nucleinsyre-bindende ligand, samtidigt eller først med den ene og dernæst med 5 den anden.

Når det faste substrat først er aktiveret af den fælles koblingsforbindelse og den fotokemisk reaktive nucleinsy-rebindende ligand er bundet til koblingsforbindelsen, er 10 den faste bærer i stand til at binde nucleinsyre dertil ved passende bestråling.

Den fotokemiske reaktivitet af den nucleinsyre-bindende ligand udnyttes således til fotokemisk at binde liganden 15 til DNA'et under assayet og ikke til fotokemisk binding af liganden til det faste substrat. Bindingen af liganden til det faste stof foregår via den fælles koblingsforbindelse.

20 Interkalerende fotokemisk reaktive nucleinsyre-bindende ligander kan benyttes i fremstillingen af mærkede nucle-insyreprober, som f.eks. anvendes i fastfase hybridise-ringsprocedurer (EP-A-0 131 830), som imidlertid ikke angår fotokemisk immobilisering af molekyler til modifice-25 ring af overfladen af en polymer.

Beskrivelse af opfindelsen

For at undgå ulemper, der er forbundet med de i dag ek-30 sisterende modificeringsmetode har den foreliggende opfindelse til formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til modificering af en polymeroverflade, fortrinsvis fotokemisk immobilisering af molekyler til polystyren eller andre plastmaterialer.

Opfindelsen er baseret på det overraskende resultat, at et antal velkendte fotoreaktive polycycliske forbindelser 35

DK 165792 B

8 bindes kraftigt til et antal polymeroverflader, såfremt de eksponeres for elektromagnetisk stråling under passende betingelser.

5 Opfindelsen angår en fremgangsmåde til modificering af en polymeroverflade, der er ejendommelig ved de foranstaltninger, der er defineret i den kendetegnende del af krav 1.

10 Den egnede elektromagnetiske stråling kan vælges med hensyn til de fotoreaktive egenskaber af forbindelsen I, f.eks. absorptionsegenskaber, der er afhængige af de aktuelle substituenter og deres omgivelser, f.eks. opløsningsmiddel og andre opløste stoffer.

15

Den elektromagnetiske bestråling udføres fortrinsvis ved bølgelængder kortere end 700 nm.

Det foretrækkes i dag, at bestrålingen udføres i UV-områ-20 det, dvs. 10-400 nm. Afhængigt af den aktuelle forbindelse I foretrækkes "langbølget-stråling", λ > 350 nm, men "kortbølget-stråling", λ < 350 nm, kan ligeledes benyttes .

25 Som vist nedenfor er det tilstrækkeligt at anvende inko-hærente UV-lamper, skønt mere komplicerede lyskilder, f.eks. monokromatiske, ikke-monokromatiske, polariserede, ikke-polariserede, kohærente, ikke-kohærente, kontinuerte eller diskontinuerte lyskilder forventes at kunne blive 30 anvendt.

Ifølge opfindelsen er forbindelsen I valgt blandt eventuelt substituerede coumariner (a) indoler (b^ med Z værende NH) 35

DK 165792 B

9 „ OCX oø 5 (a) lb2) 10 hvor de eventuelt substituerede coumariner fortrinsvis er eventuelt substituerede psoralener (c) coa (c) 20 Psoralenerne kan omfatte én eller flere substituenter og det foretrækkes, at mindst én af substituenterne er en bestanddel, der indeholder en aminogruppe, fortrinsvis 3-trimethylaminopropoxy.

25 Som eksempler på eventuelt substiturerede psoralener kan nævnes psoralen, 8-methyl-3-carboxypsoralen, 4,5',8-tri-methylpsoralen eller 3'-trimethylamino-8-propoxypsoralen.

Psoralener, som er en klasse af plane furocoumarinmoleky-30 ler, er i stand til at interkalere med dobbeltstrenget deoxyribonycleinsyre (dsDNA), og vil binde til og krydsbinde DNA covalent, når det aktiveres med langbølget (λ>350ηπι) UV-lys. Fotoreaktionen foregår mellem thymidi-nen og dobbeltbindingen i coumarin og furandelen af pso-35 ralen under dannelse et cyklisk produkt. Coumariner er også kendt for at være fotoreaktive forbindelser, f.eks.

5,7-dimethoxycoumarin, Queval et al., Eur. J. Med. Chem.

DK 165792 B

10 9, 1974, s. 335.

Ifølge opfindelsen kan psoralener bindes til polymere såsom polystyren ved hjælp af elektromagnetisk bestråling 5 og det er på denne måde muligt at immobilisere molekyler covalent til polymererne via psoralen.

De eventuelt substituerede coumariner kan endvidere være eksemplificeret ved warfarin og eventuelt substituerede 10 indoler ved 5-hydroxytryptamin og 3-indoleddikesyre.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse benyttes en ikke-præmodificeret polymer. Fremgangsmåden kan udføres i ren vandig opløsning uden tilsætning af orga-15 niske opløsningsmidler. Der opnås en meget reproducerbar og ensartet modificering af polymeren, ligesom en transparent polymer såsom polystyren forbliver fuldt transparent under hele proceduren. Det tager mindre end 60 min at binde f.eks. substituerede psoralener på denne måde 20 afhængigt af lyskilden, og det er meget let at udføre proceduren i stor skala og den involverer ingen toxiske eller carcinogene reagenser.

Som det vil fremgå af de følgende eksempler, afhænger ef-25 fektiviteten af polymeroverfladenmodificeringen ligeledes af forbindelsen-I-opløsningens pH. Det optimale pH for en given forbindelse afhænger bl.a. af de individuelle sub-stituenter og deres positive eller negative ladninger og stabiliteten af forbindelsen og kan blive etableret ved 30 eksperimenter. Som en retningslinie er det ønskeligt at undgå protonisering af forbindelsen I. Som konsekvens heraf foretrækkes basisk pH for forbindelser, der har basisk karakter, f.eks. indeholder aminogrupper, og et surt pH foretrækkes for forbindelser, der har sur karakter, 35 f.eks. indeholdende carboxylgrupper. Af praktiske grunde foretrækkes et pH fra ca. 5 til ca. 9.

DK 165792 B

11

Effektiviteten af polymeroverflademodificeringen kan blive forøget ved bestråling af polymeren og forbindelsen I i tilstedeværelse af aktiveringsmidler.

5 Den foreliggende opfindelse udøves fortrinsvis i vandig opløsning med eventuelt tilstedeværelse af en ionstyrkeforstærkende forbindelse, f.eks. NaCl.

Endvidere forbedrer tilsætning af benzoquinon til opløs-10 ningen overraskende modificeringen af polymeren. Grunden til denne aktivatoreffekt er ikke klar, men enten fungerer benzoquinon som en sensibilisator eller den deltager direkte i bindingen af forbindelsen I til polymeroverfladen.

15

Polymerer, der kan benyttes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er fortrinsvis olefiniske og er valgt blandt polystyren, polyethylenglycolterephthalat, polyvinylacetat, polyvinylchlorid, polyvinylpyrrolidon, 20 polyacrylonitril, polymethylmethacrylat, polytetrafluor- ethylen, butylgummi, styrenbutadiengummi, naturligt gummi, polyethylen, poly-4-methylpentylen, polyester og polypropylen. Det forventes, at også siliciumholdige materialer, således som glas, kan benyttes som en "polymer".

25

I en særlig foretrukken udførelsesform af den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til binding af en forbindelse med den almene formel II

30 [L]-[U], (II) hvori L angiver en koblingsenhed ("spacerarm") eller en binding og U angiver en probe, som defineres yderligere nedenfor, til en polymeroverflade via en forbindelse I som defineret ovenfor.

35

DK 165792B

12

Koblingsenheden L er en organisk bestanddel (spacerarm) eller en binding, der er i stand til at forbinde forbindelserne I og U. Eksempler på covalente eller ikke-cova-lente bindingsenheder (spacerarme) er N,N'-dimethylcyste-5 amin (Elsner et al., Anal Biochem. 149, 149, 1985, s.

575-581), diaminer såsom N,N'-dimethylhexandiamin, cyste-amin, spermidin, norspermidin (Burchardt et al., JACS 49, 1984, s. 4123-4126), piperazin (Hansen et al., Med.

Chem., 36, 1983, s. 1510-1514), selen-dipropionsyre, gly-10 cerol, hexan, og diethylethen og spacerarme som omtalt i EP A 156 287.

Et eksempel på forbindelsen I med fastgjort koblingsenhed er 8-propyloxypsoralenyl-N,N'-dimethyl-hexandiamin. Et 15 eksempel på forbindelsen I, koblingsenhed og probe er N'-biotinyl-N-8-propyloxypsoralenyl-N,Ν'-dimethylhexandiamin.

