JPH03502938A - ポリマーの表面を変性するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ボＩマーの　　　・　　るための 発明の詳細な説明 本発明は、ポリマーの表面を変性するための方法に関する。

特に、本発明は、固相ポリマー、好ましくはポリスチレン、ポリ塩化ビニル又は ポリエチレンテレフタレートグリコール上に化合物を固定するための方法に関す る。

発明の背景 固相上への生物分子の固定化は、たとえばクロマトグラフィーとして多くの技法 に、バイオセンサーに、たとえば固相酵素プロセッシング、すなわちペプチド、 オリゴヌクレオチド又は他の化合物の化学的合成のためのバイオリアクターに及 びいわゆる異質性イムノアッセイに広く使用される。

前記異質性イムノアッセイにおいては、抗原又は抗体がキャリヤー、たとえばセ ルロース、アガロース又はポリアクリルアミドに共有結合され得る。しかしなが ら、その化合物が固相、通常ポリスチレン、ポリプロピレン又はポリ塩化ビニル 試験管又はマイクロー力価−プレート上に結合される場合、その化合物の物理的 吸着は、異質性イムノアッセイにおける通常の結合方法であった（Ｅｎｇｖａｌ ｌ　ａｎｄ　Ｐｅａｒｌｍａｎｎ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１９７２、１０９〜１２９ページ）。

しかしながら、受動物理的吸着は不可逆性でなく　（Ｌｅｈｔｏｎｅｎなど、、 　Ｊ、Ｉｗ＋ｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ＋　１９８０．３４〜６１ページ）、 これは、特に抗原／抗体被覆固相が乾燥形で保存される場合、イムノアッセイの 再生能力に影響を及ぼす。また、固相吸着性抗原は、その抗原の三次構造の変性 （リコンホーメーション）によりその対応する抗体により認識され得ない（Ｋｕ ｒｋｉ　ａｎｄＶｉｒｔａｎｅｎ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ＋　 １９８４，６７〜１２２ページ）。

抗原はまた、ＤＮＡの場合におけるように、変性される場合、新規の抗原決定基 を表わすことができる。

プラスチックへの受動結合する能力は、さらに、たとえばタンパク質又は−末鎖 ＤＮＡとしての分子の限定された量に制限される。しかしながら、いくつかのタ ンパク質及び核酸並びに多糖及び小さな分子は、いくつかのタイプのプラスチッ クに直接吸着され得ない。

単純な物理的結合に比べて共有結合は、固相上でのすべての固定された化合物を 定義された手段で方向づけ、それによって固相表面上に最終的に注がれた流体相 に、たとえば抗原、抗体又は酵素触媒部位上の定義された領域を暴露する。これ らの化合物上の抗原エピトープ又は活性部位は、この手段で機能的に存続するこ とができる。分子の不可逆的固定はさらに、固相固定化化合物のそれらの乾燥状 態での貯蔵に関していくつかの利点を有する。なぜならば受動物理的結合は、た とえばいくつかのタンパク質及び核酸を一部変性するからである。

これらの理由のために、抗原、抗体又は他の分子を固相上に共有的に固定するこ とが可能である場合、多くの利点が存在する。

ポリスチレンへのあるタイプの化合物の固相共有固定化は、ここ数年来知られて いる。固相ペプチド及びオリゴヌクレオチド合成は、たとえば固体支持体として 変性されたポリスチレン粒子を用いて行なわれる。しかしながら、これらの変性 方法は、しばしばひじょうに危険な化学薬品及びいくつかの浪費操作段階を含む 、この例は、ペプチド合成に広く使用されているＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄｓ　Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　Ｒｅ５ｉｎの調製である。この樹脂の調製は、ひじょうに発癌性試 薬、クロロメチルメチルエーテルを含み、そしてこの及び他の有機溶媒は、しば しば、プラスチックがその試薬にわずかに溶解するために、濁った表面をもたら す。これは、続く分光光度検出が所望される場合、不便である。

たとえば−〇）ｆ、　　−５Ｏ３Ｈ又は−Ｎｌ２基により予備変性されたポリス チレンが利用できる。これらの予備変性されたポリスチレンを用いる場合、個々 のタイプの変性されたポリスチレンのための粒子の別々の製造が必要である。

マイクロー力価−プレートに使用するためにプラスチック表面上にアミノ基を導 入するための方法はこれまで記載されている（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ 　３．１９８１．１５５〜１６５ページ）、危険な化学薬品、たとえばメタンス ルホン酸、氷酢酸及び発ズ突硝酸を必要とするこの方法は、２日間を要し、そし て十分に機能するフードを必要とする。そのような条件は、環境破壊により大規 模な製造に使用するのには難因である。さらに、これらの方法は一般的に、時間 を要し、そして均等な表面の変性を得るのには難しい。

ポリマー材料の化学的変性は通常、ポリマー表面上に生成物の不均質混合物をも たらす。なぜならば、反応の所望しない生成物から固相に結合する主な官能基を 分離することは不可能であるからである。これは、多かれ少なかれ、たとえばタ ンパク質への異なった結合特異性を有する異なった活性基の混合物をもたらす。

官能基、たとえばＯＨ，Ｎｌ２．　Ｃ０ＯＨ，ＣＨＯ，ＮＣＯ又はＳＣＯを導入 することによりポリマー表面を化学的に変性し又は活性化するためのもう１つの 方法が、ＥＰ特許出願第１５５．２５２号に提案されている。

この出願によれば、固体ポリマー表面が、生物学的活性分子に結合することがで きる少なくとも１つの官能基を有するビニルモノマーの放射線グラフトにより活 性化される。そのポリマー表面は、ホモ重合及び制御されていない自触媒反応を 妨げるために、ビニルモノマーが１−−−又ハ１　、１−二置換される場合、３ 重量％を越えないひじょうに低いモノマー濃度で連鎖移動反応還元溶媒中におけ る溶液中でグラフトされる。ビニルモノマーが１．２−置換される場合、約１０ 重量％の高濃度が用いられ得る。

適用できるビニルモノマーとして、クロトン酸、アクリル酸、アクリル酸エステ ル、アクリルアミド、ビスアクリルアミド、メチロールアクリルアミド、アクリ ル化されたアミン、アクリル化されたエポキシド、アクリル化されたエーテル、 アクリル化されたポリエステル、アクリル化されたポリウレタン、アクリル化さ れたアクリレート、アクリル化された珪素、アクリル化されたシラン、アクリル 化されたホスフェート及びアクリル化されたチタネート、アクロレイン、フェニ ル置換のスチレン誘導体、たとえばＰ−アミノスチレン、チグリン酸、セネコイ ン酸、アンゲリカ酸、及びケイ皮酸を挙げることができる。

この方法は、ビニルモノマーの過剰重合化の固有の危険性により、制御すること は困難である。これは、記載される高い結合能力のために最も考えられる理由で ある。ウェル当たり５〜７河のタンパク質は、たぶん、単一のマイクロー力価− ウエルにおいて単層として固定され得ない、従って、ビニルモノマーが、照射さ れる場合、重合を開始することができないラジカルを形成する溶媒として定義さ れる連鎖移動反応還元溶媒に存在することが必須である。適切な溶媒の例として 、メタノール、ピリジン、水及びメタノールと水との混合物を挙げることができ る。実際、メタノール：水の１：１混合物が使用される。

従って、既知の方法は、照射グラフト重合又はフリーラジカルグラフト重合によ りポリマー表面上で重合できることが知られているビニルモノマーが、重合を妨 げる条件下で照射処理され、そして生物学的活性分子と結合することができる反 応基を放す一分子層に隣接する薄グラフト層としてポリマー表面に結合され得る 認識に基づかれている。

しかしながら、既知方法は多くの欠点を有する。第１に、グラフト方法はひじょ うに時間の浪費である。唯一の試験された放射線源であるγ−放射線でさえ、そ の反応時間は１０〜１２時間である。γ−線は重い健康的な身体の必要条件を提 供し、そしてプラスチックを乳白色にするプラスチックの脱色の傾向が存在し、 そして従って光学測定のために適用されなくなる。

さらに、その方法は酸素を含まない雰囲気及びフリーラジカル開始剤、たとえば ベンゾフェノンを必要とする。

例に提供される情報は、タンパク質の固定化がグラフトポリマーへの共有結合に より達成されることを確実に示さない。

さらに、標準のカップリング剤、たとえばグルタルアルデヒド又はカルボジイミ ド試薬がほとんどの例で使用されている。

これらの試薬は一般的に、表面特性に関係のない増強された結合を導びくタンパ ク賞分子の架橋を引き起こす。

また、γ−線は、ポリマー表面を活性化し、そしてそれによって、それらのタン パク質結合特性を改良することが知られている。

最後に、報告されたタンパク質結合結果は、ポリマー表面の活性化により、そし てγ−線及びカップリング剤の使用の結果によらないことが、確実に実証されて いない。

アリールアジドを含む二官能価試薬はボ゛リマー表面に結合され得ることがこれ まで記載されている（ＤＥ　Ａ　３４３５７４４）。これは、固相にプロティン Ａを添加し、そして続いて、二官能価化合ウニＮ−スクシンイミジル−６−（４ ’−アジド−２′−二トロフェニルーアミノ）−ヘキサノエートを添加すること によって例示された。これは、プロティンＡのアミノ基へのアリールアジド誘導 体の結合をもたらす。この結合体は、続いて光に暴露され、そしてポリマー固相 への共有結合が前提とされた。しかしながら、ポリマー表面とプロティンＡとの 間の共有結合のための証拠は存在しない、なぜならば、アリールアジド化合物の 添加なしに、ポリマー表面に結合するプロティンＡの能力を示すデータが、上記 特許出願に存在しないからである。

さらに、光分解の間、アジド基の分解生成物はプロティンＡ上に存在する多くの 求核基にたぶん結合し、従ってこのタンパク質の凝集体を形成するであろうこと が予測される。さらに、アリールアジドは、たとえば水として求核物質と反応し 、それによって、さらにポリマー表面との可能性ある反応のための可能性を減じ ることが知られている。

市販の試薬Ｎ−（４−アジド−２−ニトロフェニル）−Ｎ′＝（３−ビチオニル アミノープロビル）　−Ｎ’−メチル−１゜３−プロパンジアミン）（ｐｈｏｔ ｏｂｉｏｔｉｎ、　５１ｇ５＋ａ　Ｃａｔ、　Ｎｏ、Ａ７６６７）を光化学的に 用いてポリスチレンをビオチニル化するための研究が行なわれた。この試薬は、 例１で使用される化学リンカ−と類似するリンカ−に連結されるアリールアジド 基を含む、同じ最適な実験を、この例におけるようにして行なった。

但し、ポリスチレン固相のビオチニル化は検出されなかった。

発明の詳細な記載 現在存在する変性方法に関連する欠点を除くために、本発明は、ポリマーの表面 を変性するための方法、特にポリスチレン又は他のプラスチック材料への分子の 光化学的な固定化のための方法を提供する。

本発明は、多くの良く知られた光反応性多環式化合物が、それらが適切な条件下 で電磁線に暴露される場合、種々のポリマー表面に堅く結合される驚くべき発見 に基づかれている。

従って、その広い観点から、本発明は、ポリマー表面と下記一般式Ｉ： 〔式中、Ａは一〇　＋、　−ｓ　−、−３ｅ　＋、　＞ＮＨ，＞ＮＲ’、　−Ｎ Ｈ−Ｏ＋、　−Ｎ＝Ｎ−、＞Ｓ”Ｒ’、　−５−０−、＞Ｓｅ”Ｒ’、　−Ｃ０ −〇　−、−Ｃｏ　　Ｓ　＋、　−ｃｓ−ｏ−、−Ｃ５−３−、ＣＳｅ−０＋、 　−ｃｏ−５ｅ　＋、　−ｃｓ−ＮＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｃｏ−Ｎ（Ｒ’） 　＋。

＞ｐ＝ｏ又は−Ｐ　（−０）（０−）−であり；Ｒ’　はヒドロカルビル又はヒ ドロカルビルオキシであり、このいづれかは、ＮＯ＋　ＮＯｘ＋　ＳＯｚ＋　ｃ Ｎ、　ｏｎ、　””Ｏｓ　ＳＬ　ＳｅＨ。

