CN112585467A - 用于结核病检测的合成抗原 - Google Patents

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Abstract

本文提供合成抗原和包含其上固定有抗原的固体基质，以及将所述抗原固定在固体基质上的方法。本文还提供一种包括所述固体基质的生物传感器和结核病检测系统。本文还提供使用所述合成抗原或固体基质来检测样品中针对分枝杆菌物质的抗体的存在的方法。

Description

用于结核病检测的合成抗原
本发明涉及合成抗原和包含其上固定有抗原的固体基质，以及将所述抗原固定于固体基质的方法。本发明还涉及一种包括所述固体基质的生物传感器和结核病检测系统。本发明还涉及使用所述合成抗原或固体基质来检测样品中针对分枝杆菌物质的抗体的存在的方法。
引言
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是分枝杆菌科中的一种致病细菌菌种，并且是大多数结核病(TB)的致病因子。
在许多中低收入国家，TB仍然是主要的致死原因之一。此外，报道了越来越多的多药抗性TB病例。
因此，一种可靠而快速的结核病诊断方法至关重要。
虽然已经开发了几种诊断结核病的方法，但是所有方法都有其缺点。
感染结核分枝杆菌的人或动物通常产生针对分枝杆菌的抗体。在从感染个体获取的样品中，这些抗体的存在表明了感染。最常见的分枝杆菌特异性抗原是分枝菌酸或其衍生物。例如，WO 2005/116654和WO 2013/186679描述了通过检测抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合，来检测样品中针对分枝菌酸的抗体，用于诊断活动性结核病的方法。
在这方面，人们特别感兴趣的另一种类型的抗原包括结核菌素腺苷(tuberculosinyl adenosine，TbAd)抗原及其衍生物。
与本发明同一申请人名下的荷兰专利NL 2017204 C1描述了与其它类型的抗原相联合的固定的结核菌素腺苷抗原，用于检测样品中是否存在针对分枝杆菌物质的抗体。样品中分枝杆菌物质的存在表明样品来源对象的结核病。
然而，发明人认为在检测结核病的灵敏度方面存在改进的空间。
发明内容
发明人现已发现，通过以下方式，能够显著改善结核菌素腺苷抗原的抗原展示(antigen presentation)：在天然结核菌素腺苷抗原(1-结核菌素腺苷)于腺苷部分上具有羟甲基的位置处提供接头基团，并通过所述接头将所述抗原固定至固体基质。
因此，在第一方面，本发明涉及由下式(I)表示的合成抗原以及该抗原的对映异构体或非对映异构体。
Figure BDA0002939144570000021
式(I)R1为H或具有式(II)的基团
Figure BDA0002939144570000022
R2不存在或是具有式(II)的基团，前提条件是R1和R2之一是具有式(II)的基团。
R3和R4独立地选自氢、OH或酰基，以它们的任何组合。
R5是包含官能团的接头基团，其能够将抗原，和所述抗原的对映异构体或非对映异构体固定于固体基质。
在第二方面，本发明涉及一种固体基质，其包含固定于其上的至少一种类型的抗原，其中所述至少一种类型的抗原是由下式(I)表示的物质，或其对映异构体和非对映异构体，及其混合物：
Figure BDA0002939144570000023
其中在式(I)中，R3和R4独立地选自氢、OH或酰基，以它们的任何组合，R5是接头基团，R1是H或具有式(II)
Figure BDA0002939144570000024
(II)的基团，并且R2不存在或是具有式(II)的基团，前提条件是R1和R2之一是具有式(II)的基团，其中所述抗原在R5位置处通过所述接头基团固定于所述固体基质。
在第三方面，本发明涉及将抗原固定于固体基质的方法，包括：将由下式(I)表示的抗原或该抗原的对映异构体、非对映异构体及其混合物通过处于R5位置处的接头基团固定在固体基质上：
Figure BDA0002939144570000031
其中在式(I)中，R3和R4独立地选自氢、OH或酰基，以它们的任何组合，并且其中R5是接头基团，R1是H或具有式(II)
Figure BDA0002939144570000032
(II)的基团，并且R2不存在或是具有式(II)的基团，前提条件是R1和R2之一是具有式(II)的基团。
在第四方面，本发明涉及一种生物传感器，其包括根据第二方面的固体基质。
在第五方面，本发明涉及一种结核病检测系统，其包括根据第二方面的固体基质。
在第六方面，本发明涉及一种检测样品中针对分枝杆菌物质的抗体的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供来自人或动物的样品；
(2)使样品的至少部分暴露于根据本发明的第一方面的合成抗原或根据本发明的第二方面的固体基质；
(3)检测所述样品中的抗体与所述抗原的结合，
其中抗体与所述抗原的结合指示人或动物中分枝杆菌物质的存在。
附图说明
图1显示了血清抗体与SPR基质的结合的SPR光谱，其中，结核菌素腺苷抗原通过生物素化的PEG接头固定于所述SPR基质，根据本发明所述。
发明详述
本文所述的合成抗原能够与指示人或动物中分枝杆菌物质的存在的抗体结合。在本文中，“分枝杆菌物质”指导致人或动物中抗体产生的、源自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的物质。该物质的存在指示结核病。发明人惊奇地发现，当如上式(I)所示，上文描述的抗原通过R5位置处的接头基团固定至固体基质时，能获得优异的抗原展示，相较于当抗原例如通过R3或R4基团固定的情况。“更好的展示”是指针对样品中结核菌素腺苷的抗体显示出对固定的抗原的改善的识别。这导致结核菌素腺苷抗体标志物的检测灵敏度的显著提高，这进而改善了结核病的检测。
本发明中使用的结核菌素腺苷衍生的合成抗原由下式(I)及其对映异构体或非对映异构体表示：
Figure BDA0002939144570000041