Proben U er en kemisk bestanddel af en vilkårlig slags, 20 som kan kobles covalent eller ikke-covalent til L, hvorved U bliver immobiliseret til polymeren gennem forbindelsen I. Eksempler på proben U er: a) En markør, som kan identificeres ved benyttelse, af en 25 egnet teknik. Eksempler på sådanne teknikker omfatter spektroskopiske, radioisotopiske, fotokemiske, kemiske, immunkemiske eller biokemiske metoder, som ved benyttelse af polypeptid, lectin eller antistof, er i stand til at danne et kompleks med markøren. Eksempler 30 på markører er biotin, radioaktive forbindelser, "spin-labels", fluoregene forbindelser, f.eks. fluorescein, enzymer eller enzymfarvedannende substrater, pH farvedannende forbindelser, f.eks. phenolphthalein, eller haptener, som kan genkendes ved benyttelse af 35 f.eks. enzym-mærket antistof. Den heri anvendte beteg nelse "markør" er således tænkt at omfatte både enheder, der kan detekteres direkte og reaktive enheder,

DK 165792B

13 der kan detekteres indirekte via en reaktion, som danner et detekterbart produkt.

b) Forbindelser, der omfatter reaktive kemiske grupper, 5 f.eks. de reaktive estere: N-hydroxysuccinicimidester og p-nitrophenylester, der er i stand til at reagere under dannelse af covalente bindinger med andre kemiske grupper, f.eks. aminogrupper på proteiner. Andre eksempler er reaktive halogenholdige forbindelser, 10 f.eks. benzoylbromid, som reagerer med både thiol- og aminogrupper, disulfidholdige grupper, epoxider eller optisk aktive forbindelser, f.eks. brucin.

c) Ikke-covalent reagerende kemiske grupper, som omfatter 15 ladede eller hydrofobe kemiske grupper med affinitet for forbindelser, der bærer en modsat ladet gruppe eller en hydrofob gruppe. Eksempler på ladede kemiske grupper er -NH^* og -SO^- med affinitet for en forbindelse, der bærer den modsatte nettoladning, f.eks. et 20 protein.

d) Andre molekyler såsom proteiner med specifik affinitet for andre forbindelser, f.eks. enzymer, antistoffer, lectiner, hæmoglobin, histoner eller ikke-histonpro- 25 teiner eller hormoner, peptider, f.eks. peptidhormo ner, lægemidler, f.eks. cytostatica, vitaminer eller penicilliner, nucleinsyrer, f.eks. DNA-prober, mono-, oligo- eller polysaccharider, og eventuelt substituerede lipider.

30

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen involverer derfor præmodifikation af molekylerne, der skal immobiliseres, og ikke nødvendigvis polymeren. Dette resulterer i en meget homogen modificering af polystyren og ikke i en heterogen 35 blanding af funktionelle grupper som beskrevet ovenfor.

DK 165792 B

14

Som en yderligere fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen og i modsætning til passiv adsorption til plastoverflader, er det muligt at binde f.eks. proteiner til en fast fase (polymer) på trods af tilstedeværelsen af 5 detergenter i belægningsopløsningerne. Dette er ofte tilfældet, når detergentopløselige proteiner skal undersøges.

Psoralener er ydermere kendt for at være fotoreaktive med 10 elektrofiler såsom f.eks. dobbeltbindinger. Arylazider er, på den anden side, kendt for at være fotoreaktive med f.eks. vand og andre opløsningsmidler. Dette gør arylazider mindre egnede end psoralener.

15 Alle disse fordele, når de sammenlignes med de ovenfor nævnte fremgangsmåder, implicerer, at det heri beskrevne princip vil kunne blive benyttet til kemisk fastfasesyn-tese, som f.eks. peptid- eller oligonucleotidsyntese og en særlig fordel er, at processen kan følges spektrofoto-20 metrisk direkte i reagensglas eller på mikrotiterplader, når polymeren er transparent.

Selv hvis kemisk syntese i mikrotiterplader eller reagensglas ikke ønskes, kan fremgangsmåden ifølge opfindel-25 sen være velegnet til modifikation af polystyren på en anden form, f.eks. som partikler.

Et interessant aspekt af opfindelsen er, at det er muligt at udføre bindingen af de nævnte forbindelser til polyme-30 rer i en vilkårlig orden. Det er således muligt at fotoreagere polymeren og forbindelsen I i det første trin og dernæst forbinde koblingsenheden, hvis nødvendigt, og proben. En anden måde er at opbygge et kompleks, der omfatter forbindelsen I, den eventuelle koblingsenhed og 35 proben, og dernæst binde det dannede kompleks til polymeren ved fotoaktivering. Alternativt kan man begynde med en kombination af forbindelsen I og en koblingsenhed, la-

DK 165792B

15 de denne kombination fotoreagere med polymeren og til slut tilføre proben.

I denne forbindelse skal det bemærkes, at proben selv 5 og/eller koblingsenheden kan udgøre en del af forbindelsen I.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til at immobili-sere et molekyle på en fast overflade, der er ejendomme-10 lig ved de foranstaltninger, der er defineret i den kendetegnende del af krav 12.

Fremgangsmåde ifølge opfindelsen er meget velegnet til covalent immobilisering af forbindelser, f.eks. antigener 15 eller haptener, som ikke passivt hæfter til plastoverflader. Fremgangsmåden kan udføres direkte i mikrotiterpla-der, reagensglas, strimler eller på partikler. Fremgangsmåden kan derfor også benyttes ved forberedelsen af en fast fase, der skal benyttes i forskellige typer af im-20 munassay.

Opfindelsen angår derfor også en modificeret polymer kendetegnet ved, at den er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1. I en særlig udførelsesform er polymeren i 25 form af en plade, en partikel, et reagensglas eller en teststrimmel.

I fastfase-enzymbehandling og affinitetschromatografi skal proteiner eller andre forbindelser med specifik af-30 finitet til andre molekyler immobiliseres på en fast fase. En opløsning af molekylerne, der skal adskilles eller behandles, placeres dernæst enten gennem en kolonne eller tilføres til en suspension, der indeholder den faste bærerstøtte. Nedbrydningsprodukter eller fastfase 35 bundne forbindelser kan dernæst efterfølgende elueres.

DK 165792 B

16

Materialer, der benyttes som fastfase i chomatografi er hyppigt baseret på agarose, polyacrylamid, dextran eller cellulose. Alle disse substanser vil kollapse under det høje tryk, der benyttes under højtryksvæskechromatografi-5 (HPLC)-teknikker. Polystyrenmikropartikler, der er covalent modificeret i overensstemmelse med opfindelsen er et fordelagtigt alternativ til de ovennævnte substanser eller silicium-holdige materialer, der benyttes i HPLC-ko-lonner eller andre chromatografiske systemer.

10

Opfindelsen angår derfor ligeledes en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelse af et molekyle i en prøve, der er kendetegnet ved de foranstaltninger, der er defineret i den kendetegnende del af krav 10.

15 I en særlig udførelsesform for opfindelsen er polymer-overfladen valgt blandt polymerplader, såsom tyndtlags-plader eller mikrotiterplader, polymerperler, strimler, målepinde, reagensglas og mikrosfærer.

20 I enzymbehandlingen ønskes ofte fastfase-immobilisering. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan benyttes til dette formål såvel som til immobilisering af mikrobielle eller andre celler. Det må antages, at immobiliserede enzymer 25 kan benyttes til rensning af industrielt affald og adskillelse af organiske og uorganiske forbindelser.

Binding af f.eks. enzymer til f.eks. glas benyttes i biosensorer. Den foreliggende opfindelse kan anvendes i de 30 fremtidige udviklinger af disse.

Mikrokugler har været anvendt til behandling af cancer ved benyttelse af cytotoxiske lægemidler, der er immobiliserede til polymere. Ydermere har monoklonale anti-can-35 cercelleantistoffer, der er immobiliserede på magnetiske polystyren partikler, har været benyttet til at adskille cancerceller fra knoglemarvsceller før autotransplantati- 17

DK 165792B

on. Den foreliggende opfindelse kan ligeledes finde anvendelse på disse områder.

Den foreliggende opfindelse kan finde anvendelser i pro-5 duktionen af lamineret plast ved benyttelse af f.eks. psoralenforbindelser som fotoreaktivt lim mellem lamellerne. Opfindelsen kan også benyttes til covalent binding af farvede forbindelser til f.eks. polystyren ved benyttelse af f.eks. psoralener, der er konjugeret til en far-10 vet forbindelse.

Forbindelse I kan syntetiseres i overensstemmelse med de følgende principper: 15 Fotoreaktive benzofuraner, coumariner som psoralener og angeliciner kan syntetiseres eller de kan isoleres fra planter eller kultjære. 4, 5',8-trimethylpsoralen og 8-me-thoxypsoralen kan isoleres fra Fungus sclerotina sclero-tiorum (Scheel et al., Biochem. 2, 1963, s. 1127) og ben-20 zofuraner og coumariner kan isoleres fra kultjære eller planter.

