DE3856358T3 - Für Tests verwendbare chemilumineszierende Ester, Thioester und Amide - Google Patents

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Russell C. Minnetonka Hart
Harlen Waverly Koelling
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Tests und Immuntests unter Verwendung chemilumineszierender Konjugate als Marker.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gewisse Verbindungen geben bei der Behandlung mit Peroxid oder molekularem Sauerstoff bei hohem pH-Wert Licht ab oder "chemilumineszieren". Licht wird durch den Zerfall eines chemischen Zwischenproduktes erzeugt, das durch den Angriff von Peroxid oder eines molekularen Sauerstoffs an einem sp2- oder sp3-hybridisierten Kohlenstoffzentrum gebildet wird. Das angegriffene Kohlenstoffzentrum kann Teil einer Kette oder eines Ringes oder Ringsystems sein.
  • Die Eigenschaften und das Verhalten einiger dieser chemilumineszierenden Verbindungen sind ausführlicher in McCapra "Chemiluminescence of Organic Compounds", in Progress in Organic Chemistry, Band 8, Carruthers und Sutherland Hrsg. (Wiley & Sons 1973) beschrieben, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird.
  • Chemilumineszierende Verbindung werden seit vielen Jahren in Prototyptests, einschließlich Immuntests, als Marker verwendet. Beispiele für eine derartige Verwendung finden sich in US-Patent 4,383,031, 4,380,580, 4,226,993 und vielen anderen. Im allgemeinen jedoch wurden diese Verbindungen wegen ihrer mangelnden Stabilität in wäßrigen Lösungen nicht in kommerziellen Tests verwendet. Dieser Mangel an Stabilität ist besonders für die Unterklasse chemilumineszierender Verbindungen wichtig, welche bestimmte Ester, Thioester und Amide umfaßt. Diese Verbindungen reagieren entsprechend der allgemeinen Reaktion, die in der Folge für Ester dargestellt ist:
    Figure 00010001
    worin A = ein Arylring oder -ringsystem und B = ein heterocyclischer Ring oder ein heterocyclisches Ringsystem. Die Verbindungen dieser Unterklasse neigen zu einem "Verlust ihrer Chemilumineszenz" aufgrund der vorzeitigen Hydrolyse der Ester-, Thioester- oder Amidbindung. Sobald die Bindung hydrolysiert ist, erzeugt die Verbindung nicht mehr länger effizient eine Chemilumineszenz. Wenn die Verbindung als Marker in einem Test verwendet wird, verliert der Marker allmählich seine chemilumineszierende Fähigkeit, wodurch unzuverlässige Testergebnisse erhalten werden.
  • Es ist daher wünschenswert, chemilumineszierende Ester-, Thioester- und Amidverbindungen zur Verwendung in Tests zu schaffen, die für eine Hydrolyse nicht so anfällig sind und somit eine erhöhte Stabilität in wäßriger Lösung aufweisen.
  • Ein Artikel von Weeks et al. [Clin. Chem., 29/8, 1474–1479, (1983)] bespricht die Synthese eines chemilumineszierenden Acridiniumesterderivates, von dem behauptet wird, daß es zur kovalenten Verbindung, unter milden Bedingungen, mit Antikörpern imstande ist, um stabile, immunreaktionsfähige Derivate hoher spezifischer Chemilumineszenzaktivität zu erhalten.
  • EP-A-0263657 offenbart verschiedene polysubstituierte Arylacridiniumester. Von diesen wird behauptet, daß sie hochstabile Marker zur Verwendung in einem chemilumineszierenden Test liefern.
  • EP-A-0309230 offenbart diagnostische Testverfahren und Marker für den Nachweis eines Mediums, wenn der Analyt ein Glied eines spezifischen Bindungspaares ist. In einem besonderen System werden mit chemilumineszierendem Acridiniumester markierte Sonden in einem Hybridisierungstest für den Nachweis von Ziel-Polynucleotidsequenzen verwendet.
  • EP-A-0257541 offenbart bestimmte chemilumineszierende Acridiniumderivate und deren Verwendung in lumineszierenden Immunenzymtests.
  • EP-A-0273115 offenbart verschiedene Acridiniumsulfonylamide und Isomere davon. Es sind auch Verfahren zur Synthese offenbart. Es wird behauptet, daß das N-Sulfonyl-9-acridiniumcarboxamid und Isomer in chemilumineszierenden Tests zweckdienlich sind, wenn sie an Antigene, Haptene, Antikörper oder Nucleinsäuren konjugiert sind.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden spezifische Bindungstests offenbart, die eine chemilumineszierende Verbindung, d.h., Komponente, verwendet, die eine erhöhte Stabilität in wäßriger Lösung aufweist. Die chemilumineszierende Komponente ist ein Ester, Thioester oder Amid, wobei die Ester-, Thioester- oder Amidbindung zwischen (1) einem heterocyclischen Ring oder Ringsystem, das ein Kohlenstoffatom enthält, an dem die Bindung angelagert ist, wobei das Heteroatom in dem heterocyclischen Ring oder Ringsystem sich in einem Oxidationszustand befindet, der dieses Kohlenstoffatom für einen Angriff durch Peroxid oder molekularen Sauerstoff anfällig macht, um ein Zwischenprodukt zu bilden, das zur Erzeugung von Chemilumineszenz zerfällt, und (2) einem Arylring oder -ringsystem besteht. Der Arylring oder das Arylringsystem enthält mindestens einen substituierten, sechsgliedrigen Ring. Der substituierte, sechsgliedrige Ring hat zwei oder mehr Substituentengruppen, wobei mindestens zwei der zwei oder mehr Substituentengruppen die Hydrolyse dieser Bindung sterisch behindern. Eine oder mehr der Substituentengruppen, welche die Hydrolyse dieser Bindung sterisch behindern, können eine elektronenanziehende Gruppe sein. Der substituierte, sechsgliedrige Ring kann eine oder mehr zusätzliche Substituentengruppen zusätzlich zu den Substituentengruppen enthalten, welche die Hydrolyse der Bindungen sterisch behindern. Solche zusätzlichen Substituentengruppen können auch eine elektronenanziehende Gruppe sein.
  • Das Kohlenstoffatom in dem heterocyclischen Ring oder Ringsystem, an das die Bindung angelagert ist, kann auch einen sekundären Substituenten der Formel RnX- aufweisen, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, N, S und C, wobei R irgendeine Gruppe ist und wobei n eine derartige Zahl ist, daß X die richtige Valenz hat. Andere chemilumineszierende Komponenten sind offenbart, die durch einen heterocyclischen Ring oder ein derartiges Ringsystem und einen sekundären Substituenten der Formel RnX- gekennzeichnet sind, mit der Ester-, Thioester- oder Amidbindung zwischen dem heterocyclischen Ring oder Ringsystem und einer Abgangsgruppe. Die offenbarten chemilumineszierenden Komponenten können auch Substituenten an Peripositionen innerhalb des heterocyclischen Ringes oder Ringsystems enthalten.
  • Die chemilumineszierenden Verbindungen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, sind in den Ansprüchen 1 bis 38 offenbart. Sie können an spezifische Bindungspartner gebunden sein, um Konjugate zu bilden, wie in den Ansprüchen 39 und 40 beschrieben ist.
  • Ebenso gemäß der vorliegenden Erfindung sind Zusammensetzungen und Testkits, welche die obengenannten Verbindungen/Konjugate umfassen, wie in den Ansprüchen 41 und 42 beschrieben ist. Spezifische Bindungstests sind auch enthalten. Diese sind in den Ansprüchen 43 bis 69 beschrieben.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN UND ALTERNATIVEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
  • Die chemilumineszierenden Komponenten der vorliegenden Erfindung haben eine der beiden folgenden schematischen Formeln:
    Figure 00040001
  • In den schematischen Formeln enthält die mit punktierten Linien dargestellte, mit "L" bezeichnete Box, die Ester-, Thioester- oder Amid-"Bindung", die zwischen zwei substituierten Ringen oder Ringsystemen vorhanden ist, die durch den mit "Q" bezeichneten Kreis, und der mit vollen Linien dargesellten mit "R3" bezeichneten Box, wiedergegeben sind. Ob die Bindung L ein Ester, Thioester oder Amid ist, wird durch R4 bestimmt, der -O-, -S- beziehungsweise -N(SO2CF3)- ist. Vorzugsweise ist die Bindung eine Esterbindung.
  • Q ist ein heterocyclischer Ring oder ein derartiges Ringsystem, an welches die Ester-, Thioester- oder Amidbindung L an einem Kohlenstoffatom innerhalb des Ringes oder Ringsystems angelagert ist, das (1) entweder sp2- oder sp3- hybridisiert ist und (2) für einen Angriff durch Peroxid oder molekularen Sauerstoff anfällig ist, um ein Zwischenprodukt zu bilden, das zur Erzeugung von Chemilumineszenz zerfällt. Ob das Kohlenstoffatom für einen solchen Angriff anfällig gemacht wird, wird durch den Oxidationszustand des Heteroatoms innerhalb des heterocyclischen Ringes oder Ringsystems bestimmt. Wenn das Kohlenstoffatom, an welches die Bindung angelagert ist, sp2-hybridisiert ist, muß sich das Heteroatom in einem positiven Oxidationszustand befinden (d.h., eine positive Ladung aufweisen; wie zum Beispiel durch N-Alkylierung oder N-Oxidation erhalten wird). Wenn das Kohlenstoffatom, an welches die Bindung angelagert ist, sp3-hybridisiert ist, muß sich das Heteroatom in einem neutralen Oxidationszustand befinden (d.h., ungeladen sein). Wenn das Heteroatom Stickstoff ist, können angemessene Oxidationszustände nur erreicht werden, wenn der Stickstoff mit einer Alkylgruppe (einschließlich einer funktionalisierten Gruppe), einer Arylgruppe (einschließlich einer funktionalisierten Gruppe), -O- (wenn sich der Stickstoff in einem positiven Oxidationszustand befindet) oder -OH (wenn sich der Stickstoff in einem neutralen Oxidationszustand befindet) substituiert ist. Wenn sich das Heteroatom in diesen "geeigneten" Oxidationszuständen befindet, ist das Kohlenstoffatom für einen Angriff durch 1,2,4-Triazolkation, ein Isooxazolkation, ein Isothioazolkation, ein 1,2-Azolkation, ein Imidazolkation, ein Benzimidazolkation, Chinolinium, Isochinolinium, Chinolizinium, ein cyclisches substituiertes Chinolinium, Pyridinium, Pyrimidinium, Pyridazinium, Pyrazinium, Phenanthridinium und Chinoxalinium. Ringe oder Ringsysteme, in welchen das Heteroatom sich in einem neutralen Oxidationszustand befindet, enthalten die reduzierten Formen der obengenannten. Diese Ringe oder Ringsysteme werden aus den folgenden Ringen oder Ringsystemen abgeleitet:
    Figure 00060001
  • Chinolinserie
    Figure 00070001
    Chinolin
  • Figure 00070002
    Isochinolin
  • Figure 00070003
    Chinoliziniumkationen
  • Figure 00070004
    Cyclische C3-, C4-, C5-substituierte Chinoline
  • Figure 00080001
  • Der heterocyclische Ring oder das derartige Ringsystem kann frei von wahlweisen Substitutionen sein, die in den schematischen Formeln nicht dargestellt sein. Als Alternative kann der heterocyclische Ring oder das derartige Ringsystem wahlweise an einer beliebigen Position, einschließlich des Heteroatoms, mit Gruppen substituiert sein, die in den schematischen Formeln nicht dargestellt sind. Solche Ringe und Ringsysteme, ob sie nun wahlweise substituiert oder frei von solchen wahlweisen Substitutionen sind, werden hierin unter dem Begriff "heterocyclischer Ring oder heterocyclisches Ringsystem" verstanden.
  • Mögliche wahlweise Substitutionen können funktionell oder nichtfunktionell sein. Funktionelle, wahlweise Substitutionen enthalten jene für den Zweck der Herstellung von Peri-Wechselwirkungen um die Bindung L, der Erhöhung der Löslichkeit der Komponente, der Erhöhung der chemilumineszierenden Wirksamkeit der Komponente und vorzugsweise der Anlagerung der Komponente an Protein und anderes Material. Gruppen, die zum Anlagern der Komponente an Protein oder anderes Material zweckdienlich sind, enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, wahlweise funktionalisierte Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Alkylamin-, Oxoalkyl-, Thioalkyl- oder Alkyloxocarbonylketten (verzweigt oder unverzweigt) oder wahlweise funktionalisierte Arylgruppen. Die Arylgruppen können mit dem heterocyclischen Ring oder Ringsystem durch eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Alkylamin-, Oxoalkyl-, Thioalkyl- oder Alkyloxocarbonylkette verbunden sein. Andere Ketten, zusätzlich zu den aufgezählten, sind in der Wissenschaft allgemein bekannt. Wahlweise Funktionalitäten enthalten, ohne Einschränkung, jede der folgenden:
    -CO2R, wobei R = ein Wasserstoff, Alkyl oder Aryl,
    Figure 00090001
    wobei R = ein Rest eines funktionellen Alkohols
    -SO2Cl
    -NCS
    Figure 00090002
    Figure 00100001
    -N(CH3)(CH2)mCl, wobei m größer oder gleich 1 ist
    -N3 und andere photolabile Funktionalitäten
    -NH2.
    oder Ionen, Zucker, Polyamine und Polyoxyverbindungen (z.B., Polyoxyethylen, Polyoxybutylen usw.). Andere Ketten, Gruppen und Funktionalitäten, die zur Anlagerung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung an Protein zweckdienlich sind, sind in Ji, "Bifunctional Reagents," Meth. Enzymology 91:580 (1983) besprochen, das hierin durch Bezugnahme eingebracht wird. Verfahren zur Bindung solcher Anlagerungsgruppen an Protein und andere Materialien verwenden sowohl die kovalente Bindung als auch schwache chemische Kräfte und sind in der Wissenschaft allgemein bekannt.
  • Perisubstituenten, die Peri-Wechselwirkungen verursachen können, enthalten jede Gruppe, die eine sterische Behinderung in bezug auf den Kohlenstoff hervorrufen kann, an den die Ester-, Thioester- oder Amidbindung angelagert ist, und/oder in bezug auf den Kohlenstoff innerhalb der Ester-, Thioester- oder Amidbindung. Bevorzugte Perisubstituenten enthalten kurze Alkylgruppen (z.B., Methyl, Ethyl) und Arylgruppen (z.B., Phenyl). Die Perisubstituenten, falls vorhanden, sind an Kohlenstoffatomen innerhalb des heterocyclischen Ringes oder Ringsystems angeordnet, die sich "neben" dem Kohlenstoff befinden, an den die Ester-, Thioester- oder Amidbindung angelagert ist. Komponenten können mehr als einen Perisubstituenten enthalten. Zum Beispiel können Perisubstituenten in den folgenden Positionen angeordnet sein:
    • (a) in Acridinien und Acridanen: an C1 und C8;
    • (b) in Phenanthridinien und reduzierten Phenanthridinien: an C7; und
    • (c) in Chinolinien und reduzierten Chinolinien: an C3.
  • Der Arylring oder das Arylringsystem, der/das durch R3 dargestellt ist, enthält mindestens einen substituierten sechsgliedrigen Ring. Die Ester-, Thioester- oder Amidbindung ist direkt an einen solchen sechsgliedrigen Ring angelagert. R3 kann Phenyl, Naphthalen und Anthracen enthalten, ist aber nicht darauf beschränkt, die folgende Strukturen aufweisen:
    Figure 00110001
    Naphthalen
    Figure 00110002
    Anthracen
    Figure 00110003
    Phenyl
  • R3 kann an jeder Position substituiert sein, einschließlich der Substitutionen für R1, R2 und R2', die in der Folge beschrieben sind, ist aber nicht auf diese beschränkt. Eine Substitution, einschließlich R1, R2 und R2', kann auch zur Anlagerung der Komponente an Protein oder anderes Material verwendet werden. Geeignete Gruppen für einen solchen Zweck sind oben besprochen.
  • R2 und R2' sind voluminöse Gruppe, die sich an R3 befinden, so daß sie die Hydrolyse der Bindung L zwischen R3 und dem heterocyclischen Ring oder Ringsystem Q behindern. Wenn R3 ein Phenylring ist, bei welchem die Esterbindung an der Position 1 angelagert ist, sind R2 und R2' vorzugsweise an der 2- und 6-(ortho-) Position angeordnet. R2 und R2' können identisch sein oder sich voneinander unterscheiden und können jeweils enthalten:
    ein Alkyl oder eine wahlweise funktionalisierte Alkylgruppe
    ein Aryl oder eine wahlweise funktionalisierte Arylgruppe
    -OR, wobei R = Alkyl oder Aryl
    -NR2, wobei R = Alkyl oder Aryl
    -NR3 +, wobei R = Alkyl oder Aryl
    -COO–
    -COOH
    -COOR, wobei R = Alkyl oder Aryl
    -COR, wobei R = Alkyl oder Aryl
    -(CF2)nCF3, wobei n = 0 bis 10
    -CN
    -NH3 +
    -NO2
    -N(CH3)3 +
    -SR, wobei R = Alkyl oder Aryl
    -SR2 +, wobei R = Alkyl oder Aryl
    -SO2R, wobei R = Alkyl oder Aryl
    ein Halogen.
