DE60018758T2

DE60018758T2 - Chemiliumineszierendes Substrat von Hydrolasen wie Phosphatasen

Info

Publication number: DE60018758T2
Application number: DE60018758T
Authority: DE
Inventors: Qingping Jiang; Anand Natrajan; J. David SHARPE; Wen-Jee Wong; Say-Jong Law
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2020-07-28
Also published as: JP2003528938A; EP1203091B1; WO2001009372B1; EP1203091A1; WO2001009372A1; JP3819294B2; DE60018758D1; AU6381900A; ATE291096T1

Description

Diese Erfindung betrifft neue chemilumineszierende Verbindungen, die Substrate für Hydrolasen sind, wobei deren chemilumineszierenden Produkte deutlich verschiedene Lichtemissionseigenschaften aufweisen (d.h. Emissionswellenlänge, Kinetik oder Quantenausbeute). Diese Erfindung betrifft auch eine Licht-freisetzende Reagenzzusammensetzung, die bevorzugt mit dem chemilumineszierenden Substrat oder mit dem chemilumineszierenden Produkt in dem Gemisch der beiden reagiert, so dass ein erfassbares Signal erzeugt wird, das quantifiziert werden kann. Diese Erfindung betrifft ferner Nachweisverfahren, die ein neues chemilumineszierendes Substrat auf Acridiniumbasis, eine Hydrolase und ein Signal-freisetzendes Reagenz umfassen. Diese Erfindung betrifft ferner Nachweisvorrichtungen in Verbindung mit der Verwendung neuer chemilumineszierender Substrate und Hydrolasen, die eine rotempfindliche Photomultiplierröhre oder eine ladungsgekoppelte Vorrichtung, sowie eine Lichtfiltervorrichtung zur Maximierung des Nachweises eines Signals eines chemilumineszierenden Produkts umfassen. Ferner betrifft diese Erfindung die Verwendung dieser neuen chemilumineszierenden Substrate in Tests zum quantitativen oder qualitativen Nachweis einer interessierenden Hydrolase, die entweder als Marker oder als Marker einer biologischen Probe vorliegt. Schließlich betrifft diese Erfindung ein Verfahren und Zwischenprodukte zur Herstellung dieser neuen chemilumineszierenden Substrate.
Der Nachweis von Hydrolasen wurde in diagnostischen Tests wie Immuntests, Nukleinsäuretests, Rezeptortests und anderen Tests in erster Linie aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und nicht-Radioaktivität verbreitet verwendet. Die Hydrolasen umfassen Phosphatasen, Glycosidasen, Peptidasen, Proteasen und Esterasen. Phosphatasen und Glycosidasen werden bei weitem am gebräuchlichsten verwendet. Beispielsweise wurde alkalische Phosphatase aufgrund ihrer hohen Umsatzgeschwindigkeit, ihrer hervorragenden Wärmestabilität und ihrer einfachen Anwendung verbreitet als Marker in verschiedenen Enzymimmuntests (ELISA) eingesetzt. Viele Glucosidasen, wie z.B. β-Galactosidase und β-Glucuronidase wurden aufgrund ihrer sehr hohen Selektivität für die Hydrolyse ihrer bevorzugten Substrate ebenfalls in ELISA verwendet. Andererseits haben einige Hydrolasen als solche wichtige Funktionen in biologischen Prozessen des menschlichen Körpers und von Mikroorganismen. Daher ist ein direkter Nachweis dieser Marker ein weiterer wichtiger Aspekt der Diagnostik.
Im Zusammenhang mit dem Nachweis von Hydrolasen gibt es drei Arten von Substraten: Chromogene, fluorogene und chemilumineszierende Substrate. Von diesen Substraten bieten chemilumineszierende Substrate aufgrund der intrinsischen Vorteile einer besseren Nachweisbarkeit eines chemilumineszierenden Produkts oder eines niedrigeren Substrat- und Gerätehintergrunds die beste Enzymnachweisempfindlichkeit und eine geringere Störung durch biologische Proben. Daher gab es einen stetigen Trend in Richtung einer Entwicklung chemilumineszierender Substrate und deren Anwendung bei verschiedenen Diagnostikarten.
Stabile Dioxetane
Eine Klasse verbreitet verwendeter chemilumineszierender Substrate für Hydrolasen sind stabile Dioxetane (Bronstein et al., US 4,931,223 , 5,112,960, 5,145,772, 5,326,882; Schaap et al., US 5,892,064 , 4,959,182, 5,004,565; Akhavan-Tafti et al., US 5,721,370 ). Dabei wird die thermisch stabile Schutzgruppe am Phenolrest der Dioxetansubstrate mit einer interessierenden Hydrolase, wie z.B. alkalischer Phosphatase (AP) oder β-Galactosidase, gespalten, und zwar abhängig davon, ob die Schutzgruppe eine Phosphoryl- oder β-D-Galactopyranosidylgruppe ist. Das neu erzeugte Dioxetanphenoxid-Anion unterliegt in einem elektronisch angeregten Zustand einer Selbstzersetzung zu Methoxycarbonylphenoxid. Das Methoxycarbonylphenoxid emittiert dann Licht bei λmax etwa 470 nm.
In einer wässrigen Umgebung, in der nahezu alle biologischen Tests durchgeführt werden, erzeugt die Zersetzung der Dioxetane eine Chemilumineszenz mit einer sehr niedrigen Quantenausbeute von typischerweise etwa 0,01 % und einer langsamen Kinetik mit einer t_1/2 von 1 bis 10 min. Dies unterscheidet sich ziemlich stark von der Zersetzung der Dioxetane in einer organischen Umgebung. Beispielsweise zeigt ein Dioxetan, bei dem der Phenolrest durch eine Acetylgruppe oder eine Silylgruppe geschützt ist, bei der Behandlung mit einer Base oder mit einem Fluorid eine Quantenausbeute bis zu 25 % in DMSO bzw. 9,4 % in Acetonitril und die t_1/2 beträgt etwa 5 s bei 25°C (Schaap et al., Tetrahedron Letters 28(11), 1155, 1987, und WO 90/07511 A).
Voyta et al. ( US 5,145,772 ) haben ein Verfahren zur intermolekularen Erhöhung der Quantenausbeute der Dioxetanprodukte unter Verwendung polymerer Ammoniumsalze beschrieben, die eine hydrophobe Umgebung für das von dem Enzym erzeugte Phenoxid bereitstellen.
Akhavan-Tafti et al. berichteten über Verfahren einer intermolekularen Erhöhung der Quantenausbeute der Dioxetanprodukte unter Verwendung polymerer Phosphoniumsalze ( US 5,393,469 ) und dikationischer grenzflächenaktiver Mittel ( US 5,451,347 , 5,484,556).
Schaap et al. ( US 4,959,182 , 5,004,565) haben ein weiteres Verfahren zur Erhöhung der Quantenausbeute der Dioxetanprodukte unter Verwendung fluoreszierender grenzflächenaktiver Hilfsmittel als Energieakzeptoren beschrieben. Die Resonanzenergie, die in dem durch das Enzym erzeugten angeregten Phenoxid vorliegt, wird effektiv auf die fluoreszierenden grenzflächenaktiven Hilfsmittel übertragen. Anstelle der Emission von Licht bei λmax 470 nm, die für das Dioxetan charakteristisch ist, emittiert dieses System als Ergebnis einer Energieübertragung auf das hocheffiziente Fluorophor Fluorescein Licht bei λmax 530 nm.
Ein weiterer Ansatz zur Verbesserung der Quantenausbeute der Dioxetane, der von Schaap in der US 5,013,827 beschrieben ist, besteht darin, ein Fluorophor mit einer hohen Quantenausbeute kovalent an den lichtemittierenden Phenoxidrest zu binden. Die Resonanzenergie von dem angeregten Phenoxid wird intramolekular an das gebundene Fluorophor übertragen. Dieses wiederum emittiert Licht bei seiner eigenen Wellenlänge. Es wird behauptet, dass solche Dioxetan-Fluorophor-Konjugate eine hohe Quantenausbeute von 2 % zeigen.
Wang et al. haben in der WO 94/10258 eine Klasse von elektronenreichen, arylsubstituierten Dioxetanverbindungen beschrieben, in denen die Arylgruppe mit einer geeigneten Elektronendonorgruppe mehrfachsubstituiert ist, so dass eine intensive Lumineszenz festgestellt wird.
Akhavan-Tafti et al. haben in der US 5,721,370 eine Gruppe stabiler chemilumineszierender Dioxetanverbindungen mit verbesserter Wasserlöslichkeit und Lagerstabilität bereitgestellt. Die Verbindungen sind mit zwei oder mehr hydrophilen Gruppen, die an die Dioxetanstruktur gebunden sind, und mit einem zusätzlichen Fluoratom oder einer Niederalkylgruppe substituiert.
Schaap et al. haben in der US 5,892,064 eine Klasse chemilumineszierender Dioxetanverbindungen beschrieben, die an dem Dioxetanring mit zwei nicht-spiroverbundenen Alkylgruppen substituiert sind.
Urdea et al. haben in der EP-Anmeldung 0 401 001 A2 eine weitere Teilklasse von Dioxetanverbindungen beschrieben, die durch eine aufeinander folgende Behandlung mit zwei verschiedenen aktivierenden Enzymen zur Erzeugung von Licht angeregt werden können. Das System beruht auf dem Prinzip, dass die Dioxetansubstrate zwei Schutzgruppen aufweisen, die aufeinander folgend durch verschiedene Verfahren entfernt werden können, so dass ein angeregtes Phenoxid erzeugt wird, und die Entfernung der ersten Schutzgruppe wird durch das Enzym ausgelöst, das als Marker in dem Test verwendet wird.
Luminolsubstrate
Sasamoto et al. (Chem. Pharm. Bull. 38(5), 1323 (1990) und Chem. Pharm. Bull. 39(2), 411 (1991)) haben berichtet, dass o-Aminophthalhydrazid-N-acetyl-β-D-glucosaminid (Luminol-NAG) und 4'-(6'-Diethylaminobenzofuranyl)phthalhydrazid-N-acetyl-β-D-glucosaminid, die beide nicht-lumineszierende Formen von Luminol sind, Substrate von N-Acetyl-β-D-glucosaminidase sind. Bei der Einwirkung des Enzyms auf diese Substrate wird Luminol oder ein Luminolderivat erzeugt, das dann durch Anregen mit 0,1 % Wasserstoffperoxid und einer Peroxidase (POD) oder einem Fe(III)-TCPP-Komplexkatalysator zur Freisetzung eines chemilumineszierenden Signals nachgewiesen werden kann.
Enzym-modulierte geschützte Verstärker und anti-Verstärker
Das US-Patent 5,306,621 (Kricka) beschreibt, dass die Lichtintensität bestimmter Peroxidase-katalysierter Chemilumineszenzreaktionen durch AP moduliert werden kann, die auf einen pro-Verstärker oder einen pro-anti-Verstärker wirkt. Beispielsweise kann die Intensität einer Chemilumineszenzreaktion, die Luminol, Meerrettichperoxidase und Wasserstoffperoxid enthält, durch einen Verstärker (4-Iodphenol) verstärkt werden, der durch die enzymatische Wirkung von AP auf einen pro-Verstärker (4-Iodphenolphosphat) freigesetzt wird, wodurch AP getestet werden kann. Alternativ kann in der gleichen vorstehenden Reaktion dann, wenn ein zusätzlicher Verstärker (4-Iodphenol) vorliegt, die Lichtintensität durch einen anti-Verstärker (4-Nitrophenol) vermindert werden, der durch die enzymatische Wirkung von AP auf einen pro-anti-Verstärker (4-Nitrophenolphosphat) erzeugt wird. In dem letztgenannten Schema kann die Gegenwart von AP durch Messen der Verminderung der Lichtintensität getestet werden.
Entsprechend den vorstehenden Erläuterungen wurde ein Test unter Verwendung eines durch ein Enzym auslösbaren, geschützten Verstärkers zur Quantifizierung von Hydrolasen auch von Akhanvan-Tafti in der EP-Anmeldung 0 516 948 A1 beschrieben.
Akhanvan-Tafti et al. haben in der WO 96/07911 ein weiteres Verfahren zum Nachweisen von Hydrolasen auf der Basis des Prinzips des geschützten Verstärkers beschrieben, bei dem die lichtemittierende Spezies durch die Oxidation von Acridan durch Peroxidase und Peroxid erzeugt wird.
Acridenenolphosphat
Akhanvan-Tafti et al. ( US 5,772,926 , WO 97/26245) haben eine Klasse von heterocyclischen Enolphosphatverbindungen beschrieben, die durch das nicht-lumineszierende Acridenenolphosphat repräsentiert wird. Bei der Reaktion mit einem Phosphataseenzym wird es in das Dephosphorylenolat umgewandelt, das mit molekularem Sauerstoff unter Lichterzeugung reagiert (vgl. das nachstehende Schema). Es wurde auch beschrieben, dass die Lichtabgabe durch die Zugabe einer kationischen aromatischen Verbindung zu dem Testsystem stark erhöht wurde.
Andere Verbindungen
Renault (European Journal of Medicinal Chemistry-Chimica Therapeutica, Band 16 (1981), 24–34) beschreibt eine Gruppe von Acridindion-1,4-Verbindungen, die ein Antitumorpotenzial aufweisen. Diese Verbindungen zeigen weder eine Chemilumineszenz, noch werden sie in Tests verwendet.
Das US-Patent 4,810,636 betrifft eine Gruppe von chromogenen Enzymsubstraten, wie es vorstehend angegeben worden ist. Das Patent ist für die vorliegende Anmeldung, die chemilumineszierende Substrate betrifft, nicht relevant.
Andere chemilumineszierende Substrate für Hydrolasen
Vijay beschreibt in der US 5,589,328 Chemilumineszenztests, die Hydrolasen wie z.B. alkalische Phosphatase nachweisen oder quantifizieren, welche die Hydrolyse von Indoxylestern katalysieren. Der Test umfasst die Schritte des Umsetzens einer Testprobe mit einem Indoxylester und dann das sofortige Messen oder das Messen innerhalb einer kurzen Zeit (typischerweise von weniger als etwa 15 min) der resultierenden Chemilumineszenz. Die resultierende Chemilumineszenz kann durch Zugeben eines Chemilumineszenz-verstärkenden Reagenzes verstärkt werden.
Von den vorstehend genannten Chemilumineszenz-Hydrolaseverfahren scheint das Dioxetansystem das empfindlichste Nachweissystem zu sein und wurde daher in verschiedenen Tests zunehmend verwendet. Trotz seiner weit verbreiteten Verwendung weist dieses System einen inhärenten Nachteil dahingehend auf, dass aufgrund einer langsamen thermischen Zersetzung und einer nicht-enzymatischen Hydrolyse des Dioxetans eine Hintergrund-Chemilumineszenz in der Abwesenheit eines Enzyms festgestellt wird. Ein weiterer intrinsischer Nachteil besteht darin, dass das Phenoxid, sobald es durch die enzymatische Reaktion erzeugt worden ist, extrem instabil ist und leicht einer Zersetzung unter Lichtabgabe unterliegt. In diesem Sinn wird das Phenoxid, bei dem es sich um die lichtemittierende Spezies handelt, während der Enzymreaktion niemals "akkumuliert". Daher ist es eines der Hauptziele dieser Erfindung, neue chemilumineszierende Substrate bereitzustellen, deren abgeleiteten chemilumineszierenden Produkte unterscheidbare Emissionsprofile aufweisen und deren Gesamtsignal während der Enzymreaktion akkumuliert werden kann, wodurch ein alternatives und empfindliches Nachweisverfahren für Hydrolasen bereitgestellt wird.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, chemilumineszierende Verbindungen bereitzustellen, die Substrate von Hydrolasen sind. Die chemilumineszierenden Substrate wandeln sich bei der Behandlung mit einer Hydrolase in die entsprechenden chemilumineszierenden Produkte um, die deutlich verschiedene Lichtemissionseigenschaften aufweisen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, chemilumineszierende Verbindungen auf Acridiniumbasis bereitzustellen, die Substrate von Hydrolasen sind. Die chemilumineszierenden Substrate enthalten einen Phenolrest oder einen Enolrest im Molekül, der durch eine Gruppe maskiert ist, die thermisch und hydrolytisch stabil ist. Bei der Behandlung mit einer Hydrolase wandeln sich die chemilumineszierenden Substrate in die entsprechenden chemilumineszierenden Produkte auf Acridiniumbasis um, die deutlich verschiedene Lichtemissionseigenschaften aufweisen.
Es ist auch eine Aufgabe dieser Erfindung, dass die chemilumineszierenden Substrate und Produkte deutlich verschiedene Lichtemissionseigenschaften aufweisen, wodurch die Trennung oder Unterscheidung des Substratsignals von dem Produktsignal oder umgekehrt möglich ist, wenn sowohl das Substrat als auch das Produkt in dem gleichen Testbehälter vorliegen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die durch Hydrolasen erzeugten chemilumineszierenden Produkte Emissionsmaxima aufweisen, die sich von denjenigen ihrer entsprechenden chemilumineszierenden Substrate unterscheiden.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die durch Hydrolasen erzeugten chemilumineszierenden Produkte Quantenausbeuten aufweisen, die sich von denjenigen ihrer entsprechenden chemilumineszierenden Substrate unterscheiden.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die durch Hydrolasen erzeugten chemilumineszierenden Produkte eine Lichtemissionskinetik aufweisen, die sich von derjenigen ihrer entsprechenden chemilumineszierenden Substrate unterscheidet.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die durch Hydrolasen erzeugten chemilumineszierenden Produkte physikalische und chemische Eigenschaften aufweisen, die sich von denjenigen ihrer entsprechenden chemilumineszierenden Substrate unterscheiden. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften umfassen unter anderem die Nettoelementarladungsverteilung, das Dipolmoment, die π-Bindungsordnungen, die freie Energie oder die scheinbare Hydrophobie/Hydrophilie, die Löslichkeit, die Affinität und andere Eigenschaften, die ansonsten für den Fachmann offensichtlich sind.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die chemilumineszierenden Substrate derart strukturell verändert werden, so dass die Unterscheidung der Lichtemissionseigenschaften weiter verbessert werden kann.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die chemilumineszierenden Produkte, die aus der Einwirkung von Hydrolasen auf die chemilumineszierenden Substrate resultieren, während der Enzymreaktion keiner wesentlichen Zersetzung unterliegen, und folglich akkumuliert werden können, bis sie von einem Licht-freisetzenden Reagenz angeregt werden.
Die kombinierten Aufgaben und Vorteile dieser Erfindung, die vorstehend angegeben worden sind, werden erreicht durch:
A. Erstens ein chemilumineszierendes Substrat einer Hydrolase der folgenden allgemeinen Formel I Lumi-M-P Formel I worin "Lumi" ein chemilumineszierender Teil ist, der (a) als solcher, (b) mit gebundenem MP und (c) mit gebundenem M Licht erzeugen kann. Lumi umfasst unter anderem chemilumi neszierende Acridiniumverbindungen (z.B. Acridiniumester, Acridiniumcarboxyamide, Acridiniumthioester und Acridiniumoximester), Benzacridiniumverbindungen, Chinoliniumverbindungen, Isochinoliniumverbindungen, Phenanthridiniumverbindungen und Lucigeninverbindungen oder deren reduzierte (z.B. Acridane) oder nicht-N-alkylierte Formen (z.B. Acridine) der vorstehenden Verbindungen, Spiroacridanverbindungen, Luminolverbindungen und Isoluminolverbindungen und dergleichen. M ist ein mehrwertiges Heteroatom mit mindestens einem freien Elektronenpaar, das aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt ist und direkt an den lichtemittierenden Teil von Lumi an einem Ende und P am anderen Ende gebunden ist. (Wenn M allein an Lumi gebunden wird, um Lumi-M zu bilden, weist es selbstverständlich entweder ein Proton oder ein Gegenion auf, das damit assoziiert ist, oder es liegt in Form eines Ions vor.) P ist eine Gruppe, die durch Hydrolasen leicht entfernt werden kann, wie es nachstehend detaillierter diskutiert wird. Der lichtemittierende Rest von Lumi ist bekannt.
Wenn Lumi beispielsweise eine Acridiniumverbindung oder Luminol ist, ist der lichtemittierende Rest der Acridiniumkern bzw. ein Phthaloylrest.
B. Zweitens eine enzymatische Reaktion, welche die folgende allgemeine Reaktion A aufweist:
worin HE eine Hydrolase wie z.B. Phosphatase, Glycosidase, Peptidase, Protease, Esterase, Sulfatase und Guanidinobenzoatase ist. Lumi-M-P ist ein chemilumineszierendes Substrat einer Hydrolase. Lumi-M ist ein chemilumineszierendes Produkt mit physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften, die von denjenigen von Lumi-M-P verschieden sind. Diese physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften umfassen die Emissionswellenlänge, die Quantenausbeute, die Lichtemissionskinetik, die Nettoelementarladungsverteilung, das Dipolmoment, die π-Bindungsordnungen, die freie Energie oder die scheinbare Hydrophobie/Hydrophilie, die Löslichkeit, die Affinität und andere Eigenschaften.
