JPS6144354A - イノシンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、イノシンをイムノアッセイにより定ｍする方
法に関するものである。

アデノシンが生理活性物質として生物科学の広イ分野＋
ｃ　オいて研究、評価されているが（ＡｎｎＲｅｖＢｉ
ｏｃｈｅｍ、、　４７　、　　ｐ６５５　、１９７８　
）　、これに伴すＬＸアデノシンの異化代謝産物である
イノノ７の生体内動態の研究もまた重要性を帯びつつあ
る。

例えばイヌおよびモルモットの心臓標本における酸素分
圧低下時や各種薬物刺激時のイノシン血中濃度（ｐｆｌ
■ｇｅｒｓ　Ａｒｃｈ、、　８６９　、１）　１．１９
７７　　）（（ｉｒｃ、　Ｒｅｓ、　５３　、　ｐ６３
６　、１９８３）　、分娩時の贋帯血中４／シフ１ｍ度
（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｑｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎａｅｃｏｌ。

８８．１）１８１．１９８１）が報告され、基礎と臨床
の両面からイノシン測定の意義が検討されている。

従来、イノシンの測定法としては原理的に異なるいくつ
かの方法が報告されているが、その中から生体試料中の
イノシンの定量に実用的なものを以下に列挙する。

（１）プレラベル−薄層クロマトグラフィー法：この方
法はあらかじめ１４Ｃ−アデニンを投与して細胞内アデ
ニン化合物を１４Ｃでラベルしておいてから実験を行い
、試料を調製し、活性炭を用いて精製した後薄層クロマ
トグラフィーを行い、イノシンのスポットに存在する１
４Ｃを計測し、１４ｃｍアデニンの比放射能からイノシ
ンの化学ｍを求める方法である。この方法は放射性同位
元素（１４Ｃ）を使用する過程が長く、また試料の精製
や薄層よりのスポットのかきとり等、操作の段階が多い
のが欠点である（　ｐｆｌｌ＠ｇｅｒｓＡｒｃｈ、　３
６９　、　Ｉ）１．１９７７　）。

＋２）　　プリンヌクレオシドホスホリラーゼ法：試ｆ
４中のイノシンをリン酸の存在下でプリンスフレオシド
ホスホリラーゼの作用によってヒボキサンチンとし、次
いでヒボキサンチンにキサンチノオキシダーゼを作用さ
せ、生じた過酸化水素をペルオキシダーゼを用いる蛍光
法で定量する方法である。この方法は試薬の添加回数お
よび反応の段階が多いことや測定感度が２０　ｐｍｏｌ
　／チューブと低いなどの欠点がある（　ＡｎａｌＢｉ
ｏｃｈｅｍ、、　９５．　ｐ８７７　、　１９７９　）
。

（３）高速液体クロマトグラフィー法：逆相高速液体ク
ロマトグラフィーでイノシンを検出し、紫外部吸収度に
基づいて定量する方法である。この方法は、試料をアニ
オン交換クロマトグラフィーで前もって精製する必要が
あることや低濃度の試料には測定感度が不十分であるな
どの欠点かある（　Ｊ、　（：ｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、
　２２６．　ｐ２０２．１９８１　）。

一方、近年生体内の微坦物質を定量する方法としてラジ
オイムノアッセイ法、エンザイムイムノアノセイ法、蛍
光イムノアッセイ法などのイムノアッセイ法が開発され
、種々の生体内物質の定量に応用されているが、イノシ
ンの定量にイムノアッセイ法を応用した報告はまだ知ら
れていない。

イムノアッセイ法は、試料中の測定対象物質と既定ｍの
標識リガンドとを既定量の抗体に対して競合的に反応さ
せ、その後抗体に結合した標識リガンドもしくは遊離の
（未結合の）標識リガンドの標識Ｍを測定して試料中の
測定対象物質を定量する原理に基つく方法である。

