BR112021002078A2 - antígenos sintéticos, substrato sólido, método para imobilização de um antígeno e para detecção da presença de anticorpos, biossensor e sistema de detecção de tuberculose - Google Patents

Abstract

“antígenos sintéticos, substrato sólido, método para imobilização de um antígeno e para detecção da presença de anticorpos, biossensor e sistema de detecção de tuberculose”. a presente invenção se refere a um antígeno sintético e a um substrato sólido que compreende um antígeno imobilizado em relação ao mesmo e a um método para imobilização do dito antígeno sobre um substrato sólido. a invenção também se refere a um biossensor e a um sistema de detecção de tuberculose que compreendem o dito substrato sólido. a invenção também se refere a um método de detecção da presença de anticorpos contra material micobacteriano em uma amostra usando os ditos antígeno sintético ou substrato sólido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTÍGENOS SINTÉTICOS, SUBSTRATO SÓLIDO, MÉTODO PARA IMOBILIZAÇÃO DE UM ANTÍGENO E PARA DETECÇÃO DA PRESENÇA DE ANTICORPOS, BIOSSENSOR E SISTEMA DE DETECÇÃO DE TUBERCULOSE”

[001] A presente invenção se refere a um antígeno sintético e a um substrato sólido que compreende um antígeno imobilizado em relação ao mesmo e a um método para imobilização do dito antígeno sobre um substrato sólido. A invenção também se refere a um biossensor e a um sistema de detecção de tuberculose que compreende o dito substrato sólido. A invenção também se refere a um método de detecção da presença de anticorpos contra material micobacteriano em uma amostra usando o dito antígeno sintético ou o substrato sólido.

INTRODUÇÃO

[002] A Mycobacterium tuberculosis é uma espécie bacteriana patogênica na família Mycobacteriaceae e o agente causador da maioria dos casos de tuberculose (TB).

[003] A TB ainda é uma das principais causas de morte em muitos países de baixa e média renda. Além do mais, cada vez mais casos são relatados de TB resistente a múltiplos fármacos.

[004] Uma maneira confiável e rápida de diagnosticar a tuberculose é, portanto, de máxima importância.

[005] Diversos métodos para diagnosticar a tuberculose foram desenvolvidos, mas todos os métodos têm suas desvantagens.

[006] Os humanos ou os animais infectados com M. tuberculosis normalmente produzem os anticorpos direcionados contra a Mycobacterium. A presença destes anticorpos em uma amostra tomada a partir de indivíduos infectados indica a infecção. Os antígenos específicos de Mycobacterium mais comuns são ácidos micólicos ou derivados dos mesmos. Por exemplo, WO 2005/116654 e WO 2013/186679 descrevem os métodos dos anticorpos em uma amostra contra os ácidos micólicos para a diagnose de tuberculose ativa, pela detecção da ligação de anticorpos aos antígenos de ácido micólico imobilizados.

[007] Um outro tipo de antígeno de interesse em particular neste aspecto compreende os antígenos tipo tuberculosinil adenosina (TbAd) e os derivados dos mesmos.

[008] A patente holandesa NL 2017204 C1 em nome dos mesmos requerentes da presente invenção descreve os antígenos tipo tuberculosinil adenosina imobilizados em combinação com outros tipos de antígenos para uso na detecção da presença de anticorpos contra o material micobacteriano em uma amostra. A presença do material micobacteriano na amostra indica a tuberculose no sujeito a partir do qual a amostra foi derivada.

[009] O inventor, entretanto, considera que há espaço para a melhoria em relação à sensibilidade da detecção da tuberculose.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[010] O inventor agora descobriu que a apresentação de antígeno dos antígenos de tuberculosinil adenosina pode ser significativamente melhorada pela provisão de um grupo de ligação na posição em que os antígenos de tuberculosinil adenosina nativos (1-tuberculosiniladenosina) têm um grupo hidroximetila na fração de adenosina e pela imobilização dos antígenos em relação a um substrato sólido por meio de dito agente de ligação.

[011] Portanto, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um antígeno sintético representado pela seguinte fórmula (I) e a enantiômeros ou a diastereoisômeros deste antígeno.

(I)

[012] Na fórmula (I) R1 é H ou um grupo com a fórmula (II) (II).

[013] R2 está ausente ou é um grupo com a fórmula (II), desde que um de R1 e R2 seja um grupo com a fórmula (II).

[014] R3 e R4 são selecionados independentemente a partir de hidrogênio, OH ou um grupo acila, em qualquer combinação dos mesmos.

[015] R5 é um grupo de ligação que compreende um grupo funcional que habilita a imobilização do antígeno em relação a um substrato sólido, e enantiômeros ou diastereoisômeros do dito antígeno.

[016] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um substrato sólido, que compreende pelo menos um tipo de antígeno imobilizado em relação ao mesmo, em que o dito pelo menos um tipo de antígeno é representado pela seguinte fórmula (I) ou enantiômeros e diastereoisômeros dos mesmos e misturas dos mesmos: (I) em que, na fórmula (I), R3 e R4 são selecionados independentemente a partir de hidrogênio, OH ou um grupo acila, em qualquer combinação dos mesmos, R5 é um grupo de ligação, R1 é H ou um grupo com a fórmula (II) (II), e R2 é ausente ou um grupo com a fórmula (II), desde que um de R1 e R2 seja um grupo com a fórmula (II), em que o dito antígeno é imobilizado em relação ao dito substrato sólido por meio do dito grupo de ligação na posição R5.

[017] Em um terceiro aspecto, a invenção se refere a um método para imobilização de um antígeno em relação a um substrato sólido, que compreende: imobilizar um antígeno representado pela seguinte fórmula (I) ou enantiômeros,

diastereoisômeros do antígeno, e misturas dos mesmos: (I) em que, na fórmula (I), R3 e R4 são selecionados independentemente a partir de hidrogênio, OH ou um grupo acila, em qualquer combinação dos mesmos, e em que R5 é um grupo de ligação, R1 é H ou um grupo com a fórmula (II) (II), e R2 é ausente ou um grupo com a fórmula (II), desde que um de R1 e R2 seja um grupo com a fórmula (II), sobre um substrato sólido por meio do dito grupo de ligação na posição R5.

[018] Em um quarto aspecto, a invenção se refere a um biossensor, que compreende o substrato sólido de acordo com o segundo aspecto.

[019] Em um quinto aspecto, a invenção se refere a um sistema de detecção de tuberculose que compreende o substrato sólido de acordo com o segundo aspecto.

[020] Em um sexto aspecto, a invenção se refere a um método de detecção da presença de anticorpos contra material micobacteriano em uma amostra que compreende as etapas de: (1) prover uma amostra a partir de um humano ou um animal; (2) expor pelo menos parte da amostra aos antígenos sintéticos de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou o substrato sólido do segundo aspecto da invenção; (3) detectar a ligação de anticorpos na dita amostra nos ditos antígenos, em que a ligação de um anticorpo nos ditos antígenos é indicativa para a presença do material micobacteriano em um humano ou um animal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[021] A figura 1 mostra um espectro SPR da ligação de anticorpos séricos em um substrato SPR no qual um antígeno tipo tuberculosinil adenosina é imobilizado por meio de um PEG biotinilado de ligação de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[022] Os antígenos sintéticos aqui descritos são capazes de ligação a um anticorpo que é indicativo para a presença de material micobacteriano em um humano ou um animal. Com “material micobacteriano” neste contexto, entende-se o material derivado a partir de Mycobacterium tuberculosis que leva à geração de anticorpos em um humano ou um animal. A presença deste material indica a tuberculose. O inventor descobriu surpreendentemente que, quando os antígenos definidos anteriormente são imobilizados em relação ao um substrato sólido por meio de um grupo de ligação na posição R5, da forma indicada na fórmula (I) exposta, excelente apresentação de antígeno é obtida, se comparada com quando os antígenos seriam imobilizados, por exemplo, por meio dos grupos R3 ou R4. Por “melhor apresentação”, entende-se que os anticorpos contra tuberculosinil adenosina provenientes de uma amostra mostram melhor reconhecimento dos antígenos imobilizados. Isto resulta em uma melhoria significativa em relação à sensibilidade da detecção dos marcadores de anticorpo tipo tuberculosinil adenosina, o que, por sua vez, resulta em melhor detecção de tuberculose.