C. Lichtfreisetzungsreaktionen, die sowohl bei Lumi-M-P als auch bei Lumi-M stattfinden
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, neue Licht-freisetzende Reagenzzusammensetzungen und Reagenzzugabeschemata zum Auslösen einer Lichtemission von chemilumineszieren den Substraten und Produkten bereitzustellen, die überraschenderweise zu einer besseren Unterscheidung zwischen den Signalen der chemilumineszierenden Substrate und Produkte führen. Bei den Licht-freisetzenden Reagenzzusammensetzungen kann es sich um ein einzelnes Reagenz und/oder um mehrere Reagenzien handeln, und die Zugabe der mehreren Reagenzien zu dem Reaktionsbehälter kann synchron oder aufeinander folgend stattfinden. Erfindungsgemäß können die Lichtfreisetzungsreaktionen sowohl bei Lumi-M-P als auch bei Lumi-M stattfinden, wie es in der Formel I gezeigt ist.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die Licht-freisetzenden Reagenzzusammensetzungen ein oder mehrere Peroxide) oder Peroxidäquivalent(e) umfassen, wobei die Peroxide oder Peroxidäquivalente unter anderem Wasserstoffperoxid umfassen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die Licht-freisetzenden Reagenzzusammensetzungen mit dem chemilumineszierenden Substrat und dem Produkt unterschiedlich in Wechselwirkung treten, so dass die Unterscheidung zwischen den beiden Signalen optimiert wird.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die Licht-freisetzenden Reagenzzusammensetzungen einen oder mehrere Verstärker enthalten, der bzw. die aus organischen, anorganischen oder polymeren Verbindungen mit einem breiten Bereich von Molekulargewichten ausgewählt ist bzw. sind, der bzw. die die Lichtabgabe von dem Substrat oder dem Produkt unterschiedlich erhöht bzw. erhöhen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, dass die Licht-freisetzenden Reagenzzusammensetzungen auch einen oder mehrere Quencher, ein oder mehrere Blockiermittel oder einen oder mehrere Inhibitoren enthalten, die aus organischen, anorganischen oder polymeren Verbindungen mit einem breiten Bereich von Molekulargewichten ausgewählt sind, so dass sie die Lichtabgabe von dem Substrat oder dem Produkt unterschiedlich quenchen, blockieren oder vermindern.
Die kombinierten Aufgaben und Vorteile dieser Erfindung, die vorstehend beschrieben worden sind, werden durch eine Licht-freisetzende Reagenzzusammensetzung gelöst bzw. erreicht. Die Licht-freisetzende Reagenzzusammensetzung besteht aus zwei separaten Reagenzien, die aufeinander folgend einer Lösung zugesetzt werden, die das chemilumineszierende Substrat und/oder Produkt enthält. Das erste Reagenz enthält eine saure Wasserstoffperoxidlösung und das zweite Reagenz enthält eine alkalische Lösung mit einem oder mehreren Detergenz(ien). Alternativ enthält das erste Reagenz eine alkalische Lösung mit einem oder mehreren Detergenz(ien) und das zweite Reagenz enthält eine Wasserstoffperoxidlösung, wobei der Vorteil einer besseren Unterscheidung zwischen den Signalen bestimmter chemilumineszierender Substrate und ihren Produkten erhalten wird.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, optimale Lichtnachweisverfahren für diese Chemilumineszenzreaktionen bereitzustellen, so dass die Unterscheidung zwischen Lichtemissionen des Substrats und des Produkts für spezifische Anwendungen optimiert wird. Die optimalen Nachweisverfahren umfassen die Verwendung einer Lichtnachweisvorrichtung, die ein Luminometer, eine CCD-Kamera, einen Röntgenfilm und einen hochempfindlichen photographischen Film umfasst. Das Luminometer umfasst eine blauempfindliche Photomultiplierröhre (PMT) oder eine rotempfindliche PMT oder andere PMT's, die für spezifische Anwendungen optimiert sind. Das optimale Lichtnachweisverfahren umfasst auch die Verwendung einer optischen Filtervorrichtung zur Blockierung oder Verminderung einer nicht erwünschten Lichtemission entweder von dem Substrat oder dem Produkt. Das optimale Nachweisverfahren umfasst ferner ein Verfahren und/oder eine Vorrichtung zum Nachweis oder Erfassen von Licht in einer aufeinander folgenden Weise, das bzw. die ein unerwünschtes Signal von dem Substrat beseitigt oder vermindert.
Die kombinierten Aufgaben und Vorteile dieser Erfindung, die vorstehend angegeben worden sind, werden durch ein oder mehrere Lichtnachweisverfahren gelöst bzw. erreicht. Ein bevorzugtes Lichtnachweisverfahren umfasst die Verwendung einer PMT und eines Langwellen-Durchgangsfilters in einer Enzymreaktion zum Nachweisen des Chemilumineszenzsignals von dem Produkt, das Licht bei einer längeren Wellenlänge als derjenigen des Substrats emittiert. Ein weiteres Lichtnachweisverfahren umfasst die Verwendung einer rotempfindlichen PMT bei einer niedrigen Temperatur (d.h. unter 4°C) und eines Langwellen-Durchgangsfilters zur Verbesserung der Nachweisbarkeit des chemilumineszierenden Produkts, das Licht bei einer Wellenlänge emittiert, die länger ist als diejenige des Substrats. Ein weiteres Lichtnachweisverfahren umfasst die Verwendung einer blauempfindlichen PMT und eines Kurzwellen-Durchgangsfilters zum Nachweisen der Abnahme des Chemilumineszenzsignals von dem Substrat, dessen Emissionswellenlänge kürzer ist als diejenige des Produkts. Ein weiteres Lichtnachweisverfahren umfasst die Verwendung einer PMT mit oder ohne optischen Filter innerhalb einer feststehenden Lichtmesszeit zum Nachweisen der Abnahme des Chemilumineszenzsignals von dem Substrat, dessen Emissionskinetik schneller ist als diejenige des Produkts.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Verfahren und Tests bereitzustellen, welche die Verwendung eines oder mehrerer der chemilumineszierenden Substrate der Formel I, einer oder mehrerer der Hydrolasen, einer oder mehrerer der Licht-freisetzenden Reagenzzusammensetzungen und eines oder mehrerer der optimalen Lichtnachweisverfahren umfassen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Verfahren und Tests unter Verwendung eines oder mehrerer der chemilumineszierenden Substrate zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der Gegenwart einer bzw. eines oder mehrerer Hydrolase(n) oder Enzymkonjugats bzw. -konjugate, die entweder als Marker oder als Marker biologischer Proben vorliegen, bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das eines oder mehrere der chemilumineszierenden Substrate der Formel I und eine oder mehrere der markierten Hydrolasen zum quantitativen und/oder qualitativen Nachweis der Gegenwart eines oder mehrerer Analyten nutzt.
Schließlich ist es auch eine Aufgabe dieser Erfindung, Syntheseverfahren und Zwischenprodukte bereitzustellen, welche die Synthese der chemilumineszierenden Substrate betreffen.
Die 1A bis 1F zeigen Strukturen chemilumineszierender Substrate (2-Phosacridiniumester), die kurzwellig emittieren können, und ihrer entsprechenden chemilumineszierenden Produkte (2-Hydroxylacridiniumester), die langwellig emittieren können.
Die 1G bis 1L zeigen Strukturen chemilumineszierender Substrate (2-Phosacridiniumester), die kurzwellig emittieren können, und ihrer entsprechenden chemilumineszierenden Produkte (2-Hydroxylacridiniumester), die langwellig emittieren können, einschließlich Spiroverbindungen (1K bis 1L).
Die 1M bis 1P zeigen Strukturen chemilumineszierender Substrate, die langwellig emittieren können, und ihre entsprechenden Produkte, die kurzwellig emittieren können.
Die 1Q und 1R zeigen Strukturen eines chemilumineszierenden Substrats und dessen entsprechenden Produkts, die verschiedene Emissionskinetiken aufweisen.
Die 2A bis 2P sind die Emissionsspektren chemilumineszierender Substrate (2-Phos-acridiniumester) und ihrer entsprechenden chemilumineszierenden Produkte (2-Hydroxylacridiniumester), sowie Spektren chemilumineszierender Substrate, die langwellig emittieren können, und ihrer entsprechenden Produkte, die kurzwellig emittieren können, die durch ein spektrales Schnellabtastsystem ("Fast Scanning Spectral System" (FSSS)) be stimmt wurden. Die Emissionsspektren des chemilumineszierenden Substrats und der entsprechenden Produkte, die unterschiedliche Lichtemissionskinetiken aufweisen, sind ebenfalls gezeigt.
Die 3 ist eine Auftragung der Wellenlänge gegen die Quantenausbeute einer Hamamatsu-Photomultiplierröhre R268.
Die 4 ist eine Auftragung der Wellenlänge gegen die Quantenausbeute einer Hamamatsu-Photomultiplierröhre R2228P.
Die 5 ist eine Auftragung der Wellenlänge gegen die Quantenausbeute der dünn gemachten, von der Rückseite beleuchteten ladungsgekoppelten Vorrichtung (dünn gemachte CCD).
Die 6 ist ein Profil der Durchlässigkeit eines Langwellendurchgangsfilters LL650 von Corion (Chargen-Nr. CFS-002645).
Die 7 ist ein Profil der Durchlässigkeit eines Corion-Langwellendurchgangsfilters LL700.
Die 8 und 9 sind Auftragungen der Stabilitäten eines chemilumineszierenden Produkts (2-OH-DMAE) bei pH 10,5, 100 mM Tris-Puffer, der 1 mM MgCl₂ enthält, als Funktion der Zeit.
Die 10 ist eine Auftragung, welche die Nachweisbarkeit alkalischer Phosphatase unter Verwendung von 2-Phos-DMAE als Substrat zeigt. Die Enzymreaktion wurde 0,5 Stunden bei 45°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,25 N NaOH, das 0,5 % CTAB enthielt, geflasht, worauf sofort 0,5 % H₂O₂ zugesetzt wurde. Die Lichtabgabe wurde 2 s auf einem MLA-1 gemessen, das mit einer R268 PMT und zwei LL650-Langwellen-Durchgangsfiltern ausgestattet war.
Die 11 ist eine Auftragung, welche die Nachweisbarkeit alkalischer Phosphatase unter den gleichen Reaktionsbedingungen zeigt, wie sie bezüglich der 10 beschrieben worden sind, mit der Ausnahme, dass die Lichtabgabe auf einem MLA-1 gemessen wurde, das mit einer R2228P-PMT und zwei LL650-Langwellen-Durchgangsfiltern ausgestattet war, und dass die Einheit auf 4°C vorgekühlt worden ist.
Die 12 ist eine Auftragung, welche die Nachweisbarkeit alkalischer Phosphatase unter Verwendung von 2-Phos-DMAE als Substrat zeigt. Die Enzymreaktion wurde 1 Stunde bei 45°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,25 N NaOH, das 0,5 % CTAB enthielt, geflasht, worauf sofort 0,5 % H₂O₂ zugesetzt wurde. Die Lichtabgabe wurde 2 s auf einem MLA-1 gemessen, das mit einer R2228P-PMT und einem LL700-Langwellen-Durchgangsfilter ausgestattet war, und die Einheit wurde auf 4°C vorgekühlt.
Die 13 ist eine Auftragung, welche die Nachweisbarkeit alkalischer Phosphatase unter Verwendung von 4'-Phos-AE (1Q) als Substrat zeigt.
Die 14 ist eine Auftragung der Standardkurve eines TSH-Immuntests unter Verwendung von 2-Phos-DMAE (1) als das chemilumineszierende Substrat und alkalischer Phosphatase als Marker.
Es wurde gefunden, dass bestimmte neue chemilumineszierende Verbindungen der allgemeinen Formel I Substrate von Hydrolasen sind, wobei die Struktur der Formel I wie folgt ist: Lumi-M-P Formel I
Gemäß der Formel I ist Lumi als chemilumineszierender Teil definiert, der Licht (a) als solcher, (b) an MP gebunden und (c) nur an M gebunden erzeugen kann. M ist als mehrwertiges Heteroatom, das mindestens ein freies Elektronenpaar aufweist, definiert, das aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt ist, wobei M direkt an den lichtemittierenden Teil von Lumi an einem Ende und an P am anderen Ende gebunden ist. P ist eine Gruppe, die leicht durch Hydrolasen entfernt werden kann. Wenn nur M an Lumi unter Bildung von Lumi-M gebunden ist, weist M entweder ein Proton oder ein Gegenion auf, das damit assoziiert ist oder in Form eines Ions vorliegt.
Der chemilumineszierende Teil von Lumi umfasst unter anderem Acridiniumverbindungen (einschließlich Acridiniumester (Law et al., US 4,745,181 ), Acridiniumcarboxyamide (Mattingly et al., US 5,468,646 , Kinkel et al., J. Biolumin. Chemilumin. 4, 136–139, 1989), Acridinium-thioester (Kinkel et al., J. Biolumin. Chemilumin. 4, 136–139, 1989) und Acridiniumoximester (Ghitti et al., PCT WO 98/56765)), Benzacridiniumverbindungen, Chinoliniumverbindungen, Isochinoliniumverbindungen, Phenanthridiumverbindungen und Lucigeninverbindungen oder die reduzierten (z.B. Acridane) oder nicht-N-alkylierten (z.B. Acridine) Formen der vorstehenden Verbindungen, Spiroacridanverbindungen (Singh et al., PCT WO 94/02486), Luminolverbindungen und Isoluminolverbindungen, wie es nachstehend gezeigt ist.
Hydrolasen, die in der vorstehend gezeigten Reaktion A verwendet werden können, umfassen unter anderem Phosphatasen: Alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Phospholipase, Phosphodiesterase, Pyrophosphatase;
Glycosidasen: β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-(D)-Glucosidase, β-Glucosidase, β-Glukuronidase, α-Mannosidase, N-Acetyl-β-D-glukosaminidase, Neuraminidase, Cellulase, β-Fucosidase;
Peptidasen und Proteasen: Dipeptidylpeptidasen I, II und IV, Plasminogenaktivator, Calpain, Elastase, Trypsin, Cathepsine B, C, L und O, Urokinase, Granzym A, Prostatin, Thrombin, Trypase, Follipsin, Kallikrein, Plasmin, Prohormon-Thiolprotease, Amyloid A4-erzeugende Enzyme, menschliche Adenovirusproteinase, Kallikrein, HIV-Protease;
Esterasen: Cholinesterase, Lipase; und Sulfatase, Guanidinobenzoatase.
Die in einer wässrigen Umgebung thermisch und hydrolytisch stabilen erfindungsgemäßen chemilumineszierenden Substrate unterliegen in der Gegenwart von Hydrolasen leicht einer Hydrolysereaktion und die resultierenden Produkte, repräsentiert durch Lumi-M in der Reaktion A, sind ebenfalls chemilumineszierend. Es wurde auch überraschenderweise gefunden, dass sich die Lichtemissionseigenschaften (Emissionswellenlänge, Kinetik und Quantenausbeute) der Produkte aufgrund der Änderung einiger der chemischen und physikalischen Eigenschaften der durch die Hydrolysereaktion erzeugten chemilumineszierenden Produkte signifikant von denjenigen ihrer entsprechenden chemilumineszierenden Substrate unterscheiden. Diese chemischen und physikalischen Eigenschaften umfassen die Nettoelementarladungsverteilung, das Dipolmoment, die π-Bindungsordnungen, die freie Energie oder die scheinbare Hydrophobie/Hydrophilie, die Löslichkeit und die Affinität, usw. Als Ergebnis wird aufgrund eines oder mehrerer dieser Unterschiede ein erfassbares Signal erzeugt, was somit für eine qualitative oder quantitative Bestimmung der spezifischen Hydrolase geeignet ist, die an der vorstehend gezeigten Reaktion A beteiligt ist.
1. Substrate und Produkte mit verschiedenen Emissionswellenlängen
Eine bevorzugte Klasse chemilumineszierender Substrate, die aus der Formel I in dieser Erfindung ausgewählt ist, betrifft neue chemilumineszierende Acridiniumverbindungen der nachstehend gezeigten Formel II, wobei die Verbindungen zur Lichterzeugung chemisch angeregt werden können:
Formel II
Gemäß der Formel II ist P vorzugsweise eine Gruppe, die in einem wässrigen Medium thermisch und hydrolytisch stabil ist, jedoch durch eine Hydrolase unter Bildung von Lumi-M leicht entfernbar ist, und M ist vorzugsweise ein mehrwertiges Heteroatom mit mindestens einem freien Elektronenpaar, das aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt ist, und mit einem starken Vermögen zum Liefern von Elektronen an den Acridiniumkern nach der Entfernung von P. Vorzugsweise wird M nach der Entfernung der Schutzgruppe (P) durch eine Hydrolase in dem Reaktionsmedium ionisierbar, so dass es eine negative Ladung trägt, liefert jedoch stark Elektronen an das Acridiniumringsystem.
Gemäß der Formel II ist R₁ vorzugsweise eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Aralkylgruppe, die 0 bis 20 Heteroatome enthält. Mehr bevorzugt ist R₁ Methyl und insbesondere ist R₁ Sulfoalkyl oder ein Alkyl, das eine oder mehrere hydrophile Gruppe(n), die aus Sulfonat, Sulfat-, -CO₂H, Phosphonat, Ethylenglykol, Polyethylenglykol, quartärem Ammonium (-N⁺R₃) ausgewählt ist bzw. sind, oder jedwede Gruppen enthält, die einen oder mehrere des vorstehenden (-N⁺R₃) enthalten. Das Einbeziehen des hydrophilen Rests in R₁ dient zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit des Moleküls.
Gemäß der Formel II können die C₁-, C₃-, C₆- und C₈-Peri-Positionen bzw. -Stellungen des Acridiniumkerns nicht substituiert oder substituiert sein. Wenn eine oder mehrere der Positionen substituiert ist bzw. sind, sind die Substituenten (R_2a, R_2b, R_3b bzw. R_3d) gleich oder verschieden und aus -R, substituiertem oder nicht substituiertem Aryl (ArR oder Ar), Halogeniden, Nitro, Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, -CO₂H, -C(O)OR, Cyano (-CN), -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)NHR, Ethylenglykol oder Polyethylenglykol ausgewählt. R ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl und Aralkyl, die 0 bis 20 Heteroatome enthalten, ausgewählt.
Gemäß der Formel II können die C₄-, C₅- und C₇-Peri-Positionen des Acridiniumkerns nicht substituiert oder substituiert sein. Wenn eine oder mehrere dieser Positionen substituiert ist bzw. sind, sind die Substituenten (R_2c, R_3a bzw. R_3c) gleich oder verschieden und wie R_2a, R_2b, R_3b Und R_3d definiert. Alternativ kann einer der Reste R_2c, R_3a bzw. R_3c als M-P definiert sein. In diesem Fall kann die C₂-Peri-Position nicht substituiert oder substituiert sein. Wenn sie substituiert ist, können die Substituenten als R_2a, R_2b, R_3b Und R_3d definiert sein.
Alternativ können gemäß der Formel II jedwede zwei angrenzenden Substituenten an den Peri-Positionen des Acridiniumkerns so wie in den folgenden Beispielen verbunden sein, so dass sie einen zusätzlichen ungesättigten carbocyclischen und/oder heterocyclischen Ring bilden, der an den angeknüpften Acridiniumkern kondensiert ist, wie es nachstehend gezeigt ist.
Gemäß der Formel II ist A^– ein Gegenion für die Elektroneutralität des quartären Stickstoffs der Acridiniumverbindungen, der als Ergebnis der Quaternisierung der Acridin-Zwischenprodukte mit Alkylierungsmitteln oder aufgrund eines Anionenaustauschs erhalten wird, der während der anschließenden Syntheseschritte oder in der folgenden Aufarbeitung der Reaktionsgemische und der Reinigung der gewünschten Verbindungen in einer flüssigen Phase, die überschüssige Mengen anderer Anionen enthält, stattfindet. Beispiele für solche Gegenionen umfassen CH₃SO₄ ^– , FSO₃ ^– , CF₃SO₃ ^– , C₄F₉SO₃ ^–, CH₃C₆H₄SO₃ ^–, Halogenid, CF₃COO^–, CH₃COO^– und NO₃ ^–. A^– liegt typischerweise nicht vor, wenn der R₁-Substituent eine stark ionisierbare Gruppe enthält, die ein Anion bilden und sich mit dem quartären Ammonium-Kationteil paaren kann.
X ist Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel.
Wenn X Sauerstoff oder Schwefel ist, wird Z weggelassen und Y ist eine substituierte oder nicht substituierte Arylgruppe und vorzugsweise ist Y eine polysubstituierte Arylgruppe der Formel III:
Formel III
Gemäß der Formel III können R₄ und R₈ gleich oder verschieden und Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxyl- (-OR), Alkylthiol- (-SR) oder substituierte Aminogruppen sein, die dazu dienen, die -COX-Verknüpfung zwischen dem Acridiniumkern und dem Y-Rest durch einen sterischen und/oder elektronischen Effekt zu stabilisieren. Vorzugsweise sind R₄ und R₈ kurzkettige Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt eine Methylgruppe, oder mindestens einer von R₄ und R₈ hat die vorstehend angegebene Bedeutung, während der andere ein Wasserstoffatom oder ein Atom ist, das aus Halogeniden ausgewählt ist. R₅, R₆ und R₇ können gleich oder verschieden und aus Wasserstoff, -R, substituiertem oder nicht substituiertem Aryl, Halogeniden, Amino, -NHR, NR₂, quartärem Ammonium (-N⁺R₃), Hydroxyl, Nitro, Nitroso, Sulfonat, Sulfat, Cyano (-CN), Phosphonat, CO₂H, -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)NHR, -NHC(O)R, Ethylenglykol oder Polyethylenglykol ausgewählt sein. Vorzugsweise sind R₅, R₆ und R₇, die gleich oder verschieden sind, eine hydrophile Gruppe, die aus Sulfonat, Sulfat, -CO₂H, Phosphonat, Ethylenglykol, Polyethylenglykol, quartärem Ammonium (-N⁺R₃) ausgewählt ist, oder jedwede Gruppen, die einen oder mehrere der vorstehend genannten hydrophilen Reste enthalten, der bzw. die zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit dient bzw. dienen.