本発明者らは、イノシンをイムノアッセイにより簡便か
つ高感度に定量する方法を確立すべく種々研究を重ねた
。その結果、 ■　水系または水−有機溶媒系でイノシンに対して有機
三級アミンの存在下で無水コハク酸などの酸無水物を反
応させると、アシル基が導入される可能性のある６位水
酸基、２′位水酸基、γ位水酸基および５′位水酸基の
うち、意外にも２′位水酸基および３′位水酸基に対し
て優先的にアシル化が進み、適当な反応条件下では約８
５％以上の収率で２’、３’−ジアンルイノン／が生成
すること、 ■　上記のようにイノシンをジカルボン酸の酸無水物に
よってアシル化して得られる、たとえば２’、３’−ジ
サクンニルイノシンと、担体蛋白とを縮合剤によって縮
合させ、抗原を作製し、これを動物に免疫させれば、感
度の高い抗イ／ンン抗体が得られること、 ■　かくして得られる抗イノソン抗体は、イノシンに対
しては全（結合能がなく、その反面、２′、３′−ジア
シルイノシ／に対してきわめて特異的に親和性と高い結
合能を有すること、■　試料中のイノシンを２’、８’
−ノアンルイノシンに導びき、２′位および３′位水酸
基かアシル化された標識イノシンとともに該抗イノ７）
抗体に反応させると、相互の濃度に依存する競合的な抗
原抗体反応が生起し、高感度のイムノアノセイが可能で
あること などの知見を得、これらの知見を総合することにより本
発明方法を完成するに至った。

すなわち、本発明方法は、 ■　液体試料およびイノシン標準溶液にアシル化試藁を
添加反応させてイノシンの２′位水酸基および３′位水
酸基をアシル化し、 ■　該アシル化反応終了液に緩衝液を加えて希釈した後
、（イ）これらに、（ロ）既定量の標識２’、３’−ジ
アシルイノシンと、（ハ）イノシンのｒ位置酸ｕおよび
３′位水酸基と担体蛋白とをジカルボン酸残基を介して
結合させてなる抗原によって得られた抗イノンン抗体の
既定量とを混合して抗原抗体反応を行なわせ。

■　次いで反応液中の遊離の標識イノシンと、抗イノシ
ン抗体に結合した標識イノシンとを分離し、いずれかの
標識量を測定することにより試料中のイ／ンン含ｍを算
出する という操作手段からなるイノシンの定員法である。

本発明方法によれば、その最適実施態様では、度かつ高
精度のイノシンの定１が可能である。また、血液、尿な
どの体液試料は除蛋白やイノシンの単離精製のための前
処理を必要とせす、組織試料についても酸抽出液をその
まま本発明方法のアッセイに供することができる。

以下、本発明の具体的構成および効果について本発明方
法の操作手順にしたがって詳細に説明する。

〔１″］　　ｉ１１定試料の調製 生体試料の調製については特に制約されるものではない
。血漿、髄液、尿などの体液試料は前処理を必要とせず
、そのまま直接法のアシル化反応に適用できる。しかし
、血漿試料の場合は、採血後経時的にアデノシンデアミ
ナーゼによるイノシンの生成やスフレオシダーゼによる
イノシンの分解消失によって濃度変化が生しるが、前者
はマンガンイオン（１０ｍＭ）の添加、後者は低温（０
°Ｃ）保存によって阻止することができる。−膜組織は
酸（たとえば、塩酸、過塩素酸、トリクロル酢酸なと）
で除蛋白、抽出を行ない、中和してアシル化反応に適用
する。

〔Ｄ　　抗イノンン抗体の調製 本発明方法における抗イノシン抗体は、抗原としてイノ
シンの２位水酸基および３′位水酸基と担体蛋白とをジ
カルボン酸残基を介して結合させてなる抗原を用いて動
物に免疫させることにより調製することができる。

抗原のジカルボン酸残基の具体例としては、コハク酸残
基、グルタル酸残基などが挙げられる。

また、担体蛋白には、血清アルブミン、グロブリン、ヘ
モノアニン、オバルフ゛ミン、フイブリノーゲ７などが
適用されつるが、血清アルブミンが一般的に用いられる
。

抗原の調製は次のとおり行えばよい。

■　イノシンの２’、３’−シアツル化イノソンに、水
または水−有機溶媒（たとえば、ビリノン、ジオキサン
、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキッド、
ジエチレンゲルコールジメチルエーテル、ヘキサメチル
ホスホルトリアミド、テトラハイドロビラン、テトラハ
イドロフラン、メチルセロソルブアセテートなど）混合
溶媒中で、ジカルボン酸の酸無水物（たとえば、無水コ
ハク酸、無水グルタル酸など）を有機三級アミン（たと
えばトリエチルアミン、４−モルホリノ−Ｎ、　　ｔ（
−ジンク０ヘキゾル力ルポキサミンなど）の存在下反応
させる。