Psoralener, f.eks. 4,5',8-substituerede psoralener, kan syntetiseres fra 2-methyl-3-hydroxyphenol ved reaktion 25 med acetoeddikesyreethylester, som fører til dannelsen af en substitueret coumarin (Rangaswani et al., Proc. Ind.

Acad. Sci. Sect. A6, 1937, s. 112). Efter 5 yderligere syntesetrin: reaktion med 3-brom-2-en-propan, opvarmning, behandling med base, reaktion med brom og til slut be-30 handling med natriumethanolat, dannes en 4,5', 8-substi-tueret psoralen (Queval et al., Eur. J. Med. Chem. 9, 1974, s. 335). Reaktionssekvensen er illustreret nedenfor: 35

DK 165792 B

18

5 λ ’"'røX

R R R

C2I R*CHj X5 Ved at erstatte 2-methyl-3-hydroxyphenol med andre substituerede phenoler, er det muligt at ombytte substituen-ter på coumarinproduktet og som følge heraf ligeledes på den 4,5',8-substituerede psoralen med formlen I. Ved benyttelse af 2-methoxy-3-hydroxyphenol i stedet for vil 20 slutproduktet være 4,5'-dimethyl-8-methoxypsoralen i stedet for 4,5'-dimethyl-8-methylpsoralen. Hvis estergruppen i coumarinet skal ombyttes med f.eks. en amid, en thioes-ter, en phosphatester eller selenoester kan andre phenol-reagenser benyttes som udgangsmateriale, f.eks. et ud-25 gangsmateriale hvori 3-hydroxygruppen i hydroxyphenol er udbyttet med en amin-, en thiol-, en phosphor- eller en selengruppe. Hvis udgangsmaterialet var 2-amino-3-methyl-phenol ville produktet blive et coumarin med en amid i stedet for en ester, dvs. en lactam i stedet for en lac- 30 ton.

Ved at erstatte aceteddikesyreethylester med en halogen-alkanon i det første trin af syntesen kan estergruppen i coumarin substitueres yderligere. Hvis aceteddikesyre-35 ethylester erstattes med l-brom-3-butanon, CH^COC^C^Br, ved reaktion med 2-methyl-3-hydroxyphenol eller 2-amino- 3-hydroxyphenol, vil produktet være en coumarinanalog, i

DK 165792 B

19 hvilken esteren er udbyttet med henholdsvis en ether og en amin.

Syntese af psoralener kan også udføres ved først at syn-5 tetisere benzofurandelen. Det er muligt at begynde fra 2,4-dimethoxy-3-methylbenzoaldehyd og reducere denne forbindelse med aluminiumtrichlorid og reagere med diethyl-b'rommalonat. Dette fører til substituerede benzof uraner (Queval et al., Eur. J. Med. Chem. 9, 1974, s. 335).

10 Yderligere reaktioner i seks trin fører til 3-carbethoxy-8-methylpsoralen. Reaktionssekvensen er illustreret nedenfor: 25 oVw CHj 30 Hvis carbethoxypsoralenen behandles med iseddikesyre i svovlsyre dannes en psoralen, der indeholder en carboxylsyre.

Modificering af forbindelsen I med en reaktiv gruppe kan 35 udføres med chlormethylmethylether, hvilket resulterer i et chlormethyleringsprodukt, der afhænger af typen af den benyttede forbindelse I. Hvis forbindelsen I er 8-meth-

DK 165792 B

20 oxypsoralen vil produktet være 5-chlormethyl-8-methoxy-psoralen, og hvis forbindelsen I er 4,5',8-trimethylpso-ralen vil produktet være 4,5', 8-trimethyl-5' -chlormethyl-psoralen (Elsner et al., Anal. Biochem. 149, 1985, s.

5 575-581). Det er også muligt at omdanne en methoxygruppe til en reaktiv gruppe ved at omsætte den med magnesium-iodid og dibrompropan. Hvis den benyttede forbindelse I er 8-methoxypsoralen, vil det resulterende produkt være 3-brompropyloxypsoralen. De ovenfor nævnte omdannelser er 10 illustreret nedenfor: pir1· ~ OCHjCHjCHjSr CH OCH Cl

wTX

20 fccHj °

En reaktiv estergruppe såsom N-hydroxysuccinimidoester 25 kan indføres i en forbindelse I, der indeholder en car-boxylgruppe. Indføringen kan udføres ved at reagere car-boxylgruppen med N-hydroxysuccinimid i nærvær af carbodi-imid i f.eks. dioxan. 1 2 3 4 5 6

Indføringen af en koblingsenhed (spacerarm), om nødven 2 digt, kan blive udført ved benyttelse af forskellige syn 3 teseveje. Det synes at være muligt at forbinde en kob 4 lingsenhed til alle positioner på forbindelsen I. Til 5 koblingsenheden kan en vilkårlig forbindelse f.eks. bio- 6 tin, enzym, chirale forbindelser, lægemidler, etc. bindes. Hvis 3-brompropyloxypsoralen er opvarmet med N'-tert.-butyloxycarbonyl-N', N-dimethylhexandiamin i aceto- 21

DK 165792B

ne, vil koblingsenheden N'-tert.butyloxycarbonyl-N,N'-di-methylhexandiamin blive bundet covalent til forbindelsen I. Derefter kan tert.butyloxycarbonyl udskiftes med f.eks. biotin. Som eksempel på andre grupper kan nævnes 5 arylazider eller andre fotoreaktive forbindelser (Elsner et al.. Anal. Biochem. 149, 1985, s. 575-581).

I beskrivelsen er følgende forkortelser blevet benyttet: 10 ELISA: "enzyme-linked immunosorbent assay" dsDNA: dobbeltstrenget deoxyribonucleinsyre HPLC: højtryksvæskechromatografi HRP: peberrodsperoxidase BSA: bovin serum albumin 15 OD: optisk tæthed

IgM: immunglubulin af klassen M

IgG: immunglubulin af klassen G

RF: rheumatoide faktorer DMF: dimethylformamid 20 DMSO: dimethylsulfoxid PMMA: polymethylmethacrylat-partikler

Boc: tert.butoxycarbonyl PBS: phosphat-saltbuffer 25 Den foreliggende opfindelse vil yderligere blive illustreret i de efterfølgende Eksempler 1-5 nedenfor og bindingen af forbindelser II til psoralen vil blive illustreret i Eksemplerne A-C. 1 35

DK 165792 B

22 EKSEMPEL 1

Biotinylering af polystyren 5 Biotin-konjugeret psoralen. (PS12.) med formlen °^° ji \ > '——a 15 blev syntetiseret som følger: N-tert. butoxycarbonyl-N, N' -dimethylhexandiamin (1) 2,9 g (20 mmol) Tert.butoxycarbonylazid i 5,2 ml ether 20 ("Organic Synthesis V", s. 157-158), blev tilsat dråbevis til en omrørt opløsning af 2,92 g (20 mmol) N,Ν'-dimethylhexandiamin (Aldrich Cat. No. D16110-1) (Beilstein 4(1), s. 422) i 30 ml dimethylsulphoxid (DMSO). Temperaturen blev holdt ved 20 °C med ekstern køling. Efter endt 25 tilsætning (30 min.) blev omrøringen fortsat ved stuetemperatur i en time, hvorefter 30 ml vand blev tilsat. Opløsningen blev gjort sur (pH 5) med 2N HC1 og ekstraheret med 2 x 200 ml ether. DMSO/vand-blandingen blev gjort alkalisk (pH 11) med 6N NaOH og ekstraheret med 4 x 200 ml 30 ether. Fordampningen af etheren gav 1,2 g forbindelse (1), som en gul olie.

35

DK 165792B

23 8-hydroxypsoralen (2)

Til en suspension af 0,97 g (0,04 mol) magnesium i tør 75 ml benzen blev tilsat 10,2 g (0,04 mol) iod over en 5 periode på 1 time. Herefter blev tilsat 75 ml tør benzen og blandingen blev refluxet i 1 time. Næste dag tilsattes 4,3 g (0,02 mol) 8-methoxypsoralen (Sigma Cat. No. M 3501) og omrørt i 15 minutter, hvorefter opløsningsmidlet blev afdampet under vakuum ved 120 °C indtil resten prak-10 tisk talt var tør. Der opvarmedes dernæst yderligere til 165 °C i 2 timer. Det resulterende faste stof blev opløst med fortyndet svovlsyre og filtreret. Det faste stof vaskedes med vand, suspenderedes i fortyndet bisulfitopløs-ning, filtreredes igen, vaskedes med vand og krystallise-15 redes til sidst fra dioxan og gav 3,75 g farveløse krystaller, smp. 246 °C.