Jedwede angrenzende zwei Gruppen von R₄ bis R₈ in der Formel III können einen oder mehrere zusätzliche(n) kondensierte(n) aromatische(n) Kohlenwasserstoffring(e) oder heteroaromatische(n) Ring(e) mit oder ohne Substitutionen bilden. Die zusätzlichen kondensierten aromatischen Kohlenwasserstoffringe und heteroaromatischen Ringe umfassen unter anderem Benzol, Naphthalin, Pyridin, Thiophen, Furan und Pyrrol, usw.
Alternativ kann die Formel II eine weitere Klasse von Lumi-M-P darstellen, bei der Lumi ein Acridiniumoximester ist (gemäß der Beschreibung in der PCT WO 98/56765) und M-P die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Wenn Lumi ein Acridiniumoximester ist, sind X, Y und Z der Formel II separat wie folgt definiert:
Gemäß der Formel II ist dann, wenn X Sauerstoff ist, Z weggelassen und Y hat die vorstehend angegebene Bedeutung oder ist -N=CR₉R₁₀, wobei R₉ und R₁₀ gleich oder verschieden sind und aus Wasserstoff, substituierten oder nicht substituierten Aryl-, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Halogenid-, Alkoxyl- und Aryloxygruppen ausgewählt sind.
Gemäß der Formel II ist dann, wenn X Stickstoff ist, Z -SO₂-Y', Y' ist wie Y definiert, das die vorstehend angegebene Bedeutung hat, und Y und Y' können gleich oder verschieden sein. Zusätzlich kann Y selbst ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl, das 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, halogeniert oder nicht halogeniert oder ein substituiertes Aryl oder ein heterocyclisches Ringsystem sein.
Folglich können X, Y und Z in der Formel II unter Berücksichtigung der vorstehend diskutierten Alternativen wie folgt definiert sein:
X ist Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel, so dass dann,
wenn X Sauerstoff ist, Z weggelassen und Y eine substituierte oder nicht substituierte Arylgruppe oder -N=CR₉R₁₀ ist, wobei R₉ und R₁₀ gleich oder verschieden sein können und aus Wasserstoff, substituierten oder nicht substituierten Aryl-, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Halogenid-, Alkoxyl- und Aryloxygruppen ausgewählt sind;
wenn X Schwefel ist, Z weggelassen und Y eine substituierte oder nicht substituierte Arylgruppe ist;
wenn X Stickstoff ist, Z -SO₂-Y' ist, Y' wie Y definiert ist, Y die vorstehend angegebene Bedeutung hat oder ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl, das 0 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, halogeniert oder nicht halogeniert oder ein substituiertes Aryl oder ein heterocyclisches Ringsystem sein kann und Y und Y' gleich oder verschieden sein können.
Strukturell nahe verwandt mit den chemilumineszierenden Acridiniumverbindungen der Formel II sind deren reduzierte Formen, chemilumineszierende Acridanverbindungen der Formel IV, bei der alle Substitutionen gemäß der Formel II definiert sind. Diese Verbindungen kön nen chemisch angeregt werden, über die Bildung von Acridinium-Zwischenprodukten und/oder über eine direkte Oxidation zur Bildung elektronisch angeregter Produkte, bei denen es sich um die gleichen Produkte von Acridiniumverbindungen der Formel II handelt, Licht zu erzeugen.
Formel IV
Eine weitere Klasse chemilumineszierender Substrate, die strukturell mit den Acridiniumsubstraten der Formel II verwandt sind, sind Spiroacridanverbindungen der Formel V, bei denen X₁ und X₂ gleich oder verschieden sein können und aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff ausgewählt sind, und wenn X₁ und/oder X₂ Sauerstoff oder Schwefel sind, Z₁ und/oder Z₂ weggelassen sind, wenn X₁ und/oder X₂ Stickstoff sind, Z₁ und/oder Z₂ Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder -SO₂-Y' sind; G eine Gruppe ist, die X₁ und X₂ unter Bildung eines Rings mit 5 bis 10 Gliedern verbindet und R₁, R_2a-c, R_3a-d, M und P in der Formel II definiert sind.
Formel V
Innerhalb der chemilumineszierenden Spiroacridansubstrate der Formel V gibt es eine Teilklasse, die nachstehend als Formel VI gezeigt ist, wobei G ein einfach oder mehrfach substituierter (R₁₁) oder nicht substituierter aromatischer Ring mit 0 bis 3 Heteroatomen ist, wobei R₁₁ aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, -R, substituiertem oder nicht substituiertem Aryl (ArR oder Ar), Halogeniden, Nitro, Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, -CO₂H, -C(O)OR, Cyano (-CN), -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)NHR, Ethylenglykol oder Polyethylenglykol ausgewählt ist, und wobei diese Teilklasse von Substraten die Formel VI aufweist:
Formel VI
Vorzugsweise sind neue chemilumineszierende Acridiniumsubstrate der vorliegenden Erfindung der Formel II eine Teilklasse von Verbindungen der nachstehenden Formel VII, bei der ein mehrwertiges Heteroatom M Sauerstoff (O) ist und die Gruppe P eine Phosphorylgruppe, -PO₃Na₂, ist, wobei die beiden Natriumkationen, deren Zweck lediglich darin besteht, die Elektroneutralität des Moleküls herzustellen, unabhängig durch Wasserstoff, Kalium, Magnesium, Calcium oder durch (ein(e)) anderes) kationische(s) Ion(en) oder Gruppe(n) ausgetauscht werden können.
Formel VII
Die bevorzugte Hydrolase (HE), die im Schema I gezeigt ist, ist eine hydrolytische Phosphatase. Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer hydrolytischen Phosphatase mit einer Verbindung der Formel VII.
Strukturell nahe verwandt mit den bevorzugten chemilumineszierenden Acridiniumverbindungen der Formel VII sind deren reduzierte Formen, chemilumineszierende Acridane der Formel VIII, bei der alle Substitutionen gemäß der Formel VII definiert sind. Die Verbindun gen der Formel VII können chemisch angeregt werden, über die Bildung von Acridinium-Zwischenprodukten und/oder über eine direkte Oxidation zur Bildung elektronisch angeregter Produkte, bei denen es sich um die gleichen Produkte von Acridiniumverbindungen der Formel VII handelt, Licht zu erzeugen.
Formel VIII
Eine weitere Teilklasse der Verbindungen, die strukturell mit bevorzugten chemilumineszierenden Acridiniumverbindungen der Formel VII verwandt sind, sind Spiroacridanverbindungen der Formel IX, bei denen X₁, X₂, Z₁, Z₂, R', R₁, R_2a-c R_3a-d, M und P gemäß der Formel VI definiert sind und zwei Natriumkationen gemäß der Formel VII definiert sind.
Formel IX
Eine der bevorzugten Verbindungen, die von der Formel VII ausgewählt sind, bei der R_2a-c, R_3a-d Wasserstoff sind, R₁ Methyl, X Sauerstoff, Z weggelassen und Y ein polysubstituierter Arylrest der Formel III ist, worin R₄ und R₈ Methyl sind, R₅ und R₇ Wasserstoff sind und R₆ Carboxyl (-CO₂H) ist, ist 2-Phos-DMAE, dessen Struktur nachstehend als 1 gezeigt ist. (Vgl. die 1A. Anmerkung: Die nachstehende Struktur 1 ist auch in der beigefügten 1A gezeigt. Entsprechend werden andere Strukturen in dieser Anmeldung mit Zahlen bezeichnet, die der Bezeichnung in der 1 entsprechen.)
Wie es im Abschnitt der Beispiele beschrieben ist, ist 2-Phos-DMAE (1) ein hervorragendes Substrat der hydrolytischen alkalischen Phosphatase (AP). In einem alkalischen wässrigen Medium mit einem breiten pH-Bereich wird es durch AP unter Bildung von 2-OH-DMAE (2) leicht dephosphoryliert, wie es in der Reaktion B veranschaulicht ist. Sowohl 1 als auch 2 sind chemilumineszierend. Wie es in den 2A und 2B und auch in der Tabelle 1 beschrieben ist, wurde überraschenderweise gefunden, dass 1 und 2 Licht bei verschiedenen Emissionsmaxima emittieren, wenn sie jeweils mit Wasserstoffperoxid in stark alkalischer Lösung behandelt werden. Insbesondere emittiert die Verbindung 1 ein intensives, sichtbares blaues Licht bei λmax 478 nm, während die Verbindung 2 ein intensives, sichtbares oranges Licht bei λmax 602 nm emittiert, was zu einer bathochromen Verschiebung des Emissionsmaximums um 128 nm führt. Verschiedene Paare von Analoga (3 und 4, 5 und 6, 7 und 8), sowie ein Paar von Spiroacridanen (11 und 12), deren Strukturen in der 1 angegeben sind, weisen auch die gleichen Lichtemissionseigenschaften auf. Die Verbindungen 7 und 8 weisen am Stickstoff des Acridiniumkerns auch zusätzliche hydrophile Gruppen auf.
Reaktion B
Gemäß der Reaktion C wird die Chemilumineszenzreaktion einer Acridiniumverbindung durch Wasserstoffperoxid in stark alkalischer Lösung ausgelöst. Nach der Abspaltung der Abgangsgruppe LG wird das hochenergetische Dioxetanon gebildet. Das stark gespannte Dioxetanon-Zwischenprodukt zersetzt sich zu dem Acridon, wobei ein Teil davon in einem elektronisch angeregten Zustand gebildet wird. Wenn das angeregte Acridon zu einem Grundzustand zurückkehrt, findet eine Lichtemission statt. Die Emissionswellenlänge wird von der Energielücke zwischen dem ersten angeregten Zustand und dem Grundzustand bestimmt, die wiederum von der spezifischen Struktur des Acridons mit verschiedenen funktionellen Gruppen bestimmt wird. Gemäß der Offenbarung in der WO 00/09487 gibt es mehrere Faktoren, welche die Energielücke zwischen dem ersten angeregten Zustand und dem Grundzustand des Acridons und folglich die Emissionswellenlänge beeinflussen können. Einer der Faktoren ist die direkte Bindung der erforderlichen funktionellen Gruppe T an eine der Peri-Positionen des Acridiniumkerns. Gemäß der vorstehend genannten WO 00/09487 wurde gefunden und offenbart, dass dann, wenn eine Hydroxylgruppe an der (2)- oder (7)-Position angeordnet wird, wie z.B. in 2-OH-DMAE (2), die Verbindung in einer stark alkalischen Lösung Licht bei λmax 604 nm emittiert. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Hydroxylgruppe in einer stark alkalischen Lösung deprotoniert wird und das resultierende negativ geladene Oxyanion einen starken elektronenliefernden Effekt auf den Acridiniumkern ausübt, wodurch folglich die Energielücke zwischen dem ersten angeregten Zustand und dem Grundzustand des Acridons vermindert wird, wodurch eine bathochrome Verschiebung der Lichtemission von 430 nm der nicht substituierten Acridiniumverbindung zu 602 nm verursacht wird.
Reaktion C
In dieser Erfindung dient eine Phosphoryloxygruppe an der (2)-Position von 1 als maskierte Hydroxylgruppe. Diese Phosphoryloxygruppe ist in einem wässrigen Medium in einem breiten pH-Bereich, in dem nahezu alle Hydrolasereaktionen stattfinden, thermisch und hydrolytisch stabil. Sie ist auch in einem Gemisch aus Wasserstoffperoxid und einer stark alkalischen Lösung für einen Zeitraum stabil, der zur Umwandlung von Acridiniumverbindungen zu den lichtemittierenden Acridonen benötigt wird. Da die Phosphoryloxygruppe in 1 in der Abwesenheit einer Hydrolase während der Reaktion nahezu intakt bleibt und auch gegenüber Wasserstoffperoxid und einer stark alkalischen Lösung stabil ist, wird der elektronenliefernde Effekt des an der (2)-Position direkt gebundenen Sauerstoffs in Richtung des Acridiniumkerns signifikant vermindert. Folglich findet keine bathochrome Verschiebung der Emissionswellenlänge statt. Dies stellt einen starken Gegensatz zu der Situation von 2-OH-DMAE (2) dar, dem Produkt der Reaktion in der Gegenwart einer Hydrolase. In dem letztgenannten Fall wird die Hydroxylgruppe an der (2)-Position zu einem negativ geladenen Oxyanion ionisiert, das einen starken elektronenliefernden Effekt auf den Acridiniumkern ausübt, wodurch eine signifikante bathochrome Verschiebung der Emissionswellenlänge verursacht wird.
Es wäre erwünscht, dass in einem System, bei dem 1 als chemilumineszierendes Substrat verwendet wird, eine spezifische Hydrolase wie z.B. AP, die entweder als Marker verwendet wird oder als Marker eines Biomoleküls vorliegt, ein kurzwellig emittierendes 1 zu einem langwellig emittierenden 2 umwandelt. Tatsächlich erzeugt das Reaktionsgemisch, das sowohl 1 als auch 2 enthält, bei der Behandlung mit Wasserstoffperoxid und einer stark alkalischen Lösung ein Gemisch von Lichtsignalen, die jeweils ihr eigenes Maximum bei 478 nm bzw. 602 nm aufweisen. Die Abnahme des kurzwelligen Signals (λmax 478 nm) oder die Zunahme des langwelligen Signals (λmax 602 nm) korreliert direkt mit der Enzymmenge.
Eine andere bevorzugte Verbindung, die aus der Formel VII ausgewählt ist, ist 2-Phos-7-MeO-DMAE (9). Überraschenderweise wurde gefunden, dass das dephosphorylierte Produkt 2-OH-7-MeO-DMAE (10) in der Reaktion D ein um 60 bis 70 nm langwelligeres Emissionsmaximum aufweist als die nicht methoxylierte Verbindung 2 (2-OH-DMAE), während beide entsprechenden 2-phosphorylierten Formen nahezu die gleichen Lichtemissionsmaxima aufweisen. Folglich erzeugt das 2-Phos-7-MeO-DMAE- und 2-OH-7-MeO-DMAE-Paar aus chemilumineszierendem Substrat und Produkt effektiv eine weiter verbesserte Unterscheidung bei der Lichtemissionswellenlänge. Diese Erkenntnis hat zu einem weiteren bevorzugten Satz chemilumineszierender Substrate auf Acridiniumbasis geführt, bei denen die Formel VII wie vorstehend definiert ist, die Substituenten von R_3c jedoch jedwede elektronenliefernde Gruppe wie z.B. Hydroxy, Thiol, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Alkoxy oder Thioalkyl sein können. Die Gegenwart dieser zweiten elektronenliefernden Gruppe vermindert die Energielücke zwischen dem elektronisch angeregten Zustand und dem Grundzustand des lichtemittierenden Acridons weiter. Folglich wird verglichen mit 2-Hydroxy-DMAE eine weitere Rotverschiebung der Lichtemission festgestellt. Diese Verschiebung führt auch zu einer verstärkten spektralen Unterscheidung des Blau- und Rot-emittierenden Acridiniumesterpaars.
Reaktion D
Einer der Modi des Enzymnachweises, der in dieser Erfindung beschrieben ist, besteht darin, das langwellige Signal des Produkts (2) nachzuweisen, das sich aus der Enzymeinwirkung ergibt. Die gebräuchlich verwendeten Verfahren zum Lichtnachweis umfassen die Verwendung eines Luminometers, einer CCD-Kamera, eines Röntgenfilms und eines hochempfindlichen photographischen Films. Da die nachzuweisende Hydrolase in der Probe häufig in einer kleinen Menge vorliegt, ist die Menge des durch das Enzym erzeugten Produkts im Vergleich zu der Menge des in der Reaktion verwendeten Substrats relativ klein. Daher ist es kritisch, dazu in der Lage zu sein, ein solches geringes Ausmaß dieses Signals in der Gegenwart eines starken Signals des Substrats nachweisen zu können.
Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung, der den Nachweis eines langwelligen Emissionssignals des Produkts wie z.B. 2 betrifft, das durch eine Hydrolase erzeugt worden ist, ist die Verwendung eines Luminometers mit einer rotempfindlichen Photomultiplierröhre (PMT). (Häufig wird diese Art von PMT während des Gebrauchs gekühlt, um das Systemrauschen zu vermindern.) Die am gebräuchlichsten verwendeten käuflichen Photomultiplierröhren sind aus einem Bialkalimaterial mit geringem Dunkelrauschen hergestellt. Dieses weist eine hervorragende Quantenausbeute im kurzen Wellenlängenbereich, jedoch eine sehr geringe Quantenausbeute im langen Wellenlängenbereich auf. Beispielsweise weist die Bialkali-PMT Modell R268 von Hamamatsu eine Quantenausbeute von etwa 22 % im Bereich von 400 bis 500 nm und von nur etwa 2 % bei 600 nm und darüber auf, was für diese spezifische Anwendung nicht bevorzugt ist. Andererseits ist eine PMT, die aus einem Multialkalimaterial hergestellt ist, relativ rotempfindlicher als eine PMT, die aus einem Bialkalimaterial hergestellt ist. Beispielsweise weist die Multialkali-PMT Modell R2228 von Hamamatsu eine Quantenausbeute von 3 bis 5 % im Bereich von 400 bis 500 nm und eine Quantenausbeute von etwa 5 % um 600 nm auf. Dies ist für diese Anwendung mehr bevorzugt. Der Nachteil dieser PMT ist ein hohes Dunkelrauschen und sie muss daher bei niedrigen Temperaturen betrieben wer den, um das Dunkelrauschen zu unterdrücken. Die 3 und 4 zeigen Quanteneffizienzen von Bialkali R268- bzw. Multialkali R2228P-PMT's.
Ein weiterer nützlicher Aspekt dieser Erfindung, der den Nachweis eines langwelligen Emissionssignals des Produkts betrifft, ist die Verwendung einer CCD-Kamera, insbesondere einer dünn gemachten, von der Rückseite beleuchteten gekühlten CCD. Gemäß der 5 weist diese CCD bei 400 nm eine Quanteneffizienz von etwa 80 % und bei 700 nm eine Quanteneffizienz von etwa 90 % auf, wodurch folglich die Nachweisbarkeit eines langwelligen Emissionssignals (>550 nm) verglichen mit R268 um das 10- bis 20-fache erhöht werden kann.
Da sowohl die Substrate als auch die Produkte der vorliegenden Erfindung chemilumineszierend sind, ist ein essentieller Aspekt dieser Erfindung, der den Nachweis eines langwelligen Emissionssignals von 2 betrifft, die Verwendung einer Filtervorrichtung zur Blockierung des kurzwelligen Signals von 1. Die 6 und 7 zeigen die Durchlässigkeiten von Langwellen-Durchgangsfiltern LL700 bzw. LL650 von Corion (Corion, Franklin, MA).
Einer der Vorteile der Verwendung chemilumineszierender Acridiniumsubstrate wie z.B. 1 zum Nachweis von Hydrolasen besteht darin, dass die Produkte wie 2, die durch das Enzym erzeugt werden, akkumuliert werden, ohne dass sie während der Enzymreaktion einer signifikanten Zersetzung unterliegen. Die 8 und 9 zeigen die Stabilität von 2-OH-DMAE (2) in einem wässrigen Medium bei pH 9 und 10,5 und bei verschiedenen erhöhten Temperaturen.
Die Empfindlichkeit beim Nachweis eines langwelligen Emissionssignals des Produkts, das durch eine Hydrolase erzeugt worden ist, hängt stark von der Signaldifferenzierung des Produkts (2) und des Substrats (1) ab. Es ist daher bevorzugt, die Hintergrundemission des Substrats 2-Phos-DMAE zu vermindern, um ein empfindliches System zu erhalten. Die Erzeugung von Licht durch Acridiniumverbindungen wird herkömmlich zuerst durch die Behandlung mit einer sauren Wasserstoffperoxidlösung und dann mit einer alkalischen Lösung eines grenzflächenaktiven Mittels durchgeführt. Der Zweck der Säure ist die Umwandlung der pseudo-Form der Acridiniumverbindung in die quartäre Form und das grenzflächenaktive Mittel unterstützt bei der Erhöhung der Quantenausbeute der Acridiniumverbindung. Vorzugsweise enthält die saure Wasserstoffperoxidlösung Wasserstoffperoxid in einer Konzentration von 0,001 bis 5 % und Salpetersäure in einer Konzentration von 0,001 bis 1 N, und die alkalische Lösung eines grenzflächenaktiven Mittels enthält Natriumhydroxid in einer Konzentration von 0,01 bis 1 N und 0,01 bis 1 % AQUARD (CTAB). Mehr bevorzugt enthält die saure Wasserstoffperoxidlösung 0,5 % Wasserstoffperoxid und 0,1 N Salpetersäure und die alkalische Lösung eines grenzflächenaktiven Mittels enthält 0,25 N Natriumhydroxid und 0,5 AQUARD (CTAB).
