DE3205506C2

DE3205506C2 - Carboxyfluorescein-Derivate und ihre Verwendung als Tracer zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten mittels einer Fluoreszenzpolarisationstechnik

Info

Publication number: DE3205506C2
Application number: DE19823205506
Authority: DE
Inventors: Chao-Huie Jeffrey Wang; Stephen Denham Stroupe; Michael Ernest Jolley
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1981-02-17
Filing date: 1982-02-16
Publication date: 1996-10-10
Anticipated expiration: 2002-02-17
Also published as: CA1178269A; DE3205506A1; NZ199629A

Description

Die Erfindung betrifft Carboxyfluorescein-Derivate und ihre Verwendung als Tracer zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma, Rückenmarkflüssigkeit, Amnionflüssigkeit und Urin, mittels Fluoreszenzpolarisationstechnik. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay der Erfindung vereinigt die Spezifität eines Immunoassays mit der Geschwindigkeit und der Zweckmäßigkeit von Fluores zenzpolarisationsmethoden und erlaubt die Bestimmung der Menge eines in einer Probe vorhandenen spezifischen Li ganden.

Immunoassays auf der Basis einer kompetitiven Bindung zur Messung von Liganden beruhen auf der Konkurrenz zwischen einem Liganden in einer Testprobe und einem markierten Reagens, das als Tracer bezeichnet wird, um eine begrenzte Anzahl von Rezeptorbindungsstellen an für den Liganden und Tracer spezifischen Antikörpern. Die Konzentration des Liganden in der Probe bestimmt die Tracermenge, die eine spezifische Bindung mit einem Antikörper eingeht. Die Menge des gebildeten Tracer-Antikörper-Konjugats kann quantitativ gemessen werden und ist umgekehrt proportional zur Menge des Liganden in der Testprobe.

Im allgemeinen beruhen Fluoreszenzpolarisationsverfahren auf dem Prinzip, daß eine fluoreszierend markierte Ver bindung bei Anregung durch linear polarisiertes Licht Fluoreszenz emittiert, deren Polarisationsgrad in umge kehrter Beziehung zur Rotationsgeschwindigkeit steht. Wird somit ein Molekül, z. B. ein Tracer-Antikörper-Kon jugat mit einer fluoreszierenden Markierung, mit linear polarisiertem Licht angeregt, so bleibt das emittierte Licht stark polarisiert, da der Fluorophor im Zeitraum zwischen der Absorption und Emission des Lichts am Ro tieren gehindert wird. Wenn eine "freie" Tracerverbindung (d. h. nicht an einen Antikörper gebunden) durch linear polarisiertes Licht angeregt wird, ist ihre Drehung we sentlich rascher als beim entsprechenden Tracer-Antikörper- Konjugat und die Moleküle orientieren sich willkürlicher, so daß das emittierte Licht depolarisiert wird. Die Fluoreszenzpolarisation erlaubt somit eine Messung der bei einem Immunoassay auf der Basis einer kompetitiven Bindung gebildeten Menge eines Tracer-Antikörper-Konjugats.

Es sind verschiedene fluoreszierend markierte Verbindungen bekannt. Die US-PS 3 998 943 beschreibt die Herstellung eines fluoreszierend markierten Insulinderivats unter Ver wendung von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) als fluores zierende Markierung und eines fluoreszierend markierten Morphinderivats unter Verwendung von 4-Aminofluorescein hydrochlorid als fluoreszierende Markierung. Carboxyfluor escein wurde ebenfalls für analytische Bestimmungen ein gesetzt. R.F. Chen, Anal. Lett., Bd. 10, (1977), S. 787 beschreibt die Verwendung von Carboxyfluorescein zur Er mittlung der Aktivität von Phospholipase. Hierbei erfolgt jedoch keine Konjugation von Carboxyfluorescein im Sinne der vorliegenden Erfindung, vielmehr ist es in Lecithin- Liposomen eingekapselt und fluoresziert nur wenn es durch Hydrolyse von Lecithin freigesetzt wird.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Die Erfindung betrifft Carboxyfluorescein-Derivate der allgemeinen Formel

in der R ein Ligandenanaloges mit einer einzelnen reak tiven primären oder sekundären Aminogruppe bedeutet, die an ein Carbonylkohlenstoffatom eines Carboxyfluo resceinrestes gebunden ist und sich von einer Verbin dung aus folgender Gruppe ableitet:
o-, m- oder p-Aminophenobarbital der Formel

2-β-Aminoethylphenytoin, 8-β-Aminoethyl- oder 8-Aminomethyltheophyllin der Formel

wobei n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder 2 ist, 2-Ethyl-, 2-n-Propyl- und 2-n-Butyl-5-aminopentansäure der Formel

in der p eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 4 ist, 5-(γ-Aminopropyliden)-5H-dibenzo[a,d]-10,11-dihydro cyclohepten, Nortriptylin, Desipramin oder N-Aminoacetyldesipramin, Thyroxin oder Trÿodthyronin der Formel

wobei R′ ein Wasserstoff- oder Jodatom bedeutet, 3-Amino-3-desoxydigoxigenin der Formel

Propranolol, O-Aminoacetylpropranolol der Formel

o-, m- oder p-Aminoprimidon der Formel

1-(4′-Nitrophenyl)-1-hydroxy-2-amino-3-hydroxypropan, p-Aminophenol, N-(2-Aminoethyl)-ethosuximid, N′-Desethyl-N-acetyl-procainamid oder N′-Desethyl-N- acetyl-N′-aminoacetylprocainamid, 1-Amino-2-phenyl-2-(2′-pyridyl)-4-(diisopropylamino)- butan, N-Aminoacetyliminodibenzyl, Carbhydraziniminodibenzyl, Dibenzosuberonhydrazon, 5-Amino-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]-cyclohepten,

wobei n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 und m 0 oder 1 sind, wobei vorzugsweise n 2 und m 0 sind oder vorzugsweise die Verbindung 2-Carboxymethylphenytoin hydrazid, sowie biologisch verträgliche Salze davon.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Be stimmung von Liganden in einer Probe, dadurch gekenn zeichnet, daß man die Probe mit einer Verbindung der Formel (I) als Tracer und einem Antikörper der spezi fisch den Liganden und den Tracer erkennen kann, ver mischt und anschließend die Menge des an den Antikörper gebundenen Tracers mittels einer Fluoreszenzpolarisa tionstechnik bestimmt.