式(I)中R1为H或具有式(II)的基团
Figure BDA0002939144570000042
R2不存在或是具有式(II)的基团，前提条件是R1和R2之一是具有式(II)的基团。
R3和R4独立地选自氢、OH或酰基，以它们的任何组合。
R5是接头基团。抗原可通过R5处的所述接头基团而固定于固体基质。
在式(I)中，R1可以是式(II)的基团，而R2可以不存在。在其它实施方式中，R1可以是H，而R2可以是式(II)的基团。在R2是式(II)的基团的情况中，其所连接的氮带有正电荷。
在R3或R4为酰基的情况下，优选R3和R4中仅一个为酰基。例如，R3或R4可以是酰胺、酯、酮或醛或羧酸基团。
R3可以是H，且R4是OH。也可以R4为H且R3为OH。R3和R4都可以是H。
优选R3和R4之一是OH，例如R4是OH或R3是OH。优选R4为OH，甚至更优选R4和R3为OH。这样的分子可以有效地合成，例如根据Buter等(2016)描述的方法，并且显示良好的抗原展示。
在一个优选的实施方式中，式(I)的抗原由式(III)或(IV)的化合物表示，其中R5是接头基团：
Figure BDA0002939144570000051
在这方面，根据本发明的固体基质可包含能够与落在式(I)定义内的指示结核病的抗体结合的抗原的任何组合，例如，根据式(I)的抗原的组合，其包含式(III)和(IV)的化合物。基质可以仅包含一种根据式(I)的具体化合物，例如仅1-结核菌素腺苷抗原(根据式(III)，仅化合物(IV)或这些分子的任何组合)。也可以是对映异构体或非对映异构体的组合。
根据式(I)、(III)和(IV)的合成抗原可以例如根据Buter等(2016)中所描述的方法来合成。接头基团可以根据有机化学领域中的可用技术来添加。在这方面，接头偶联的腺苷部分优选在将腺苷部分偶联至结核菌素基(tuberculosinyl moiety)部分之前制备。
为了检测样品中抗体的存在，可将抗原固定于固体基质，可使该固体基质暴露于源自人或动物的样品，从而可以定性地或定量地或以两种方式确定抗体与固定的抗原的结合。应注意，在本申请中，术语“固体基质”与“固体表面”或“固体支持物”含义相同。
在该方面中，固体基质可以是表面等离子共振装置、电化学阻抗光谱装置、等温滴定量热装置、生物层干涉亮度装置、光栅装置、光子晶体装置、声共振仿形装置或石英晶体微天平装置的传感或检测表面；或酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹试验、放射性标记试验，光谱试验、免疫荧光试验、免疫沉淀试验、免疫细胞化学试验、免疫组织化学试验、安培检测试验、伏安检测试验或电化学阻抗光谱试验中的传感或检测表面。
在一个实施方式中，所述固体基质是硝酸纤维素。
在另一个实施方式中，所述固体基质是表面等离子体共振(SPR)传感器盘。
关于接头基团，适合于将抗原固定于固体基质的任何接头基团都可以是适格的，且适合于固定抗原的多种接头基团是本领域已知的。这种接头的例子将在下文讨论。
通常，优选接头基团在一定程度上是亲水的，除非是通过疏水相互作用进行固定的情况。亲水性使抗原更易溶于水性溶液，因此更易于使用。增加的亲水性使固定有抗原的检测表面或传感器表面更加亲水。因此，抗原中抗体的相互作用更容易发生，并将提高检测速度。此外，在使用合成抗原的情况下，更容易合成抗原。
为了实现对于固体基质的固定，接头优选包含能够实现对于基质的固定的官能团。因此，本申请中术语“官能团”应理解为能够将抗原固定于固体基质的基团。为此目的，所述接头基团可包含选自硫基，胺基，醛基，叠氮基，聚组氨酸或生物素基的官能团。
用于本发明目的的合适的接头是合适官能化以实现固定的聚乙二醇(PEG接头)。在一个优选的实施方式中，所述接头基团是包含能够实现对于固体基质的固定的官能团的PEG(聚乙二醇)。许多合适的PEG接头是可用的，并且许多方式适合将抗原偶联至固体基质。PEG基团可以例如用以下基团官能化，包括选自硫基，胺基，醛基，叠氮基，聚组氨酸或生物素基团的官能团。因此，在一个实施方式中，接头基团可以是生物素化的PEG基团。在另一个实施方式中，所述接头基团可以是包含叠氮化物基团的PEG基团，例如，如以下式(V)所示。
Figure BDA0002939144570000061
因此，可以通过将至少根据式(V)的抗原固定在所述基质上来获得根据本发明的固体基质。在这种情况下，固定作用是通过叠氮化物偶联进行的，任选地通过所述叠氮化物将另一官能团如生物素偶联至接头上。根据本发明的示例性抗原例如可以是以下根据式(VI)的抗原：
Figure BDA0002939144570000071
一些偶联方法要求对抗原以及与抗原偶联的固体基质进行修饰。所述基质可以用选自以下的基团修饰：羧甲基葡聚糖，羧甲基纤维素，羧甲基聚乙二醇，链霉亲和素衍生的羧甲基葡聚糖，生物素衍生的羧甲基葡聚糖，二硫化物修饰的羧甲基葡聚糖，NTA衍生的羧甲基葡聚糖，聚羧酸酯/盐，生物素衍生的聚羧酸酯/盐，酰肼衍生的线性聚羧酸酯/盐，二硫化物衍生的线性聚羧酸酯/盐，聚-L-赖氨酸，透明质酸，明胶，藻酸盐。经修饰基质的其它示例包括：
·NHS酯活化的支持材料，其中NHS酯是通过EDC活化羧酸酯分子与抗原上的伯胺反应形成的反应性基团；
·醛活化的支持材料，其中抗原的偶联通过称为还原胺化的反应进行；
·吖内酯(azlactone)活化的支持材料，包括丙烯酰胺与吖内酯的共聚合；
·CDI活化的支持材料，其中羰基二咪唑(CDI)活化羟基以形成反应性咪唑氨基甲酸酯，其与含伯胺/修饰的抗原形成氨基甲酸酯键；
·巯基反应性支持材料，其中硫醇基团可用于直接偶联反应；
·马来酰亚胺活化的支持材料，其中马来酰亚胺活化的试剂形成稳定的硫醚键；
·碘乙酰基活化的支持材料，其与巯基反应，产生稳定的硫醚键；
·吡啶基二硫化物支持材料，其中吡啶基二硫化物与巯基反应；和
·酰肼活化的支持材料。