反応は室温下で数秒〜士数分で十分で十分進行、する。

■　２’、３’−ジアシルイノシンと担体蛋白との縮合 ２’、３’−ジアシルイノシンのア／ル基残基の遊離の
カルボン酸部分と担体蛋白のアミノ基などとを縮合反応
させる。縮合反応には特に制約されず、たとえば、シン
クロへキンルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）
、１−エチル−３−（３−ジエチルアミノプロピル）−
カルボジイミド、１−ソクロへキンルー３−（２−モル
ホリノエチルクーカルボジイミド、Ｎ−メチル−Ｎ、Ｎ
’−ジｔ−プチルカルポジイミノウムテトラフルオロホ
ウ酸塩などのカルボジイミド試薬の存在下で両者を縮合
させるカルボジイミド法などを適用すればよい。さらに
縮合剤としてウッドワード試薬Ｋを用いる方法、酸無水
物法などを適用することもできる。縮合反応の条件は常
法による。

抗体は、上記のようにして得られる抗原を常法によって
、ウサギ、ラット、ヒツジ、ウマ、ウソなどの動物に免
疫させることにより産生させることができる。抗体とし
ては、このような動物から採取される抗血清を用いるこ
とができる。また、抗血清から抗体を精製してもよいし
、抗体をベプノンなどの酵素処理することにより得られ
るＦ（ａｌ）’）２　　フラグメント、さらに２−メル
カプトエチルアミンなどの還元剤処理して得られるＦａ
＆フラグメントなどの抗体活性画分も用いつる。

また、免疫動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを公
知の方法により細胞融合させ、得られた融合細胞（ハイ
ブリドーマ）をｉｎ　■】ｔｒｏ　　あるいはｉｎ　ｖ
ｉｖｏで増殖させて得られるモノクローナル抗体を使用
することもてきる。

さらに、抗体は、液相法によるアッセイ用には各種緩衝
液溶液または凍結乾爆物として、週製されるが、固相法
によるアッセイ法用には不溶１コ［担体に固相化して調
製される。

抗体を固相化させる不溶性担体としては、／リコーン、
ガラス、セラミック、ポリスチレン、スチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体、ポリエチレン、ポリプロピレン、
架橋ポリアクリルアミド、ＣＭセルロース、ＤＥＡＥセ
ルロース、架橋デキストランなどの一般のイムノアッセ
イで用いられつるものを適用すればよい。担体の形状は
特に昭定されず、ラテックス状、粒子状、チューブ状な
どのいずれでもよい。不溶性担体に抗体を固相化させる
方法も公知の方法によればよく、たとえば直接物理的に
吸着させる方法、グルタルアルデヒド、２．２〜ジピリ
ジルサルフアイド、ｐ、ｐ′−ジフルオロ−ｍｌ　ｍ−
ジニトロンフェニルスルホンなどの二官能基性の化学結
合剤を介して化学的に結合させる方法か適用される。

〔ｕｔ）　　標識２’、３’−ジアンルイノソンの調製
１ａｋ２’、３’−ジアシルアデノシンの標識物質とし
てはラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、化学発光物
質などイムノアッセイの標識物質としてイ 一般に用いられているもので、１１シンへの標識化が可
能なものを適用することができる。たと手ρ℃ ５１１ら酵素の活性フラグメントなど、標識用蛍光物質
としてはフルオレセイン、ローダミンナトカ用いられる
うこれらの標識化方法は公知の方法に準じて行うことが
できる。

たとえば　３Ｈを標識に用いる場合は、市販の８Ｈ−ア
デノシンを７デノンンデアミナーゼで処理して得られる
　３Ｈ−イア□シンを用いて、その２′位水酸基および
３′位水酸基をアソル化すればよい。尋人されるへきア
シル基の種類は、抗体の作製に用いられた抗原のハプテ
ンと担体蛋白の結合部分のジカルボン酸残基の種類に応
して選択される。たとえば、抗原がコハク酸残基を有す
るものである場合には、サクンニル基が最も好適に選択
される。