Eine überraschende Erkenntnis, die einen Vorteil beim Nachweis des langwelligen Emissionssignals von 2 darstellt, besteht darin, dass die Chemilumineszenz von 1 unter bestimmten Bedingungen selektiv und signifikant unterdrückt wird und dass dadurch die Gesamtsignaldifferenzierung von 2 gegenüber 1 verbessert wird. Insbesondere wird die Chemilumineszenz von 1 signifikant vermindert, wenn die Lösung zuerst mit einer alkalischen Lösung und dann mit einer Wasserstoffperoxidlösung behandelt wird. Insbesondere wenn eine Lösung von 1 mit einer 0,25 N Natriumhydroxidlösung, die 0,5 % AQUARD enthält, und dann mit 0,5 % Wasserstoffperoxid behandelt wird, wird die Quantenausbeute von 1 um mehr als das 30-fache vermindert. Im Gegensatz dazu wird unter den gleichen Bedingungen die Quantenausbeute von 2 im Wesentlichen nicht beeinflusst. Dies führt zu einer Gesamtverbesserung der Signaldifferenzierung um das 30-fache. Folglich enthält für eine bessere Unterscheidung zwischen den Signalen bestimmter chemilumineszierender Produkte und deren Substraten die alkalische Lösung vorzugsweise Natriumhydroxid in einer Konzentration von 0,01 bis 1 N und AQUARD in einer Konzentration von 0,01 bis 1 %, und die Wasserstoffperoxidlösung enthält Wasserstoffperoxid in einer Konzentration von 0,001 bis 5 %. Mehr bevorzugt enthält die alkalische Lösung 0,25 N Natriumhydroxid und 0,5 % AQUARD und die Wasserstoffperoxidlösung enthält 0,5 % Wasserstoffperoxid.
Mit einem oder mehreren der vorstehend beschriebenen Ansätze in einer Kombination werden mehrere Testsysteme auf der Basis des Prinzips des Nachweises des langwelligen Emissionssignals, das durch die Wirkung von AP auf 2-Phos-DMAE (1) erzeugt wird, aufgebaut, und diese sind in dem Abschnitt der Beispiele beschrieben. Ein Beispiel (Beispiel 17) besteht aus der Inkubation von AP-Standards in einer Substratlösung, die 0,1 mM 2-Phos-DMAE (1), 1 mM Magnesiumchlorid in 100 mM pH 9 Tris-Puffer enthält, für 1 Stunde bei 45°C. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer gemessen, das mit einer rotempfindlichen PMT (R2228P) und einem Langwellen-Durchgangsfilter (LL700) ausgestattet und in einem 4°C kalten Raum angeordnet war. Die Probe wurde zuerst mit einer 0,25 N Natriumhydroxidlösung, die 0,5 % AQUARD enthielt, und sofort danach mit 0,5 % Wasserstoffperoxid behandelt. Gemäß der 12 wird AP in einer Konzentration von unter 1,0 · 10^–18 mol nachgewiesen. Ein weiteres Beispiel bei entsprechenden Bedingungen ist im Beispiel 16 angegeben und das Ergebnis ist in den 10 und 11 gezeigt.
Ein weiteres wichtiges Verfahren zum selektiven Vermindern des Hintergrunds von 2-Phos-DMAE (1) besteht aus einem selektiven Quenchen. Selektives Quenchen bezieht sich hier und nachstehend auf die Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen) oder eines chemischen Rests oder mehrerer chemischer Reste zur selektiven Verminderung der Chemilumineszenz des Substrats wie z.B. 1 über einen Energieübertragungsmechanismus. Unter Bezugnahme auf das Schema III kann die Energie des angeregten Acridons (Donor), die aus der Chemilumineszenzreaktion der Acridiniumverbindung resultiert, auf ein benachbartes, nicht fluoreszierendes Molekül (Akzeptor oder Quencher) übertragen werden. Dieses nicht fluoreszierende Molekül kehrt über einen von Strahlung verschiedenen Weg zur Energiefreisetzung in den Grundzustand zurück. Die Quantenausbeute der Acridiniumverbindung wird als Ergebnis des Quenchens gequencht oder vermindert. Die Effektivität des Quenchens hängt von dem Abstand, der spektralen Überlappung und der Dipol-Dipol-Übergangswechselwirkung der Acridiniumverbindung und dem Quencher ab. Als erstes müssen die Acridiniumverbindung und der Quencher nahe beeinander angeordnet sein, vorzugsweise in einem Abstand von weniger als 10 nm, um einen Quencheffekt von 20 bis 100 zu erhalten, da die Effektivität der Energieübertragung umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstands zwischen dem Donor und dem Akzeptor ist. Zweitens muss das UV-Absorptionsspektrum des Quenchers zumindest teilweise mit dem Emissionsspektrum der Acridiniumverbindung überlappen. Schließlich erfüllt, obwohl es häufig nicht einfach ist, die räumlichen Konformationen der beiden betroffenen Moleküle so zu steuern, dass eine effektive Dipol-Dipol-Übergangswechselwirkung erhalten wird, eine relativ freie Bewegung der räumlich nahe beieinander liegenden Moleküle dieses Erfordernis.
Es gibt allgemein zwei Wege des Quenchens, nämlich einen intermolekularen und einen intramolekularen Weg. Insbesondere bezüglich dieser Erfindung bezieht sich das intermolekulare Quenchen darauf, dass der Quencher und die Acridiniumverbindung in der gleichen Lösung koexistieren, die beiden Moleküle jedoch nicht miteinander verknüpft sind. Das intramolekulare Quenchen bezieht sich darauf, dass sowohl der Quencher als auch die Acridiniumverbindung in einem Molekül kovalent verknüpft sind. Im Fall des intermolekularen Quenchens hängt die Effektivität des Quenchens von der Konzentration des Quenchers relativ zu der Konzentration der Acridiniumverbindung ab. Die Konzentration des Quenchers oder des Substrats oder von beiden muss im Bereich von millimolar liegen, um ein effektives Quenchen zu erreichen. Beim intramolekularen Quenchen wird die Effektivität des Quenchens jedoch durch den Bindungsabstand zwischen den beiden Molekülen bestimmt und dies wiederum kann durch eine geeignete Auswahl der Länge der Kette, welche die beiden verbindet, gewährleistet werden.
Ein weiterer Aspekt, der eng mit der Auswahl eines Quenchers zusammenhängt, besteht darin, dass der Quencher nur selektiv oder vorzugsweise Licht von 2-Phos-DMAE (1) quencht und einen geringen oder keinen Effekt auf die Lichtemission von 2-OH-DMAE (2) aufweist. Um dies zu erreichen, sollte das UV-Absorptionsspektrum des Quenchers eine maximale Überlappung mit dem Emissionsspektrum von 1, jedoch eine minimale Überlappung oder vorzugsweise keinerlei Überlappung mit dem Emissionsspektrum von 2 haben. Das andere Kriterium für einen effektiven Quencher für diese Anwendung umfasst einen hohen molaren Extinktionskoeffizienten und eine angemessene Wasserlöslichkeit. Beispiele für Verbindungen, die als Quencher geeignet sind, sind nachstehend angegeben, jedoch nicht auf die angegebenen Verbindungen beschränkt.
Diese Erfindung soll unter anderem einen Mechanismus zur selektiven Verminderung der Lichtemission des Substrats über ein selektives Quenchen bereitstellen. Es sollte beachtet werden, dass jedweder andere Ansatz oder Mechanismus, der die Quantenausbeute der chemilumineszierenden Substrate selektiv vermindern kann, ebenfalls in den Bereich dieser Erfindung fällt.
Der zweite Modus des Lichtnachweises umfasst den Nachweis des kurzwelligen Emissionssignals des Substrats (1), das sich als Ergebnis der Enzymwirkung vermindert. Dieser Nachweismodus nutzt die hohe Quantenausbeute von blauempfindlichen Bialkali-PMT's, wie es weiter oben diskutiert worden ist. Im Zusammenhang mit der Verwendung einer blauempfindlichen PMT muss auch eine Filtervorrichtung verwendet werden, die ein langwelliges Emissionssignal blockieren kann, um die langwellige Lichtemission des Produkts in der Hydrolasereaktion zu blockieren.
Im Rahmen der Formel II umfasst eine weitere wichtige Teilklasse chemilumineszierender Substrate im Zusammenhang mit dieser Erfindung Substrate, die zu einer „umgekehrten Emission" fähig sind, bei denen Lumi-M-P langwelliges Licht emittieren kann, während das Produkt (Lumi-M) kurzwelliges Licht emittieren kann. Ein Hauptvorteil bei diesem umgekehrten Emissionsmodus besteht darin, dass das Produkt bei einem kurzwelligen Emissionssignal mit einer blauempfindlichen Bialkali-PMT, die mit einem Kurzwellen-Durchgangsfilter ausgestattet ist, nachgewiesen wird, wobei die Quantenausbeute der PMT einen hohen Wert von 22 % aufweist.
Chemilumineszierende Substrate, die zu der umgekehrten Emission fähig sind, werden durch die Formel II dargestellt, wobei M-P durch die Formel X ersetzt wird:
Formel X
In der Formel X sind M und P vorzugsweise gemäß der Formel II definiert. ED ist eine elektronenliefernde Gruppe, vorzugsweise eine ionisierbare Gruppe, die ein Elektronenpaar an das konjugierte System liefert und aus Hydroxyl, -OR, -NR'R'', Thiol (-SH), -SR und -CHWn ausgewählt ist, wobei n = 1 oder 2, W eine elektronenziehende Gruppe ist, die unter anderem Nitro, Nitroso, Cyano (-CN), -CHO, -C(O)R, -N⁺RR'R'', -CO₂H, -CO₂R, -S(O)R, -SO₂R, -SO₂OR, -SO₂NHR, -SO₂NR'R'', -SO₃H oder F umfasst, wobei R gemäß der Formel II definiert ist, R' und R'' Wasserstoff oder Niederalkyl sind und R, R' und R'' alle gleich oder verschieden sein können. ED ist mit R₁₂ oder R₁₅ austauschbar.
R₁₂, R₁₃, R₁₄ und R₁₅ können gleich oder verschieden sein und sind aus Wasserstoff, -R, Hydroxyl, Amino, Halogeniden, Nitro, Nitroso, Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, -CO₂H, Cyano (-CN), -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R und -C(O)NHR ausgewählt und R ist gemäß der Formel II definiert. Alternativ können jedwede benachbarte zwei Gruppen von R₁₂ bis R₁₅ einen oder mehrere zusätzliche(n) kondensierte(n) aromatische(n) Kohlenwasserstoffringe) oder heteroaromatische(n) Ring(e) mit oder ohne Substitutionen bilden und die zusätzlichen kondensierten aromatischen Kohlenwasserstoffringe und heteroaromatischen Ringe umfassen unter anderem Benzol, Naphthalin, Pyridin, Thiophen; Furan und Pyrrol, usw.
Vorzugsweise sind R₁₂, R₁₃, R₁₄ und R₁₅ alle Wasserstoff und ED ist Hydroxy und chemilumineszierende Substrate, die zu einer umgekehrten Emission fähig sind, haben die Formel XI:
Alternativ kann sich die Gruppe der Formel X an der C₃-Position des Acridiniumkerns befinden, was durch die nachstehende Formel XII dargestellt ist:
Formel XII
Mehr bevorzugt sind in der Formel XI und XII M Sauerstoff, P eine Phosphorylgruppe, -PO₃Na₂, wobei die beiden Natriumkationen unabhängig durch Wasserstoff, Kalium, Magnesium, Calcium oder (ein(e)) anderes) kationische(s) Ion(en) oder Gruppe(n) ersetzt werden kann, um die Elektroneutralität des Moleküls aufrecht zu erhalten, R_2a-c und R_3a-d sind Wasserstoff, R₁ ist Methyl, X ist Sauerstoff, Z ist weggelassen und Y ist ein polysubstituierter Arylrest der Formel III, wobei R₄ und R₈ Methyl sind, R₅ und R₇ Wasserstoff sind und R₆ Carboxyl (-CO₂H) ist. Eines der mehr bevorzugten chemilumineszierenden Substrate, das zu einer umgekehrten Emission fähig ist, hat die Struktur 13. Es wird durch alkalische Phosphatase leicht in dessen Ketoform (14) umgewandelt.
Ein weiteres bevorzugtes chemilumineszierendes Substrat, das zu einer umgekehrten Emission fähig ist, ist die reduzierte Form der Verbindung 13,
die als 15 gezeigt ist. Wie 13 wird auch die Verbindung 15 durch alkalische Phosphatase leicht in deren Ketoform (16) umgewandelt.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass beide Verbindungen 13 und 15 Licht mit extrem langen Wellenlängen emittieren können. Die 2M ist das Emissionsspektrum der Verbindung 15, das mittels FSSS bestimmt worden ist und zeigt, dass die Verbindung 15 Licht bei λmax 678 nm emittiert. Die 2N ist das Emissionsspektrum der Verbindung 16, die das Produkt von 15 nach der Behandlung mit AP ist. Die 2N zeigt, dass 16 Licht bei λmax 450 nm emittiert, wodurch eine hypsochrome Nettoverschiebung von 15 von 228 nm erhalten wird.
Eine hypsochrome Verschiebung der Emissionswellenlänge aufgrund einer Anzahl von Faktoren, einschließlich Lösungsmitteleffekten und chemischen Substitutionseffekten auf die Acridiniumverbindungen, wurde in der gleichzeitig anhängigen WO 00/09487 beschrieben. Eine der Erkenntnisse in dieser Erfindung, die eine große hypsochrome Verschiebung der Emissionswellenlänge von 13 zu 14 und von 15 zu 16 betrifft, ist auf die Unterbrechung der elektronischen Konjugation zwischen dem Acridiniumkern und der elektronenreichen aromatischen Seitenkette zurückzuführen, die durch die enzymatische Dephosphorylierung verursacht wird.
2. Substrate und Produkte mit verschiedenen Emissionskinetiken
Zusätzlich zur spektralen Unterscheidung als Mittel der Unterscheidung eines chemilumineszierenden Substrats von einem Produkt ist auch die enzymvermittelte Veränderung der Acridiniumester-Flashkinetik ein effektives Verfahren zur Überwachung und Bestimmung der Konzentration des Enzyms. Diese Verfahrensweise stellt somit ein alternatives „Lese"-Signal bereit, wenn das Enzym als Marker in einem Test verwendet wird. Ein Ansatz zur Modulierung der Acridiniumester-Lichtemissionskinetik besteht in der Veränderung der elektroni schen Eigenschaften einer geeigneten funktionellen Gruppe, die sich am Phenol befindet, wie es in der Reaktion E gezeigt ist. Während der Chemilumineszenzreaktion von Acridiniumestern ist die Spaltung des phenolischen Esters eine Voraussetzung für die Bildung der Dioxetanon-Vorstufe, die schließlich für die Lichtemission verantwortlich ist. Wenn die Spaltung dieses phenolischen Esters in einer vorhersagbaren Weise dadurch verändert werden kann, dass das Phenol zu einer besseren oder schlechteren Abgangsgruppe gemacht wird, kann die Kinetik der Lichtemission des entsprechenden Acridiniumesters moduliert werden. Beispielsweise wird eine elektronenliefernde Gruppe, die sich ortho oder para zu dem phenolischen Hydroxylrest befindet, das Phenol elektronenreich und somit zu einer schlechten Abgangsgruppe machen. Dies wird zu einer langsamen Lichtemission führen. Die Umwandlung der elektronenliefernden Gruppe zu einer elektronenziehenden Gruppe wird die Spaltung des phenolischen Esters beschleunigen und es wird eine schnelle Lichtemission erhalten. Die Umwandlung einer elektronenliefernden in eine elektronenziehende Gruppe oder umgekehrt kann enzymatisch erreicht werden. Beispielsweise ist bekannt, dass oxidative Enzyme wie z.B. Peroxidasen elektronenliefernde Gruppen wie z.B. Aminogruppen in elektronenziehende Gruppen wie z.B. Nitroso- oder Nitrogruppen umwandeln können. Andererseits können Hydrolasen eine elektronenziehende oder neutrale funktionelle Gruppe in eine elektronenliefernde Gruppe umwandeln. In diesem Fall wird die Kinetik der Lichtemission eines Acridiniumesters durch den Enzymmarker verlangsamt.
Reaktion E
Acridiniumester, die am Phenol eine 4'-Hydroxygruppe enthalten, zeigen bei der Lichtemission bei der Reaktion mit Wasserstoffperoxid in stark alkalischer Lösung eine langsame Kinetik. Dies ist in erster Linie darauf zurückzuführen, dass das Phenol in dem Acridiniumester, das die 4'-Hydroxygruppe enthält, eine schlechte Abgangsgruppe ist. Die Umwandlung dieser Hydroxygruppe in einen Phosphatester dämpft das Vermögen des 4'-Sauerstoffsubstituenten zum Liefern von Elektronen etwas. Die Lichtemission von Acridiniumestern, die einen 4'-Phosphosubstituenten enthalten, ist relativ schneller als die Lichtemission ihrer 4'-Hydroxy-Gegenstücke. Innerhalb dieser Kategorie gibt es eine Teilgruppe chemilumineszierender Acridiniumsubstrate, die nach der Behandlung mit einer Hydrolase Licht mit einer langsameren Kinetik emittieren können, wobei die Teilgruppe der chemilumineszierenden Acridiniumsubstrate die Formel XIII hat, worin R₁, R_2a-c, R_3a-d, A^–, M und P gemäß der Formel II definiert sind, R_2d wie R_2a, R_2b, R_3b und R_3d definiert ist und R₅ und R₇ gemäß der Formel III definiert sind. R₁₆ und R₁₇, die gleich oder verschieden sind, sind Gruppen, die aus Wasserstoff, Methyl, Alkyl mit niedrigem Molekulargewicht und Halogeniden ausgewählt sind. Vorzugsweise sind R₁₆ und R₁₇ verschieden und einer davon ist Wasserstoff. Mehr bevorzugt sind sowohl R₁₆ als auch R₁₇ Wasserstoff.
Formel XIII
Eines der mehr bevorzugten chemilumineszierenden Acridiniumsubstrate der Formel XIII ist die Verbindung 4'-Phos-AE (17). Gemäß der Reaktion F wird 17 durch AP leicht in das Produkt 4'-OH-AE (18) umgewandelt. Es wurde gefunden, dass bei kurzen Messzeiten (0,5 bis 0,3 s) 17 Licht etwa 190-Mal schneller emittierte als 18. Während theoretisch entweder die Konzentration des Substrats oder des Produkts gemessen werden kann, um die Enzymaktivität abzuschätzen, wurde gefunden, dass es bequemer ist (für eine effektive Signalunterscheidung) die Chemilumineszenzaktivität des Substrats 4'-Phos-AE (17) zu messen. Die Chemilumineszenzreaktion auf die Konzentration der alkalischen Phosphatase unter Verwendung von 17 als Substrat ist in der 13 gezeigt.