通过在(修饰的)抗原(例如伯胺、巯基、羧酸、醛)上特定的官能团和支持材料上的反应性基团之间形成共价化学键，可以将抗原直接固定或“偶联”到固体支持材料上。也可将抗原非共价结合地固定，如通过疏水性相互作用或通过链霉亲和素-生物素偶联。在基于疏水性进行固定的情况下，接头应配备有合适的疏水性末端。
可采用各种偶联方法。例如，硫偶联，胺偶联和羰基反应固定化方法，其涉及通过羰基(糖)基偶联，其中顺式二醇可被高碘酸钠氧化以产生醛作为共价固定位点。也可采用自组装固定方法。
例如，基于二氧化硅的基质可以用含有游离胺基的硅烷衍生物修饰，例如，氨基丙基三乙氧基硅烷或氨基甲氧基硅烷。该游离胺基与硫醇修饰的抗原自发反应以形成共价键。这不需要复杂方案。
在金固体基质例如SPR基质的情况下，可以将硫醇半胱胺单层施加到金基质上。然后，硫醇半胱胺的游离胺可用于与硫醇修饰的抗原的自发偶联反应。这不需要复杂方案。
如果将SPR传感器盘用作固体基质，则可以使用平面(2D)覆层或3D水凝胶基质对其进行修饰。平面覆层可包括：生物素，共价固定在糖单层上，羧甲基葡聚糖表面；羧甲基化的枝状聚甘油；羧甲基化四乙二醇单层；羧基官能化的自组装烷基单层；葡聚糖表面；聚羧酸盐表面；疏水性平面烷基层；肼修饰的羧基表面；部分烷基衍生的羧甲基葡聚糖表面；NTA衍生的螯合表面；羟基官能化的自组装烷基单层；蛋白A/G衍生的羧甲基葡聚糖表面；链霉亲和素衍生的羧甲基葡聚糖表面；四甘醇单层；二硫键修饰的羧甲基葡聚糖表面；紫外光交联剂衍生的羧甲基葡聚糖；紫外线光交联剂衍生的聚羧酸盐表面。3D水凝胶基质可包括：琼脂糖水凝胶；海藻酸盐水凝胶；生物素，固定在羧甲基葡聚糖水凝胶中；生物素，固定在线性聚羧酸盐水凝胶中；线性聚羧酸盐水凝胶；羧甲基纤维素水凝胶；羧甲基葡聚糖水凝胶；羧甲基聚乙二醇；酰肼衍生的线性聚羧酸盐水凝胶；部分烷基衍生的羧甲基葡聚糖水凝胶；NTA衍生的羧甲基葡聚糖水凝胶；NTA衍生的线性聚羧酸盐水凝胶；蛋白A/G衍生的羧甲基葡聚糖水凝胶；蛋白A/G衍生的线性聚羧酸盐水凝胶；聚乙二醇；聚-L-赖氨酸；链霉亲和素衍生的羧甲基葡聚糖水凝胶；链霉亲和素衍生的线性聚羧酸盐水凝胶；二硫化物修饰的羧甲基葡聚糖水凝胶；二硫化物修饰的线性聚羧酸盐水凝胶；紫外光交联剂衍生的羧甲基葡聚糖水凝胶；紫外光交联剂衍生的聚羧酸盐水凝胶；两性离子聚羧酸盐水凝胶；两性离子聚羧酸盐水凝胶，带正电，NHS预活化；聚羧酸盐水凝胶，部分磺化；葡聚糖水凝胶；明胶水凝胶；聚羧酸盐水凝胶；肝素；聚羧酸盐水凝胶；透明质酸水凝胶。
关于与硝酸纤维素膜的偶联，偶联可以基于各种机理。如上所述，未修饰的抗原可以通过疏水部分固定在膜上，但是其它机理也是可行的。此类机理包括将硫醇化抗原共价连接于环氧官能化的硝酸纤维素膜，将生物素化抗原通过与硝酸纤维素结合的链霉亲和素锚定蛋白连接，和将抗原与新型硝酸纤维素结合锚定蛋白融合以供直接偶联和共价连接，其采用官能化的硝酸纤维素膜固定法通过环氧基硫醇连接进行。
在其它实施方式中，固定通过亲和素-生物素相互作用进行。作为亲和素，例如链霉亲和素或中性亲和素，可以偶联至固体基质，例如SPR基质，而结核菌素抗原的接头被生物素部分官能化，从而能够偶联至亲和素修饰的固体基质表面。用于此目的合适的合成抗原例如可以是根据式(VI)的抗原：
Figure BDA0002939144570000091
本发明还涉及生物传感器。可以将固定的抗原掺入可用于本发明方法的生物传感器中。此类生物传感器可以是适合用于任何上述装置或试验中的任何生物传感器。例如，生物传感器可以包括具有固定抗原的基于二氧化硅的基质和硅环共振器。这种生物传感器可以用于环共振。生物传感器的腔室的基质很可能是基于金的。当使用表面等离子体共振或电化学阻抗谱来检测抗体与固定的抗原的结合时，基于金的基质特别有用。本发明还涵盖包含本发明固体基质的任何其它生物传感器。
本发明还涉及一种包括根据本发明的固体基质的结核病检测系统。因此，该结核病检测系统可以包括根据本发明的生物传感器。结核病检测系统适合于进行根据本发明的检测样品中针对分枝杆菌物质的抗体的存在的检测方法。
该方法包括以下步骤：
(1)提供来自人或动物的样品；
(2)使样品的至少部分暴露于根据本发明的合成抗原；
(3)检测所述样品中的抗体与所述抗原的结合，
其中抗体与所述抗原的结合指示人或动物中分枝杆菌物质的存在。在该方法中，优选将合成抗原固定于固体基质，因此优选在步骤(2)中将所述至少部分样品暴露于根据本发明的固体基质。
在一个实施方式中，该方法还包括检测所述样品中的抗体与一种或多种其它类型的固定抗原的结合。这样的抗原可以包括分枝菌酸衍生物，二酰基糖脂，甘露糖基磷酸酮酯抗原和这些抗原的衍生物，以任何组合形式，例如本申请申请人的早期申请WO2017/211314A1和WO2017/211316A1中定义和描述的组合和变化形式。
在本发明的方法中，来自人或动物的一个或多个样品可以与来自经证实是健康的人或动物的样品和与来自经证实患有结核病的人或动物的样品进行比较。为了可靠性，非常优选的是，一次分析中所有样品都按照本发明方法的步骤进行相同的处理。在本发明的方法中，提供了来自人或动物的样品。通常，样品来自疑似患有活动性结核病的人或动物，例如与患有结核病的人接触或居住于结核病高发区域或前往结核病高发区域的人或动物。
可以通过从对象获得血液的任何常规手段来获得样品。为了用于本发明的方法，可以使用在较早阶段收集的样品，储存直至在合适的条件下使用并在合适的时刻提供。或者，样品可以在本发明的检测方法中当场(on the spot)使用，即作为床边检验。
样品优选是血液源性样品。样品可以是全血样品，血浆样品或血清样品。血清是没有凝血因子的血浆，并且优选是血浆形式。因此，本申请中的血浆一词也可以指(血液)血清。血清是优选的，因为它与血浆相比包含的物质(可能导致非特异性相互作用或不想要的生物活性)更少。另外，血清的粘度可能低于血浆。因此，使用血清可以避免稀释样品的需要，这节省了时间和材料。
在样品是全血样品的情况下，优选将样品预过滤或分离成血浆或血清。对于这样的预过滤步骤合适的滤器是0.2微米的滤器。