またサクンニル基と構造を類似する他のアシル基、たと
えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、グルタ
ル基などもアッセイの測定感度か低下するものの使用す
ることは可能である。アシル化の方法条件は、抗原作製
の偵の記−戒に阜する。こまた、放射性ヨードを標識に
する場合は、イノシンの２′位水酸基および３′位水酸
基にア／ル基としてジカルボン酸残基を導入し、遊離の
カルボッ酸部分にさら１こたとえばチロ７ンメチルエス
テルなどを結合させ、このベンゼン環に放射性フードを
標識する手段などが採用される。

［ｆｆ）　　試料および標準溶液のア／ル化アシル化反
応は、前記の抗原作製時のイノ７ノのア／ル化反応に準
しる。すなわち、試料および標準溶液に対して、酸無水
物とａ機三級アミンを添加することによりアシル化が行
われる。

酸無水物のｇＩＴＡは、標識２’、３’−ジアシルイノ
シンのアシル基に準して同様に決定すればよい。

このような試料および標準溶液のアシル化に際しては、
酸無水物を一定の試薬形態として調製してお（ことが、
その定量操作性上好ましい。調製形帖としては、粉末態
であってもよいが、予め有機溶媒溶液とした方が有機三
級アミンおよび試料との混和性にすぐれており、取り扱
いが容易である。

何機溶媒および有機三級アミンの種類についても前例に
よる。酸無水物と有機三級アミンとを同一溶媒溶液中に
共存させておくと、両者が反応して２４時間経過時では
そのアシル化能は半減する。

したがって、試薬の安定性が求められる試薬キットなど
に両試薬を組み入れる場合は、それぞれを別封にする必
要がある。

試薬の使用量はその種類に応じて適宜に決定すればよい
が、たとえば試薬１００μｌに対して酸無水物２０〜４
０μｍｏｌ、有機三級アミン５〜１０μｅに有機溶媒を
加えて１００μｅ　としたものを用いればよい。

アシル化反応条件も室昌で数秒〜士数分て十分である。

たとえばイノシン５μｍｏｌ　を添加した生Ｆｌ’　食
塩水または各種試料に対してサクノニル化を行なった時
の２’、３’−ジサクノニルイノ７）の収率を高速液体
クロマトグラフィーによって求めた結果を第１表に示す
。

〔ｖ〕　　抗原抗体反応 アシル化反応後、測定試料は緩衝液を用いて通常５〜ｌ
Ｏ倍に希釈する。イノシン標準液は希釈用緩衝液（通常
、アシル化試薬を５〜１０９６含有する緩衝液）を用い
て順次倍数希釈して、抗原抗体反応に供する。

緩衝液としては、抗原抗体反応を安定に進行させつるも
のであれば適用可能である。本発明方法においては、特
にｐＨ５〜８の０．１〜０．５Ｍイミダゾール緩衝液が
好適に用いられる。抗原抗体反応を阻害する非特異性因
子や未反応のアシル化試薬等の影響を実質的に排除でき
る工夫を施せば、他の緩衝液、たとえば酢酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液、りん酸緩衝液などの使用も可能である。

抗原抗体反応は、既定量の可溶性もしくは不溶性抗イノ
シン抗体に対して測定試料中の゛τ、３′−ジアンルイ
ノシンと既定量の標識２′、８’−シアツルイノシンと
を同時もしくは相前後して添加して行なわれる。標識２
’、３’−シアツルイノシンの化学ｍは、たとえば　８
Ｈ−２’、３’−ジサクシニルイノシンの場合０．５〜
１　ｐｍｏｌ　／　ｔｕｂｅ　　とするのが最適である
。

抗原抗体反応は、通常、０〜１０’Ｃ１６〜４８時間、
好ましくは１２〜２４時間の条件下で行なわれる。

〔■〕　測定 抗原抗体反応が終了した後、抗体に結合した標１２’、
３’−ジアンルイノンン（以下ｒＢＪと称する）と結合
しなかった遊離の標識ｚ、３゛−ノア／ルイノシン（以
下ＣＦ）と称する）とを常法により分離し、そのいずれ
かの標識量を測定する。

固相法の場合にはｒＢＪとｒＦＪとの分離は、吸引、傾
瀉、ろ過などの方法により容易に行われる。液相法の場
合には、適当な分離剤を用いる方法により両者の分離が
行われる。適用される分離法としては、たとえば抗イノ
ンン抗体またはそのＦ（ａｔｒ）２　もしくはＦ　ａ　
ｂ’フラグメントに対スる第二抗体を第−抗体作製時の
免疫動物とは異拝の動物に免疫させて作成し、得られた
第二抗体を用いてｒＢＪを吸む沈澱化させる方法、ある
いは第二抗体を適宜な不溶性担体に固相化してこれにｒ
ＢＪを結合させる方法などの二重抗体法をはしめ、デキ
ストランでコートした活性炭（ＤＣＣ）によりｒＦＪを
吸着分離する方法、ポリエチレンゲルコールでｒＢＪを
沈澱分離する方法、硫酸アンモニウムを用いてｒＢＪ　
とｒＦＪとを分画する塩析法などが適用できる。これら
の分離剤による分離操作はそれぞれ公知の方法１ζよれ
ばよい。たとえば、ＤＣＣの場合は、抗原抗体反応終了
液にＤＣＣを加えて遠心分離すれば、上清にｒＢＪを回
収することができ、その上清を放射能測定に供すればよ
い。

標！ａ量の測定は、各標識物質の種類に応じて公知の手
段を採用して行う。たとえば放射能屋の測定は、液体ン
ンチレーションカウター、ガンマーカウノターなど標識
に用いられた放射性元素の放射能ｍを測定することがで
きる機器を用いて行なえばよい。酵素量の測定は、その
酵素の種類に対応する基質溶液を用い、酵素反応に伴な
う物質の消費、生成のｍもしくは速度を電気化学的、分
光光学的、蛍光的手法などによって測定することにより
行われる。

生体試料中のイノシン含量は、試料に対する標識ｎの測
定値から下記の式によって結合率＝　Ｂ／Ｔ□□□値を
求め、同様に各種濃度の標準溶液の標！１里α１定値か
ら求めたＢ／Ｔｔｆｌ値を縦軸に、横軸に片対数で濃度
をとってプロットして作成した標準曲線に、試料のＢ／
Ｔ（至）値をプロットすることにより求めることができ
る。

（Ｔｌ−（ＢＬ） （Ｂｌ・・・生体試料または各標準溶液の標識量平均測
定値 ＣＢＬＬ・・ブランク平均値 ＦＴ＋　　　総標識量平均測定値 本発明方法による生体試料の測定における正当性を希釈
、添加実験結果で示す。なお、定量操作の方法条件、試
薬は後記実施例と同様にして行なった。

（１）血漿試料の場合（ロー３　平均値上標準偏差）（
２］　　肝油出液の場合（ｎ＝３　平均値上標準偏差〕
以下、本発明方法の実施例を挙げて、本発明方法のより
具体的な説明とする。ただし、これらは実施態様の一例
を開示するものであり、本発明を限定するものではない
。

実施例 （１〕　　定型試薬の調製 ■　抗イノシン抗体の作製用抗原の調製イノシン７ｇを
蒸留水５００　ｍｌに溶解させ、これに無水コハク酸２
０９、ジオキサン４５０ｍ１゜トリエチルアミン５０　
ｍｌを加えて室温で１０分間撹拌反応させた。反応液に
蒸留水１１を加えて反応を停止させ、減圧上濃縮した後
、濃縮液を連相カラムクロマトグラフィー（ｐｒｅｐｐ
ａｃｋカラム）にかけて得られた目的とする画分を凍結
乾燥し、２゜３′−ジサクシニルイノシン８．４５９を
得た。

核磁気共鳴スヘクトル　　δ（ｐｐｍ）（ＤＭＳＯ−ｄ
６）８、２８　（Ｓ、　１．８−Ｈ）　８．１８　（Ｓ
、　１．２−Ｈ）　６．３０　（ｄ、　１．Ｊ＝５．４
．１’−Ｈ）５．８８　（ｔ、　ｔ、　Ｊ＝５．４．２
’−Ｈ）　５．６５　（ｍ、　１．３’−Ｈ）４．４７
　（ｍ、　１．４’−Ｈ）　　３．９２　（ｂｄ、　２
．５’−Ｈ）（Ｊ　　　　　　　　　ｔＪ ２’、３’−ジサクシニルイノシン２００１１９、ヒト
血清７　ルブミン１ｏｏｌｌｌＦ、ＥＤＣ（塩酸塩）１
００ｍｙ　＋ｃ酢酸緩Ｗｊｉ（ｊｔ　（ｐＨ５，５）　
ヲ加エテ総ｆｆｉ　３０　ｍｌにし、室温で２０時間反
応させた。反応液を４°Ｃにて０．９９６生理的食塩水
２０１に対して４８時間流水透析した。透析内液につい
てＵ■吸収スペクトルから２’、８’−ジサクシニルイ
ノシン／ヒト血清アルブミンのモル比を求めたところ９
．３であった。

■　抗イノシン抗体の作製 上記の抗原溶液を等量のコンプリート・フロインズ・ア
ジュバントと混合し、油中水滴乳剤として家兎の背側及
内にアルブミンｍとして０．２ｑずつ１０日おきに８回
投与し、さらに３ｏ日後投与を２回繰返した。採血後、
遠心分離して得た血清に５０　ｍＭ酢酸緩衝液（１）Ｈ
６，５）を加え抗イノシン抗体試薬とした。

■　放射性元素標識２’、３’−ジサクンニルイノシン
の調製 （２，８−３Ｈ）アデノノン（ＮＥＮ社製、比放処理で
（２，８−３Ｈ）イノシンに変換させ、５０ｍＭ酢酸緩
衝Ｍ　（１）Ｈ６，５）　テ１００倍に希釈し、この溶
ｉ＆　１　ａｔに無水コハク酸４ｏη、ノオキサ７０．
９ａｔ、トリエチルアミン０．１　ｍｌを加えて室温で
５分間反応させた。反応後、０．３　Ｍイミダゾール緩
衝液（ｐＨ６，５）を３１３ｘｌ加えて最終的に３Ｈ−
７，３−ジサクンニルイノシン２゜５μｃ１ｉｏ、　ｓ
　Ｍイミダソール緩衝Ｏ（ｐＨ６，５）　　１０ｍｌト
ＬＴ３Ｈ−２’、３’−ジサクシニルイノシン試薬とし
た。

■　測定試料の調製 ＳＤ系ラットから採取した血液に、１０　ｍＭ塩化マン
ガンを加え、低温下遠心分離して上清を血漿試料とした
。

■　サクシニル化試薬の調製 無水コハク酸４０（ｌｖ／ジオキサン９　ｍｌとトリエ
チルアミン１　ｚｔを混合してサクシニル化試薬を調製
した。

■　希釈用緩衝液の調製 ０．３Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ６，５）、蒸留水お
よびサクシニル化試薬を８＋１：１に混合して希釈用緩
衝液を調製した。

■　ＢＦ分離用試薬の調製 活性炭５ｏｏａｙ、ウシ血清アルブミン５００ｑ、デキ
ストラン７５ηを蒸留水５０ｍ１中で混合してＤＣＣを
調製し、この２倍希釈液を分離用試薬とした。

〔２〕　　定量操作 ■　試料および標準溶液のサクノニル化イノシン溶液（
８２００ｐｍｏｌ／水１ｓ＋ｔ）１００μａを小試験管
に採り、サクシニル化試薬１００ｔｔｅ　と混合し、５
分間室温に放置した後、０３Ｍイミダゾール緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）　８００μｅを加えて２’、３’−ジサクン
ニ／Ｌフイノ’／　７　（８２ｐｍｏ１７１００μＮ）
標準液１ｍ１ＣＮαＩ）を調製した。

小試験管８本（Ｎα■〜■）に希釈用緩衝液を５００Ｈ
ｇずつ分注し、２’、８’−’ジサクノニルイノシン標
準液５００１１ｅをＮｎｌの小試験管に加えて混合した
。以下順次倍数希釈を行ない、次に示す各Ｏ度（／ｌｏ
ｏμｅ）の２′、コーサクシニルイノソノ標準液を調製
した。

ｓ　　ｐｍｏｌ（ｂｌ）、　　４　　ｐｍｏｌ　（ＮＱ
ＩＹ）２　　ｐｍｏｌ　（Ｎｕ　Ｙ　）、　　１　　ｐ
ｍｏｌ　（Ｎｕ　■）０、５　　ｐｍｏｌ　（Ｈａ■）
、０．２５　　ｐｍｏｌ　（Ｎｃｔｉ）０．１２５　ｐ
ｍｏｌ（ＮａＤ［）、 血漿試料１００μｇを小試験管に保り、これにサクシニ
ル化試薬１００μｅを加えて混合し、５分間室温に放置
した後、０．３Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ６，５）８
００μｌを加えた。

■　抗原抗体反応 小試験管を次のように準備した。

総カウント用　　　２本　　Ｎａ　１．２ブランク用　
　　　　２本　　Ｎα３．４ゼロ用　　　　　　２本　
　Ｎα５．６標準溶液用　　　１８本　　尚７〜２４血
漿試料用　　　　２本　　Ｎｃｉ２５．２６３Ｈ−２’
、３’−ジサクノニルイノシン試薬を＋００μｅずつＮ
α１〜２６の試験管に分注した。

μカウント用（Ｎα１．２）、ブランク用（Ｎα３、４
）、ゼロ用（Ｎα５．６）の各試験管に希釈用緩衝液１
００μｅずつ加えた。

標準溶液用試薬管（Ｎα７〜２４）にｚ、Ｊ−ジサクノ
ニルイノンン標準液ＮＣＬｌ〜■を１００μｅずつ加え
た。

血漿試料用試験管（Ｎ（１２５，２６）にサクシエル化
した血漿試料１００μｅを加えた。

ゼロ用、標準溶液用、血漿試料用試験管（Ｎα５〜２６
）に抗イノンン抗体試薬を１００μβずつ添加し、混合
後１８時間氷水中１と放置した。

総カウント用、ブランク用試験管（漱１〜４）に０．３
Ｍイミダゾール緩衝液を１００μｇずつ添加し、混合後
１８時間氷水中に放置した。

■　放射能量の測定およびイノシン含旦の算出縁カウン
ト用以外の試験管に、分離用試薬ＧＯＯμｅずつ加え、
８０００　ｒｐｍ、５分間遠心分離した。

総カウント用試験管に水５００　ｐＨを加え、混合した
。

各試験管から上清を５００μＥずつ採り、放射能測定用
試験管に移し、液体ソンチレーノヨンカウンター（アロ
カ社製、液体ンンチレーションスペクトロメーター）で
各放射能を測定した。

測定値に基づいて結合率Ｂ／Ｔ□□□を計算した。

その結果を第４表に示す。

これらの値から標準曲線（第１図参照）を作成し、これ
を用いて血漿試料中のイノシン濃度を求めた。その値は
５．５　ｐｍｏｊ／１ｕｂｅ、５６０　ｐｍｏｌ／　ｍ
ｌ血漿てあった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一実施例において作成された標準曲
線であり、縦軸は抗体結合率（Ｂ／Ｔ（ト））、横軸は
イノシン濃度を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）試料中のイノシン含量をイムノアツセイにより定量
   する方法において； （１）液体試料およびイノシン標準溶液にアシル化試薬
   を添加反応させてイノシンの２′位水酸基および３′位
   水酸基をアシル化し、 （２）該アシル化反応終了液に緩衝液を加えて希釈した
   後、（イ）これらに、（ロ）既定量の標識２′，３′−
   ジアシルイノシンと、（ハ）イノシンの２′位水酸基お
   よび３′位水酸基と担体蛋白とをジカルボン酸残基を介
   して結合させてなる抗原によつて得られた抗イノシン抗
   体の既定量とを混合して抗原抗体反応を行なわせ、 （３）次いで反応液中の遊離の標識イノシンと、抗イノ
   シン抗体に結合した標識イノシンとを分離し、いずれか
   の標識量を測定することにより試料中のイノシン含量を
   算出する ことを特徴とするイノシンの定量法。 ２）抗イノシン抗体を得るための抗原においてイノシン
   と担体蛋白とを結合させるジカルボン酸残基がコハク酸
   残基である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）アシル化試薬が酸無水物と有機三級アミンからなる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）酸無水物が無水コハク酸である特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ５）標識２′、３′−ジアシルイノシンが標識２′、３
   ′−ジサクシニルイノシンである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。