[023] O antígeno sintético derivado de tuberculosinil adenosina usado na presente invenção é representado pela seguinte fórmula (I) e enantiômeros ou diastereoisômeros do mesmo: (I)

[024] Na fórmula (I), R1 é H ou um grupo com a fórmula (II) (II).

[025] R2 é ausente ou um grupo com a fórmula (II), desde que um de R1 e R2 seja um grupo com a fórmula (II).

[026] R3 e R4 são selecionados independentemente a partir de hidrogênio, OH ou um grupo acila, em qualquer combinação dos mesmos.

[027] R5 é um grupo de ligação. O antígeno pode ser imobilizado em relação a um substrato sólido por meio do dito grupo de ligação em R5.

[028] Na fórmula (I), R1 pode ser um grupo da fórmula (II) e R2 pode estar ausente. Em outras modalidades, R1 pode ser H e R2 pode ser um grupo da fórmula (II). No caso R2, é um grupo da fórmula (II), o nitrogênio no qual o mesmo é anexado conduz uma carga positiva.

[029] No caso em que R3 ou R4 forem um grupo acila, é preferido que apenas um de R3 e R4 seja um grupo acila. Por exemplo, R3 ou R4 podem ser uma amida, um éster, uma cetona ou um aldeído ou grupo de ácido carboxílico.

[030] É possível que R3 seja H e R4 seja OH. Também é possível que R4 seja H e R3 seja OH. Também é possível que tanto R3 quanto R4 sejam H.

[031] É preferido que um de R3 e R4 seja OH, por exemplo, que R4 seja OH ou que R3 seja OH. É preferido que R4 seja OH e ainda mais preferido que R4 e R3 sejam OH. Tais moléculas podem ser efetivamente sintetizadas, por exemplo, de acordo com o método descrito em Buter et al., 2016 e mostram boa apresentação de antígeno.

[032] Em uma modalidade preferida, o antígeno da fórmula (I) é representado por um composto das fórmulas (III) ou (IV), em que R5 é um grupo de ligação:

(III) (IV)

[033] Neste aspecto, o substrato sólido de acordo com a invenção pode conter qualquer combinação de antígenos que são capazes de se ligar aos anticorpos que são indicativos para a tuberculose que caem na definição da fórmula (I), por exemplo, uma combinação de antígenos de acordo com a fórmula (I) que compreendem um composto das fórmulas (III) e (IV). O substrato pode compreender apenas um composto em particular de acordo com a fórmula (I), tal como apenas os antígenos 1- tuberculosinyladenosine (que são de acordo com a fórmula (III), apenas o composto (IV) ou qualquer combinação destas moléculas. Também, as combinações dos enantiômeros ou diastereoisômeros são possíveis.

[034] Os antígenos sintéticos de acordo com as fórmulas (I), (III) e (IV) podem, por exemplo, ser sintetizados de acordo com o método descrito em Buter et al., 2016. Os grupos de ligação podem ser adicionados de acordo com as técnicas disponíveis na tecnologia de química orgânica. É preferido, neste aspecto, que uma fração de adenosina acoplada em agente de ligação seja preparada antes de a fração de adenosina ser acoplada na fração de tuberculosinil.

[035] Para os propósitos da detecção da presença de anticorpos em uma amostra, os antígenos podem ser imobilizados em relação a um substrato sólido que pode ser exposto a uma amostra derivada a partir de um humano ou um animal, de forma que a ligação dos anticorpos aos antígenos imobilizados possa ser determinada, tanto qualitativamente quanto quantitativamente ou ambos. Percebe-se que, neste pedido, o termo “substrato sólido” significa o mesmo que “superfície sólida” ou “suporte sólido”.

[036] O substrato sólido pode ser, adequadamente, uma superfície sensora ou de detecção de um dispositivo de ressonância plasmônica superficial, dispositivo de espectroscopia por impedância eletroquímica, dispositivo de calorimetria de titulação isotérmica, dispositivo de interferometria de biocamada, dispositivo de grades ópticas, dispositivo de cristal fotônico, dispositivo de perfilagem ressonante acústica, ou dispositivo de microequilíbrio de cristal de quartzo; ou uma superfície sensora ou de detecção em um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), um ensaio Western blotting, ensaio de rotulagem radioativa, ensaio fotoespectrométrico, ensaio de imunofluorescência, ensaio de imunoprecipitação, ensaio de imunocitoquímica, ensaio de imuno-histoquímica, ensaio de detecção amperométrica, ensaio de detecção voltamétrica, ou ensaio de espectroscopia por impedância eletroquímica.

[037] Em uma modalidade, o dito substrato sólido é nitrocelulose.

[038] Em uma modalidade adicional, o dito substrato sólido é um disco sensor da ressonância plasmônica superficial (SPR).

[039] Em relação ao grupo de ligação, qualquer grupo de ligação adequado para imobilizar um antígeno em relação a um substrato sólido pode se qualificar e muitos grupos de ligação adequados para a imobilização de antígenos são conhecidos na tecnologia. Os exemplos de tais ligações serão discutidos a seguir.

[040] No geral, é preferido que o grupo de ligação seja um tanto hidrofílico, exceto quando a imobilização ocorrer por interações hidrofóbicas. A hidrofilicidade torna os antígenos mais solúveis em soluções aquosas e, assim, mais fácil de usar. A maior hidrofilicidade torna a superfície de detecção ou a superfície do sensor nos quais os antígenos são imobilizados mais hidrofílicas. Em virtude disto, as interações de anticorpos no antígeno ocorrem de forma mais fácil e a velocidade da detecção será intensificada. Além do mais, será mais fácil sintetizar os antígenos no caso em que os antígenos sintéticos forem usados.

[041] A fim de habilitar a imobilização em relação a um substrato sólido, o agente de ligação preferivelmente contém um grupo funcional que habilita a imobilização em relação ao substrato. O termo “grupo funcional” neste pedido, portanto, deve ser entendido como um grupo que habilita a imobilização do antígeno em relação a um substrato sólido. Para este propósito, o dito grupo de ligação pode compreender um grupo funcional selecionado a partir de um grupo tio, um grupo amina, um grupo aldeído, um grupo azida, uma poli-histidina, ou um grupo biotina.

[042] Um agente de ligação adequado para os propósitos desta invenção é um polietileno glicol (agente de ligação PEG) apropriadamente funcionalizado para habilitar a imobilização. Em uma modalidade preferida, o dito grupo de ligação é um PEG (polietileno glicol) que contém um grupo funcional que habilita a imobilização em relação a um substrato sólido. Muitos PEG de ligação adequados estão disponíveis e muitas maneiras são adequadas para acoplar os antígenos em um substrato sólido. O grupo PEG pode, por exemplo, ser funcionalizado com um grupo que compreende um grupo funcional selecionado a partir de um grupo tio, um grupo amina, um grupo aldeído, um grupo azida, uma poli-histidina, ou um grupo biotina. Em uma modalidade, o grupo de ligação pode, portanto ser um grupo PEG biotinilado. Em uma outra modalidade, o dito grupo de ligação pode ser um grupo PEG que contém um grupo azida, por exemplo, da forma mostrada na fórmula (V) a seguir.

(V).

[043] O substrato sólido de acordo com a invenção pode, portanto, ser obtido pela imobilização sobre o dito substrato de pelo menos um antígeno de acordo com a fórmula (V). Neste caso, a imobilização ocorre por meio do acoplamento de azida, opcionalmente, pelo acoplamento de um outro grupo funcional, tal como biotina, no agente de ligação por meio da dita azida. Um antígeno exemplar de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser os antígenos a seguir de acordo com a fórmula (VI): (VI)

[044] Alguns métodos de acoplamento exigem que, para além do antígeno, também, o substrato sólido no qual os antígenos são acoplados é modificado. O dito substrato pode ser modificado com um grupo selecionado a partir de carboximetildextrano, carboximetilcelulose, carboximetilpolietilenoglicol, carboximetildextrano derivado de estreptavidina, carboximetildextrano derivado de biotina, carboximetildextrano modificado por dissulfeto, carboximetildextrano derivado de NTA, policarboxilato, policarboxilato derivado de biotina, policarboxilato linear derivado de hidrazida, policarboxilato linear modificado por dissulfeto, poli-L-lisina, ácido hialurônico, gelatina, alginato. Os exemplos adicionais de substratos modificados incluem: * Materiais de suporte ativados por éster NHS, em que ésteres NHS são grupos reativos formados pela ativação de EDC das moléculas de carboxilato para reagir com as aminas primárias no antígeno; * Materiais de suporte ativados por aldeído, em que o acoplamento do antígeno ocorre por uma reação chamada de aminação redutiva; * Materiais de suporte ativados por azlactona, envolvendo a copolimerização de acrilamida com azlactona; * Materiais de suporte ativados por CDI, em que carbonil di-imidazol (CDI) ativa hidroxilas para formar imidazol-carbamatos reativos que formam ligações de carbamato com antígenos contendo/modificados por amina primários; * Materiais de suporte reativos a sulfidrila, em que o grupo tiol pode ser usado para reações de acoplamento direto;

* Materiais de suporte ativados por maleimida, em que reagentes ativados por maleimida formam ligações de tioéter estáveis; * Materiais de suporte ativados por iodoacetil, que reagem com grupos sulfidrila, resultando em ligações de tioéter estáveis; * Materiais de suporte de piridil dissulfeto, em que os piridil dissulfetos reagem com os grupos sulfidrila; e * Materiais de suporte ativados por hidrazida.