Reaktion F
3. Lichtemissionsspektren
Die Lichtemissionsspektren der Verbindungen 1 bis 12 und 15 bis 18 wurden durch ein spektrales Schnellabtastsystem ("Fast Spectral Scanning System" (FSSS)) von Photo Research (eine Abteilung von Kollmorgen Corp.), Burbank, Kalif., USA, bestimmt. Das Experiment wurde in einer Dunkelkammer durchgeführt. Jede Verbindung wurde in Acetonitril oder N,N-Dimethylformamid gelöst. Das resultierende Konzentrat wurde mit dem gleichen Lösungsmittel zur Bildung der Arbeitslösung verdünnt, die beim Flashen eine Lichtemission mit einer angemessenen Intensität ergab. Bei einem typischen Experiment wurden 10 bis 100 μg oder mehr der Probe in 500 μl des Lösungsmittels eingesetzt, das in einem 13 × 100 mm-Borosilikatreagenzglas enthalten war. Das Reagenzglas wurde in einem auf eine geeignete Höhe gebrachten Reagenzglashalter angeordnet. Ein Stück Aluminiumfolie wurde auf der Rückseite des Reagenzglases angeordnet, um die Nachweisbarkeit des emittierten Lichts zu erhöhen. Der optische Kopf des FSSS wurde vor dem Reagenzglas in einem Abstand von etwa 130 mm angeordnet, wobei dessen Linse auf die Flüssigkeit in dem Reagenzglas fokussiert war. Die Probelösung wurde zuerst mit 0,35 ml des Flashreagenz #1 (Bayer Diagnostics) behandelt, das 0,1 N HNO₃ und 0,5 % H₂O enthielt. Der Raum wurde dann abgedunkelt und 0,35 ml des Flashreagenz #2 (Bayer Diagnostics), das 0,25 N NaOH und 0,5 ARQUAD enthielt, wurde sofort dem Reaktionsgemisch zugesetzt (vgl. das US-Patent 4,927,769). Das Licht, das sofort nach der Zugabe des Reagenz #2 erzeugt worden ist, wurde mit dem FSSS 5 s lang aufgezeichnet, und zwar beginnend etwa 1 s vor der Zugabe des Reagenz #2. Die verschiedenen Emissionsspektren, die mit dem FSSS bestimmt worden sind, sind in den 2A bis 2P angegeben und auch in der Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
4. Anwendungen der chemilumineszierenden Enzymsubstrate in Bindungstests
Während in dem hier beschriebenen spezifischen Beispiel des tatsächlichen diagnostischen Tests 2-Phos-DMAE (1) als chemilumineszierendes Substrat für alkalische Phosphatase genutzt wird, wobei die alkalische Phosphatase als Marker für den Nachweis von menschlichem Thyroid-stimulierendem Hormon (TSH) in Serum dient, ist die Schlussfolgerung sinnvoll, dass verschiedene Hydrolasen im Zusammenhang mit den geeigneten chemilumineszierenden Substraten in verschiedenen Testarchitekturen zum Nachweis entweder von endogenen diagnostischen Enzymmarkern oder anderen klinisch relevanten diagnostischen Markern verwendet werden könnten, falls die Hydrolase als Marker verwendet wird. Während daher geltend gemacht wird, dass diese Testarchitekturen für den Fachmann für enzymatische diagnostische Tests offensichtlich oder in anderer Weise ersichtlich sein sollten, sind die Ansprüche nicht auf die nachstehende Beschreibung beschränkt.
a. Umwandlung eines Testlesesystems von einem kolorimetrischen Nachweis oder einem Fluoreszenznachweis zu einem Chemilumineszenznachweis:
Über die gemeinsame Anwendung von Enzymmarkern und der davon abhängigen Lumineszenzchemie auf bioanalytische Techniken wurde als eine von mehreren Strategien zur Entwicklung ultraempfindlicher klinischer Nachweisverfahren von Kricka (Clin. Biochem. 26, 325 (1993)) berichtet. Die Umwandlung bestehender diagnostischer Testformate von deren gegenwärtigen Verfahren der kolorimetrischen oder fluorimetrischen Messung in das potenziell empfindlichere Verfahren des Chemilumineszenznachweises würde in verschiedenartiger Weise Anwendung bei der klinischen Analyse finden, insbesondere da diese kolorimetrischen oder fluorimetrischen Tests bereits in zahlreichen Konfigurationen vorliegen. Wie es weiter oben erwähnt worden ist, wurden in empfindlichen Immuntests chromogene und fluorimetrische Indikatorsubstanzen in Form von Enzymsubstraten zum Nachweis von Enzymen oder der Analyten, auf welche diese Enzyme als Marker gerichtet sind, verwendet. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein analytisches Verfahren, bei dem im Allgemeinen die Chemilumineszenzemissionseigenschaften eines Enzymsubstrats von dem resultierenden Produkt unterscheidbar sind und bei dem die Enzymquelle für die katalytische Umwandlung des Substrats in das Produkt zur direkten Messung der Enzymaktivität zur Messung entweder des Enzyms oder der Analyten, an die das Enzym als Marker gebunden würde, verwendet werden kann.
b. Ein Analyt, wie in dem nachstehenden Beispiel bezüglich menschlichem TSH, wird spezifisch mit zwei verschiedenen Antikörpern komplexiert, die auf einer Festphase immobilisiert und jeweils mit einem Enzymmarker markiert sind. Die Menge eines Analyten in einer Probe sollte zur Menge des eingefangenen Markers korrelieren, bei dem es sich in diesem Fall um alkalische Phosphatase handelt, und sollte schließlich zu der festgestellten Stärke der Chemilumineszenz korrelieren. Es ist jedoch in breiterer Weise das folgende Schema von Testarchitekturen vorgesehen, das allgemein in die beiden Klassen aufgeteilt wird, die unabhängig in Immuntests und Nukleinsäuretests bezeichnet werden. Diese Klassen werden ferner entweder in homogene oder heterogene Testkonfigurationen eingeteilt, und zwar abhängig von der Trennung eines gebundenen von einem freien Analyten. Ferner werden die Ansprüche nicht auf diejenigen Testsysteme beschränkt, die gegenwärtig Enzyme als Marker nutzen, d.h. EIA, ELISA, Emit^®, usw., sondern umfassen auch das Gebiet der klinischen Diagnostik, bei dem Enzyme nicht-Enzymmarker, d.h. Radioisotope, Chromaphore, Fluore, usw., frei ersetzen können.
c. Heterogener Chemilumineszenztest
Ein Enzym, das von einer Festphasenmatrix, wie z.B. einer Polystyroloberfläche, einem magnetischen Teilchen oder einer Kombination aus beidem, oder von einem ausfallenden Protein eingefangen worden ist, würde entweder unspezifisch, z.B. mittels Absorption, oder spezifisch, z.B. mittels nicht-kovalentem oder sonstigem Binden eines (gerichteten) Bindungspartners, einschließlich einer komplementären Nukleinsäuresequenz, Biotin, eines Antikörpers, eines bindenden Proteins, eines Rezeptors, eines Liganden, usw., an die Festphase, durch die Trennung der Festphase von anderen Testkomponenten vor der Anwendung des chemilumineszierenden Substrats von störenden Substanzen getrennt werden.
Das Enzym könnte entweder der interessierende endogene diagnostische Marker, ein kovalent oder in einer anderen Weise an einen spezifischen Bindungspartner gebundener Marker (zusammen als Tracer oder Sonde bezeichnet), der von der Festphase eingefangen wird, oder ein Sekundärreagenz sein, das zur Signalerzeugung oder Amplifizierung erforderlich ist, wie z.B. in Enzymtests mit periodischem Durchlauf.
Beispiele für diese Testkonfigurationen sind vielfältig in der Literatur und in Kompendien spezifischer Konstrukte beschrieben (E. Maggio, Enzyme-immunoassay; 1980, CRC Press; D. Wild, The Immunoassay Handbook (1994), Stockton Press).
Ein heterogener Enzymimmuntest zum Nachweisen einer Enzymphosphatase könnte in verschiedenen Konfigurationen bereitgestellt werden. Das einfachste Verfahren wäre das Einfangen der Phosphatase unter Verwendung eines Antikörpers, der die Phosphatase spezifisch an eine trennbare Festphase bindet, und das Waschen störender Substanzen von der Festphase vor der Zugabe eines chemilumineszierenden phosphorylierten Substrats. Es könnte ein zweites Verfahren bezüglich eines Proteinanalyten bereitgestellt werden, bei dem ein Sandwichtest unter Verwendung von zwei Antikörpern eingesetzt wird, wobei der erste Antikörper in der vorstehend beschriebenen Weise an eine Festphase gebunden würde, und der zweite Antikörper an das Signalerzeugungssystem, d.h. alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase, usw., gebunden würde. Die Konzentration des Enzymmarkers in dem Test wird dann durch Anwenden des spezifischen chemilumineszierenden Substrats gemessen. Alternativ kann in einem kompetetiven Test bezüglich eines kleinen Analyten ein Chemilumineszenz-erzeugendes Enzym wie z.B. alkalische Phosphatase an das gleiche Hapten zur Verwendung in dem Test als Tracer gekoppelt werden, wobei der endogene Analyt und das Hapten-Enzym-Konjugat um eine begrenzte Anzahl von Festphasenbindungsstellen konkurrieren und ein ähnlicher Signallesemechanismus verwendet wird, wie er vorstehend für den Sandwichtest beschrieben worden ist.
d. Homogener Chemilumineszenztest
Mit der vorliegenden Erfindung können auch Tests eingesetzt werden, die ein homogenes Format nutzen. Homogene Testarchitekturen erfordern keine Trennung der Testkomponenten zur Unterscheidung zwischen negativen und positiven Analytkontrollen und erfordern daher weniger Verarbeitungsschritte als heterogene Tests. Homogene Testtechnologien wie z.B. Emit^® und CEDIATM könnten an einen Chemilumineszenznachweis angepasst werden. Es könnten Emit^®-Tests für kleine Analyten entwickelt werden, bei denen einer klinischen Probe sowohl ein Hapten-Enzym-Konjugat, das dem vorstehend beschriebenen Hapten-Enzym-Konjugat ähnlich ist, als auch ein Analyt-spezifischer Antikörper zugesetzt würden. Die resultierende Chemilumineszenz wäre von dem Grad der Enzymhemmung abhängig, die bei der Bildung des Antikörper-Enzym-Komplexes auftreten würde. Es sind CEDIATM-Tests vorgesehen, bei denen ein Hapten kovalent an das aminoterminale Fragment von rekombinanter β-Galactosidase oder das Enzym-Donor-Fragment (ED-Fragment) gebunden wird. Sowohl das Hapten-ED-Konjugat als auch ein Analyt-spezifischer Antikörper würden dann mit der klinischen Probe in der Gegenwart des carboxyterminalen Fragments von β-Galactosidase, das als Enzymakzeptor (EA) bezeichnet wird, inkubiert werden (W. Engel, P. Khanna, J. Immunol. Methods 150, 99 (1992)). Die Stärke der resultierenden Chemilumineszenz des vermuteten Enzymsubstratkatalyseprodukts, 2-Hydroxy-DMAE, würde von dem Grad der verbleibenden Enzyminaktivierung abhängen.
e. Chemilumineszenz-Nukleinsäuretests
Es wird die Anwendung der chemilumineszierenden Enzym-Substrat-Systeme für die Markierung und/oder den Nachweis von Nukleinsäuren in Nukleinsäuretests vorgeschlagen.
Die hier beschriebene Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, jedoch nicht eingeschränkt.
Beispiel 1 Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-hydroxy-10-methyl-acridinium-9-carboxylattrifluoracetat (2-OH-DMAE-Bn, 4)
4-Methoxyethoxymethoxyiodbenzol
Eine Lösung von 4-Iodphenol (10 g, 45,45 mmol) in 200 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wurde bei 0°C 5 min mit Natriumhydrid (2,36 g, 60 %ige Dispersion, 59,09 mmol) behandelt. Dem resultierenden Gemisch wurde während eines Zeitraums von 5 min langsam periodisch Methoxyethoxymethylchlorid (8,3 ml, 72,73 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 min bei 0°C unter Stickstoff gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 500 ml Ether aufgenommen, mit 5 %iger Natriumhydroxidlösung (4 × 200 ml), Wasser (4 × 200 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung (1 × 200 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Verdampfung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab 14,1 g eines öligen Produkts. DC (Silicagel, Ether): Rf 0,5.
N-(4-Methoxyethoxymethoxy)phenylisatin
Eine Lösung von Isatin (4,0 g, 27,2 mmol) in 200 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid wurde bei Raumtemperatur 0,5 Stunden mit Natriumhydrid (1,036 g, 60 %ige Dispersion, 32,64 mmol) behandelt, worauf 4-Methoxyethoxymethoxyiodbenzol (12,57 g, 40,8 mmol) und Kupfer(I)-iodid (10,34 g, 54,4 mol) zugesetzt wurden. Das resultierende Gemisch wurde 17 Stunden unter Stickstoff bei 160°C gerührt. Es wurde auf Raumtemperatur gekühlt und mit 400 ml Chloroform verdünnt. Das resultierende Gemisch wurde zur Entfernung der anorganischen Materialien filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft, wobei eine rohes Gemisch erhalten wurde, das N-(4-Methoxyethoxymethoxy)phenylisatin als Hauptprodukt enthielt. DC (Silicagel, Ether): Rf 0,8.
2- Methoxyethoxymethoxyacridin-9-carbonsäure
Das vorstehend genannte rohe 4-Methoxyethoxymethoxyphenylisatin wurde ohne Reinigung in 120 ml einer 10 %igen Kaliumhydroxidlösung suspendiert. Die Suspension wurde 5 Stunden bei 150°C unter Rückfluss gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch zur Entfernung der orangen Verunreinigungen filtriert. Das Filtrat wurde in einem Eis-Wasser-Bad mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 angesäuert. Der resultierende gelbe Niederschlag wurde gesammelt und mit Wasser (4 × 50 ml) gewaschen und luftgetrocknet. Das getrocknete Material wurde weiter mit Ether (6 × 50 ml) gewaschen, wobei 6,7 g des gewünschten Produkts erhalten wurden. DC (Silicagel, 30 % Methanol/Chloroform): Rf 0,5.
(2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-methoxyethoxymethoxyacridin-9-carboxylat
Eine Suspension von 2-Methoxyethoxymethoxyacridin-9-carbonsäure (3,6 g, 11 mmol) in 150 ml wasserfreiem Pyridin wurde 5 min bei 0°C mit p-Toluolsulfonylchlorid (4,183 g, 22 mmol) behandelt, wobei eine homogene braune Lösung gebildet wurde. Dann wurde Benzyl-3,5-dimethyl-4-hydroxybenzoat (2,818 g, 11 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde auf einer in Hexan gepackten Silica-Flashchromatographiesäule getrennt. Es wurde mit 50 % Ether/Hexan (1 Liter) und dann mit 70 % Ether/Hexan (3 Liter) eluiert. Die Produktfraktion wurde aus dem 70 % Ether/Hexan-Eluat erhalten. Das Verdampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck ergab 3,74 g des gewünschten Produkts. DC (Silicagel, Ether): Rf 0,8.
(2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-hydroxy-10-methyl-acridinium-9-carboxylattrifluoracetat
Eine hellgelbe Lösung von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-methoxyethoxymethoxyacridin-9-carboxylat (400 mg, 0,708 mmol) in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid wurde 14 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur unter Stickstoff mit Methyltrifluormethansulfonat (0,4 ml, 3,54 mmol) behandelt. Das resultierende Gemisch wurde mit wasserfreiem Ether (20 ml) behandelt. Der Niederschlag wurde gesammelt und mit Ether (4 × 20 ml) gewaschen, wobei 325 mg des Rohprodukts erhalten wurden. MS (ESI): m/z 492,6 (M⁺).
¹H-NMR (300 MHz, MeOD-d₄/CDCl₃): δ 2,52 (6H, s), 5,01 (3H, s), 5,42 (2H, s), 7,37–7,51 (5H, m), 7,81 (1H, d, J = 2,6 Hz), 7,97 (2H, s), 8,10 (1H, t, J = 7,0 Hz), 8,16 Hz (1H, dd, J₁ = 8,0 Hz, J₂ = 2,6 Hz), 8,42 (1H, t, J = 7,0 Hz), 8,60 (1H, d, J = 8,8 Hz) und 8,73 (2H, zwei überlappende Dubletts, J etwa 8,0 Hz). Das Produkt (25 mg) wurde auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 250 × 30 mm, ODS, 10 μm) mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert: 40 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 20 ml/min, bei 260 nm überwacht. Das gewünschte Produkt bei einer Retentionszeit von etwa 30 min wurde gesammelt und aus Methylenchlorid/Ether kristallisiert, wobei 17 mg reines 4 erhalten wurden. Beispiel 2 Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-phosphoryloxy-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluoracetat (2-Phos-DMAE-Bn, 3)
A^– = CF₃CO₂ ^–, nachdem die Verbindung aus
einer CF₃CO₂H-enthaltenden mobilen HPLC-Phase zurückgewonnen worden ist
Eine Lösung von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-hydroxy-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (50 mg, 0,102 mmol) in Pyridin (0,5 ml) wurde auf 0°C gekühlt und dann während eines Zeitraums von 3 min tropfenweise einer vorgekühlten Lösung von Phosphoroxychlorid (57 μl, 6 Äquiv.) in 0,5 ml Pyridin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min unter Stickstoff bei 0°C gerührt. Die Reaktion wurde mit 400 μl 0,5 N NaOH gequencht, worauf weitere 200 μl 1 N NaOH zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde mit 1 ml Wasser verdünnt und dann filtriert. Der resultierende gelbe Feststoff wurde in einem Gemisch aus DMF und Wasser gelöst und auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 250 × 30 mm, ODS, 10 μm) getrennt, wobei mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert wurde: 30 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 20 ml/min, bei 260 nm überwacht. Es wurden 20 mg des gewünschten Produkts (3) bei einer Retentionszeit von 32 min erhalten. MS (MALDI-TOF): m/z 573 (M + 1). Beispiel 3 Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-2-hydroxy-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluoracetat (2-OH-DMAE, 2)
A^– = CF₃CO₂ ^– , nachdem die Verbindung aus
einer CF₃CO₂H-enthaltenden mobilen HPLC-Phase zurückgewonnen worden ist
Eine Lösung von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-hydroxy-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (100 mg) in 4 ml 30 %igem Bromwasserstoff in Essigsäure wurde 1 Stunde unter Stickstoff bei 55°C gerührt und dann mit 10 ml wasserfreiem Ether behandelt. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und mit Ether (4 × 10 ml) gewaschen, wobei 80 mg (4-Carboxyl-2,6-dimethyl)phenyl-2-hydroxy-10-methylacridin-ium-9-carboxylatbromid erhalten wurden. MS (ESI): m/z 402,7 (M⁺). ¹H-NMR (300 MHz, CD₃CN/MeOD-d₄): δ 2,52 (6H, s), 4,95 (3H, s), 7,78 (1H, d, J = 2,7 Hz), 7,76 (2H, s), 8,10 (1H, t, J = 7,0 Hz), 8,13 (1H, dd, J₁ = 9,9 Hz, J₃₌₂ 2,7 Hz), 8,40 (1H, dt, J₁ = 2,7 Hz, J₂ = 8,0 Hz), 8,62 (1H, d, J = 8,0 Hz), 8,77 (1H, d, J = 9,2 Hz) und 8,78 (1H, d, J = 9,9 Hz). Die weitere Reinigung des vorstehend genannten Produkts (68 mg) wurde mittels präparativer HPLC (YMC, 250 × 30 mm, ODS, 10 μm) durchgeführt, wobei mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert wurde: 10 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 20 ml/min, bei 260 nm überwacht. Es wurden 46 mg des gewünschten Produkts (2) bei einer Retentionszeit von etwa 27 min erhalten.
Beispiel 4 Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-10-methyl-2-phosphoryloxyacridinium-9-carboxylatbromid (2-Phos-DMAE, 1)
Ein Gemisch von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-10-methyl-2-phosphoryloxy-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluoracetat (3, 37 mg) und 2,5 ml 30 %iger Bromwasserstoff in Essigsäure wurde 1,5 Stunden bei 50°C unter Stickstoff gerührt. Das resultierende Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Ether behandelt, wobei ein gelber Niederschlag gebildet wurde. Der Niederschlag wurde mit Hilfe einer kleinen Menge Triethylamin in einem DMF/Wasser-Gemisch gelöst. Das Gemisch wurde auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 250 × 30 mm, ODS, 10 μm) getrennt, wobei mittels eines Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert wurde: 10 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 20 ml/min, bei 260 nm überwacht. Die Fraktion bei einer Retentionszeit von etwa 17 min wurde gesammelt und zur Trockne lyophilisiert, wobei 5,3 mg reines 1 erhalten wurden. MS (DALTI-TOF): m/z 482,818 (M + 1).
Beispiel 5 Synthese von Phenyl-2-hydroxy-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (2-OH-AE, 6)
Phenyl-2-methoxyethoxymethoxyacridin-9-carboxylat
Einer Lösung von 2-Methoxyethoxymethoxyacridin-9-carbonsäure (101 mg, 0,308 mmol) in 5 ml wasserfreiem Pyridin wurde p-Toluolsulfonylchlorid (117 mg, 0,616 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde 5 min bei 0°C und zusätzliche 10 min bei Raumtemperatur gerührt, bevor 29 mg (0,038 mmol) Phenol zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in einem Gemisch aus Methanol und Ethylacetat suspendiert und filtriert. Das resultierende Filtrat wurde auf ein kleines Volumen eingeengt und auf 4 präparativen Silicagelplatten (20 × 20 cm × 2 mm dick) getrennt, die mit Hexan/Ether (2:1) entwickelt wurden. Die Hauptproduktbande wurde gesammelt und mit dem gleichen Lösungsmittelsystem eluiert. Die Entfernung der Lösungsmittel ergab 27 mg des reinen Produkts. DC (Silicagel, Hexan/Ether 2:1): Rf 0,9.
Phenyl-2-hydroxy-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat
Eine Lösung von Phenyl-2-methoxyethoxymethoxyacridin-9-carboxylat (25 mg, 0,062 mmol) in 1,5 ml wasserfreiem Methylenchlorid wurde mit Methyltrifluormethansulfonat (38 μl, 0,336 mmol) unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur und unter Stickstoff behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit weiteren 0,5 ml Methylenchlorid verdünnt und dann mit wasserfreiem Ether (4 ml) behandelt. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und mit Ether gewaschen, wobei 19 mg 6 erhalten wurden. MS (ESI): m/z 330 (M⁺). Beispiel 6 Synthese von Phenyl-10-methyl-2-phosphoryloxyacridinium-9-carboxylattrifluoracetat (2-Phos-AE, 5)
A^– = CF₃CO₂ ^–, nachdem die Verbindung aus
einer CF₃CO₂H-enthaltenden mobilen HPLC-Phase zurückgewonnen worden ist
Eine Lösung von Phenyl-2-hydroxy-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (19 mg, 0,040 mmol) in Pyridin (0,3 ml) wurde auf 0°C gekühlt und dann langsam einer vorgekühlten Lösung von Phosphoroxychlorid (22 μl, 0,24 mmol) in 0,3 ml Pyridin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei 0°C unter Stickstoff gerührt und mit 500 μl 5 %igem Ammoniumhydroxid 10 min gequencht. Die Lösung wurde dann mit 1 ml Wasser verdünnt und mit 1 N HCl neutralisiert. Das Gemisch wurde auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 300 × 20 mm, ODS, 10 μm) getrennt, wobei mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert wurde: 10 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 20 ml/min, bei 260 nm überwacht. Es wurden 8 mg des gewünschten Produkts (5) bei einer Retentionszeit von 18 min erhalten. MS (ESI): m/z 410 (M⁺).