ＰＯｓ−−、ＰＯｚ−、Ｃｏｏ　　、ハロゲンエポキシド、ＮＨ！、　ＮＨＲ’ 。

ＮＲ’Ｒ”　（ここでＲ”はＲ１について定義されたのと同じ意味を存する）に よりｒＩｔ換され得； Ｒ！、　Ｒ２，Ｒ４及びＲ’（同じであっても良く又は異なっていても良い）は 、Ｈ５ハロゲン、ＮＯ，ＮＯ□、　Ｓｏｗ、　ＣＮ、　ＯＨ，−０゜ＳＨ＋　Ｓ ｅａ、　ｐｏ、−−、ｐｏ！−１ｃｏｏ　　Ｉ　エポキシド、Ｎｉｂ、　ＮＩＩ Ｒ’。

−ＮＲ’Ｒ”又はヘテロシクリルであり、又はＲ１について定義されたのと同じ 意味を有し； Ｘ及びＹ（同じであっても良く又は異なっていても良い）は、Ｒ２−Ｒ５につい て定義されたのと同じ意味を有し、又は Ｘ及びＹは、お互いに隣接し、そして式−ＣＲ’＝ＣＲ’−Ａ’−（ここでＡ′ は上記Ａについて定義されたのと同じ意味を有し、そしてＲ６及びＲ７は同じで あっても良く又は異なっていても良く、Ｒｔ　、　ＲＳについて定義されたのと 同じ意味を有する）で表わされる基を一緒に形成し：そして場合によっては、１ 又は複数のＲ１−Ｒ７がプローブを示す〕で表わされる化合物とを接触し；そし て前記ポリマー及び式Ｉの化合物を’を磁線により照射することを含んで成る、 ポリマーの表面を変性するための方法に関する。

適切な電磁線は、化合物Ｉの光反応性性質、たとえば実際の置換基及びそれらの 周囲環境、たとえば溶媒及び他の溶質に依存する吸収性質に関して選択される。

電磁線照射は好ましくは、７００ｎｍよりも短い波長で行なわれる。

ＵＶＴｉ１域、すなわち１０〜４００ｎｍでの照射が現在、好ましい、実際の化 合物Ｉに依存して、“長い波長”の放射線（＞３５０ｎｍ）が好ましいが、しか しまた“短い波長”　　（＜３５０ｎｍ）も使用され得る。

下記に示されるように、より複雑な光源、たとえば単色、非単色、偏光、非偏光 、干渉、非干渉、連続又は不連続光源の適用が考えられるが、非干渉性ＵＶ−ラ ンプを適用することで十分である。

用語“ヒドロカルビル”とは、水素及び炭素を含んで成る基、たとえば“アルキ ル、アルケニル及びアルキニル基（ここですべては多くても３０個の炭素原子を 含んで成る）；アリール、アルカニル及びアラルキル基（ここで“アルカ”又は “アルキル”成分は多くても３０個の炭素原子を含んで成る）を示し；そして用 語“アリール”とはフェニル、ナフチル、ビフェニル、トリル基、等を示す。

用語′°ヒドロカルビルオキシ”とは、酸素結合を通して残る分子に連結される 上記に定義されたようなヒドロカルビル基を示す。

Ｃ８−３゜アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、イソブ チル、ｔｅｒｔ・ブチル、ｎ−、イソ−及びｔｅｒ　ｔ・ペンチル、ヘキシル、 ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、ペンタデシル、エイコシル、 ベンタコシル及びトリアコンチルであり； Ｃト、。アルケニル基の例は、エチニル、プロペンチル−１、プロペンチル−２ 、ブテン−１−イル、ブテン−２−イル、ペン）−１−エン−イル、ヘプト−１ −エン−イル、等テアリ； Ｃ２−１゜アルキニル基の例は、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル 、等であり；そして ヒドロカルビルオキシ基の例は、酸素原子を通して連結される上記に定義された ようなヒドロカルビル基である。

特に好ましいヒドロカルビル基は、長鎖のアルキル基、すなわち８〜１６個の炭 素原子の基、特にメチル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、 ペンタデシル及びキキサデシルである。

用語”へテロシクリル”とは、好ましくは、ピリジル、ピリミゾニル、ピリジニ ル、フリル、チェニル、イミダゾリル、イソキサゾリル、オキサシリル、チアゾ リル、アクリジニル及びモルホリル、等を示し、これらは、化合物ｌにいづれの 位置にも結合され得る。

用語“ハロゲン”とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを示す。

本発明の特に好ましいＢ様において、化合物Ｉは、任意に置換された下記一般式 のクマリン（ａ）、ベンゾフラン（ｂＩ。

ＺがＯである）、インドール（ｂｔ、ｚがＮＨである）及びアンゲリシン（ｃ） から成る群から選択される：任意に置換されたクマリンは、好ましくは、任意に 置換された下記一般式のソラレン（ｄ）である：上記式（ａ）〜（ｄ）において 、任意の置換基は、Ｒｚ〜Ｒ５について上記で定義されたような基である。

次の記載においては、ソラレンについて言及するが、しかし、一般式Ｉにより包 含される他の化合物も、下記に例示されるのと同じ態様で使用され得る。

ソラレンは１又は複数の置換基を含んで成り、そして少なくとも１つの置換基が 、アミノ基含有成分、好ましくは３−トリメチルアミノプロポキシであることが 好ましい。

任意に置換されたソラレンの例として、８−メチル−３−カルボキシソラレン、 ４．５’　　、８−）リメチルソラレン、３′−トリメチルアミノ−８−プロビ ルオキシソラレンを言及することができる。

二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）中に挿入することができる平面のフロク マリン分子の種類であるソラレンは、“長い波長”　（λ＞３５０ｎｍ）のＵＶ 光により活性化される場合、ＤＮＡに共有結合し、そして架橋するであろう、光 反応が、チミジン及びクマリン中の二重結合並びに環状生成物の形成下でのソラ レンのフラン部分の間に生じる。クマリンはまた、光反応性化合物（たとえば、 ５．７−シメトキシクマリン）であることが知られている（Ｑｕｅｖａｌなど＋ ｌ　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｗ。

９、１９７４．３３５ベージ）。

本発明によれば、ソラレンは、ＮＮ線によりポリマー、たとえばポリスチレンに 結合され、そしてソラレンを通してそのポリマーに分子を共有的に固定すること が可能である。

任意に置換されたクマリンはさらに、ワルファリン及び任意に置換されたインド ールにより、たとえば５−ヒドロキシトリプタミン及び３−インドール酢酸によ り例示される。

本発明の方法に使用されるポリマーは、好ましくは、オレフィンであり、そして ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートグリコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ 塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチル、メタ クリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジェンゴ ム、天然ゴム、ポリエチレンポリ−４−メチルベンチレン、ポリエステル及びポ リプロピレンから成る群から選択され得る。また、シリカ含有材料、たとえばガ ラスも、“ポリマー”として使用され得る。

本発明の方法によれば、予備変性されていないポリマーも使用される。その方法 は、有機溶媒の添加なしに、純粋な水溶液において行なわれ得る。ひじょうに再 現性があり且つ均等なポリマーの変性が得られ、そして透明なポリマー、たとえ ばポリスチレンは、全工程の間、十分に透明のまま存続する。この方法で、たと えば置換されたソラレンを結合するためには、光源に依存して、６０分以下を要 し、そして大規模で容易に行なわれ、そして毒性又は発癌性試薬を含まない。

次の例から明らかなように、ポリマー表面の変性の効率はまた、化合物Ｉの溶液 のｐＨにも依存する。与えられた化合物のための最適ｐｕは、化合物の個々の置 換基及び陽電荷又は負電荷並びに安定性に依存し、そして実験により確立され得 る。

指針として、化合物Ｉの陽性化を回避することが所望される。

従って、アルカリ性のｐｏが、塩基性特性を有する化合物、たとえばアミノ基を 含む化合物のために好ましく、そして酸性特性を有する化合物、たとえばカルボ キシル基を含む化合物のためには、酸性ｐＨが好ましい。実際の目的のためには 、約５〜約９のｐＨが好ましい。

ポリマー表面の変性の効率は、活性化剤の存在下でポリマー及び化合物Ｉを照射 することによって増強され得る。

好ましくは、本発明は、イオン強度増強化合物、たとえばＮａＣｆｌの任意の存 在下での水溶液中で行なわれる。

さらに、溶液へのベンゾキノンの添加は、驚くべきには、ポリマーの変性を改良 する。この活性剤の効果のための理由は明解ではないが、しかしベンゾキノンが 増悪剤として機能するか又はそれがポリマー表面への化合物Ｉの結合に直接関与 しているかいづれかである。

本発明の特に好ましい態様においては、下記一般式■：（Ｌ）　−（Ｕ）　　　 　　　　　　　ｎ〔式中、Ｌは結合単位（スペーサーアーム）又は結合を示し、 そしてＵは下記に定義されるようなプローブを示す〕で表わされる化合物を、上 記で定義されたような一般式■の化合物を通してポリマー表面に結合するための 方法が提供される。

結合単位りは、化合物Ｉ及びＵを連結することができる有機成分（スペーサーア ーム）又は結合である。共有又は非共有結合単位（スペーサーアーム）の例は、 Ｎ、Ｎ’−ジメチルシステアミン（Ｅｌｓｎｅｒなと、、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃ ｈｅａ＋、１４９．１９８５＋５７５〜５８１ページ）、ジアミン、たとえばＮ 、Ｎ’−ジメチルヘキサンジアミン、システアミン、スペルミジン、ノルスペル ミジン（Ｂｕｒｃｈａｒｄｔなど、、　ＪＡＧＳ　４９．１９８４．４１２３〜 ４１２６ページ）、ピペラジン（Ｈａｎｓｅｎなど、、　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｗ、、 　３６．１９８３゜１５１０〜１５１４ページ）、セレノ−ジプロピオン酸、グ リセロール、ヘキサン及びジエチルエテン並びにＥＰ　Ａ　１５６２８７に言及 されているようなスペーサーアームである。

結合された結合単位を有する化合物Ｉの例は、８−プロビルオキシソラレニルー Ｎ、Ｎ’　−ジメチルヘキサンジアミンであり、リンカ−及びプローブを有する 化合物ｌの例は、Ｎｌ−ビオチニル−Ｎ−８−プロビルオキシソラレニルーＮ、 Ｎ’−ジメチルヘキサンジアミンである。

プローブＵは、Ｌに共有又は非共有結合され得るいづれかの種類の化学成分であ り、それによって、化合物■を通してポリマーに固定される。Ｕの例は次のもの である：ａ）適切な技法を用いて固定され得るラベル成分。そのような技法の例 は、ラベル成分と複合体を形成することができるポリペプチド、レクチン又は抗 体を用いることによる、分光分析、放射性同位体、光化学、化学、免疫化学又は 生化学手段を包含する。ラベル成分の例は、ビオチン、放射性化合物、スピンラ ベル、螢光化合物（たとえばフルオレセイン）、酵素又は酵素着色性基質、ｐＨ 着色性化合物（たとえばフェノールフタレイン）又はハブテン（たとえば酵素ラ ベルされた抗体を用いて認識され得る）である。従って、本明細書に使用される 場合、用語“ラベル”とは、直接検出され得る成分及び検出可能な生成物を形成 する反応を通して間接的に検出される反応性成分の両者を包含することを意図す る。

ｂ）他の化学基（たとえばタンパク質上のアミノ基）と共有結合の形成下で反応 することができる反応性化学基を組む化合物（たとえば活性エステルであるＮ− ヒドロキシースクシニックイミドエステル及びｐ−ニトロフェニルエステル）。

他の例は、チオール及びアミノ基の両者と反応する活性ハロゲン含有化合物（た とえば臭化ベンゾイル）、ジスルフィド含有化合物、エポキシド又は光学的活性 化合物（たとえばブルシン）である。

Ｃ）反対の電荷の基又は疎水性基を担持する化合物のための親和性を有する荷電 され又は疎水性化学基を含んで成る非共有反応性化学基。荷電された化学基の例 は、陽電荷を担持する化合物（たとえばタンパク質）のための親和性を有する一 ＮＨ３”及び−５ｌｈ−である。