  • Die erforderliche sterische Behinderung kann auch durch andere Ringe in einem Mehrfachring R3 bereitgestellt werden, die sich "neben" dem sechsgliedrigen Ring befinden, an den die Esterbindung angelagert ist. Wenn zum Beispiel R3 = Naphthalen und eine Esterbindung an der 1-Position angelagert ist, könnte R2 eine Methylgruppe an der 2-Position sein und R2' ist der "benachbarte" Ring, der Kohlenstoffe 7–10 enthält. In solchen Fällen wird hierin der benachbarte Ring als eine Substitution (an dem sechsgliedrigen Ring innerhalb von R3) angesehen, welche die Hydrolyse der Bindung sterisch behindert.
  • R1 kann jede elektronenziehende Gruppe an R3 sein, wird aber vorzugsweise ausgewählt aus -NO2, -SO2Cl, -Br, -N(CH3)3 + und -H. Wie in dieser Beschreibung und den beiliegenden Ansprüchen verwendet wird, soll "elektronenziehende Gruppe" jede Gruppe bezeichnen, die einen Sigmap-Wert größer oder gleich 0,0 hat. Tabellen von Sigmap-Werten für verschiedene Gruppen finden sich in Hansch et al., J. Med. Chem. 16(11):1209–1213 (1977) und Hansch und Leo, "Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology", Kapitel 6, Seite 49–52 (John Wiley & Sons, New York, 1979), die beide hierin durch Bezugnahme eingeführt werden.
  • In einigen Komponenten sind R1 und eines oder beide von R2 und R2' elektronenziehende Gruppen (die identisch oder voneinander unterschiedlich sein können). Wenn mehr als eine Gruppe von R1, R2 und R2' elektronenziehende Gruppen sind, wird bevorzugt, daß der additive Sigmap-Wert nur für jene Gruppen, die elektronenziehende Gruppen sind (das heißt, ausschließlich jener Gruppen mit Sigmap < 0,0) kleiner oder gleich etwa 1,0 ist. Einige Komponenten mit einem additiven Sigmap-Wert größer 1,0 sind instabil.
  • Die Komponenten der vorliegenden Erfindung können auch durch Substitutionen an R3 an Protein und anderes Material angelagert werden. Einige elektronenziehende Gruppen können als Mittel zur Anlagerung verwendet werden. Von den bevorzugten elektronenziehenden Gruppen kann -SO2Cl zur Anlagerung einer Komponente an Protein oder anderes Material verwendet werden. Als Alternative kann auch jede der oben angeführten Gruppen zur Anlagerung an den heterocyclischen Ring oder das heterocyclische Ringsystem Q verwendet werden, wenn sie als Substitutionen an R3 angelagert werden können. Verfahren zur Bindung solcher Anlagerungsgruppen an Protein und andere Materialien verwenden sowohl die kovalente Bindung als auch schwache chemische Kräfte und sind in der Wissenschaft allgemein bekannt.
  • In der oben angeführten, schematischen Formel II ist Z eine sekundäre Substituentengruppe, die an das Kohlenstoffatom angelagert ist, an welches die Ester-, Thioester- oder Amidbindung angelagert ist, wenn ein solches Kohlenstoffatom sp3-hybridisiert ist. Z kann, ohne aber darauf beschränkt zu sein, folgendes enthalten:
    -H
    ein Halogen
    -CN
    -OR
    -NR2
    -NA3 +
    -SR
    -SR2 +
    -S2R
    -NRCO2R
    -NHNR2
    -NRNR2
    -NHOR
    -ONR2
    -CR(CN)2
    -CR(COR)2
    -CR2NO2
    -C≡COR.
  • Im allgemeinen kann Z; zusätzlich zu einem Wasserstoff und einem Halogen, jede nucleophile Gruppe der allgemeinen Formel RnX sein, wobei X = O, N, S oder C (mit angemessenen Änderungen in n zur Anpassung an Valenzänderungen in X), und wobei R = jeder Substituent (vorzugsweise Alkyl, Aryl, eine Aminosäure oder ein Zucker, wahlweise substituiert) und wobei mehrere R-Gruppen wahlweise cyclische Strukturen bilden können (z.B., in den Z-Gruppen:
    Figure 00140001
  • Rn und RnX können auch ein Arzneimittel oder ein Steroidmolekül sein (oder davon abgeleitet sein).
  • In Verbindungen, in welchen Z = RnX ist, dient Z als "blockierende" Komponente, welche die Hydrolyse der Ester-, Thioester- oder Amidbindung verhindert oder behindert, wodurch die Wahrscheinlichkeit gesenkt wird, daß solche Verbindungen instabil sind. Die blockierende Wirkung wird (1) durch das sterische Volumen der RnX -Gruppe verursacht, welches physisch den Angriff durch chemische Spezies blockiert, welche die Hydrolyse der Ester-, Thioester- oder Amidbindung herbeiführen oder verstärken würden (z.B., Spezies, die eine Pseudobase bei Kohlenstoff 9 einer Acridiniumverbindung bilden würden), und (2) durch elektronische Wirkungen, die durch die Änderung des Kohlenstoffatoms von einer sp2- zu einer sp3-Hybridisierung erzeugt werden (wodurch sich die Ester-, Thioester- oder Amidbindung eher wie ein aliphatischer Ester, Thioester oder ein aliphatisches Amid verhält). Wenn Verbindungen, die eine RnX-Gruppe enthalten, zur Erzeugung von Chemilumineszenz getriggert werden, müssen sie zuerst mit Säure behandelt werden, welche die RnX-Gruppe spaltet, wodurch die Einleitung der chemilumineszierenden Reaktion nach der Zugabe von Peroxid, Base oder eines anderen Triggermittels möglich ist (die Säurebehandlung ist für Verbindungen, in welchen Z = -H oder ein Halogen ist, nicht notwendig). Die Eigenschaft und Struktur der RnX-Gruppe ist nur durch zwei Faktoren beschränkt: (1) die Größe der RnX-Gruppe muß derart sein, daß die Gruppe den Verbindungen der vorliegenden Erfindung während der Synthese, wie in der Folge beschrieben und durch andere synthetische Verfahren, zugegeben werden kann (d.h., die RnXH-Spezies, aus welcher sich die RnX-Gruppe während der Synthese ableitet, kann nicht so groß sein, daß sterische Wirkungen die Synthese einer Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einer solchen RnX-Gruppe unmöglich machen), und (2) die RnX-Gruppe muß eine sterische und chemische Eigenschaft aufweisen, so daß sie von dem Molekül mit Säure abgespalten werden kann, bevor die chemilumineszierende Reaktion getriggert wird.
  • Die zuvor beschriebenen, verbesserten chemilumineszierenden Komponenten sind in einem weiten Bereich spezifischer Bindungstest auf das Vorhandensein eines Analyts in einer Probe zweckdienlich. "Vorhandensein" soll hierin den qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines Analyts bedeuten. Solche Tests können auf jedes Analyt ausgerichtet sein, daß durch Verwendung der verbesserten chemilumineszierenden Komponente in Verbindung mit spezifischen Bindungsreaktionen nachgewiesen werden kann. Diese Tests enthalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Immuntests, Proteinbindungstests und Nucleinsäure-Hybridisierungstests.
  • In einem typischen Immuntest ist das Analyt immunreaktionsfähig, und sein Vorhandensein in einer Probe kann durch seine Immunreaktion mit einem Testreagens bestimmt werden. In einem typischen Proteinbindungstest wird das Vorhandensein von Analyt in einer Probe durch das spezifische Bindungsreaktionsvermögen des Analyts mit einem Testreagens bestimmt, wobei das Reaktionsvermögen ein anderes als das Immunreaktionsvermögen ist. Beispiele dafür umfassen die Enzym-Substrat-Erkennung, und die Bindungsaffinität von Avidin für Biotin. In dem typischen Nucleinsäure-Hybridisierungstest wird das Vorhandensein des Analyts in einer Probe durch eine Hybridisierungsreaktion des Analyts mit einem Testreagens bestimmt. Analyt-Nucleinsäure (die für gewöhnlich als doppelsträngige DNA oder RNA vorhanden ist) wird für gewöhnlich zunächst in eine einzelsträngige Form umgewandelt und auf einem Träger (z.B. einem Nitrocellulosepapier) immobilisiert. Die Analyt-Nucleinsäure kann als Alternative in eine Gelmatrix elektrophoretisiert werden. Der immobilisierte Analyt kann dann durch eine komplementäre Nucleinsäuresequenz hybridisiert werden (d.h., spezifisch gebunden werden).
  • Die obengenannten spezifischen Bindungstests können in einer großen Vielzahl von Testformaten ausgeführt werden. Diese Testformate fallen in zwei große Kategorien. In der ersten Kategorie verwendet der Test ein chemilumineszierendes Konjugat, das die verbesserte chemilumineszierende Komponente umfaßt, die an ein spezifisches Bindungsmaterial angelagert ist. "Spezifisches Bindungsmaterial" bezeichnet hierin jedes Material, das spezifisch durch eine Immunreaktion, Proteinbindungsreaktion, Nucleinsäure-Hybridisierungsreaktion und jede andere Reaktion bindet, in welcher das Material spezifisch mit einer begrenzten Klasse biologischer, biochemischer oder chemischer Spezies reagiert. In dieser Kategorie von Tests nimmt das chemilumineszierende Konjugat an einer spezifischen Bindungsreaktion teil, und das Vorhandensein des Analyts in der Probe ist proportional zu der Bildung eines oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionsprodukte, welche das chemilumineszierende Konjugat enthalten. Der Test wird durchgeführt, indem das Eintreten der erforderlichen spezifischen Bindungsreaktionen unter geeigneten Reaktionsbedingungen ermöglicht wird. Die Bildung spezifischer Bindungsreaktionsprodukte, welche das chemilumineszierende Konjugat enthalten, wird durch Messen der Chemilumineszenz solcher Produkte, die das chemilumineszierende Konjugat enthalten, bestimmt oder durch Messen der Chemilumineszenz des nicht reagierten oder teilweise reagierten, chemilumineszierenden Konjugates, das in solchen Produkten nicht enthalten ist.
  • Die erste Kategorie von Testformaten wird durch Sandwich-Tests, kompetitive Tests, Oberflächenantigentests, Sequenz-Sättigungstests, kompetitive Verdrängungstests und Löschtests veranschaulicht.
  • In einem Sandwich-Format ist das spezifische Bindungsmaterial, an welches die chemilumineszierende Komponente angelagert wird, zur spezifischen Bindung mit dem Analyt imstande. Der Test verwendet weiters einen Reaktionspartner, der zur spezifischen Bindung mit dem Analyt zur Bildung eines Reaktionspartner-Analyt-chemilumineszierendes Konjugat-Komplexes imstande ist. Der Reaktionspartner kann an eine Festphase angelagert werden, die, ohne darauf beschränkt zu sein, Tauchstäbe, Perlen, Rohre, Papier oder Polymerblätter enthalten kann. In solchen Fällen ist das Vorhandensein des Analyts in einer Probe proportional zu der Chemilumineszenz der Festphase nach Beendigung der spezifischen Bindungsreaktionen. Solche Testformate sind näher in US-Patent Nr. 4,652,533, 4,383,031, 4,380,580 und 4,226,993 beschrieben.
  • In einem kompetitiven Format verwendet der Test einen Reaktionspartner, der zur spezifischen Bindung mit dem Analyt zur Bildung eines Analyt-Reaktionspartner-Komplexes und mit dem spezifischen Bindungsmaterial, an welches die chemilumineszierende Komponente angelagert ist, zur Bildung eines chemilumineszierendes Konjugat-Reaktionspartner-Komplexes imstande ist. Der Reaktionspartner kann an eine Festphase angelagert sein oder als Alternative können Reaktionsprodukte, die den Reaktionspartner enthalten, durch Verwendung eines zweiten Antikörpers oder durch andere bekannte Mittel ausgefällt werden. In diesem kompetitiven Format ist das Vorhandensein des Analyts "proportional", d.h., umgekehrt proportional, zu der Chemilumineszenz der Festphase oder des Niederschlages. Eine nähere Beschreibung dieses Testformats findet sich in den unmittelbar zuvor genannten US-Patenten.
  • In einem anderen Testformat kann das Analyt an einer größeren biologischen, biochemischen oder chemischen Spezies auftreten oder an diese gebunden sein. Diese Art von Format ist durch einen Oberflächenantigentest veranschaulicht. In diesem Format ist das spezifische Bindungsmaterial zur spezifischen Bindung mit dem Analyt imstande, und das Vorhandensein des Analyts ist proportional zu dem Analyt-chemilumineszierendes Konjugat-Komplex, der als Reaktionsprodukt gebildet wird. Dies wird durch Anlagern der chemilumineszierenden Komponente an einen Antikörper veranschaulicht, der für ein Oberflächenantigen auf einer Zelle spezifisch ist. Das Vorhandensein des Zelloberflächenantigens wird durch die Chemilumineszenz der Zellen nach Beendigung der Reaktion angezeigt. Die Zellen selbst können in Verbindung mit einem Filtrationssystem zur Abtrennung des Analyt-chemilumineszierendes Konjugat-Komplexes, der sich an der Oberfläche der Zellen bildet, von dem nicht reagierten chemilumineszierenden Konjugat verwendet werden. Dies ist näher in US-Patent 4,652,533 beschrieben.
  • Die verbesserte, chemilumineszierende Komponente kann in weiteren Testformaten verwendet werden, die in der Wissenschaft bekannt sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, der Sequenzsättigung und kompetitiven Verdrängung, die beide ein chemilumineszierendes Konjugat verwenden, wobei sowohl (1) das spezifische Bindungsmaterial, an welches die Komponente angelagert ist, als auch (2) der Analyt spezifisch mit dem Reaktionspartner binden. Im Falle der Sequenzsättigung wird der Analyt zuerst mit dem Reaktionspartner zur Reaktion gebracht, wonach eine Reaktion des chemilumineszierenden Konjugates mit dem verbleibenden, nicht reagierten Reaktionspartner folgt. Im Falle einer kompetitiven Verdrängung verdrängt das chemilumineszierende Konjugat der Analyt kompetitiv, welcher bereits an den Reaktionspartner gebunden ist.
  • In einem Löschformat verwendet der Test einen Reaktionspartner, der zur spezifischen Bindung mit dem Analyt zur Bildung eines Analyt-Reaktionspartner-Komplexes, und mit dem spezifischen Bindungsmaterial, an welches die chemilumineszierende Komponente angelagert ist, zur Bildung eines chemilumineszierendes Konjugat-Reaktionspartner-Komplexes imstande ist. An den Reaktionspartner wird eine Löschkomponente angelagert. Wenn die Löschkomponente sehr nahe an die chemilumineszierende Komponente herangebracht wird, verringert oder löscht sie die Chemilumineszenz der chemilumineszierenden Komponente. In diesem Löschformat ist das Vorhandensein des Analyts proportional zu der Chemilumineszenz der chemilumineszierenden Komponente. Eine nähere Beschreibung dieses Formats findet sich in US-Patent 4,220,450 und 4,277,437.
  • Angesichts der zuvor besprochenen Testformate und bei den Formaten, die in der Folge besprochen werden, kann die Reihenfolge, in welcher Testreagenzien hinzugefügt und zur Reaktion gebracht werden, sehr unterschiedlich sein, wie in der Wissenschaft allgemein bekannt ist. Zum Beispiel kann in einem Sandwich-Test der Reaktionspartner, der an eine Festphase gebunden ist, mit einem Analyt zur Reaktion gebracht werden, der in einer Probe enthalten ist, und nach dieser Reaktion kann die Festphase, die den zum Komplex gebildete Analyt enthält, von der übrigen Probe abgetrennt werden. Nach diesem Trennungsschritt kann das chemilumineszierende Konjugat mit dem Komplex an der Festphase zur Reaktion gebracht werden. Als Alternative können die Festphase, die Probe und das chemilumineszierende Konjugat gleichzeitig zugegeben und vor der Trennung zur Reaktion gebracht werden. Als eine weitere, aber weniger bevorzugte Alternative können der Analyt in der Probe und das chemilumineszierende Konjugat vor der Zugabe des Reaktionspartners an der Festphase zur Reaktion gebracht werden. Ähnliche Variationen beim Mischen und in den Reaktionsschritten sind für kompetitive Testformate wie auch andere Formate möglich, die in der Wissenschaft bekannt sind. Das "Ermöglichen unter geeigneten Bedingungen einer wesentlichen Bildung" spezifischer Bindungsreaktionsprodukte soll hierin die vielen verschiedenen Variationen in der Reihenfolge der Zugabe und Reaktion von Testreagenzien beinhalten.
  • In der zweiten Kategorie von Testformaten verwendet der Test eine nichtkonjugierte, verbesserte chemilumineszierende Komponente. Das Vorhandensein des Analyts in der Probe ist proportional zu der Bildung eines oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionsprodukte, die selbst die chemilumineszierende Komponente nicht enthalten. Statt dessen chemiluminesziert die chemilumineszierende Komponente proportional zu der Bildung solcher Reaktionsprodukte.
  • In einem Beispiel dieser zweiten Kategorie von Tests verwendet der Test einen Reaktionspartner, der zur Bindung mit dem Analyt zur Bildung eines Analyt-Reaktionspartner-Komplexes imstande ist, der bewirkt, daß die chemilumineszierende Komponente chemiluminesziert. Dies wird durch einen einfachen Enzym-Substrat-Test veranschaulicht, in welchem der Analyt das Substrat Glucose und der Reaktionspartner das Enzym Glucoseoxidase ist. Die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes triggert die chemilumineszierende Komponente. Ein solcher Enzym-Substrat-Test für Glucose ist in US-Patent 3,964,870 und 4,427,770 geoffenbart. Dieser Enzym-Substrat-Test ist ein spezifischer Bindungstest in dem Sinn, daß das Substrat spezifisch an die aktive Stelle des Enzyms auf sehr ähnliche Weise bindet, wie ein Antigen an einen Antikörper bindet. In diesem Test bindet das Enzym spezifisch mit dem Substrat, was zu der Erzeugung von Peroxid führt, das seinerseits bewirkt, daß die chemilumineszierende Komponente chemiluminesziert.
  • In der zweiten Kategorie von Tests sind auch jene Tests enthalten, in welchen die Bildung der Reaktionsprodukte die Chemilumineszenz durch die chemilumineszierende Komponente in einer weniger direkten Weise fördert oder hemmt. In diesem Test wird ein erster Reaktionspartner, der mit dem Analyt kreuzreaktionsfähig ist, an ein Enzym wie Glucoseoxidase nahe seiner aktiven Stelle angelagert. Ein zweiter Reaktionspartner, der sowohl für den Analyt als auch für das immunreaktionsfähige Material spezifisch ist, wird der Probe und dem veränderten Enzym in Gegenwart des Substrates (d.h., der Glucose) zugegeben. Wenn der zweite Reaktionspartner an den ersten Reaktionspartner bindet, der sich nahe der aktiven Stelle an dem Enzym befindet, blockiert der zweite Reaktionspartner die aktive Stelle derart, daß das Substrat nicht an das Enzym an der aktiven Stelle binden kann oder die Bindung des Substrates an der aktiven Stelle deutlich verringert ist. Der zweite Reaktionspartner, der das Enzym auf diese Weise blockiert, hemmt das Enzym an der Erzeugung von Peroxid, das seinerseits die chemilumineszierende Komponente getriggert hätte. Der Analyt in der Probe bindet jedoch den zweiten Reaktionspartner, wodurch verhindert wird, daß der zweite Reaktionspartner die Erzeugung von Peroxid hemmt. Das Vorhandensein des Analyts ist proportional zu der Chemilumineszenz der Komponente.
  • Die Tests, die in den obengenannten beiden Kategorien von Testformaten enthalten sind, können heterogen oder homogen sein. In heterogenen Tests werden die Reaktionsprodukte, deren Bildung proportional zum Vorhandensein von Analyt in der Probe ist, von anderen Reaktionsprodukten abgetrennt. Die Trennung kann durch ein beliebiges Mittel, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, der Trennung einer flüssigen Phase von einer festen Phase durch Filtration, Mikrofiltration, doppelte Antikörperausfällung, Zentrifugation, Größenausschlußchromatographie, Entfernung einer festen Phase (z.B. eines Tauchstabes) aus einer Probenlösung oder Elektrophorese durchgeführt werden. Zum Beispiel wird in einem Sandwich-Test der Reaktionspartner-Analyt-chemilumineszierendes Konjugat-Komplex von dem nicht reagierten, chemilumineszierenden Konjugat abgetrennt. In einem Oberflächenantigentest wird der Analyt-chemilumineszierendes Konjugat-Komplex von dem nicht reagierten, chemilumineszierenden Konjugat abgetrennt. In einem kompetitiven Test wird der Reaktionspartner-chemilumineszierendes Konjugat-Komplex von dem nicht reagierten, chemilumineszierenden Konjugat abgetrennt. In einem Sequenz-Sättigungstest und in einem kompetitiven Verdrängungstest wird der Reaktionspartner-chemilumineszierendes Konjugat-Komplex von dem nicht reagierten, chemilumineszierenden Konjugat abgetrennt. Als Alternative werden in homogenen Tests die Reaktionsprodukte nicht abgetrennt. Nachdem die Testreagenzien zur Reaktion gebracht wurden, kann die Chemilumineszenz aus der gesamten Testmischung gemessen werden, ob sich diese Mischung nun in Lösung, auf einer Festphase oder zwischen den verschiedenen Membranschichten eines Tauchstabes oder anderen festen Trägers befindet. Der Glucosetest unter Verwendung von Glucoseoxidase und einer chemilumineszierenden Komponente stellt einen einfachen homogenen Test dar, in dem eine Trennung nicht notwendig ist. Der Löschtest stellt einen komplexeren homogenen Test dar, in dem eine Trennung nicht notwendig ist. Es wird davon ausgegangen, daß jede Kategorie von Testformaten entweder zu heterogenen oder homogenen Formaten führen kann.
  • Schließlich soll "Messen der Chemilumineszenz", falls zutreffend, das Abtrennen jener spezifischen Bindungsreaktionsprodukte, deren Bildung proportional zu dem Vorhandensein eines Analyts in der Probe ist, von anderen Reaktionsprodukten beinhalten. Es soll auch, falls zutreffend (i) die Behandlung der chemilumineszierenden Komponente mit Säure zur Spaltung einer Z- (d.h., RnX-) Gruppe von der Komponente, und/oder (ii) das Triggern der chemilumineszierenden Komponente zum Chemilumineszieren im Falle jener Testformate, in welchen die Bildung des Reaktionsproduktes selbst die chemilumineszierende Komponente nicht triggert, beinhalten.
  • SYNTHESE VON KOMPONENTEN
  • Die folgenden Beispiele zeigen die Synthese von gewissen chemilumineszierenden Komponenten der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiel 1
  • Eine bevorzugte chemilumineszierende Komponenten der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (oder andere Gegenione wie Chlorid, Trifluoroacetat, Sulfat usw.), das die folgende Formel hat:
    Figure 00220001
  • (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat wird nach dem folgenden Schema synthetisiert:
    Figure 00230001
    Figure 00240001
  • Die Kondensation von Isatin (1) mit Resorcinol (2) ergibt die 3-Hydroxyacridin-9-carbonsäure (3). Die Reaktion mit Benzyl-4-bromobutyrat ergibt den Ester. (4) mit der veretherten 3-Hydroxygruppe. Die Hydrolyse unter Verwendung einer Base entfernt beide Benzylgruppen, wodurch die Dicarbonsäure (5) erhalten wird. Die selektive Rebenzylierung der Carbonfunktion der Propyloxygruppe ergibt die 9-Carbonsäure (6). Die Veresterung mit 2,6-Dimethyl-4-nitrophenol und die Methylierung des Acridinstickstoffes ergibt (8). Die Entfernung der Schutzgruppen der Carboxylgruppe mit HBr und die Kondensation mit N-Hydroxysuccinimid unter Verwendung von DCC ergibt (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat. Diese Reaktionen werden in der Folge ausführlicher beschrieben.
  • 4-Bromobutyrylchlorid (13,8 g, 75 mmol) wurde in einen 100 ml Rundkolben eingebracht. Der Kolben wurde unter Verwendung eines Trockeneis/Kohlenstofftetrachloridbades auf –20 °C gekühlt, Ethylacetat (50 ml), das N-Methylmorpholin (7,58 g, 75 mmol, 8,2 ml) enthielt, wurde sorgsam hinzugefügt. Unter Verwendung eines Zugabetrichters wurde Benzylalkohol (6,97 g, 6,67 ml, 6,64 mmol) tröpfchenweise zugegeben. Nach der Zugabe wurde das Bad entfernt und die Mischung 2 Stunden gerührt. Das Produkt wurde unter Verwendung von Ethylacetat (50 ml) in einen Trenntrichter überführt, einmal mit Natriumbicarbonat (10 %), dann zweimal mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Eindampfen der Lösemittel ergab Benzyl-4-bromo-butyrat als Öl (Ausbeute = 91 %).
  • Isatin (1) (1,88 g) wurde langsam einer Lösung von Kaliumhydroxid (5,07 g, 0,09 mol), aufgelöst in Wasser (3,5 ml), zugegeben. Der Reaktionskolben wurde in einem Ölbad auf etwa 50 °C erwärmt. Es wurden noch etwa 10 ml Wasser tröpfchenweise zugegeben. Resorcinol (2) (10 g, 0,089 mol) wurde zugegeben, und die Temperatur wurde unter fortgesetztem Rühren auf 100 °C erhöht, was zur Bildung einer geschmolzen Mischung führt. Es wurde weiteres Isatin (1) (1,88 g) zugegeben. Der Reaktionskolben (Dreihalsrundkolben) wurde an einem Stickstoffeinlaß befestigt, und die Wasserdämpfe wurden durch den Stickstoffstrom ausgespült. Die Mischung wurde 4 Stunden bei 125 °C gerührt. Wasser (70 ml) wurde zugegeben, und der Inhalt wurde durch fortgesetztes Rühren aufgelöst. Nach der Überführung der Mischung in einen Erlenmeyerkolben wurde das Volumen mit Wasser auf 200 ml ergänzt. Der pH-Wert wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Durch Filtrieren und Waschen der Feststoffe mit Wasser wurde die rohe Acridinsäure erhalten. Diese wurde dann in 2N NaOH (100 ml) aufgelöst, und die Lösung wurde durch Celite gefiltert. Das Celitebett wurde mit 200 ml 1N NaOH gewaschen. Das Filtrat wurde mit konzentrierter HCl auf den pH-Wert 2,0 ange säuert. Der Niederschlag einer 2-Hydroxy-acridin-9-carbonsäure (3) wurde gefiltert, mit Wasser gewaschen und in Vakuum über P2O5 getrocknet (Ausbeute = 42 %).
  • 3-Hydroxy-9-acridincarbonsäure (3) (4 g, 0,017 mol), Benzyl-4-brombutyrat (14,6 g, 0,057 mol) und Cäsiumcarbonat (22,16 g, 0,068 mol) wurden in DMSO (125 ml) in einem 250 ml Rundkolben aufgelöst. Der Kolben wurde in einem Ölbad auf etwa 50 °C erwärmt. Nach dem Rühren der Mischung bei dieser Temperatur über 1 Stunde wurde die Mischung in Wasser (1 Liter) gegossen. Das ausgefällte Produkt wurde mit Chloroform extrahiert, nachdem die wäßrige Suspension mit Natriumbicarbonat alkalisch gemacht wurde. Das Trocknen und die Verdampfung von Chloroform ergab 3-(3-Benzyloxycarbonyl)-propyloxy-9-(3-benzyloxy-carbonyl-propyl)acridincarboxylat (4), das auf einer Silicagel-Säule unter Verwendung von Chloroform als Lösemittel chromatographiert wurde. Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,36 bei TLC mit CHCl3/EtOAc, 9/1, wurden gepoolt. Die Lösemittel wurden verdampft (Ausbeute = 55 %).
  • 3-(3-Benzyloxycarbonyl)-propyloxy-9-(3-benzyloxycarbonylpropyl)acridincarboxylat (4) (4,93 g, 8,3 mmol) wurde einer Mischung von 2N NaOH (300 ml) und Methanol (300 ml) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 48 Stunden gerührt. Das Methanol wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt, und die Lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure auf pH 6,0 angesäuert. Die ausgefällten Feststoffe wurden gefiltert, mit Wasser gewaschen und in Ethylacetat aufgelöst. Die Lösung wurde getrocknet, und dann wurden die Lösemittel verdampft, um 3-(3-Carboxy)propyloxy-acridin-9-carbonsäure (5) zu erhalten (Ausbeute 92,8 %).
  • 3-(3-Carboxy)propyloxy-acridin-9-carbonsäure (5) (1,5 g, 4,6 mmol) wurden in DMAP (80 ml, 1,3-Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(IH)pyrimidon) unter Erwärmung aufgelöst. Benzylalkohol (0,5 ml, 0,52 g, 4,8 mmol), 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (1,04 g, 5,0 mmol) und N,N-Dimethylaminopyridin (0,2 g, 1,6 mmol) wurden der Reaktion hinzugefügt, die zuvor in einem Bad aus Trockeneis/CCl4 gekühlt worden war. Die Mischung wurde 15 Stunden mit einem Stickstoffeinlaß bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde gesättigtem Natriumchlorid (320 ml) zugegeben. 3-(3-Benzyloxycarbonyl)propyloxy-acridin-9-carbonsäure (6) wurde gefiltert und mit einer geringen Menge Wasser gewaschen.
  • Das Produkt wurde auf einer Silicagel-Säule unter Verwendung von CHCl3/MeOH, 95/5, als Lösemittel chromatographiert (Ausbeute = 26 %).
  • 3-(3-Benzyloxycarbonyl)propyloxy-acridin-9-carbonsäure (6) (0,5 g, 1,2 mmol) und p-Toluolsulfonylchlorid (0,46 g, 2,4 mmol) wurden in Pyridin (20 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde in einem Bad aus Trockeneis/CCl4 15 Minuten gekühlt. 2,6-Dimethyl-4-nitrophenol (0,2 gm, 1,2 mmol) wurde zugegeben, und das Kühlbad wurde entfernt, und die Mischung wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sie wurde zu Nasser (450 ml) zugesetzt, und der pH-Wert wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Das Produkt wurde gefiltert, mit Wasser gewaschen und in Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silicagel-Säule unter Verwendung von Chloroform als Lösemittel chromatographiert. Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,8 bei TLC mit CHCl3/EtOAc, 1:1, wurden gepoolt. Das Verdampfen der Lösemittel ergab (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-benzyloxycarbonyl)-propyloxy-acridin-9-carboxylat (7) (Ausbeute = 47 %).
  • Das Acridin (7) (0,32 g, 0,56 mmol) wurde in wasserfreiem Methylenchlorid (4 ml) aufgelöst, und Methylfluorosulfat (0,27 ml, 3,36 mmol, 6 Moläquivalent) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasserfreier Ether (20 ml) wurde zugegeben. (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-benzyloxycarbonyl)propyloxy-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (8) wurde gefiltert und mit Ether (50 ml) gewaschen. Die Ausbeute war quantitativ.
  • Der Benzyl-geschützte Acridiniumester (8) (250 ng) wurde mit 30 % HBr/Essigsäure (3 ml) 2 Stunden bei 55 °C behandelt. Wasserfreier Ether (20 ml) wurde zum Ausfällen des Produktes zugegeben. Das Filtern und Waschen der Feststoffe mit Ether ergab (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-carboxyl)propyloxyacridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (9). Die Kristallisation von Acetonitril lieferte die reine Verbindung (Ausbeute = 80 %).
  • Das von Schutzgruppen befreite Acridinium (9) (67 mg, 0,13 mmol) wurde in einem 50 ml Zweihalsrundkolben in wasserfreiem Acetonitril (10 ml) aufgelöst. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 33 mg, 0,16 mmol) wurde zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 45 Minuten gerührt. N-Hydroxysuccinimid (17 mg, 0,15 mmol) wurde zugegeben und die Reaktion 2,5 Stunden fortgesetzt. Weiteres DCC (14 mg) und N-Hydroxysuccinimid (8 mg) wurden zugegeben und nach 1,5 Stunden dieselben Mengen noch einmal 1,5 Stunden nach der letzten Zugabe wurde Eisessig (1,71) zum Löschen von überschüssigem DCC zugegeben. Das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt.
  • Das Rohprodukt wurde auf einer halbpräparativen C18-Dynamax HPLC-Säule (im Handel von Rainin Instrument Co., Inc., Woburn, Massachusetts erhältlich) unter Verwendung von CH3CN/H2O (0,1 % Trifluoressigsäure) 60/40, als mobile Phase bei einer Strömungsrate von 1,8 ml/min gereinigt, unter Verwendung von 360 nm für den Nachweis. Die Fraktion bei der Retentionszeit 9,4 Minuten wurde gesammelt und die Lösemittel unter Vakuum entfernt. Das (2,6-Dimethyl-4-nitro)-phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (10) wurde unter Vakuum in einem Exsikkator getrocknet, der Phosphorpentoxid enthielt (Ausbeute = 33 %). MS: FAB, Thioglycerolmatrix, 586 (M+). HPLC: Rainin C18 Dynamax (10 mm × 25 mm), CH3CN/H2O (0,1 % Trifluoressigsäure), 60:40, Strömungsrate 1,8 ml/min, Retentionszeit 9,4 min, nachgewiesen bei 360 nm.
  • Beispiel 2
  • Eine weitere bevorzugte Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat, das die folgende Formel hat:
    Figure 00280001
  • (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat wird nach dem folgenden Schema synthetisiert:
    Figure 00290001
  • Die Veresterung von Acridin-9-carbonsäure (11) mit 2,6-Dimethoxyphenol (12) über das Säurechlorid liefert den Ester (13). Die Methylierung des Acridinstickstoffes mit Methylfluorosulfat und die anschließende Chlorsulfonierung mit Chloroschwefelsäure ergibt den Marker (15). Diese Reaktionen sind in der Folge ausführlicher beschrieben.
  • Acridin-9-carbonsäure (11) (6,10 g, 0,027 mol) in einem 250 ml Rundkolben wurden mit Thionylchlorid (130 ml) gemischt, und die Mischung wurde unter Rühren 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Das überschüssige Thionylchlorid wurde in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde mit Benzol (75 ml) behandelt und das Lösemittel unter Vakuum entfernt, um Spuren von Thionylchlorid zu entfernen. Der Rückstand von Acridin-9-carbonylchlorid (11) wurde mit Pyridin (130 ml) vermischt, und 2,6-Dimethoxyphenol (12) (4,16 g, 0,027 mol) wurde zugegeben. Die Mischung wurde unter Verwendung eines Wasserbades (etwa 60 °C) zur Lösung aller Feststoffe erwärmt. Nach 15-ständigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung in 1 Liter Wasser gegossen. Die Suspension wurde mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2,0 angesäuert. Das feste Produkt wurde gefiltert, mit Wasser gewaschen und in Chloroform aufgelöst. Das Trocknen (wasserfreies Natriumsulfat) und die Verdampfung von Chloroform ergab (2,6-Dimethoxy)phenyl-acridin-9-carboxylat (13). Dieses wurde auf einer Silicagel-Säule unter Verwendung von CHCl3/EtOAc, 98:2, als Lösemittel chromatographiert. Die Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,19 bei TLC mit demselben Lösemittel wurden gepoolt, und die Verdampfung der Lösemittel ergab den reinen Ester (13) (Ausbeute = 30 %).