[045] Os antígenos podem ser imobilizados ou “acoplados” diretamente no material de suporte sólido pela formação de ligações químicas covalentes entre os grupos funcionais em particular no antígeno (modificado) (por exemplo, aminas primárias, sulfidrilas, ácidos carboxílicos, aldeídos) e grupos reativos no material de suporte. Também é possível que os antígenos sejam ligação não covalente imobilizada, tais como interação hidrofóbica ou por meio de acoplamento estreptavidina-biotina. No caso de imobilização com base em hidrofobicidade, o agente de ligação deve ser equipado com um terminal hidrofóbico adequado.

[046] Vários métodos de acoplamento são possíveis. Por exemplo, o acoplamento tio, o acoplamento amina e os métodos de imobilização reativos a carbonila, que envolvem o acoplamento através dos grupos carbonila (açúcar) em que os cis-dióis podem ser oxidados com periodato de sódio para criar os aldeídos como locais para a imobilização covalente. Também, os métodos de imobilização de automontagem são possíveis.

[047] Por exemplo, um substrato com base em silica pode ser modificado com um derivado de silano que contém um grupo amina livre, por exemplo, aminopropiltrietoxissilano ou aminometoxissilano. Este grupo amina livre reage espontaneamente com um antígeno modificado por tiol para formar uma ligação covalente. Isto não exige protocolos complicados.

[048] No caso de substratos sólidos de ouro, tais como substratos SPR, uma monocamada de tiol cisteamina pode ser aplicada no substrato de ouro. A amina livre do tiol cisteamina pode, em vez disto, ser aplicada em uma reação de acoplamento espontânea com um antígeno modificado por tiol. Isto não exigirá protocolos complicados.

[049] Se os discos sensores de SPR forem usados como o substrato sólido, os mesmos podem ser modificados com um revestimento plano (2D) ou uma matriz de hidrogel 3D. Os revestimentos planos podem incluir biotina, covalentemente imobilizada em uma monocamada de sacarídeo, superfície de carboximetildextrano; poliglicerol dendrítico carboximetilado; monocamada de glicol tetraetileno carboximetilado; monocamada de alquila automontada em carboxila funcionalizada; superfície de dextrano; superfície de policarboxilato; camada de alquila plana hidrofóbica; superfície de carboxila hidrazomodificada; superfície de carboximetildextrano parcialmente derivada de alquila; superfície de quelação derivada de NTA; monocamada de alquila automontada em hidroxila funcionalizada; superfície de carboximetildextrano derivada da proteína A/G; superfície de carboximetildextrano derivada de estreptavidina; monocamada de tetraetileno glicol; superfície de carboximetildextrano modificada por dissulfeto; carboximetildextrano derivado de fotorreticulador UV; superfície de policarboxilato derivada de fotorreticulador UV. As matrizes de hidrogel 3D podem incluir hidrogel de agarose; hidrogel de alginato; biotina, imobilizada em um hidrogel de carboximetildextrano; biotina, imobilizada em um hidrogel de policarboxilato linear; hidrogel de policarboxilato linear; hidrogel de carboximetilcelulose; hidrogel de carboximetildextrano; carboximetil polietilenoglicol; hidrogel de policarboxilato linear derivado de hidrazida; hidrogel de carboximetildextrano parcialmente derivado de alquila; hidrogel de carboximetildextrano derivado de NTA; hidrogel de policarboxilato linear derivado de NTA; hidrogel de carboximetildextrano derivado de proteína A/G; hidrogel de policarboxilato linear derivado de proteína A/G; polietilenoglicol; Poli-L- lisina; hidrogel de carboximetildextrano derivado de estreptavidina; hidrogel de policarboxilato linear derivado de estreptavidina; hidrogel de carboximetildextrano modificado por dissulfeto; hidrogel de policarboxilato linear modificado de dissulfeto; hidrogel de carboximetildextrano derivado de fotorreticulador UV; hidrogel de policarboxilato derivado do fotorreticulador UV; hidrogel de policarboxilato zwitteriônico; hidrogel de policarboxilato zwitteriônico, positivamente carregado, NHS pré-ativado; hidrogel de policarboxilato, parcialmente sulfonado; hidrogel dextrano; hidrogel de gelatina; hidrogel de policarboxilato; heparina; hidrogel de policarboxilato; hidrogel de ácido hialurônico.

[050] Em relação ao acoplamento nas membranas de nitrocelulose, o acoplamento pode ser com base em vários mecanismos. Um antígeno não modificado pode ser imobilizado na membrana com uma fração hidrofóbica, da forma discutida anteriormente, mas outros mecanismos também são possíveis. Tais mecanismos incluem a anexação covalente do antígeno tiolado em uma membrana de nitrocelulose funcionalizada por epóxido, a anexação de um antígeno biotinilado através de uma proteína âncora estreptavidina que se liga a nitrocelulose, e fusão de um antígeno em uma proteína âncora que se liga a nitrocelulose inédita para o acoplamento direto e a anexação covalente através de uma ligação epóxido tiol usando uma imobilização de membrana de nitrocelulose funcionalizada.

[051] Na modalidade adicional, a imobilização ocorre por meio da interação avidina-biotina. Como avidina, por exemplo, a estreptavidina ou a neutravidina podem ser acopladas no substrato sólido, por exemplo, um substrato SPR, ao mesmo tempo em que o agente de ligação do antígeno tuberculosinil é funcionalizado com uma fração de biotina para habilitar o acoplamento na superfície do substrato sólido modificado por avidina. Um antígeno sintético adequado para estes propósitos pode, por exemplo, ser o antígeno de acordo com a fórmula (VI): (VI)

[052] A invenção também se refere a um biossensor. Os antígenos imobilizados podem ser incorporados em um biossensor que pode ser usado no método da invenção. Um biossensor como este pode ser qualquer biossensor que é adequado para uso em qualquer um dos dispositivos ou ensaios supramencionados. Por exemplo, o biossensor pode compreender um substrato com base em silica com antígenos imobilizados e um ressonador em anel Si. Um biossensor como este pode ser usado para ressonância de anel. Também é bem possível que os substratos das câmaras do biossensor sejam com base em ouro. Os substratos com base em ouro são particularmente úteis quando a ressonância plasmônica superficial ou a espectroscopia por impedância eletroquímica forem usadas para detectar a ligação de anticorpos nos antígenos imobilizados. A invenção também abrange qualquer outro biossensor que compreende o substrato sólido da invenção.

[053] A invenção também se refere a um sistema de detecção de tuberculose que compreende o substrato sólido de acordo com a invenção. Este sistema de detecção de tuberculose pode, portanto, compreender o biossensor de acordo com a invenção. O sistema de detecção de tuberculose é adequado para realizar um método para detecção da presença de anticorpos contra material micobacteriano em uma amostra de acordo com a invenção.

[054] Este método compreende as etapas de: (1) prover uma amostra a partir de um humano ou um animal; (2) expor pelo menos parte da amostra aos antígenos sintéticos de acordo com a invenção; (3) detectar a ligação de anticorpos na dita amostra nos ditos antígenos, em que a ligação de um anticorpo nos ditos antígenos é indicativa da presença do material micobacteriano em um humano ou um animal. Neste método, é preferido que os antígenos sintéticos sejam imobilizados em relação a um substrato sólido, portanto, é preferido que, na etapa (2), a dita pelo menos uma parte da amostra seja exposta ao substrato sólido de acordo com a invenção.

