DE69231559T2 - Reagenzien und verfahren zur quantifizierung des totalgehaltes an doxepinen in biologischen flüssigkeiten - Google Patents
Reagenzien und verfahren zur quantifizierung des totalgehaltes an doxepinen in biologischen flüssigkeitenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung handelt von der Immunoassay-Bestimmung von Doxepinen in einer Testprobe. Insbesondere handelt die vorliegende Erfindung von Immonogenen, von Antiseren, die von diesen Immunogenen gebildet werden, und von markierten Reagenzien für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine in einer Testprobe, vorzugsweise für die Verwendung in einem Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay.
- Die Überwachung des therapeutischen Arzneimittelpegels in biologischen Flüssigkeiten wie z. B. Serum, Plasma, Vollblut, Urin und ähnliches ist inzwischen recht nützlich geworden, um Ärzten die Informationen zu liefern, die bei der Behandlung von Patienten behilflich sind. Die Überwachung solcher Arzneimittelpegel ermöglicht die Einstellung der Patientendosis, um optimale therapeutische Effekte zu erzielen, und hilft, sowohl therapeutisch zu geringe als auch toxische Pegel zu verhindern. Doxepin ist ein trizyklisches Antidepressivum, das in zwei isomeren Formen vorliegt: E-Doxepin (Formel IA, R=CH&sub3; und Z-Doxepin (Formel IB, R=CH&sub3;):
- Auch wenn für Doxepin herausgefunden wurde, dass es sehr wirksam für die Behandlung chronischer Depressionen ist, muss seine Konzentration im Blut eines Patienten in einem therapeutischen Bereich gehalten werden. Normalerweise führt eine bestimmte Dosis bei verschiedenen Patienten im humanen Plasma zu einer Konzentration, die eine große Schwankungsbreite aufweist. Hohe Dosismengen wurden jedoch mit Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Toxizität, Bluthochdruck, Krämpfen, Koma und Tod in Zusammenhang gebracht. Da einzelne Patienten sehr unterschiedlich auf Doxepin reagieren, ist es notwendig, die Therapie durch Messen des Arzneimittelpegels beispielsweise im Serum oder Plasma des Patienten zu überwachen.
- Doxepin wird als ein Gemisch des E-Doxepin- und Z-Doxepin-Isomers, die auch als trans- Doxepin bzw. cis-Doxepin bezeichnet werden, in einem Verhältnis von etwa 85 : 15 (E : Z) verabreicht. Nach der Verabreichung wird Doxepin durch N-Demethylierung metabolisiert und bildet Desmethyldoxepin, das ebenfalls wirksam ist und das auch sowohl als E- als auch als Z-Isomeres vorliegt (Formeln IA und IB, R=H). Für Desmethyldoxepin wurden für verschiedene Patienten unterschiedliche Isomerenverhältnisse berichtet.
- Da sowohl Doxepin (E-Isomer und Z-Isomer) als auch Desmethyldoxepin (E-Isomer und Z- Isomer) für die Behandlung von Depressionssymptomen wirksam sind, basieren konventionelle diagnostische Techniken für die Bestimmung von Doxepinpegeln auf der Messung von Pegeln der entsprechenden Isomere von Doxepin und Desmethyldoxepin, wobei der therapeutische Bereich, der dem Blutpegel eines Patienten zugeschrieben wird, die Gesamtmenge an Doxepinen und Desmethyldoxepinen ist, d. h. E-Doxepin plus Z- Doxepin plus E-Desmethyldoxepin plus Z-Desmethyldoxepin gleich Gesamtdoxepine. Konzentrationen unterhalb dieses Bereichs gelten für die Behandlung von Depressionen als therapeutisch zu gering, während Pegel oberhalb dieses Bereichs mit unerwünschten Nebenwirkungen einschließlich Komplikationen des Herz-Kreislauf-Systems, anticholinergischen Effekten und Sedierung in Zusammenhang gebracht werden können, ohne daß eine Zunahme der antidepressiven Wirksamkeit zu beobachten wäre.
- Auch wenn die Pegel von Doxepinen und Desmethyldoxepinen durch chromatographische Techniken gemessen werden können, z. B. durch Hochleistungsflüssigchromatographie [Park, J. of. Chromatogr., 375, 202-206 (1986)] oder Gaschromatographie [Rosseel et al J. Pharm. Sci., 67, 802-805 (1978)], sind solche Techniken sehr arbeitsintensiv und benötigen ein hoch qualifiziertes Personal für die Durchführung verschiedener umständlicher Schritte, die zeitaufwendig und langwierig sind. Ebenso wurden Derivate des trizyklischen Antidepressivums, die als Amitriptylin bekannt sind, eingesetzt für die Bildung von Antiseren und markierten Reagenzien, die in einem Radioimmunoassaysystem für die Bestimmung von Doxepin- und Desmethyldoxepinpegeln verwendet werden [Midha und Charette, Communications in Psychopharmacol., 4, 11-15 (1980); Virtanen et al., Acta. Pharmacol. Et. Toxicol., 47, 274-278 (1980)]. Jedoch gelang es mit solchen Techniken unter Einsatz nichtisomerer Immunogene (d. h. Bindung eines N-substituierten Amitriptylins an einen Proteinträger) und nichtisomerer markierter Reagenzien nicht, Isomere von Doxepin und Desmethyldoxepin gleichwertig zu erkennen. Insbesondere ist ein nicht-spezifischer Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA) für den Nachweis der Gesamtmenge der vier wichtigsten trizyklischen Antidepressiva kommerziell erhältlich und in der europäischen Patentanmeldung Nr. 226.730 und U.S. Pat. No. 4.420.568 beschrieben, wobei die durch diesen Test bestimmte Konzentration nur eine grobe Schätzung der Gesamtmenge trizyklischer Antidepressiva im Plasma oder Serum ist. Daher können solche Tests nicht dazu verwendet werden, die Gesamtmenge aller vier Isomere von Doxepin und Desmethyldoxepin quantitativ zu bestimmen.