ｄ）他の分子、たとえば他の化合物のために特定の親和性を有するタンパク質（ たとえば酵素、抗体、レクチン、ヘモグロビン、ヒストン又は非ヒストンタンパ ク質又はホルモン）、ペプチド（たとえばペプチドホルモン）、医薬（たとえば 細胞増殖抑制剤、ビタミン又はペニシリン）、核酸（たとえばＤＮＡプローブ） 、単糖、オリゴ糖又は多糖及び任意に置換された脂質。

従って、本発明の方法は、固定されるべき分子の予備変性を包含するが、ポリマ ーの予備変性は必ずしも包含しない。

これは、ポリスチレンのひじょうに均等な変性をもたらすが、上記のような官能 基の不均質混合物はもたらさない。

さらに、プラスチックへの受動吸着と比べての本発明の方法の利点は、被覆溶液 に界面活性剤の存在にもかかわらず、たとえばタンパク質を固相（ポリマー）に 結合することが可能であることである。これは、界面活性剤溶解性タンパク質が 研究される場合によ（ある。

ソラレンは、さらに、たとえば二重結合として求電子試薬と光反応することが知 られている。他方、了り−ルアジドは、たとえば水及び他の溶媒と光反応するこ とが知られている。

これは、アリールアジドをソラレンよりも不適切にする。

上記言及された方法におけるすべての利点は、本明細書に開示される原理が、化 学的固相合成、たとえばペプチド−又はオリゴヌクレオチド合成のために使用さ れ得ることを包含し、そして特別な利点は、本発明の方法が、ポリマーが透明で ある場合、管又はマイクロー力価−プレート中において直接、分光光度分析にゆ だねられることである。

マイクロー力価−プレート又は管における化学合成が所望されない場合でさえ、 本発明の方法は、他の形での、たとえば粒子としてのポリスチレンの変性のため に同様に適切である。

本発明の興味ある点は、任意の順序で物質をポリマーに結合する工程を実施する ことが可能であることである。第１段階でポリマー及び化合物Ｉを光反応せしめ 、そして次に、結合単位（必要ならば）及びプローブを連結することが可能であ る。他の方法は、化合物１、任意の結合単位及びプローブから成る複合体を構築 し、そして次に、その形成された複合体を光活性化によりポリマーに結合するこ とである。さらにもう１つの方法は、化合物及び結合単位の組合せで開始し、こ の組合せとポリマーとを光反応せしめ、そして最後に、プローブを添加すること である。

この点については、プローブ自体及び／又は結合単位が一般式Ｉの化合物の一部 を構成することができることが注目されるべきである。

一般的に、分子は、下記段階から成る方法により固体表面上に固定され得る。

ａ）前記分子及び一般式■の化合物、場合によっては、結合単位を反応せしめ、 前記組合せとポリマー材料とを接触せしめ、そしてポリマー及び組合された分子 及び化合物Ｉを電磁線照射にゆだねる段階又は ｂ）を磁線照射によりポリマー表面と化合物Ｉとを接触せしめることによってそ のポリマーの表面を変性し、そしてその後、その変性されたポリマー表面及び分 子、場合によっては結合単位を反応せしめる段階。

本発明の方法は、プラスチックに受動的に付着しない化合物（たとえば抗原又は ヘプテン）の共有固定のためにひじょうに適切である。本発明の方法は、マイク ロー力価−プレート、管、ストリップにおいて又は粒子上で直接実施され得る。

従って、その方法はまた、異なったタイプのイムノアッセイに使用される固相の 調製にも利用され得る。

本発明の特定の態様において、固体表面は、ポリマープレート；たとえば薄層プ レート又はマイクロ−力価−プレート、ポリマービーズ、ストリップ、デツプス ティック、試験管及び（微小）球体から選択される。

固相酵素プロセッシング及びアフィニティークロマトグラフィーにおいては、他 の分子に対して特異的親和性を有するタンパク質又は他の化合物が、固相上に固 定されるべきである。次に、分離され又は処理されるべき分子の溶液が、カラム を通され又は固体支持体を含む懸濁液に添加される０次に、分解生成物又は固相 結合化合物が続いて溶離され得る。

クロマトグラフィーに固相として使用される材料は、しばしば、アガロース、ポ リアクリルアミド、デキストラン又はセルロースに基づかれている。これらのす べての物質は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技法に使用される高 圧下で破壊するであろう。本発明に従って共有的に変性されたポリスチレン微小 粒子は、ＨＰＬＣ−カラム又は他のクロマトグラフィーシステムに使用される上 記物質又は珪素含有物質の好都合な代用物である。

酵素処理においては、固相固定化がしばしば所望される。

本発明の方法は、この目的のために、並びに微生物細胞又は他の細胞の固定化の ために使用される。固定化された酵素は、産業廃棄物の精製及び無機化合物の分 離に使用され得る。

たとえばガラスへのたとえば酵素の固定化は、バイオセンサーに使用される。本 発明は、さらにこれらの開発にも適用され得る。

微小球体は、ポリマーに固定された細胞毒性薬物を用いて癌の処置に使用されて 来た。さらに、磁気性ポリスチレン粒子上に固定された抗癌細胞性モノクローナ ル抗体が、自己移植の前、骨髄細胞から癌細胞を分離するために使用されて来た 。本発明は、またこれらの分野にも適用できる。

本発明は、たとえばソラレン化合物を用いて、ラミネート間に光活性グルーとし て、積層されたプラスチックの製造にもまた、適用され得る。それはまた、たと えば着色された化合物に接合されるソラレンを用いて、たとえばポリスチレンに 着色された化合物を共有結合するためにも使用され得る。

化合物Ｉは、次の原理に従っ合成され得る：光活性ベンゾフラン、ソラレンとし てのクマリン及びアンゲリシンを合成し又はそれらを植物又はコールタールから 単離することができる。４．５’　　、８−）リメチルソラレン及び８−メトキ シソラレンは、菌類、たとえばスクレロチナ　セレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔ ｉｎａ　ｓｅｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）から単離され得（Ｓｃｈｅｅｌなど、。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、２．１９６３．１１２７ページ）、そしてベンゾフラン及びク マリンはコールタール又は植物から単離され得る。

ソラレン、たとえば８−置換ソラレンは、置換クマリンの形成を導び（、アセト 酢酸エチルエステルとの反応により２−メチル−３−ヒドロキシ−フェノールか ら合成され得る（Ｒａｎｇａｓｗａｎｉなど、、　Ｐｒｏｃ、Ｉｎｄ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、５ｅｃｔ、Ａ６＋　１９３７＋　１１２ヘーシ）サラに５段階の合成 ：３−ブロモ−２−エンブロバンとの反応、加熱、塩基による処理、臭素との反 応及び最後に、ナトリウムエタルレートによる処理の後、４．５’、８−置換ソ ラレンが形成される（Ｑｕｅｖａｌなど、、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｍｅｄ。

Ｃｈｅｍ、９．１９７４．３３５ページ）、その反応の順序は下記に例示される ： ２−メチル−３−ヒドロキシ−フェノールと他の置換フェノールとを置換するこ とによって、クマリン生成物及び従って、式Ｉの４．５’、８−置換ソラレン上 の置換基を置換することが可能である。代わりに２−メトキシ−３−ヒドロキシ −フェノールを用いれば、最後生成物は、４．５′−ジメチル−８−メチルソラ レンの代わりに４．５′−ジメチル−８−メトキシソラレンであろう。クマリン 中のエステル基が、たとえばアミド、チオエステル、ホスホエステル又はセレノ エステルにより置換される場合、他のフェノール試薬が、出発材料、たとえばヒ ドロキシフェノール中の３−ヒドロキシ基がアミン、チオール、リン又はセレン により置換されている出発材料として使用され得る。その出発材料が２−アミノ −３−メチルフェノールである場合、生成物は、エステルの代わりにアミド（ラ クトンの代わりにラクタム）を有するクマリンであろう。

前記合成の第１段階において酢酸エチルエステルとハロアルカノンとを置換する ことによって、クマリン中のエステル基がさらに置換され得る。２−メチル−３ −ヒドロキシ−フェノール又は２−アミノ−３−ヒドロキシ−フェノールと反応 する場合、アセト酢酸エチルエステルを１−ブロモ−３−ブタノン（Ｃ）１３ｃ ＱｃＨｚｃＨＪｒ）により置換する場合、その生成物は、エステルがエーテル及 びアミンをそれぞれ小置換しているクマリン類似体であろう。

ソラレンの合成はまた、初めにベンゾフラン部分を合成することによっても行な われ得る。２，４−ジメトキシ−３−メチルベンズアルデヒドから開始し、そし てこの化合物を三塩化アルミニウムにより環元し、そしてジエチルブロモマロネ ートと反応せしめることが可能である。これは、置換ベンゾフランを導び（（Ｑ ｕｅｖａｌなど、、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、９＋　１９７４＋３３５ ページ）。追加の６段階の反応は、３−カルベトキシ−８−メチルソラレンを導 びく。その反応順序は下記に示される二 カルベトキシソラレンが硫酸中、氷酢酸溶液により処理される場合、カルボン酸 を含むソラレンが生成される。

反応性基による化合物■の変性は、使用される化合物Ｉのタイプに依存して、ク ロロメチル化生成物をもたらすクロロメチルメチルエーテルにより行なわれ得る 。化合物■が８−メトキシソラレンである場合、生成物は５−クロロメチル−８ −メトキシソラレンであり、そして化合物Ｉが４．５’８−トリメチルソランで ある場合、生成物は、４．５’、８−トリメチル−５′−クロロメチル化生成物 であろう（Ｅｌｓｎｅｔなど、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４９．１９８ ５．５７５〜５８１ページ）、ヨウ化マグネシウム及びジブロモプロパンとメト キシ基とを反応せしめることによて、そのメトキシ基を反応基に転換することも また可能である。使用される化合物Ｉが８−メトキシソラレンである場合、その 得られる生成物は３−プロモープロピルオキシーソラレンであろう、上記に言及 された転換は、下記に示される： 反応性エステル基、たとえばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルは、カル ボキシル基を含む化合物Ｉ中に導入され得る。その導入は、たとえばジオキサン 中、カルボジイミドの存在下でカルボキシル基とＮ−ヒドロキシ−ヌクシンイミ ドとを反応せしめることによって行なわれ得る。

結合単位（スペーサーアーム）の導入（必要なら）は、異なった合成路を用いて 行なわれ得る。化合物■上のすべての位置で結合単位を連結することが可能であ ると思われる。いづれかの化合物（たとえばビオチン、酵素、キラル化合物、医 薬、等）が、結合単位に連結され得る。３−プロモブロピルオキシソラレンが、 アセトン中、Ｎ　’　−Ｌｅｒｔ・ブチルオキシカルボニル−Ｎ’、Ｎ−ジメチ ルヘキサン−ジアミンと共に加熱される場合、結合単位、すなわちＮ’　　ｔｅ ｒｔ・ブチルオキシカルボニル−Ｎ、Ｎ’−ジメチルヘキサンジアミンが、化合 物Ｉに共有結合されるであろう、その後、ｔｅｒｔ・ブチルオキシカルボニルが 、たとえばビオチンにより置換され得る。

他の基の例として、アリールアジド又は他の光反応性化合物を言及することがで きる（Ｅｌｓｎｅｒなど、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４９＋１９８５． ５７５〜５８１ページ）。