[055] Em uma modalidade, este método compreende adicionalmente detectar a ligação de anticorpos na dita amostra a um ou mais tipos adicionais de antígeno imobilizado. Tais antígenos podem incluir derivados ácido de micólico, diacil glicolipídeos, antígenos manosil fosfocetida e derivados destes antígenos em qualquer combinação, tal como, por exemplo, nas combinações e nas variações, da forma definida e descrita em pedidos anteriores WO2017/211314 A1 e WO2017/211316 A1 dos presentes requerentes.

[056] No método da invenção, uma ou mais amostras provenientes de um humano ou um animal podem ser comparadas com uma amostra proveniente de um humano ou um animal que é confirmado como saudável e com uma amostra proveniente de um humano ou um animal que é confirmado tendo tuberculose. A título de confiabilidade, é altamente preferido que todas as amostras em uma análise passem pelo mesmo tratamento de acordo com as etapas do método da invenção. No método da invenção, uma amostra proveniente de um humano ou um animal é provida. Normalmente, a amostra é derivada a partir de um humano ou um animal que é suspeito de ter tuberculose ativa, por exemplo, um humano ou um animal que teve contato com alguém que sofre de tuberculose ou que reside em uma área ou se deslocou para uma área com alta prevalência de tuberculose.

[057] A amostra pode ser obtida por qualquer meio regular de obtenção de sangue a partir de um sujeito. A fim de serem usadas nos métodos da invenção, podem ser usadas as amostras que foram coletadas em um estágio anterior, armazenadas até o uso sob condições adequadas e providas em um momento adequado. Alternativamente, uma amostra pode ser usada no método de detecção da invenção no ponto, isto é, como um ponto do teste de cuidado.

[058] A amostra é, preferivelmente, uma amostra derivada do sangue. A amostra pode ser uma amostra de sangue total, uma amostra de plasma ou uma amostra de soro. O soro sanguíneo é o plasma sanguíneo sem fatores de coagulação e é preferido como plasma. A palavra plasma neste pedido pode, portanto, também se referir ao soro (sanguíneo). O soro é preferido em virtude de o mesmo conter menos materiais diferentes do que o plasma sanguíneo, o que pode levar a interações aespecíficas ou atividade biológica indesejada. Além do mais, o soro pode ter uma viscosidade inferior à do plasma sanguíneo. Usar o soro, portanto, pode contornar a necessidade de diluir uma amostra, o que poupa tempo e materiais.

[059] No caso de a amostra ser uma amostra de sangue total, a amostra é, preferivelmente, pré-filtrada ou separada em plasma ou soro. Um filtro adequado para uma etapa de pré-filtragem como esta é um filtro de 0,2 mícron.

[060] Cerca de 55% do sangue total consiste em plasma/soro. Se uma amostra de sangue total não for filtrada suficientemente ou se a situação física do paciente necessitar da mesma, pode ser desejado diluir a amostra de sangue total ou do plasma ou do soro. As palavras plasma ou soro, neste pedido, podem, portanto, também se referir ao plasma ou ao soro diluídos. Uma diluição do sangue ou do plasma pode, portanto, ser implementada no método da invenção, tais como diluição de 5 a 10 x, uma diluição de 10 a 20 x, uma diluição de 20 a 50 x, uma diluição de 50 a 100 x, uma diluição de 250 a 5.000 x, uma diluição de 750 a 1.250 x, tais como, por exemplo, uma diluição de 5 x, 10 x, 20 x, 50 x, 100 x, 200 x, 500 x, 4.000 x, 2.000 x ou 1.000 x. Dependendo da viscosidade da amostra, tal diluição pode ocorrer antes da etapa de separação do plasma do sangue (etapa de filtragem ou etapa de separação). Alternativamente, a diluição pode ocorrer depois da etapa de filtragem.

[061] A diluição pode ser realizada com qualquer diluente adequado, por exemplo, um tampão com base em PBS, tal como um tampão de bloqueio.

[062] A amostra de sangue total ou do plasma ou do soro pode ser adicionalmente diluída com os agentes que impedem a coagulação sanguínea, tais como EDTA, heparina ou citrato.

[063] Opcionalmente, um detergente pode ser adicionado em baixa concentração no sangue/plasma/soro para evitar a pegajosidade dos componentes do sistema de teste usado.

[064] Para a detecção, pelo menos parte da amostra é exposta a um substrato sólido que conduz o antígeno imobilizado, isto é, a um substrato de detecção, e a ligação dos anticorpos ao antígeno é detectada.

[065] A ligação dos anticorpos aos antígenos imobilizados pode ser detectada por meio de qualquer ensaio que envolve a medição da mudança de massa no substrato, da mudança do índice refrativo, da mudança de entropia, da mudança de entalpia, da mudança da viscosidade, da mudança da temperatura, da mudança de cor, etc.

[066] A detecção da ligação de anticorpos ao antígeno no substrato de detecção pode ocorrer com qualquer método de detecção adequado, incluindo a simples detecção visual ou os métodos que incluem a detecção voltamétrica, amperométrica ou qualquer detecção eletroquímica.

[067] A detecção da ligação dos anticorpos no antígeno no substrato de detecção pode ocorrer em tempo real ou por meio de um ensaio de ponto final.

[068] Em um método em tempo real, em virtude de a detecção ocorrer em tempo real, a ligação dos anticorpos nos antígenos imobilizados nos substratos de detecção é diretamente detectada durante o processo de ligação. Para a detecção, em princípio, todas as técnicas de análise em tempo real, livres de rótulo podem ser usadas.

[069] Os ensaios de detecção em tempo real adequados incluem a ressonância plasmônica superficial ou a espectroscopia por impedância eletroquímica, a calorimetria de titulação isotérmica, a interferometria de biocamada, as grades ópticas, o cristal fotônico, a perfilagem ressonante acústica, os microequilíbrios de cristal de quartzo.

[070] Em um método de detecção em tempo real, o substrato sólido que conduz o antígeno pode ser com base em sílica, tais como substratos com base em dióxido de silício. Em uma modalidade como esta, os antígenos são preferivelmente modificados em uma ou ambas das cadeias de acila com um grupo funcional que habilita a imobilização. Os substratos com base em sílica são particularmente úteis quando a tecnologia da ressonância de anel for usada para detectar a ligação de anticorpos aos antígenos imobilizados. Preferivelmente, a detecção é realizada usando um chip biossensor usando um ressonador em anel com base em Si. Isto habilita que o método da invenção seja realizado com um dispositivo muito compacto.

[071] Também é bem possível que o substrato sólido seja com base em ouro. Os substratos com base em ouro são particularmente usados quando a ressonância plasmônica superficial ou a espectroscopia por impedância eletroquímica forem usadas para detectar a ligação de anticorpos aos antígenos imobilizados.

[072] A detecção da ligação de anticorpos e/ou outro material ao antígeno no substrato de detecção pode ser realizada em um dispositivo automatizado. Vários dispositivos automatizados serão conhecidos pelos versados na técnica, e os versados na técnica serão capazes de selecionar o meio de software adequado para determinar o grau ou a extensão da ligação no substrato de detecção.

[073] A detecção da ligação de anticorpos no antígeno no substrato de detecção também pode ocorrer por meio de um ensaio de ponto final. O termo “ensaio de ponto final” deve ser entendido como um ensaio em que o resultado de interesse é o resultado final depois de um período de incubação em ensaio fixo, ao contrário do supramencionado ensaio em tempo real. Um ensaio de detecção de ponto final pode, por exemplo, detectar mudanças nos níveis de cor, fluorescência, absorbância ou luminescência no final de um teste.

[074] Os ensaios de ponto final adequados incluem o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), Western blotting, ensaio de rotulagem radioativa, ensaio fotoespectrométrico, imunofluorescência, imunoprecipitação, imunocitoquímica, imuno-histoquímica, ensaio de detecção amperométrica ou voltamétrica, ou espectroscopia por impedância eletroquímica.

[075] Em uma modalidade preferida de um ensaio de ponto final, a detecção ocorre por meio de um ensaio de filtração immunogold. Em um ensaio como este, o substrato de detecção é uma membrana microporosa, preferivelmente, uma membrana de nitrocelulose ou uma membrana PVDF, na qual um antígeno é imobilizado.

[076] Em um ensaio de ponto final, a interação de anticorpos com os antígenos pode ser realizada usando os anticorpos secundários que se ligam à cadeia pesada dos anticorpos primários que se ligam aos antígenos imobilizados. Muitos anticorpos secundários adequados estão comercialmente disponíveis. O anticorpo secundário pode ser acoplado em nanopartículas ou contas, por exemplo contas de ouro, ou associado com lipossomos. Os exemplos de anticorpos secundários podem ser a proteína A ou G, possivelmente conjugada com uma enzima que habilita a detecção.

[077] Uma técnica ou detecção adequada em particular da ligação de anticorpos nos antígenos imobilizados no substrato de detecção é o assim denominado ensaio de filtração immunogold (IGFA), e, em particular, o ensaio dot filtração immunogold (DIGFA).

[078] Os ensaios filtração immunogold são os métodos que combinam ELISA e a técnica immunogold e são os métodos nos quais permite-se que uma amostra a ser ensaiada filtre através de uma membrana microporosa, preferivelmente, uma membrana de nitrocelulose, e seja capturada por uma sonda de captura revestida na membrana. Permite-se que uma sonda rotulada em ouro coloidal filtre através da membrana microporosa da mesma maneira. Pelo uso de uma membrana microporosa como o carreador para a sonda de captura e pelo emprego da ação capilar e da permeabilidade da membrana, os antígenos e os anticorpos podem reagir facilmente e podem ser convenientemente sujeitos a etapas de lavagem e/ou bloqueio opcionais. Quando a sonda rotulada em ouro coloidal se ligar à sonda de captura, as partículas de ouro coloidal agregam e aparece um ponto vermelho que é visível com o olho nu.

[079] No caso de o ensaio de ponto final da presente invenção ser um ensaio de filtração immunogold, o antígeno é imobilizado em uma membrana microporosa, preferivelmente, uma membrana de nitrocelulose. Depois da imobilização do antígeno sobre a membrana microporosa, as amostras opcionalmente pré-tratadas podem ser aplicadas na membrana. Depois da adição das frações de amostra e da reação dos antígenos imobilizados com os anticorpos contidos nas amostras na membrana, os segundos anticorpos rotulados com ouro coloidal podem ser adicionados sobre a membrana para ter a agregação de partícula de ouro no local da reação antígeno- anticorpo. No caso de agregação, pontos vermelhos ou marrons visíveis são formados. A intensidade do ponto é proporcional à quantidade das reações entre o antígeno e o anticorpo, isto é, à quantidade de anticorpos na amostra. Em outras palavras, uma amostra proveniente de uma pessoa que sofre de tuberculose irá resultar em um ponto mais intenso do que uma amostra proveniente de uma pessoa que está saudável.

[080] Os ensaios filtração immunogold são métodos simples e de rápida detecção em virtude de nenhum instrumento ser exigido, exceto uma membrana, e os reagentes e os resultados poderem ser observados pelo olho nu em poucos minutos.

[081] Em um ensaio de filtração immunogold, a membrana microporosa pode ser, por exemplo, uma membrana de nitrocelulose, uma membrana de acetato de celulose ou uma membrana PVDF com um diâmetro de poro adequado. Preferivelmente, a nitrocelulose é usada. Um diâmetro de poro adequado é 0,2 a 5 μm.

[082] Entre as várias etapas de um ensaio de filtração immunogold, a membrana pode ser lavada com um tampão adequado, por exemplo, um tampão com base em PBS. Tal tampão pode ser, por exemplo, um tampão PBS/AE que compreende NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4 e EDTA em água em pH fisiológico. Tal tampão pode ser um tampão com base em PBS que consiste em 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 0,2 g de KH2PO4, e 1,05 g de Na2HPO4 por litro de água deionizada duplamente destilada que contém 1 mM EDTA e 0,025% (m/v) de azida de sódio que é ajustado no pH 7,4.

[083] No caso em que DIGFA for usado, o antígeno pode ser imobilizado em relação à membrana microporosa de uma maneira ponto a ponto. Em um ensaio DIGFA, as amostras também são aplicadas na membrana na forma de pontos. Também, os segundos anticorpos rotulados com ouro coloidal são adicionados na forma de pontos. Um ensaio DIGFA é particularmente preferido em virtude de, em pontos diferentes em diversas membranas, vários antígenos que derivam de várias cepas micobacterianas poderem ser imobilizados. Desta maneira, torna-se possível prover a informação sobre com qual cepa micobacteriana um paciente está infectado. Uma outra vantagem de usar DIGFA é que as amostras derivadas a partir de diferentes pessoas podem ser comparadas em um teste, em virtude de DIGFA habilitar a rápida e confiável detecção da interação anticorpo-antígeno em uma quantidade ilimitada de pontos, dependendo do tamanho da membrana.

[084] A detecção da ligação de anticorpos e/ou outro material aos antígenos imobilizados, por exemplo, o tingimento em vermelho no caso de um ensaio DIGFA ser usado como um método de detecção, pode ser realizada em um dispositivo automatizado. Vários dispositivos automatizados serão conhecidos pelos versados na técnica e os versados na técnica serão capazes de selecionar meio de software adequado para quantificar o grau ou extensão da ligação nos substratos de detecção.

[085] A detecção da ligação dos anticorpos e/ou outro material ao antígeno imobilizado pode ser realizada por uma técnica de detecção visual ou qualquer outra técnica de detecção adequada. Em uma modalidade preferida em particular, a detecção por meio do ensaio de ponto final ocorre visualmente, preferivelmente, com o olho nu. Isto tem a vantagem da fácil detecção sem a necessidade de onerosa e complicada tecnologia de detecção. No caso em que DIGFA for usado, a ligação de anticorpos do anticorpo e/ou outro material aos antígenos imobilizados pode ser avaliada por meio do olho nu.

[086] Um sinal visual, por exemplo, o tingimento em vermelho no caso de um ensaio DIGFA ser aplicado como o ensaio de ponto final, também pode ser detectado com a ajuda de um aplicativo móvel, isto é, um programa de computador desenhado para executar em dispositivos móveis, tais como computadores tipo tablet ou telefones inteligentes. Por exemplo, pode ser usado um aplicativo que é desenhado para comparar o sinal de ligação entre diferentes amostras ou frações de amostra e que indica se o humano ou o animal a partir do qual a amostra originou tem tuberculose.

[087] O método da invenção pode compreender etapas adicionais que são vantajosas para a sensibilidade do método. Por exemplo, o método pode conter as etapas adicionais de expor a amostra às moléculas que têm afinidade com as moléculas na amostra que levam a um sinal de ligação que não é específico para a tuberculose a fim de eliminar estas moléculas não específicas.

[088] O método também pode conter as etapas adicionais de dividir a amostra. A alta especificidade dos antígenos de acordo com as fórmulas (I), (V) e (VI) usadas de acordo com a invenção para os anticorpos específicos de tuberculose e o risco inferior associado de falsos positivos também tornam possível diagnosticar de forma confiável se uma pessoa tem tuberculose sem a necessidade de dividir uma amostra proveniente de um humano ou um animal em duas frações de amostra das quais uma é exposta a antígenos antes de as duas frações serem expostas a um substrato de detecção com antígenos. Os métodos que envolvem dividir a amostra em frações são, por exemplo, descritos em WO 2005/116654 e WO 2013/186679. Contudo, o substrato sólido da invenção seria adequado em um método como este. Em uma modalidade, o método da invenção, portanto, pode ser um método em tempo real que compreende as etapas de: i) prover uma amostra proveniente de um humano ou um animal; ii) obter pelo menos duas frações da dita amostra; iii) expor a primeira das ditas frações a um substrato sólido que conduz antígenos imobilizados, iv) expor a segunda das ditas frações a um substrato sólido que não conduz antígenos imobilizados; v) expor a fração da amostra exposta na etapa iii) a um substrato de teste sólido que é um substrato sólido, da forma supradescrita para o segundo aspecto da invenção, e expor a fração da amostra exposta na etapa iv) a um substrato de controle sólido que tem a mesma composição do substrato de teste sólido; vi) detectar a ligação de anticorpos aos antígenos imobilizados da etapa v) em tempo real; e vii) comparar o grau ou extensão da ligação entre os substratos de teste e de controle, qualquer ligação menor observada ao substrato de teste sendo um indicador da presença de anticorpos no antígeno imobilizado na amostra que indica a tuberculose no humano ou no animal a partir dos quais as amostras originaram, em que os antígenos imobilizados em relação ao substrato sólido da etapa iii) compreendem pelo menos um tipo, preferivelmente, todos os tipos de antígenos que são imobilizados em relação aos substratos de teste e de controle sólidos.