大约55％的全血由血浆/血清组成。如果没有充分过滤全血样品或者如果患者的身体状况对其有需求，则可能需要稀释全血样品或血浆或血清。因此，本申请中的血浆或血清一词也可以指稀释的血浆或血清。因此，血液或血浆的稀释可以在本发明的方法中实施，例如5至10x稀释，10至20x稀释，20至50x稀释，50至100x稀释，250至5000x稀释，750至1250x稀释，诸如5x、10x、20x、50x、100x、200x、500x、4000x、2000x或1000x稀释。根据样品的粘度，可以在将血浆与血液分离的步骤(过滤步骤或分离步骤)之前进行这种稀释。或者，稀释可在过滤步骤之后进行。
稀释可以用任何合适的稀释剂进行，例如，基于PBS的缓冲液，如封闭缓冲液。
全血样品或血浆或血清可以用防止血液凝固的试剂进一步稀释，例如EDTA，肝素或柠檬酸盐。
任选地，可以将低浓度的去污剂添加到血液/血浆/血清中，以避免粘附所用测试系统的组件。
为了检测，将样品的至少部分暴露于携带固定的抗原的固体基质，即暴露于检测基质，并检测抗体与抗原的结合。
抗体与固定的抗原的结合可以通过任何试验的方式检测，所述试验涉及测量基质上质量的变化，折射率的变化，熵的变化，焓的变化，粘度变化，温度变化、颜色变化等。
检测抗体与检测基质上的抗原的结合可以用任何合适的检测方法进行，包括简单的视觉检测或包括伏安、电流或任何电化学检测的方法。
检测抗体与检测基质上的抗原的结合可以实时进行或通过终点试验进行。
在实时方法中，因为检测是实时进行的，所以在结合过程中直接检测抗体与固定在检测基质上的抗原的结合。为了检测，原则上，可以使用所有实时无标记分析技术。
合适的实时检测试验包括表面等离子体共振或电化学阻抗光谱，等温滴定量热法，生物层干涉亮度法，光学光栅，光子晶体，声共振概况，石英晶体微天平。
在实时检测方法中，携带抗原的固体基质可以是基于二氧化硅的，例如基于二氧化硅的基质。在这样的实施方式中，抗原优选在一个或两个酰基链上用能够固定的官能团修饰。当使用环共振技术检测抗体与固定的抗原的结合时，基于二氧化硅的基质特别有用。优选地，使用基于Si的环形谐振器的生物传感器芯片进行检测。这使得本发明的方法能够以非常紧凑的装置实现。
也有可能的是，固体基质是基于金的。当使用表面等离子体共振或电化学阻抗谱来检测抗体与固定的抗原的结合时，基于金的基质特别有用。
检测抗体和/或其他物质与检测基质上的抗原的结合可以在自动化装置中进行。本领域技术人员已知各种自动化装置，并且技术人员能够选择合适的软件装置来确定与检测基质结合的程度或范围。
检测抗体与检测基质上的抗原的结合可以通过终点试验进行。术语“终点试验”应理解为这样的试验，其中感兴趣的结果是固定的试验孵育期后的结果，与前述实时试验相反。终点检测试验可以例如在测试结束时检测颜色，荧光，吸光度或发光水平的变化。
合适的终点试验包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，Western印迹，放射性标记测定法，光谱试验，免疫荧光，免疫沉淀，免疫细胞化学，免疫组织化学，安培或伏安检测试验或电化学阻抗光谱。
在终点试验的优选实施方案中，通过免疫金过滤试验进行检测。在这种试验中，检测基质是微孔膜，优选硝酸纤维素膜或PVDF膜，其上固定有抗原。
在终点试验中，抗体与抗原的相互作用可以使用与一抗重链结合的二抗进行，所述一抗能与固定的抗原结合。许多合适的二抗是市售可得的。二抗可以偶联至纳米颗粒或珠，例如金珠，或与脂质体联合。二抗的示例可以是蛋白A或G，其可与能够实现检测的酶共轭。
特别合适的技术或检测抗体与检测基质上固定的抗原的结合是所谓的免疫金过滤试验(IGFA)，特别是斑点免疫金过滤试验(DIGFA)。
免疫金过滤试验是将ELISA和免疫金技术结合的方法，并且是允许其中待测定的样品过滤通过微孔膜的方法，优选硝酸纤维素膜过滤，并通过涂覆在膜上的捕获探针捕获。以相同的方式允许胶体金标记的探针通过微孔膜过滤。通过使用微孔膜作为捕获探针的运载体并且利用膜的毛细作用和渗透性，抗原和抗体可以容易地反应并且可以方便地进行任选的洗涤和/或阻断步骤。当胶体金标记的探针与捕获探针结合时，胶体金颗粒聚集并且出现肉眼可见的红点。
在本发明的终点试验是免疫金过滤试验的情况中，抗原被固定于微孔膜，优选硝酸纤维素膜。在将抗原固定在微孔膜上之后，可以将任选地预处理的样品施加到膜上。在添加样品份(fraction)以及使固定的抗原与膜上样品中所含抗体反应后，可以将胶体金标记的二抗添加到膜上，以使金颗粒在抗原-抗体反应位置聚集。在聚集的情况下，形成可见的红色或棕色斑点。斑点的强度与抗原和抗体之间的反应量成正比，即与样品中抗体的量成正比。换言之，来自患有结核病的人的样品将产生比来自健康人的样品更强烈的斑点。
免疫金过滤试验是一种简单且快速的检测方法，因为除了膜和试剂外，不需要任何仪器，并且可以在几分钟内用肉眼观察结果。
在免疫金过滤试验中，微孔膜可以是例如具有合适孔径的PVDF膜、醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜。优选地，使用硝酸纤维素。合适的孔径为0.2至5μm。
免疫金过滤试验的各个步骤之间，可以用合适的缓冲液(例如基于PBS的缓冲液)洗涤膜。例如，这类缓冲液可以是含有生理pH值的水中的NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4和EDTA的PBS/AE缓冲液。这类缓冲液可以是基于PBS的缓冲液，由每升包含1mM EDTA和0.025％(m/v)叠氮化钠的双蒸去离子水(调节至pH 7.4)中8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g KH2PO4和1.05gNa2HPO4组成。
在使用DIGFA的情况中，抗原可以以点状方式固定于微孔膜。在DIGFA试验中，也以点的形式将样品施加于膜。胶体金标记的二抗也以点的形式添加。DIGFA试验是特别优选的，因为在几个膜上的不同点处，可以固定来自各种分枝杆菌菌株的各种抗原。这样就可以提供有关患者感染了哪种分枝杆菌菌株的信息。使用DIGFA的另一个优点是，可以在一个测试中比较来自不同人的样品，因为DIGFA能够在无限量的斑点中快速且可靠地检测抗体-抗原相互作用，取决于膜的大小。
检测抗体和/或其他物质与固定的抗原的结合，例如在DIGFA试验的情况中，将红色染色用作检测方法，可以在自动化装置中进行。本领域技术人员已知各种自动化装置，并且技术人员能够选择合适的软件装置来定量与检测基质结合的程度或范围。
检测抗体和/或其他物质与固定的抗原的结合可以通过视觉检测技术或任何其他合适的检测技术进行。在一个特别优选的实施方式中，利用终点试验的检测通过视觉进行，优选用利用肉眼进行。这具有易于检测的优点，而无需昂贵和复杂的检测技术。在使用DIGFA的情况下，可以借助肉眼来评估一个或多个抗体和/或其他物质与固定的抗原的结合。
视觉信号，例如在DIGFA试验情况中用作终点试验的红色染色，也可以借助移动应用程序检测，即设计为在诸如平板电脑或智能电话的移动设备上运行的计算机程序。例如，可以使用这样的应用(app)，所述应用旨在比较不同的一个或多个样品份之间的结合信号，并且指示该样品来源的人或动物是否具有结核病。
本发明的方法可以包括有利于该方法的灵敏度的其它步骤。例如，所述方法可包括将样品暴露于对样品中的分子具有亲和力的分子的其它步骤，所述分子导致对结核病不具有特异性的结合信号，以清除这些非特异性分子。
所述方法还可包括将样品分开的其它步骤。根据本发明使用的根据式(I)、(V)和(VI)的抗原对结核特异性抗体的高特异性以及相关的较低的假阳性风险也使得能够可靠地诊断人是否患有结核病，而无需将来自人或动物的样品分为两个样品份，其中一份暴露于抗原，然后再将这两份暴露于带有抗原的检测基质。例如，在WO 2005/116654和WO 2013/186679中描述了涉及将样品分成多份的方法。然而，本发明的固体基质在这种方法中将是合适的。因此，在一个实施方式中，本发明方法可以是包括下述步骤的实时方法：
i)提供来自人或动物的样品；
ii)获得所述样品的至少两份；
iii)将第一个所述份暴露于带有固定的抗原的固体基质，
iv)将第二个所述份暴露于未带有固定的抗原的固体基质；
v)将在步骤iii)中暴露的样品份暴露于固体测试基质，所述固体测试基质是如上针对本发明第二方面所述的固体基质，并且，将在步骤iv)中暴露的样品份暴露于固体对照基质，所述固体对照基质具有与固体测试基质相同的组成；
vi)实时检测与步骤v)中抗体与固定抗原的结合；和
vii)比较测试基质和对照基质之间结合的度或程度，任何观察到的与测试基质的较少结合均指示所述样品中存在针对固定的抗原的抗体，其指示样品来源人或动物中的结核病，其中，固定于步骤iii)的固体基质的抗原包括固定于固体测试基质和对照基质的抗原的至少一种类型，优选全部类型。
在相当的实施方式中，本发明的方法可以是检测样品中针对分枝杆菌物质的抗体的终点方法，
其包括以下步骤：
i)提供来自人或动物的样品；
ii)获得所述样品的至少两份；
iii)将第一个所述份暴露于带有固定的抗原的固体基质；
iv)将第二个所述份暴露于不带有固定的抗原的固体基质；或将第二个所述份的至少部分储存直到步骤v)，跳过将第二个所述份暴露于不携带所述固定的抗原的固体基质的步骤；
v)将在步骤iii)中暴露的所述样品份的至少部分暴露于固体测试基质，所述固体测试基质是如上针对本发明第二方面所述的固体基质，并且将步骤iv)中暴露或储存的样品份暴露于与固体测试基质组成相同的固体对照基质；
vi)在终点试验中检测步骤v)的抗体与固定的抗原的结合；和
vii)比较测试基质和对照基质之间结合的度或程度，任何观察到的与测试基质的较少结合均指示所述样品中存在针对固定的抗原的抗体，其指示样品来源人或动物中的结核病，其中，固定于步骤iii)的固体基质的抗原包括固定于固体测试基质和对照基质的抗原的至少一种类型，优选全部类型。
在这些实施方式的上下文中，应当理解的是，较低可以被定性和定量地解释，即，结合较低可以被解释为具有较少的结合事件以及具有较弱的结合。这两个实施方式的优点在于，即使仍存在背景信号，但也不需要健康人的样品作为参考或对照样品。在这些实施方式中，仅需要来自一个对象的一个样品。
此外，其上在这些实施方式的步骤iii)中固定有抗体的基质一般不由与测试/对照基质相同的材料制成。步骤iii)中的基质可由对样品中的分子的非特异性结合呈惰性的任何材料制成。这类材料包括聚四氟乙烯(例如特氟龙
Figure BDA0002939144570000152
)、聚丙烯、聚醚酮(PEEK)和聚乙烯。这些实施方式中的测试和对照基质是如上所述的检测试验中检测表面或基质或检测装置的传感表面或基质。
实施例
下述实施例旨在说明本发明的原理，不应被理解为限制权利要求的范围。
实施例1
由结核菌素醇(tuberculosinol)合成结核菌素腺苷偶联的-PEG-叠氮化物
Figure BDA0002939144570000151
2',3'-O-异亚丙基-5'-O-(4-硝基苯氧羰基)-腺苷(2)：
在0℃，向1(1.55g，5.04mmol)在无水THF(25mL)中的悬浮液逐滴添加Et3N(1.5mL，10.1mmol，2当量)和氯甲酸4-硝基苯酯(1.52g，7.5mmol，1.5当量)。混合物在室温搅拌20小时。然后，反应用冰淬灭，随后添加EtOAc和饱和水性NaHCO3(15mL)。分离各层，有机层用NaHCO3(15mL)和饱和水性NaCl(15mL)洗涤，经MgSO4干燥，真空浓缩。残余物通过柱色谱法纯化(硅胶，AcOEt/MeOH＝25/1)，得到2(1.95g，82％)为浅黄色泡沫状固体。NMR数据与文献相符。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.33(s,1H),8.22(d,J＝9.2Hz,2H),7.91(s,1H),7.29(d,J＝8.8Hz,2H),6.15(s,1H),5.98(s,2H),5.52(d,J＝6.0Hz,1H),5.20(dd,J＝6.0Hz,2.8Hz,1H),4.60-4.55(m,2H),4.49-4.44(m,1H),1.63(s,3H),1.41(s,3H).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ155.75,155.34,153.28,152.16,149.33,145.55,139.98,125.40,121.73,120.40,114.90,91.05,84.86,84.36,81.63,68.55,27.27,25.49.
Figure BDA0002939144570000161
((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二噁酚-4-基)甲基(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(4)：
室温下，向2(1.35g,2.85mmol)在CHCl3(20mL)中的溶液添加Et3N(0.60mL,4.28mmol)和N3-PEG-叠氮化物3(0.6mL,3.02mmol,1.1当量)。将反应搅拌18小时。此后，将反应真空浓缩。残余物通过柱色谱法纯化(硅胶，(MeOH/CH2Cl2＝0/100,1/98,3/97)以得到4(1.2g,76％)，为黄色粘性油。
Figure BDA0002939144570000171
((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(5)：
将4(1.01g，1.83mmol)在TFA和水(4:1，10mL)的混合物中的溶液搅拌2小时。TLC指示完全转换。减压浓缩反应物。将残余物与EtOH(3×10mL)和CH2Cl2(3×10mL)共同蒸发，得到粗产物，为亮黄色泡沫。粗产物的NMR分析表明杂质，因此，粗产物通过柱色谱法((MeOH/CH2Cl2,0/100,3/97,5/95/2/8)纯化，得到纯产物(0.703g，75％)，然后再开始下一步。
Figure BDA0002939144570000172
(4aS,5R,6S)-5-((E)-5-氯-3-甲基戊-3-烯-1-基)-1,1,5,6-四甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢萘(结核菌素氯)：
向N-氯琥珀酰亚胺(0.18g，1.34mmol，1.3当量)于无水CH2Cl2(2.7mL)的悬浮液(冷却至-20℃)中逐滴添加无水CH2Cl2(0.9mL)中的二甲基硫醚(0.115mL，8.78mmol，1.5当量)。通过冰浴放置15分钟，使乳白色悬浮液升温至0℃，然后将反应瓶再次置于-40℃的冷却浴中。无水CH2Cl2(3.5mL)中的结核菌素醇(0.3g，1.03mmol)，在15分钟内，借助注射泵。添加后，移去冷却浴，使反应物温热至室温。将反应在该温度下搅拌2小时，之后TLC表明结核菌素醇完全转化。将反应混合物在减压下浓缩并用戊烷处理，在其上涂上琥珀酰亚胺。倒出混合物并过滤，过滤物在减压下浓缩，得到粗制的结核菌素氯(0.31g，97％)，为黄色油。粗制的结核菌素氯无需纯化即可用于下一步。
Figure BDA0002939144570000181
6-氨基-9-((2R,3R,4S,5R)-5-(15-叠氮基-3-氧代-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-1-((E)-3-甲基-5-((1R,2S,8aS)-1,2,5,5-四甲基-1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢萘-1-基)戊-2-烯-1-基)-9H-嘌呤-1-鎓(TbAd-PEG-N3)：
将先前步骤中获得的粗制结核菌素氯(0.2g，0.61mmol)置入铝箔包裹的圆底烧瓶(5mL)中。向烧瓶中依次添加DMF(1.2mL)，碘化钠(0.11g，0.73mmol，1.2当量)和腺苷-PEG-N3 5(0.375g，0.73mmol，1.2当量)。将得到的悬浮液搅拌3天(65小时)。TLC表明起始物质已完全转化。将反应混合物减压浓缩，随后使用柱色谱法纯化(MeOH/CH2Cl2＝1/19,1/9，得到纯TbAd-PEG-N3，为浅黄色泡沫状固体。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.52(s,1H),8.48(s,1H),6.07(d,J＝5.3Hz,1H),5.51–5.43(m,2H),4.93(d,J＝6.7Hz,2H),4.70(t,J＝5.2Hz,1H),4.33(dddt,J＝24.9,12.9,8.8,3.9Hz,5H),3.69–3.59(m,13H),3.55(t,J＝5.4Hz,3H),3.39–3.33(m,2H),3.29(d,J＝5.4Hz,2H),2.28–2.19(m,1H),2.13–2.05(m,2H),1.90(d,J＝1.3Hz,4H),1.83–1.74(m,1H),1.65–1.49(m,4H),1.48–1.38(m,2H),1.22(td,J＝12.6,5.5Hz,1H),1.10–0.99(m,7H),0.92(q,J＝7.3,6.7Hz,1H),0.85(d,J＝6.7Hz,3H),0.66(s,3H).13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ158.4,153.9,152.2,148.3,147.8,147.6,147.1,144.0,121.3,117.4,115.6,90.2,84.6,75.6,71.9,71.6,71.5,71.5,71.4,71.4,71.2,71.2,71.0,70.8,65.2,51.7,42.0,41.8,41.1,38.1,37.0,35.9,34.6,33.9,32.6,30.3,29.5,28.6,23.2,17.3,16.6,15.6.HRMS(ESI)算得C39H62N9O8 +[M]+784.472,实得784.472.
实施例2
如实施例1所述获得的TbAd-PEG-N3(对应于如本申请先前所述的根据式(V)的化合物)通过叠氮化物部分用二苯并环辛炔-PEG4-生物素偶联物(DBCO-4PEG-生物素)生物素化，根据以下反应方案在无铜点击反应中进行：
Figure BDA0002939144570000191
为了进行该反应，将DBCO-4PEG-生物素溶于水:MeOH(50:50)中，以便于称量，因为它是一种粘性化合物(5mg/1mL)。取0.39mL添加至TbAd-PEG-N3抗原，并将反应混合物混合并在室温下搅拌。使用TLC监测反应，并加入更多的DBCO-4PEG-生物素以消耗更多的抗原。当确定抗原与DBCO-4PEG-生物素的反应完成时，使溶剂在旋转蒸发仪上蒸发并将化合物冷冻干燥过夜。所获得的TbAd-PEG-生物素分子对应于式(VI)表示的抗原。
实施例3
通过表面等离子体共振(SPR)测试该TbAd-PEG-生物素分子对来源于结核病检测呈阳性的对象的血清中的抗体的暴露。为此，在双通道ESPRIT SPR系统(荷兰，动态评估仪器公司(Kinetic Evaluation Instruments))中使用链霉亲和素偶联的葡聚糖修饰的金色SPR盘(SAHC30M，Xantec)。该系统具有一个双通道，在同一金传感器上具有两个独立的反应区域(通道)。在第一通道中，生物素-HRP通过传感器盘的链霉亲和素部分偶联以获得对照基质(生物素HRP0.1mg/ml)。在第二通道中，TbAd-PEG-生物素通过传感器盘的链酶亲和素部分偶联，以获得在甲醇/水中33％的1mg/ml TbAd-PEG-生物素的测试基质。PBS-明胶用作抗原封闭缓冲液。
为了测试固定的TbAd-PEG-生物素能否检测到TB特异性抗体，将对照和测试盘暴露于250x稀释的血清中，该血清源自PBS明胶测试对于中结核病呈阳性的对象。
图1显示该测试结果。虚线是基准线。血清在用“1”指示的时间点注射。
基线表示为在约270m°/26.30℃的水平细虚线。
条纹线显示了对照的谱。其在时间点“1”处向上直线表示样品的折射率变化。刚好在时间点“1”之后，HRP线的实际水平走向表明没有抗体结合发生。
实线显示了血清与固定的TbAd-PEG-生物素相互作用的谱。该线代表与固定的TbAd-PEG-生物素特异性结合的抗体的典型曲线。直线向上表示样品的折射率变化。此后，线逐渐升高，表明抗体与SPR盘上固定的TbAd-PEG-生物素抗原结合。
在时间点“2”处，用洗涤缓冲液开始洗涤步骤。如谱所示，不可能洗掉全部信号。
图1显示当抗原通过如上式(I)中所示的R5位上的接头基团固定于固体基质时，获得了优异的抗原展示。
参考文献
WO 2005/116654
WO 2013/186679
NL 2017204 C1
WO2017/211314 A1
WO2017/211316 A1
Buter J,Heijnen D,Wan IC,Bickelhaupt FM,Young DC,Otten E,Moody DB,Minnaard AJ.J Org Chem.2016年7月11日.