Die Tracer der Erfindung liegen im allgemeinen in einem Gleichgewicht zwischen dem sauren und dem ionisierten Zu stand vor, wobei die ionisierte Form im erfindungsgemäßen Verfahren wirksam ist. Somit umfaßt die Erfindung die Tracer sowohl in der sauren als auch in der ionisierten Form, wobei sie aus Zweckmäßigkeitsgründen in den Struk turformeln in der sauren Form angegeben werden. Liegen die Tracer der Erfindung in ihrer ionisierten Form vor, so handelt es sich um biologisch verträgliche Salze. Unter "biologisch verträglichen Salzen" sind Salze, wie Natrium-, Kalium-, Ammoniumsalze und dergl. zu verstehen, die es er möglichen, daß die erfindungsgemäßen Tracer bei Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren in ionisierter Form vor liegen können. Im allgemeinen liegen die Tracer der Erfin dung in Lösung als Salze vor, wobei das spezielle Salz durch den verwendeten Puffer bedingt ist, beispielsweise liegen die Tracer in Gegenwart von Natriumphosphatpuffer im allgemeinen in ionisierter Form als Natriumsalze vor.

Der Ausdruck Ligandenanaloges betrifft einen ein- oder mehrwertigen Rest, von dem ein wesentlicher Anteil die gleiche räumliche und polare Organisation wie der Ligand aufweist, so daß eine oder mehrere Determinanten oder epitopen Stellen definiert werden, die in der Lage sind, mit dem Liganden um die bindenden Stellen eines Rezeptors zu konkurrieren. Ein Charakteristikum für ein derartiges Ligandenanaloges besteht darin, daß es eine so große strukturelle Ahnlichkeit mit dem in Frage stehenden Li ganden aufweist, so daß es durch den Antikörper gegen den Liganden erkannt werden kann. Meistens weist das Liganden analoge in einem beträchtlichen Anteil der Moleküloberflä che die gleiche Struktur und Ladungsverteilung (räumliche und polare Organisation) wie der in Frage stehende Ligand auf. Da häufig die bindende Stelle für ein Hapten bei der Herstellung des Antigens zur Bildung von Antikörpern die gleiche ist, die zur Verknüpfung mit dem Liganden verwen det wird, liegt der gleiche Teil des Ligandenanalogen, der die Schablone für den Antikörper darstellt, im Liganden analogen im Tracer frei.

Im allgemeinen leitet sich die Klasse der durch R wieder gegebenen Ligandenanalogen von den entsprechenden Liganden durch Entfernung eines reaktiven Wasserstoffatoms, d. h. eines an ein reaktives Amin (primär oder sekundär) gebun denen Wasserstoffatoms, oder durch Bildung eines Amino derivats des Liganden ab, wobei eine Iminogruppe

an der Stelle der Bindung an den Carboxyfluoresceinrest eine oder mehrere ursprünglich im Liganden vorhandene Atome ersetzt.

Die Tracer der Erfindung werden im allgemeinen nach an sich bekannten Verfahren hergestellt. Beispielsweise wird eine Verbindung der allgemeinen Formel III

R-X (III)

in der R die vorstehende Bedeutung hat und X ein reaktives Wasserstoffatom bedeutet, mit einer Verbindung der allge meinen Formel IV

in der Z Hydroxyl oder einen aktiven Ester bedeutet und die Carboxylgruppe vorzugsweise an die 4- oder 5-Stellung des Benzoesäurerings gebunden ist, in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels behandelt, wodurch man eine Verbindung der allgemeinen Formel I erhält.

Unter dem Ausdruck "aktiver Ester" ist ein Rest zu verstehen, der leicht in Gegenwart eines Kupplungsmittels vom Car boxykohlenstoffatom entfernt wird. Derartige, für den Fach mann leicht zu ermittelnde aktive Ester von Carboxyfluor escein werden durch Umsetzung von Carboxyfluorescein mit einer Verbindung, wie N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzo triazol-hydrat oder p-Nitrophenol, in Gegenwart eines Kupplungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, und eines Lösungsmittels hergestellt. Die auf diese Weise erhaltenen aktiven Ester von Carboxyfluorescein werden anschließend mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III unter Bildung eines Tracers der allgemeinen Formel I umgesetzt.

Ist die Verbindung der allgemeinen Formel III wasserlöslich, so schreitet der Reaktionsmechanismus unter direkter Um setzung von Carboxyfluorescein mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III in wäßriger Lösung in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids, wie 1-Athyl-3-(3′- dimethylaminopropyl)-carbodimid-hydrochlorid, als Kupp lungsmittel fort.

Die Temperatur, bei der das Verfahren zur Herstellung der Tracer der Erfindung abläuft, ist nicht kritisch. Die Temperatur soll für die Einleitung und Aufrechterhaltung der Reaktion ausreichend sein. Im allgemeinen ist aus Zweckmäßigkeitsgründen und aus wirtschaftlichen Gründen Raum temperatur ausreichend. Zur Herstellung der Tracer der Er findung ist das Verhältnis der Reaktionsteilnehmer nicht eng begrenzt. Pro 1 Mol einer Verbindung der allgemeinen Formel II sollte zur Gewährleistung einer annehmbaren Aus beute 1 Mol einer Verbindung der allgemeinen Formel III eingesetzt werden. Vorzugsweise wird ein Überschuß der Verbindung der allgemeinen Formel III eingesetzt, um die Durchführung der Reaktion zu erleichtern und die Ausbeute zu verbessern.

Im Hinblick auf eine leichte Handhabung und auf die Aus beute an Produkt wird das Verfahren zur Herstellung der Tracer der Erfindung in Gegenwart eines inerten Lösungs mittels durchgeführt. Geeignete inerte Lösungsmittel sind solche, die nicht mit den Ausgangsmaterialien reagieren und für eine ausreichende Lösung dieser Ausgangsmaterialien sorgen. Beispiele dafür sind Wasser (falls die Verbindung der allgemeinen Formel III wasserlöslich ist), Dimethyl formamid, Dimethylsulfoxid und dergl. Handelt es sich bei der Verbindung der allgemeinen Formel III um ein re aktives Aminsalz, wird das Reaktionsgemisch zur Bildung der freien Base des reaktiven Amins mit einer entsprechen den Base versetzt. Ein Beispiel hierfür ist Triäthylamin. Die Reaktionsprodukte der allgemeinen Formel I werden im allgemeinen vor ihrem Einsatz im erfindungsgemäßen Ver fahren dünnschichtchromatographisch oder säulenchromato graphisch gereinigt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine den zu be stimmenden Liganden enthaltende Probe mit einem biologisch verträglichen Salz eines Tracers der allgemeinen Formel I und einem für Liganden und Tracer spezifischen Antikörper vermischt. Der in der Probe vorhandene Ligand und der Tracer reagieren unter Bildung von Ligand-Antikörper- und Tracer-Antikörper-Komplexen um begrenzte Antikörperstellen. Hält man die Konzentration an Tracer und Antikörper kon stant, so ist das entstehende Verhältnis von Ligand-Anti körper-Komplex zu Tracer-Antikörper-Komplex direkt pro portional zur Menge des in der Probe vorhandenen Liganden. Somit wird nach Anregung des Gemisches mit polarisiertem Licht und Messung der Polarisation der durch einen Tracer und einen Tracer-Antikörper-Komplex emittierten Fluores zenz eine quantitative Bestimmung des Liganden in der Pro be möglich.

Theoretisch ist die Fluoreszenzpolarisation eines nicht mit einem Antikörper komplexierten Tracers gering und geht nach Null. Nach Komplexieren mit einem spezifischen Anti körper übernimmt der Tracer-Antikörper-Komplex die Rotation des Antikörpermoleküls, die geringer ist als die des re lativ kleinen Tracermoleküls, wodurch die beobachtete Po larisation ansteigt. Konkurriert nun ein Ligand mit dem Tracer um Antikörperstellen, so ergibt sich für die be obachtete Polarisation der Fluoreszenz des Tracer-Anti körper-Komplexes ein Wert, der irgendwo zwischen dem Wert für den Tracer und dem Wert für den Tracer-Antikörper- Komplex liegt. Enthält eine Probe eine hohe Ligandenkon zentration, so liegt der beobachtete Polarisationswert näher am Wert des freien Liganden, d. h. er ist gering. Enthält die Testprobe eine geringe Ligandenkonzentration, so liegt der Polarisationswert näher am Wert des gebun denen Liganden, d. h. er ist hoch. Durch aufeinanderfolgen de Anregung des Reaktionsgemisches eines Immunoassays zu nächst mit vertikal und dann mit horizontal polarisiertem Licht und durch Analyse nur der vertikalen Komponente des emittierten Lichts kann die Polarisation der Fluoreszenz im Reaktionsgemisch genau bestimmt werden. Die genaue Be ziehung zwischen Polarisation und Konzentration des zu bestimmenden Liganden wird ermittelt, indem man die Polarisationswerte von Kalibratoren (Eichsubstanzen) mit bekannten Konzentrationen mißt. Die Konzentration des Liganden kann aus einer auf diese Weise aufgestellten Eich kurve extrapoliert werden.

Der pH-Wert, bei dem das erfindungsgemäße Verfahren durch zuführen ist, muß ausreichen, daß die Tracer der allge meinen Formel I in ionisiertem Zustand vorliegen können. Der pH-Wert kann etwa 3 bis 12, insbesondere etwa 5 bis 10 und vorzugsweise etwa 6 bis 9 betragen. Zur Einstellung und Aufrechterhaltung des pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergl. Die Art des verwendeten Puffers ist für die Er findung nicht kritisch, jedoch kann bei einer bestimmten Bestimmung ein spezieller Puffer im Hinblick auf den ver wendeten Antikörper und den zu bestimmenden Liganden be vorzugt sein. Das Kation des Puffers bestimmt im allgemei nen das Kation des Tracersalzes in der Lösung.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei mäßigen Tempera turen und vorzugsweise bei einer konstanten Temperatur durchgeführt. Die Temperatur beträgt im allgemeinen etwa 0 bis 50°C und vorzugsweise etwa 15 bis 40°C.

Die Konzentration des zu bestimmenden Liganden variiert im allgemeinen von etwa 10^-2 bis 10^-13 m und insbesondere von etwa 10^-4 bis 10^-10 m. Höhere Ligandenkonzentrationen können bestimmt werden, nachdem man die Originalprobe verdünnt hat.

Neben dem Konzentrationsbereich des in Frage stehenden Li ganden bestimmen Erwägungen, z. B. ob die Bestimmung quali tativ, halbquantitativ oder quantitativ durchgeführt wer den soll, die verwendete Einrichtung und die Eigenschaften von Tracer und Antikörper im allgemeinen die Konzentration des zu verwendenden Tracers und Antikörpers. Während die Konzentration des Liganden in der Probe den Konzentra tionsbereich der anderen Reagentien, d. h. Tracer und Anti körper, (im allgemeinen unter Optimierung der Empfindlich keit der Bestimmung) entscheidend sind, können die ein zelnen Reagentienkonzentrationen empirisch festgelegt wer den. Entsprechende Konzentrationen für Tracer und Anti körper kann der Fachmann leicht ermitteln.

Wie vorstehend erläutert, werden bevorzugte Tracer der Er findung aus 5-Carboxyfluorescein, 4-Carboxyfluorescein oder deren Gemischen hergestellt. Sie lassen sich durch die all gemeinen Formeln V und VI wiedergeben:

Die folgenden Beispiele erläutern Herstellungsverfahren für spezielle Tracer der Erfindung. Das in den Struktur formeln, die die in den nachstehenden Beispielen herge stellten Verbindungen erläutern, vorkommende Symbol [CF] bedeutet einen Rest der allgemeinen Formel VII

in der das Carbonylkohlenstoffatom in der 4- oder 5- Stellung der vorgenannten Formel gebunden ist. Dies an gesichts der Tatsache, daß ein Gemisch aus 4- und 5-Car boxyfluorescein als Ausgangsmaterial verwendet wird.

Beispiel 1

5 mg m- oder p-Aminophenobarbital und 5 mg Carboxyfluores cein werden in 0,5 ml Pyridin gelöst. Das Gemisch wird mit 15 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 2stün diger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch 2mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Ver wendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (2 : 1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein Aminophenobarbi tal-Carboxyfluorescein-Konjugat der Formel

Beispiel 2

Eine Lösung mit einem Gehalt an 1,0 g Natriumhydroxid, 2,5 g Phenytoin und 2,0 g 2-Brommethylamin-hydrobromid in 100 ml 100prozentigem Äthanol wird 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt und sodann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Wasser sus pendiert. Der pH-Wert wird durch Zusatz von 6 n Natriumhydroxidlösung auf 11 eingestellt, um nicht umgesetztes Phenytoin in Lösung zu bringen. Der verbleibende Niederschlag, nämlich 2-β-Aminoäthylphenytoin, wird filtriert, gründlich mit Wasser gespült und getrocknet.

Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird hergestellt, indem man 5 mg N-Hydroxysuccinimid, 7,5 mg Carboxyfluor escein und 20 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Pyridin löst. Nach 2stündiger Umsetzung bei Raumtempera tur werden 10 mg 2-β-Aminoäthylphenytoin im Reaktionsge misch gelöst. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht im Dunklen bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch 2mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloro form und Methanol (3 : 1) als Laufmittel gereinigt. Man er hält ein 2-β-Aminoäthylphenytoin-Carboxyfluorescein-Kon jugat der Formel

Beispiel 3

Eine Lösung mit einem Gehalt an 620 mg 2-Carboxymethyl phenytoin, 248 mg N-Hydroxysuccinimid und 453 mg N,N′- Dicyclohexylcarbodiimid in 6 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird das Gemisch filtriert. 4,5 ml Filtrat werden mit 0,7 ml 95prozentigem Hydrazin versetzt. Nach 4stün diger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 40 ml Wasser und 0,5 ml 10prozentiger Natriumhydroxid lösung versetzt. Das als Niederschlag gebildete 2-Carboxymethyl phenytoin-hydrazid wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und ohne weitere Reinigung eingesetzt.

15 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid werden zu einer Lösung von 5 mg 2-Carboxymethylphenytoin-hydrazid und 5 mg Carboxy fluorescein in 0,5 ml Pyridin gegeben. Nach 2stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das gebildete Reaktions produkt 2mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Ace ton (1 : 1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein 2-Car boxymethylphenytoin-hydrazid-Carboxyfluorescein-Konjugat der Formel

Beispiel 4

15 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid werden zu einer Lösung von 5 mg 8-β-Aminoäthyltheophyllin und 5 mg Carboxyfluor escein in 0,5 ml Pyridin gegeben. Nach 2stündiger Um setzung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsprodukt 2mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwen dung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (2 : 1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein 8-β-Aminoäthyltheophyl lin-Carboxyfluorescein-Konjugat der Formel

Beispiel 5

Das Verfahren von Beispiel 4 wird unter Verwendung von 8-Aminomethyltheophyllin anstelle von 8-β-Aminoäthyltheo phyllin wiederholt. Man erhält ein 8-Aminom-hyltheophyllin- Carboxyfluorescein-Konjugat der Formel

Beispiel 6

7,5 g δ-Valerolactam werden unter trockenem Stickstoff in 60 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Der Reak tionskolben wird tropfenweise mit 90 ml einer 1,6 m Lösung von n-Butyllithium in Hexan versetzt und in einem Trocken eis/Aceton-Bad gekühlt. Nach beendeter Zugabe des n-Butyl lithiums wird das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtem peratur gerührt, 30 Minuten unter Rückfluß erwärmt und sodann unter trockenem Stickstoff auf Raumtemperatur ab gekühlt. Anschließend werden unter Kühlung des Kolbens in einem Eisbad 8,0 g 1-Bromäthan langsam zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird hierauf 16 Stunden bei Raumtempera tur gerührt und sodann langsam mit 100 ml Wasser versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abtrennen der organischen Phase wird die wäßrige Phase mit 50 ml Diäthyläther extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und über Natriumsul fat getrocknet. Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene dunkle Öl kristallisiert beim Stehenlassen. Der kristalline Rückstand wird aus Petroläther umkristallisiert. Man erhält 3,8 g Rückstand. 2,8 g des Rückstands werden in 25 ml 6 n Salzsäure 6 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Nach dem Abdampfen des Wassers aus dem Reaktionsgemisch erhält man 2-Äthyl-5-aminopentansäure in Form eines dunklen, dicken Öls, das ohne weitere Reinigung weiterverwendet wird.

Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird hergestellt, indem man 5 mg N-Hydroxysuccinimid, 7,5 mg Carboxyfluor escein und 20 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Pyridin löst. Nach 2stündiger Umsetzung bei Raumtempera tur wird das Reaktionsgemisch mit 20 mg 2-Athyl-5-amino pentansäure versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht im Dunklen bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Reak tionsprodukt wird 2mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (3 : 1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein 2-Äthyl-5-aminopentansäure-Carboxyfluorescein-Konjugat der Formel

Beispiel 7

Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird hergestellt, indem man 5 mg N-Hydroxysuccinimid, 7,5 mg Carboxyfluores cein und 20 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Pyri din löst. Nach 2stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 20 mg 5-(γ-Aminopropyliden)- 5H-dibenzo[a,d]-10,11-dihydrocyclohepten versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht im Dunklen bei Raumtem peratur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2mal dünn schichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung ei nes Gemisches aus Chloroform und Methanol (3 : 1) als Lauf mittel gereinigt. Man erhält ein 5-(γ-Aminopropyliden)-5H- dibenzo[a,d]a,d7-10,11-dihydrocyclohepten-Carboxyfluorescein- Konjugat der Formel

Beispiel 8

Eine Lösung von 1,33 g Desipramin-hydrochlorid und 0,8 g Chloracetylchlorid in 25 ml Chloroform wird 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Der nach dem Abdampfen des Chloroforms erhaltene Rückstand wird in 25 ml Aceton gelöst. Die Ace tonlösung wird mit 0,75 g Natriumjodid versetzt. Die Lösung wird 30 Minuten unter Rückfluß erwärmt. Sodann wird die Lösung filtriert und das ausgefallene Salz mit Aceton ge waschen. Das Acetonfiltrat wird eingedampft und der Rück stand in 20 ml Methanol aufgenommen. Nach Zusatz von 20 ml konzentriertem Ammoniak zur Methanollösung wird die er haltene Lösung 1 Stunde unter Rückfluß erwärmt. Sodann wird das Reaktionsgemisch 3mal mit je 25 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden über Natrium sulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Man erhält N-Aminoacetyldesipramin, das ohne weitere Reinigung ein gesetzt wird. 5 mg N-Aminoacetyldesipramin und 5 mg Car boxyfluorescein werden in 0,5 ml Pyridin gelöst. Das Ge misch wird mit 15 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktion läuft 2 Stunden bei Raumtemperatur ab. Anschließend wird das Reaktionsprodukt 2mal dünnschicht chromatographisch an Kieselgel unter Verwendung eines Ge misches aus Chloroform und Aceton (1 : 1) als Laufmittel ge reinigt. Man erhält ein N-Aminoacetyldesipramin-Carboxy fluorescein-Konjugat der Formel

Beispiel 9

Eine Lösung von 5 mg N-Hydroxysuccinimid, 7,5 mg Carboxy fluorescein und 20 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Pyridin wird 4 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird ausgefällt, in dem man das Reaktionsgemisch mit 10 ml Diäthyläther ver setzt. Der Niederschlag wird filtriert, gründlich mit Di äthyläther gewaschen und in 0,5 ml Dimethylsulfoxid in Lösung gebracht. Sodann wird die Lösung mit 10 mg L-Thyro xin versetzt. Nach 2stündiger Umsetzung bei Raumtempera tur wird das Reaktionsprodukt 2mal dünnschichtchromatogra phisch an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (3 : 1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein L-Thyroxin-Carboxyfluorescein-Konjugat der Formel

Beispiel 10

Eine Lösung von 0,89 g Ammoniumacetat, 389 mg 3-Oxodigoxi genin und 63 mg Natriumcyanoborhydrid in 5 ml Methanol wird 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird die Lösung durch Zusatz von konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 1 eingestellt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser aufgenommen und 3 mal mit je 10 ml Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit festem Kaliumhydroxid auf den pH-Wert 11 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird 5 mal mit je 10 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält 3-Amino-3-des oxydigoxigenin, das ohne weitere Reinigung eingesetzt wird.

Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird hergestellt, indem man 5 mg N-Hydroxysuccinimid, 7,5 mg Carboxyfluores cein und 20 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Pyri din löst. Nach 2stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das 3-Amino-3-desoxydigoxigenin-Carboxyfluorescein- Konjugat der folgenden Formel isoliert.

Gemäß dem vorstehenden Verfahren werden folgende Tracer hergestellt.

Beispiel 11 O-Aminoacetyl-propranolol-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 12 2-Propyl-5-aminopentansäure-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 13 2-Butyl-5-aminopentansäure-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 14 Aminoprimidon-Carbcxyfluorescein-Konjugat Beispiel 15 1-(4′-Nitrophenyl)-1-hydroxy-2-amino-3-hydroxypropan- Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 16 p-Aminophenol-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 17 N-(2-Aminoäthyl)-ethosuximid-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 18 N′-Desäthyl-N-acetyl-procainamid-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 19 N′-Desäthyl-N′-aminoacetyl-N-acetyl-procainamid-Carboxy fluorescein-Konjugat Beispiel 20 1-Amino-2-phenyl-2-(2′-pyridyl)-4-(diisopropylamino)-butan- Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 21 3,3′,5-Trÿod-L-thyronin-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 22 3,3′,5,5′-Tetrajod-D-thyronin-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 23 N-Aminoacetyl-iminodibenzyl-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 24 Carbhydrazinimino-dibenzyl-Carboxyfluorescein-Konjugat Beispiel 25 Dibenzosuberonhydrazon-Fluorescein-Konjugat Beispiel 26 5-Amino-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]-cyclohepten

Wie bereits erwähnt, handelt es sich bei den Tracern der Erfindung um wirksame Reagentien zur Verwendung bei Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays. Die folgenden Bei spiele erläutern die Eignung der Tracer der Erfindung bei Immunoassays unter Anwendung von Fluoreszenzpolarisations techniken. Derartige Bestimmungen werden nach folgendem allgemeinen Verfahren durchgeführt:

1) Ein gemessenes Volumen eines Standards oder Testserums wird in ein Reagenzglas gegeben und mit Puffer verdünnt.
2) Eine bekannte Konzentration eines Tracers der Erfindung, der gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel enthält, wird sodann in die einzelnen Reagenzgläser gegeben.
3) Eine bekannte Konzentration an Antiseren wird in die Reagenzgläser gegeben.
4) Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur inkubiert.
5) Die an Antikörper gebundene Menge an Tracer wird durch Fluoreszenzpolarisationstechniken als ein Maß für die Ligandenmenge in der Probe gemessen.