3-brompropyloxypsoralen (3) 20 4,04 g (20 mmol) 8-hydroxypsoralen (2) og 1,6 g (8 mmol) dibrompropan blev refluxet i 400 ml acetone med 20 g ka-liumcarbonat i 24 timer. Opløsningen blev filtreret og inddampet under vakuum. Chromatografi af resten på sili-cagel med chloroform som eluent gav 2,6 g 3-brompropyl-25 oxypsoralen som et hvidt pulver.

PS12 1.6 g 3-brompropyloxypsoralen (3) .og 1,3 g N-tert.butoxy-30 carbonyl-N,N'-dimethylhexandiamin (1) blev blandet i 100 ml acetone med 1,8 g kaliumcarbonat og refluxet i 72 timer, hvorefter det blev filtreret og inddampet i vakuum.

Resten blev omrørt i HC1 (2M) i iseddikesyre i en time og efterfølgende inddampet under vakuum. Resten blev opløst 35 i 20 ml absolut ethanol og 1 ml triethylamin, hvorefter 1.7 g hydroxysuccinimidobiotin (NHS-d-biotin), (Sigma Cat. No. H1759), blev tilsat. Efter omrøring i 24 timer

DK 165792 B

24 blev den inddampet under vakuum, og 10 ml fortyndet saltsyre tilsattes til resten. Efter ekstraktion med 2 x 2 ml chloroform blev opløsningen gjort alkalisk med fortyndet natriumhydroxid og ekstraheret igen med 3 x 2 ml chloro-5 form. Det basiske chloroformekstrakt blev omrørt, tørret over magnesiumsulfat og inddampet under vakuum. Resten blev opløst i 1 ml methanol, hvorefter 100 μΐ saltsyre (10 N) blev tilført; Hydrochloridet (PS12) blev udfældet med ether, opsamlet og frysetørret.

10 PS12-Binding til polystyren

En 10 mg/ml stamopløsning af PS12 i dimethylsulfoxid blev opbevaret ved -4 °C. Ti-ganges fortyndinger i destilleret 15 vand blev fremstillet fra denne stamopløsning i koncentrationsområdet fra 0,1 til 1.000 ag/ml, og 100 μΐ/brønd af hver opløsning blev tilsat til brøndene i polystyren-mikrotiterplader (Nunc, Danmark). Pladerne blev dernæst bestrålet i to timer ved stuetemperatur med langbølget 20 (λ>350 nm) UV-lys fra en Philips TL 20W/09N-lampe, der var placeret 20 cm over mikrotiterpladerne, og brøndene blev vasket 8 gange med 200 μΐ vaskebuffer (29,2 g NaCl, 0,2 g KC1, 0,2 g KH2P04, 0,92 g Na2HP04, Triton®X-100, 1.000 ml vand, pH 7,2). Det samme eksperiment blev udført 25 uden bestråling af mikro-titer-pladerne.

Til detektering af PS12-binding til den faste fase blev tilsat 100 μΐ/brønd af en opløsning af 100 μΐ/brønd af et avidin-peberrodperoxidase kompleks (avidin-HRP), (Sigma), 30 25 μg avidin-HRP, 100 mg BSA og 10 ml vaskebuffer til brøndene og inkuberet ved 37 “C i 1 time. Pladerne blev dernæst vasket 3 gange med vaskebuffer, og 100 μΐ/brønd af et farvedannende substrat, 1 mg o-phenyldiamin (Sigma) per ml citrat/phosphatbuffer (7,3 g citronsyre, 11,86 g 35 Na2HP04.2H20, destilleret vand til 1 liter), og 1 μΐ H202 (35%) blev tilsat. Efter ca. 10 minutter blev farvereaktionen stoppet med 100 μΐ IN H2S04 og den optiske tæthed

DK 165792 B

25 (OD) blev aflæst på et Titertek® Multiscan ELISA-fotome-ter (fig. 1).

Tidsafhængighed af psoralen-biotinbindingen 5

En PS12 stamopløsning blev fortyndet i vand til henholdsvis en koncentration på 10 ug/ml og 100 ug/ml. 100 ul/brønd af hver opløsning blev overført til mikro-titer-plader, UV-bestrålet af forskellig varighed eller bestrå-10 lingstid og behandlet som beskrevet ovenfor (fig. 2).

Immobilisering af streptavidin 1 ug/brønd streptavidin (Zymed) i destilleret vand blev 15 tilsat til hver brønd af mikrotiterplader, der var dækket med PS12 (0,1 ug/brønd, 1 »g/brønd og 10 ug/ brønd).

Efter 12 timer ved 4 °C blev pladerne vasket 3 gange med vaskebuffer og en opløsning på 100 μΐ af et biotin-HRP kompleks (Sigma) (25 ug biotin-HRP, 100 mg BSA, 10 ml 20 vaskebuffer, vand) blev tilsat, hvorefter pladerne blev inkuberet ved 37 °C. Efter 1 time blev pladerne vasket 3 gange med vaskebuffer og peroxidaseaktivitet blev detek-teret som beskrevet ovenfor (fig. 3).

25 RESULTATER

Det blev vist, at PS12, der var bestrålet med UV-lys, var i stand til at binde til polystyren. PS12-bindingen blev målt med avidin-HRP. Uden UV-bestrålingen kunne ingen 30 biotinylering af brøndene detekteres (fig. 1). Dette in dikerer stærkt, at bindingen er af covalent natur, hvilket yderligere støttes af det faktum, at PS12 ikke kan fjernes ved behandling under stærke alkaliske eller sure betingelser. Bindingen modstår således en behandling nat-35 ten over med f.eks. 4 N H2S04' 10 N NaOH, absolut ethanol eller methanol, iseddikesyre eller 50 % DMSO i vand.

DK 165792B

26

Biotinyleringen af polystyren forøgedes, når forøgede koncentrationer af PS12 blev tilsat til brøndene. Ingen maximumsværdi blev opnået i disse eksperimenter. OD-vær-dierne steg fra 0,2 til 2,6 med PS12 koncentrationer i 5 intervallet fra 0,1 ug/brønd til 1.000 ug/brønd.

Ved brug af avidin-HRP blev det vist, at en maximal bio-tinyleringsgrad blev opnået efter en bestrålingsperiode på 1,5 timer. OD-værdierne steg fra 0,1 til 1,2 under 10 denne periode, når der anvendtes 1 ug PS12, og fra 0,1 til 1,6, når der anvendtes 10 ug PS12 (fig. 2).

Det maximale antal frie biotinbindings-sites på immobili-seret streptavidin, som detekteret med biotin-HRP, blev 15 opnået, når brøndene blev overtrukket med 1 ug/100 ul PS12. Dette svarer til en OD-værdi på 1,3. Når pladerne blev overtrukket med 0,1 ug/brønd eller 10 ug/brønd PS12 var antallet frie biotin-sites mindre. Formindskelsen i antallet af biotin-sites ved benyttelse af PS12-koncen-20 trationer mindre end 1 ug/ml skyldes sandsynligvis de lave mængder af biotin på polystyrenoverfladen. Da det var vist på fig. 1, at mængden af avidin-HRP, der immobilise-rer til den biotin-konjugerede polystyrenoverflade, kor-relerer godt med PS12-koncentrationen, kan formindskelsen 25 i frie biotin-sites, der ses på fig. 3, forklares som en blokering af biotin-sitene på streptavidin ved forøgede mængder af fastfase-bundet biotin.

Når intet PS12 blev benyttet, blev der ikke bundet strep-30 tavidin til polystyren som det fremgår af fig. 3.

Når der anvendtes 1 ug/brønd PS12, gav biotinyleringsgraden, som detekteret med avidin-HRP, en OD > 3, hvorimod ingen detekterbare frie biotin-sites kunne observeres ved 35 benyttelsen af biotin-HRP (Tabel 1). Når 2 ug/brønd streptavidin blev tilsat til hver brønd faldt mængden af frit fastfase-bundet biotin, målt ved hjælp af avidin- 27

DK 165792B

peroxidase, til OD = 0,111. Parallelt hermed steg mængden af frie biotin-sites, målt ved hjælp af biotin-HRP, til OD > 3 (Tabel 1). Dette indikerer, at streptavidin virkeligt blev immobiliseret og bundet til næsten al fastfase-5 bundet biotin. Ved benyttelse af biotin- eller avidin-konjugeret peroxidase var det yderligere muligt at følge den efterfølgende binding af biotinylerede forbindelser som f.eks. nucleinsyre.

10 TABEL 1 PS12-overtrukke- PS12- + streptavi-de brønde din-overtrukkede brønde 15 -

Biotin-peroxidase 0,070 > 3,000

Avidin-peroxidase > 3,000 0,111 20 EKSEMPEL 2

En "enzym-linked immunosorbent assay" (ELISA) til bestemmelse af IgM-rheumatoide faktorer 25 Passiv adsorption af avidin til en fast fase er blevet beskrevet i forbindelse med sekundær immobilisering af biotinylerede forbindelser, såsom f.eks. immunglobulin eller carbonhydrater (US patentskrift nr. 4 582 810). Den eksemplificerede anvendelse af denne opfindelse var i 30 forbindelse med udvikling af immunassay.