[089] Em uma modalidade comparável, o método da invenção pode ser um método de ponto final de detecção dos anticorpos contra material micobacteriano em uma amostra, que compreende as etapas de: i) prover uma amostra a partir de um humano ou um animal; ii) obter pelo menos duas frações da dita amostra; iii) expor a primeira das ditas frações a um substrato sólido que conduz antígenos imobilizados; iv) expor a segunda das ditas frações a um substrato sólido que não conduz os antígenos imobilizados; ou armazenar pelo menos parte da segunda das ditas frações até a etapa v), ignorar a etapa de expor a segunda das ditas frações a um substrato sólido que não conduz os antígenos imobilizados; v) expor pelo menos parte da fração da amostra exposta na etapa iii) a um substrato de teste sólido que é um substrato que é um substrato sólido, da forma supradescrita para o segundo aspecto da invenção, e expor a fração da amostra exposta ou armazenada na etapa iv) a um substrato de controle sólido que tem a mesma composição do substrato de teste sólido; vi) detectar a ligação de anticorpos ao antígeno imobilizado da etapa v) em um ensaio de ponto final; e vii) comparar o grau ou extensão da ligação entre os substratos de teste e de controle, qualquer ligação menor observada ao substrato de teste sendo um indicador da presença de anticorpos no antígeno imobilizado na amostra que indica a tuberculose no humano ou no animal a partir dos quais as amostras originaram, em que os antígenos imobilizados em relação ao substrato sólido da etapa iii) compreendem pelo menos um tipo, preferivelmente, todos os tipos de antígenos que são imobilizados em relação aos substratos de teste e de controle sólidos.

[090] No contexto destas modalidades, entende-se que menor pode ser interpretado qualitativamente e quantitativamente, isto é, menor ligação pode ser interpretada como tendo menos eventos de ligação bem como tendo ligações mais fracas. A vantagem destas duas modalidades é que nenhuma amostra de uma pessoa saudável é exigida como uma amostra de referência ou de controle, mesmo se ainda houver sinal de antecedentes. Apenas uma amostra proveniente de um sujeito é necessária nestas modalidades.

[091] Adicionalmente, o substrato no qual o anticorpo é imobilizado na etapa iii) destas modalidades, no geral, não é feito do mesmo material do substrato de teste/controle. O substrato na etapa iii) pode ser feito de qualquer material que é inerte para ligação não específicas das moléculas da amostra. Tais materiais incluem politetrafluoretileno (por exemplo, Teflon®), polipropileno, polietercetona (PEEK) e polietileno. Os substratos de teste e de controle nestas modalidades são superfícies ou substratos sensoras de um dispositivo de detecção ou superfícies ou substratos de detecção em um ensaio de detecção, da forma discutida anteriormente.

EXEMPLOS

[092] Entende-se que os seguintes exemplos ilustram o princípio da invenção e não devem ser interpretados como limitante do escopo das reivindicações. EXEMPLO 1 SÍNTESE DE PEG-AZIDA CONJUGADA COM TUBERCULOSINIL

ADENOSINA PROVENIENTE DE TUBERCULOSINOL 2′,3′-O-Isopropilideno-5′-O-(4-nitrofenoxicarbonil)adenosina (2):

[093] Em uma suspensão de 1 (1,55 g, 5,04 mmol) em THF seco (25 mL) foi adicionado Et3N (1,5 mL, 10,1 mmol, 2 eq) e 4-nitrofenil cloroformato (1,52 g, 7,5 mmol, 1,5 eq) parte a parte em 0 °C. A mistura foi agitada 20 h em temperatura ambiente. Então, a reação foi finalizada por gelo e subsequentemente EtOAc e NaHCO3 aquoso saturado (15 mL) foram adicionados. As camadas foram separadas, e a camada orgânica foi lavada com NaHCO3 (15 mL) e NaCl aquoso saturado (15 mL), seca sobre MgSO4, concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (sílica gel, AcOEt/MeOH = 25/1) para permitir 2 (1,95 g, 82%) como um sólido espumoso amarelo claro. Os dados NMR corresponderam à literatura.

[094] 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,33 (s, 1 H), 8,22 (d, J = 9,2 Hz, 2 H), 7,91 (s, 1 H), 7,29 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 6,15 (s, 1 H), 5,98 (s, 2 H), 5,52 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 5,20 (dd, J = 6,0 Hz, 2,8 Hz, 1 H), 4,60-4,55 (m, 2 H), 4,49-4,44 (m, 1 H), 1,63 (s, 3 H), 1,41 (s, 3 H), 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 155,75, 155,34, 153,28, 152,16, 149,33, 145,55, 139,98, 125,40, 121,73, 120,40, 114,90, 91,05, 84,86, 84,36, 81,63, 68,55, 27,27, 25,49.

((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-amino-9H-purina-9-il)-2,2-dimetiltetra- hidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)metil (2-(2-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)carbamato (4):

[095] Em uma solução de 2 (1,35 g, 2,85 mmol) em CHCl3 (20 mL) foi adicionado Et3N (0,60 mL, 4,28 mmol) e N3-PEG-Azida 3 (0,6 mL, 3,02 mmol, 1,1 eq) em temperatura ambiente. A reação foi agitada por 18 h. Posteriormente, a reação foi concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (sílica gel, (MeOH/CH2Cl2 = 0/100, 1/98, 3/97) para proporcionar 4 (1,2 g, 76%) como um óleo pegajoso amarelo.

((2R,3S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-3,4-di-hidroxitetra-

hidrofurano-2-il)metil (2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)carbamato (5):

[096] Uma solução de 4 (1,01 g, 1,83 mmol) em uma mistura de TFA e água (4:1, 10 mL) foi agitada por 2 h. O TLC indicou conversão completa. A reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi coevaporado com EtOH (3 × 10 mL) e CH2Cl2 (3 × 10 mL), para proporcionar um produto cru como uma espuma amarela brilhante. A análise NMR do produto cru indicou impurezas, portanto, o cru foi purificado por cromatografia de coluna ((MeOH/ CH2Cl2, 0/100, 3/97, 5/95/ 2/8) para permitir o produto puro (0,703 g, 75%) antes de iniciar a próxima etapa.

(4aS,5R,6S)-5-((E)-5-cloro-3-metilpent-3-en-1-il)-1,1,5,6-tetrametil- 1,2,3,4,4a,5,6,7-octa-hidronaftaleno (cloreto de tuberculosinil):

[097] Em uma suspensão de N-clorosuccinimida (0,18 g, 1,34 mmol, 1,3 eq) em CH2Cl2 seco (2,7 mL), resfriado até -20 °C, foi adicionado gota a gota sulfeto de dimetil (0,115 mL, 8,78 mmol, 1,5 eq) em CH2Cl2 seco (0,9 mL). Permitiu-se que a suspensão branca leitosa aquecesse até 0 °C pela substituição em banho de gelo por 15 min, depois do que o frasco da reação foi novamente colocado em banho de resfriamento, que estava em -40 °C. Tuberculosinol (0,3 g, 1,03 mmol) em CH2Cl2 seco (3,5 mL) com o auxílio de uma seringa bombeou durante 15 min. Depois da adição, o banho de resfriamento foi removido e permitiu-se que a reação aquecesse até a temperatura ambiente. Permitiu-se que a reação agitasse nesta temperatura por 2 h, depois do que o TLC indicou a completa conversão do tuberculosinol. A mistura da reação foi concentrada sob pressão reduzida e tratada com pentano, sob o qual succinimida foi eliminada por óleo. A mistura foi decantada e filtrada, o material eluído foi concentrado sob pressão reduzida que permite o cloreto de tuberculosinil cru (0,31 g, 97%) como um óleo amarelo. O cloreto de tuberculosinil cru foi usado na próxima etapa sem purificação.