Claims (27)

1.一种由下式(I)表示的合成抗原：
Figure FDA0002939144560000011
其中，式(I)中：
R3和R4独立地选自氢、OH或酰基，以它们的任何组合；
R5是包含使抗原固定于固体基质的官能团的接头基团；
R1是H或具有式(II)的基团
Figure FDA0002939144560000012
并且
R2不存在或是具有式(II)的基团，前提条件是R1和R2之一是具有式(II)的基团；
以及所述抗原的对映异构体或非对映异构体。
2.如权利要求1所述的合成抗原，其中R4是OH，优选其中R4和R3是OH。
3.如权利要求1或2所述的合成抗原，其中所述抗原由式(III)或(IV)的化合物表示，其中R5如权利要求1所定义：
Figure FDA0002939144560000013
Figure FDA0002939144560000021
4.如权利要求1-3中任一项所述的合成抗原，其中所述接头基团是聚乙二醇(PEG)基团，其包含能够实现固体基质的固定的官能团。
5.如权利要求1-4中任一项所述的合成抗原，其中所述接头基团包含选自硫基，胺基，醛基，叠氮基，聚组氨酸或生物素基的官能团。
6.如权利要求4所述的合成抗原，其中所述接头基团是生物素化的PEG基团。
7.如权利要求4所述的合成抗原，其中所述接头基团是含有叠氮基的PEG基团。
8.固体基质，其包含固定在其上的至少一种类型的抗原，其中所述至少一种类型的抗原由下式(I)或其对映异构体或非对映异构体表示：
Figure FDA0002939144560000022
其中，式(I)中：
R3和R4独立地选自氢、OH或酰基，以它们的任何组合；
R5是接头基团；
R1是H或具有式(II)的基团
Figure FDA0002939144560000031
并且
R2不存在或是具有式(II)的基团，前提条件是R1和R2之一是具有式(II)的基团；
并且，其中所述抗原通过所述接头基团固定于所述固体基质。
9.如权利要求8所述的固体基质，其通过将至少一种类型的如权利要求1-7中任一项所定义的抗原固定在所述基质上而获得。
10.如权利要求8或9中任一项所述的固体基质，其中，所述固体基质是表面等离子体共振装置、电化学阻抗光谱装置、等温滴定量热装置、生物层干涉亮度装置、光栅装置、光子晶体装置、声共振仿形装置或石英晶体微天平装置的传感或检测表面；或酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹试验、放射性标记试验，光谱试验、免疫荧光试验、免疫沉淀试验、免疫细胞化学试验、免疫组织化学试验、安培检测试验、伏安检测试验或电化学阻抗光谱试验中的传感或检测表面。
11.如权利要求8-10中任一项所述的固体基质，其中所述基质是硝酸纤维素。
12.如权利要求8-10中任一项所述的固体基质，其中，所述基质是表面等离子体共振(SPR)传感器盘。
13.如权利要求8-12中任一项所述的固体基质，其中，所述基质用选自以下的基团修饰：羧甲基葡聚糖，羧甲基纤维素，羧甲基聚乙二醇，链霉亲和素衍生的羧甲基葡聚糖，生物素衍生的羧甲基葡聚糖，二硫化物修饰的羧甲基葡聚糖，NTA衍生的羧甲基葡聚糖，聚羧酸酯/盐，生物素衍生的聚羧酸酯/盐，酰肼衍生的线性聚羧酸酯/盐，二硫键修饰的线性聚羧酸酯/盐，聚-L-赖氨酸，透明质酸，明胶，藻酸盐，和/或其中所述基质包含选自以下的材料：NHS酯活化的支持材料，醛活化的支持材料，吖内酯活化的支持材料，CDI活化的支持材料，巯基反应性支持材料，马来酰亚胺活化的支持材料，碘乙酰基活化的支持材料，吡啶基二硫化物支持材料，或酰肼活化的支持材料。
14.将抗原固定于固体基质的方法，包括：
将至少由下式(I)表示的抗原或所述抗原的对映异构体或非对映异构体通过R5位置处的接头基团固定于固体基质：
Figure FDA0002939144560000041
其中，式(I)中：
R3和R4独立地选自氢、OH或酰基，以它们的任何组合；
R5是接头基团；
R1是H或具有式(II)的基团
Figure FDA0002939144560000042
并且
R2不存在或是具有式(II)的基团，前提条件是R1和R2之一是具有式(II)的基团。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述抗原如权利要求1-7中任一项所定义。
16.如权利要求14或15中任一项所述的方法，其中，所述固体基质是表面等离子共振装置、电化学阻抗光谱装置、等温滴定量热装置、生物层干涉亮度装置、光栅装置、光子晶体装置、声共振仿形装置或石英晶体微天平装置的传感或检测表面；或酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹试验、放射性标记试验，光谱试验、免疫荧光试验、免疫沉淀试验、免疫细胞化学试验、免疫组织化学试验、安培检测试验、伏安检测试验或电化学阻抗光谱试验中的传感或检测表面。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中，所述基质选自下组：硝酸纤维素，PVDF，ELISA板，硅基基质，SPR传感器盘。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述基质表面被修饰以使所述抗原能够固定。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述基质用选自以下的基团修饰：羧甲基葡聚糖，羧甲基纤维素，羧甲基聚乙二醇，链霉亲和素衍生的羧甲基葡聚糖，生物素衍生的羧甲基葡聚糖，二硫化物修饰的羧甲基葡聚糖，NTA衍生的羧甲基葡聚糖，聚羧酸酯/盐，生物素衍生的聚羧酸酯/盐，酰肼衍生的线性聚羧酸酯/盐，二硫键修饰的线性聚羧酸酯/盐，聚-L-赖氨酸，透明质酸，明胶，藻酸盐，和/或其中所述基质包含选自以下的材料：NHS酯活化的支持材料，醛活化的支持材料，吖内酯活化的支持材料，CDI活化的支持材料，巯基反应性支持材料，马来酰亚胺活化的支持材料，碘乙酰基活化的支持材料，吡啶基二硫化物支持材料，酰肼活化的支持材料。
20.如权利要求14-19中任一项所述的方法，其中固定通过亲和素-生物素相互作用，例如链霉亲和素-生物素相互作用或中性亲和素-生物素相互作用进行。
21.生物传感器，其包含如权利要求8-13中任一项所述的固体基质。
22.结核病检测系统，其包括如权利要求8-13中任一项所述的固体基质。
23.一种检测样品中针对分枝杆菌物质的抗体存在的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供来自人或动物的样品；
(2)将样品的至少部分暴露于如权利要求1-7中任一项所述的合成抗原；
(3)检测所述样品中的抗体与所述抗原的结合，
其中抗体与所述抗原的结合指示人或动物中分枝杆菌物质的存在。
24.如权利要求23所述的方法，其中在步骤(2)中，将所述样品的至少部分暴露于如权利要求8-13中任一项所述的固体基质。
25.如权利要求23或权利要求24所述的方法，其进一步包括检测所述样品中的抗体与一种或多种其它类型的固定的抗原的结合。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中，检测所述抗体与所述固定的抗原的结合涉及测量基质上质量的变化，折射率的变化，熵的变化，焓的变化，粘度变化，温度变化或颜色变化。
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中，检测涉及选自以下的技术：表面等离子体共振，电化学阻抗谱，等温滴定量热法，生物层干涉法，光栅，光子晶体，声共振谱，石英晶体微天平，酶联免疫吸附试验(ELISA)，Western印迹，放射性标记试验，光谱试验，免疫荧光，免疫沉淀，免疫细胞化学，免疫组织化学，电化学阻抗谱，安培试验或伏安试验，或免疫金过滤试验，优选其中免疫金试验是斑点免疫金试验(DIGFA)。
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