Det er velkendt, at mange sunde personer besidder anti-avidin-antistoffer i deres blodsera, hvilket kan forstyrre målingen af andre forbindelser.

Streptavidin, der er isoleret fra Streptomyces, viser på den anden side meget lav aktivitet med normalt humant se- 35

DK 165792B

28 rum, men adhærerer ikke passivt til polystyren (eksempel 1), hvilket er forskelligt fra avidin. Streptavidin kan derfor ikke benyttes på denne måde som et reagens for sekundær immobilisering af biotinylerede forbindelser.

5

Med fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan streptavidin imidlertid immobiliseres til polystyren. Dette kan udnyttes i f.eks. "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA).

Dette eksemplificeres ved en ELISA-fremgangsmåde til belt) stemmelse af IgM-rheumatoide faktorer (IgM-RF).

Disse antistoffer er af IgM-immunglobulinklassen, som har affinitet for Fc-delen (fragmentkrystalliserbar) af im-munglobulin af IgG-klassen. Denne fremgangsmåde kan be-15 nyttes til diagnosticering af sygdommen rheumatoid arthritis.

Passiv binding af avidin til polystyren mikrotiter-plader 20 Opløsninger (100 μΐ) af avidin i koncentrationsområdet fra 1 ng/ml til 1 mg/ml i 0,1 M carbonatbuffer, pH 9,5, blev tilsat til hver brønd af ikke-modificeret polystyren mikrotiterplader og inkuberet over natten ved 4 °C. Pladerne blev vasket med vaskebuffer og tilstedeværelsen af 25 biotin-sites blev detekteret ved biotin-HRP som beskrevet i Eksempel 1 (fig. 4).

Immobiliseringen af streptavidin på polystyren mikro-ti-terplader blev udført som beskrevet i Eksempel 1. ’ 1 mg 30 PS12 blev tilsat til hver brønd og pladerne blev bestrålet i 2 timer ved stuetemperatur med UV-lys (λ>350 nm). Efterfølgende blev tilsat 2 wg/brønd streptavidin, inkuberet i 1 time ved 37 °C og vasket 3 gange som beskrevet i Eksempel 1. Andre ikke-modificerede polystyren-mikroti-35 terplader blev overtrukket direkte med 2 ug/brønd avidin som beskrevet ovenfor.

DK 165792 B

29

De streptavidin- og avidinovertrukkede plader blev blokeret over natten ved 4 °C med vaskebuffer, der indeholdt 1% BSA (fortyndet buffer) (200 ul/brønd). En plade, der kun indeholdt fortyndet buffer blev også forberedt.

5

Reaktivitet af immunglobulin fra sunde bloddonorer over for fastfaseimmobiliseret avidin og streptavidin

Blodsera fra 10 sunde bloddonorer blev testet på plader-10 ne, der var overtrukket med henholdsvis streptavidin, avidin og BSA ved tilsætning af 100 ul/brønd, l:100-for-tyndinger i fortyndede buffere og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Efter 1 times inkubationsperiode blev pladerne vasket, og en 1:1000-fortynding af HRP-mærket 15 kanin-antihuman IgM eller igG blev tilsat (100 ul/brønd) og inkuberet 1 time ved stuetemperatur. Fastfase-bundet HRP blev detekteret som beskrevet i Eksempel 1.

Bestemmelse af IgM-RF ved benyttelse af biotinyleret bun-20 det IgG, der er bundet til fastfase immobiliseret streptavidin

Biotinyleret humant IgG (VECTOR) blev immobiliseret til polystyren-mikrotiterplader via fastfase-immobiliseret 25 streptavidin. En opløsning af 20 ug/ml biotinyleret IgG i fortyndet buffer (100 ul/brønd) blev tilsat til pladerne, der indeholdt immobiliseret streptavidin som beskrevet ovenfor, og pladerne blev inkuberet i 1 time ved 37 °C.

De blev dernæst vasket og serumfortyndinger (1:100) i 30 fortyndet buffer af 10 IgM-RF positive sera og sera fra 10 sunde bloddonorer blev tilsat i duplikat (100 ul/brønd).

Binding af immunoglobulin af IgM-klassen blev detekteret 35 som beskrevet ovenfor.

DK 165792B

30

RESULTATER

På fig. 4 er vist, at mængden af passivt adsorberet avi-din forøges, når stigende mængder tilsættes til brøndene.

5 Maximale OD-værdier .blev opnået-, når 2 ug blev tilført til hver brønd.

I Eksempel 1 blev det vist, at intet streptavidin blev adsorberet, når der blev benyttet ikke-biotinyleret poly-10 styren. Dette blev bekræftet ved anvendelse af 125-1 mærket streptavidin.

Fig. 5 viser resultaterne af afprøvning af sera fra 10 sunde bloddonorer på brønde, der var overtrukket med hen-15 holdsvis avidin, streptavidin og BSA. Sammenlignet med BSA-overtrukkede brønde besidder et signifikant antal af seraprøverne IgG- såvel som IgM-antistof direkte mod avidin. Ingen signifikant reaktion kan imidlertid ses med streptavidin-overtrukne brønde.

20

Fig. 6 viser resultaterne af afprøvning af sera fra de 10 samme donorer og ydermere 10 IgM-RF positive sera for tilstedeværelsen af IgM-RF. Dette blev udført ved benyttelse af mikrotiterplader, der indeholdt streptavidin-im-25 mobiliseret humant biotinyleret IgG. Alle IgM-RF positive sera blev også fundet positive i denne ELISA-assay og ingen sera fra sunde bloddonorer indeholdt IgM-RF.

På denne måde blev biotinyleret IgG bundet meget stærkt 30 til den faste fase, hvilket må være en fordel, når pladerne opbevares i tør tilstand.

C

35

DK 165792B

31 EKSEMPEL 3

Biotinylering af polymethylmethacrylat med PS12 5 Til 3 bægerglas med 2 ml 0,05 NaCl i vand blev tilsat 100 mg polymethacrylatpartikler (PMMA) ELVASIT 2041 (Dupont).

Til to af disse bægerglas med PMMA blev tilført 10 al PS12 (10 mg/ml i DMS0 (dimethylsulfoxid)). Et af bægerglassene blev bestrålet i 1 time med UV-lys (λ>350 nm) 10 fra en Philips TL 20W/09N-lampe 20 cm over bægerglasset og indholdet blev omrørt. Efter bestråling blev PMMA-par-tiklerne vasket med 3 x 1 ml vaskebuffer (29,2 g NaCl, 0,2 g KC1, 0,2 g KH2P04, 0,92 g Na2HP04, Triton©X-100, vand til 1.000 ml pH 7,2) og 2 gange med vand. Dernæst 15 tilsattes en opløsning af 1 ml avidin-peroxidase (Sigma) (25 ag avidin-peroxidase, 100 mg BSA, 100 ml vaskebuffer) og bægerglassene blev inkuberet ved 37 °C. Efter 1 time blev PMMA-partiklerne vasket 3 gange med vaskebuffer, overført til rene Eppendorf-reagensglas og 1 ml substrat 20 blev tilsat (3 mg 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-sulfonsyre) (Sigma) i 10 ml vand). Efter 5 minutter blev 100 al citronsyre (10 g i 100 ml vand) tilsat til hvert bægerglas og den optiske tæthed (OD) blev bestemt ved 410 nm efter fortynding med vand 10 gange.

25 RESULTATER: TABEL 2 30 -

Polymethylmethacrylat: 0,030 OD

Polymethylmethacrylat + PS12: 0,251 OD

Polymethylmethacyrlat + PS12 + lys: 1,010 OD

35

DK 165792B

32 KONKLUSION: PS12 binder fotokemisk til PMMA.

5 EKSEMPEL 4

Biotinylering af polystyren med PS13

Opløsninger af radioaktivt mærket aH-3-trimethylamin-8-10 propoxypsoralen (PS13) (J.B. Hansen et al., Journal of

Medical Chemistry 28, 1985, s. 1001-1010) blev tilsat til mikrotiterbrønde (100 ul, 1 mg/ml, 3.800.000 tællinger per minut) (NUNC, Danmark) og fortyndet 6 gange 1:10 til en slutkoncentration på 0,01 yg/ml. Mikrotiterbrøndene 15 blev dernæst bestrålet som beskrevet ovenfor i 2 timer ved stuetemperatur og vasket 8 gange med 200 ul vaskebuffer. Det samme eksperiment blev udført uden UV-bestrå-ling.

20 Brøndene blev dernæst tømt, mekanisk adskilt og overført til scintillatorprøvebeholdere, hvor fastfase-immobilise-ret radioaktivitet blev bestemt ved benyttelse af væske-scintillationstælling i 10 ml Instagel (Packard).