Beispiel 7 Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-2-phosphoryloxy-10-sulfobutylacridinium-9-carboxylat (2-Phos-NSB-DMAE, 7)
(2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-hydroxyacridin-9-carboxylat
Eine Lösung von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-methoxyethoxymethoxyacridin-9-carboxylat (960 mg, 1,7 mmol) in Methylenchlorid (5 ml) wurde mit Trifluoressigsäu re (5 ml) bei Raumtemperatur für 19 Stunden behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Stickstoffstrom zur Trockne geblasen und der Rückstand wurde in Ether suspendiert. Das Produkt wurde gesammelt und weiter mit Ether (2 × 10 ml) gewaschen, wobei 610 mg erhalten wurden. MS (MALTI-TOF): m/z 479 (M + 1).
(2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-dimethylphosphoryloxyacridin-9-carboxylat
Einer Lösung von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-hydroxyacridin-9-carboxylat (50 mg, 0,105 mmol) in Pyridin (2 ml) bei 0°C unter Stickstoff wurde Natriumhydrid (5 mg, 0,208 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, bevor Dimethoxychlorphosphat (56 μl, 0,519 mmol) zugesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 3 Stunden gerührt. Das Produkt wurde auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 250 × 30 mm, ODS, 10 μm) isoliert. Die Säule wurde mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert: 40 bis 80 % B während 40 min, Flussrate 20 ml/min, bei 260 nm überwacht. Die Fraktion bei einer Retentionszeit von etwa 52 min wurde gesammelt und zur Trockne lyophilisiert, wobei 45 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden. MS (MALTI-TOF): m/z 587 (M + 1).
(2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-dimethylphosphoryloxy-10-sulfobutylacridinium-9-carboxylat
Ein Gemisch von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-dimethylphosphoryloxyacridin-9-carboxylat (45 mg, 0,0768 mmol) und 1,4 Butansulton (1 ml, 9,78 mmol) wurde 6 Stunden unter Stickstoff bei 150°C gerührt. Der resultierende dicke Gummi wurde in einem Gemisch von Acetonitril/Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 250 × 30 mm, ODS, 10 μm) getrennt. Die Säule wurde mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert: 40 bis 80 % B während 40 min, Flussrate 20 ml/min, bei 260 nm überwacht. Die Fraktion bei einer Retentionszeit von etwa 21 min wurde gesammelt und zur Trockne lyophilisiert, wobei 1 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden. MS (MALTI-TOF): m/z 723 (M + 1).
(2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-2-phosphoryloxy-10-sulfobutylacridinium-9-carboxylat
Eine Lösung von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-dimethylphosphoryloxy-10-sulfobutylacridinium-9-carboxylat (1 mg, 0,00140 mmol) in Chloroform (0,5 ml) wurde mit Bortribromid (4 μl, 0,0423 mmol) behandelt. Die Lösung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Gemisch wurde mit einem Stickstoffstrom zur Trockne geblasen und dann in einem Gemisch von Acetonitril und Wasser gelöst. Das gewünschte Produkt wurde mit einer halbpräparativen HPLC-Säule (Phenomenex, 300 × 7,8 mm, ODS, 10 μm) isoliert. Die Säule wurde mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert: 10 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 2,5 ml/min, bei 260 nm überwacht. Die Fraktion bei einer Retentionszeit von etwa 17 min wurde gesammelt und zur Trockne lyophilisiert, wobei 0,1 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden. MS (MALTI-TOF): m/z 605 (M + 1).
Beispiel 8 Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-2-hydroxy-10-sulfobutylacridinium-9-carboxylat (2-OH-NSB-DMAE, 8)
N-(4-Methoxyphenyl)isatin
Eine Lösung von Isatin (2,5 g, 0,017 mmol) in wasserfreiem DMF (50 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre auf 0°C gekühlt und mit Natriumhydrid (0,5 g, 1,2 Äquivalente) behandelt. Es bildete sich eine violette Lösung, die 30 min bei 0°C gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmt wurde. 4-Bromanisol (2,13 ml, 1 Äquivalent) wurde zugesetzt, worauf Kupferiodid (6,46 g, 2 Äquivalente) zugesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 7 Stunden in einem Ölbad bei 145°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit einem gleichen Volumen Ethylacetat verdünnt. Diese Suspension wurde filtriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. DC (1:4, Ethylacetat:Hexane) zeigte eine sehr saubere Reaktion; Rf (Produkt) = 0,5. Das Rohmaterial wurde als solches für die nächste Reaktion verwendet.
2-Methoxyacridin-9-carbonsäure
Das rohe N-(4-Methoxyphenyl)isatin aus der vorstehenden Reaktion wurde in 10 %igem wässrigen Kaliumhydroxid (150 ml) suspendiert und unter einer Stickstoffatmosphäre unter Rückfluss gehalten. Nach 4 Stunden wurde der Rückfluss gestoppt und das Reaktionsgemisch wurde noch im heißen Zustand filtriert. Das Filtrat wurde mit Wasser (etwa 150 ml) und Eis verdünnt. Diese Lösung wurde dann mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Es trat ein gelber Niederschlag auf, der durch Filtration gesammelt wurde. Der Niederschlag wurde dann mit kaltem Wasser und Ether gespült und dann luftgetrocknet. Der getrocknete Rückstand wurde mit Hilfe von Methanol in einen Rundkolben überführt und die partielle Lösung wurde zur Trockne eingedampft. Der resultierende Rückstand wurde zweimal aus Toluol zur Trockne eingedampft. Es wurden 1,15 g eines gelb-braunen Pulvers gewonnen. Ein DC (1:4, Methanol:Chloroform) zeigte eine saubere Reaktion; Rf (Produkt) = 0,14. Dieses Material wurde als solches für die nächste Reaktion verwendet.
(2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-methoxyacridin-9-carboxylat
2-Methoxyacridin-9-carbonsäure (0,8 g, 0,0032 mmol) in wasserfreiem Pyridin (50 ml) wurde in einem Eisbad unter einer Stickstoffatmosphäre gekühlt und mit p-Toluolsulfonylchlorid und 4-Benzyloxycarbonyl-2,6-dimethylphenol (0,81 g, 0,0032 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 24 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Chloroform (10 ml) gelöst. Das Produkt wurde durch Flashchromatographie unter Verwendung von 5 % Ethylacetat, 25 % Chloroform, 70 % Hexane gereinigt. Die Verdampfung der Flashfraktionen, die das Produkt enthielten, ergab 0,84 g eines leuchtend gelben Feststoffs. MS (MALDI-TOF): m/z MS 492,8 (M + 1).
(2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-methoxy-10-sulfobutylacridinium-9-carboxylat
Ein Gemisch von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-methoxyacridin-9-carboxylat (200 mg, 0,407 mmol) in 2 ml 1,4-Butansulton wurde 19 Stunden unter Stickstoff bei 150°C gerührt. Der resultierende dicke Gummi wurde in einem Mischlösungsmittel aus Acetonitril/Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 250 × 30 mm, ODS, 10 μm) getrennt. Die Säule wurde mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert: 30 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 20 ml/min, bei 260 nm überwacht. Die Fraktion bei einer Retentionszeit von etwa 37 min wurde gesammelt und zur Trockne lyophilisiert, wobei 58,5 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden. MS (MALTI-TOF): m/z 629 (M + 1).
(2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-2-hydroxy-10-sulfobutylacridinium-9-carboxylat
Eine Lösung von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-methoxy-10-sulfobutylacridinium-9-carboxylat (50 mg, 0,080 mmol) in Chloroform (4 ml) wurde mit Bortribromid (50 μl, 0,529 mmol) behandelt und 3 Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Stickstoffstrom zur Trockne geblasen und dann in einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser gelöst. Das gewünschte Produkt wurde auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 250 × 30 mm Innendurchmesser, ODS, 10 μm) isoliert. Die Säule wurde mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert: 10 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 20 ml/min, bei 260 nm überwacht. Die Fraktion bei einer Retentionszeit von etwa 26 min wurde gesammelt und zur Trockne lyophilisiert, wobei 18 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden. MS (MALTI-TOF): m/z 525 (M + 1). Diese Verbindung wurde unter Verwendung einer weiteren präparativen HPLC-Säule (YMC, 300 × 20 mm Innendurchmesser, ODS, 10 μm) weiter gereinigt. Die Säule wurde mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert: 10 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 16 ml/min, bei 260 nm überwacht. Es wurden 4 mg des reinen Produkts erhalten. MS (MALTI-TOF): m/z 525 (M + 1).
Beispiel 9 Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-2-hydroxy-7-methoxy-10-methylacridinium-9-carboxylat (2-OH-7-MeO-DMAE, 10) und (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-2-phosphoryloxy-7-methoxy-10-methylacridinium-9-carboxylat (2-Phos-7-MeO-DMAE, 9)
Synthese von 4-Benzyloxybrombenzol
4-Bromphenol (2 g, 0,0116 mol) in Aceton (40 ml) wurde mit Kaliumcarbonat (1,91 g, 1,2 Äquivalente) und Benzylbromid (1,44 ml, 1,05 Äquivalente) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff unter Rückfluss gehalten. Nach 5 bis 6 Stunden Rückfluss wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gekühlt und mit einem gleichen Volumen Ethylacetat verdünnt. Dieses Gemisch wurde weiter mit Wasser verdünnt und die organische Schicht wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, wobei ein weißes lockeres Pulver erhalten wurde. Ausbeute = 2,36 g (73 %).
Synthese von N-(4'-Benzyloxy)phenyl-5-methoxyisatin
5-Methoxyisatin (1,5 g, 0,847 mmol) in wasserfreiem DMF (50 ml) wurde in einem Eisbad unter Stickstoff gekühlt und mit Natriumhydrid (0,25 g, 1,2 Äquivalente) behandelt. Nach 15 bis 20 min im Eis wurde eine Lösung von 4-Benzyloxybrombenzol (2,36 g) in DMF (etwa 3 ml) zusammen mit Cul (3,23 g, 2 Äquivalente) zugesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden unter Stickstoff in einem Ölbad bei 140°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat suspendiert und durch Flashchromatographie unter Verwendung von 35 % Ethylacetat in Hexan gereinigt. Das Eindampfen der Flashfraktionen ergab das alkylierte Isatin als orange-braunen Feststoff. Ausbeute = 1 g (32 %).
Synthese von 2-Benzyloxy-7-methoxyacridin-9-carbonsäure
Das N-alkylierte Isatin aus der vorstehenden Reaktion (1 g) wurde in 10 %igem Kaliumhydroxid (100 ml) suspendiert und 4 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann im noch heißen Zustand filtriert und das Filtrat wurde in Eis gekühlt. Dieses Reaktionsgemisch wurde vorsichtig mit einem Gemisch aus Eis und konzentrierter HCl angesäuert, bis ein dicker gelber Niederschlag ausfiel. Der Niederschlag wurde etwa 15 min stehen gelassen und dann durch Filtration gesammelt. Nach dem Spülen mit Ether wurde das Produkt sorgfältig luftgetrocknet. Ausbeute = 0,75 g (75 %).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-benzyloxy-7-methoxyacridin-9-carboxylat
2-Benzyloxy-7-methoxyacridin-9-carbonsäure (0,36 g, 0,001 mol) in wasserfreiem Pyridin (30 ml) wurde in einem Eisbad unter Stickstoff gekühlt und mit p-Toluolsulfonylchlorid (0,39 g, 2 Äquivalente) und dann mit 4-Carbobenzyloxy-2,6-dimethylphenol (0,3 g, 1,2 Äquivalente) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und unter Stickstoff 16 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Chloroform (etwa 60 ml) gelöst. Die Chloroformlösung wurde mit 3 %igem wässrigen Ammoniumchlorid gewaschen. Sie wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde mittels präparativer DC unter Verwendung von 70 % Hexan, 27 % Chloroform, 3 % Methanol gereinigt und als gelber Feststoff isoliert. Ausbeute = 0,31 g (50 %). MALDI-TOF-MS 599,02 gemessen (597,67 berechnet).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-2-benzyloxy-7-methoxy-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat
Der vorstehende Acridinester (0,31 g, 0,52 mmol) wurde in Dichlormethan (5 ml) gelöst und mit Methyltrifluormethansulfonat (0,575 ml, 10 Äquivalente) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde Ether (150 ml) zugesetzt und das ausgefallene Produkt wurde mittels Filtration gesammelt und luftgetrocknet. Ausbeute = 0,23 g. MALDI-TOF-MS 613,33 gemessen (612,7 berechnet).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-2-hydroxy-7-methoxy-10-methylacridinium-9-carboxylat (10)
Der vorstehende Acridiniumester (0,124 g) wurde in einem Gemisch aus Methylsulfid und 30 % HBr/AcOH (1:1, 4 ml) gerührt. Nach 4 Stunden wurde Ether zugesetzt, um das Produkt auszufällen, das mittels Filtration gesammelt und luftgetrocknet wurde. Dieses Produkt wurde in Methanol gelöst und mittels analytischer HPLC unter Verwendung einer 3,9 × 300 mm C18-Säule und einem 30 min-Gradienten von 10 bis 100 % Acetonitril/Wasser, in denen jeweils 0,05 % TFA enthalten war, bei einer Flussrate von 1 ml/min und UV-Detektion bei 260 nm analysiert. Es wurde gefunden, dass das Produkt bei 15 min eluierte, während das Ausgangsmaterial bei 24 min eluierte. Etwa 60 % des Rohmaterials wurden mittels präparativer HPLC gereinigt und die HPLC-Fraktionen wurden zur Trockne lyophilisiert. Ausbeute = 42 mg (80 %). MALDI-TOF-MS 432,87 gemessen (432,45 berechnet).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-2-phosphoryloxy-7-methoxy-10-methylacridinium-9-carboxylat (9)
Roher, von der Schutzgruppe befreiter Acridiniumester aus der vorstehenden Reaktion (80 mg) wurde in Pyridin (25 ml) gelöst und mit Phosphoroxychlorid (3 × 0,75 μl, etwa 15 Äquivalente) bei 0°C unter Stickstoff behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunden gerührt und dann mit Wasser (3 ml) gequencht und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf ein kleines Volumen konzentriert. Eine HPLC-Analyse unter den gleichen Bedingungen, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, jedoch mit einem 40 min-Gradienten von 10 bis 60 % Acetonitril/Wasser (jeweils mit 0,05 % TFA) zeigte ein Produkt, das bei 20 min eluierte, wobei das Ausgangsmaterial bei 24 min eluierte. Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC isoliert und die HPLC-Fraktionen wurden zur Trockne lyophilisiert. Ausbeute = 3 mg gelbes Pulver. MALDI-TOF-MS 513,00 gemessen (513,26 berechnet).
Beispiel 10 Synthese von 2-OH-Spiroacridan (12) und 2-Phos-Spiroacridan (11)
N-(4'-Benzyloxy)phenylisatin
Einer Lösung von Isatin (4 g, 27,2 mmol) in DMF (50 ml) wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur NaH (871 mg, 34,5 mmol) zugesetzt. Die Farbe des Reaktionsgemischs änderte sich von orange nach violett. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, bevor 4-Benzyloxyphenylbromid (10,21 g, 38,8 mmol) und CuI (10,34 g, 54,4 mmol) zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden unter Stickstoff bei 160°C in einem Ölbad unter Rückfluss gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch in Chloroform (400 ml) gegossen und filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, wobei das gewünschte Produkt als brauner Gummi erhalten wurde. Es wurde ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet.
2-Benzyloxyacridin-9-carbonsäure
Das vorstehend genannte Gemisch wurde 20 Stunden bei 130°C in 10 % KOH/H₂O (220 ml) unter Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde im noch warmen Zustand filtriert und das Filtrat wurde auf 0°C gekühlt, bevor es mit konzentrierter HCl auf pH 3 angesäuert wurde. Der gelbe Niederschlag wurde filtriert und der Filterkuchen wurde mit Wasser (4 × 200 ml) gewaschen. Der Filterkuchen wurde 20 Stunden bei 50°C unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurden 1,8 g des gewünschten Produkts erhalten. Das Produkt wurde mittels MS (MALTI-TOF): m/z 331 (M + 1) bestätigt.
(2'-Benzyloxy)phenyl-2-benzyloxyacridin-9-carboxylat
Eine Lösung von 2-Benzyloxyacridin-9-carbonsäure (306 mg, 0,93 mmol) in Pyridin (30 ml) wurde mit p-Toluolsulfonylchlorid (276 mg, 1,45 mmol) bei Raumtemperatur unter Stickstoff 30 min behandelt, bevor 2-(Benzyloxy)phenol zugesetzt wurde. Die Lösung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Es wurde auf einer Flashsäule gereinigt, die mit einem Gradientenlösungsmittelsystem aus Ethylacetat/Hexan ausgehend von 10 % eluiert wurde. Das Produkt eluierte bei 20 %. Die gewünschten Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, wobei 226 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden. Das Produkt wurde durch MS (MALTI-TOF): m/z 513 (M + 1) bestätigt.
(2'-Benzyloxy)phenyl-2-benzyloxy-10-methylacridin-9-carboxylattrifluormethansulfonat
Eine Lösung von (2'-Benzyloxy)phenyl-2-benzyloxyacridin-9-carboxylat (109 mg, 0,213 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wurde 20 Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur mit Methyltrifluormethansulfonat (260 μl, 2,30 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Stickstoff zur Trockne geblasen, worauf es in Ether suspendiert wurde. Der gelbe Niederschlag wurde mit mehr Ether (4 × 10 ml) gewaschen. Der resultierende Feststoff wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 71,35 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden.
2-OH-Spiroacridan (12)
Ein Gemisch aus (2'-Benzyloxy)phenyl-2-benzyloxy-10-methylacridin-9-carboxylat (30 mg, 0,043 mmol) in 30 % HBr/AcOH (400 μl) wurde 1 Stunde bei 45°C gerührt. Es wurde mit Stickstoff zur Trockne geblasen, worauf in Ether suspendiert wurde. Der Feststoff wurde filtriert, mit mehr Ether gewaschen (4 × 10 ml) und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 17 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden. Ein Teil dieses Produkts (11 mg) wurde auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 250 × 20 mm Innendurchmesser, ODS, 10 μm) gereinigt. Die Säule wurde mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert: 10 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 16 ml/min, bei 260 nm überwacht. Die Fraktion bei einer Retentionszeit von etwa 25 min wurde gesammelt und zur Trockne lyophilisiert, wobei 7,3 mg reines Produkt erhalten wurden. Das Produkt wurde mittels MS (MALTI-TOF): m/z 347 (M + 1) bestätigt.
2-Phos-Spiroacridan (11)
Einer Lösung des vorstehend beschriebenen 2-OH-Spiroacridans (5,66 mg, 0,016 mmol) in Pyridin (0,5 ml) wurde bei 0°C unter Stickstoff POCl₃ (7,65 μl, 0,082 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde bei dieser Temperatur 1 Stunde gerührt und dann mit Wasser (0,5 ml) gequencht und weitere 15 min gerührt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, worauf auf einer präparativen HPLC-Säule (YMC, 250 × 20 mm Innendurchmesser, ODS, 10 μm) gereinigt wurde. Die Säule wurde mittels Gradienten durch Mischen von 0,05 % TFA/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,05 % TFA/Acetonitril (Lösungsmittel B) in der folgenden Weise eluiert: 10 bis 60 % B während 40 min, Flussrate 16 ml/min, bei 260 nm überwacht. Die Fraktion bei einer Retentionszeit von etwa 18 min wurde gesammelt und zur Trockne lyophilisiert, wobei 2,3 mg reines Produkt erhalten wurden. Das Produkt wurde mittels MS (MALTI-TOF): m/z 427 (M + 1) bestätigt.
Beispiel 11 Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-3-(β-phosphoryloxy-4'-hydroxystyryl)-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (3-Enol-Phos-DMAE, 13) und des entsprechenden Acridans (3-Enol-Phos-acridan, 15)
Synthese von N-[-3-(1,3-dioxolyl)phenyl]isatin
Isatin (3,2 g, 0,0218 mol) wurde in wasserfreiem DMF (75 ml) gelöst und in einem Eisbad unter einer Stickstoffatmosphäre gekühlt. Dieser kalten Lösung wurde Natriumhydrid (0,575 g, 0,0239 mol) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden bei 0°C gerührt. Diese Lösung wurde dann mit 2-(3-Bromphenyl)-1,3-dioxolan (5 g, 1 Äquivalent) und dann mit CuI (8,3 g, 2 Äquivalente) behandelt. Die resultierende Suspension wurde 16 Stunden in einem Ölbad unter Stickstoff bei 130 bis 140°C erhitzt. Sie wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und mit einem gleichen Volumen Chloroform verdünnt. Diese Suspension wurde filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Es wurde ein viskoses braunes Öl gewonnen, das in Xylolen (150 ml) suspendiert und zur Trockne eingedampft wurde. Der Rückstand wurde als solcher für die folgende Reaktion verwendet. Ein DC (5 Methanol in Chloroform) zeigte eine saubere Umwandlung; Rf (Produkt) = 0,86.