  • (2,6-Dimethoxy)phenyl-acridin-9-carboxylat (13) (2,01 g, 5,6 mmol) wurde in Dichloromethan (110 ml, wasserfrei) in einem 250 ml Rundkolben aufgelöst. Methylfluorosulfat (4,60 ml, 6,48 g, 56 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden gerührt. Wasserfreier Ether (100 ml) wurde zugegeben, und die ausgefällten hellgelben Feststoffe wurden gefiltert, nachdem die Suspension 0,5 Stunden gerührt worden war. Der Feststoff wurde gut mit Ether (etwa 100 ml) und dann mit Pentan (50 ml) gewaschen. Das Acridinium wurde von Acetonitril rekristallisiert, um reines 2,6-Dimethoxy-phenyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (14) zu erhalten (Ausbeute = 81 %).
  • Das(2,6-Dimethoxy)phenyl-10-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (14) (101,7 mg, 0,215 mmol), ein magnetischer Rührstab und wasserfreies CH2Cl2 (5 ml) wurden in einen trockenen, 25 ml Zweihalsrundkolben eingebracht. Die Suspension wurde geführt und auf –20 °C in einem CCl4/Trockeneisbad gekühlt. Chlorschwefelsäure (72 1, 0,125 g, 1,07 mmol) wurde zugegeben und mit dem Rühren bei –20 °C 30 Minuten fortgefahren. Die Reaktionsmischung wurde dann langsam auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und weitere 2 Stunden gerührt. Wasserfreier Ether (5 ml) wurde dem Reaktionskolben zugegeben, was zu der Bildung eines hellgelben Niederschlags führte. Dieser wurde gefiltert und gründlich mit Ether gewaschen. Das Trocknen unter Vakuum ergab (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenylacridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (15) (Ausbeute = 93,4 %). MS: FAB, Dithiothreitol/Dithioerythrytolmatrix, 472 (M+).
  • Beispiel 3
  • Eine weitere bevorzugte Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat mit der folgenden Formel:
    Figure 00310001
  • 9-(2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat wurde durch dasselbe Veresterungsverfahren wie (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxyfluorosulfonat synthetisiert, wobei 2,6-Dimethyl-4-bromo-phenol das substituierte Phenol ersetzte, das in der (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxyfluorosulfonat-Synthese verwendet wurde.
  • Beispiel 4
  • Eine weitere bevorzugte Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat, das folgende Formel hat:
    Figure 00320001
  • (2,6-Dimethyl-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat wurde durch dasselbe Verfahren wie (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxyfluorosulfonat synthetisiert, wobei 2,6-Dimethyl-dimethoxyphenol das 2,6-Dimethoxyphenol im Veresterungsschritt ersetzte.
  • Beispiel 5
  • Eine weitere bevorzugte Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-9,10-dihydro-N-methyl-acridan-9-carboxylat, das die folgende Formel hat:
    Figure 00330001
  • (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-9,10-dihydro-N-methyl-acridan-9-carboxylat wurde aus der Acridiniumsäure (9) synthetisiert. Die Reduktion der Säure (9) mit Natriumcyanoborohydrid ergibt das Acridan, welches dann zu dem NHS-Ester durch das gemischte Anhydridverfahren umgewandelt wird. Diese Reaktionen sind in der Folge ausführlicher beschrieben.
  • Die Acridiniumsäure (9) (210 mg, 0,37 mmol) wurde in einer 1:1 Mischung von Acetonitril und 0,1M Phosphatpuffer, pH 5,2 (60 ml), aufgelöst. Eine Lösung von Natriumcyanoborohydrid (190 mg) in Acetonitril (5 ml) wurde tröpfchenweise der Acridiniumlösung zugegeben. Dies führt zu der Bleichung der gelben Farbe der Lösung. Mit dem Rühren wurde 15 Minuten fortgefahren. Acetonitril (100 ml) wurde zugegeben, und die Lösemittel wurden in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand als Suspension in Wasser wird mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Entfernung der Lösemittel ergab (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-carboxyl)propyloxy-9,10-dihydro-acridan-9-carboxylat (Ausbeute = 90 %).
  • Die Acridansäure (125 mg, 0,255 mmol) und N-Methylmorpholin (28 l) wurden in wasserfreiem Acetonitril (15 ml) aufgelöst. Die Mischung wurde in einem CCl4/Trockeneisbad unter Stickstoff gekühlt. Isobutylchloroformat (35 l) wurde zugegeben, die Mischung wurde 3 Minuten gerührt und N-Hydroxysuccinimid (35 mg), aufgelöst in Acetonitril (2 ml), wurde zugegeben. Nach 15-minütigem Rühren bei –20 °C wurde das CCl4/Trockeneisbad entfernt und die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Nach 2 Stunden wurden die Lösemittel verdampft und der Rückstand in Ethylacetat extrahiert. Das unlösliche N-Methylmorpholin- Hydrochloridsalz wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde konzentriert und Hexan (20 ml) wurde zugegeben. Das Abkühlen führte zu einer Kristallisation von (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyloxy-carbonyl)propyloxy-9,10-dihydro-N-methyl-acridan-9-carboxylat. Die Kristalle wurden schließlich gefiltert und mit Hexan gewaschen (Ausbeute = 70 %). MS: FAB, Dithiothreito/Dithioerythrytolmatrix, 588 (M+ + 1). HPLC: Waters C18 Novapak (3,9 mm × 15 mm) (Im Handel von Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, Milford, Massachusetts, erhältlich), CH3CN/H2O (0,1 % Trifluoressigsäure) 60:40, Strömungsrate 1,0 ml/min, Retentionszeit 6,34 min, nachgewiesen bei 280 nm.
  • Beispiel 6
  • Eine weitere bevorzugte Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat-3-oxo-butyrimidatchlorid, Hydrochlorid, das die folgende Formel hat:
  • Figure 00340001
  • (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat-3-oxo-butyrimidatchlorid, Hydrochlorid wird nach dem folgenden Schema synthetisiert:
    Figure 00350001
  • Die Reaktion von 3-Hydroxy-9-acridin-carbonsäure (16) mit 4-Bromobutyronitril ergibt einen Ester (17). Die Hydrolyse des Esters und die Umesterung mit 2,6-Dimethyl-4-nitrophenol ergibt (19). Die Methylierung mit Methylfluorosulfat und die Umwandlung der Cyanogruppe zu dem Imidatester unter Verwendung von Chlorwasserstoffgas und Methanol ergibt (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat-3-oxo-butyrimidatchlorid, Hydrochlorid (21). Diese Reaktionen sind in der Folge näher beschrieben.
  • 3-Hydroxy-9-acridincarbonsäure (16) (2 g, 8,4 mmol), 4-Bromobutyronitril (5,87 ml, 8,74 g, 34 mmol) und Cäsiumcarbonat (11,08 g, 34 mmol) wurden in wasserfreiem DMSO (50 ml) in einem 100 ml Rundkolben aufgelöst. Die Mischung wurde in einem Wasserbad unter Rühren auf etwa 50 °C erwärmt. Nach 3 Stunden wurde die Mischung in Wasser (600 ml) gegossen. Die Feststoffe wurden gefiltert und in Chloroform aufgelöst. Das Trocknen und Verdampfen der Lösemittel ergab 3-(3-Cyano)propoxyl-acridin-9-carbonsäure-(3-cyano)propylester (17). Dieser wurde dann in Toluol (50 ml) aufgelöst, und Cyclohexan (150 ml) wurde zugegeben. Das reine Produkt (17) trennte sich ab, und wurde dann gefiltert und getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde durch Dünnschichtchromatographie mit Ethylacetat als mobile Phase gereinigt (Rf = 0,58) (Ausbeute = 78,6 %).
  • Der Cyanopropylester (17) (3,73 g, 10 mmol) wurde in einer Mischung von 0,5N NaOH (90 ml) und Methanol (90 ml) aufgelöst und in einem Wasserbad bei 60 °C unter Verwendung eines Rücklaufkondensators 2,5 Stunden gerührt. Das Methanol wurde in einem Rotationsverdampfer entfernt, und das Produkt wurde mit Ethylacetat nach dem Ansäuern der wäßrigen Phase mit konzentrierter Salzsäure extrahiert. Das Trocknen und Verdampfen des Lösemittels ergab 3-(3-Cyano)propoxyl-acridin-9-carbonsäure (18) (Ausbeute = 80 %).
  • Die Carbonsäure (18) (4,62 g, 15 mmol) wurde in Pyridin (130 ml) aufgelöst, und die Lösung wurde in einem CCl4/Trockeneisbad gekühlt. P-Toluolsulfonylchlorid (5,8 g, 30 mmol) wurde zugegeben, und das Bad wurde entfernt. Nach 15-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde 2,6-Dimethyl-4-nitrophenol (2,8 g, 16,8 mmol) zugegeben. Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur wurde Wasser (10 ml) zugegeben, und die Lösemittel wurden unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Chloroform (200 ml) aufgelöst, und die organische Schicht wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 100 ml), Wasser (2 × 100 ml), 1N HCl (1 × 100 ml) und schließlich mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen. Das Trocknen und Verdampfen des Lösemittels ergab (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-cyano)propoxyl-acridin-9-carboxylat (19), das in einer Silicagel-Säule unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (7:3) als Lösemittel chromatographiert wurde (Ausbeute = 74,5 %).
  • Der Ester (19) (1,6 g, 3,52 mmol) wurde in trockenem Methylenchlorid (50 ml) aufgelöst, und unter Stickstoff wurde Methylfluorosulfat (1,6 ml, 17,6 mmol) zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden gerührt. Wasserfreier Ether (100 ml) wurde zugegeben, und das ausgefällte (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-cyano)propoxyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (20) wurde gefiltert, mit Ether gewaschen und unter Vakuum getrocknet (Ausbeute = 84,7 %).
  • Der Acridiniumester (20) (4 mg, 7,4 × 10–3 mmol) wurde in Methanol (0,5 ml) in einem 5 ml Zweihalskolben aufgelöst. Wasserfreies Chlorwasserstoffgas wurde sorgfältig 10 Minuten durchgeperlt. Wasserfreier Ether (3 ml) wurde zugegeben. Das ausgefällte (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat-3-oxo-butyrimidatchlorid, Hydrochlorid (21) wurde gesammelt und mit Ether gewaschen. Der Feststoff wurde in Vakuum getrocknet und in einem Exsikkator, der Phosphorpentoxid enthielt, gelagert.
  • Beispiel 7
  • Eine weitere Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-N-methyl-phenanthridinium-6-carboxylatfluorosulfonat, das die folgende Formel hat:
    Figure 00370001
  • (2,6-Dimethyl-4-vitro)phenyl-N-methyl-phenanthridinium-6-carboxylatfluorosulfonat wird nach dem folgenden Schema synthetisiert:
    Figure 00380001
  • 2-Aminobiphenyl (16,9 g, 0,1 mol) wurde in wasserfreiem Pyridin (30 ml) aufgelöst, und Essigsäureanhydrid (10,5 ml 0,11 mol) wurde zugegeben. Die Lösung wurde kurz geschüttelt und auf Raumtemperatur gekühlt und 15 Stunden stehengelassen. Nach der Zugabe von Wasser (50 ml) wurde N-Acetyl-2-aminobiphenyl (22) abgefiltert und aus wäßrigem Ethanol rekristallisiert, um 19,6 g weiße Nadeln (Ausbeute = 93 %) zu erhalten.
  • N-Acetyl-2-aminobiphenyl (22) (19 g, 0,09 mol) wurde 80 Minuten mit frisch destilliertem Phosphorylchlorid (45 ml, 0,49 mol) sanft unter Rückfluß erwärmt. Die Lösung wurde dann in Eis gekühlt, und der Niederschlag (6-Methylphenanthridinhydrochlorid) wurde abgefiltert, in Wasser aufgelöst und mit wäßrigem Ammoniak alkalisch gemacht. Die Lösung wurde dann mit Ether (4 × 75 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet, und der Ether wurde unter Vakuum entfernt. Das erhaltene gelbe Öl wurde in kochendem Cyclohexan (400 ml) aufgelöst und bildete beim Kühlen weiße Nadeln aus 6-Methylphenanthridin (23) (Ausbeute = 63 %).
  • 6-(2-Hydroxy-1-hydroxymethylethyl)-phenanthridin (24) wurde durch Behandlung von 6-Methylphenanthridin (23) mit Formaldehyd nach dem Verfahren von Morgan und Walls, J. Chem. Soc. 34:2447 (1931), hergestellt, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. 6-(2-Hydroxy-1-hydroxymethylethyl)-phenanthridin (24) bildete sich in Form weißer Nadeln (Ausbeute = 57 %).
  • Eine Mischung von 6-(2-Hydroxy-1-hydroxymethylethyl)-phenanthridin (24) (6 g, 31 mmol), und feinpulverigem Selendioxid (3,8 g, 34 mmol) wurde 10 Stunden in Ethylacetat (125 ml) unter Rückfluß erwärmt. Die tiefrote Lösung wurde dann noch warm, vor dem Eindampfen zur Trockenheit, durch Celite gefiltert. Der erhaltene Feststoff wurde in warmer 1M Salzsäure (125 ml) aufgeschlossen, gefiltert und mit Natriumbicarbonat teilweise neutralisiert. Der anfängliche rote Niederschlag wurde vor der vollständigen Neutralisierung der Lösung abgefiltert. Der erhaltene blaßgelbe Feststoff wurde abgefiltert und aus Aceton/Pet.Ether rekristallisiert, um 2,7 g 6-Formylphenanthridin zu erhalten (Ausbeute = 42 %).
  • 6-Carboxyphenanthridin (25) wurde durch Chromsäureoxidation von 6-Formylphenanthndin nach dem Verfahren von Morgan und Walls, J. Chem. Soc. 34:2447 (1931), hergestellt, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Das Produkt (25) bildete sich als weißes Pulver (Ausbeute = 60 %).
  • 6-Carboxyphenanthridin (25) (662 mg, 3 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (14 ml) aufgelöst und auf 0 °C gekühlt. Es wurde p-Toluol-sulfonylchlorid (1,15 g, 6 mmol) und anschließend 2,6-Dimethyl-4-nitrophenol (501 mg, 3 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 4 °C stehengelassen. Die erhaltene braune Lösung wurde in geeistes Wasser gerührt. Der Niederschlag wurde abgefiltert und auf einem Silicagel unter Verwendung von Chloroform/Hexan (1:1) chromatographiert, um (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-phenanthridin-6-carboxylat (26) zu erhalten (Ausbeute = 60 %).
  • In einem trockenen 25 ml Zweihalsrundkolben wurde der Ester (26) (369 mg, 1 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (5 ml) suspendiert. Die Suspension wurde in einem Trockeneis/CCl4-Bad unter Stickstoff gekühlt. Chlorsulfonsäure (342 l, 6 mmol) wurde zugegeben, und mit dem Rühren wurde 30 Minuten bei –20 °C fortgefahren. Die Mischung wurde dann langsam auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und weitere 2 Stunden gerührt. Wasserfreier Ether (20 ml) wurde zugegeben, und die ausgefällten Feststoffe wurden gefiltert und mit Ether gewaschen. Die Trocknung ergab (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-N-methyl-phenanthridinium-6-carboxylatfluorosulfonat (27) (Ausbeute = 90 %).
  • Beispiel 8
  • Eine weitere Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-5,6-dihydro-N-methyl-phenanthridinium-6-carboxylatfluorosulfonat, das die folgende Formel hat:
    Figure 00400001
  • (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-5,6-dihydro-N-methyl-phenanthridinium-6-carboxylatfluorosulfonat wird von dem nichtreduzierten Phenanthridiniumanalog (27) synthetisiert. Das Phenanthridinium (27) (398 mg, 0,8 mmol) wurde in einer 1:1 Mischung von Acetonitril und 0,1M Phosphatpuffer, pH 5,2 (80 ml), aufgelöst. Eine Lösung von Natriumcyanoborohydrid (410 mg) in Acetonitril (10 ml) wurde der Phenanthridiniumlösung tröpfchenweise zugegeben. Dies führte zum Bleichen der gelben Farbe der Lösung. Mit dem Rühren wurde 15 Minuten fortgefahren. Acetonitril (100 ml) wurde zugegeben, und die Lösemittel wurden in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser suspendiert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Entfernung der Lösemittel ergab (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-5,6-dihydro-N-methyl-phenanthridinium-6-carboxylatfluorosulfonat (Ausbeute = 90 %).
  • Beispiel 9
  • Eine weitere Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl-phenyl)-2-phenyl-N-methyl-chinolinium-4-carboxylatfluorosulfonat, das die folgende Formel hat:
    Figure 00410001
  • (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl-phenyl)-2-phenyl-N-methyl-chinolinium-4-carboxylatfluorosulfonat wird nach dem folgenden Schema synthetisiert:
    Figure 00420001
  • Acetophenon (29) (120 g, 1 mol) und Isatin (30) (147 g, 1 mol) wurden 10 Stunden in Wasser und Ethanol mit Kaliumhydroxid (17 g) unter Rückfluß erwärmt. 2-Phenyl-chinolin-4-carbonsäure (31) wurde aus Ethanol in Form von weißen Nadeln gewonnen (Ausbeute 84 %).
  • 2-Phenyl-chinolin-carbonsäure (31) (735 mg, 3 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (14 ml) aufgelöst und in einem Eiswasserbad gekühlt. P-Toluolsulfonylchlorid (1,15 g, 6 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. 2,6-Dimethoxyphenol (462 mg, 3 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden gerührt. Die Lösung wurde in Eiswasser (300 ml) gegossen, und das (2,6-Dimethoxy)phenyl-2-phenyl-chinolin-4-carboxylat (32) wurde gefiltert. Die Feststoffe wurden getrocknet und auf einer Silicagel-Säule unter Verwendung von Chloroform/Hexan (1:1) (Ausbeute = 50 %) gereinigt.
  • Der Ester (32) (381 g, 1 mmol) wurde in wasserfreiem Methylenchlorid (3 ml) aufgelöst, und Methylfluorosulfat (492 1, 0,69 g, 6 mmol) wurde zugegeben. Nach 15-ständigem Rühren bei Raumtemperatur unter Stickstoff wurde wasserfreier Ether (20 ml) zugegeben. Das (2,6-Dimethoxy)phenyl-2-phenyl-chinolin-4-carboxylat-N-methylfluorosulfonat (33) wurde gefiltert und mit Ether gewaschen und getrocknet (Ausbeute = 95 %).
  • In einem trockenen, 25 ml Zweihalsrundkolben wurde der Ester (33) (200 mg, 0,4 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (5 ml) suspendiert. Die Suspension wurde in einem Trockeneis/CCl4-Bad unter Stickstoff gekühlt. Chlorschwefelsäure (144 1, 2 mmol) wurde zugegeben, und es wurde mit dem Rühren bei –20 °C 0,5 Stunden fortgefahren. Dann wurde die Mischung langsam auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und weitere 2 Stunden gerührt. Wasserfreier Ether (20 ml) wurde zugegeben, und das ausgefällte (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-2-phenyl-N-methyl-chinolinium-4-carboxylatfluorosulfonat (34) wurde gefiltert und mit Ether gewaschen und getrocknet (Ausbeute = 90 %).
  • Beispiel 10
  • Eine weitere Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-2-phenyl-1,4-dihydro-N-methyl-chinolin-4-carboxylat, das die folgende Formel hat:
    Figure 00440001
  • (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-2-phenyl-1,4-dihydro-N-methyl-chinolin-4-carboxylat wurde aus dem (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-2-phenyl-N-methyl-chinolinium-4-carboxylat durch Reduktion mit Natriumcyanoborohydrid synthetisiert. Das nichtreduzierte Chinolinium wurde durch dasselbe Verfahren wie die (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenylacridinium-Komponente, die zuvor beschrieben wurde, erhalten, wobei Acridin durch Chinolin substituiert war.
  • Der Chinoliniumester (500 mg, 0,9 mmol) wurde in einer 1:1 Mischung von Acetonitril und 0,1M Phosphatpuffer, pH 5,2 (80 ml), aufgelöst. Eine Lösung von Natriumcyanoborohydrid (56 mg, 0,9 mmol) in Acetonitril/Puffer-Mischung (10 ml) wurde zugegeben. Nach 2-minütigem Rühren wurde die Mischung auf pH 2,0 angesäuert und Acetonitril (100 ml) wurde zugegeben. Die Lösemittel wurden in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser suspendiert und mit Ethylacetat extrahiert. Das Trocknen und Verdampfen des Ethylacetats ergab (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-2-phenyl-1,4-dihydro-N-methyl-chinolin-4-carboxylat (Ausbeute = 70 %).
  • Beispiel 11
  • Eine weitere Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-2-phenyl-1,2,3,4-tetrahydro-N-methyl-chinolin-4-carboxylat, das die folgende Formel hat:
    Figure 00450001
  • (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-2-phenyl-1,2,3,4-tetrahydro-N-methyl-chinolin-4-carboxylat wurde aus dem (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-2-phenyl-N-methyl-chinolinium-4-carboxylat durch Reduktion mit Natriumcyanoborohydrid synthetisiert. Das nichtreduzierte Chinolinium wurde durch dasselbe Verfahren wie die (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenylacridinium-Verbindung, die zuvor beschrieben wurde, erhalten, wobei Acridin durch Chinolin substituiert war.
  • Der Chinoliniumester (500 mg, 0,9 mmol) wurde in einer 1:1 Mischung von Acetonitril und 0,1M Phosphatpuffer, pH 5,2 (80 ml), aufgelöst. Eine Lösung von Natriumcyanoborohydrid (560 mg, 9,0 mmol) in Acetonitril/Puffer-Mischung (20 ml) wurde zugegeben. Nach 30-minütigem Rühren wurde die Mischung mit 0,1N Salzsäure auf pH 2,0 angesäuert und weitere 5 Minuten gerührt. Acetonitril (100 ml) wurde zugegeben, und die Lösemittel wurden in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser suspendiert und mit Ethylacetat extrahiert. Das Trocknen und Verdampfen des Ethylacetats ergab (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-2-phenyl-1,2,3,4-tetrahydro-N-methyl-chinolin-4-carboxylat (Ausbeute = 80 %).
  • Beispiel 12
  • Eine weitere bevorzugte Komponente der vorliegenden Erfindung ist (2,6-Dimethyl-4-trimethylammonio)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatdifluorosulfonat, das die folgende Formel hat:
  • Figure 00460001
  • (2,6-Dimethyl-4-trimethylammonio)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatdifluorosulfonat wird nach dem folgenden Schema synthetisiert:
    Figure 00470001
  • (2,6-Dimethyl-4-trimethylammonio)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat (35) wurde durch Veresterung von Acridin-9-carbonsäure mit 2,6-Dimethyl-4-nitrophenol (36) erhalten. Das Produkt (37) wurde mit Zink auf das (2,6-Dimethyl-4-amino)phenyl-acridin-9-carboxylat (38) reduziert. Zwei Methylgruppen wurden an der Aminogruppe durch Behandlung mit Methyliodid eingeführt. Die Quaternisierung und Acridiniumbildung wurden dann unter Verwendung von Methylfluorosulfat erreicht. Diese Reaktionen sind in der Folge ausführlicher beschrieben.
  • Acridin-9-carbonsäure (35) (3,05 g, 0,014 mol) wurde in einem 250 ml Rundkolben mit Thionylchlorid (65 ml) gemischt, und die Mischung wurde unter Rühren 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Das überschüssige Thionylchlorid wurde in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde mit Benzol (75 ml) behandelt, und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, um Spuren von Thionylchlorid zu entfernen. Der Rückstand von Acridin-9-carbonylchlorid wurde mit Pyridin (65 ml) gemischt, und 2,6-Dimethyl-4-nitrophenol (36) (2,25 g, 0,014 mol) wurde zugegeben. Die Mischung wurde unter Verwendung eines Wasserbades (etwa 60 °C) zur Auflösung aller Feststoffe erwärmt. Nach 15-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung in 1 Liter Wasser gegossen. Die Suspension wurde mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2,0 angesäuert. Das feste Produkte wurde gefiltert, mit Wasser gewaschen und in Chloroform aufgelöst. Das Trocknen (wasserfreies Natriumsulfat) und die Verdampfung von Chloroform ergab den rohen Ester.
  • Der rohe Ester wurde auf einer Silicagel-Säule unter Verwendung von CHCl3/EtOAc 98:2 als Lösemittel chromatographiert. Die Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,6 bei TLC mit demselben Lösemittel wurden gepoolt, und die Verdampfung der Lösemittel ergab reines (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-acridin-9-carboxylat (37) (Ausbeute = 30 %).
  • Der (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenylester (37) (1,16 g, 3,1 mmol) wurde in Essigsäure (50 ml) durch Erwärmen in einem Ölbad bei etwa 65 °C aufgelöst. Zinndichlorid (1,5 g) wurde in konzentrierter Salzsäure (10 ml) aufgelöst und der Esterlösung zugegeben. Die Mischung wurde 45 Minuten gerührt und dann in Wasser (750 ml) gegossen. Die Extraktion mit Chloroform (3 × 200 ml) entfernte nicht reagierten (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenylester. Die wäßrige Schicht wurde mit Natriumbicarbonat alkalisch gemacht und wurde mit Chloroform (4 × 200 ml) extrahiert. Das Trocknen und Verdampfen des Chloroforms ergab (2,6-Dimethyl-4-amino)phenyl-acridin-9-carboxylat (38) (Ausbeute = 25 %).
  • Der Aminoester (38) (64 mg, 0,18 mmol) wurde in Nitromethan (5 ml) aufgelöst. Methyliodid (1 ml) und Pyridin (0,1 ml) wurden zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden gerührt. Methanol (2 ml) wurde zugegeben, und die Mischung wurde dann weitere 2 Stunden gerührt. Die Lösemittel wurden verdampft, und der Rückstand wurde mit Wasser (10 ml) behandelt und wurde dann mit Chloroform extrahiert (4 × 20 ml), nachdem die Lösung alkalisch gemacht wurde. Das Trocknen und Verdampfen des Chloroforms ergab (2,6-Dimethyl-4-dimethylamino)phenyl-acridin-9-carboxylat (39) (Ausbeute = 50 %).
  • Der Dimethylaminoester (39) (154 mg, 0,41 mmol) wurde in Methylenchlorid (2 ml) aufgelöst. Methylfluorosulfat (265 1, 3,28 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden gerührt. Wasserfreier Ether (15 ml) wurde zugegeben, und die ausgefällten Feststoffe wurden gefiltert und mit Ether gewaschen. Die Trocknung ergab (2,6-Dimethyl-4-trimethylammonio)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat (40) (Ausbeute = 50 %). MS: FAB, Thioglycerolmatrix, m/e 400 (M+).
  • MARKIERUNG VON PROTEIN UND ANDEREM MATERIAL MIT CHEMILUMINESZIERENDEN KOMPONENTEN
  • Beispiel 13
  • Ein Konjugat der vorliegenden Erfindung umfaßt Progesteron, das an ein (3-D-Thioglucose-Addukt von (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat gebunden ist. Das Progesteronkonjugat des β-D-Thioglucose-Addukts von (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat hat die folgende Formel:
    Figure 00500001
  • Das Progesteronkonjugat wird nach dem folgenden Schema synthetisiert:
    Figure 00510001
    Figure 00520001
  • 3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzamid (35) (3,0 g, 15,2 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (15 ml) aufgelöst, und die Lösung wurde in einem Trockeneis/CCl4-Bad gekühlt. Acetylchlorid (1,4 ml, 1,54 g, 19,7 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden fortgesetzt gerührt. Methanol (1 ml), und Wasser (5 ml) wurden zugegeben, und die Lösemittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser (50 ml) behandelt, das mit verdünnter Salzsäure angesäuert war, und wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Waschen mit Wasser, Trocknen und Verdampfen des Ethylacetats ergab 2,6-Dimethoxy-4-carbozamidophenylacetat (36) (2,2 g), das aus Ethylacetat rekristalliert wurde (Ausbeute = 60 %).
  • Das Phenylacetat (36) (1,27 g, 5,33 mmol) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (125 ml) aufgelöst. Diboranlösung in THF (1,0M, 10,9 ml 10,9 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde 4 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Wasser (2 ml) und Salzsäure (1,0N, 5 ml) zugegeben. Nach 30-minütigem Rühren wurden die Lösemittel in Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Chloroform extrahiert. Das Chloroform wurde dann getrocknet und unter Vakuum entfernt. 2,6-Dimethoxy-4-aminomethylphenol (37) wurde in dem nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
  • Einer Lösung des rohen Amins (37) in wasserfreiem Pyridin (10 ml) wurde Benzylchloroformat (1,050 ml, 1,25 g, 7,3 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser (5 ml) wurde zugegeben, und die Lösemittel wurden unter Vakuum entfernt. Dem Rückstand wurde Wasser (30 ml) zugegeben, und die Mischung wurde mit verdünnter HCl angesäuert. Die Extraktion mit Ethylacetat, das Waschen mit Wasser, das Trocknen, und Verdampfen des Lösemittels ergab 2,6-Dimethoxy-4-(benzyloxycarbonylamino)methylphenol (38) als Öl (Ausbeute = insgesamt 70 %).
  • Acridin-9-carbonsäure (754 mg, 3,38 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (14 ml) aufgelöst. P-Toluolsulfonylchlorid (1,28 g, 6,76 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt. 2,6-Dimethoxy-4-(benzyloxycarbonylamino)methylphenol (38) (1,18 g, 3,76 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden gerührt. Wasser (10 ml) wurde zugegeben, und die Lösemittel wurden unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst, und die Chloroformschicht wurde der Reihe nach mit Wasser, 0,1N HCl und Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Das Trocknen und Verdampfen von Chloroform ergab den rohen Ester, der auf einer Silicagel-Säule unter Verwendung von CHCl3/Ethylacetat, 1:1, als Lösemittel chromatographiert wurde. Das Verdampfen der Lösemittel aus den gepoolten Fraktionen ergab [2,6-Dimethoxy-4-(benzyloxycarbonylamino)methyl]phenyl-acridin-9-carboxylat (39) (Ausbeute = 22 %).
  • Das Acridin (39) (296 mg, 0,57 mmol) wurde in wasserfreiem Methylenchlorid (5 ml) aufgelöst. Methylfluorosulfat (2771, 3,4 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden gerührt. Wasserfreier Ether (25 ml) wurde zugegeben, und das ausgefällte [2,6-Dimethoxy-4-(benzyloxycarbonylamino) methyl]phenyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (40) wurde gefiltert und mit Ether gewaschen und getrocknet (Ausbeute = 99 %).
  • Das Acridinium (40) (107 mg, 0,169 mmol) wurde in wasserfreiem Methylenchlorid (2 ml) suspendiert. Chlorschwefelsäure (53 l, 92 mg, 0,797 mmol) wurde zugegeben, nachdem der Kolben in einem Trockeneis/CCl4-Bad gekühlt worden war. Es wurde 30 Minuten gerührt, und das Bad wurde entfernt. Nach weiterem Rühren bei Raumtemperatur über 1,5 Stunden wurde wasserfreier Ether (20 ml) zugegeben. Das ausgefällte Produkt wurde gefiltert und unter Vakuum getrocknet. Das (2,6-Dimethoxy-4-aminomethyl-3-chlorosulfonyl)phenyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (41) wurde direkt in der nächsten Reaktion verwendet.
  • Das Sulfonylchlorid (41) (129 mg) wurde bei Raumtemperatur in einer Mischung von Methanol (12,5 ml) und Wasser (12,5 ml) 3 Stunden gerührt. Acetonitril (35 ml) wurde zugegeben, und die Lösemittel wurden verdampft. Der Rückstand wurde in Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Das (2,6-Dimethoxy-4-aminomethyl-3-oxosulfonyl)phenyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat (42) wurde direkt für die nächste Reaktion verwendet. Progesteronhemisuccinat (90 mg, 0,209 mmol), und N-Methylmorpholin (221, 209 mmol) wurde in wasserfreiem DMF (2 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde in einem Trockeneis/CCl4-Bad abgekühlt, und Isobutylchloroformat (30 l, 0,229 mmol) wurde zugegeben. Nach 2 Minuten wurde eine Lösung des Acridinium (42) (101 mg, 0,143 mmol) in Dimethylsulfoxid (2 ml), das N-Methylmorpholin (3,141, 0,28 mmol) enthielt, zugegeben. Mit dem Rühren wurde 10 Minuten bei –20 °C fortgefahren, und das Kühlbad wurde entfernt. Nach 7-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurden 3 Tropfen Wasser zugegeben. Die Lösemittel wurden unter Vakuum entfernt, und Ethylacetat wurde dem Rückstand zugegeben. Der ölige Niederschlag wurde wiederholt mit Ethylacetat gewaschen. Beim Triturieren mit Acetonitril (2 ml) wurde das Öl in Form von Feststoffen abgetrennt. Das Produkt wurde auf HPLC unter Verwendung einer C18 Dynamax halbpräparativen Säule (10 mm × 250 mm) (im Handel von Rainin Instrument Co., Inc., Woburn, Massachusetts erhältlich) unter Verwendung von CH3CN/H2O (0,1 Trifluoressigsäure), 55,45, als mobile Phase bei einer Strömungsrate von 2,75 ml/min gereinigt. Der Peak, der bei der Retentionszeit von 6,00 Minuten erschien, wurde gesammelt. Das Verdampfen der Lösemittel ergab das Konjugat (43) (Ausbeute = 30 %). MS: FAB, Thioglycerolmatrix, 895 (M+, ohne Gegenionen).
  • Das Progesteronkonjugat (43) (1,1 mg) in einer Mischung von CH3CN (1 ml), und H2O (200 l) wurde mit β-D-Thioglucose (0,29 mg) als Lösung in Wasser (721) behandelt. Nach 10 Minuten wurden die Lösemittel unter Vakuum vollständig entfernt, um das oben dargestellte β-D-Thioglucose-Addukt zu erhalten.
  • Beispiel 14
  • Das folgende Verfahren zum Anlagern an Protein ist allgemein bei den Komponenten der vorliegenden Erfindung anwendbar.
  • Maus-IgG (Sigma, 1 mg) wurde in 0,9 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 8,0, 150 mM) aufgelöst. Die Lösung wurde dann in drei gleiche Teile von 0,33 mg/0,3 ml (0,0022 mol) geteilt. Etwa 0,3 mg einer Komponente der vorliegenden Erfindung wurden in etwa 0,4 ml DMF aufgelöst, um 0,022 mol der Komponente in 15 l DMF zu erhalten.
  • 0,022 mol der Verbindung der vorliegenden Erfindung wurden mit 0,0022 mol IgG in einem Kunststoff-Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. Nach 15 Minuten wurden weitere 0,022 mol der Verbindung dem Mikrozentrifugenröhrchen zugegeben (das Molverhältnis von Verbindung zu Protein betrug 20:1). Nach weiteren 15 Minuten wurden überschüssige Mengen der Verbindung der vorliegenden Erfindung mit Lysin-HCl-Lösung (10 l in 100 mM pi-Puffer, pH 8,0) 15 Minuten gelöscht.
  • Als Alternative wurden Teilmengen von 0,0055 mol der Verbindung der vorliegenden Erfindung anstelle von 0,022 mol verwendet (das Molverhältnis von Verbindung zu Protein betrug 5:1).
  • Biorad-Glassäulen (1 cm × 50 cm) (im Handel von Biorad, Chemical Division, Richmond, Kalifornien, erhältlich) wurden mit zuvor gequollenem und entlüftetem Sephadex® G-50-80 in Phosphatpuffer (100 mM, pH 6,3, 150 mM NaCl, 0,001 % TMS) auf ein Bettvolumen von 45 ml gepackt. Die Reaktionslösung wurde mit einer Strömungsrate von 0,3–0,4 ml/min durch die Säulen laufen gelassen. 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Markierte Proteinfraktionen wurden durch Verdünnen von 20 l jeder Fraktion auf 1 ml und Bestimmen der Chemilumineszenz, die mit 30 l der verdünnten Lösung erzeugt wurde, nachgewiesen. Markierte Fraktionen wurden dann gepoolt.
  • Die gepoolten Konjugatfraktionen wurden zur Verbesserung der Reinheit des immunraktionsfähigen Konjugates dialysiert. Die gepoolten Fraktionen wurden gegen 500 ml, pH 6,3, Phosphatpuffer (100 mM, pH 6,3, 150 mM NaCl, 0,001 % TMS) über einen Zeitraum von 24 Stunden mit dreifachem Puffertausch dialysiert.
  • Beispiel 15
  • Komponenten, die einen nichtreduzierten heterocylischen Ring oder ein derartiges Ringsystem enthalten, können in ihre äquivalenten reduzierten Formen umgewandelt werden, während solche nichtreduzierten Komponenten an Protein oder anderes Material angelagert sind. Dies kann durch Verwendung eines Reduktionsmittels wie Natriumcyanoborohydrid erreicht werden. Das Verfahren zur Reduktion eines Acridinium/IgG-Konjugates ist in der Folge beschrieben. Dasselbe Verfahren ist bei der Reduktion anderer Konjugate anwendbar.
  • Das IgG, das mit einem repräsentativen Acridinium (100 g) in Phosphatpuffer (400 l) (pH 6,0, 100 mM, 150 mM, NaCl, 0,001 % Thimerosal) markiert war, wurde mit einer frisch zubereiteten Lösung (10 l) behandelt, die Natriumcyanoborohydrid (10–7 mol) enthielt. Nach zwei Stunden Inkubation bei Raumtemperatur ist die Umwandlung des Acridiniummarkers an dem Antikörper zu Acridan vollendet, wie aus den UV-VIS-Spektren hervorgeht, die das Erscheinen einer Bande bei 280 nm und das Verschwinden der Bande bei 360 nm anzeigen. Diese reduzierten Formen behielten alle ihre immunologischen Eigenschaften.
  • TESTPROTOKOLLE
  • Beispiel 16
  • 1. Bestandteile
    • A) Markierter Antikörper (Konjugat): Affinitätsgereinigtes Kaninchen-Anti-Prolactin, konjugiert an (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat. Lagerpuffer: 10 mM Phosphatpuffer, 100 mM NaCl, pH 6,0, 0,001 % Thimerosal, 0,4 % BSA.
    • B) Anlagerungsantikörper: Kaninchen-Anti-Prolactin (6 g/ml) als Festphase auf Nunc-Röhrchen (im Handel von Midland Scientific, Roseville; Minnesota, erhältlich).
    • C) Beschichtete Festphasenröhrchen: Getrocknete Nunc-Röhrchen wurden wie folgt hergestellt: 1) 0,3 ml des Anlagerungsantikörpers pro Röhrchen bei 6 g/ml in PBS-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2–7,4, 10 mM Phosphat, 100 mM NaCl, 10 mM NaN3) wurden in Nunc-Röhrchen pipettiert. 2) Die Röhrchen wurden 18–24 Stunden inkubiert. 3) Die Röhrchen wurden zweimal mit dem PBS-Puffer gewaschen. 4) Die Röhrchen wurden mit 2,0 % BSA in PBS-Puffer blockiert. Inkubation über ≤ 4 Stunden bei Raumtemperatur. 5) Die Röhrchen wurden dreimal mit PBS-Puffer gewaschen. 6) Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur getrocknet. 7) Die Röhrchen wurden in Plastikgefrierbeuteln bei 4 °C gelagert.
    • D) Standards: Hergestellt in Pferdeserum 0, 5, 30, 100 und 200 ng/ml/ml.
  • 2. Testprotokoll
    • 1) 25 l der Probe oder des Standards wurden in die antikörperbeschichteten Röhrchen pipettiert.
    • 2) 100 l markierter Antikörper wurden zugegeben.
    • 3) Die Röhrchen wurden sanft gewirbelt.
    • 4) Die Röhrchen wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubiert.
    • 5) Die Röhrchen wurden dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen.
    • 6) Die Chemilumineszenz wurde 2 Sekunden (Pumpe 1: 0,1N HNO3 + 0,25 % H2O2; Pumpe 2: 0,25N NaOH + 0,125 % CTAC) in einem LumaTagTM Analysator (im Handel von London Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota erhältlich) gezählt.
  • Beispiel 17
  • 1. Bestandteile
    • A) Progesteronkonjugat des β-D-Thioglucose-Adduktes von (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat: 20 pg/ml Progesteronkonjugat in Phosphatpuffer (pH 6,0, 100 mM Phosphat, 150 mM Na Cl, 0,1 % Humanserumalbumin, 0,001 % Thimerosal).
    • B) Primärer Antikörper: Kaninchen-Anti-Progesteron (Cambridge Medical Diagnostics) in Phosphatpuffer (pH 6,0, 200 mM Phosphat, 150 mM NaCl, 0,1 % Humanserumalbumin, 0,01 % CHAPS, 5 g Danazol).
    • C) Beschichtete Festphasenröhrchen: Getrocknete Nunc-Röhrchen, beschichtet mit 2,5 g Ziegen-Anti-Kaninchen-fc und blockiert mit 0,5 % BSA. Die Röhrchen wurden wie folgt hergestellt: 1) Die Röhrchen wurden 1 Stunde mit 2,5 g/ml Ziegen-Anti-Kaninchen-fc (500 l) bei Raumtemperatur inkubiert. 2) Die Röhrchen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. 3) Die Röhrchen wurden sofort 3 Stunden mit 0,5 % BSA (500 l) bei Raumtemperatur inkubiert. 4) Die Röhrchen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. 5) Die Röhrchen wurden über Nacht bei 40 % relativer Feuchtigkeit bei Raumtemperatur getrocknet. 6) Die Röhrchen wurden in Plastikgefrierbeuteln bei 4 °C gelagert.
    • D) Serummatrix: Antech-Rinderserum
    • E) Standards: 0, 0,13, 0,38, 1,31, 7,31, 16,6 und 37,0 ng/ml.
  • 2. Testprotokoll
    • 1) 50 l Probe oder Standard wurden in die antikörperbeschichteten Röhrchen pipettiert.
    • 2) 100 l Konjugatpuffer wurden zugegeben.
    • 3) 100 l Primärantikörperpuffer wurden zugegeben.
    • 4) Die Röhrchen wurden sanft gewirbelt.
    • 5) Die Röhrchen wurden 2 Stunden bei 37 °C inkubiert.
    • 6) Die Röhrchen wurden dekantiert und mit 150 mM NaCl in 0,1 % Tween (1 ml) und dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
    • 7) Die Röhrchen wurden umgedreht und ablaufen gelassen.
    • 8) Die Chemilumineszenz wurde 2 Sekunden (Pumpe 1: 0,1N HNO3 + 0,25 % H2O2; Pumpe 2: 0,25N NaOH + 0,125 % CTAC) in einem LumaTagTM Analysator (im Handel von London Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota, erhältlich) gezählt.
  • Beispiel 18
  • 1. Bestandteile
    • A) Markierter Ab: Affinitätsgereinigtes Ziegen-Anti-TSH, konjugiert an (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat.
    • B) Lagerpuffer: 100 mM Phosphat, 0,145M NaCl, 0,001 % Thimerosal, 0,4 % BSA, 0,1 mg/ml Maus-Globuline und 0,1 mg/ml Ziegen-Globuline, pH 6,0.
    • C) Anlagerungsantikörper: Monoklonales Anti-TSH (2 g/ml) als Festphase auf Nunc-Röhrchen. Verfahren zur Herstellung von Festphasen-Nunc-Röhrchen: 1) 0,4 ml des Anlagerungsantikörpers bei 2 g/ml in PBS-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2–7,4, 10 mM Phosphat, 100 mM NaCl, 10 mM NaN3) wurden jedem Röhrchen zugegeben. 2) Die Röhrchen wurden 18–24 Stunden inkubiert. 3) Die Röhrchen wurden dreimal mit dem PBS-Puffer gewaschen. 4) Die Röhrchen wurden mit 2,0 % BSA in PBS-Puffer blockiert. Inkubation über ≤ 4 Stunden bei Raumtemperatur. 5) Die Röhrchen wurden dreimal mit PBS-Puffer gewaschen. 6) Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur getrocknet. 7) Die Röhrchen wurden in Plastikgefrierbeuteln bei 4 °C gelagert.
    • D) Standards: Hergestellt in Pferdeserum 0, 0,5, 2,5, 10, 25 und 100 IE/ml.
    • E) 2. Testprotokoll 1) 200 l der Probe wurden in die beschichteten Röhrchen pipettiert. 2) 100 l markierter Antikörper wurden zugegeben. 3) Die Röhrchen wurden sanft gewirbelt. 4) Die Röhrchen wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttelapparat inkubiert. 5) Die Röhrchen wurden unter Verwendung eines Biotomic-Waschapparates (im Handel von Ocean Scientific, Inc., Garden Grove, Kalifornien, erhältlich) gewaschen. 6) Die Chemilumineszenz wurde 2 Sekunden (Pumpe 1: 0,1N HNO3 + 0,25 % H2O2; Pumpe 2: 0,25N NaOH + 0,125 % CTAC) in einem LumaTagTM Analysator (im Handel von London Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota, erhältlich) gezählt.
  • Beispiel 19
  • 1. Bestandteile
    • A) Markierter Ab: Affinitätsgereinigtes Kaninchen-Anti-Prolactin, konjugiert an (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat. Lagerpuffer: 10 mM Phosphatpuffer, 100 mM NaCl, pH 6,0, 0,001 % Thimerosal, 0,4 % BSA.
    • B) Anlagerungsantikörper: Kaninchen-Anti-Prolactin (6 g/ml) als Festphase auf Nunc-Röhrchen.
    • C) Beschichtete Festphasen-Röhrchen: Getrocknete Nunc-Röhrchen wurden wie folgt hergestellt: 1) 0,3 ml des Anlagerungsantikörpers pro Röhrchen bei 6 g/ml in PBS-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2–7,4, 10 mM Phosphat, 100 mM NaCl, 10 mM NaN3) wurden in Nunc-Röhrchen pipettiert. 2) Die Röhrchen wurden 18–24 Stunden inkubiert. 3) Die Röhrchen wurden zweimal mit dem PBS-Puffer gewaschen. 4) Die Röhrchen wurden mit 2,0 % BSA in PBS-Puffer blockiert. Inkubation über ≤ 4 Stunden bei Raumtemperatur. 5) Die Röhrchen wurden dreimal mit PBS-Puffer gewaschen. 6) Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur getrocknet. 7) Die Röhrchen wurden in Plastikgefrierbeuteln bei 4 °C gelagert.
    • D) Standards: Hergestellt in Pferdeserum 0, 5, 30, 100 und 200 ng/ml/ml.
  • 2. Testprotokoll
    • 1) 25 l der Probe oder des Standards wurden in die antikörperbeschichteten Röhrchen pipettiert.
    • 2) 100 l markierter Antikörper wurden zugegeben. 3) Die Röhrchen wurden sanft gewirbelt.
    • 4) Die Röhrchen wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubiert.
    • 5) Die Röhrchen wurden dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen.
    • 6) Die Chemilumineszenz wurde 2 Sekunden (Pumpe 1: 0,1N HNO3 + 0,25 % H2O2; Pumpe 2: 0,25N NaOH + 0,125 % CTAC) in einem LumaTagTM Analysator (im Handel von London Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota, erhältlich) gezählt.
  • STABILITÄTSSTUDIEN
  • Gemäß den folgenden Stabilitätsstudien werden die Komponenten und Konjugate der vorliegenden Erfindung vorzugsweise bei einem pH zwischen etwa 6,5 und 7,5 gelagert und in Tests verwendet. Die Komponenten und Konjugate weisen bei anderen pH-Werten unter gewissen Bedingungen eine erhöhte Stabilität auf; die Erhöhung ist jedoch in dem bevorzugten pH-Bereich nicht von den Bedingungen abhängig.
  • Beispiel 20
  • Die Vergleichsstabilität wurde durch einen Vergleich der Anzahl von Tagen (t1/2) bestimmt, in welchen eine Komponente 50 % ihrer Chemilumineszenz einbüßte. Die Stabilität bestimmter Komponenten, die nicht an Protein oder anderes Material gebunden waren, wurde bei Raumtemperatur und bei 4 °C aufgezeichnet. Die Komponenten wurden in Puffer (pH 6,0, 50 mM pi, 0,1 % BSA) gelagert. (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-methylacridinium-9-carboxylatfluorosulfonat zeigte keinen nennenswerten Verlust an Zählungen nach 98 Tagen sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 4 °C. (2,6-Isopropyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methylacridinium-9-carboxylatfluorosulfonat zeigte keinen nennenswerten Verlust an Zählungen nach 312 Tagen bei Raumtemperatur und bei 4 °C. Für (2,6-Dimethyl-4-trimethylammonio)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatdifluorosulfonat betrug t1/2 105 Tage bei Raumtemperatur, und t1/2 konnte bei 4 °C nach 105 Tagen nicht erreicht werden. Für (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat betrug t1/2 50 Tage bei Raumtemperatur. t1/2 konnte bei 4 °C nach 130 Tagen nicht erreicht werden. Für (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl-4-propion)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat betrug t1/2 24 Tage bei Raumtemperatur und > 95 Tage bei 4 °C. Für (2,6-Dimethyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat betrug t1/2 50 Tage bei Raumtemperatur. Im Vergleich dazu hatten die Komponenten, welche die Substitutionen der Komponenten der vorliegenden Erfindung nicht aufwiesen, einen durchschnittlichen t1/2-Wert von weniger als 8 Tagen bei Raumtemperatur und etwa 32 Tagen bei 4 °C.
  • Beispiel 21
  • Die Vergleichsstabilität der Phenyl-, (2,6-Dimethyl) phenyl-, und (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-, (2,6-Dimethyl-3-chlorosulfonyl)phenyl-, (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-, (2,6-Dimethyl-4-trimethylammonio)phenyl-, und (2,6-Dimethyl-4-bromo)phenyl-N-methylacridiniumester wurde in Phosphatpuffer (100 mM pi, 150 mM NaCl, 0,001 % Thimerosal, 0,005 % Humanserumalbumin) bei pH 6,3 und pH 8,0 während einer Inkubation bei 35 °C und 45 °C beobachtet.
  • Alle substituierten Phenylverbindungen, mit Ausnahme der (2,6-Dimethyl)phenylverbindung, zeigten eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu der blanken Verbindung. Die (2,6-Dimethyl)phenylverbindung war bei pH 6,3 bei 35 °C weniger stabil als die blanke Phenylverbindung, zeigte aber eine erhöhte Stabilität bei pH 8,0 bei 35 °C und bei beiden pH-Werten bei 45 °C.
  • Beispiel 22
  • Die Stabilität von (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat und (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-Maus IgG-Konjugaten wurde bei verschiedenen Temperaturen und pH-Werten untersucht und mit der Stabilität von 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugaten verglichen. 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat hat die folgende Formel:
    Figure 00630001
  • 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat unterscheidet sich von den Verbindungen der vorliegenden Erfindung darin, daß es keine elektronenziehende Gruppe oder 2,6-Substitutionen am Phenylring aufweist. 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat wurde in der Literatur veröffentlicht und wird weitgehend in Chemilumineszenz-Anwendungen eingesetzt.
  • Wie in der Folge dargestellt, ist ein Verlust an Zählungen in einem bestimmten Konjugat durch die Hydrolyse der Esterbindung in dem chemilumineszierenden Marker bedingt. Daher nimmt mit sinkender Stabilität der markierenden Verbindung die Verlustrate der Zählungen in dem Konjugat ab.
  • Maus IgG-Konjugate von (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat, (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat und 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat wurden bei 4 °C gelagert. Die Konjugate wurden in drei verschiedenen Pufferlösungen bei pH 6,3, 7,3 und 8,0 gelagert.
  • Der erste Puffer enthielt 100 mM pi, 150 mM NaCl, 0,001 % Thimerosal, 0,1 % Humanserumalbumin, 20 mg/l Schaf IgG ("Standardphosphatpuffer").
  • Der zweite Puffer war ein Standardphosphatpuffer ohne Schaf IgG.
  • Der dritte Puffer war ein Standardphosphatpuffer ohne Schaf IgG und mit 0,1 Rinderserumalbumin anstelle des Humanserumalbumins.
  • In jedem Puffer und bei jedem pH zeigten (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat- und (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugate eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugat.