本明細書において、次の略語が使用される：ＥＬＩＳＡ　　：酵素結合イムノソ ルベントアッセイｄｓＤＮＡ　　：二本鎖デオキシ−リボ核酸ＨＰＬＣｒ高性能 液体クロマトグラフィーＨＲＰ　　：ホースラディシュ　ペルオキシダーゼＢＳ Ａ　　：ウシ血清アルブミン ＯＤ＝光学密度 ＩｇＭｓＭクラスの免疫グロブリン ＩｇＧｓＧクラスの免疫グロブリン ＲＦ：リウマトイド因子 ＤＭＦ　　ニジメチルホルムアミド ＤＭＳＯニジメチルスルホキシド Ｐ問Ａ：ボリメタクリレート粒子 Ｂｏａ　　：　ｔｅｒｔ・ブトキシカルボニルＰＢＳ　ニリン酸緩衝溶液 本発明は、下記例１〜１１にさらに例示され、そしてソラレンへの化合物■の結 合が、下記例Ａ−Ｃに例示されるであろ例Ｉ ＰＳ１２によるボ１スチレンのビオチニル下記一般式； を有するビオチン−接合ソラレン（ｐｓ１２）を、次の通りにして合成した： エーテル中、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアジド（“ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔ ｈｅｓｉｓ　Ｖ”　、　１５７〜１５８ページ）（２，９ｇ、　２０ｍモル、５ ．２ｄ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　（３０ｍｌ！　）中、Ｎ、Ｎ ’−ジメチル−ヘキサンジアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃａｔ、　Ｎｏ、Ｄ１６１ １０−１）（Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ　４（１）、　４２２ページ）（２，９２ｇ、 ２０ｍモル）の撹拌溶液に滴下した。温度を、外部からの冷却により２０℃で維 持した。添加が完結した後（３０分）、撹拌を室温で１時間続け、その後、水（ ３０ａｙｊりを添加した。その溶液を２ＮのＨ（Ｊにより酸性化（ｐＨ５）　、 そしてエーテルにより抽出した（２×２００ｄ）　、　ＤＭＳＯ／水混合物を６ ＮのＮａＱＨによりアルカリ性にしくｐＨ１１）　、そしてエーテルにより抽出 した（　４　Ｘ　２００ａｙｊり　。

エーテルの蒸発により、黄色の油状物として標記化合物（１）（Ｉ、２ｇ）を得 た。

８−ヒドロキシソーレン　２ 無水ベンゼン（７５ｍ）中、マグネシウム（０，９７ｇ、０．０４モル）の懸濁 液に、ヨード（１０，２ｇ、０．０４モル）を、１時間にわたって添加した。次 に、無水ベンゼン７５Ｉｄを添加し、そしてその混合物を１時間、還流した０次 の日、８−メトキシソラレン（Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ、　Ｎｏ、Ｍ２ＳＯ４）　（ ４，３ｇ、０．０２モル）を添加し、そして１５分間の撹拌の後、残留物が実質 的に乾燥するまで、溶媒を１２０°Ｃで真空下で蒸発した。次に、それを、１６ ５°Ｃで２時間加熱した。その得られた固形物を希硫酸により分解し、そして濾 過した。固形物を水により洗浄し、措置亜硫酸塩溶液に懸濁し、再び濾過し、水 により洗浄し、そして最後にジオキサンから結晶化し、そして無色の結晶（３， ７５ｇ、ｍ、ｐ、　２４６°Ｃ）を得た。

３−ブロモ−８−プロビルオキシソーレン　３８−ヒドロキシソラレン（２）　 （４，０４ｇ　、　２０ｍモル）及びジブロモプロパン（１，６ｇ、８ｍモル） ヲ、炭酸カリウム（２０ｇ）と共にアセトン（４００ｄ）中で２４時間、還流し た。その溶液を濾過し、そして真空下で蒸発した。溶離剤としてクロロホルムを 用いてのシリカゲル上での残留物のクロマトグラフィー処理は、白色粉末として ３−プロモープロビルオキシソラレン（２，６ｇ）を生成した。

ハ■ ３−プロモープロピルオキシソラレン（３）（１，６ｇ　）　及びＮ　−ｔｅｒ ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ、Ｎ’−ジメチルヘキサンジアミン（１）（１，３ ｇ）を、炭酸カリウム（１，８ｇ）と共にアセトン（１００ｄ　）中で混合し、 そして７２時間還流し、その後、それを濾過し、そして真空下で蒸発した。残留 物を氷酢酸中、ＨＣｊ２（２Ｍ）中で１時間撹拌し、そして続いて真空下で蒸発 せしめた。残留物を無水エタノール（２０ｄ）及びトリエチルアミン（１Ｍ１） に溶解し、その後、ヒドロキシスクシンイミド−ビオチン（Ｎｌ２−ｄ−ビオチ ン）（Ｓｉｇａ＋ａ　Ｃａｔ、　Ｎｏ。

８１７５９）　（１，７ｇ　）を添加した。２４時間、撹拌した後、それを真空 下で蒸発せしめ、そしてクロロホルム（２Ｎ２ｍ）により希釈し、その溶液を希 水酸化ナトリウムによりアルカリ性にし、そしてクロロホルム（３Ｎ２ｍ）によ り再び抽出した。

塩基性クロロホルム抽出物をプールし、硫酸マグネシウム上で乾燥せしめ、そし て真空下で蒸発した。残留物をメタノールｌｌ１１に溶解し、その後、塩酸（Ｉ ＯＮ）１００ｍを添加した。その塩酸塩（ＰＳ１２）をエーテルにより沈殿せし め、集め、そして凍結乾燥せしめた。

ボッスチレンへのＰＳ１２の　ム ジメチルスルホキシド中、ＰＳ１２の１０■／ｄ原液を、−４°Ｃで貯蔵した。

蒸留水中、１０倍の希釈を、０．１〜１，０００　ｎ／ｄｉの範囲の濃度でこの 原液から行ない、そして１００ｐ１／ウエルの個々の希釈溶液をボリスチレンマ イクローカ価−プレート（Ｎｕｎｃ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに添加した０ 次に、ツレラップレートを、そのプレート上２０ＣＩ＋の所に配置されたＰｈ１ ｌｉｐｓ　ＴＬ２０Ｗ１０９Ｎランプからの“長い波長”（λ＞３５０ｎｅｗ） のＵＶ−光により、室温で２時間照射し、そしてウェルを洗浄用緩衝液（ＮａＣ ｌ２２９．２ｇ、　ＫＣｆ　　Ｏ，２ｇ、　　０．２　ｇのＫＨ２ＰＯ４，０， ９２ｇのＮａｚＨＰＯ４＋　Ｔｒｉｔｏｎ＠Ｘ−１００，水１，０００ｉｄ、ｐ Ｈ７，２）により８度洗浄した。同じ実験を、マイクロー力価−プレートの照射 を伴わないで行なった。

固相へのＰＳ１２−結合を検出するために、１００ｍ／ウェルのアビジンーホー スラディシュペルオキシダーゼ（アビジン−ＨＲＰ）複合体（Ｓｉｇｍａ）　、 アビジン−ＨＲＰ　２５ｘＳＢＳＡ　１００１ｇ、洗浄用緩衝液１０ｄの溶液を 、ウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄 用緩衝液により３度洗浄し、そして１００ｇ／ウェルの着色性基質を添加した（ 〔クエン酸塩／リン酸塩緩衝液（７，３ｇのクエン酸、１１．８６ｇのＮａｔＨ ＰＯａ＋　ＨｚＯｚ、　１１までの蒸留Ｑｌｄのｏｚｏｚ　（３５％）〕ｌｄ当 たりＯ−フェニルジアミン（Ｓｉｇｓａ）　１　ｍｇ）　、約１０分後、色彩反 応をＩＮのＨ２ＳＯ４１００ＩＩｌにより停止し、そして光学密度（ＯＤ）を、 ＴｉｔｅｒｔｅｋｏＭｕｌｔｉｓｃａｎ　ＥＬＩＳＡ−分光計により読み取った （第１図）。

ソーレンービオチン　４の　目 ＰＳ１２原液を水により希釈い、それぞれ１０ｇ／ｄ及び１００ｎ／ｄの濃度に した。１００ｍ／ウェルの個々の希釈溶液をマイクロー力価−プレートに移し、 種々の時間又は照射時間、ＵＶ−照射し、そして上記のようにして処理した（第 ２図）。

ストレプ　ビジンの ストレブタビジン（Ｚｙｍｅｄ）　（Ｎ留水中において１ｎ／ウエル）を、ＰＳ １２により被覆されたマイクロー力価−プレートの個々のウェルに添加した（０ ．１■／ウエル、１ｇ／ウェル及び１０■／ウエル）。４°Ｃで１２時間後、プ レートを洗浄用緩衝液により液洗浄し、そしてビオチン−ＨＲＰ複合体（Ｓｉｇ ＋ｗａ）　（２５ｇのビオチン−ＨＲＰ、１００■のＢＳＡ、１０ＩＩｌの洗浄 用緩衝液、水）ＬｏｏＩｔｌの溶液を添加し、この後、プレートを３７°Ｃでイ ンキュベートした。１時間後、プレートを洗浄用緩衝液により３度洗浄し、そし てペルオキシダーゼ活性を上記のようにして検出した（第３図）。

結果 ＵＶ−光により照射される場合、ＰＳ１２はポリスチレンに結合できることが示 された。ＰＳ１２−結合を、アビジン−ＨＲＰにより測定した。ＵＶ−光なしで は、ウェル中のビオチン化は、検出され得なかった（第１図）、これは、結合が 共有性質のものであることを強く示す、これは、さらに、ＰＳ１２は、強いアル カリ又は酸性条件下での又はほとんどの有機溶媒による続く処理により除かれ得 ない事実により支持される。従って、その結合は、たとえば４ＮのＨ，ＳＯ４、 ＩＯＮのＮａＯＨ１無水エタノール又はメタノール氷酢酸又は水中、５０％のＤ ＭＳＯによる一晩の処理に対して耐性を有する。

ポリスチレンのビオチル化は、高濃度のＰＳ１２がウェルに添加される場合、高 まった。最大値は、これらの実験において達成されなかった。ＯＤ値は、ＰＳ１ ２の濃度が０．１ｇ／ウェルから１，０００ｇ／ウェルに高まる場合、０．２か ら２．６に高まった。

アビジン−ＨＲＰを用いて、最大ビオチニル化度が、１．５時間の照射の後、達 成されたことが示された。ＯＤ値は、ｌｘのＰＳ１２が使用される場合、０．１ から１．２に上昇し、そして１０ｎのＰＳ１２が使用される場合、０．１から１ ．６に上昇した（第２図）。

ビオチン−１（ＲＰにより検出される場合、固定化されたストシブタビジン上の 遊離ビオチン結合部位の最大数が、ウェルが１　ｗ／　１００ｄ　ＰＳ１２によ り被覆される場合に達成された。

これは、１．３のＯＤ値に対応する。プレートが０．１ｐｇ／ウェル又は１０Ｒ Ｉ／ウエルのＰＳ１２により被覆される場合、遊離ビオチン部位の数は少なくな った。１〜／Ｉ１１以下のＰＳ１２濃度を用いてのビオチン部位の数の低下は、 たぶん、ポリスチレン表面上にビオチンの量の低下によるものであった。ビオチ ン接合ポリスチレン表面に固定されるアビジン−ＨＲＰＯ量は、ＰＳ１２濃度と 十分に相互関係することが第１図に示されているので、第３図に見られる遊離ビ オチン部位の低下は、固相結合ビオチンの量の上昇によるストレゾタビジン上の ビオチン部位の阻止として説明され得る。

ＰＳ１２が使用されない場合、ストレプタビジンは、第３図から明らかなように 、ポリスチレンに結合されなかった。

１躍／ウエルのＰＳ１２が使用される場合、ビオチニル化度は、アビジン−ＨＲ Ｐにより検出される場合、ＯＤ＞３を示し、ところが検出可能な遊離ビオチン部 位は、ビオチン−ＨＲＰを用いる場合、観察されなかった（第１表）。２■／ウ エルのストレブタビジンが個々のウェルに添加される場合、アビジン−ペルオキ シダーゼにより測定される、遊離固相結合とオチンの量は、ＯＤ　＝０．１１１ に低下した。同時に、ビオチン−ＨＲＰにより測定される、遊離ビオチン部位の 量は、ＯＤ〉３に上昇した（第１表）、これは、ストレプタビジンが実際に固定 され、そして固相結合ビオチンのほぼすべてに結合されたことを示す。ビオチン −又はアビジン接合ペルオキシダーゼを用いる場合、たとえば核酸のようなビオ チニル化された化合物の続く結合を従えることがさらに可能であった。

第１表 ビオチン−ペルオキシダーゼ　　０．０７０　　　　　　＞３．０００アビジン −ペルオキシダーゼ　＞３．０００　　　　　　０．１１１例２ Ｌ　Ｍ　リウマトイド　　の°　のための　、へイムノソルベントア・セイ　Ｅ ＬＩＳＡ 固相へのアビジンの受動吸着は、ビオチニル化された化合物、たとえば免疫グロ ブリン又は炭水化物の二次固定化に関連して記載されて来た（アメリカ特許第４ ．５８２．８１０号）０本発明のための典型的な使用は、イムノア・ノセイの開 発であった。

しかしながら、多くの健康な人々は、彼らの血清中に、他の化合物の測定を妨げ ることができる、抗−アビジン抗体を有することが、良く知られている。

他方、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｒｓ）から単離されたストレ ブタビジンは、正常なヒト血清とひじように低む１反応性を示すが、しかしアビ ジンとは異なって、ポリスチレンに受動的に吸着しない（例１）、従って、スト レプタビジンは、ビオチニル化された化合物の二次固定化のための薬剤としてこ の方法においては使用され得ない。

しかしながら、本発明の方法によれば、ストレブタビジンはポリスチレンに固定 され得る。これは、たとえば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ） に使用され得る。これは、ＴｇＭ−リウマトイド因子（ＩｇＭ−ＲＦ）の決定の ためのＥＬＩＳＡ方法により例示される。

これらは、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンのＦｃ（フラグメント結晶可能な）部 分のための親和性を有する、１ｇＭ免疫グロブリンクラスの抗体である。

ポ１スチレンマイクロ−−プレートへのアビジンの慧金 ０、ＩＭの炭酸塩緩衝液（ｐ）１９．５）中、１　ｎｇ　／　Ｍ１〜１　ｍｇ　 ／　ｄの範囲の濃度のアビジンの溶液（１００Ｉ！１）を、変性されていないボ リスチレンマイクローカ価−プレートの個々のウェルに添加し、そして４°Ｃで 一晩インキユベートした。プレートを洗浄用緩衝液により洗浄し、そしてビオチ ン部位の存在を、例１に記載されているようにしてビオチン−１（ＲＰにより検 出した（第４図）。

ボリスチレンマイクローカ価−プレート上でのストレプタビジンの固定化を、例 １に記載されるようにして行なった。

１躍のＰＳ１２を個々のウェルに添加し、そしてプレートを、λ＞３５０ｎｍで のＵＶ光により、室温で２時間照射した。続いて、２■／ウエルのストレプタビ ジンを添加し、３７°Ｃで１時間インキュベートし、そして例１に記載されてい るように３度洗浄した。他の変性されていないボリスチレンマイクローカ価−プ レートを、上記のようにして２■／ウエルのアビジンにより直接被覆した。

ストレプタビジンー及びアビジン−被覆プレートを、１％ＢＳＡを含む洗浄用緩 衝液（希釈緩衝液）により４℃で一晩、阻止した（２００　Ｊ１１／ウェル）。

希釈緩衝液を含む１つのプレートをまた、調製した。

健康な血液供与者からの免疫グロブリンと固相との反応は、それぞれアビジン及 びストレブタビジンを固定した。

１０人の健康な血液供与者からの血清を、ストレプタビジン、アビジン及びＢＳ Ａによりそれぞれ被覆されたプレート上に、希釈緩衝液における１：１００の希 釈溶液１００ｉ！１／ウエルを添加し、そして室温で１時間インキュベートする ことによって試験した。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、 そして）ＩＲＰ−ラベルされたウサギ−抗ヒトＩｇＭ又はＩｇＧの１：１０００ 希釈溶液を添加しく１００ｍ／ウェル）、そして室温で１時間インキュベートし た。固相結合のＨＲＰを、例１に記載しているようにして検出した。

ビオチニル化されたヒトＩ　ｇＧ　（ＶＥＣＴＱＲ）を、固相に固定化されたス トレブタビジンを通して、ＰＳ１２変性ボリスチレンマイクローカ価−プレート に固定した。

希釈緩衝液中、２０ｍ／ｄのビオチニル化されたＩｇＧの溶液（１００ｊ１１／ ウエル）を、上記のように、固定化されたストレブタビジンを含むプレートに添 加し、そしてそのプレートを３７°Ｃで１時間インキュベートした。次に、それ らを洗浄し、そして１０種のＩｇＭ−ＲＦ陽性血清及び１０人の健康な供与者の 血液からの血清の希釈緩衝液中、血清希釈溶液（１：１００）を、２通りに添加 した（１００ｍ／ウェル）。

１ｇＭクラスの免疫グロブリンの結合を、上記のようにして検出した。

結果 第４図においては、受動吸着されたアビジンの量は、ウェルに多量添加される場 合、上昇することが示される。最大ＯＤ値は、２罐が個々のウェルに添加される 場合に得られる。

例１においては、ストレプタビジンは、ビオチニル化されていないポリスチレン を用いる場合、吸着されなかったことが示された。これは、１２５−１によりラ ベルされたストレブタビジンを用いて確証された。

第５図は、それぞれアビジン、ストレブタビジン及びＢＳＡにより被覆されたウ ェル上での１０人の健康な供与者の血液からの血清の試験結果を示す、ＢＳＡに より被覆されたウェルに比べると、有意な数の血清は、アビジンに対して向けら れているＩｇＧ−及びＩｇＭ−抗体を有する。しかしながら、ストレブタビジン により被覆されたウェルに関しては、有意な反応は見出されない。

第６図は、同じ１０人の供与者からの血清及びさらに１０種のＩｇＭ−ＲＦ陽性 血清のＩｇＭ−ＲＦの存在のための試験結果を示す、これは、ストレプタビジン 固定のヒトビオチニル化１ｇＧを含むマイクロー力価−プレートを用いて行なわ れた。すべてのＩｇＭ−ＲＰ陽性血清はまた、このＥＬＩＳＡ−アッセイにおい て陽性であることが見出され、そして健康な供与者の血液からの血清はＩｇＭ− ＲＦを含まなかった。

この場合、ビオチニル化されたＩｇＧは、プレートが乾燥状態で貯蔵される場合 、好都合であるにちがいない固相にひじょうに強く結合された。

水中、０．０５ＮのＮａＣ１２ｒｉを有する３本のビーカーに、ポリメチルメタ クリレート粒子（ＰＭＭＡ）　（ＥＬＡＶＡＳＩＴ２０４１（Ｄｕｐｏｎｔ）） １００■を添加した。ＰＭＭＡを有する２本のビーカーに、ＰＳ１２（ＤＭＳＯ （ジメチルスルホキシド）中において１０■／ｄ）　１０ｍを添加した。それら のビーカーの１本を、そのビーカー上２０１に配置サレタＰｈ１ｌｉｂＳＴＬ２ ０Ｗ１０９Ｎランプカら（７）ＵＶ−光（λ＞３５０ｎｍ）により１時間、照射 し、そしてその内容物を撹拌した。照射の後、ＰＭＭＡ粒子を、洗浄緩衝液（２ ９，２ｇのＮ５Ｃ１，０，２ｇのに１４，０．２ｇのＫＨｚＰＯ４，０，９２ｇ のＮａｚＨＰＯｎ＋ＴｒｉｔｏｎＯＸ−１００，１，ＯＯＯＭＮまでの水、ｐＨ ７，２）１ＭＮにより３度洗浄し、そして水により２度洗浄した。次に、ｌｄの アビジンーベＪレオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）　（２５ｇのアビジン−ペルオキ シダーゼ、１００■のＢＳＡ　、　１０ｄの洗浄緩衝液）を添加し、そしてビー カーを３７°Ｃでインキュベートした。１時間後、ＰＭＭＡ粒子を洗浄緩衝液に より３度洗浄し、きれいなＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、そしてＩＨｌの基質（ １０ｄの水中、３■の２，２′−アデノビス−１３−エチルベンズチアゾリンス ルホン酸（Ｓｉｇ＋ｓａ）　）を添加した。５分後、クエン酸（水１００ｄ中、 ＩＯｇのクエン酸）１００Ｉ１１ヲ個々のビーカーに添加し、そして４１０ｎ■ での光学濃度（ＯＤ）を、水により１０倍に希釈した後、決定した。

結果 第２表 ポリメチルメタクリレ−１−：　　　　　　　　　０．０３０００ポリメチルメ タクリレート十ＰＳ１２　：　　　　　０．２５１００ポリメチルメタクリレー ト＋ＰＳＩ２＋光：　　　１．０１０００結論 ＰＳＬ２は、ＰＭＭＡに光化学的に結合する。

例４ ＰＳＬ３によるポリスチレンのビオチニル放射性ラベルされた３Ｈ−３−）ジメ チルアミン−８−プロボキシソラレン（ＰＳＬ３）　（Ｊ、Ｂ、Ｈａｎｓｅｎな ど、、　Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｃｈｅｓｉｓｔｒｙ　２Ｂ＋　１ ９８５．１００１〜１０１０ページ）の水溶液を、ポリスチレンマイクロー力価 −ウエル（１００ｊｌ！、　１■／Ｍ１゜３、８００．０００ｃｐＩＩ）　（Ｎ ＵＮＣ，デンマーク）に添加し、そして蒸留水により１０×６倍に希釈し、０． ０１／Ｉｇ／ｄの最終濃度にした０次に、マイクロー力価−ウエルを、上記のよ うに室温で２時間、照射し、そして洗浄用緩衝液２００ｐ１により８度洗浄した 。同じ実験が、ＵＶ照射を伴わないで行なわれた。次に、ウェルを空にし、機械 的に分離し、そしてシンチレータ−バイアルに移し、ここで固相固定放射能が、 １０ｄのＩｎｓｔａｇｅｌ　（Ｐａｃｋａｒｄ）中での液体シンチレーション計 数を用いて決定された。

結果 １■／ｄで、８７ｄｇのＰＳＬ３を、光化学的に固定化したが、しかしたった１ ７ｄｇのみが、照射されていないウェルに固定された。１００ｘ／ｄでのＰＳＬ ３の濃度を用いる場合、４８ｄｇが固相に固定されたが、しかし照射されていな いウェルは、バックグラウンド値近くの値を示した（１２■）（第７図）。

１１００１ｔ／ｄ以下の濃度で、ＰＳＬ３の有意な固定化は検出され得ない。た ぶん、バックグラウンド値に比べての希釈溶液中の放射能の低いレベルによるも のであろう。

例５ ＰＳＬ２によるマイクロ−−プレートのビオチニルウェル当たり２パのＰＳＬ２ を用いての、例１に記載されるのと類似する実験を、異なった製造元及び材料の マイクロ−力価−プレートを用いて行なった。

次の丸底マイクロー力価−プレートを用いた：Ｔｉｔｅｒｔｅｋ＠　：　　　　 　ポリ塩化ビニル、Ｃａｔ、　Ｎｏ。

？？−１７３−０５＋　Ｆｌｏｓｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

ＵＳＡ（Ｆｌｏｗ　ＰＶＣ）　　； Ｎｕｎｃ−ｆＩｌｌｕｎｏｐｌａｔｅｓ　　：ポリスチレン、Ｃａｔ、　Ｎｏ、 ４３９４５４．　Ｎｕｎｃ。

デンマーク（ＮｕｎｃＰＳ）　； 結果 第３表に示されるように、すべてのタイプのプレートは、例１に定義されるよう にＵＶ−光により照射される場合、多量のＰＳＬ２を結合した。照射されていな いプレートは、有意な量のＰＳＬ２を結合しなかった。

第３表 プレートタイプ　照射された　照射されていないＦｌｏｗ　ＰＶＣ１，０９０， ２Ｏ Ｎｕｎｃ　ＰＳ　　　　　　１．１１　　　　　　０．１２Ｇｒｅｉｎ　ＰＳＨ Ｏ，９００，１０ Ｇｒｅｉｎ　ＰＳＬ　　　　　１．４５　　　　　　０．０８Ｃｏｓｔ　ＰＳ　 　　　　　Ｏ，８４０，１０Ｃｏｓｔ　ＰＥＴＧ　　　　　Ｏ，６８０，１１例 ６ マイクロ−−プレートのビオ　ニル　に・　るイオン渡ｍ 照射期間の間、蒸留水の代わりにＮａＣｉＬ溶液（ＩＭ）を用いて、例５に記載 されるのと類似する実験を行なった。ポリマーのビオチニル化度は、５０〜１０ ０％高められた。