Synthese von 2-(9'-Carboxyacridin-3'-yl)-1,3-dioxolan
Rohes N-[-3-(1,3-dioxolyl)phenyl]isatin von der vorstehenden Reaktion wurde in 10 %igem KOH (150 ml) suspendiert und die resultierende Suspension wurde 4,5 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde mit Eis verdünnt und mit 20 bis 30 %iger HCl angesäuert, bis es schwach sauer war. Es fiel ein gelber Niederschlag aus, der mittels Filtration gesammelt und luftgetrocknet wurde. Als Ausbeute wurden etwa 5 g eines gelben klebrigen Feststoffs erhalten, der als solcher für die folgende Reaktion verwendet wurde.
Synthese von Acridin-9-carbonsäure-3-carboxaldehyd
Rohes 2-(9'-Carboxyacridin-3'-yl)-1,3-dioxolan (etwa 5 g) wurde in 80 %iger wässriger Essigsäure (100 ml) suspendiert. Diese Suspension wurde 16 Stunden unter Stickstoff bei 80°C erhitzt. Bei der Reaktion trat ein gelber Niederschlag auf. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und mit wasserfreiem Ether (etwa 500 ml) verdünnt. Der ausgefallene Feststoff wurde mittels Filtration gesammelt, mit Ether gewaschen und luftgetrocknet. Der Feststoff wurde dann in einen Rundkolben überführt, in Toluol (50 ml) suspendiert und zur Trockne eingedampft. Dieses Verfahren wurde noch einmal wiederholt. Es wurde ein leuchtend gelber Feststoff gewonnen. Ausbeute = 1,72 g (31 % Gesamtausbeute). MALDI-TOF-MS 252,3 gemessen (251,24 berechnet).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenylacridin-9-carboxylat-3-carboxaldehyd
Acridin-9-carbonsäure-3-carboxaldehyd (0,3 g, 0,0012 mol) in Pyridin (50 ml) wurde in einem Eisbad unter Stickstoff gekühlt und mit p-Toluolsulfonylchlorid (0,456 g, 0,00239 mol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 min bei 0°C gerührt und dann wurde 2,6-Dimethyl-4-benzyloxycarbonylphenol (0,306 g, 1 Äquivalent) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 48 Stunden unter Stickstoff gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst, das dann mit wässrigem Hydrogencarbonat und wässrigem Ammoniumchlorid gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Der rohe Rückstand (0,6 g) wurde mittels präparativer DC auf Silica unter Verwendung von 10 % Ethylacetat in Chloroform gereinigt; Rf (Produkt) = 0,6. Ausbeute = 0,24 g (41 %), leuchtend gelber Feststoff. MALDI-TOF-MS 490,78 gemessen (489,53 berechnet). ¹H-NMR (CDCl₃): δ ppm 2,46 (s, 6H), 5,40 (s, 2H), 7,37–7,50 (m, 5H), 7,78 (m, 1H), 7,94 (m, 3H), 8,12 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 8,39 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 8,45 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 8,51 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 8,79 (s, 1H), 10,31 (s, 1H).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-3[1'-hydroxy-2'-(4'-benzyloxyphenyl)ethyl]acridin-9-carboxylat
Benzyloxybenzylchlorid (1 g, 0,0043 mol) in wasserfreiem THF (20 ml) wurde mit Mg-Spänen (etwa 0,5 g) behandelt, die in kleinere Stücke gebrochen worden sind, um frische Oberflächen freizulegen. Beim leichten Erwärmen startete die Grignard-Reaktion und es wurde mit kaltem Wasser gekühlt, bis die Reaktion vollständig war. Die Lösung des Grignard-Reagenzes wurde dann in einem Trockeneis-Aceton-Bad gekühlt und dann langsam mittels einer Spritze einer Lösung des vorstehenden Aldehyds (0,5 g, 0,001 mol) in THF (10 ml) zugesetzt, die unter Stickstoff in einem Trockeneis-Aceton-Bad sorgfältig gekühlt worden ist. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei –78°C gerührt, wobei am Ende dieses Zeitraums ein DC einen vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials anzeigte. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Ethylacetat (50 ml) verdünnt und die resultierende Lösung wurde in kaltes wässriges Ammoniumchlorid (etwa 2 %, 200 ml) gegossen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der rohe Rückstand wurde mit präparativer DC auf Silica unter Verwendung von 1:4 Ethylacetat in Hexan gereinigt. Das Produkt wurde als gelber Feststoff gewonnen und als solcher für die folgende Reaktion verwendet. Ausbeute = 0,38 g (54 %).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-3-(4'-benzyloxyphenylacetyl)-acridin-9-carboxylat
Der vorstehende Alkohol (0,38 g, 0,55 mmol) in Dichlormethan (30 ml) wurde mit PCC (0,18 g, etwa 5 Äquivalente) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1 Stunde wurden zusätzliche 10 Äquivalente PCC zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat (25 ml) verdünnt und filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde mit präparativer DC auf Silica unter Verwendung von 5 % Ethylacetat in Chloroform gereinigt.
Das Produkt wurde als leuchtend gelber Feststoff gewonnen. Ausbeute = 80 mg (20 %). ¹H-NMR (CDCl₃): δ ppm 2,46 (s, 6H), 4,47 (s, 2H), 5,04 (s, 2H), 5,39 (s, 2H), 6,97 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,26–7,49 (m, 10H), 7,76 (dd, 1H), 7,90 (dd, 1H), 7,95 (s, 2H), 8,23 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 8,39 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 8,45 (d, 1H, J = 6,9 Hz), 8,48 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 9,02 (s, 1H). MALDI-TOF-MS 687,27 gemessen (686,78 berechnet).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-3-(β-dibenzylphosphotriester-4'-benzyloxystyryl)acridin-9-carboxylat
Dibenzylphosphit (0,263 g, 0,001 mol) in wasserfreiem Benzol (4 ml) wurde mit N-Chlorsuccinimid (0,134 g, 1 Äquivalent) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Das vorstehende Acridinesterketon (80 mg, 0,117 mmol) wurde in wasserfreiem THF (5 ml) gelöst und unter Stickstoff in einem Trockeneis-Aceton-Bad auf –78°C gekühlt und Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (0,6 bis 0,7 ml, 1,0 M) wurde tropfenweise mittels einer Spritze zugegeben. Es bildete sich eine violette Lösung, die 20 min in dem Trockeneis-Aceton-Bad gerührt wurde, und dann wurde die Benzollösung von Dibenzylphosphochloridat tropfenweise zugegeben und dann auf Raumtemperatur erwärmt. Nach etwa 15 min wandelte sich das dunkelviolett gefärbte Reaktionsgemisch in eine dunkelgelbe Lösung um, die mit Ethylacetat (25 ml) verdünnt und dann zweimal mit wässrigem Ammoniumchlorid (etwa 2 %) gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde mittels präparativer DC unter Verwendung von 2:3 Ethylacetat in Hexan gereinigt. Ausbeute = 59 mg (53 %), orange-gelber öliger Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃): δ ppm 2,47 (s, 6H), 4,91 (m, 4H), 5,07 s, 2H), 5,39 (s, 2H), 6,76 (s, 1H, Vinyl), 6,97 (d, 2H), 7,15–7,50 (m, 20H), 7,69 (m, 2H), 7,87 (m, 1H), 7,96 (s, 2H), 8,34 (d, 1H), 8,41 (d, 1H), 8,57 (s, 1H). MALDI-TOF-MS 947,11 gemessen (947,01 berechnet).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonyl)phenyl-3-(β-dibenzylphosphotriester-4'-benzyloxystyryl)-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat
Der vorstehende Acridin-Enol-Phosphattriester (59 mg, 0,0624 mmol) wurde in Dichlormethan (5 ml) gelöst und mit Methyltrifluormethansulfonat (71 μl, 10 Äquivalente) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine HPLC-Analyse des Reaktionsgemischs auf einer 3,9 × 300 mm C18-Säule und einem 30 min-Gradienten von 10 bis 100 % Acetonitril/Wasser, in denen jeweils 0,05 % TFA enthalten war, bei einer Flussrate von 1 ml/min und UV-Detektion bei 260 nm zeigte ein Produkt, das bei 19,2 min eluierte (60 % Umwandlung). Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC isoliert und die HPLC-Fraktionen wurden unter vermindertem Druck konzentriert. Der Acridiniumester wurde als violetter Feststoff isoliert. Ausbeute = 29 mg (43 %). MALDI-TOF-MS 962,11 gemessen (962,04 berechnet).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-3-(β-phosphoryloxy-4'-hydroxystyryl)-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (13)
Der vorstehende Tetrabenzyl-geschützte Acridiniumester (12,8 mg, 0,012 mmol) wurde in Methylsulfid (1 ml) gelöst und mit 30 % HBr in Essigsäure behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 4 Stunden wurde Ether (20 ml) zugesetzt und der ausgefallene Feststoff wurde mittels Filtration gesammelt. Das Produkt wurde in Methanol (10 ml) gelöst und mittels analytischer HPLC analysiert (siehe oben), die eine saubere Umwandlung in das Produkt zeigte, das bei etwa 16 min eluierte. Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC isoliert. Die HPLC-Fraktionen wurden durch einen Rotationsverdampfer auf ein kleines Volumen konzentriert und dann zur Trockne lyophilisiert. Ausbeute = 6 mg (71 %). MALDI-TOF-MS 601,34 gemessen (600,54 berechnet).
Synthese von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-3-(β-phosphoryloxy-4'-hydroxystyryl)-10-methylacridan (15)
Roher Tetrabenzyl-geschützter Acridiniumester (etwa 40 mg) wurde in einem Gemisch aus Methanol (14 ml), Aceton (5 ml) und 0,1 M Ammoniumacetat pH 6,9 (1,5 ml) gelöst. Diese Lösung wurde mit Palladiumschwarz (18 mg) behandelt. Die resultierende Suspension wurde unter Verwendung eines Ballons bei Raumtemperatur hydriert. Nach 3 bis 4 Stunden wurde eine hellgrüne Lösung erhalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert und das Filtrat wurde auf ein kleines Volumen konzentriert und die Hälfte des Materials wurde mittels präparativer HPLC unter Verwendung eines 25 min-Gradienten von 30 bis 90 % Methanol in Wasser (die jeweils 0,05 % TFA enthielten) auf einer C18-Säule (30 × 250 mm) und UV-Detektion bei 260 nm gereinigt. Das Produkt eluierte als breiter Peak bei etwa 26,5 min. Die HPLC-Fraktion, die Produkt enthielt, wurde zur Trockne konzentriert, wobei ein violetter Feststoff erhalten wurde. Ausbeute = 8 mg. MALDI-TOF-MS 600,25 gemessen (601,55 berechnet).
Beispiel 12 Enzymatische Umwandlung von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-3-(β-phosphoryloxy-4'-hydroxystyryl)-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (13) in dessen Ketoprodukt [3-(4'-Hydroxybenzyl)carbonyl-DMAE, 14]
Eine 1 mM-DMF-Lösung des Acridinium-3-enol-phosphats (13) wurde mit 150 μl 100 mM Tris pH 9, das auch 1 mM MgCl₂ enthielt, gemischt. Alkalische Phosphatase (5 μl einer 2 mg/ml-Lösung) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Eine HPLC-Analyse unter Verwendung einer 3,9 × 300 mm-C18-Säule und eines 30 min-Gradienten von MeCN in Wasser, die jeweils 0,05 % TFA enthielten, bei einer Flussrate von 1 ml/min und UV-Detektion bei 260 nm zeigte eine vollständige Umwandlung; Rt (Ausgangsmaterial) = 16 min, Rt (Produkt) = 20 min. Das Produkt wurde mit einer halbpräparativen HPLC unter Verwendung einer 7,8 × 300 mm-C18-Säule isoliert. MALDI-TOF-MS des Produkts zeigte, dass es sich dabei tatsächlich um das Ketoprodukt (14) handelte: m/z 521,36 gemessen (520,56 berechnet).
Beispiel 13 Enzymatische Umwandlung von (2',6'-Dimethyl-4'-carboxyl)phenyl-3-(β-phosphoryloxy-4'-hydroxystyryl)-10-methylacridan (3-Enol-Phos-acridan, 15) in dessen Ketoprodukt [3-(4'-Hydroxybenzyl)carbonylacridan, 16]
Eine 20 μl-DMF-Lösung des Acridans (15) (1,7 mM) wurde mit 180 μl 0,15 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol pH 10,3, das auch 1 mM Magnesiumacetat enthielt, vereinigt. Es wurde eine klare blaue Lösung erhalten (0,17 mM Substrat), die dann mit alkalischer Phosphatase (10^–10 mol) behandelt worden ist. Die blaue Farbe wurde sofort entfärbt. Nach einer Stunde zeigte eine HPLC-Analyse unter Verwendung einer C18-Säule (3,9 × 300 mm) und eines 40 min-Gradienten von 10 bis 90 % MeCN/Wasser, die jeweils 0,05 % TFA enthielten, bei einer Flussrate von 1 ml/min und UV-Detektion bei 260 nm eine saubere Umwandlung zu einem später bei 21,3 min eluierenden Produkt (das Ausgangsmaterial eluierte bei 19,3 min). Das Reaktionsgemisch wurde dann mittels FSSS bewertet, um das Lichtemissionsspektrum des Produkts zu bestimmen, das in der 2N gezeigt ist. Das Produkt wurde mittels halbpräparativer HPLC isoliert. MALDI-TOF-MS zeigte, dass es sich dabei tatsächlich um die Acridanketoverbindung (16) handelte: m/z = 521,67 gemessen (521,56 berechnet).
Beispiel 14 Synthese von 4'-Hydroxyphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (4'-OH-AE 18
Synthese von 1,4-Dihydroxybenzolmono-tert-butyldimethylsilylether.
Hydrochinon (0,5 g, 0,0045 mol) in THF (25 bis 30 ml) wurde unter Stickstoff mit Imidazol (0,434 g, 1,5 Äquivalente) und tert-Butyldimethylchlorsilan (0,686 g, 1 Äquivalent) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Bei der Zugabe des Chlorsilans trat sofort ein Niederschlag auf. Nach 3 bis 4 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat verdünnt und mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat (etwa 2 %) und Kochsalzlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde mittels präparativer DC unter Verwendung von 25 % Ethylacetat in Hexanen gereinigt. Das Produkt wurde als Öl erhalten. Ausbeute = 0,5 g (50 %).
Synthese von 4'-tert-Butyldimethylsilyloxyphenylacridin-9-carboxylat
Acridin-9-carbonsäure (0,29 g, 0,0013 mol) in wasserfreiem Pyridin (10 ml) wurde in Eis unter Stickstoff gekühlt und mit p-Toluolsulfonylchlorid (0,595 g, 2 Äquivalente) behandelt. Nach etwa 10 min Rühren in Eis wurde Hydrochinonmono-tert-butyldimethylsilylether (0,29 g) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 16 Stunden unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (50 ml) gelöst und mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat (etwa 2 %) gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde mittels präparativer DC auf Silica unter Verwendung von 25 % Ethylacetat in Hexanen gereinigt. Ausbeute = 0,25 g (45 %). MALDI-TOF-MS 431,61 gemessen (429,58 berechnet).
Synthese von 4'-Hydroxyphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (18) Der vorstehende Acridinester (90,25 g, 0,58 mmol) in Dichlormethan (etwa 10 ml) wurde mit Methyltrifluormethansulfonat (0,66 ml, 10 Äquivalente) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde Ether zugesetzt, um das Produkt auszufällen, das mittels Filtration gesammelt wurde. Es wurde ein gelbes Pulver erhalten. Ausbeute = 0,19 g. MALDI-TOF-MS 330,68 gemessen (330,36 berechnet).
Beispiel 15 Synthese von 4'-Phosphophenyl-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (4'-Phos-AE, 17)
Das vorstehende 4'-Hydroxyphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat (32 mg, 0,069 mmol) wurde in Pyridin (1 ml) gelöst und in einem Eisbad unter Stickstoff gekühlt. Phosphoroxychlorid (45 μl, 5 Äquivalente) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 30 min in Eis gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in eiskaltes Wasser (950 ml) gegossen, das 0,25 ml 5 N NaOH enthielt. Nach kurzem Rühren wurde diese Lösung mit Chloroform und dann Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Lösung wurde dann zur Trockne lyophilisiert. Es wurde ein leuchtend gelber Feststoff erhalten, der mittels HPLC auf einer 3,9 × 300 mm C18-Säule und einem 40 min-Gradienten von 10 bis 90 % Acetonitril/Wasser, die jeweils 0,05 % TFA enthielten, bei einer Flussrate von 1 ml/min und UV-Detektion bei 260 nm analysiert wurde. Das Produkt eluierte bei 12 min, wobei sehr wenig Ausgangsmaterial bei 15 min eluierte. Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt und die HPLC-Fraktion wurde zur Trockne lyophilisiert. Ausbeute = 14 mg gelbes lockeres Pulver. MALDI-TOF-MS 411,13 gemessen (410,33 berechnet).
Beispiel 16
Test mit alkalischer Phosphatase unter Verwendung von 2-Phos-DMAE (1) (45°C, 1 Stunde) Die Substratlösung von 2-Phos-DMAE (1) wurde bei 0,1 mM in 100 mM, pH 9,0 Tris-Puffer, der 1 mM MgCl₂ enthielt, hergestellt. Die Standards der alkalischen Phosphatase, Sigma Kat.-Nr. P-3681, Aktivität 4900 Einheiten (DEA)/mg Protein wurden in Wasser hergestellt. Zwei μl jedes Standards der alkalischen Phosphatase wurden 0,5 Stunden bei 45°C mit 48 μl der Substratlösung mit 2 IL Wasser als Nullkontrolle inkubiert. Die Lösungen wurden dann mit 100 mM, pH 9,0 Tris-Puffer, der 1 mM MgCl₂ enthielt, jeweils 100-fach verdünnt. Jede Verdünnung (25 μl) wurde bei 5 Wiederholungen mit 300 μl 0,25 N NaOH, die 0,5 CTAB enthielt, und sofort danach mit 300 μl 0,5 % H₂O₂ geflasht. Die Lichtabgabe wurde für 2 s auf einem Bayer Diagnostics Magic Lite Analyzer 1 (MLA-1) gemessen, der mit einer R268-PMT und zwei LL650-Langwellen-Durchgangsfiltern (Corion, Chargen-Nr. CFS-002645) ausgestattet war. Das Ergebnis ist in der 10 gezeigt. Die Verdünnungen wurden auch auf einem MLA-1 geflasht, der mit einer R2228P-PMT und zwei LL650-Langwellen-Durchgangsfilter ausgestattet war, und die Einheit wurde in einem kalten Raum (4°C) vorgekühlt. Das Ergebnis ist in der 11 gezeigt.
Beispiel 17
Test mit alkalischer Phosphatase unter Verwendung von 2-Phos-DMAE (1) (45°C, 1 Stunde)
Gemäß dem Beispiel 16 wurde ein Test mit alkalischer Phosphatase durch Zugeben von 5 μl des AP-Standards zu 95 μl der Substratlösung durchgeführt. Die Lösungen wurden 1 Stunde bei 45°C inkubiert und dann mit dem Tris-Puffer 100-fach verdünnt. Die Verdünnung (25 μl) wurde bei 3 Wiederholungen mit 300 μl 0,25 N NaOH, die 0,5 CTAB enthielt, und sofort danach mit 300 μl 0,5 % H₂O₂ geflasht. Die Lichtabgabe wurde für 2 s auf dem MLA-1 gemessen, der mit einer R2228P-PMT und einem LL700-Langwellen-Durchgangsfilter ausgestattet war, und die Einheit wurde in einem kalten Raum (4°C) vorgekühlt. Das Ergebnis ist in der 12 gezeigt.
Beispiel 18
Test mit alkalischer Phosphatase unter Verwendung von 4'-Phosphoryloxyphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat (4'-Phos-AE, 17)
Es wurde eine Behandlung einer Lösung von 4'-Phos-AE (17, 0,1 mM) in 100 mM Tris pH 9, 1 mM MgCl₂ mit variierenden Konzentrationen an alkalischer Phosphatase durchgeführt. Die Reaktionsgemische wurden 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann aufeinander folgend 10⁴-fach mit "Flashpuffer" verdünnt, der 10 mM Phosphat pH 8 mit 150 mM NaCl, 0,1 % BSA und 0,05 % Natriumazid enthielt. Die Chemilumineszenz einer 25 μl-Lösung wurde mit einem Bayer Diagnostics Magic Lite Analyzer (MAL1), der mit einem BG38-Filter ausgestattet war, gemessen. Es wurde eine Messzeit von 0,3 s eingesetzt. Die Bewertung der Chemilumineszenzaktivität der Reaktionen zeigte eine stetige Abnahme der Gesamtchemilumineszenz mit steigenden Enzymkonzentrationen. Folglich wird bei einer Erhöhung der Enzymkonzentration ein größerer Anteil des schnell emittierenden Substrats 4'-Phos-AE in das langsam emittierende Produkt 4'-OH-AE (18) umgewandelt, was zu einer Gesamtabnahme der Lichtabgabe (bei einer kurzen Messzeit) führt. Die Dosis-Reaktion-Kurve wies eine sigmoide Form auf (eine log-log-Auftragung ist in der 13 gezeigt). Alkalische Phosphatase konnte in diesem Test einfach bei 5 × 10^–17 mol (0,1 ml Reaktionsvolumen) nachgewiesen werden.