  • Maus IgG-Konjugate von (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat, (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat und 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat wurden bei Raumtemperatur (etwa 23 °C) ("RT") und bei 37 °C gelagert. Die Konjugate wurden in Standardphosphatpuffer bei pH 6,3, 7,3 und 8,0 gelagert.
  • Bei jedem pH und bei Raumtemperatur und 37 °C zeigten (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat- und (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugate eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugat.
  • (2,6-Dimethyl-4-vitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-, (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat- und 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acrtdinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugate wurden bei 37 °C in Azidpuffer (50 mM pi, 100 mM NaCl, 0,1 % Rinderserumalbumin, 10 mM Natriumazid) bei pH 6,9, 7,0 7,3 und 3,0 gelagert.
  • Bei pH-Werten über 7,3 zeigten sowohl (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat- als auch (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugate eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugat. Bei pH 6,9 und 7,0 zeigt nur das (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methylacridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugat eine erhöhte Stabilität. Das (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugat war nicht signifikant stabiler als das 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugat bei pH 6,9 und 7,0.
  • (2,6-Dimethyl-4-vitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-, (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat- und 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugate wurden bei 37 °C in Azidpuffer bei pH 6,3 gelagert.
  • (2,6-Dimethyl-4-vitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-, und 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugate wurden bei Raumtemperatur und 4 °C in Azidpuffer bei pH 5,9 gelagert.
  • Bei pH-Werten unter 6,3 bei 37 °C zeigten sowohl (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat- als auch (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugate eine verringerte Stabilität im Vergleich zu 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl- acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugat. Bei pH 5,9 bei Raumtemperatur und 4 °C zeigte das (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-3-(3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugat eine verringerte Stabilität im Vergleich zu 4-(2-Succinimidylcarboxyethyl)-phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatfluorosulfonat-IgG-Konjugat.
  • Beispiel 23
  • Die Vergleichsstabilität der Phenyl-, (2,6-Dimethyl) phenyl- und (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-N-methyl-acridanester wurde in Phosphatpuffer (100 mM pi, 150 mM NaCl, 0,001 % Thimerosal, 0,005 % Humanserumalbumin) bei pH 6,3 und pH 8,0, während einer Inkubation bei 35 °C und 45 °C beobachtet.
  • Die (2,6-Dimethyl)phenyl- und (2,6-Dimethyl-4-nitro)phenyl-Verbindungen zeigten eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu den blanken Phenylverbindungen.
  • WEITERE CHEMILUMINESZIERENDE KOMPONENTE
  • Beispiel 24
  • Eine bevorzugte, chemilumineszierende Komponente der vorliegenden Erfindung mit einer RnX-Gruppe an dem Kohlenstoff, an dem die Esterbindung angelagert ist, ist (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat, das die folgende Formel hat:
    Figure 00660001
  • (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat wird aus (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium- 9-carboxylat durch zwei alternative Verfahren synthetisiert, die in der Folge beschrieben sind.
  • 1. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
  • Eine C18-Säule (Rainin, Dynamax 60Å, 250 mm × 10 mm) wurde mit einer Mischung von Ethanol und Acetonitril (bis zu 10 %) äquilibriert, die etwa 0,05 % eines tertiären Amins (z.B., Triethylamin) enthielt. (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat wurde in der mobilen Phase aufgelöst und auf die Säule gespritzt. Die Hauptfraktion, die mit einer maximalen optischen Dichte bei 280 nm eluierte, wurde bei einer Strömungsrate von 2,0–2,5 ml/min gesammelt. Das Lösungsmittel wurde sofort unter Vakuum vollständig entfernt. Der Rückstand wurde dann mit einer geringen Menge Benzol zur Entfernung von Alkoholspuren und zur Entfernung von Feuchtigkeit aus dem Endprodukt, (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat, behandelt. Dieses HPLC-Verfahren ist das bevorzugte Syntheseverfahren, da es ein viel reineres Produkt liefert. Das HPLC-Verfahren kann jedoch für bestimmte Nucleophile nicht geeignet sein. Wenn das HPLC-Verfahren nicht funktioniert, kann das in der Folge beschriebene nucleophile Anionenverfahren angewendet werden.
  • 2. Behandlung der Ausgangsverbindung mit nucleophilem Anion
  • (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat (0,013 mmol, 7,5 mg) wurde in absolutem Ethanol (3 ml) unter Stickstoff aufgelöst. Eine Lösung von Kalium-t-butoxid in absolutem Ethanol (2 mg/ml) wurde (unter Verwendung einer gasdichten Spritze) der heftig gerührten (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylatlösung tropfenweise zugegeben, bis die gelbe Farbe der Lösung vollständig beseitigt war. Das Ethanol wurde dann unter Vakuum vollständig entfernt. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Ether (2 ml) und etwa 1 g wasserfreiem Natriumsulfat behandelt. Die Abtrennung der Etherlösung und das Verdampfen des Lösemittels ergab (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat als weißen Feststoff (2,5 mg).
  • (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-methoxy-9-carboxylat wurde unter Verwendung beider synthetischer Verfahren, sowohl der HPLC als auch des nucleophilen Anionenverfahrens, aus (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat hergestellt. (2,6-Dimethyl-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-methoxy-9-carboxylat wurde unter Verwendung des synthetischen, nucleophilen Anionenverfahrens aus (2,6-Dimethyl-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat hergestellt.
  • 3. Andere Synthesen
  • Beide synthetischen Verfahren, die zuvor beschrieben wurden, können zur Herstellung jeder der Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer RnX-Gruppe verwendet werden. Wenn ein anderes Nucleophil als Ethanol die RnX-Gruppe spenden soll, wird das gewünschte Nucleophil anstelle von Ethanol in den synthetischen Verfahren verwendet. Wenn ein anderes Acridinium, Phenanthridinium usw. gewünscht ist, kann die Verbindung, welcher die RnX-Gruppe hinzugefügt werden soll, das (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat in den zuvor beschriebenen, synthetischen Verfahren ersetzen. In vielen Fällen erfordert eine Änderung des Nucleophils auch eine Änderung des Lösemittels (z.B., wenn Methanol das gewünschte Nucleophil ist, kann Ethanol wegen der Konkurrenz bei der Anlagerung nicht als Lösemittel verwendet werden). In solchen Fällen kann das neue Nucleophil als Ersatzlösemittel verwendet werden, falls zutreffend, oder es kann statt dessen ein nichtnucleophiles, nichtprotisches Lösemittel (z.B. THF) verwendet werden.
  • Andere synthetische Verfahren, einschließlich der Behandlung mit einem nucleophilen Lösemittel, ohne aber darauf beschränkt zu sein, können ebenso zur Herstellung von Komponenten mit einer RnX-Gruppe verwendet werden.
  • Beispiel 25
  • Die Durchführbarkeit der synthetischen Verfahren, die in Beispiel 24 beschrieben sind, wurde durch Analyse der Produkte durch UV-VIS-Spektroskopie, Massenspektroskopie durch Beschuß mit schnellen Atomen, und 300 MHz Proton-NMR bestätigt.
  • Beispiel 26
  • (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat wurde als Marker in einem Test auf TSH wie folgt verwendet:
  • 1. Bestandteile
    • A) Markierter Ab: Affinitätsgereinigtes Ziegen-Anti-TSH wurde an (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat wie folgt konjugiert: eine Lösung des Ziegen-Anti-TSH-Antikörpers (etwa 100 μg) in Bicarbonatpuffer (0,1M, pH 9,6) wurde mit 25 mol Überschuß von (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat als Lösung in DMF behandelt. Die Reaktionsmischung wurde auf einer schnell laufenden Sephadex® G25 (superfeinen) Säule (Pharmacia) unter Verwendung eines HPLC-Systems gereinigt. Der Proteinpeak wurde bei einer Strömungsrate von etwa 0,75 ml/min mit einer mobilen Phase aus Phosphatpuffer (pH 6,0), die etwa 20 % Ethanol enthielt, gesammelt. Nach dem Pufferaustausch wurde die markierte Antikörperzubereitung mit Lagerpuffer verdünnt, um etwa 100000 Zählungen/100 μl in einem LumaTagTM Analysator (im Handel von London Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota, erhältlich) nach einer 1:10 Verdünnung zu erhalten.
    • B) Lagerpuffer: 100 mM Phosphat, 0,145 M NaCl, 0,001 % Thimerosal, 0,4 % BSA, 0,1 mg/ml Maus-Globuline und 0,1 mg/ml Ziegen-Globuline, pH 6,0.
    • C) Anlagerungsantikörper: Monoklonal-Anti-TSH (2 μg/ml) als Festphase auf Nunc-Röhrchen. Verfahren zur Herstellung von Festphasen-Nunc-Röhrchen: 1) 0,4 ml des Anlagerungsantikörpers bei 2 μg/ml in PBS-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2–7,4, 10 mM Phosphat, 100 mM NaCl, 10 mM NaN3) wurden jedem Röhrchen zugegeben. 2) Die Röhrchen wurden 18–24 Stunden inkubiert. 3) Die Röhrchen wurden dreimal mit PBS-Puffer gewaschen. 4) Die Röhrchen wurden mit 2,0 % BSA in PBS-Puffer blockiert und ≤ 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. 5) Die Röhrchen wurden dreimal mit PBS-Puffer gewaschen. 6) Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur getrocknet. 7) Die Röhrchen wurden in Plastikgefrierbeuteln bei 4 °C gelagert.
    • D) Standards: Hergestellt in Pferdeserum 0, 0,05, 0,1, 0,5, 2,5, 10, 25 und 50 μIE/ml.
    • E) Waschlösung: Kochsalzpuffer, der BSA enthält.
  • 2. Testprotokoll
    • 1) 200 μl der Probe wurden in die beschichteten Röhrchen pipettiert.
    • 2) 100 μl markierter Antikörper wurden zugegeben.
    • 3) Die Röhrchen wurden sanft gewirbelt.
    • 4) Die Röhrchen wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttelapparat inkubiert.
    • 5) 1 ml Waschlösung wurde jedem Röhrchen zugegeben.
    • 6) Die Röhrchen wurden unter Verwendung eines Biotomic-Waschapparates (im Handel von Ocean Scientific, Inc., Garden Grove, Kalifornien, erhältlich) gewaschen.
    • 7) Die Chemilumineszenz wurde 2 Sekunden (Pumpe 1: 0,1N HNO3 + 0,25 % H2O2; Pumpe 2: 0,25N NaOH + 0,125 % CTAC) in einem LumaTagTM Analysator (im Handel von London Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota, erhältlich) gezählt.
  • Die Zugabe von HNO3 zu der Testmischung, welche den markierten Antikörper enthält, bewirkt die Abspaltung der C9 Ethoxygruppe von dem Acridiniummolekül, bevor die Chemilumineszenzreaktion durch die Zugabe von NaOH getriggert wird.
  • Beispiel 27
  • Die Vergleichsstabilität von (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridinium-9-carboxylat ("DMC") und (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat ("DME") wurde bei pH 9,6 bei 25 °C verglichen. Die Verbindungen wurden in DMF (etwa 0,5 mg/ml) aufgelöst. 10 μl der Lösung wurden dann 1 ml Bicarbonatpuffer (0,1M Bicarbonat, 0,00025 % Thimerosal, 0,1 % Rinderserumalbumin) zugegeben. Die Lösung wurde weiter verdünnt, um etwa 300.000 Zählungen in 10 μl zu erhalten. Die Daten von der Stabilitätsstudie sind in 36 dargestellt. Es zeigte sich, daß DME über längere Zeit stabiler ist als DMC.
  • Die Vergleichsstabilität von DMC-markiertem TSH-Konjugat und DME-markiertem TSH-Konjugat wurde bei pH 6,0 bei 25, 30 und 35 °C verglichen. Es zeigte sich, daß das DME-markierte TSH-Konjugat über längere Zeit stabiler ist.
  • Die vorliegenden Ausführungsbeispiele werden in jeder Hinsicht als beispielhaft und nicht als einschränkend angesehen und der Umfang der Erfindung ist durch die beiliegenden Ansprüche angegeben.

Claims (68)

  1. Chemilumineszierende Verbindung mit der allgemeinen Formel I:
    Figure 00720001
    wobei: R4 derart ist, daß der gestrichelte Kasten, der mit L bezeichnet ist, eine Ester-, Thioester- oder Amidbindung enthält; Q einen heterocyclischen Ring oder ein heterocyclisches Ringsystem darstellt, der/das ein Kohlenstoffatom enthält, an welchem die Bindung L angelagert ist, wobei das Heteroatom in dem Ring oder Ringsystem sich in einem Oxidationszustand befindet oder befinden kann, der das Kohlenstoffatom für einen Angriff durch Peroxid oder molekularen Sauerstoff anfällig macht, um ein Zwischenprodukt zu bilden, das zur Erzeugung von Chemilumineszenz zerfällt; R3 einen Arylring oder ein Arylringsystem darstellt, das mindestens einen sechsteiligen Ring enthält; jedes von R2 und R2' für sich Gruppen darstellt, welche die Hydrolyse der Bindung L sterisch behindern; R1 eine elektronenziehende Gruppe darstellt, die -NO2, -SO2Cl, -Br oder -N(CH3)3 ⊕ ist; eines von R1, R2 und R2' auch eine Gruppe darstellen kann, welche imstande ist, die Verbindung an einem Protein oder einer Nucleinsäure anzulagern; oder ein Salz davon.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei jedes von R2 und R2' für sich die Gruppe -R, -OR oder -SR darstellt, wobei R eine Arylgruppe darstellt.
  3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R2 und R2' sich in den ortho-Stellungen an R3 befinden, wenn R3 ein Phenylring, bei welchem die Esterbindung an Position 1 angehängt ist.
  4. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Q Acridinium, Benz[a,b oder c]acridinium, 1,2,4-Triazolkation, Isooxazolkation, Isothioazolkation, 1,2-Azolkation, Imidazolkation, Benzimidazolkation, Chinolinium, Isochinolinium, Chinolizinium, eine cyclische C3-, C4- oder C5-substituierte Chinolinium-, Pyridinium-; Pyrimidinium-, Pyridazinium-, Pyrazinium-, Phenanthridinium- oder Chinoxaliniumgruppe oder eine reduzierte Form davon darstellt.
  5. Chemilumineszierende Verbindung mit der allgemeinen Formel I:
    Figure 00730001
    wobei: R4 derart ist, daß der gestrichelte Kasten, der mit L bezeichnet ist, eine Ester-, Thioester- oder Amidbindung enthält; Q einen heterocyclischen Ring oder ein heterocyclisches Ringsystem darstellt, der/das ein Kohlenstoffatom enthält, an welchem die Bindung L angelagert ist, wobei das Heteroatom in dem Ring oder Ringsystem sich in einem Oxidationszustand befindet oder befinden kann, der das Kohlenstoffatom für einen Angriff durch Peroxid oder molekularen Sauerstoff anfällig macht, um ein Zwischenprodukt zu bilden, das zur Erzeugung von Chemilumineszenz zerfällt; wobei das Ringsystem Acridinium, Benz[a,b oder c]acridinium, ein Benzimidazolkation, Chinolinium, Isochinolinium, Chinolizinium, ein cyclisches C3-, C4- oder C5- substituiertes Chinolinium, Phenanthridinium oder Chinoxalinium; oder eine reduzierte Form solcher Ringsysteme ist; Q zusätzlich mit einem oder mehreren Perisubstituenten substituiert ist, von welchen jeder an einem Kohlenstoffatom in dem Ringsystem Q angeordnet ist, das imstande ist, einen Substituenten anzunehmen und sich am nächsten zu dem Kohlenstoffatom befindet, an welchem die Ester-, Thioester- oder Amidbindung L angelagert ist, und die eine sterische Behinderung bei diesem Kohlenstoffatom verursachen; R3 einen Arylring oder ein Arylringsystem darstellt, das mindestens einen sechsteiligen Ring enthält; R2 und R2' Substituenten darstellen, die gemeinsam mit dem/den Perisubstituenten die Hydrolyse der Bindung L sterisch behindern; R1 eine elektronenziehende Gruppe darstellt, mit einem σp-Wert über 0,0 und wobei der zusätzliche σp-Wert für R1, R2 und R2', wobei R2 und/oder R2' elektronenziehende Gruppen sind, kleiner oder gleich 1,0 ist; und eines von R1, R2 und R2' auch eine Gruppe darstellen kann, die imstande ist, die Verbindung an ein Protein oder eine Nucleinsäure anzulagern; oder ein Salz davon.
  6. Verbindung nach Anspruch 5, wobei jeder Perisubstituent für sich eine Methyl-, Ethyl- oder Phenylgruppe darstellt.
  7. Verbindung nach Anspruch 5 oder 6, wobei Q eine Acridinium-, Phenanthridinium-, Chinolixinium- oder Chinoliniumgruppe darstellt.
  8. Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Perisubstituenten in den folgenden Positionen angeordnet sind: (a) an C1 und C8, wobei Q ein Acridinium darstellt; (b) an C7, wobei Q eine Phenanthridiniumgruppe darstellt; oder (c) an C3, wobei Q eine Chinoliniumgruppe darstellt.
  9. Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei mindestens ein Persisubstituent -CH3 ist.
  10. Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei R3 eine Phenylgruppe darstellt und die Summe aller σp-Werte für R1, R2 und R2', wenn sie eine elektronenziehende Gruppe darstellen, kleiner oder gleich 1,0 ist.