Beispiel 27 Bestimmung von Phenytoin

A) Erforderliche Materialien:
- 1) BGG-Puffer, bestehend aus 0,1 m Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,01 Prozent Rinder-γ- Globulin und 0,01 Prozent Natriumazid.
- 2) Tracer, bestehend aus 2-β-Aminoäthylphenytoin-Carboxy fluorescein in einer Konzentration von etwa 105 nanomolar in BGG-Puffer mit einem Zusatz an 5 Prozent Natriumcholat.
- 3) Antiserum, bestehend aus Antiserum gegen Phenytoin, entsprechend in BGG-Puffer mit einem Gehalt an 0,005 Pro zent Benzalkoniumchlorid verdünnt.
- 4) Proben von Humanserum oder anderen biologischen Flüssig keiten mit einem Gehalt an Phenytoin.
- 5) Als Küvetten verwendete gläserne Kulturröhrchen der Ab messungen 10 × 75 mm.
- 6) Fluorimeter zur Messung der Fluoreszenzpolarisation mit einer Präzision von ± 0,001 Einheiten.
B) Bestimmungsverfahren:
- 1) Jede Küvette wird mit einem geringen Probenvolumen (0,366 µl) versetzt, indem man 15 µl Probe in ein Verdünnungsgefäß pipettiert und mit 600 µl BGG-Puffer verdünnt. Anschließend werden 15 µl der verdünnten Pro be in die Küvette pipettiert und sodann mit 600 µl BGG- Puffer versetzt.
- 2) Tracer wird zugegeben, indem man 140 µl Tracer und 1000 µl BGG-Puffer in die Küvette pipettiert.
- 3) Zum Start der Reaktion wird Antiserum zugesetzt, indem man 40 µl Antiserum und anschließend 1000 µl BGG-Puffer in die Küvette pipettiert.
- 4) Der Küvetteninhalt wird jeweils gründlich vermischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- 5) Die Fluoreszenzpolarisation wird am Fluorimeter ab gelesen. Zur Bestimmung unbekannter Proben wird eine Eichkurve aufgestellt.
C) Die Ergebnisse einer Reihe von Eichseren mit einem Phenytoingehalt zwischen 0 und 40 µl/ml sind nachstehend zusammengestellt. Die einzelnen Konzentrationen werden jeweils 2fach bestimmt und sodann die Mittelwerte be rechnet.

Phenytoinkonzentration (µm/ml)

Polarisation

0

0,222

2,5 0,196

5,0 0,178

10,0 0,154

20,0 0,132

40,0 0,110

Es ist ersichtlich, daß die Polarisation der Fluoreszenz in regelmäßiger Weise mit zunehmender Phenytoinkonzentra tion abnimmt, was die Aufstellung einer Eichkurve er möglicht. Unbekannte, auf identische Weise behandelte Proben können mit Hilfe der Eichkurve quantitativ bestimmt werden. Die vorstehenden Ausführungen belegen also die Eig nung von 2-β-Aminoäthylphenytoin-Carboxyfluorescein zur Messung von Phenytoin.

Beispiel 28 Bestimmung von Phenobarbital

A) Erforderliche Materialien:
- 1) BGG-Puffer (vgl. Phenytoin).
- 2) Tracer, bestehend aus Aminophenobarbital-Carboxyfluor escein in einer Konzentration von etwa 110 nanomolar in Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,01 Prozent Natriumazid, 0,01 Prozent Rinder-γ-Globulin und 0,125 Prozent Natriumdodecylsulfat.
- 3) Antiserum, bestehend aus Antiserum gegen Phenobarbital, entsprechend verdünnt in BGG-Puffer mit einem Gehalt an 0,005 Prozent Benzalkoniumchlorid.
- 4) Proben von Humanserum oder anderen biologischen Flüssig keiten mit einem Gehalt an Phenobarbital.
- 5) Küvetten (vgl. Phenytoin).
- 6) Fluorimeter (vgl. Phenytoin).
B) Bestimmungsverfahren:
- 1) In die Küvette wird ein geringes Probenvolumen (0,196 µl) gegeben, indem man 10 µl Probe in ein Verdünnungsgefäß pipettiert und mit 500 µl BGG-Puffer verdünnt. Sodann wer den 10 µl verdünnte Probe und hierauf 500 µl BGG-Puffer in die Küvette pipettiert.
- 2) Tracer wird zugesetzt, indem man jeweils 140 µl Tracer und 1000 µl BGG-Puffer in die Küvetten pipettiert.
- 3) Antiserum wird zum Start der Reaktion zugesetzt, in dem man 140 µl Antiserum und anschließend 1000 µl BGG- Puffer pipettiert.
- 4) Der Inhalt sämtlicher Küvetten wird gründlich ver mischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- 5) Die Fluoreszenzpolarisation wird mittels eines Fluori meters abgelesen. Zur Bestimmung von unbekannten Proben wird eine Eichkurve aufgestellt.
C) Die Ergebnisse einer Reihe von Serumstandards mit einem Gehalt an Phenobarbital zwischen 0 und 80 µg/ml sind nach stehend angegeben. Für jede Konzentration wird eine Doppel bestimmung vorgenommen und gemittelt.

Phenobarbitalkonzentration (µl)

Polarisation

0

0,250

5,0 0,231

10,0 0,196

20,0 0,150

40,0 0,104

80,0 0,0770

Es ist ersichtlich, daß die Polarisation der Fluoreszenz in regelmäßiger Weise mit zunehmender Phenobarbital konzentration abnimmt, was die Aufstellung einer Eich kurve ermöglicht. Unbekannte, auf identische Weise be handelte Proben können mittels der Eichkurve quantitativ bestimmt werden. Somit eignet sich Aminophenobarbital- Carboxyfluorescein zur Messung von Phenobarbital.

Beispiel 29 Bestimmung von Theophyllin

A) Erforderliche Materialien:
- 1) Tracer, bestehend aus 2 nanomolar 8-Aminoäthyltheophyl lin-Carboxyfluorescein in BGG-Puffer (vgl. Phenytoinbestim mung) mit einem Gehalt an 0,01 Prozent Natriumdodecylsul fat.
- 2) Antiserum, bestehend aus Antiserum gegen Theophyllin, in BGG-Puffer entsprechend verdünnt.
- 3) Proben von Humanserum oder anderen biologischen Flüssig keiten mit einem Gehalt an Theophyllin.
- 4) Küvetten (vgl. Phenytoinbestimmung).
- 5) Fluorimeter (vgl. Phenytoinbestimmung).
B) Bestimmungsverfahren:
- 1) Jeweils 1,0 ml Tracer in die Küvette geben.
- 2) Jeweils 2,0 µl Probe in die Küvette geben.
- 3) Jede Küvette mit jeweils 1,0 ml Antiserum versetzen.
- 4) Gründlich mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- 5) Die Fluoreszenzpolarisation am Fluorimeter ablesen und eine Eichkurve aufstellen.
C) Die Ergebnisse einer Reihe von Serumstandards mit ei nem Gehalt an Theophyllin in Konzentrationen zwischen 0 und 40 µg/ml sind nachstehend wiedergegeben. Für jede Konzentration wird eine Doppelbestimmung durchgeführt und gemittelt.

Theophyllinkonzentration (µm/ml)

Polarisation

0

0,158

2,5 0,118

5 0,105

10 0,091

20 0,076

40 0,063

Es ist ersichtlich, daß die Polarisation der Fluoreszenz in regelmäßiger Weise mit zunehmender Theophyllinkon zentration abnimmt, was die Aufstellung einer Eichkurve ermöglicht. Unbekannte, auf identische Weise behandelte Proben können mit Hilfe der Eichkurve quantitativ be stimmt werden. Somit eignet sich 8-Aminoäthyltheophyllin- Carboxyfluorescein zur Messung von Theophyllin.

Beispiel 30 Bestimmung von Digoxin

A) Erforderliche Materialien:
- 1) BGG-Puffer, bestehend aus 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,01 Prozent Rinder-γ- Globulin und 0,01 Prozent Natriumazid.
- 2) Tracer, bestehend aus Digoxin-Carboxyfluorescein in einer Konzentration von etwa 2 nanomolar in BGG-Puffer.
- 3) Antiserum, bestehend aus Kaninchenantiserum gegen Digo xin, entsprechend verdünnt in BGG-Puffer.
- 4) Proben von Humanserum oder anderen biologischen Flüssig keiten mit einem Gehalt an Digoxin.
- 5) Fällungsreagens: 5prozentige Trichloressigsäure in Wasser.
- 6) Küvetten: Gläserne Kulturröhrchen der Abmessungen 10 × 75 mm.
- 7) Fluorimeter zur Messung der Fluoreszenzpolarisation mit einer Genauigkeit von ± 0,001 Einheiten.
B) Bestimmungsverfahren:
- 1) 100 µl 5prozentige Trichloressigsäure wird in einem Reagenzglas mit 100 µl Standard oder unbekannter Probe versetzt. Die die Probe enthaltenden Röhrchen werden ver schlossen und gründlich geschüttelt (vortexed).
- 2) Die den Standard oder die Probe in Trichloressigsäure enthaltenden Röhrchen werden zentrifugiert.
- 3) Ein Reagenzglas mit 1,8 ml BGG-Puffer und 25 µl Anti serum wird bei 35°C mit 150 µl des Trichloressigsäure überstands versetzt.
- 4) Die Antiserum und Überstand enthaltenden Reagenzgläser werden 6 Minuten bei 35°C inkubiert. Anschließend wird die Fluoreszenzpolarisation der Reagenzgläser gemessen. Bei dieser Messung handelt es sich um die Hintergrund fluoreszenz-Polarisation des Standards oder der unbe kannten Probe.
- 5) 10 Minuten nach der Zugabe des Überstands zum Antiserum werden 25 µl Tracer in das Reagenzglas gegeben.
- 6) 6 Minuten nach der Zugabe des Tracers wird die Fluores zenzpolarisation der Standard- und Probenröhrchen gemessen. Die auf die vorstehende Weise ermittelte Hintergrundfluores zenzpolarisation wird subtrahiert, wodurch man die Fluores zenzpolarisation des gebildeten Antikörper-Tracer-Komplexes erhält.
- 7) Die Ergebnisse einer Reihe von Serumstandards mit einem Gehalt an Digoxin in Konzentrationen zwischen 0 und 5 ng/ml sind nachstehend wiedergegeben. Für jede Konzentration wird eine Vierfachbestimmung durchgeführt und gemittelt.
  
  Digoxinkonzentration (ng/ml)
  
  Polarisation
  
  0
  
  0,142
  
  0,5 0,134
  
  1,0 0,123
  
  2,0 0,106
  
  3,0 0,092
  
  5,0 0,070
  
  Es ist ersichtlich, daß die Polarisation der Fluoreszenz in regelmäßiger Weise mit zunehmender Digoxinkonzentration abnimmt, was die Aufstellung einer Eichkurve erlaubt. Un bekannte, in identischer Weise behandelte Proben können mittels der Eichkurve quantitativ bestimmt werden, was die Eignung von Digoxin-Carboxyfluorescein zur Messung von Digoxin belegt.

In der nachstehenden Tabelle sind verschiedene Fluores zenzpolarisationsbestimmungen zusammengestellt, die gemäß den vorstehenden Ausführungen unter Verwendung der gemäß den Beispielen hergestellten Tracer durchgeführt werden können. Für die einzelnen Tracer ist jeweils die entspre chende Nummer des Herstellungsbeispiels und der bzw. die spezifischen Liganden angegeben.