6-amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-(15-azido-3-oxo-2,7,10,13-tetraoxa-4- azapentadecil)-3,4-di-hidroxitetra-hidrofurano-2-il)-1-((E)-3-metil-5-((1R,2S,8aS)- 1,2,5,5-tetrametil-1,2,3,5,6,7,8,8a-octa-hidronaftaleno-1-il)pent-2-en-1-il)-9H- purina-1-ium (TbAd-PEG-N3):

[098] O cloreto de tuberculosinil cru (0,2 g, 0,61 mmol) obtido na etapa prévia foi tomado em um frasco de base redonda envolvido com folha de alumínio (5 mL). No frasco, DMF (1,2 mL), iodeto de sódio (0,11 g, 0,73 mmol, 1,2 eq) e adenosina-PEG-N3 5 (0,375 g, 0,73 mmol, 1,2 eq) foram sequencialmente adicionados. Permitiu-se que a suspensão resultante agitasse por 3 dias (65 h). O TLC indicou a conversão completa do material inicial. A mistura da reação foi concentrada sob pressão reduzida e subsequentemente purificada usando cromatografia de coluna (MeOH/CH2Cl2 = 1/19, 1/9 para proporcionar TbAd-PEG-N3 pura como um sólido espumoso ligeiramente amarelo.

[099] 1H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 8,52 (s, 1H), 8,48 (s, 1H), 6,07 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 5,51 – 5,43 (m, 2H), 4,93 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 4,70 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 4,33 (dddt,

J = 24,9, 12,9, 8,8, 3,9 Hz, 5H), 3,69 – 3,59 (m, 13H), 3,55 (t, J = 5,4 Hz, 3H), 3,39 – 3,33 (m, 2H), 3,29 (d, J = 5,4 Hz, 2H), 2,28 – 2,19 (m, 1H), 2,13 – 2,05 (m, 2H), 1,90 (d, J = 1,3 Hz, 4H), 1,83 – 1,74 (m, 1H), 1,65 – 1,49 (m, 4H), 1,48 – 1,38 (m, 2H), 1,22 (td, J = 12,6, 5,5 Hz, 1H), 1,10 – 0,99 (m, 7H), 0,92 (q, J = 7,3, 6,7 Hz, 1H), 0,85 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,66 (s, 3H), 13C NMR (101 MHz, Metanol-d4) δ 158,4, 153,9, 152,2, 148,3, 147,8, 147,6, 147,1, 144,0, 121,3, 117,4, 115,6, 90,2, 84,6, 75,6, 71,9, 71,6, 71,5, 71,5, 71,4, 71,4, 71,2, 71,2, 71,0, 70,8, 65,2, 51,7, 42,0, 41,8, 41,1, 38,1, 37,0, 35,9, 34,6, 33,9, 32,6, 30,3, 29,5, 28,6, 23,2, 17,3, 16,6, 15,6. HRMS (ESI) calculado para C39H62N9O8+ [M]+ 784,472, descoberto: 784,472. EXEMPLO 2

[0100] O TbAd-PEG-N3 (correspondente ao composto de acordo com a fórmula (V), da forma mencionada anteriormente neste pedido) e obtido da forma descrita no Exemplo 1 foi biotinilado por meio da fração de azida com conjugado dibenzociclo-octina- PEG4-biotina (DBCO-4PEG-BIOTINA) em uma reação de clique livre de cobre de acordo com o esquema de reação a seguir:

[0101] A fim de realizar esta reação, DBCO-4PEG-BIOTINA foi dissolvido em água:MeOH (50:50) para pesagem mais fácil em virtude de o mesmo ser um composto pegajoso (5 mg em 1 mL). 0,39 mL foi adicionado no antígeno TbAd-PEG-N3 e a mistura da reação foi misturada e agitada em temperatura ambiente. A reação foi monitorada usando TLC e mais DBCO-4PEG-BIOTINA foi adicionado para consumir mais antígeno.

Quando foi determinado que a reação do antígeno com o DBCO-4PEG-BIOTINA estava completa, o solvente foi evaporado em rotavap e o composto foi congelado a seco durante a noite. A molécula de TbAd-PEG-biotina obtida corresponde ao antígeno representado pela fórmula (VI). EXEMPLO 3

[0102] A exposição desta molécula de TbAd-PEG-biotina aos anticorpos no soro derivado a partir de um sujeito que foi testado positivo para a tuberculose foi testada por meio de Ressonância Plasmônica Superficial (SPR). Por este propósito, os discos SPR dourados modificados por dextrano acoplados em estreptavidina (SAHC30M, Xantec) foram usados em um sistema ESPRIT SPR de canal duplo (Kinetic Evaluation Instruments, Holanda). Este sistema tem um canal duplo com duas áreas (canais) de reação independentes no mesmo sensor de ouro. Em um primeiro canal, Biotina-HRP foi acoplado por meio da fração de estreptavidina do disco sensor para obter um substrato de controle (Biotina HRP 0,1 mg/mL). Em um segundo canal, TbAd-PEG- biotina foi acoplado por meio da fração de estreptavidina do disco sensor para obter um substrato de teste de 1 mg/mL de TbAd-PEG-biotina em metanol/água 33%). Como tampão de bloqueio do antígeno, PBS-gelatina foi usado.

[0103] A fim de testar se o TbAd-PEG-biotina imobilizado foi capaz de detectar anticorpos específicos de TB, os discos de controle e de teste foram expostos a um soro diluído 250 x derivado a partir de um sujeito que foi testado positivo para tuberculose em gelatina PBS.

[0104] A figura 1 mostra os resultados deste teste. A linha pontilhada é a linha de base. O soro é injetado no ponto do tempo indicado com “1”.

[0105] A fina linha horizontal pontilhada em ~270 m°/26,30 °C representa uma linha de base.

[0106] A linha listrada mostra o espectro do controle. Sua linha reta até o ponto no tempo “1” indica a mudança do índice refrativo da amostra. O curso praticamente horizontal da linha HRP imediatamente depois do ponto no tempo “1” indica que nenhuma ligação de anticorpo ocorre.

[0107] A linha contínua mostra o espectro da interação do soro com o TbAd-PEG- biotina imobilizado. Esta linha representa uma típica curva dos anticorpos de ligação específica ao TbAd-PEG-biotina imobilizado. A linha reta para cima indica a mudança do índice refrativo da amostra. Depois disto, a linha sobe gradualmente, indicando a ligação de anticorpos aos antígenos de TbAd-PEG-biotina imobilizado no disco SPR.

[0108] No ponto no tempo “2”, uma etapa de lavagem foi iniciada com o tampão de lavagem. Da forma mostrada no espectro, não foi possível eliminar por lavagem o sinal completo.

[0109] A figura 1 mostra que, quando os antígenos são imobilizados em relação a um substrato sólido por meio de um grupo de ligação na posição R5 da forma indicada na fórmula (I) exposta, excelente apresentação de antígeno é obtida.

REFERÊNCIAS

[0110] WO 2005/116654

[0111] WO 2013/186679

[0112] NL 2017204 C1

[0113] WO2017/211314 A1

[0114] WO2017/211316 A1

[0115] Buter J, Heijnen D, Wan IC, Bickelhaupt FM, Young DC, Otten E, Moody DB, Minnaard AJ. J Org Chem. 2016 Jul 11.

Claims (27)

REIVINDICAÇÕES

1. Antígeno sintético representado pela seguinte fórmula (I): (I) caracterizado por, na fórmula (I): R3 e R4 serem selecionados independentemente a partir de hidrogênio, OH ou um grupo acila, em qualquer combinação dos mesmos; R5 ser um grupo de ligação que compreende um grupo funcional que habilita a imobilização do antígeno em relação a um substrato sólido; R1 ser H ou um grupo com a fórmula (II) (II); e R2 estar ausente ou ser um grupo com a fórmula (II), desde que um de R1 e R2 seja um grupo com a fórmula (II); e enantiômeros ou diastereoisômeros do dito antígeno.

2. Antígeno sintético, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R4 ser OH, preferivelmente em que R4 e R3 são OH.

3. Antígeno sintético, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o dito antígeno ser representado por um composto das fórmulas (III) ou (IV), em que R5 é da forma definida na reivindicação 1: (III)

(IV).

4. Antígeno sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o dito grupo de ligação ser um grupo polietileno glicol (PEG) que contém um grupo funcional que habilita a imobilização em relação a um substrato sólido.

5. Antígeno sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o dito grupo de ligação compreender um grupo funcional selecionado a partir de um grupo tio, um grupo amina, um grupo aldeído, um grupo azida, uma poli-histidina, ou um grupo biotina.