  11. Chemilumineszierende Verbindung mit der allgemeinen Formel II:
    Figure 00750001
    wobei: R4 derart ist, daß der gestrichelte Kasten, der mit L bezeichnet ist, eine Ester-, Thioester- oder Amidbindung enthält; Q einen heterocyclischen Ring oder ein heterocyclisches Ringsystem darstellt, der/das ein Kohlenstoffatom enthält, an welchem die Bindung L angelagert ist, wobei das Heteroatom in dem Ring oder Ringsystem sich in einem Oxidationszustand befindet oder befinden kann, der das Kohlenstoffatom für einen Angriff durch Peroxid oder molekularen Sauerstoff anfällig macht, um ein Zwischenprodukt zu bilden, das zur Erzeugung von Chemilumineszenz zerfällt; R3 einen Arylring oder ein Arylringsystem darstellt, das mindestens einen sechsteiligen Ring enthält; jedes von R2 und R2' für sich Substituenten darstellt, welche die Hydrolyse der Bindung L sterisch behindern; R1 eine elektronenziehende Gruppe darstellt mit einem σp-Wert über 0,0 und wobei der zusätzliche σp-Wert für R1, R2 oder R2', wobei R2 und/oder R2' eltronenziehende Gruppen sind, kleiner oder gleich 1,0 ist; eines von R1, R2 und R2' auch eine Gruppe darstellen kann, die imstande ist, die Verbindung an ein Protein oder eine Nucleinsäure anzulagern; Z einen Substituenten darstellt, der an das sp3-hybridisierte Kohlenstoffatom angelagert ist, an welches die Bindung L angelagert ist, und folgendes ist: – ein Wasserstoff- oder Halogenatom; -CN; -OR; -NR2; -NR⊕ 3; -SR; -SR⊕ 2; -S2R; -NRCO2R; -NHNR2; -NRNR2; -ONR2; -NHOR; -CR(CN)2; -CR(COR)2; -CR2NO2; -C≡COR; -XRn; – ein Arzneidrogen- oder Steroidmolekül; -2-Oxazol; -1-Imidazol; wobei: R eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe, eine Aminosäure, einen Zucker darstellt oder mehrere R-Gruppen
    Figure 00770001
    darstellen können; X ein Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder Kohlenstoffatom darstellt; n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, deren Wert durch die Valenz des Atoms bestimmt wird, das durch X dargestellt ist; oder ein Salz davon.
  12. Verbindung nach Anspruch 11, welche (2,6-dimethoxy-3-chlorsulfonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat ist.
  13. Verbindung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei, wenn Z RnX ist, es durch Behandlung der Verbindung mit einer Säure gespalten werden kann.
  14. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Q ein Acridinium, Benz[a,b oder c]acridinium, 1,2,4-Triazolkation, Isooxazolkation, Isothioazolkation, 1,2-Azolkation, Imidazolkation, Benzimidazolkation, Chinolinium, Isochinolinium, Chinolizinium, eine cyclische C3-, C4- oder C5- substituierte Chinolinium-, Pyridinium-, Pyrimidinium-, Pyridazinium-, Pyrazinium-, Phenanthridinium- oder Chinoxaliniumgruppe oder eine reduzierte Form davon darstellt.
  15. Chemilumineszierende Verbindung mit der allgemeinen Formel I:
    Figure 00780001
    wobei: R4 derart ist, daß der gestrichelte Kasten, der mit L bezeichnet ist, eine Ester-, Thioester- oder Amidbindung enthält; Q einen heterocyclischen Ring oder ein heterocyclisches Ringsystem darstellt, der/das ein Kohlenstoffatom enthält, an welchem die Bindung L angelagert ist, wobei das Heteroatom in dem Ring oder Ringsystem sich in einem Oxidationszustand befindet oder befinden kann, der das Kohlenstoffatom für einen Angriff durch Peroxid oder molekularen Sauerstoff anfällig macht, um ein Zwischenprodukt zu bilden, das zur Erzeugung von Chemilumineszenz zerfällt; Q zusätzlich durch einen Substituenten substituiert ist, der imstande ist, durch eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Alkylamino-, Oxoalkyl-, Thioalkyl- oder eine Alkylaxycarbonyl-Gruppe, die an Q gebunden ist, mit einem spezifischen Bindungsmaterial konjugiert zu werden, wobei der Substituent mindestens eine der folgenden funktionelle Gruppen aufweist: -COOR, wobei R eine Alkyl- oder Arylgruppe darstellt; -C(OR)=NH⊕ 2, wobei R einen Rest eines funktionellen Alkohols darstellt; -SO2Cl; -NCS;
    Figure 00790001
    -N(CH3)(CH2)mCl, wobei m zumindest eins ist; -N3; -NH2; oder – ein Ion, einen Zucker, ein Polyamin, Polyoxyethylen oder Polyoxybutylen; R3 einen Arylring oder ein Arylringsystem darstellt, das mindestens einen sechsteiligen Ring enthält; jedes von R2 und R2' für sich Substituenten darstellt, welche die Hydrolyse der Bindung L sterisch behindern; R1 eine elektronenziehende Gruppe darstellt mit einem σp-Wert über 0,0 und wobei der zusätzliche σp-Wert für R1, R2 oder R2', wobei R2 und/oder R2' elektronenziehende Gruppen sind kleiner oder gleich 1,0 ist; oder ein Salz davon.
  16. Verbindung nach Anspruch 15, wobei der Substituent durch eine Oxoalkyl- oder Alkyloxycarbonylgruppe gebunden ist.
  17. Verbindung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die funktionelle Gruppe Succinimid oder N-Carboxylsuccinimid ist.
  18. Verbindung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei Q ein Acridinium, Benz[a,b oder c]acridinium, 1,2,4-Triazolkation, Isooxazolkation, Isothioazolkation, 1,2-Azolkation, Imidazolkation, Benzimidazolkation, Chinolinium, Isochinolinium, Chinolizinium, eine cyclische C3-, C4- oder C5- substituierte Chinolinium-, Pyridinium-, Pyrimidinium-, Pyridazinium-, Pyrazinium-, Phenanthridinium- oder Chinoxaliniumgruppe oder eine reduzierte Form davon darstellt.
  19. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei R4 -Odarstellt, so daß L eine Esterbindung ist.
  20. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei R3 eine Phenylgruppe darstellt.
  21. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei R1 -NO2, SO2Cl oder -N(CH3)3 ⊕ darstellt.
  22. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei R1 -SO2Cl darstellt.
  23. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei R2 und R2' -CH3 oder OCH3 darstellen.
  24. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei R3 eine Phenylgruppe darstellt und die Summe aller σp-Werte für R1, R2 und R2', wenn sie eine elektronenziehende Gruppe darstellen, kleiner oder gleich 1,0 ist.
  25. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Q eine Acridiniumgruppe darstellt.
  26. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 19, 20 und 23 bis 25, die folgendes ist:
    Figure 00810001
  27. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 19 bis 25, die folgendes ist:
    Figure 00810002
  28. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 19 bis 25, die folgendes ist:
    Figure 00820001
  29. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 19 bis 21 und 23 bis 25, die folgendes ist:
    Figure 00820002
  30. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 19 bis 21, 23 und 24, die folgendes ist:
    Figure 00830001
  31. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 19 bis 24, die folgendes ist:
    Figure 00830002
  32. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 19 bis 24, die folgendes ist:
    Figure 00840001
  33. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 19, 20, 23 und 24, die folgendes ist:
    Figure 00840002
  34. Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, die (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulphonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-ethoxy-9-carboxylat, (2,6-Dimethoxy-3-chlorosulphonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-methoxy-9-carboxylat oder (2,6-Dimethyl-3-chlorosulphonyl)phenyl-N-methyl-acridan-9-methoxy-9-carboxylat ist.
  35. Verbindung nach einem der Ansprüche 15 bis 21 und 23 bis 25, die
    Figure 00850001
    folgendes ist:
  36. Verbindung nach einem der Ansprüche 15 bis 21 und 23 bis 25, die folgendes ist:
    Figure 00850002
  37. Verbindung nach einem der Ansprüche 15 bis 21 und 23 bis 25, die folgendes ist:
    Figure 00860001
  38. Verbindung nach einem der Ansprüche 15 bis 21 und 23 bis 25, die folgendes ist:
    Figure 00860002
  39. Konjugat, das eine chemilumineszierende Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38 umfaßt, die an einen spezifischen Bindungspartner für eine biologische, biochemische oder chemische Spezies gebunden ist.
  40. Konjugat nach Anspruch 39, das spezifisch durch eine Immunreaktion, Proteinbindungsreaktion oder Nucleinhybridisierung binden kann.
  41. Zusammensetzung, das eine chemilumineszierende Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38 oder ein Konjugat nach Anspruch 39 oder 40 umfaßt.
  42. Spezifischer Bindungstestkit, der eine Ampulle aufweist, die eine Zusammensetzung nach Anspruch 41 enthält.
  43. Spezifischer Bindungstest für den Nachweis der Gegenwart eines Analyts in einer Probe, wobei der Test ein chemilumineszierendes Konjugat nach Anspruch 39 oder 40 oder eine chemilumineszierende Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38, die an ein spezifisches Bindungsmaterial angelagert ist, verwendet, wobei die Gegenwart des Analyts in der Probe proportional zu der Bildung eines oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionsprodukte ist, die das Konjugat enthalten, wobei der Test umfaßt: das Ermöglichen einer wesentlichen Bildung eines oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionsprodukte, die das Konjugat enthalten, unter geeigneten Bedingungen; und das Messen der Chemilumineszenz entweder (i) eines oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionsprodukte oder (ii) des Konjugates, das nicht in den Bindungsreaktionsprodukten nicht enthalten ist.
  44. Test nach Anspruch 43, wobei das spezifische Bindungsmaterial imstande ist, spezifisch mit dem Analyt zu binden und das spezifische Bindungsreaktionsprodukt ein Analyt-Konjugat-Komplex ist, wobei der Test umfaßt: das Ermöglichen einer wesentlichen Bildung des Analyt-Konjugat-Komplexes unter geeigneten Bedingungen; und das Messen der Chemilumineszenz entweder (i) des Analyt-Konjugat-Komplexes oder (ii) des Konjugates, das nicht in dem Analyt-Konjugat-Komplex enthalten ist.
  45. Test nach Anspruch 44, der ein Oberflächenantigentest ist, wobei das spezifische Bindungsmaterial ein Antikörper ist, der für ein Oberflächenantigen auf einer Zelle spezifisch ist.
  46. Test nach Anspruch 44 oder 45, der weiters einen Reaktionspartner verwendet, der zur spezifischen Bindung sowohl mit (i) dem Analyt zur Bildung eines Analyt-Reaktionspartner-Komplexes als auch mit (ii) dem spezifischen Bindungsmaterial zur Bildung eines Konjugat-Reaktionspartner-Komplexes, der das spezifische Bindungsreaktionsprodukt ist, imstande ist, wobei der Test umfaßt: das Ermöglichen einer wesentlichen Bildung des Analyt-Reaktionspartner-Komplexes und Konjugat-Reaktionspartner-Komplexes unter geeigneten Bedingungen; und das Messen der Chemilumineszenz entweder (i) des Konjugat-Reaktionspartner-Komplexes oder (ii) des Konjugates, das nicht in dem Konjugat-Reaktionspartner-Komplex enthalten ist.
  47. Test nach Anspruch 43, der ein kompetitiver Test ist.
  48. Test nach Anspruch 46 oder 47, wobei der Reaktionspartner an eine Festphase angelagert ist oder Komplexe, die den Reaktionspartner enthalten, ausgefällt sind.
  49. Test nach Anspruch 43, der ein Sequenz-Sättigungstest ist und der Analyt zunächst mit dem Reaktionspartner vor der Reaktion des Konjugates mit dem verbleibenden, nicht reagierten Reaktionspartner zur Reaktion gebracht wird.
  50. Test nach Anspruch 43, der ein kompetitiver Verdrängungstest ist, wobei das Konjugat den Analyt, der bereits an den Reaktionspartner gebunden ist, kompetitiv verdrängt.
  51. Test nach Anspruch 43, der ein Löschungstest ist, wobei der Reaktionspartner an eine Löschungskomponente angelagert ist.
  52. Test nach Anspruch 51, wobei die Löschungskomponente die Chemilumineszenz der Verbindung verringert oder löscht, wenn sie sehr nahe an die Verbindung herangebracht wird.
  53. Test nach Anspruch 43, wobei das spezifische Bindungsmaterial zur spezifischen Bindung mit dem Analyt imstande ist und der Test weiters einen Reaktionspartner verwendet, der zur spezifischen Bindung mit dem Analyt zur Bildung eines Reaktionspartner-Analyt-Konjugat-Komplexes, der das spezifische Bindungsreaktionsprodukt ist, imstande ist, wobei der Test umfaßt: das Ermöglichen einer wesentlichen Bildung des Reaktionspartner-Analyt-Konjugat-Komplexes unter geeigneten Bedingungen; und das Messen der Chemilumineszenz entweder (i) des Reaktionspartner-Analyt-Konjugat-Komplexes oder (ii) des Konjugates, das nicht in dem Reaktionspartner-Analyt-Konjugat-Komplex enthalten ist.
  54. Test nach Anspruch 53, der ein Sandwich-Test ist.
  55. Test nach Anspruch 53 oder 54, wobei der Reaktionspartner an eine Festphase angelagert ist.
  56. Test nach einem der Ansprüche 53 bis 55, wobei der Reaktionspartner an einen Tauchstab, eine Perle, ein Rohr oder ein Papier oder eine Polymerfolie angelagert ist.
  57. Test nach Anspruch 55 oder 56, wobei der Reaktionspartner, der an die Festphase angelagert ist, mit dem Analyt in der Probe zur Reaktion gebracht wird, wonach die Festphase, die das zum Komplex gebildete Analyt enthält, von der übrigen Probe abgetrennt wird und der Komplex dann mit dem Konjugat zur Reaktion gebracht wird.
  58. Spezifischer Bindungstest für den Nachweis der Gegenwart eines Analyts in einer Probe, wobei der Test eine chemilumineszierende Komponente verwendet, die eine chemilumineszierende Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38 umfaßt, und die Gegenwart an des Analyts in der Probe proportional zu der Bildung eines oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionsprodukte ist, welche die chemilumineszierende Verbindung nicht enthalten, und die Verbindung im Verhältnis zu der Bildung der spezifischen Bindungsreaktionsprodukte chemiluminesziert, wobei der Test umfaßt: das Ermöglichen einer wesentlichen Bildung der spezifischen Bindungsreaktionsprodukte unter geeigneten Bedingungen; und das Messen den Chemilumineszenz der Verbindung, die durch die Bildung der spezifischen Bindungsreaktionsprodukte verursacht wird.
  59. Test nach Anspruch 58, der weiters einen Reaktionspartner verwendet, der zur Bindung mit dem Analyt zur Bildung eines Analyt-Reaktionspartner-Komplexes imstande ist, und wobei die Verbindung im Verhältnis zu der Bildung des Analyt-Reaktionspartner-Komplexes chemiluminesziert.
  60. Test nach Anspruch 59, der ein Enzym-Substrat-Test ist, wobei die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes die chemilumineszierende Verbindung triggert.
  61. Test nach Anspruch 60, wobei der Analyt das Substrat Glucose ist und der Reaktionspartner das Enzym Gluxoseoxidase ist.
  62. Test nach Anspruch 61, wobei die Bildung des spezifischen Bindungsreaktionsproduktes die Chemilumineszenz der Verbindung fördert oder hemmt.
  63. Test nach Anspruch 58, wobei ein erster Reaktionspartner, der mit dem Analyt kreuzreaktionsfähig ist, an ein Enzym nahe seiner aktiven Stelle angelagert ist und ein zweiter Reaktionspartner, der sowohl für das Analyt als auch für ein immunreaktionsfähiges Material spezifisch ist, der Probe und dem Enzym in Gegenwart eines Substrates zugegeben wird.
  64. Test nach Anspruch 63, wobei der zweite Reaktionspartner an den ersten Reaktionspartner zum Blockieren der aktiven Stelle an dem Enzym derart bindet, daß das Substrat nicht an das Enzym an der aktiven Stelle binden kann oder die Bindung des Substrates an der aktiven Stelle signifikant verringert ist.
  65. Test nach einem der Ansprüche 43 bis 64, der ein Immuntest, Proteinbindungstest oder Nucleinsäure-Hybridisierungstest ist. 66 Test nach Anspruch 65, der ein Nucleinsäure-Hybridisierungstest ist, wobei jede doppelsträngige DNA oder RNA in eine einzelsträngige Form vor der Hybridisierung umgewandelt wird und auf einem Träger immobilisiert oder auf einer Gelmatrix einer Elektrophorese unterzogen wird.
  66. Test nach einem der Ansprüche 43 bis 66, der ein heterogener Test ist, wobei die Reaktionsprodukte, deren Bildung proportional zu der Gegenwart des Analyts in der Probe ist, von anderen Produkten der Reaktion abgetrennt werden.
  67. Test nach einem der Ansprüche 43 bis 66, der ein homogener Test ist, wobei die Reaktionsprodukte nicht von anderen Produkten der Reaktion abgetrennt werden und die Chemilumineszenz aus der ganzen Testmischung gemessen wird.
  68. Test nach einem der Ansprüche 43 bis 68, wobei die Messung der Chemilumineszenz gegebenenfalls die Behandlung der Verbindung mit einer Säure zur Spaltung von Z beinhaltet, wenn Z vorhanden ist, und wenn es eine RnX-Gruppe darstellt, sowie das Triggern der Chemilumineszenz, wenn die Verbindung zur Bildung des Reaktionsproduktes dies nicht bereits vorgenommen hat.
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