25 RESULTATER

Ved 1 mg/ml blev 87 ng PS13 fotokemisk immobiliseret, hvorimod kun 17 ng blev immobiliseret i ikke bestrålede brønde. Ved benyttelse af koncentrationer af PS13 ved 100 30 til/ml blev 48 ng immobiliseret til den faste fase, hvorimod ikke-bestrålede brønde viste værdier nær baggrundværdierne (12 ug) (fig. 7).

Ved koncentrationer mindre en 100 ug/ml kunne ingen sig-35 nifikant immobilisering af PS13 blive detekteret - måske på grund af det lave radioaktivitetsniveau i opløsningerne, når der sammenlignes med baggrundsværdierne.

EKSEMPEL 5

DK 165792B

33

Biotinylering af mikrotiterplader med PS12 5 Lignende eksperimenter som beskrevet i Eksempel 1 ved benyttelse af 2 ug PS12 pr. brønd blev udført ved anvendelse af mikrotiterplader af forskellige fabrikater og materialer. De følgende fladbundede mikrotiterplader blev benyttet : 10

Titertek®: Polyvinylchlorid, Cat. No.

77-173-05, Flow Laboratories, USA (FlowPVC); 15 Nunc-Immunplader: Polystyren, Cat. No. 439454,

Nunc, Danmark (NuncPS);

Polystyren med høj bindingskapacitet: Cat. No. 655061, C.A. Greiner 20 und Sohne, West-Germany (GreinPSH);

Polystyren med medium bindingskapacitet: Cat. No. 655001, C.A. Greiner 25 und Sohne, West-Germany (GreinPSL):

Polystyren EIA-

plader: Cat. No. 3590, Costar, USA

30 (CostPS);

Polyettr ^englycol-terephthalat-plader med høj

35 bindingskapacitet: Cat. No. 6595, Costar, USA

(CostPETG).

DK 165792B

34 RESULTATER:

Som vist i Tabel 3 binder alle pladetyper store mængder PS12, når de bestråles med UV-lys. Ikke-bestrålede plader 5 binder ikke signifikante mængder PS12.

TABEL 3

Pladetype bestrålet ikke-bestrålet 10 -

FlowPVC 1,09 0,20

NuncPS 1,11 0,12

GreinPSH 0,90 0,10

GreinPSL 1,45 0,08 15 CostPS 0,84 0,10

CostPETG 0,68 0,11 EKSEMPEL 6 20

Tilsvarende eksperimenter som beskrevet i Eksempel 5 blev udført ved benyttelse af NaCl-opløsning (1M) i stedet for destilleret vand under bestrålingsperioden. Biotinyle-ringsgraden af polymerene blev forøget med 50 til 100%.

25 EKSEMPEL 7

Immobilisering af 5-hydroxytryptamin til polystyren 30 En opløsning af 10 mg/ml 5-hydroxytryptamin (Aldrich catalog nummer 10775-1) i DMSO blev fremstillet. 0,1, 1 og 10 nl 5-hydroxytryptamin i DMSO blev tilsat til en carbo-natbuffer (pH = 5, 3 x 1 ml, 0,1 M), en phosphatbuffer (pH = 7, 3 x 1 ml, 0,1 M) og en citratbuffer (pH = 9, 3 x 35 1 ml, 0,1 M). Til hver af de 9 opløsninger blev tilsat 3 H-mærket 5-hydroxytryptamin (Amerham catalog nummer TRK.223) (10 nCi, 10 ni, 4 ng), som resulterede i 9 for- 35

DK 165792B

skellige opløsninger med forskellige pH og koncentrationer. pH var 5, 7 og 9 og koncentrationerne af 5-hydroxy-tryptamin var 5, 14 og 104 ug/ml buffer.

5 Til 2x9 polystyren mikrotiterbrønde (Cova-sorb, NUNC Danmark) blev tilsat 2 x 100 nl buffer med 5-hydroxy-tryptamin for hver af de 9 opløsninger. Mikrotiterbrønde-ne blev dernæst bestrålet med "langbølget UV-stråling" (λ>350 nm) fra en Philips TL 20W/09N-lampe i 3 timer ved 10 stuetemperatur og vasket 8 gange med 200 ul vaskebuffer og 2 gange med 100 ul ethanol som beskrevet ovenfor i Eksempel 1.

De samme eksperimenter blev udført uden UV-bestråling, og 15 med "kortbølget" UV-bestråling fra en Philips 57415-P/40 TUV 15 W lampe. Brøndene blev dernæst tømt, adskilt mekanisk og overført til scintillationsbeholdere, hvor fast-faseimmobiliseret radioaktivitet blev bestemt ved anvendelse af væskescintillationstælling i 1,5 ml Ecosicent A 20 (National Diagnostic).

Mængden af immobiliseret hydroxytryptamin er bestemt ud fra standardkurver, der er fremstillet fra en 10 gange fortynding af buffer med 5-hydroxytryptamin (14 ug/ml).

25

RESULTATER

Mængden af immobiliseret 5-hydroxytryptamin afhang af pH og typen af UV-lys (Tabel 4). Mængden af immobiliseret 5-30 hydroxytryptamin var størst efter bestråling med "kort bølget" UV-lys ved neutralt pH, dvs. 8 ng/brønd.

35

DK 165792B

TABEL 4

Kone. Stråling Stråling pH ug/ml Mørke* langbølget UV* kortbølget UV* 5 - 36 9 5 1 20 300 9 14 10 120 700 9 104 0 120 80 10 7 5 1 3 310 7 14 80 70 5000 7 104 500 900 8000 15 5 5 0 12 0 5 14 10 100 90 5 104 1100 1000 3000 *pg immobiliseret 5-hydroxytryptamin 20 EKSEMPEL 8

Immobilisering af 3-indoleddikesyre til polystyren 25 En opløsning af 10 mg/ml 3-indoleddikesyre (Aldrich catalog nr. 1-375-0) i DMSO blev fremstillet. 0,1, 1 og 10 ul 3-indoliseddikesyre i DMSO blev tilsat til en carbonat-buffer (pH = 9), 3 x 1 ml, 0,1 M) en phosphatbuffer (pH = 7, 3 x 1 ml, 0,1 M), og en citratbuffer (pH = 5, 3 x 1 30 ml, 0,1 M). Til hver af de 9 opløsninger blev tilsat 14C-mærket 3-indoliseddikesyre (Amersham catalog nr. CFA.323) (1 uCi, 20 n1, 3 ug), som resulterede i 9 forskellige opløsninger med forskellige pH-koncentrationer. pH var 5·, 7 · og 9 og koncentrationerne af 3-indoliseddikesyre var 5, 35 14 og 104 ug/ml buffer.

37

DK 165792B

Til 2x9 polystyren mikrotiterplader (Cova-sorb, NUNC, Danmark) blev tilsat 2 x 100 μΐ buffer med 3-indoliseddi-kesyre fra hver af de 9 opløsninger. Mikrotiterbrøndene blev dernæst bestrålet med "langbølget" UV-stråling 5 (λ>350 nm) fra en Philips lampe TL 20W/09N i 3 timer ved stuetemperatur og vasket 8 gange med 200 wl vaskebuffer og 2 gange med 100 μΐ ethanol, som beskrevet i Eksempel 1. De samme eksperimenter blev udført uden UV-bestråling, og med "kortbølget" UV-stråling fra en Philips lampe 10 57415-P/40 TUV 15 W. Brøndene blev dernæst tømt, adskilt mekanisk og overført til scintillationsbeholdere, hvor fastfaseimmobiliseret radioaktivitet blev bestemt ved anvendelse af væskescintillationstælling i 1,5 ml Ecoscient A (National Diagnostic).

15 Mængden af immobiliseret 3-indoleddikesyre blev bestemt ud fra standardkurver, der var fremstillet fra 10 gange fortyndet buffer med 3-indoleddikesyre (13 ug/ml).

20 RESULTATER

Mængden af immobiliseret 3-indoleddikesyre afhang af pH og typen af UV-lys (Tabel 5). Mængden af immobiliseret 3-indoleddikesyre var størst efter bestråling med kortbøl-25 get UV-lys, dvs. 12 ng/brønd. Med langbølget UV-lys er det muligt at immobilisere 11 ng/brønd ved pH 5. 1 35

Kone. Stråling Stråling pH ag/ml Mørke* langbølget UV* kortbølget UV* 5 -----—

DK 165792B

TABEL 5 38 9 4 7 6 7 9 13 70 30 70 9 103 230 200 400 10 7 4 2 8 70 7 13 100 30 30 7 103 800 1000 1200 15 5 4 1 12 80 5 13 7 100 100 ’ 5 103 0 1100 9000 *pg immobiliseret 3-indoleddikesyre 20 EKSEMPEL 9

Immobilisering af warfarin til polystyren 25 En opløsning af 10 mg/ml warfarin (Aldrich catalog nr. 10775-1) i DMS0 blev fremstillet. 0,1, 1 og 10 al warfarin i DMSO blev tilsat til en carbonatbuffer (pH = 9, 3 x 1 ml, 0,1 M), en phosphatbuffer (pH = 7, 3x1 ml, 0,1 M), og en citratbuffer (pH = 5, 3 x 1 ml, 0,1 M). Til 3 30 hver af de 9 opløsninger blev dernæst tilsat C-mærket warfarin (Amersham catalog nr. CFA.449) (1 aCi, 20 al, 7 ag) som resulterede i 9 forskellige opløsninger med forskellige pH og koncentrationer. pH var 5, 7 og 9 og koncentrationerne af warfarin var 8, 17 og 107 ag/ml buffer.