Beispiel 19
Herstellung eines anti-αTSH-alkalische Phosphatase-Konjugats
Thiolierung von monoklonalem Mäuse-anti-TSH
Monoklonale Mäuse-Antikörper (32 nmol, 4,95 mg) mit einer Bindungsaffinität für die α-Untereinheit von menschlichem Thyroid-stimulierenden Hormon (TSH) wurden mit 2-Iminothiolan (0,32 μmol, 10 Äquivalente) in 0,10 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, 5,0 mM EDTA, pH 8,1 für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur derivatisiert. Das thiolierte anti-αTSH wurde in dem Hohlraumvolumen einer Sephadex^®-G25-Feinsäule (1,5 cm Innendurchmesser × 80 ml) in 0,10 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, 5,0 mM EDTA, pH 7,0 isoliert. Die Ausbeute betrug 4,65 mg Protein (93,4 % Rückgewinnung). Der mittels MALDI-TOF-MS bestimmte Thioleinbau pro anti-αTSH betrug 3,8.
Maleimidaktivierung von alkalischer Phosphatase
Alkalische Phosphatase von Kalbsdarm [EC 3.1.3.1] (39 nmol, 5,50 mg) mit einer spezifischen Aktivität von 3880 pNPP U/mg wurde mit Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (sulfo-SMCC) (89 nmol, 2,3 Äquivalente) in 0,10 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, 5,0 mM EDTA, pH 7,0 für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur derivatisiert. Die Maleimido-alkalische Phosphatase wurde durch retentive Zentrifugalultrafiltration auf einem 30 kD-Molekulargewichtssperrfilter mit mehreren Pufferaustauschzyklen in 0,10 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, 5,0 mM EDTA, pH 7,0 isoliert. Die Ausbeute betrug 4,64 mg Protein (84,4 % Rückgewinnung). Der mit MALDI-TOF-MS bestimmte Maleimideinbau betrug 1,0 Maleimid pro alkalischer Phosphatase.
Konjugation von Maleimido-alkalischer Phosphatase an thioliertes anti-αTSH Maleimido-alkalische Phosphatase (12 nmol, 0,62 Äquivalente) wurde in 0,10 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, 5,0 mM EDTA, pH 7,0 16 Stunden bei 4°C an thioliertes anti-αTSH (19,4 nmol) gekoppelt. Das Konjugat wurde mittels SEC auf einer Sephadex^®-G-200-Säule (1,5 cm Innendurchmesser × 125 ml, 40 bis 120 ☐m) in 0,10 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4 bei Umgebungstemperatur isoliert. Mittels MALDI-TOF wurde eine univalente Konjugation bestätigt.
Beispiel 20
Ein heterogener Immuntest, der den Nutzen von 2-Phos-DMAE (1) als Substrat für den Chemilumineszenznachweis von TSH in menschlichem Serum zeigt
Die Anwendbarkeit von 2-Phos-DMAE als chemilumineszierendes Substrat in einem diagnostischen Test wurde unter Verwendung eines divalenten Sandwich-Enzym-Immuntests (EIA) bewertet, der für die klinische Quantifizierung von TSH in Serum formuliert worden ist. Bei diesem Test sollte das alkalische Phosphatase-anti-αTSH-Konjugat (nachstehend als Tracer bezeichnet) spezifisch an den ausgewählten Analyten, der α-Untereinheit von intaktem menschlichen TSH, das in einer Patientenprobe oder einem TSH-enthaltenden Standard (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA) vorliegt, binden, um einen nicht-kovalent assoziierenden Antikörper-Antigen-Komplex zu bilden. Der Tracer-Analyt-Komplex wird wiederum von einer Magnetkügelchen-Festphase eingefangen, die kovalent an einen zweiten monoklonalen Mäuseantikörper gebunden ist, der eine Bindungsaffinität für die β-Untereinheit von intaktem menschlichen TSH aufweist. Gebundener Tracer wird magnetisch von nichtgebundenem Tracer getrennt und durch enzymatische Hydrolyse des angewandten chemilumineszierenden Substrats quantifiziert. Zur Berechnung der TSH-Konzentration mehrerer Kontrollproben wurden Standardkurvendaten verwendet.
Der Tracer wurde von 1,0 nM in ACS^TM TSH3 Lite Reagent Buffer (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA) zu einer Arbeitskonzentration verdünnt. Der TSH-Test wurde gestartet, wenn 100 μl des Tracers mit 200 μl entweder eines TSH-Standards oder einer Kontrolle gemischt waren. Es wurden 8 TSH-Standards verwendet, die TSH in Konzentrationen von 0,000, 0,120, 0,740, 1,92, 3,86, 8,99, 19,9 und 49,6 μl.U./ml enthielten (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA). Es wurden auch drei Kontrollen getestet. Dabei handelte es sich um die Liganden 1, 2 und 3 von Bayer Diagnostics, die TSH in mittleren Konzentrationen von 0,60, 5,1 bzw. 18,4 μl.U./ml enthielten. Die Gemische wurden zusammen dreimal für 5 s bei der Einstellung Nr. 5 auf einem Mehrfachröhrchen-Vortexer, Modell 4010, von Corning Inc. vortexiert. Datenpunkte wurden dreifach erhalten. Die Testgemische wurden dann 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, worauf jedem Test 225 μl anti-βTSH-MLP-Festphase (etwa 56 μg) zugesetzt wurden. Die Testgemische wurden dreimal in der vorstehend beschriebenen Weise vortexiert und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Festphase wurde durch die dreiminütige Anwendung einer Anordnung von Permanentmagneten in einem Bayer Magic Lite-Testgestell magnetisch getrennt. Der Überstand wurde von der Festphase abdekantiert. Restlicher Überstand wurde durch Aufsaugen für drei Minuten und dann erneut für eine Minute entfernt. Die Festphase wurde mit zwei separaten 1,0 ml-Volumina Wasser gewaschen und in 100 μl einer Substratlösung suspendiert, die 0,10 mM 2-Phos-DMAE (1) in 100 mM Tris, 1,0 mM MgCl₂, pH 9,0 enthielt. Die Enzymreaktion wurde 1 Stunde bei 45°C durchgeführt und durch die Zugabe von 2,0 ml eines Flashpuffers, der 10 mM Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, 0,05 % (w/v) Natriumazid, 0,1 % (w/v) BSA enthielt, durchgeführt. Die Chemilumineszenzreaktion wurde durch die aufeinander folgende Zugabe von jeweils 300 μl des Flashreagenzes 1 (0,25 N Natriumhydroxid, 0,5 % (w/v) N,N,N,N-Hexadecyltrimethylammoniumchlorid als grenzflächenaktives Mittel) und des Flashreagenzes 2 (0,5 (w/v) Wasserstoffperoxid) zu 25 μl des verdünnten Reaktionsgemischs auf einem Bayer Diagnostics Magic Lite Analyzer gestartet, der mit zwei optischen LL-650-Filtern von Corion ausgestattet war. Die Chemilumineszenzdaten wurden als Photonen gesammelt, die von dem Magic Lite Analyzer detektiert worden sind, und als relative Lichteinheiten (RLU's) ausgedrückt.
Berechnungsverfahren für Sandwich-Testparameter
Arithmetische Mittelwerte für RLU's, die sich aus einer spezifischen Analytkonzentration ergeben und die hier als μ dargestellt werden, wurden aus drei Wiederholungen berechnet. Nicht-Tracer-Testreagenzien tragen auch zu einer kleinen, wenn auch manchmal signifikanten Anzahl von RLU's bei. Deshalb wurde eine Kontrollreaktion, die alle Testreagenzien mit Ausnahme des Tracers enthielt, parallel laufen gelassen, um den nicht-Tracer- Reagenzhintergrund zu bestimmen, der hier als n dargestellt ist. Arithmetische RLU-Mittelwerte μ wurden korrigiert, um RLU's darzustellen, die nur von dem Tracer erhalten wurden und die hier als B dargestellt werden, wobei B = μ – n. Wo die Analytkonzentration am höchsten war, wurde der korrigierte arithmetische RLU-Mittelwert für diesen Punkt als Bmax bezeichnet. Eine direkte, jedoch nicht-lineare Beziehung besteht zwischen der Analytkonzentration, die in dem Standard vorliegt, und den detektierten RLU's. Folglich verknüpft die gleiche direkte sigmoide Korrelation auch die Analytkonzentration mit dem resultierenden %B/Bmax und kann in der empirischen linearen Form als
genau ausgedrückt werden, wobei x die Analytkonzentration und y das festgestellte Signal ist, das entweder als %B/Bmax oder als RLU's erzeugt worden ist (Lit. A, B, C).

A. David Rodbard, Ligand Analysis (1981), J. Langon, J. Clapp (Hrsg.), Masson Publishing, Inc., New York, Seiten 45–101.
B. Barry Nix, The Immunoassay Handbook (1994), David Wild (Hrsg.), Stockton Press, Inc., New York, Seiten 117–123.
C. Jeffrey H. Peterman, Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay (1991), J. Butler (Hrsg.), CRC Press, Inc., Boca Raton, Seiten 47–65.

Zusätzlich gibt es vier weitere Parameter, nämlich die Regressionskonstante b, den Regressionskoeffizienten m, die asymptotische unspezifische Bindung (NSB) bei der Dosis (Analytkonzentration) Null y₀ und die asymptotisch-unendliche Grenzreaktion für eine unendlich hohe Dosis y_∞. Die drei letztgenannten Parameter dieser Parameter wurden unter Verwendung der iterativen gewichteten Vierparameter-Logistik-Analysefunktion (4PL-WTD-Analysefunktion) des DOSECALC.EXE Rev.1.73-Programms (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA) berechnet. Der arithmetische Mittelwert der Regressionskonstanten b wurde über den gesamten Bereich der Analytkonzentrationen bestimmt, und zwar durch Berechnen des Dosis-Reaktion-Ausdrucks, der als
umgeformt worden ist.
Unbekannte Analytkonzentrationen wurden dann unter Verwendung der Dosis-Reaktion-Gleichung berechnet, die als
umgeformt worden ist.
TSH-Enzymimmuntest-Standardkurve unter Verwendung von 2-Phos-DMAE (1) als chemilumineszierendes Substrat
TSH-Testdaten wurden als Chemilumineszenz gegen die TSH-Konzentration aufgetragen, was in der 14 gezeigt ist. Der Dynamikbereich erstreckte sich über zwei Größenordnungen der Analytkonzentration, was in diesem Fall für die genaue Bestimmung der TSH-Konzentration für die drei Kontrollserumstandards zufrieden stellend war.
Testgenauigkeit bei der Bestimmung der TSH-Konzentration
SH-Konzentrationen wurden für die Bayer Diagnostics-Liganden 1, 2 und 3 unter Verwendung der gewichteten 4PL-Funktion berechnet. Die berechneten Werte stimmten ziemlich genau mit den bekannten Werten überein, die in der entsprechenden Produktliteratur angegeben sind. Daher weist das chemilumineszierende Substrat, 2-Phos-DMAE, einen nachweislichen Nutzen zur genauen Bestimmung der TSH-Konzentration in menschlichem Serum auf.

Claims

Chemilumineszierendes Substrat einer Hydrolase mit der Struktur Lumi-M-Pworin: Lumi ein chemilumineszierender Teil ist, wobei der chemilumineszierende Teil Lumi eine Acridiniumverbindung mit der folgenden Struktur ist:
worin: P eine Gruppe ist, welche in wäßrigem Medium thermisch und hydrolytisch stabil ist und durch eine Hydrolase unter Bildung von Lumi-M leicht entfernbar ist, M Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel ist, R₁ ein 0 bis 20 Heteroatome enthaltendes Alkyl, Alkenyl, Alkinyl oder Aralkyl ist, C₁, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇ und C₈ Peri-Stellungen des Acridiniumkerns sind, die entweder nicht substituiert oder substituiert sind, und wenn diese substituiert sind, können die Substituenten R_2a, R_2b, R_2c, R_3a, R_3b, R_3c und R_3d gleich oder unterschiedlich sein, wobei die Substituenten aus der Gruppe, bestehend aus -R, substituiertem oder nicht substituiertem Aryl, Halogeniden, Nitro, Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, -CO₂H, -C(O)OR, Cyano (-CN), -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)NHR, Ethylenglykol und Polyethylenglykol, ausgewählt sind, wobei R aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl und Aralkyl, welche von 0 bis 20 Heteroatome aufweisen, ausgewählt ist, A^– ein Gegenion für die Elektroneutralität des quartären Stickstoffs der Acridiniumverbindung ist, wobei A^– nicht vorhanden ist, wenn der Substituent R₁ eine stark ionisierbare Gruppe enthält, welche ein Anion bilden kann und sich mit dem quartären Ammonium-Kationenteil paaren kann, X Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ist, so daß, wenn X Sauerstoff ist, Z weggelassen ist und Y eine substituiere oder nicht substituierte Arylgruppe oder -N=CR₉R₁₀ ist, worin R₉ und R₁₀ gleich oder unterschiedlich sein können und aus Wasserstoff, substituierten oder nicht substituierten Aryl-, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Halogenid-, Alkoxy- und Aryloxy-Gruppen, ausgewählt sind, wenn X Schwefel ist, Z weggelassen ist und Y eine substituierte oder nicht substituierte Arylgruppe ist, wenn X Stickstoff ist, Z -SO₂-Y' ist, wobei Y' wie oben Y definiert ist, Y wie oben definiert ist oder ein verzweigtkettiges oder geradkettiges 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthaltendes Alkyl, halogeniert oder nicht-halogeniert, oder ein substituiertes Aryl oder heterocyclisches Ringsystem sein kann, und Y und Y' gleich oder unterschiedlich sein können.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 1, wobei R₁ Methyl, Sulfoalkyl oder ein Alkyl ist, welche eine oder mehrere hydrophile Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sulfonat, Sulfat, -CO₂H, Phosphonat, Ethylenglykol, Polyethylenglykol, quartärem Ammonium (-N⁺R₃) und jedwede eine oder mehrere dieser hydrophilen Gruppen enthaltende Gruppe, enthält.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 1 oder 2, wobei R_2c, R_3a oder R_3c M-P ist, wobei die C₂-Peri-Stellung substituiert oder nicht substituiert ist.
Chemilumineszierendes Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei jedwede zweier benachbarter Substituenten an den Acridiniumkern-Peri-Stellungen verknüpft sein können, um zusätzliche carbocyclische und heterocyclische Ringe, die an den angeknüpften Acridiniumkern kondensiert sind, zu bilden, wobei die Ringe aus der Gruppe, bestehend aus:
ausgewählt sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Gegenionen A aus der Gruppe, bestehend aus CH₃SO₄ ^– , FSO₃ ^– , CF₃SO₃ ^–, C₄F₉SO₃ ^–, CH₃C₆H₄SO₃ ^–, Halogenid, CF₃COO^–, CH₃COO^– und NO₃ ^–, ausgewählt sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei X Sauerstoff oder Schwefel ist, Z weggelassen ist, Y eine polysubstituierte Arylgruppe der folgenden Formel ist:
worin R₄ und R₈ gleich oder unterschiedlich sein können und Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxyl- (-OR), Alkylthiol- (-SR) oder substituierte Aminogruppen sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 6, wobei R₅, R₆ und R₇ gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, -R, substituiertes oder nicht substituiertes Aryl, Halogenide, Amino, -NHR, -NR₂, quartäres Ammonium (-N⁺R₃), Hydroxyl, Nitro, Nitroso, Sulfonat, Sulfat, Cyano (-CN), Phosphonat, CO₂H, -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)NHR, -NHC(O)R, Ethylenglykol oder Polyethylenglykol sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 6 oder 7, wobei R₄ und R₈ kurzkettige, 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylgruppen, vorzugsweise Methylgruppen, sind, oder mindestens eine von R₄ und R₈ wie definiert ist, während die andere ein Wasserstoff oder ein Halogenid ist.
Chemilumineszierendes Substrat nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei jedwede zweier benachbarter Gruppen von R₄ bis R₈ einen oder mehrere zusätzliche kondensierte aromatische Kohlenwasserstoffringe oder heteroaromatische Ringe mit oder ohne Substituenten bilden können, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Benzol, Naphthalin, Pyridin, Thiophen, Furan und Pyrrol.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 6, wobei R₅, R₆ und R₇ gleich oder unterschiedlich sein können und hydrophile Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sulfonat, Sulfat, -CO₂H, Phosphonat, Ethylenglykol, Polyethylenglykol, quartärem Ammonium (-N⁺R₃) und jedwede eine oder mehrere dieser hydrophilen Gruppen enthaltende Gruppe, umfassen.
Chemilumineszierendes Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei nach der Entfernung von P durch eine Hydrolase, M in dem Reaktionsmedium ionisierbar wird, um eine negative Ladung zu tragen, und somit stark Elektronen an das Acridiniumringsystem liefert.
Chemilumineszierendes Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 11 mit der folgenden Struktur:
worin B entweder ein zweiwertiges Kation oder zwei einwertige Kationen ist, wobei die einwertigen Kationen gleich oder unterschiedlich sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 12, wobei, wenn B ein einwertiges Kation ist, jedes B aus der Gruppe, bestehend aus Natrium, Wasserstoff, Kalium, Ammonium, und ausgewählt ist, oder, wenn B ein zweiwertiges Kation ist, B Calcium und Magnesium ist.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 13 mit der folgenden Struktur:
Chemilumineszierendes Substrat einer Hydrolase mit der Struktur Lumi-M-P, wobei Lumi ein chemilumineszierender Teil ist und wobei der chemilumineszierende Teil Lumi eine Acridanverbindung mit der folgenden Struktur ist:
worin R₁, R_2a-c, R_3a-d, M, P, X, Y und Z wie in Anspruch 1 definiert sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 15, wobei M-P O-PO₃Na₂ ist.
Chemilumineszierendes Substrat einer Hydrolase mit der Struktur Lumi-M-P, wobei Lumi ein chemilumineszierender Teil ist und wobei der chemilumineszierende Teil Lumi eine Spiroacridanverbindung mit der folgenden Struktur ist:
worin R₁, R_2a-c, R_3a-d, M und P wie in Anspruch 1 definiert sind, X₁ und X₂ gleich oder unterschiedlich sind und aus der Gruppe, bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff ausgewählt sind, und wenn entweder eine oder beide von X₁ und X₂ Sauerstoff oder Schwefel sind, das entsprechende Z₁ oder Z₂ oder beide Z₁ und Z₂ weggelassen sind, wenn eine oder beide von X₁ oder X₂ Stickstoff sind, das entsprechende Z₁ oder Z₂ oder beide Z₁ und Z₂ Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder -SO₂-Y' sind, und G eine Gruppe ist, welche X₁ und X₂ verbindet, um einen Ring mit 5 bis 10 Gliedern zu bilden.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 17 mit der folgenden Struktur:
worin R₁₁ eine einzelne oder mehrfache Substitution ist, wobei jeder Substituent davon aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, -R, substituiertem oder nicht substituiertem Aryl (ArR oder Ar), Halogeniden, Nitro, Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, -CO₂H, -C(O)OR, Cyano (-CN), -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)NHR, Ethylenglykol oder Polyethylenglykol, ausgewählt ist.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 18 mit der folgenden Struktur:
Chemilumineszierendes Substrat einer Hydrolase mit der Struktur Lumi-M-P, wobei Lumi ein chemilumineszierender Teil ist und wobei der chemilumineszente Teil Lumi eine Acridiniumverbindung mit der folgenden Struktur ist:
worin R₁, R_2a-c, R_3a-d, A^–, M, P, X, Y und Z wie in Anspruch 1 definiert sind, R₁₂, R₁₃, R₁₄ und R₁₅ gleich oder unterschiedlich sind und aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, -R, Hydroxyl, Amino, Halogeniden, Nitro, Nitroso, Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, -CO₂H, Cyano (-CN), -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R und -C(O)NHR, ausgewählt sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 20, wobei jedwede zweier benachbarter Gruppen von R₁₂ bis R₁₅ einen oder mehrere zusätzliche kondensierte aromatische Kohlenwasserstoffringe oder heteroaromatische Ringe mit oder ohne Substitutionen bilden können, wobei die Ringe aus der Gruppe, bestehend aus Benzol, Naphthalin, Pyridin, Thiophen, Furan und Pyrrol, ausgewählt sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 20 mit der folgenden Struktur:
Chemilumineszierendes Substrat einer Hydrolase mit der Struktur Lumi-M-P, wobei Lumi ein chemilumineszierender Teil ist und wobei der chemilumines zierende Teil Lumi eine Acridiniumverbindung mit der folgenden Struktur ist:
worin R₁, R_2a-c, R_3a-d, R₅, R₇, A^–, M und P wie in Anspruch 1 definiert sind, R_2d wie für R_2a-c und R_3a-d definiert ist, R₁₆ und R₁₇ gleich oder unterschiedlich sind und aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Alkyl mit niedrigem Molekulargewicht und Halogeniden, ausgewählt sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 23, worin R₁₆ und R₁₇ unterschiedlich sind und eine davon Wasserstoff ist.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 23, wobei sowohl R₁₆ als auch R₁₇ Wasserstoff sind.
Chemilumineszierendes Substrat nach Anspruch 23 mit der folgenden Struktur: