JPH06289021A

JPH06289021A - 遊離型セクレタリー・コンポーネントの定量法及び測定キット

Info

Publication number: JPH06289021A
Application number: JP5096605A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Uchida; 俊昭内田; Shunichi Dosemari; 俊一堂迫
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1993-03-31
Publication date: 1994-10-18

Abstract

(57)【要約】【構成】遊離型セクレタリー・コンポーネント（ＦＳ
Ｃ）含有試料を固定化免疫グロブリンと接触させて複合
体を形成させ、この複合体を抗ＳＣ抗体またはそのフラ
グメントと接触させて抗体複合体を形成させ、この抗体
複合体を定量することよりなるＦＳＣ定量法及びこのＦ
ＳＣ定量に使用するキット。【効果】ＦＳＣのみが免疫グロブリンと結合する性質
を利用するので抗ＳＣ抗体としてポリクローナル抗体を
使用することができる。また大量の試料を迅速に定量す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遊離型セクレタリー・
コンポーネントの定量法及びそれに使用する測定キット
に関する。

【０００２】

【従来の技術】セクレタリー・コンポーネント（Ｓｅｃ
ｒｅｔｏｒｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、以下ＳＣと略記す
る）は、乳、血液、体液中に広く存在する糖蛋白質で、
２量体免疫グロブリンＡ (以下ＩｇＡ²と略記する) や
免疫グロブリンＭ（以下ＩｇＭと略記する）に結合し、
ＳＣ結合型ＩｇＡ²（以下ＳＩｇＡと略記する) やＳＣ
結合型ＩｇＭ（以下ＳＩｇＭ）を形成することが知られ
ており（Ｎａｔｕｒｅ、第３１１巻、７１〜７３頁、１
９８４年）、また、ＳＣが結合したＳＩｇＡ及びＳＩｇ
Ｍは、消化酵素に対して耐性を示し、体外に分泌された
免疫グロブリンの機能維持に貢献していることも知られ
ている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１０９巻、２７５〜
２８３頁、１９７２年）。

【０００３】一方、ＳＣの定量は、生理学的及び生化学
的研究において重要な課題となっており、さらには、Ｓ
Ｃの診断薬の重要性も明らかになってきている。すなわ
ち、肝臓疾患において、ＳＣの血中濃度及び胆汁中濃度
が上昇することが知られている。詳しくは、肝疾患によ
る高アルカリフォスファターゼ症、胆汁流出閉塞症、胆
石、初期肝臓癌、肝臓移殖後の急性拒絶、肝臓移殖片局
所貧血などの症例において、著しいＳＣの上昇が起こる
ことが知られている（ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪ．
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第８５巻、３２７〜３３０頁、１９
８８年、Ｃｌｉｎ．ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ、第１９
７巻、１７１〜１８７頁、１９９１年、Ｈｅｐａｔｏｌ
ｏｇｙ、第１４巻、１０４６〜１０５３頁、１９９１
年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１２９巻、１３３〜１３
８頁、１９８２年）。また、免疫組織学的には、子宮内
膜癌や胃癌などの組織でＳＣの顕著な減少が観察されて
いる（日本産婦人科学会誌、第３８巻、１７０７〜１７
１２頁、１９８６年、Ｃａｎｃｅｒ、第６６巻、２１６
８〜２１７３頁、１９９０年）。その他、近年になっ
て、医薬品、食品、化粧品及び飼料などへのＳＣの応用
も幅広く検討されるようになってきており、遊離型ＳＣ
（以下ＦＳＣと略記する）の定量について、ますます重
要性が高まってきている現状にある。

【０００４】現在知られているＳＣの定量法は幾つかあ
るが、その中、抗体を用いてＦＳＣを定量する方法の問
題点は、ＦＳＣと同時にＳＩｇＡやＳＩｇＭも抗体で検
出されてしまうことにある。したがって、簡便に調製が
可能なポリクローナル抗体を用いたＦＳＣの定量法で
は、ＦＳＣのみをどのようにして定量するかが大きな課
題となっている。抗ＳＣポリクローナル抗体を用いたＦ
ＳＣの定量法としては、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ
ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ
法）を用いた方法が提案されている（特開昭５８−９９
７５８号公報）。しかし、この方法では、ＳＩｇＡの妨
害を避けるために、予め試料を抗ＩｇＡ抗体カラムで処
理してＳＩｇＡを除去しなければならない。このような
前処理を必要とする方法では、多くの試料を定量する際
に時間が要するので好ましくない。また、その他のＦＳ
Ｃを定量する方法としては、ＳＣ、ＩｇＡ及びＳＩｇＡ
のポリクローナル抗体を用いてそれぞれの物質の定量を
し、その値からＦＳＣ量を算出する方法がある（Ｃｌｉ
ｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第７巻、１６
５〜１７５頁、１９８９年）。しかし、この方法では誤
差が大きくなりやすい欠点がある。さらに、ＳＣのモノ
クローナル抗体を用いる方法として、ＥＬＩＳＡ法が開
発されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、
第１０６巻、１５３〜１６０頁、１９８８年、Ｃｌｉｎ
ｃａ．Ｃｈｉｍｉｃａ．Ａｃｔａ．、第１９７巻、１７
１〜１８８頁、１９９１年）。しかし、モノクローナル
抗体を用いた蛋白質の定量では、抗原認識部位が一ヶ所
のみであるため、異なる抗原認識部位を有する２種類の
モノクローナル抗体を作製しなければならず、多大な労
力と時間を要するという問題があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ＦＳＣ
を定量するに際して、ポリクローナル抗体を用いても高
い精度が得られ、しかも、簡便に定量できる方法を見出
すべく検討を行ったところ、ＦＳＣがＩｇＡ²あるいは
ＩｇＭに結合する性質を利用することにより、ポリクロ
ーナル抗体を用いた方法でも簡便に精度の高いＦＳＣの
定量が行えることを見出し、本発明をなすに至った。し
たがって、本発明は、ポリクローナル抗体を用いたＦＳ
Ｃの定量法を提供することを課題とする。また、本発明
は、このポリクローナル抗体を用いたＦＳＣの定量法に
用いる測定キットを提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明では、まず、固相
にＩｇＡ²あるいはＩｇＭを固定化する。固相にＩｇＡ
²あるいはＩｇＭを固定化する方法としては、ＥＬＩＳ
Ａ用プレートカルボやＥＬＩＳＡ用プレートアミノ（住
友ベークライト（株）製）のような共有結合を利用する
ことやイオン交換樹脂を用いてイオン結合を利用するこ
ともできるが、ＩｇＡ²あるいはＩｇＭを固相と接触さ
せるだけで吸着させる方法が簡便で実用的である。

【０００７】また、ＩｇＡ²あるいはＩｇＭを固定化す
る固相としては、蛋白質を良好に吸着するものであれば
何でも用いることができる。このような固相としてポリ
スチレン系樹脂、シリコン系樹脂、ポリビニル系樹脂、
その他の化学合成樹脂、あるいはガラスやセルロースな
どの天然高分子を素材とする平板、ビーズ、膜などを例
示することができる。これらの固相については、油脂な
どの付着物を除去するため、使用前にアルコールなどで
洗浄しておくことが望ましい。一方、固相に固定化する
ＩｇＡ²あるいはＩｇＭは、ヒト、マウス、ウサギ、ウ
シなどの哺乳類由来のものやＩｇＡ²あるいはＩｇＭ産
生細胞の培養によって得られるものを用いることができ
る。これらの免疫グロブリンについては、ＳＩｇＡや単
量体の免疫グロブリンＡ（以下ＩｇＡと略記する）ある
いはＳＩｇＭが混在していても特に定量には影響ない
が、ＳＣ非結合型であるＩｇＡ²あるいはＩｇＭのみの
精製品を用いることが望ましい。また、これらの免疫グ
ロブリンに含まれている不純物については、除去するこ
とが望ましい。なお、これらのＩｇＡ²あるいはＩｇＭ
は、ヒト、マウス、ウサギ、ウシなどのＳＣと非選択的
に反応するので、例えば、ヒトのＦＳＣを定量する際に
は、ヒト由来のＩｇＡ²あるいはＩｇＭを使用せずに異
種のＩｇＡ²あるいはＩｇＭを使用することが望まし
い。なぜならば、ＦＳＣの定量時に起こり得る試料中の
抗原とＩｇＡ²あるいはＩｇＭとの反応を抑制すること
ができ、ＦＳＣの定量精度を上げることができるからで
ある。