Til 2x9 polystyren mikrotiterbrønde (Cova-sorb, NUNC, Danmark) blev tilsat 2 x 100 al buffer med warfarin fra 35 39

DK 165792B

hver af de 9 opløsninger. Mikrotiterbrøndene blev dernæst bestrålet med "langbølget" UV-bestråling fra en Philips lampe TL 20W/09N i 3 timer ved stuetemperatur og vasket 8 gange med 200 al vaskebuffer og 2 gange med 100 ul etha-5 nol som beskrevet ovenfor i Eksempel 1.

De samme eksperimenter blev udført uden UV-bestråling, og med "kortbølget" UV-bestråling fra en Philips lampe 57415-P/40 TUV 15 W. Brøndene blev dernæst tømt, adskilt 10 mekanisk og overført til scintillationsbeholdere, hvor fastfase immobiliseret radioaktivitet blev bestemt ved anvendelse af væskescintillationstælling i 1,5 ml Ecoscient A (National Diagnostic).

15 Mængden af immobiliseret warfarin blev bestemt ud fra en standardkurve, der var fremstillet fra en 10 ganges tyn-ding af buffer med warfarin (17 ug/ml).

RESULTATER

20 Mængden af immobiliseret warfarin afhang af pH og typen af UV-lys. Mængden af immobiliseret warfarin var størst efter bestråling med langbølget UV-lys (Tabel 6), 300 ng/brønd ved pH = 5.

25 1 35 TABEL 6

Kone. Stråling Stråling pH ug/ml Mørke* langbølget UV* kortbølget UV* 5 ---

DK 165792B

40 9 8 0 808 7 9 17 10 20 20 9 107 200 200 80 10 7 8 0 1 5 7 17 0 20 20 7 107 60 90 80 15 5 8 1 2 10 5 17 0 20 100 5 107 0 300 200 *pg immobiliseret warfarin 20 EKSEMPEL 10

Forstærket kobling af PS12 på polystyren mikrobrønde ved anvendelse af aktivatormolekyler f.eks. parabenzoquinon 25

En stamopløsning af parabenzoquinon, Merck artikel nr. 802410, blev fremstillet i en koncentration på 10 mg/ml DMSO. Stamopløsningen blev indstillet ved +4 °C.

30 PS12-stamopløsningen (10 mg/ml DMSO) blev fortyndet til 4 Mg/ml i phosphatsaltbuffer, pH 7,3, 2 M CaCl. Parabenzoquinon blev tilsat i en 2 ganges fortyndingsserie for at give slutkoncentrationer fra 0-500 ug/ml. 1 100 μΐ PS12 parabenzoquinonsuspension blev pipetteret til hver brønd af et Mikrowellmodul (Nunc-Immuno modul C12, A/S NUNC, Danmark).

41

DK 165792B

Koblingen blev udført ved bestråling af de fyldte brønde i 1 time ved anvendelse af en Philips UV-lampe, type TL20W/09N. Afstanden mellem lampen og Mikrowellmodulet var 20 cm.

5

Hver brønd blev vasket 3 gange ved anvendelse af 350 μΐ vaskeopløsning (phosphatsaltbuffer, pH 7,2, 2 M NaCl,

Triton®X-100), og kobling af PS12 på Mikrowellmodulet blev detekteret ved tilsætning af en blanding af avidin 10 (Sigma nr. A-9390) og peberrodsperoxidase der var konjugeret til avidin (Dakopatts kode P347, lot 047), 100 dl/brønd, ved en koncentration på 4 wg/ml og 0,45 ug/ml.

Brøndene blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur og 15 ' vasket 3 gange med vaskebuffer (350 ul/brønd).

Substratreaktionen blev udført ifølge procedure, der er beskrevet i Eksempel 1.

20 Den optiske tæthed blev aflæst ved anvendelse af et Jasco Immuno Reader NJ-2000 (Nippon InterMed, Japan).

Det viste sig (fig. 8), at tilsætningen af parabenzoqui-non ved en koncentration på op til ca. 12 ug/brønd har en 25 forstærkende virkning på koblingen af PS12 til polysty-renMikrowellmodulet. For koncentrationer af parabenzoqui-non over dette niveau falder koblingen imidlertid. Bindingen af PS12 modstod successiv behandlinger med 0,1 % natriumdodecylsulfonat (SDS), 1 M eddikesyre og 5 M NaCl 30 hver i 1/2 time.

35 EKSEMPEL 11

DK 165792B

42

Kobling af biotin-N-hydroxysuccinimidester (NHS-d-biotin) bil polystyren fastfase modificeret med N,N'-dimethylhe-5 xandiamin-8-propyloxypsoralen (PS14)

En arbejdsopløsning af PS14 med formlen

I MJ

0 ? 1 15 dvs. 500 ug/ml PBS, pH 8,2, 2 M NaCl blev fremstillet ud ' 20 fra en PS14-stamopløsning på 10 mg/ml DMSO.

100 i*l PS14 arbejdsopløsning blev tilsat til hver brønd af et Nunc-Immuno modul C12, A/S NUNC, Danmark, og bestrålet i 1 time i en afstand på 20 cm fra en UV-lyskilde 25 (Philips, type TL20W/Q9N).

Hver brønd blev vasket 3 gange med demineraliseret vand, NHS-d-biotin (Hoechst, lot nr. 410074, Calbiochem) blev dernæst tilsat i en 2-ganges fortyndingsserie med start-30 koncentration på 125 ug/ml carbonatbuffer, pH 9,6, 0,005 M (1,59 g, Na2C0g, 2,93 g NaHCO^, til 1000 ml destilleret vand).

Mikrowellmodulerne blev inkuberet i 2 timer ved stuetem-35 peratur. Hver brønd blev dernæst vasket 3 gange med vaskeopløsning som beskrevet tidligere.

43

DK 165792B

Koblingseffektiviteten af biotin blev synliggjort ved benyttelse af en blanding af avidin og peberrodsperoxidase, der var konjugeret med avidin, som beskrevet ovenfor. 'Substratreaktionen blev aflæst ved anvendelse af Jasco's 5 Immuno Reader NJ-2000.

Resultatet er vist på fig. 9, og det ses, at der er en enestående korrelation mellem mængden af tilsat NHS-d-biotin og niveauet af det opnåede signal, hvilket indike-10 rer, at koblingen af NHS-d-biotin til PS14 er forekommet.

Dette viser yderligere det faktum, at tilsætning af NHS-d-biotin med en koncentration på 125 μg/ml til ikke-modi-ficerede brønde, men i øvrigt behandlet som ovenfor, vi-15 ser et middelsignalniveau på blot 0,077 OD-enheder. Middelbaggrundssignalet af PS14 var 0,094 OD-enheder.

Bindingen af PS14 modstod behandlinger med 0,1 % SDS, 1 M eddikesyre og 5 M NaCl.

20

Fremstilling af formel-II forbindelser

Fremstillingen af nogle forbindelser med den almene formel II, der er bundet til psoralen, er illustreret i de 25 følgende Eksempler A-C. Reaktionsskemaet nedenfor viser de fremstillede forbindelser. 1 35

DK 165792B

44 * 1 CHjCl n CHjCl ο^ο-^-σ 0/(Ρ©Ο CH) . OCH] ru 5 M * i€ * jj£J^ o4w i —— HCs-slir HN^ ' OCH, CH,

* ^ ’ £QQ

0<^%^8r 10 i, * HCl f J^QQ THi

15 CHjfO

20 EKSEMPEL Å N, N1 -dimethyl-N- [3-(8-psoralenyloxy)propyl]cysteamin (3a) O, 5 g (1,6 mmol) N-tert. butoxycarbonyl-N,N’ -dimethyl- 25 cysteamin (1), 0,4 g (1,6 mmol) 3-brompropyloxypsoralen (Antonello, C., Magno, S.M., Gia O., Carlassare, F., Bac-cichetti, F., and Bordin, F.: Il Farmaco, Ed. Sci. 34, 1979, s. 139) (2a) og 0,5 g K2C03 blev blandet i 20 ml CHC13. Blandingen blev omrørt i 72 timer og derpå inddam-30 pet til tørhed. Chromatografi af resten på silicagel med 5% methanol i methylenchlorid som eluent gav 0,46 g (60 %) N-Boc-N, N * -dimethyl -N1 - [ 3 - (8 -psoralenyloxy) propyl ] - cysteamin, hvoraf 0,22 g blev opløst i eddikesyre med mættet med 20 ml hydrogenchlorid. Efter 40 minutter ved 35 stuetemperatur udfældedes forbindelsen 3a, 2 HCl, 2 H^O.

45

DK 165792 B

Analyse:

Beregnet for ^ø^gN-^O^S^ ^ H<^1, 2 H20: C 45,20 H 6,07 N 5,27 S 12,06 Cl 13,34 5 Fundet: C 45,03 H 5,25 N 5,29 S 12,45 Cl 13,75.

IR-Spektrum (KBr): > = 2900 og 3000 (NH), 1720 (CO), ΓΠ3Χ 1590 cm 1.

10 Massespektrum El/MS, m/e: 422 (M).

^-NMR-spektret var i udmærket overensstemmelse med den angivne struktur.

15 EKSEMPEL B

N, N’-dimethyl-N-[((8-methoxy)psoralen-5-yl)methyl]cyste-amin (3b) 20 0,7 g (2,4 mmol) N-Boc-N,N'-dimethylcysteamin (1) 0,65 g (2,4 mmol) 5-chlormethyl-8-methoxypsoralen (Aboulezz, A.F., El-Attar, A.A., and El-Sockary, M.: Acta Chim.

Acad. Sci. Hung. 77, 1973, s. 208) (2b) og 0,5 g K2C03 blev blandet i 25 ml DMF. Blandingen blev opvarmet til 70 25 °C i 3 timer og derpå inddampet til tørhed. Chromatografi af resten på silicagel med ethylacetat/toluen (5-25% lineær gradient) som eluent gav 0,63 g (51 %) N-Boc-N,Ν'-dimethyl-N-[((8-methoxy)psoralen-5-yl)methyl]cysteamin.

O, 45 g af denne forbindelse blev beskyttet som beskrevet 30 ovenfor for forbindelsen 3a. Tilsætning af ethylacetat udfældede 0,3 g (70 %) forbindelsen 3b, 2 HC1, H20, smp. 208-210 °C.

35

DK 165792B

46

Analyse:

Beregnet for ci9H24N2°4S2' ^ HC1i- 1/3 1^0: C 46,53 H 5,55 N 5,71 S 13,07 Cl 14,46 5 Fundet: C 46,35 H 5,51 N 5,42 S 12,62 Cl 14,17.

IR-Spektrum (KBr): * = 2500 og 3000 (NH), 1720 (CO), 1590 cm 1.

10 Massespektrum El/MS, m/e: 408 (M).

NMR-spektret var i udmærket overensstemmelse med den angivne struktur.

15 EKSEMPEL C

N,N'-dimethyl-N-C((4,8,5’-trimethyl)psoralen-41-yl)me-thyl]cysteamin (3c) 20 0,4 g (1,4 mmol) N-Boc-N,N'-dimethylcysteamin (1), 0,4 g (1,4 mmol) 4’-chlormethyl-(4,8,5'-trimethyl)psoralen (Isaacs, S.T., Shen, J.K., Hearst, J.E., og Rapoport, H.: Biochemistry 16, 1977, s. 1058) (2c) og 0,5 g K^CO^ blev blandet i 30 ml CHCl^. Blandingen blev omrørt i 27 timer 25 og derpå inddampet til tørhed. Chromatografi på silicagel med CHClg som eluent gav 0,48 g (64 %) N-Boc-N,Ν'-dimethyl-N-C ( 4,8,5'-trimethyl)psoralen-4'-yl)methyl]cyste-amin, som blev beskyttet som beskrevet ovenfor for forbindelse 3a. Tilsætning af ethylacetat udkrystalliserede 30 0,40 g (86 %) forbindelsen 3c, 2 HC1, 12 H20, smp. 183- 186 °C.

Analyse: 35 Beregnet for C2iIi28N203S2/ ^ HC1, 2 H^O: C 47,63 H 6,47 N 5,29 S 12,11 Cl 13,39 Fundet: C 47,96 H 6,57 N 5,28 S 12,05 Cl 13,33.

47

DK 165792 B

IR-Spektrum (KBr): * = 2500 og 3000 (NH), 1720 (CO), 1600 cm 1.

Massespektrum FAB/MS (glycerol), m/e: 421 (M + 1).

5 ^-NMR-spektret var i udmærket overensstemmelse med den angivne struktur.

10 15 20 25 30 35

Claims (12)

1. Fremgangsmåde til modificering af en polymeroverflade, 5 kendetegnet ved, at polymeroverfladen bringes i kontakt med en forbindelse I valgt blandt coumariner eller derivater deraf, såsom psoralen eller et i psoralen-derivat, især 31-trimethylamin-8-propoxypsoralen 10 eller N,N'-dimethylhexandiamin-8-propyloxy-psoralen; eller warfarin; og indoler eller derivater deraf, såsom 5-hydroxytryptamin eller 3-indoleddikesyre; 15 eventuelt forbundet med en probe; og at polymeren og forbindelsen I bestråles med elektromagnetisk stråling, der har en bølgelængde kortere end 20 700 nm, fortrinsvis kortere end 400 nm.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bestrålingen udføres ved anvendelse af en vandig opløsning af forbindelsen I fortrinsvis med et pH på fra 25 ca. 5 til ca. 9 og eventuelt indeholdende en ionstyrkeforstærkende forbindelse, fortrinsvis NaCl.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kendetegne t ved, at bestrålingen udføres i tilstedeværelse af 30 benzoquinon.

4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, kendetegnet ved, at polymeren er valgt blandt polystyren, polyethylenglycolterephthalat, polyvinylace- 35 tat, polyvinylchlorid, polyvinylpyrrolidon, polyacrylni- tril, polymethylmethacrylat, polytetrafluorethylen, bu-tylgummi, styren-butadiengummi, naturligt gummi, poly- DK 165792 B ethylen og polypropylen.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de forudgående krav, kendetegnet ved, at proben, som eventuelt er 5 forbundet til forbindelsen I via en koblingsforbindelse, er valgt blandt identificerbare markører, såsom biotin, radioaktive forbindelser, "spin-labels", fluorogene forbindelser, enzymer, enzymsubstrater, pH-farvedannende forbindelser, og haptener; 10 forbindelser, der omfatter reaktive kemiske grupper, såsom reaktive estere, der er i stand til at danne covalen-te bindinger med andre kemiske grupper, reaktive halogen-holdige forbindelser og disulfidholdige forbindelser; 15 ikke-covalente kemiske grupper, såsom ladede eller hydrofobe kemiske grupper med affinitet for forbindelser, der bærer en modsat ladet gruppe eller en hydrofob gruppe, og 20 andre molekyler, såsom proteiner, peptider, lægemidler, mono-, oligo- og polysaccharider, eller nucleinsyrer, og eventuelt substituerede lipider.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at polymeren er polystyren, polyvinylchlorid, eller polyethylenglycolterephthalat, forbindelsen I er 8-pro-pyloxypsoralen, som bærer en probe, der er biotin, og som er forbundet til forbindelsen I via en N, N' -dimethylhe-xandiamin koblingsforbindelse. 30

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polymeren er polystyren og forbindelsen I er 3'-trimethylpropyloxy-8-psoralen. 1

8. Modficeret polymer fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1. DK 165792 B

9. Modificeret polymer ifølge krav 8, kendetegnet ved, at polymeren foreligger i form af en plade, en partikel, et reagensglas eller en teststrimrael.

10. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelse af et molekyle i en prøve, kendetegnet ved, en prøve indeholdende molekylet bringes i kontakt med en modificeret polymer ifølge kravene 8 og 9.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at den faste overflade af polymeren er valgt blandt polymerplader såsom tyndtlagsplader eller mikrotiterpla-der, polymerperler, strimler, målepinde, reagensglas og mikrokugler. 15

12. Fremgangsmåde til immobilisering af et molekyle på en fast overflade, kendetegnet ved, at a) molekylet bringes i kontakt med en forbindelse I, - 20 som defineret i krav 1, om ønsket ved hjælp af en koblingsenhed, ved at bringe kombinationen i kontakt med et polymermateriale og underkaste polymeren,og det kombinerede molekyle og forbindelsen I elektromagnetisk bestråling, der har en bølgelængde kortere 25 end 700 nm, fortrinsvis kortere end 400 nm, eller ved, b) at overfladen af en polymer modificeres ved ét bringe den i kontakt med en forbindelse I, som defineret 30. krav 1, ved hjælp af elektromagnetisk bestråling, der har en bølgelængde kortere end 700 nm, fortrinsvis kortere end 400 nm, og at den modificerede polymeroverflade dernæst bringes i kontakt med molekylet, eventuelt ved hjælp af en koblingsenhed. 35