6. Antígeno sintético, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o dito grupo de ligação ser um grupo PEG biotinilado.

7. Antígeno sintético, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o dito grupo de ligação ser um grupo PEG que contém um grupo azida.

8. Substrato sólido, caracterizado por compreender pelo menos um tipo de antígeno imobilizado em relação ao mesmo, em que o dito pelo menos um tipo de antígeno é representado pela seguinte fórmula (I) ou um enantiômero ou diastereoisômero da mesma: (I) em que, na fórmula (I) R3 e R4 são selecionados independentemente a partir de hidrogênio, OH ou um grupo acila, em qualquer combinação dos mesmos; R5 é um grupo de ligação;

R1 é H ou um grupo com a fórmula (II) (II); e R2 está ausente ou é um grupo com a fórmula (II), desde que um de R1 e R2 seja um grupo com a fórmula (II); e em que o dito antígeno é imobilizado em relação ao dito substrato sólido por meio do dito grupo de ligação.

9. Substrato sólido, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ser obtido pela imobilização sobre o dito substrato de pelo menos um tipo de antígeno, da forma definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

10. Substrato sólido, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado por o dito substrato ser uma superfície sensora ou de detecção de um dispositivo de ressonância plasmônica superficial, dispositivo de espectroscopia por impedância eletroquímica, dispositivo de calorimetria de titulação isotérmica, dispositivo de interferometria de biocamada, dispositivo de grades ópticas, dispositivo de cristal fotônico, dispositivo de perfilagem ressonante acústica, ou dispositivo de microequilíbrio de cristal de quartzo; ou uma superfície sensora ou de detecção em um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), um ensaio Western blotting, ensaio de rotulagem radioativa, ensaio fotoespectrométrico, ensaio de imunofluorescência, ensaio de imunoprecipitação, ensaio de imunocitoquímica, ensaio de imuno-histoquímica, ensaio de detecção amperométrica, ensaio de detecção voltamétrica, ou ensaio de espectroscopia por impedância eletroquímica.

11. Substrato sólido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-10, caracterizado por o dito substrato ser nitrocelulose.

12. Substrato sólido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-10, caracterizado por o dito substrato ser um disco sensor da ressonância plasmônica superficial (SPR).

13. Substrato sólido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a

12, caracterizado por o dito substrato ser modificado com um grupo selecionado a partir de carboximetildextrano, carboximetilcelulose, carboximetilpolietilenoglicol, carboximetildextrano derivado de estreptavidina, carboximetildextrano derivado de biotina, carboximetildextrano modificado por dissulfeto, carboximetildextrano derivado de NTA, policarboxilato, policarboxilato derivado de biotina, policarboxilato linear derivado de hidrazida, policarboxilato linear modificado por dissulfeto, poli-L-lisina, ácido hialurônico, gelatina, alginato e/ou em que o substrato compreende um material selecionado a partir de materiais de suporte ativados por éster NHS, materiais de suporte ativados por aldeído, materiais de suporte ativados por azlactona, materiais de suporte ativados por CDI, materiais de suporte reativos a sulfidrila, materiais de suporte ativados por maleimida, materiais de suporte ativados por iodoacetil, materiais de suporte de piridil dissulfeto, ou materiais de suporte ativados por hidrazida.

14. Método para imobilização de um antígeno em relação a um substrato sólido, caracterizado por compreender: imobilizar pelo menos um antígeno representado pela seguinte fórmula (I) ou um enantiômero ou diastereoisômero do dito antígeno: (I) em que, na fórmula (I): R3 e R4 são selecionados independentemente a partir de hidrogênio, OH ou um grupo acila, em qualquer combinação dos mesmos; R5 é um grupo de ligação; R1 é H ou um grupo com a fórmula (II) (II); e

R2 está ausente ou é um grupo com a fórmula (II), desde que um de R1 e R2 seja um grupo com a fórmula (II); sobre um substrato sólido por meio de dito grupo de ligação na posição R5.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o antígeno ser da forma definida em qualquer uma das reivindicações 1-7.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por o dito substrato ser uma superfície sensora ou de detecção de um dispositivo de ressonância plasmônica superficial, dispositivo de espectroscopia por impedância eletroquímica, dispositivo de calorimetria de titulação isotérmica, dispositivo de interferometria de biocamada, dispositivo de grades ópticas, dispositivo de cristal fotônico, dispositivo de perfilagem ressonante acústica, ou dispositivo de microequilíbrio de cristal de quartzo; ou uma superfície sensora ou de detecção em um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), um ensaio Western blotting, ensaio de rotulagem radioativa, ensaio fotoespectrométrico, ensaio de imunofluorescência, ensaio de imunoprecipitação, ensaio de imunocitoquímica, ensaio de imuno-histoquímica, ensaio de detecção amperométrica, ensaio de detecção voltamétrica, ou ensaio de espectroscopia por impedância eletroquímica.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16, caracterizado por o dito substrato ser selecionado a partir do grupo de nitrocelulose, PVDF, placa de ELISA, um substrato com base em silício, um disco sensor de SPR.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-17, caracterizado por a superfície do substrato ser modificada para habilitar a imobilização do antígeno.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a superfície do substrato ser modificada com um grupo selecionado a partir de carboximetildextrano, carboximetilcelulose, carboximetilpolietilenoglicol, carboximetildextrano derivado de estreptavidina, carboximetildextrano derivado de biotina, carboximetildextrano modificado por dissulfeto, carboximetildextrano derivado de NTA, policarboxilato, policarboxilato derivado de biotina, policarboxilato linear derivado de hidrazida, policarboxilato linear modificado por dissulfeto, poli-L-lisina, ácido hialurônico, gelatina, alginato, e/ou em que o substrato compreende um material selecionado a partir de materiais de suporte ativados por éster NHS, materiais de suporte ativados por aldeído, materiais de suporte ativados por azlactona, materiais de suporte ativados por CDI, materiais de suporte reativos a sulfidrila, materiais de suporte ativados por maleimida, materiais de suporte ativados por iodoacetil, materiais de suporte de piridil dissulfeto, materiais de suporte ativados por hidrazida.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-19, caracterizado por a imobilização ocorrer por meio de interação avidina-biotina, tal como interação estreptavidina-biotina ou interação neutravidina-biotina.

21. Biossensor, caracterizado por compreender o substrato sólido como definido em qualquer uma das reivindicações 8-13.

22. Sistema de detecção de tuberculose, caracterizado por compreender o substrato sólido como definido em qualquer uma das reivindicações 8-13.

23. Método de detecção da presença de anticorpos contra material micobacteriano em uma amostra, caracterizado por compreender as etapas de: (1) prover uma amostra proveniente de um humano ou animal; (2) expor pelo menos parte da amostra aos antígenos sintéticos como definido em qualquer uma das reivindicações 1-7; (3) detectar a ligação dos anticorpos na dita amostra aos ditos antígenos, em que a ligação de um anticorpo nos ditos antígenos é indicativa para a presença de material micobacteriano em um humano ou animal.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por, na etapa (2), a dita pelo menos uma parte da amostra ser exposta ao substrato sólido como definido em qualquer uma das reivindicações 8-13.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado por compreender adicionalmente detectar a ligação de anticorpos na dita amostra a um ou mais tipos adicionais de antígeno imobilizado.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-25,

caracterizado por a detecção da ligação dos anticorpos aos antígenos imobilizados envolver a medição da mudança de massa no substrato, mudança do índice refrativo, mudança de entropia, mudança de entalpia, mudança da viscosidade, mudança da temperatura, ou mudança de cor.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-26, caracterizado por a detecção envolver uma técnica selecionada a partir de ressonância plasmônica superficial, espectroscopia por impedância eletroquímica, calorimetria de titulação isotérmica, interferometria de biocamada, grades ópticas, cristal fotônico, perfilagem ressonante acústica, microequilíbrios de cristal de quartzo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), Western blotting, ensaio de rotulagem radioativa, ensaio fotoespectrométrico, imunofluorescência, imunoprecipitação, imunocitoquímica, imuno-histoquímica, espectroscopia por impedância eletroquímica, ensaio amperométrico, ou ensaio voltamétrico, ou um ensaio de filtração immunogold, preferivelmente em que o ensaio immunogold é um ensaio dot immunogold (DIGFA).