【０００８】本発明では、まず、ＦＳＣがＩｇＡ²ある
いはＩｇＭに結合するという性質を利用するため、上記
のようにして調製したＩｇＡ²あるいはＩｇＭ固定化固
相と試料とを接触させる。この際、ＦＳＣは固相に結合
するが、ＳＩｇＡあるいはＳＩｇＭは固相に結合しない
ので、ＦＳＣが結合した固相を十分洗浄することによ
り、ＳＩｇＡあるいはＳＩｇＭを完全に除去することが
できる。

【０００９】次に、固相に結合したＦＳＣと抗ＳＣ抗体
を接触させる。ここでは、モノクローナル抗体を用いて
も構わないが、ポリクローナル抗体を用いることで十分
である。使用する抗ＳＣ抗体は、ウサギ、ヤギなどに通
常の方法で免疫し、採血後、血清部分を遠心分離で分画
したものを用いることができる。また、血清をプロテイ
ンＧセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）のようなＩ
ｇＧのアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどで
さらに精製したＩｇＧ画分を用いることもできる。ある
いは、市販の抗ヒトＳＣ抗体（ノルディック社製）など
を用いることもできる。

【００１０】そして、通常行われているラジオイムノア
ッセイ（以下ＲＩＡ法と略記する)やエンザイムイムノ
アッセイ法でＦＳＣを定量する。ＦＳＣの定量は、これ
らの定量法の原理を用いたものであればいずれの方法を
用いても構わない。例えば、ＲＩＡ法の競合反応系や非
競合反応系、あるいはＥＬＩＳＡ法の均一測定法や非均
一測定法などを用いて測定することができ、また、抗Ｓ
Ｃ抗体の標識方法も酵素標識法や蛍光標識法などを用い
ることができる。以下に、使用頻度の最も高いエンザイ
ムイムノアッセイ法のうち、エンザイムリンクイムノア
ッセイ法（以下ＥＬＩＳＡ法と略記する) を中心にし
て、本発明を説明する。

【００１１】固相にＩｇＡ²あるいはＩｇＭを結合させ
た後、非特異的結合を防ぐためにブロッキングを行う。
ブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン、ブロッ
クエース（大日本製薬（株）販売）、スパーブロッキン
グバッファー（ピアス社製)などを例示することができ
る。ＩｇＡ²あるいはＩｇＭを固定化した固相をブロッ
キング剤に十分浸漬させた後、ブロッキング剤を除去す
る。次に、ＦＳＣを含む試料をＩｇＡ²あるいはＩｇＭ
を固定化した固相と接触させて試料中のＦＳＣをＩｇＡ
²あるいはＩｇＭに結合させた後、試料を除去して洗浄
液で洗浄する。用いる洗浄液は特に限定されないが、
０．０５％ツィーン２０及び０．１５Ｍ塩化ナトリウム
を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下ＰＢＳと略記
する）や希釈したブロックエースなどを用いることがで
きる。洗浄液で数回洗浄した後、抗ＳＣ抗体と接触させ
る。

【００１２】抗ＳＣ抗体は、ポリクローナルで十分であ
るが、モノクローナル抗体を用いても構わない。また、
これらの抗体はそのままの形で用いても構わないし、Ｆ
（ａｂ′)₂、Ｆａｂ′、Ｆａｂのような抗体のフラグメ
ントとしても用いることができる。これらのフラグメン
トは常法により作成することが可能である。例えば、Ｆ
（ａｂ′)₂は抗体を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４．５）に溶解し、これにペプシンを添加して３７℃
で一晩反応を行った後、中和してゲル濾過で精製する。
Ｆａｂ′は得られたＦ（ａｂ′)₂をジチオスレイトール
及び１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）の存在下に室
温で１時間反応させた後、冷却してヨードアセトアミド
を添加し、３０分間処理を行い、さらにジチオスレイト
ールと室温で１５分間反応を行い、ゲル濾過で精製す
る。Ｆａｂは抗体にパパインを０．０１Ｍシステイン及
び２ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した溶液を
添加し、３７℃で一晩反応させた後、陰イオン交換体に
より分離、精製する。

【００１３】これらの抗体あるいはそのフラグメント
は、そのまま用いても構わないが、あらかじめ種々の方
法で標識したものを用いると、操作性の向上や時間の短
縮化などの点で有利である。標識方法としては、β−ガ
ラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースアミラーゼなどの
酵素を用いる方法、ビオチンを用いる方法などがあり、
ＲＩＡ法で定量する場合は、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉなどの放射
性同位体を用いる方法がある。さらには、フルオレッセ
インイソチオシアネート、ローダミンイソチオシアネー
ト、フィコエリトリンなどを用いて蛍光標識したものな
ども用いることができる。これらの標識法の中、放射性
同位体を用いる方法は、特殊な施設を必要とし、また取
扱も難しい。また、ビオチン標識のものは感度の点で優
れているが、操作が複雑である。さらに、蛍光標識のも
のでは感度の点で劣る。したがって、酵素標識法が特に
有利である。酵素標識法としては、一般に知られている
方法を用いることができ、例えば、チオール基−マレイ
ミド基、ピリジルスルフィド基−チオール基、アミノ基
−アルデヒド基間の結合反応を利用した標識法がある。

【００１４】検出は、酵素標識法の場合、基質を添加し
てその発色や蛍光を分光光度計や蛍光光度計などを用い
て測定し、定量を行う。例えば、β−ガラクトシダーゼ
の場合はＯ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド
（ＯＮＰＧ）、パーオキシダーゼの場合は２，２′−ア
ジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリンスルフォン酸）
（ＡＢＴＳ）、アルカリフォスファターゼの場合はＰ−
ニトロフェニルフォスフェート（ＰＮＰＰ）や５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート−ｐ−
トルイジン塩（ＢＣＩＰ）、グルコースオキシダーゼの
場合はβ−Ｄ−グルコースなどの基質を用いることがで
きる。また、アビジン−ビオチン標識したものも酵素標
識法と同様に行うことができる。放射性同位体を用いる
場合にはγ線測定器を用いて放射線量を測定する。ま
た、蛍光標識したものでは蛍光分光光度計を用いて測定
する。本発明の定量法は、乳、血液、体液などのＳＣを
含有する試料中のＳＣの定量に用いられる。以下実施例
により、本発明を具体的に説明する。

【００１５】

【実施例１】ここでは、西洋ワサビパーオキシダーゼ標
識した抗ウシＳＣ抗体を用いてウシＳＣの定量を行っ
た。（１）ウシＳＣの調製１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳＰ
−トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）を充填したカ
ラム（直径２．１ｃｍ×高さ１４ｃｍ、容量５０ｍｌ）
に未殺菌チーズホエー１，０００ｍｌを通液してウシＳ
Ｃを吸着させた後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．
０）でｐＨを４．０とした。次に、０．４５Ｍ塩化ナト
リウムを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で
ラクトパーオキシダーゼなどの不純物を溶出した後、２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを７．０と
し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）でウシＳＣを溶出した。この処理に
より純度７１％のウシＳＣを得た。そしてさらにウシＳ
Ｃの純度を高めるため、プロテインＧセファロース４Ｂ
（ファルマシア社製）を充填したカラム（直径１．２ｃ
ｍ×高さ３．６ｃｍ、容量４ｍｌ) に上記のウシＳＣ画
分を通液して非吸着画分を回収し、分画分子量１０，０
００のミリポアフィルターを用いて濃縮したウシＳＣ画
分を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したスーパーロース１
２（ファルマシア社製) を用いてゲル濾過を行った。こ
の処理により電気泳動的に単一なウシＳＣ２６ｍｇを得
た。

【００１６】（２）抗ウシＳＣ抗体の調製上記のようにして調製したウシＳＣをウサギに免疫した
後、血清を採取し、５０％硫安分画により沈澱した画分
を回収した。この回収した画分を０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に対して２４時間透析し、プロテインＧ
セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラ
ム（直径１．２ｃｍ×高さ３．６ｃｍ、容量４ｍｌ) に
添加した。そして、非吸着画分を０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で洗浄した後、０．１Ｍグリシン−塩酸
緩衝液（ｐＨ２．７）でＩｇＧ画分を得、これを抗ウシ
ＳＣ抗体として以下の試験に用いた。

【００１７】（３）ヒトＩｇＭ固定化プレートの調製ヒト血清ＩｇＭ（ケミコン社製) を１００ｎｇ／ｍｌの
濃度となるよう１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液に溶
解してヒトＩｇＭ溶液とした。そして、このヒトＩｇＭ
溶液を９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク−イム
ノプレートマキシーソープ、インターメッド社製) の
各ウェルに５０μｇずつ添加し、室温で１時間反応させ
てヒトＩｇＭをプレートに固定化した後、ヒトＩｇＭ溶
液を除去した。次に、４倍希釈のブロックエース（大日
本製薬（株）販売）をプレートに満たし、室温で１時間
静置した後、ブロッキング剤を除去してプレートのブロ
ッキング処理を行い、ヒトＩｇＭ固定化プレートを調製
した。

【００１８】（４）ウシＳＣの定量１〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した標準ウシＳＣを
含む試料を１０倍希釈のブロックエースで希釈してヒト
ＩｇＭ固定化プレートの各ウェルに５０μｌずつ添加
し、室温で１時間プレートを振とうした後、試料を除去
し、０．０５％ツィーン２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）でプレートを３回洗浄した。次に、西
洋ワサビパーオキシダーゼ標識キット（ピアス社製) を
用いて先に調製した抗ウシＳＣ抗体を標識した西洋ワサ
ビパーオキシダーゼ標識抗ウシＳＣ抗体をブロックエー
スで２００ｎｇ／ｍｌに希釈した溶液を各ウェルに５０
μｌずつ添加し、室温で１時間プレートを振とうした
後、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗ウシＳＣ抗体溶
液を除去し、０．０５％ツィーン２０を含む１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でプレートを６回洗浄した。
そして、ＡＢＴＳを０．３ｍｇ／ｍｌとなるよう０．０
０６％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸−クエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解した溶液を各ウェ
ルに１００μｌずつ添加して発色を行い、プレートリー
ダーを用いて４１５ｎｍの吸収で測定した。この測定値
から検量線を作成したところ、ウシＳＣ濃度が１〜２０
０ｎｇ／ｍｌの範囲で定量性が確認された。その結果を
図１に示す。さらに、ウシＳＩｇＡがウシＳＣの測定に
影響するか否かを調べる目的で、榎本らの方法〔消化器
と免疫、第１６巻、１４６〜１５０頁、１９８６年〕に
従ってウシ初乳２リットルから調製したウシＳＩｇＡ５
４ｍｇを用い、１ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの濃度に
調製したウシＳＩｇＡを試料に添加したが、ウシＳＣの
定量性に影響がないことが判った。その結果を図２に示
す。

【００１９】

【実施例２】ここでは、アルカリフォスファターゼ標識
した抗ヒトＳＣ抗体を用いてヒトＳＣの定量を行った。（１）ウシＩｇＡ²の調製実施例１で調製したウシＳＩｇＡを１ｍＭヨード酢酸を
含む３Ｍ塩酸グアニジンに対して透析した後、３Ｍ塩酸
グアニジンで平衡化したスーパーデックス２００（ファ
ルマシア社製) を充填したカラム（直径２．１ｃｍ×高
さ９０ｃｍ、容量３１２ｍｌ）を用いてゲル濾過を行
い、ウシＳＣを除去してウシＩｇＡ²８ｍｇを得た。

【００２０】（２）ヒトＳＣの調製１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳＰ
−トヨパール６５０Ｍを充填したカラム（直径２．１ｃ
ｍ×高さ１４ｃｍ、容量５０ｍｌ）に母乳３００ｍｌを
通液してヒトＳＣを吸着させた後、１０ｍＭクエン酸緩
衝液（ｐＨ４．０）でｐＨを４．０とした。次に、０．
４Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）で血清アルブミンなどの不純物を溶出した
後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを７．
０とし、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）でヒトＳＣを溶出した。この処
理により純度７６％のヒトＳＣを得た。そしてさらにヒ
トＳＣの純度を高めるため、プロテインＧセファロース
４Ｂを充填したカラム（直径１．２ｃｍ×高さ３．６ｃ
ｍ、容量４ｍｌ）を用いて免疫グロブリンを除去し、
０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したスーパーロース１２を
用いてゲル濾過を２回行った。この処理により純度９６
％のヒトＳＣ７ｍｇを得た。

【００２１】（３）抗ヒトＳＣ抗体抗ヒトＳＣ抗体は、市販の抗ヒトＳＣ抗体（ノルディッ
ク社製）を用いた。（４）ウシＩｇＡ²固定化プレートの調製先に調製したウシＩｇＡ²を１００ｎｇ／ｍｌの濃度と
なるよう１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液に溶解して
ウシＩｇＡ²溶液とした。そして、このウシＩｇＡ²溶
液を９６穴マイクロタイタープレート（スミロン、住友
化学（株）製）の各ウェルに５０μｇすつ添加し、室温
で１時間反応させてウシＩｇＡ²をプレートに固定化し
た後、ウシＩｇＡ²溶液を除去した。次に、４倍希釈の
ブロックエース（大日本製薬（株）販売）をプレートに
満たし、室温で１時間静置した後、ブロッキング剤を除
去してプレートのブロッキング処理を行い、ウシＩｇＡ
²固定化プレートを調製した。

【００２２】（５）ヒトＳＣの定量１〜３００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した標準ヒトＳＣを
含む試料を１０倍希釈のブロックエースで希釈してウシ
ＩｇＡ²固定化プレートの各ウェルに５０μｌずつ添加
し、室温で１時間プレートを振とうした後、試料を除去
し、０．０５％ツィーン２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）でプレートを３回洗浄した。次に、抗
ヒトＳＣ抗体（ノルディック社製）をアルカリフォスフ
ァターゼ標識キット（ピアス社製) を用いて標識した抗
ヒトＳＣ抗体をブロックエースで２００ｎｇ／ｍｌに希
釈した溶液を各ウェル５０μｇずつ添加し、室温で１時
間プレートを振とうした後、アルカリフォスファターゼ
標識抗ウシＳＣ抗体溶液を除去し、０．０５％ツィーン
２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でプレ
ートを６回洗浄した。そして、市販の発色キット（ギブ
コ社製) を用いてＢＣＩＰを各ウェルに１００μｌずつ
添加して発色を行い、プレートリーダーを用いて４１５
ｎｍの吸収で測定した。この測定値から検量線を作成し
たところ、ヒトＳＣ濃度が１〜３００ｎｇ／ｍｌの範囲
で定量性が確認された。その結果を図３に示す。さら
に、ヒトＳＩｇＡがヒトＳＣの測定に影響するか否かを
調べる目的で、ヒトＳＩｇＡ（日本ケミカルリサーチ社
製）を用い、１ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの濃度に調
製したヒトＳＩｇＡを試料に添加したが、ヒトＳＣの定
量性に影響がないことが判った。その結果を図４に示
す。

【００２３】

【実施例３】ここでは、アルカリフォスファターゼ標識
した抗ヒトＳＣ抗体のＦａｂフラグメントを用いてヒト
ＳＣの定量を行った。（１）アルカリフォスファターゼ標識Ｆａｂフラグメン
トの調製０．０１Ｍシステイン及び２ｍＭＥＤＴＡを含む０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌ
に実施例２で得られた抗ヒトＳＣ抗体５ｍｇを溶解した
溶液に、０．０１Ｍシステイン及び２ｍＭＥＤＴＡを
含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５
０μｌにパパイン（エラスチン・プロダクト社製）０．
１ｍｇを溶解した溶液を添加し、３７℃で一晩反応を行
った。反応終了後、この溶液を０．０１Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析し、０．０１Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したＣＭ−
５２（ホワットマン社製) を充填したカラム（直径１．
０ｃｍ×高さ５．０ｃｍ、容量４ｍｌ）に添加した後、
０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄
して非吸着画分を分取し、この画分を抗ヒトＳＣ抗体の
Ｆａｂフラグメントとした。そして、このＦａｂフラグ
メントをアルカリフォスファターゼ標識キットにより標
識してアルカリフォスファターゼ標識Ｆａｂフラグメン
トを得た。

【００２４】（２）ヒトＳＣの定量実施例２で調製したウシＩｇＡ²固定化プレートと先に
調製したアルカリフォスファターゼ標識Ｆａｂフラグメ
ントを用い、実施例２に示した手順に準じて検量線を作
成したところ、ヒトＳＣ濃度が１〜３００ｎｇ／ｍｌの
範囲で定量性が確認された。その結果を図５に示す。

【００２５】

【実施例４】ここでは、ＦＩＴＣ標識した抗ヒトＳＣ抗
体を用いたヒトＳＣの定量について説明する。（１）ＦＩＴＣ標識抗ヒトＳＣ抗体の調製ＦＩＴＣを１ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう０．１Ｍ炭酸
ナトリウム溶液に溶解してＦＩＴＣ溶液とした。一方、
実施例２で得られた抗ヒトＳＣ抗体５ｍｇを０．１Ｍ炭
酸ナトリウム溶液１ｍｌに溶解した後、０．１Ｍ水酸化
ナトリウムでｐＨを９．０に調整した溶液に、氷冷しな
がらＦＩＴＣ溶液５０μｌを添加し、４℃で１８時間反
応を行った。反応終了後、この溶液を０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ２５
（ファルマシア社製）を充填したカラム（直径１．０ｃ
ｍ×高さ６０．０ｃｍ）に添加し、未反応のＦＩＴＣを
分離してＦＩＴＣ標識抗ヒトＳＣ抗体を得た。

【００２６】（２）ヒトＳＣの定量実施例２で調製したウシＩｇＡ²固定化プレートと先に
調製したＦＩＴＣ標識抗ヒトＳＣ抗体を用い、実施例２
に示した手順に準じて検量線を作成したところ、ヒトＳ
Ｃ濃度が１０〜３００ｎｇ／ｍｌの範囲で定量性が確認
された。なお、ＦＩＴＣの検出は蛍光分光光度計を用い
て行い、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで測
定した。その結果を図６に示す。

【００２７】

【実施例５】ここでは、ヒトＳＣ測定キットについて説
明する。（１）ヒトＳＣ測定キットに組み込む構成要素ウシＩｇＡ²固定化プレート実施例２に示した方法によって調製したウシＩｇＡ²を
同じく実施例２に示した方法によってＥＬＩＳＡ用プレ
ートＨ（住友ベークライト（株）製）に吸着させた後、
軽く溶液を除去し、乾燥を防ぐためにシールしたもの用
いた。但し、ＩｇＡ²を溶解した１００ｍＭ炭酸水素ナ
トリウム溶液には、０．０２％アジ化ナトリウムを防腐
剤として添加した。ホースラディシュパーオキシダーゼ標識抗ヒトＳＣ
抗体ノルディック社製のパーオキシダーゼ標識抗ヒトＳＣ抗
体を用いた。ブロッキング剤大日本製薬が販売しているブロッキング剤「ブロックエ
ース」を用いた。洗浄用緩衝液０．０５％ツイーン２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を洗浄用緩衝液として用いた。発色用緩衝液０．００６％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸−クエ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を発色用緩衝液と
して用いた。発色剤ＡＢＴＳ和光純薬（株）製のＡＢＴＳを用いた。凍結乾燥標準ＳＣ実施例２に示した方法によって調製したヒトＳＣを透析
膜あるいは限外濾過膜（分画分子量５０，０００以下）
で脱塩し、凍結乾燥したものを用いた。

【００２８】（２）ヒトＳＣ測定キットの構成ウシＩｇＡ²固定化プレート１枚ホースラディシュパーオキシダーゼ標識抗ヒトＳＣ
抗体１μｇブロッキング剤１００ｍｌ洗浄用緩衝液１，０００ｍｌ発色用緩衝液２０ｍｌ発色剤ＡＢＴＳ３．７ｍｇ×３凍結乾燥標準ＳＣ標準ＳＣ０：０．００ｎｇのＳＣを含有したもの標準ＳＣ１：０．２５ｎｇのＳＣを含有したもの標準ＳＣ２：１．２５ｎｇのＳＣを含有したもの標準ＳＣ３：２．５０ｎｇのＳＣを含有したもの標準ＳＣ４：１２．５０ｎｇのＳＣを含有したもの標準ＳＣ５：２５．００ｎｇのＳＣを含有したもの標準ＳＣ６：３７．５０ｎｇのＳＣを含有したもの標準ＳＣ７：５０．００ｎｇのＳＣを含有したもの標準ＳＣ８：６２．５０ｎｇのＳＣを含有したもの

【００２９】（３）測定方法ウシＩｇＭ固定化プレートに凍結乾燥標準ＳＣに脱イオ
ン水３００μｌを加えて調製した標準ＳＣまたはブロッ
キング剤で適当な濃度に希釈した試料を１ウェル当たり
５０μｌ添加し、室温で１時間振とうした後、標準ＳＣ
または試料を除去し、洗浄用緩衝液で３回洗浄する。次
に、ブロッキング剤５ｍｌに溶解したホースラディシュ
パーオキシダーゼ標識抗ヒトＳＣ抗体を１ウェル当たり
５０μｌ添加し、室温で１時間振とうした後、ホースラ
ディシュパーオキシダーゼ標識抗ヒトＳＣ抗体を除去
し、洗浄用緩衝液で６回洗浄する。そして、使用直前
に、脱イオン水６ｍｌに溶解した発色剤に発色用緩衝液
６ｍｌを加えて調製した発色液を１ウェルあたり１００
μｌ添加し、室温で２０分間振とうした後、４０５ｎｍ
で吸光度を測定する。

【００３０】（４）測定結果ヒトＳＣ測定キットを用いて標準ＳＣの検量線を作成し
た。その結果を図７に示す。また、ヒトＳＣ測定キット
を用いてヒト血清中のＳＣ量を測定した結果を表１に示
す。

【表１】 ────────────────────────── 試料ＳＣ濃度（μｇ／ｍｌ） ────────────────────────── １０．１２２２０．０４１３０．１１３４０．０２５５０．０７５ ──────────────────────────

【００３１】

【発明の効果】本発明の方法により、モノクローナル抗
体を用いなくともポリクローナル抗体のみで遊離のＳＣ
量を測定することができるので、安価な測定キットを提
供することが可能である。また、本発明の方法により、
大量の試料を迅速に定量することができるようになっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の測定で得られたウシＳＣ標準曲線を
示す。

【図２】実施例１で行ったＦＳＣの定量におけるＳＩｇ
Ａの影響を示す。

【図３】実施例２の測定で得られたヒトＳＣ標準曲線を
示す。

【図４】実施例２で行ったＦＳＣの定量におけるＳＩｇ
Ａの影響を示す。

【図５】実施例３の測定で得られたヒトＳＣ標準曲線を
示す。

【図６】実施例４の測定で得られたヒトＳＣ標準曲線を
示す。

【図７】実施例５の測定で得られたヒトＳＣ標準曲線を
示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物学的定量法を用いて遊離型セクレタ
リー・コンポーネントを定量する方法において、固相に
固定化した免疫グロブリンと遊離型セクレタリー・コン
ポーネント含有試料とを接触させて免疫グロブリン−セ
クレタリー・コンポーネント複合体を形成させた後、こ
の複合体と抗セクレタリー・コンポーネント抗体または
この抗体フラグメントとを接触させて免疫グロブリン−
セクレタリー・コンポーネント−抗セクレタリー・コン
ポーネント抗体複合体または抗体フラグメント複合体を
形成させ、この複合体を定量することを特徴とする遊離
型セクレタリー・コンポーネントの定量法。
【請求項２】抗セクレタリー・コンポーネント抗体ま
たは抗セクレタリー・コンポーネント抗体フラグメント
がポリクローナル抗体またはそのフラグメントである請
求項１記載の定量法。
【請求項３】少なくとも免疫グロブリン固定化プレー
トと標識抗セクレタリー・コンポーネント抗体または標
識抗セクレタリー・コンポーネント抗体フラグメントと
から成り、請求項１の遊離型セクレタリー・コンポーネ
ントの定量のために使用する測定キット。