Beispiel Nr.
Ligand(en)
1
Phenobarbital
2	Phenytoin
3	Phenytoin
4	Theophyllin
5	Theophyllin
6	Valproasäure
7	Nortriptylin; Amitriptylin
8	Imipramin; Desipramin
9	Thyroxin
10	Digoxin
11	Propranolol
12	Valproasäure
13	Valproasäure
14	Primidon
15	Chloramphenicol
16	Acetaminophen
17	Ethosuximid
18	N-Acetylprocainamid
19	N-Acetylprocainamid
20	Disopyramid
21	Trÿodthyronin
22	Thyroxin
23	Imipramin; Desipramin
24	Imipramin; Desipramin
25	Nortriptylin; Amitriptylin
26	Nortriptylin; Amitriptylin

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß die Tracer der Erfindung wirksame Reagentien für Fluoreszenz polarisationsimmunoassays sind. Zusätzlich zu den vorer wähnten Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen Tracer thermisch sehr stabil, besitzen ein hohes Maß an gebun dener Polarisation, gewährleisten hohe Quantenausbeuten und sind relativ leicht herzustellen und zu reinigen.

Versuchsbericht

Von der Anmelderin wurden unter der Leitung von Stephen D. Stroupe, einem Miterfinder der vorliegenden Erfindung, Unter suchungen durchgeführt, in denen das Verhalten eines erfindungsgemäßen Carboxyfluorescein-Tracers und eines herkömmli chen Fluoresceinisothiocyanat-Tracers bei Fluoresezenzpolari sationstests verglichen wurde. Insbesondere wurden die Polarisa tionswerte und das Signal-Rausch-Verhältnis für die einzelnen Tracer bei einer bekannten Antikörperkonzentration gemessen und miteinander verglichen.

Zunächst wurden der Carboxyfluorescein-Tracer und der Fluo resceinisothiocyanat-Tracer (Digoxinderivate) hergestellt. Anschließend wurden mit den beiden Tracern getrennte Fluo reszenzpolarisationstests durchgeführt, um damit bekannte Konzentrationen von Digoxin zu prüfen. Die Antikörperkonzen tration, das Probenvolumen, das Pipettierschema und die In kubationszeiten waren jeweils identisch. Es wurden lediglich unterschiedliche Tracer verwendet.

Für die Tests wurden die nachstehenden Polarisationswerte ermittelt:

Die Werte der vorstehenden Tabelle sind in der beigefügten Figur A graphisch dargestellt. Der Carboxyfluorescein-Tracer weist eine "Spanne" von 97,3 Millipolarisationseinheiten im Vergleich von einem Wert von nur 60,1 für den herkömmlichen Tracer auf. Je größer diese Spanne ist, desto höher ist auch die Präzision der Testdurchführung. Somit zeigt der erfindungsgemäße Tracer eine wesentlich höhere Präzision als der herkömmliche Tracer, da die Spanne erfindungsgemäß mehr als 60% größer ist.

Ferner wurde das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) für die Tracer gemessen. Dieser Wert stellt die Intensität des Tracers dividiert durch den Leerwert dar. Das S/N-Verhältnis wurde aus Ergebnissen von Tests berechnet, die mit Digoxin-Antikörper unter Verwendung der beiden Tracer durchgeführt wurden. Ferner wurde auch versucht, in einem Testansatz die Spannen von Fluoresceinisothiocyanat und Carboxyfluorescein aneinander anzupassen. Dafür wurde die Konzentration von Fluoresceiniso thiocyanat von 0,4 nanomolar auf 0,2 nanomolar verringert. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengestellt.

Die Ergebnisse zeigen, daß das Signal-Rausch-Verhältnis für Beispiel I mit dem von Beispiel II vergleichbar ist, jedoch ist der Wert der Spanne für Beispiel I erheblich besser. Bei vergleichbaren Spannen (Beispiele I und III) ergibt sich für das Beispiel III ein unterlegenes S/N-Verhältnis. Somit erweist sich der in Beispiel I verwendete erfindungsgemäße Tracer als erheblich günstiger, wenn man das Gleichgewicht zwischen Spanne und S/N-Verhältnis berücksichtigt.

Claims

1. Carboxyfluorescein-Derivate der allgemeinen Formel in der R ein Ligandenanaloges mit einer einzelnen reak tiven primären oder sekundären Aminogruppe bedeutet, die an ein Carbonylkohlenstoffatom eines Carboxyfluo resceinrestes gebunden ist und sich von einer Verbin dung aus folgender Gruppe ableitet:
o-, m- oder p-Aminophenobarbital der Formel 2-β-Aminoethylphenytoin, 8-β-Aminoethyl- oder 8-Aminomethyltheophyllin der Formel wobei n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder 2 ist, 2-Ethyl-, 2-n-Propyl- und 2-n-Butyl-5-aminopentansäure der Formel in der p eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 4 ist, 5-(γ-Aminopropyliden)-5H-dibenzo[a,d]-10,11-dihydro cyclohepten, Nortriptylin, Desipramin oder N-Aminoacetyldesipramin, Thyroxin oder Trÿodthyronin der Formel wobei R′ ein Wasserstoff- oder Jodatom bedeutet, 3-Amino-3-desoxydigoxigenin der Formel Propranolol, O-Aminoacetylpropranolol der Formel o-, m- oder p-Aminoprimidon der Formel 1-(4′-Nitrophenyl)-1-hydroxy-2-amino-3-hydroxypropan, p-Amlnophenol, N-(2-Aminoethyl)-ethosuximid, N′-Desethyl-N-acetyl-procainamid oder N′-Desethyl-N- acetyl-N′-amjnoacetylprocainamid, 1-Amino-2-phenyl-2-(2′-pyridyl)-4-(diisopropylamino)- butan, N-Aminoacetyliminodibenzyl, Carbhydraziniminodibenzyl, Dibenzosuberonhydrazon, 5-Amino-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]-cyclohepten, wobei n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 und m 0 oder 1 sind, sowie biologisch verträgliche Salze davon.

2. Carboxyfluorescein-Derivat nach Anspruch 1, worin R sich von wobei n 2 und in 0 sind, oder 2-Carboxymethylphenytoinhy drazid ableitet, sowie biologisch verträgliche Salze davon.

3. Verfahren zur Bestimmung von Liganden in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einer Verbindung nach Anspruch 1 als Tracer und einem Anti körper der spezifisch den Liganden und den Tracer er kennen kann, vermischt und anschließend die Menge des an den Antikörper gebundenen Tracers mittels einer Fluoreszenzpolarisationstechnik bestimmt.