例７ ポリスチレンへの５−ヒドロキシ　１プ　ミンのＤＭＳＯ中、１０　ｍｇ　／　 ｍｌの５−ヒドロキシトリプタミン（Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号１０７７５− １）の溶液を調製した。　ＤＭＳＯ中、それぞれ０．１．１及び１０ｄの５−ヒ ドロキシトリプタミンを、炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝５．３ｘｌＩＩ１１，０．１Ｍ ）　、リン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．３Ｘ１ｄ、０．１Ｍ）及びクエン酸塩緩衝液 （ｐＨ＝９゜３Ｘ１ｍ、０．１Ｍ）に添加した０次に、９種の溶液のそれぞれに 、異なったｐｉ（及び濃度を有する９種の溶液をもたらす３Ｈ−ラベルされた５ −ヒドロキシトリプタミン（Ａｓｅｒｓｈａ曽カタログ番号ＴＲＫ、２２３）　 （１０ｐｃｉ　、　１０ｍ　、　４　ｇ）を添加した。

ｐＨは、５，７及び９であり、そして５−ヒドロキシトリプタミンの濃度は緩衝 液１ｄ当たり５，１４及び１０４眉であった。

２×９個のボリスチレンマイクローカ価−ウエル（Ｃｏｖａ−５ｏｒｂ、　ＮＵ ＮＣデンマーク）に、９種の溶液のそれぞれからの５−ヒドロキシトリプタミン を有する２Ｘ１０ＱＩＩｌの緩衝液を添加した。次に、マイクロー力価−ウエル を、Ｐｈ１ｌｉｐｓランプＴＬ　２０Ｗ１０９Ｎからの“長い波長”　（λ＞３ ５０ｎｍ）のＵＶ−光により室温で３時間照射し、そして洗浄用緩衝液２００ｍ により８度及びエタノール１００ｄにより２度、例１に記載されているようにし て洗浄した。

同じ実験を、ＵＶ照射を伴わないで及びＰｈ１ｌｉｐｓランプ５７４１．５−Ｐ ／４０　ＴＵＶ　１５Ｗからの短い波長のＵＶ線により行なった。次に、ウェル を空にし、機械的に分離し、そしてシンチレータ−バイアルに移し、ここで面相 固定化放射能が、１、５　ｄのＥｃｏｓｃｉｅｎｆ、　Ａ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　 Ｄｉａｇｎｏｓｔｔｃ）における液体シンチレーション計数を用いて決定された 。

固定されたヒドロキシトリプタミンの量を、５−ヒドロキシトリプタミン（１４ １！ｇ／Ｍｉ）を含む緩衝液の１０倍希釈溶液から調製された標準曲線から決定 する。

結果 固定された５−ヒドロキシトリプタミンの量は、ｐＨ及びＵＶ光のタイプに依存 した（第４表）、固定された５−ヒドロキシトリプタミンの量は、中性ｐＨで、 短い波長のＵＶ光により照射された後、最大、すなわち８　ｎｇ／ウェルであっ た。

第４表 ＊　固定された５−ヒドロキシトリプタミン（Ｐｇ）。

例８ ボテスチレンへの３−インドール　　のＤＭＳＯ中、１０Ｍ／ｄの３−インドー ル酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号！−３７５−０）の溶液を調製した。ＤＭ ＳＯ中、それぞれ０．１　、１及び１０ｐ！の３−インドール酢酸を、炭酸塩緩 衝液（ｐＨ＝９゜３Ｘ１４．０．１Ｍ）、リン酸塩緩衝液（ｐｔｌ＝７　、３Ｘ ＩＭｌ。

０．１Ｍ）及びクエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝５．３ｘｌｄ、０．１Ｍ）に添加した ０次に、９種の溶液のそれぞれに、異なったｐｆｌ及び濃度を有する９種の溶液 をもたらす１４Ｃ−ラベルされた３−インドール酢酸（＾＋＊ｅｒｓｈａｍカタ ログ番号ＣＦＡ、３２３）　（１μＣｉ。

２０ｄ　、　３■）を添加した。　ｐＨは、５．７及び９であり、そして３−イ ンドール酢酸の濃度は緩衝液１ｄ当たり５，１４及び１０４躍であった。

２×９個のボリスチレンマイクローカ価−ウエル（Ｃｏｖａ−５ｏｒｂ、　ＮＵ ＮＣデンマーク）に、９種の溶液のそれぞれからの３−インドール酢酸を有する ２Ｘ１００／ｆの緩衝液を添加した。

次に、マイクロー力価−ウエルを、Ｐｈ１ｌｉｐｓランプＴＬ　２０Ｗ１０９Ｎ からの“長い波長”　（λ＞　３５０躍ｍ）のＵＶ−光により室温で３時間照射 し、そして洗浄用緩衝液２００ｍにより８度及びエタノール１００Ｉにより２度 、例１に記載されているようにして洗浄した。同じ実験を、ＵＶ照射を伴わない で及びＰｈ１１ｉｐｓランプ５７４１５−Ｐ／４０　ＴＵＶ　１５Ｗからの短い 波長のＵＶ線により行なった０次に、ウェルを空にし、機械的に分離し、そして シンチレータ−バイアルに移し、ここで固相固定化放射能が、１．５　ｄのＥｃ ｏｓｃｉｅｎｔ　Ａ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）における液体 シンチレーション計数を用いて決定された。

固定された３−インドール酢酸の量を、３−インドール酢酸（１３ａｇ／ｄ）を 含む緩衝液の１０倍希釈溶液から調製された標準曲線から決定する。

結果 固定された３−インドール酢酸の量は、ｐＨ及びＵＶ光のタイプに依存した（第 ５表）、固定された３−インドール酢酸の量は、短い波長のＵＶ光により照射さ れた後、最大、すなわち１２ｎｇ／ウェルであった。長い波長のＵＶ光に関して は、ｐＨ＝５でｌｌｏｇ／ウェルを固定することが可能である。

第５表 ＊　固定された３−インドール酢酸（Ｐｇ）。

ＤＭＳＯ中、１０ｇ／ｄのワーファリン（Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号１０７７ ５−１）の溶液を調製した。ＤＭＳＯ中、それぞれ０．１　、１及び１０Ｉのワ ーファリンを、炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝９．３Ｘ１ｍ。

０．１Ｍ）、リン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．３Ｘ１ｄ、０．１Ｍ）及びクエン酸塩 緩衝液（ｐＨ＝５．３Ｘ１ｍ、０．１Ｍ）に添加した。次に、９種の溶液のそれ ぞれに、異なったｐＨ及び濃度を有する９種の溶液をもたらす３Ｃ−ラベルされ たワーファリン（＾ｔａｅｒｓｈａｔａカタログ番号ＣＦＡ、４４９）　（１ｕ ｃｉ　、　２０．ｍ　、　７　ｇ）を添加した。　ｐＨは、５．７及び９であり 、そしてワーファリンの濃度は緩衝液ｌａｄ当たり８，１７及び１０７汀であっ た。

２×９個のボリスチレンマイクローカ価−ウエル（Ｃｏｖａ−Ｓｏｒｂ、　ＮＵ ＮＣデンマーク）に、９種の溶液のそれぞれからのワーファリンを有する２Ｘ１ ００ｍの緩衝液を添加した０次に、マイクロー力価−ウエルを、Ｐｈ１ｌｉｐｓ ランプＴＬ　２０Ｗ１０９Ｎからの“長い波長″　（λ＞３５Ｏｎ＋ｓ）のＵＶ −光により室温で３時間照射し、そして洗浄用緩衝液２００　ｄにより８度及び エタノール１００Ｉにより２度、例１に記載されているようにして洗浄した。

同じ実験を、ＵＶ照射を伴わないで及びＰｈ１ｌｉｐｓランプ５７４１５−Ｐ／ ４０　ＴＵＶ　１５Ｗからの短い波長のＵＶ線により行なった１次に、ウェルを 空にし、機械的に分離し、そしてシンチレータ−バイアルに移し、ここで固相固 定化放射能が、１、５　ｄのＥｃｏｓｃｉｅｎｔ　Ａ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃ）における液体シンチレーション計数を用いて決定された。

固定されたワーファリンの量を、ワーファリン（１７ｔａｒ　／　ｄ　）を含む 緩衝液の１０倍希釈溶液から調製された標準曲線から決定する。

結果 固定されたワーファリンの量は、ｐＨ及びＵＶ光のタイプに依存した（第６表） 。固定されたワーファリンの量は、ｐＨ＝５で、長い波長のＵＶ光により照射さ れた後、最大、すなわち３００ｎｇ／ウェルであった。

第６表 ＊　固定されたワーファリン（Ｐｇ）。

例１０ パ、たとえばバー−ベンゾキノン　　いてのボ１スチレンマイクロウェル上への ＰＳ１２の　　　れた　人バラーベンゾキノンの原液（Ｍｅｒｃｋ　Ａｒｔ、８ ０２４ＩＱ）ＤＭＳＯに希釈し、１０■／ｄの濃度にした。その原液を、＋４° Ｃで貯蔵した。

ＰＳ１２　（ＤＭＳＯ中、１０■／ｄの原液）を、リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７， ３、２ＭのＣａＣｌ　ｔ）中に希釈し、４Ｉｔｇ／ｄにした。バラ−ベンゾキノ ンを、２倍の一連の希釈度で添加した。（０〜５００Ｉ！ｇ／ｄの最終濃度を付 与した。）。

ＰＳ１２パラ−ベンゾキノン懸濁液１００Ｉを、ＭｉｃｒｏＷｅｌｌモジュール （Ｎｕｎｃ−１ｍｍｕｎｏ　Ｍｏｄｕｌｅ　Ｃ１２＋　Ａ／　Ｓ　ＮＵＮＣ、デ ンマーク）の個々のウェルにピペットで添加した。

結合は、Ｐｈ１ｌｉｐｓ　ＵＶ７７ブ、タイプＴＬ　２０Ｗ１０９Ｎを用いて、 充填されたウェルを１時間、照射することによってなされた。ランプとＭｉｃｒ ｏＷｅｌｌとの間の距離は２０ｃｍであった。

個々のウェルを、洗浄用溶液（リン酸塩緩衝溶液、ｐＨ７，２゜２ＭのＮａＣ１ 、ＴｒｉｔｏｎＯＸ−１００）　３５０Ｉｉを用いて３度洗浄し、そしてＭｉｃ ｒｏＷｅｌ　ｌ上へのＰＳ１２の結合を、アビジン（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ。

Ａ−９３９０）及びアビジンに接合されたホースラデイシュペルオキシダーゼ（ ＤａｋｏｐａｔｉｓコードＰ３４７、ロット０４７）の混合物（それぞれ４　ｔ ａｒ　／　Ｍｌ及び０．４５ｇ／ｌｄの濃度で）を、ウェル当たり１００Ｉで添 加することによって検出した。

室温で２時間インキュベートし、そして洗浄用緩衝液により３度洗浄した（３５ ０ｍ／ウェル）。

基質反応を、例１に記載される方法に従って行なった。光学密度を、Ｊａｓｃｏ 　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ　Ｒｅａｄｅｒ　ＮＪ−２０００（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄ。

Ｊａｐａｎ）を用いて読んだ。

ウェル当たり約１２眉までの濃度でのバラ−ベンゾキノンの添加は、ポリスチレ ンＭｉｃｒｏＷｅｌｌ上でのＰＳ１２の結合に対する増強効果を有したことが示 される（第８図）。しかしながら、このレベル以上のバラ−ベンゾキノンの濃度 は、結合を低めた。　ＰＳ１２の結合は、それぞれ０．１％のナトリウムドデシ ルスルホネート（ＳＯＳ）　、Ｉ　Ｍの酢酸及び５ＭのＮａＣｌによる１／２時 間の連続処理に対しての耐性を有した。

例１１ 下記一般式： で表わされるＰＳ１４の使用液（５００鴻／−〇ＰＢＳ、　ｐＨ８，２、２Ｍの Ｎａｃｆ）を、ＰＳ１４原液（１０ｍｇ／　ｘｒｌのＤＭＳＯ）から製造した。

ＰＳ１４の使用液１００１１！を、Ｎｕｎｃ−１ｍｎ＋ｕｎｏ　Ｍｏｄｕｌｅ　 Ｃ１２（Ａ／Ｓ　ＮＵＮＣ−、デンマーク）の個々のウェルに添加し、そしてＵ Ｖ光源（Ｐｈｉｌｉｐｓ、タイプＴＬ　２０Ｗ１０９Ｎ）から２０ａ＋＋の距離 で１時間照射した。

個々のウェルを脱イオン水により３度洗浄し、次にＮＨ３−ｄ−ビオチン（Ｈｏ ｅｃｈｓｔ、ロフト番号４１００７４．　Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅ＋＊）を、１２５ ｘ／ｄの開始濃度の炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６、０，００５Ｍ（１，５９ｇのＮ ａｚＣＯｉ＋　２．９３　ｇのＮａＨＣＯ：＋、１００００　ｒｔｄの蒸留水） により２倍希釈にして添加した。

ＭｉｃｒｏＷｅｌｌモデュールを、室温で２時間インキュベートした０次に、個 々のウェルを、前記のようにして洗浄用緩衝液により３度洗浄した。

ビオチンの結合効率を、上記のようにしてアビジンとホースラディシュベルオキ シダーゼ接合アビジンとの混合物を用いて可視化した。基質反応を、Ｊａｓｃｏ 　Ｉ＋＋ｖ＋ｕｎｏ　Ｒｅａｄｅｒ　ＮＪ−２０００を用いて読んだ。

結果は第９図に示され、そして見られるように、添加されたＮＮ５−ｄ−ビオチ ンの量と得られたシグナルレベルとの間に卓越した相互関係が存在し、これは、 ＰＳ１４へのＮ）ＩＳ−ｄ　−ビオチンの結合が生じたことを示す。

これは、さらに、変性されていない（但し、上記のように処理されている）ウェ ルへの１２５處／ａｆの濃度のＮＨＳ−ｄ　−ビオチンの添加がたった０、０７ ７００単位の平均シグナルレベルを示した事実により示される。ＰＳ１４の平均 バックグラウンドシグナルは、０．０９４００単位であった。

ＰＳ１４結合は、０．１％のＳＤＳ、ＩＭの酢酸及び５ＭのＮａＣ１による処理 に対して耐性を有した。

人工上金立■囲１ ソラヘンに結合される、一般式■のいくつかの化合物の調製が次の例Ａ−Ｃに例 示される。下記スケムは、調製された化合物を示す。

Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ、Ｎ’−ジメチルシステアミン（１）（ ０，５ｇ、　１．６ｍモル）、３−プロモプロピルオキシソラレン（Ａｎｔｏｎ ｅｌｌｏ、　Ｃ，、Ｍａｇｎｏ、　Ｓ、Ｍ、、　Ｇｉａ　Ｏ，。

Ｃａｒｌａｓｓａｒｅ＋　ｐ、Ｉ　Ｂａｃｃｉｃｈｅｔｔｉ、　Ｆ、、及びＢｏ ｒｄｉｎ、　Ｆ、　：　ＩｆＦａｒｍａｃｏ、　Ｅｄ、Ｓｃｉ、３４＋　１９７ ９．１３９　ページ）（２ａ）（０，４ｇ。

１．６ｍモル）及びにＩＣ０３（０，５ｇ　’）を、ＣＨＣｆ　３　（２０ｍ　 ＞中で混合した。その混合物を７２時間撹拌し、そして続いて、蒸発により乾燥 せしめた。溶離剤として塩化メチレン中、５％メタノール溶液を用いてのシリカ ゲル上での残留物のクロマトグラフィー処理は、Ｎ　−Ｂｏｃ　−Ｎ　、　Ｎ’ −ジメチル−Ｎ’−〔３−（ソラレニルオキシ）プロピルコシステアミン（０， ４６ｇ、６０％）を生成し、この０．２２ｇを塩化水素（２０ｄ）により飽和さ れた酢酸溶液に溶解した。室温で４０分後、（化合物３　ａ　、　２ＨＣｆ　、 　２１ｈＯ）が沈殿した。

分析： ＣｚｏＦｌｚＪｚＯ４Ｓｚ　、　２ＨＣ／！　、　２Ｈ！Ｏ：実測値：Ｃ４５， ２０）１６．０７　　Ｎ５．２７　３１２．０６　　ＣＩ！、１３．３４計算値 ：Ｃ４５，０３Ｎ５．２５　　Ｎ５．２９　　Ｓ１２．４５　　Ｃ１３，７５゜ ＩＲ−スペクトル（ＫＢｒ）　　：　ｖ、、、　＝２９００及び３０００　（Ｎ Ｈ）　。

１７２０（ＣＯ）、　１５９０ＣＩｌ−’。

質量スペクトルＥ　ｉ　／　ｔｒｓ　、　ｍ　／　ｅ　：　４２２（Ｍ　）。

’ＨＮＭＲスペクトルは、与えられた構造と卓越して一致した。

例Ｂ Ｎ　　Ｎ’−ジメチル−Ｎ−（（８−メトキシ　ソーシン−５−イル　メチル　 システアミン　３ｂ Ｎ　−Ｂｏａ　−Ｎ　、　Ｎ’−ジメチルシステアミン（１）（０，７ｇ。

２．４ｍモル）、５−クロロメチル−８−メトキシメチレン（Ａｂｏｕｌｅｚｚ 、　Ａ、Ｆ、、　Ｅｌ−Ａｔｔａｒ、　Ａ、Ａ、、及びＥｌ−５ｏｃｋａｒｙ、 　Ｍ、　：Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｈｕｎｇ、７７＋　　１９ ７３．２０８　ページ）（２ｂ）（０，６５ｇ、２．４ｍモル）及びにＩＣ０３ （０，５ｇ　）を、ＤＭＦ（２５ｍ）中で混合した。その混合物を、３時間、７ ０″Ｃに加熱し、そして続いて蒸発し、乾燥せしめた。溶離剤として酢酸エチル ／トルエン（５〜２５％線状グラジェント）を用いてのシリカゲル上での残留物 のクロマトグラフィー処理は、Ｎ　−Ｂｏｃ　−Ｎ。

Ｎ′−ジメチル−Ｎ−（（（８−メトキシ）メチレン−５−イル）メチルコシス テアミン（０，６３ｇ　、　５１％）を生成した。この化合物（０，４５ｇ）を 、化合物３ａについて上記で記載されているようにして保護解除した。酢酸エチ ルの添加は、３ｂ。

２１１．１／２Ｈ２０（０，３ｇ　、７０％）（ｍ、ｐ、　２０８〜２１０°Ｃ ）の沈殿を引き起こした。

分析： Ｃ１ｑＨｔａＮｚＯａＳｔ　、　２　ＨＣＩ　、　１／２ＨｚＯ：実測値：Ｃ４ ６，５３Ｎ５．５５　　Ｎ５．７１　　Ｓ１３．０７　　Ｃ：ｆｆ１１４．４６ 計算値：Ｃ４６，３５Ｎ５．５１　　Ｎ５．４２　　Ｓ１２．６２　　ＣＩ！、 １４．１７ＩＲ−スペクトル（ＫＢｒ）　　：　Ｖ□、＝　２５００及び３００ ０　（ＮＨ）　。

１７２０（ＧＯ）、　１５９０Ｃ１１−’。

質量スペクトルＥｉ　／ｕ　、　ｍ／　ｅ　：　４０Ｂ（Ｍ）。

ＮＭＲスペクトルは、与えられた構造と卓越して一致した。

Ｎ　−Ｂｏｃ　−Ｎ　、　Ｎ’−ジメチルシステアミン（１）（０，４ｇ。

１．４ｍモル）、４′−クロロメチル−（４，８，５’−）ジメチル）メチレン （ｒｓａａｃｓ＋　Ｓ、Ｔ、、　５ｈｅｎ、　Ｊ、に、、　Ｈｅａｒｓｔ、　Ｊ 、Ｅ、。

及びＰａｐｏｐｏｒｔ、　Ｈ，：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６＋　１９７ ７．１０５８ページ）（２ｃ）（０，４ｇ、１．４ｍモル）及びＫｚＣＯｓ（０ ，５ｇ　）を、ＣＨＣｆｆｉ　３（３０−”）中で混合した。その混合物を２７ 時間撹拌し、そして続いて蒸発乾燥せしめた。溶離剤としてＣＨＣ１ｓを用いて のシリカゲル上での残留物のクロマトグラフィー処理は、Ｎ　−Ｂｏｃ　−Ｎ　 、　Ｎ’−ジメチル−Ｎ−ＣＣ４，８，５’−トリメチル）−メチレン−４′− イル）メチルコシステアミン（０，４８ｇ　、　６４％）を生成し、そしてこれ を、化合物３ａにっいて上記で記載されているようにして保護解除した。酢酸エ チルの添加は、３　ｃ　、　２ＨＣｆｆｉ　、　２１ｈＯ（０，４０ｇ　＋　８ ６％）（ｍ、ｐ。

１８３〜１８６℃）の結晶化を引き起こした。

分析： Ｃｚ＋Ｈｚｓ）ｂＯｌｓｚ　、　２ＨＣｊ！　、　２８ｚＯ：実測値：Ｃ４７， ６３Ｈ６，４７Ｎ５．２９　　Ｓ１２．１１　　Ｃｆ１３．３９計算値：Ｃ４１ ，９６Ｈ６，５７Ｎ５．２Ｂ　　Ｓ１２．０５　　Ｃｆｆ１１３．３３ＩＲ−ス ペクトル（ＫＢｒ）　　：　Ｖ、、、　＝２５００及び３０００　（ＮＨ）　。

１７２０（Ｃｏ）、　１６００Ｃ１１−’。

質量スペクトルＦＡＢ／μｓ（グリセロール）　、ｍ　／　ｅ　：　４２１（Ｍ ＋１）。

’ＨＮＭＲスペクトルは、与えられた構造と卓越して一致した。

浄書（内容に変更なし） ＯＤ　　４９２ ｅ、ｅｌ　　ｅ、１θ　　　１．ｅｅ　　　１ｅ、８ｅ　　１ｅ８．ｅ８ｕｇ　 　ＰＳ１２ Ｆ：Ｌｇ−’１ ＯＤ　　４９２ Ｆｉ（７−２ ＯＤ　　４９２ ｅ　　　　　８．１θ　　　　１．ｅｅ　　　　１ｅ、ｅｅｕｇ　　ＰＳ１２ Ｆ″±９−　３ い い Ｅ″１９．　７ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年６月７日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＤＫ８８１０　Ｏ２０５ ２発明の名称 ポリマーの表面を変性するための方法 ３　特許出願人 名　称　ゲルチク　アンパーツゼルスカブ４代理人 住　所　東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル〒１０５　　を話（ ５０４）　０７２１５　補正書の提出年月日 また、固体支持体への核酸の結合に関しては、ＣＮＢｒ又は１゜４−ブタンジオ ールジグリシジルのような相互カップラーと反応基（該反応基はカルボキシル、 アミノ又は同様の基、好ましくはセルロース上に見出されるようなヒドロキシル 基を有する固体支持体及び官能価された光化学的反応性核酸結合リガンドである 特異的カップリング試薬の両者とを同時に、又は第−者と次の２者の１つ及び次 に他の１つとを反応せしめることがこれまで記載されている（ＥＰ−Ａ−０１３ ０５２３）　。

固体支持体が相互カップラーにより活性化され、そして光化学的反応性核酸結合 リガンドが前記カップラーに結合される、固体支持体は、適切な照射に基づいて それらに核酸を結合することができる。

従って、核酸結合リガンドの光化学的反応性は、アッセイの間、リガンドをＤＮ Ａに光化学的に結合するために適用され、そして固体支持体にリガンドを光化学 的に結合するためには適用されない。

内位添加性光化学的反応性核酸結合リガンドは、たとえば固相バイブリプ−ジョ ンフォーマットに通用されるラベルされた核酸プローブの製造に使用され（ＥＰ −Ａ−０１３１８３０）　、Ｌかしながらその特許は、ポリマー表面を変性する ために分子の光化学的固定化を開示しない。

発明の詳細な記載 現在存在する変性方法に関連する欠点を除くために、本発明の目的は、ポリマー の表面を変性するための方法、特にボリスチレン又は他のプラスチック材料への 分子の光化学的な固定化のための方法を提供する。

本発明は、多くの良く知られた光反応性多環式化合物が、それらが適切な条件下 で電磁線に暴露される場合、種々のポリマー表面に堅く結合される驚くべき発見 に基づかれている。

従って、その広い観点から、本発明は、ポリマー表面と下記一般式■： 〔式中、Ａは−０−、−３＋、　−３ｅ　−、＞ＮＨ，＞ＮＲ’、　−ＮＨ−Ｏ −、−Ｎ＝Ｎ−、＞、Ｓ’Ｒ’、　−３−０＋、　＞Ｓｅ”Ｒ’、　−ＣＯ−Ｏ −、−Ｃｏ−３−、−ＣＳ−０−、−Ｃ５−３＋、　−ＣＳｅ　−０、−Ｃｏ− ３ｅ−、−Ｃ５−ＮＨ、Ｃｏ−ＮＨ、Ｃ０−Ｎ（Ｒ’）　　。

〉Ｐ＝０又は−Ｐ　Ｃ＝Ｏ）（０−）−であり；Ｒ１はヒドロカルビル又はヒド ロカルビルオキシであり、このいづれかは、ＮＯＩ　Ｎ０ＺＩ　ＳＯｓ＋　ＣＮ ＋　ＯＬ　−０＋　ＳＨｔ　ＳｅＨ。

ＰＯ３−−、Ｐ（ｈ−、ＣＯＯ−、ハロゲンエポキシド、ＮＨ，、Ｎ）ＩＲＩ。

ＮＲ’Ｒ”　（ここでＲ”　はＲ１について定義されたのと同じ意味を有する） により置換され得； 菫二文Ｊと玉り皿 １、　ポリマー表面を変性するための方法であって、前記ポリマー表面と下記一 般式Ｉ： 〔式中、Ａは−０−、−３−、−３ｅ　＋、　＞Ｎｔｉ、　＞ＮＲ’、　−ＮＨ −Ｏ＋、　−Ｎ””Ｎ−、＞Ｓ”Ｒ’、　−３−０−、＞Ｓｅ”Ｒ’、　−Ｃ０ −Ｏ−、−ｃｏ−ｓ　＋、　−ｃｓ−ｏ　−、−ｃｓ−ｓ　−、−ＣＳｅ　−０ −、−ＣＯ−５ｅ　＋、　−ｃｓ−ＮＨ−、−Ｃｏ−ＮＯ−、−ｃｏ−ＮＣＲ’ ）　＋。

〉Ｐ＝０又は−Ｐ　（＝０）（０−）−であり：Ｒ１はヒドロカルビル又はヒド ロカルビルオキシであり、このいづれかは、Ｎｏ、　ＮＯｚ＋　ＳＯ３，ＣＮ、 　ＯＨ，−０，ＳＨｔ　ＳｅＨ。

ＰＯ３−−、Ｐ（ｈ−、ＣＯＯ−、ハロゲンエポキシド、ＮＨｔ、　ＮＯＲ’又 はＮＲ’Ｒ”　（ここでＲ”はＲ’について定義されたのと同じ意味を有する） により置換され得； Ｒ！、　Ｒ３ｔ　Ｒ４及びＲ’（同じであっても良く又は異なっていても良い） は、Ｈ１ハロゲン、Ｎｏ、　ＮＯ□、　ＳＯ３，ＣＮ、　ＯＨ，Ｏ。

ＳＨ，Ｓｅａ、　ＰＯ２−、ＰＯＺ−、Ｃｏ　　Ｏ、エポキシド、　ＮＨｚ、　 　ＮＯＲ’。

−ＮＲ’Ｒ”又はヘテロシクリルであり、又はＲ’について定義されたのと同じ 意味を有し； Ｘ及びＹ（同じであっても良く又は異なっていても良い）は、Ｒ２−Ｒ５につい て定義されたのと同じ意味を有し、又は Ｘ及びＹは、お互いに隣接し、そして式−ＣＲ’　＝ＣＲ’　−Ａ’−（ここで Ａ′、は上記Ａについて定義されたのと同じ意味を有し、そしてＲ６及びＲ７は 同じであっても良く又は異なっていても良く、Ｒ２〜Ｒ％について定義されたの と同じ意味を有する）で表わされる基を一緒に形成し；そして手続補正書（方式 ） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＤＫ８８１００２０５ ２、発明の名称 ポリマーの表面を変性するための方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　ゲルチク　アンバーツゼルスカブ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１〕　　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表 者」の欄 （２）委任状 （３）図面の翻訳文 （４）法人証明書 ７、補正の内容 （１〕　　訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　　　　　１ 通国際調査報告 Ｉｅ＋ｅ＋ＡＩ＋幡１１−＾拳−縦１１ゆ１軸ＰＣ丁／ＤＫ８８１００２０５

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリマー表面を変性するための方法であって、前記ポリマー表面と下記−般 式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ 〔式中、Ａは−Ｏ−，−Ｓ−，−Ｓｅ−，＞ＮＨ，＞ＮＲ１，−ＮＨ−Ｏ−，− Ｎ−Ｎ−，＞Ｓ＋Ｒ１，−Ｓ−Ｏ−１，＞Ｓｅ＋Ｒ１，−ＣＯ−Ｏ−，−ＣＯ− Ｓ−，−ＣＳ−Ｏ−，−ＣＳｅ−Ｏ−，−ＣＯ−Ｓｅ−，−ＣＳ−ＮＨ−，−Ｃ Ｏ−ＮＨ−，−ＣＯ−Ｎ（ＲＩ）−，＞Ｐ＝Ｏ又は−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−）−であ り； Ｒ１はヒドロカルビル又はヒドロカルビルオキシであり、このいづれかは、ＮＯ ，ＮＯ２，ＳＯ３，ＣＮ，ＯＨ，−Ｏ，ＳＨ，ＳｅＨ，ＰＯ３−−，ＰＯ２−， ＣＯＯ−、ハロゲンエポキシド、ＮＨ２，ＮＨＲ１又はＮＲ′Ｒ′１（ここでＲ ′１はＲ１について定義されたのと同じ意味を有する）により置換され得； Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４及び５，（同じであっても良く又は異なっていても良い）は、 Ｈ、ハロゲン、ＮＯ，ＮＯ，ＮＯ２，ＣＯ３，ＣＮ，ＯＨ，Ｏ，ＳＨ，ＳｅＨ， ＰＯ３−，ＰＯ２−，ＣＯ−，Ｏ、エポキシド、−ＮＨ２，−ＮＨＲ１，−ＮＲ １Ｒ′１又はヘテロシクリルであり、又はＲ１について定義されたのと同じ意味 を有し； Ｘ及びＹ（同じであっても良く又は異なっていても良い）は、Ｒ２〜Ｒ３につい て定義されたのと同じ意味を有し、又は Ｘ及びＹは、お互いに隣接し、そして式−ＣＲ６＝ＣＲ７−Ａ′−（ここでＡ′ は上記Ａについて定義されたのと同じ意味を有し、そしてＲ６及びＲ７は同じで あっても良く又は異なっていても良く、Ｒ２〜Ｒ５について定義されたのと同じ 意味を有する）で表わされる基を一緒に形成し；そして場合によっては、１又は 複数のＲ１〜Ｒ７がプローブを示す〕で表わされる化合物とを接触し；そして前 記ポリマー及び式１の化合物を電磁線により照射することを含んで成る方法。
2. ２．前記電磁線が７００ｎｍよりも短い波長、好ましくは４００ｎｍよりも短い 波長を有する請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記電磁線照射が、好ましくは約５〜約９のｐＨを有し、そして場合によっ ては、イオン強度調整化合物、好ましくはＮａＣｅを含む、化合物１の水溶液を 用いて行なわれる請求の範囲第１及び２項記載の方法。
4. ４．前記電磁線照射が、活性剤分子、好ましくはベンゾキノンの存在下で行なわ れる請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の方法。
5. ５．前記ポリマーを、ポリスチレン、ポリエチレングリコールテレフタレート、 ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリ ル、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、ス チレン−ブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン及びポリプロピレンから選択 する請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．記化合物１を、任意に置換されたクマリン、ベンゾフラン、インドール及び アンゲリシンから成る群から選択する請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の 方法。
7. ７．前記任意に置換されたクマリンが、任意に置換されたソラレンである請求の 範囲第６項記載の方法。
8. ８．前記ソラレン中の少なくとも１つの置換基がアミノ基含有成分である請求の 範囲第７項記載の方法。
9. ９．前記アミノ基含有成分が３−トリメチルアミノプロポキシである請求の範囲 第８項記載の方法。
10. １０．前記任意に置換されたソラレンを、ソラレン、８−メチル−３−カルボキ シソラレン、４，５′，８−トリメチルソラレン、３′−トリメチル−アミノ− ８−プロピルオキシソラレン又はＮ，Ｎ′−ジメチルヘキサンジアミン−８−プ ロビルオキシソラレンから選択する請求の範囲第７項記載の方法。
11. １１．前記任意に置換されたクマリンがワーファリンである請求の範囲第６項記 載の方法。
12. １２．前記任意に置換されたインドールが５−ヒドロキシトリプタミン又は３− インドール酢酸である請求の範囲第６項記載の方法。
13. １３．前記プローブが、結合単位を通して化合物１に任意に連結される有機成分 である請求の範囲第１項記載の方法。
14. １４．前記プローブを、同定され得るラベル成分、反応性化学基を含む化合物、 非共有相互作用性化学基及び他の分子から選択する請求の範囲第１３項記載の方 法。
15. １５．前記同定され得るラベル成分を、ビオチン、放射性化合物、スピンラベル 、螢光化合物、酵素基質、ｐＨ発色性化合物及びヘプテンから成る群から選択す る請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．前記反応性化学基を含んで成る化合物を、他の化学基と共有結合を形成す ることができる活性エステル、活性ハロゲン含有化合物及びジスルフィド含有化 合物から選択する請求の範囲第１４項記載の方法。
17. １７．前記非共有化学基が、反対の荷電基又は疎水性基を担持する化合物のため に親和性を有する荷電された又は疎水性化学基である請求の範囲第１４項記載の 方法。
18. １８．前記他の分子を、タンパク質、ヘプチド、医薬、単−、オリゴー、多糖、 又は核酸並びに場合によっては置換された脂質から成る群から選択する請求の範 囲第１４項記載の方法。
19. １９．前記ポリマーがポリスチレンであり、前記式１の化合物が、Ｎ，Ｎ′−ジ メチルヘキサンジアミンリンカーを通して化合物１に連結されるピオチンである プローブを担持する８−プロポキシソラレンである請求の範囲第１項記載の方法 。
20. ２０．前記ポリマーがポリ塩化ビニルであり、前記式１の化合物が、Ｎ，Ｎ′− ジメチルヘキサンジアミンリンカーを通して化合物１に連結されるビオチンであ るプローブを担持する８−プロポキシソラレンである請求の範囲第１項記載の方 法。
21. ２１．前記ポリマーがポリエチレングリコールテレフタレートであり、前記式１ の化合物がＮ，Ｎ′−ジメチルヘキサンジアミンリンカーを通して化合物１に連 結されるビオチンであるプローブを担持する８−プロポキシソラレンである請求 の範囲第１項記載の方法。
22. ２２．前記ポリマーがポリスチレンであり、そして前記化合物１が３′−トリメ チルプロピルオキシ−８−ソラレンである請求の範囲第１項記載の方法。
23. ２３．請求の範囲第１項記載の方法により調製される変性されたポリマー。
24. ２４．プレート、粒子、試験管又は試験トリップの形で存在する請求の範囲第２ ３項記載の変性されたポリマー。
25. ２５．サンプル中の分子の存在を決定するための方法であって、前記分子を含む サンプルと請求の範囲第２３又は２４項記載の変性されたポリマーとを接触する ことを含んで成る方法。
26. ２６．前記固体表面を、ポリマープレート、たとえば簿層プレート又はマイクロ ー力価−プレート、ポリマービーズ、ストリップ、ディップスティック、試験管 及び（微小）球体から選択する請求の範囲第２５項記載の方法。
27. ２７．固体表面上に分子を固定するための方法であって、ａ）前記分子及び−般 式１の化合物、場合によっては、結合単位を反応せしめ、前記組合せとポリマー 材料とを接触せしめ、そしてポリマー及び組合された分子及び化合物１を電磁線 照射にゆだね、又はｂ）電磁線照射によりポリマー表面と請求の範囲第１項記載 の化合物１とを接触せしめることによってそのポリマーの表面を変性し、そして その後、その変性されたポリマー表面及び分子、場合によっては結合単位を反応 せしめる段階を含んで成る方法。