- U.S. Patent No. 4.495.281 offenbart Antikörper, Immunogene für die Herstellung der Antikörper und Tracer, die in Immunoassays für Doxepine nützlich sind, wobei die Immunogene und Tracer für Doxepin nicht die gleichen sind wie die für Desmethyldoxepin.
- Die vorliegende Erfindung handelt von einem ersten Immunoassayverfahren für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine in einer Testprobe, wobei diese Gesamtdoxepine eine oder mehrere der Komponenten E-Doxepin, Z-Doxepin, E- Desmethyldoxepin und Z-Desmethyldoxepin enthalten, und wobei das Verfahren aus den Schritten besteht:
- (a) Testprobe mit dem E-Isomer und dem Z-Isomer eines markierten Reagenzes und einem Antikörperreagenz in Kontakt bringen zur Bildung einer Reaktionslösung, wobei das Antikörperreagenz Antikörper enthält, die in der Lage sind, sich an alle Doxepine zu binden, worin (i) diese Antikörper hergestellt werden mit Immunogenen der Formeln:
- und
- worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist, und worin (ii) das markierte Reagenz eine Zusammensetzung ist eines Gemischs aus
- und
- worin Q' eine nachweisbare Komponente ist; und
- (b) Messen der Menge des markierten Reagenzes in dieser Reaktionslösung, die als Funktion der Gesamtdoxepine in dieser Testprobe entweder an der Bindungsreaktion teilgenommen hat oder nicht.
- Die vorliegende Erfindung handelt darüber hinaus von einem zweiten Immunoassayverfahren für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine in einer Testprobe, wobei diese Gesamtdoxepine eine oder mehrere der Komponenten E-Doxepin, Z-Doxepin, E-Desmethyldoxepin und Z-Desmethyldoxepin enthalten, und wobei die Methode aus den Schritten besteht:
- (a) In Kontakt bringen der Testprobe mit einem Antikörperreagenz und dem E-Isomer und dem Z-Isomer eines markierten Reagenzes zur Bildung einer Reaktionslösung, wobei das Antikörperreagenz Antikörper enthält, die in der Lage sind, sich an alle Doxepine zu binden, worin (i) diese Antikörper hergestellt werden mit einem Immunogen der Formel:
- worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist, und worin (ii) das markierte Reagenz eine Zusammensetzung ist eines Gemischs aus
- und
- worin Q' eine nachweisbare Komponente ist; und
- (b) Messen der Menge des markierten Reagenzes in dieser Reaktionslösung, die als Funktion der Gesamtdoxepine in dieser Testprobe entweder an der Bindungsreaktion teilgenommen hat oder nicht.
- Es versteht sich von selbst, dass eine Testprobe nicht notwendigerweise gleichzeitig jedes einzelne der E- und Z-Isomere von Doxepin und der E- und Z-Isomere von Desmethyldoxepin enthalten muss, aber dass diese allein oder in allen möglichen Kombinationen und Verhältnissen vorhanden sein können. Entsprechend soll der Ausdruck "Gesamtdoxepine" und deren quantitative Bestimmung, wie er hierin verwendet wird, die quantitative Bestimmung jedes einzelnen, jeder Kombination oder jedes Verhältnisses von Doxepinen und Desmethyldoxepinen in einer Testprobe umfassen.
- Insbesondere wird die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine mit einem Immunoassay nach der vorliegenden Erfindung erreicht, indem erstmals die Testprobe mit einem markierten Reagenz und einem Antikörperreagenz in Kontakt gebracht wird, entweder gleichzeitig oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge.
- Die vorliegende Erfindung handelt darüber hinaus von Antiseren und markierten Reagenzien für die Verwendung in den Immunoassayverfahren der Erfindung, von den Immunogenen, die für die Aufzucht dieser Antiseren verwendet werden, und von Kits, die für die Durchführung der Immunoassayverfahren der Erfindung nützlich sind.
- Abb. 1 stellt einen Syntheseweg für die Herstellung eines Immunogens und eines fluoreszierend markierten Reagenzes der vorliegenden Erfindung dar, die von (E)-Doxepin abgeleitet sind.
- Abb. 2 stellt einen Syntheseweg für die Herstellung eines Immunogens und eines fluoreszierend markierten Reagenzes der vorliegenden Erfindung dar, die von (Z)-Doxepin abgeleitet sind.
- Abb. 3 stellt einen Syntheseweg für die Herstellung eines Immunogens und einer fluoreszierend markierten Reagenzes der vorliegenden Erfindung dar.
- Abb. 4 stellt einen Syntheseweg für die Herstellung fluoreszierend markierter Reagenzien der vorliegenden Erfindung dar.
- Abb. 5 ist ein Diagramm, in dem die quantitative Bestimmung von Doxepin und Desmethyldoxepin durch Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay mit einem Abbott TDx®- Analyzer unter Verwendung von Antikörpern und markierten Reagenzien, die aus Doxepinderivaten hergestellt wurden, dargestellt ist, und in dem die Änderung des mP-Werts für jedes der E- und Z-Isomere für Doxepin und Desmethyldoxepin dargestellt ist, wie durch den in Beispiel 11 beschriebenen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay bestimmt.
- Abb. 6 ist ein Diagramm, in dem die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine durch Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay mit einem Abbott TDx®-Analyzer unter Verwendung von Antikörpern und markierten Reagenzien, die aus Doxepinderivaten hergestellt wurden, dargestellt ist, und in dem die Änderung des mP-Werts für jedes der E- und Z-Isomere für Doxepin und Desmethyldoxepin dargestellt ist, wie durch den in Beispiel 11 beschriebenen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay bestimmt.
- Abb. 7 ist ein Diagramm, in dem die Genauigkeit des Verfahrens Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay mit einem Abbott TDx®-Analyzer, wie in Beispiel 11 für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine der vorliegenden Erfindung beschrieben, im Vergleich zur Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) dargestellt ist.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine erreicht, indem erstens die Testprobe mit einem markierten Reagenz und einem Antikörperreagenz in Kontakt gebracht wird, entweder gleichzeitig oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge, dann die Menge des markierten Reagenzes gemessen wird, die an einer Bindungsreaktion mit dem Antikörperreagenz als Funktion der Menge der Gesamtdoxepine in der Testprobe entweder teilgenommen hat oder nicht. Insbesondere handelt die vorliegende Erfindung von Immunogenen, von Antisera, die mit diesen Immunogenen gebildet werden, und von markierten Reagenzien, die im Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine verwendet werden können.
- Gemäß einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden Antikörper in einem Satz von Wirtstieren gebildet, der mit einem E-Doxepinimmunogen immunisiert wurde, und Antikörper werden in einem weiteren Satz von Wirtstieren gebildet, der mit einem Z- Doxepinimmunogen immunisiert wurde, wobei es sich bei den E- und Z-Immunogenen um die handelt, die in dem ersten Verfahren weiter oben aufgeführt sind.
- Das markierte Reagenz wird mit dem E-Doxepinderivat und dem Z-Doxepinderivat hergestellt, die in dem ersten Verfahren weiter oben aufgeführt sind, und als Zusammensetzung zweier solcher Derivate verwendet. Die Antiseren umfassen eine Zusammensetzung, die ein Gemisch aus allen Antiseren ist (eingestellt auf äquivalente Titer), die aus dem E-Doxepin-Immunogen und dem Z-Doxepin-Immunogen bei einem Verhältnis zwischen 4 : 1 bzw. 1 : 4, besser zwischen 2 : 1 bzw. 1 : 2, gebildet wurden. Das markierte Reagenz umfaßt eine Zusammensetzung aus einem Gemisch des E-Doxepin- markierten Reagenzes und des Z-Doxepin-markierten Reagenzes in einem Verhältnis zwischen 2 : 1 bzw. 1 : 6, besser zwischen 1 : 1 bzw. 1 : 4. Besser umfassen die Antiseren eine Zusammensetzung eines Gemischs aus allen Antiseren (eingestellt auf äquivalente Titer), die aus dem E-Doxepin-Immunogen und dem Z-Doxepin-Immunogen bei einem Verhältnis von etwa 1 : 1 gebildet werden, und das markierte Reagenz umfaßt eine Zusammensetzung eines Gemischs des E-Doxepin-markierten Reagenzes bzw. des Z-Doxepin-markierten Reagenzes in einem Verhältnis von etwa 1 : 2.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführung ist das immunogene Trägermaterial Rinderserumalbumin und die nachweisbare Komponente 6-Fluorescein.
- Gemäß einer anderen Ausführung der vorliegenden Erfindung werden ein Immunogen auf der Basis von Dibenzoxazepin, wobei es davon keine isomeren Formen gibt, und ein fluoreszierendes Tracerreagenz auf der Basis von Doxepin eingesetzt. Insbesondere werden Antikörper, die von dem Dibenzoxazepinimmunogen, wie in dem zweiten Verfahren weiter oben aufgeführt, gebildet werden, in einem Immunoassaysystem eingesetzt mit einem markierten Reagenz, das aus einem fluoreszierenden Tracerreagenz mit einem E-Doxepin- Tracer und einem Z-Doxepin-Tracer, wie in dem zweiten Verfahren weiter oben aufgeführt, besteht. Bevorzugt werden Rinderserumalbumin als immunogenes Trägermaterial und Aminomethylfluorescein als nachweisbare Komponente.
- Gemäß dieser Ausführung umfassen die Antiseren die Antiseren, die von dem Dibenzoxazepin-Immunogen gebildet werden, und das fluoreszierende Tracerreagenz umfaßt eine Zusammensetzung eines Gemischs des fluoreszierenden E-Doxepin-Tracers und des fluoreszierenden Z-Doxepin-Tracers in einem Verhältnis von zwischen 2 : 1 und 1 : 6, besser zwischen 1 : 1 bzw. 1 : 4, und am besten etwa 1 : 2.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde unerwartet und überraschenderweise herausgefunden, dass für die quantitative Bestimmung des Gesamtdoxepins die Kombination der neuartigen Immunogene, die für die Aufzucht von Antikörpern verwendet werden, und der neuartigen fluoreszierenden Tracer, die in dem ersten Verfahren weiter oben aufgeführt wurden, entscheidend war für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine, wie durch die vorliegende Erfindung beabsichtigt. Diese vorteilhafte Kombination einzelner Reagenzien bietet einen Vorteil in der Technik der quantitativen Bestimmung der Gesamtdoxepine. Diese Zusammensetzung isomerer Immunogene und isomerer Tracer wurde verwendet, um die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine in Testproben zu erreichen, von denen bekannt ist, dass sie einen breiten Bereich aufweisen für die Verhältnisse E-Doxepin (IA, R=CH&sub3;): Z-Doxepin (IB, R=CH&sub3;): E-Desdoxepin (IA, R=H): Z-Desmethyldoxepin (IB, R=H), wie Abb. 5 und Abb. 6 zeigen. Die Leistungsfähigkeit der oben genannten Kombination ist durch Korrelation mit der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) in Abb. 7 dargestellt.
- Doxepinderivate können für die Herstellung von Immunogenen der vorliegenden Erfindung durch Kopplung an konventionelle Trägermaterialien eingesetzt werden, die danach verwendet werden, um Antikörper zu erhalten, oder sie können verwendet werden, um markierte Reagenzien zu bilden, die als Nachweisreagenzien in Immunoassays für die Bestimmung der Gesamtdoxepine in einer Testprobe dienen. Insbesondere können Doxepinderivate an immunogenes Trägermaterial über verschiedene konventionelle Techniken, die auf diesem Gebiet bekannt sind, gekuppelt werden.
- Wie für den Fachmann auf diesem Gebiet selbstverständlich sein wird, kann das immunogene Trägermaterial aus den konventionell bekannten ausgewählt werden, und in den meisten Fällen wird es ein Protein oder Polypeptid sein, auch wenn andere Materialien wie Kohlenhydrate, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Nucleinsäuren und dergleichen bei ausreichender Größe und Immunogenität ebenfalls eingesetzt werden können. Vorzugsweise ist das immunogene Trägermaterial ein Protein wie Rinderserumalbumin, Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH, das Hämocyanin der marinen Schlüssellochschnecke) oder Thyreoglobulin und ähnliches. Die Immunogene der vorliegenden Erfindung können für die Herstellung von Antikörpern, sowohl polyklonalen als auch monoklonalen, verwendet werden, nach Verfahren, die auf diesem Gebiet bekannt sind, für die Verwendung in einem Immunoassaysystem gemäß der vorliegenden Erfindung. Im allgemeinen wird einem Wirtstier wie z. B. einem Kaninchen, einer Ziege, einer Maus, einem Meerschweinchen oder einem Pferd an einer oder an verschiedenen Stellen das Immunogen injiziert, normalerweise vermischt mit einem Adjuvans. Weitere Injektionen werden an der gleichen Stelle oder an verschiedenen Stellen in regelmäßigen oder unregelmäßigen Intervallen vorgenommen, wobei anschließend Blut entnommen wird, um den Antikörpertiter zu beurteilen, bis festzustellen ist, dass der optimale Titer erreicht wurde. Die Antikörper werden entweder durch Blutentnahme vom Wirtstier erhalten, bis ein bestimmtes Volumen Antiserum vorliegt, oder durch somatische Zellhybridisierungstechniken oder andere Techniken, die auf dem Gebiet der Beschaffung monoklonaler Antikörper bekannt sind.
- Bei der Durchführung eines Immunoassays für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine gemäß der vorliegenden Erfindung können verschiedene auf diesem Gebiet bekannte heterogene und homogene Immunoassaysystemformen befolgt werden. Hierzu gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Sandwich-Techniken und immunometrische Techniken.
- Zu den nachweisbaren Markern gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Enzyme, radioaktive Marker, Biotin, Toxine, Arzneistoffe, Haptene, DNA, RNA, Liposomen, Chromophoren, chemilumineszierende Verbindungen, farbige Partikel und farbige Mikropartikel, fluoreszierende Verbindungen wie Aminomethylfluorescein, Aminofluorescein, 5-Carboxyfluorescein, 6-Carboxyfluorescein, 5-Fluoresceinyl, 6-Fluoresceinyl, Thioharnstofffluorescein und Methoxytriazinolylaminofluorescein, und ähnliches. Wie hierin beschrieben, kann die Testprobe eine natürlich vorkommende oder künstlich gebildete Flüssigkeit oder ein Extrakt daraus sein, und hierzu gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, biologische Testproben wie Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Exkremente, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit und Hirngewebe und ähnliches. Des weiteren kann es sich bei der Testprobe um einen Extrakt der Testprobe handeln oder ein beliebiges Derivat davon.
- In einem Kompetitiv-Immunoassaysystem konkurriert eine zu messende Substanz, oftmals als Ligand bezeichnet, mit einer Substanz von großer struktureller Ähnlichkeit, die an eine nachweisbare Komponente gekuppelt ist, oftmals als Tracer bezeichnet, um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen auf Antikörpern, die für den Teil oder die Teile des Liganden oder Tracers mit struktureller Ähnlichkeit spezifisch sind, und mit einem Immunogen geteilt werden, das für die Bildung dieser Antikörper eingesetzt wird.
- Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine, wie sie hier beschrieben wird, insbesondere nützlich in einem Fluoreszenzpolarisationsimmunoassaysystem, bei dem die nachweisbare Komponente des Tracers eine fluoreszierende Komponente ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinen, Aminofluoresceinen, Aminomethylfluoresceinen, Carboxyfluoresceinen und dergleichen besteht. Die Menge des an den Antikörper gebundenen Tracers verhält sich umgekehrt proportional zu der Menge der in der Testprobe vorhandenen Gesamtdoxepine. Dementsprechend sind die relativen und daher charakteristischen Bindungsaffinitäten der Gesamtdoxepine und des Tracers zur Antikörperbindungsstelle wichtige Parameter für das Assaysystem. Im allgemeinen basieren Fluoreszenzpolarisationstechniken auf dem Prinzip, dass ein fluoreszierender Tracer bei Anregung durch planares polarisiertes Licht einer charakteristischen Wellenlänge Licht einer anderen charakteristischen Wellenlänge (d. h. Fluoreszenz) emittiert, das einen Teil der Polarisation des einfallenden stimulierenden Lichts beibehält, der umgekehrt proportional zu der Rotationsgeschwindigkeit des Tracers in einem bestimmten Medium ist. Als Konsequenz dieser Eigenschaft hält eine Tracersubstanz mit eingeschränkter Rotation, z. B. in einer viskosen Lösung oder wenn die Tracersubstanz an eine andere Lösungskomponente mit einer relativ niedrigen Rotationsgeschwindigkeit gebunden ist, einen relativ gesehen größeren Teil der Polarisation des emittierten Lichts zurück als in einer freien Lösung. Deshalb sollten innerhalb des Zeitrahmens, in dem der Ligand und der Tracer um die Bindung an den Antikörper konkurrieren, die Tracer- und die Ligandbindungsrate zu einer geeigneten Proportion an freiem und gebundenem Tracer führen unter Beibehaltung wichtiger Leistungsparameter wie Selektivität, Sensitivität und Genauigkeit.
- Bei der Durchführung eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Testprobe, von der angenommen wird, dass sie Gesamtdoxepine enthält, mit Antiserum, das mit Immunogenen gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, in Kontakt gebracht in Gegenwart eines geeignet ausgewählten fluoreszierenden Derivats, das eine nachweisbare Fluoreszenzpolarisationsantwort auf das Vorhandensein von Antiserum erzeugen kann, das mit Immunogenen gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt worden ist. Planares polarisiertes Licht wird dann durch die Lösung hindurchgeleitet, um eine Fluoreszenzpolarisationsantwort zu ergeben und die Antwort wird nachgewiesen als ein Maß für die Menge der Gesamtdoxepine, die in der Testprobe vorhanden sind.
- Ein Testkit gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt alle wesentlichen Reagenzien, die benötigt werden, um einen gewünschten Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für die Gesamtmenge der Doxepine, wie hier beschrieben, durchzuführen. Das Testkit wird in einer kommerziell abgepackten Form angeboten als eine Kombination von einem oder mehreren Behältern, die die notwendigen Reagenzien als eine Zusammensetzung oder Beimischung enthalten, sofern es die Kompatibilität der Reagenzien zulässt. Besonders bevorzugt wird ein Testkit für die quantitative Bestimmung der Gesamtmenge an Doxepinen durch einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay, das fluoreszierende Tracerverbindungen und Antikörper enthält, die mit den Immunogenen gebildet werden, wie weiter oben beschrieben. Es versteht sich von selbst, dass das Testkit auch andere Materialien enthalten kann, die auf diesem Gebiet bekannt sind und die von einem kommerziellen Benutzerstandpunkt aus betrachtet wünschenswert sein können, z. B. Puffer, Verdünner, Standards und ähnliches.
- Die vorliegende Erfindung wird jetzt durch die folgenden Beispiele erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Strukturformeln, die in den Abb. 1-4 verwendet werden.
- Kurzbezeichnungen für Lösungsmittel: CHCl&sub3; = Chloroform, MeOH = Methanol, DMF = Dimethylformamid, CH&sub2;Cl&sub2; = Methylenchlorid, Et&sub2;O = Diethylether, EtOAc = Ethylacetat, Hex = Hexan, THF = Tetrahydrofuran, HOAc = Essigsäure.
- Doxepinhydrochlorid [1] (E/Z = 85/15) (55,0 g, 0,174 mol) wurde in 600 ml H&sub2;O gelöst, mit 6 M NaOH basisch eingestellt und mit CHCl&sub3; (3 · 600 ml) extrahiert. Die CHCl&sub3;-Extrakte wurden zusammengefasst, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Das resultierende Öl wurde in 250 ml EtOH gelöst, dann wurden 21,15 g (0,182 mol) Maleinsäure, gelöst in 100 ml EtOH, langsam unter Rühren zugegeben, gefolgt von weiteren 350 ml EtOH. Die resultierende wolkige Lösung wurde am Rückflusskühler erhitzt, bis sich die Lösung klärte, dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die resultierenden Kristalle wurden durch Vakuumfiltration isoliert. Weitere Rekristallisation von EtOH ergab 41,3 g (0,104 mol) eines weißen kristallinen Produkts [2] mit einem E/Z- Verhältnis von 98/2 (bestimmt durch HPLC über eine Waters Mporasil-Säule unter Elution mit EtOAc/MeOH/NH&sub4;OH (90/10/0,2) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,7 ml/Minute); Schmelzpunkt: 171-172ºC.
- (E)-Doxepinmaleat [2] (2,50 g, 6,32 mmol) wurde teilweise in 60 ml H&sub2;O gelöst, mit 6 M NaOH basisch eingestellt und mit CHCl&sub3; (3 · 60 ml) extrahiert. Die CHCl&sub3;-Extrakte wurden zusammengefasst, mit 60 ml Salzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das resultierende Öl wurde in 10 ml CHCl&sub3; erneut gelöst, 1,8 ml (13 mmol) Triethylamin wurden zugesetzt, und dann 1,8 ml (13 mmol) 2,2,2- Trichlorethylchlorformiat hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde unter N&sub2; 3,5 Stunden gerührt. Das vollständig umgesetzte Reaktionsgemisch wurde dann mit 140 ml Et&sub2;O verdünnt, nacheinander mit 0,5 M HCl (2 · 140 ml), H&sub2;O (140 ml) und Salzlösung (140 ml) gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das resultierende Material wurde weiter gereinigt durch Säulenchromatographie über Silicagel unter Elution mit EtOAc/Hex (20/80) und ergab 1,48 g (3,36 mmol) des gewünschten Produkts als ein klares Öl; ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 2,5 (q, 2H), 2,8(0, 3H), 3,5 (t, 2H), 4,6-4,7 (m, 2H), 4,8-5,7 (breit s, 2H), 6,0 (t, 1H), 6,8-6,9 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 6H); Massenspektrum (FAB): (M)&spplus; 440.
- Das N-geschützte (E)-Desmethyldoxepin-Zwischenprodukt (1,44 g, 3,27 mmol) wurde in 12 ml THF gelöst, 2,88 g Zinkpulver wurden zugesetzt, dann 2,3 ml 1 M Natriumphosphat (pH = 5,5), und das Reaktionsgemisch 17 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann vakuumfiltriert, das Filtratlösungsmittel unter Vakuum entfernt, und der resultierende Rückstand gereinigt durch Säulenchromatographie über Silicagel unter Elution mit THF/MeOH/NH&sub4;OH (85/15/0,4), dann THF/MeOH/NH&sub4;OH (75/25/0,4) und ergab 744 mg (2,80 mmol) des gewünschten Produkts [3] als einen blassgelben Feststoff; ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 2,5 (s, 3H), 2,7 (m, 2H), 3,0 (m, 2H), 4,7-5,8 (breit s, 2H), 6,0 (t, 1H), 6,8-6,9 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 6H); Massenspektrum (FAB): (M+H)&spplus; 266.
- Zu einer Lösung von (E)-Desmethyldoxepin [3] (724 mg, 2,73 mmol) in 10 ml DMF wurden 0,838 ml (6,01 mmol) Triethylamin und 0,605 ml (5,46 mmol) Ethylbromacetat zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 17 Stunden unter N&sub2; gerührt. Das vollständig umgesetzte Reaktionsgemisch wurde dann in 60 ml H&sub2;O geschüttet, mit 6 M NaOH basisch eingestellt, und mit Et&sub2;O (3 · 60 ml) extrahiert. Die Etherextrakte wurden zusammengefasst und mit 60 ml Salzlösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie über Silicagel unter Eution mit EtOAc/Hex (50/50) gereinigt und ergab 511 mg (1,45 mmol) des gewünschten Produkts als ein klares Öl; ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 1,2 (t, 3H), 2,3 (s, 3H), 2,4 (m, 2H), 2,6 (t, 2H), 3,2 (s, 2H), 4,2 (q, 2H), 4,7-5,8 (breit s, 2H), 6,0 (t, 1H), 6,8-6,9 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 6H); Massenspektrum (DCl-NH&sub3;): (M+H)&spplus; 352.
- Das Ester-Zwischenprodukt (460 mg, 1,31 mmol) wurde in 8,4 ml MeOH gelöst, 4,2 ml 10% NaOH wurden zugegeben und die Lösung 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 30 ml H&sub2;O verdünnt, der pH mit 1 M HCl auf 3-4 eingestellt, und das Gemisch mit CHCl&sub3; (3 · 35 ml) extrahiert. Die CHCl&sub3;-Extrakte wurden zusammengefasst, mit 35 ml Salzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, und ergaben 424 mg (1,31 mmol) des gewünschten Produkts [4] als einen weißen Feststoff; ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 2,5-2,7 (m, 2H), 2,6 (s, 3H), 3,2 (m, 2H), 3,4 (s, 2H), 4,7-5,8 (breit s, 2H), 6,0 (t, 1H), 6,5 (breit s, 2H), 6,8-6,9 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 6H); Massenspektrum (DCl-NH&sub3;): (M+H)&spplus; 324.
- Die freie Säure [4] (59 mg, 0,18 mmol) wurde in 0,86 ml DMF gelöst, 25 mg (0,22 mmol) N- Hydroxysuccinimid wurde zugesetzt, dann 45 mg (0,22 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid, und das Reaktionsgemisch wurde 17 Stunden unter N&sub2; gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in eine Lösung filtriert, die 306 mg Rinderserumalbumin (BSA), gelöst in 5,35 ml 0,1 M Natriumphosphat (pH = 7,8) und 1,4 ml DMF, enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt, dann gegen 2 Liter 0,1 M Natriumphosphat (pH = 7,8) 2 Stunden dialysiert, danach gegen H&sub2;O (8 · 2 Liter). Nach der Lyophilisierung wurden 276 mg des gewünschten Immunogens [5] als ein lockerer weißer Feststoff erhalten.
- Die freie Säure [4] (11 mg, 0,034 mmol) wurde in 0,50 ml DMF gelöst, 9 mg (0,04 mmol) 2- Ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (Woodward-K) wurde zugegeben, der pH mit Triethylamin auf 9 eingestellt und das Reaktionsgemisch 40 Minuten unter N&sub2; gerührt. Dann wurden 14 mg (0,034 mmol) Aminomethylfluoresceinhydrochlorid zugesetzt, der pH der Reaktion wiederum mit Triethylamin auf 9 eingestellt und die Lösung in der Dunkelheit Stunden unter N&sub2; gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt und der Rohrückstand auf einer einzelnen präparativen 1-mm-C18-Chromatographieplatte unter Elution mit H&sub2;O/MeOH/HOAc (20/80/0,4) gereinigt und ergab 9 mg (0,01 mmol) des gewünschten Produkts [6] als einen orangen Feststoff; Massenspektrum (FAB): (M+H)&spplus; 667.
- Doxepinhydrochlorid [1] (E/Z = 85115) (100 g, 0,317 mol) wurde in 800 ml H&sub2;O gelöst, mit 6 M NaOH basisch eingestellt und mit CHCl&sub3; (3 · 800 ml) extrahiert. Die CHCl&sub3;-Extrakte wurden zusammengefasst, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das resultierende Öl wurde in 700 ml EtOH gelöst, dann wurden 36,7 g (0,317 mmol) Maleinsäure, gelöst in 600 ml EtOH, langsam unter Rühren zugesetzt. Die resultierende wolkige Lösung wurde am Rückflusskühler bis zur Klarheit erhitzt, dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Kristalle wurden durch Vakuumfiltration isoliert und die Mutterlauge aufgefangen. Die Kristalle wurden zwei weitere Male wie oben rekristallisiert, und die drei Mutterlaugen wurden aufgefangen und zusammengefasst und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Rekristallisation der Mutterlauge von am Rückflusskühler erhitzten EtOH lieferte letztendlich 24 g eines Mutterlaugenprodukts, das 65% Z-Isomer in der Zusammensetzung enthielt (bestimmt durch HPLC über einer Waters Mporasil-Säule unter Elution mit EtOAc/MeOH/NH&sub4;OH (90/10/0,2) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,7 ml/Minute). Rekristallisation dieses Materials von 450 ml EtOH ergab Kristalle (9,1 g), die zu 80% Z-Isomer waren. Dieses Material wurde von 170 ml CHCl&sub3;/CCl&sub4; (50/50) bei 4ºC rekristallisiert und ergab 7,65 g kristallines Material, das 87% Z- Isomer in der Zusammensetzung enthielt. Drei weitere Rekristallisationen von CHCl&sub3;/CCl&sub4; lieferten letztendlich 5,12 g (12,9 mmol) des gewünschten Produkts [7] mit einem E/Z- Verhältnis von 4/96; Schmelzpunkt: 162-163ºC.
- (Z)-Doxepinmaleat [7] (1,00 g, 2,53 mmol) wurde teilweise in 35 ml H&sub2;O gelöst, mit 6 M NaOH basisch eingestellt und mit CHCl&sub3; (3 · 35 ml) extrahiert. Die CHCl&sub3;-Extrakte wurden zusammengefasst, mit 35 ml Salzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das resultierende Öl wurde in 4 ml CHCl&sub3; erneut gelöst, 0,65 ml (4,7 mmol) Triethylamin wurden zugegeben, dann 0,65 ml (4,7 mmol) 2,2,2- Trichlorethylchlorformiat, und das Reaktionsgemisch wurde 3,5 Stunden unter N&sub2; gerührt. Das vollständig umgesetzte Reaktionsgemisch wurde dann mit 50 ml Et&sub2;O verdünnt, nacheinander mit 0,5 M HCl (2 · 50 ml), H&sub2;O (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das resultierende Material wurde weiter gereinigt durch Säulenchromatographie über Silicagel unter Elution mit EtOAc/Hex (20/80) und ergab 710 mg (1,61 mmol) des gewünschten Produkts als ein klares Öl; ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 2,7 (q, 2H), 2,9 (d, 3H), 3,5 (t, 2H), 4,6-4,7 (m, 2H), 5,0-5,4 (breit s, 2H), 5,7 (t, 1H), 6,9 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 6H); Massenspektrum (FAB): (M)&spplus; 440.
- Das N-geschützte (Z)-Desmethyldoxepin (679 mg, 1,54 mmol) wurde in 5,7 ml THF gelöst, 1,36 g Zinkpulver wurden hinzugefügt, dann 1,1 ml 1 M Natriumphosphat (pH = 5,5), und das Reaktionsgemisch wurde 17 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann vakuumfiltriert, das Filtratlösungsmittel unter Vakuum entfernt, und der verbleibende Rückstand gereinigt durch Säulenchromatographie über Silicagel unter Elution mit THF/MeOH/NH&sub4;OH (85/15/0,4), dann THF/MeOH/NH&sub4;OH (8211810,4), und ergab 364 mg (1,37 mmol) des gewünschten Produkts [8] als einen blassgelben Feststoff; 1H NMR (200 MHz, CD&sub3;OD): d 2,7 (s, 3H), 2,8 (q, 2H), 3,2 (t, 2H), 5,1-5,3 (breit s, 2H), 5,7 (t, 1H), 6,8-7,0 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 6H); Massenspektrum (DCl-NH&sub3;): (M+H)&spplus; 266.
- (Z)-Desmethyldoxepin [8] (336 mg, 1,27 mmol) wurde in 4 ml DMF gerührt, 0,39 ml (2,8 mmol) Triethylamin wurde zugegeben, dann 0,28 ml (2,5 mmol) Ethylbromacetat, und dann wurde das Reaktionsgemisch 17 Stunden unter N&sub2; gerührt. Das vollständig umgesetzte Gemisch wurde dann in 30 ml H&sub2;O geschüttet, mit 6 M NaOH basisch eingestellt und mit Et&sub2;O (3 · 30 ml) extrahiert. Die Etherextrakte wurden zusammen mit 30 ml Salzlösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie über Silicagel unter Elution mit EtOAc/Hex (50/50) gereinigt und ergab 191 mg (0,543 mmol) des gewünschten Produkts als ein gelbes Öl; ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 1,2 (t, 3H), 2,4 (s, 3H), 2,5-2,8 (m, 4H), 3,2 (s, 2H), 4,2 (q, 2H), 5,1-5,3 (breit s, 2H), 5,7 (t, 1H), 6,8-7,0 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 6H); Massenspektrum (DCl-NH&sub3;): (M+H)&spplus; 352.
- Das Ester-Zwischenprodukt (180 mg, 0,51 mmol) wurde in 3,3 ml MeOH gelöst, 1,64 ml 10% NaOH wurden zugegeben und die Lösung 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 10 ml H&sub2;O verdünnt, mit 1 M HCl auf pH 3-4 eingestellt und dann mit CHCl&sub3; (3 · 10 ml) extrahiert. Die CHCl&sub3;-Extrakte wurden zusammengefasst, mit 10 ml Salzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, und ergaben 166 mg (0,51 mmol) des gewünschten Produkts [9] als einen weißen Schaum; ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 2,7 (s, 3H), 2,7-2,9 (m, 2H), 3,2-3, 4 (m, 2H), 3,5 (s, 2H), 5,1-5,3 (breit s, 2H), 5,7 (t, 1H), 5,9-6,3 (breit s, 2H), 6,8-7,0 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 6H); Massenspektrum (DCl-NH&sub3;): (M+H)&spplus; 324.
- Die freie Säure [9] (65 mg, 0,20 mmol) wurde in 0,94 ml DMF gelöst, 28 mg (0,24 mmol) N- Hydroxysuccinimid wurde zugegeben, dann 50 mg (0,24 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid, und das Reaktionsgemisch wurde 17 Stunden unter N&sub2; gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in eine Lösung filtriert, die 342 mg Rinderserumalbumin, gelöst in 5,8 ml 0,1 M Natriumphosphat (pH = 7,8) und 1,5 ml DMF, enthielt. Dieses Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt, dann gegen 2 Liter 0,1 M Natriumphosphat (pH = 7,8) 3 Stunden dialysiert, danach gegen H&sub2;O (7 · 2 Liter). Nach der Lyophilisierung wurden 317 mg des gewünschten Immunogens [10] als ein lockerer weißer Feststoff erhalten.
- Die Säure [9] (12 mg, 0,037 mmol) wurde in 0,50 ml DMF gelöst, 10 mg (0,041 mmol) 2- Ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat wurden zugegeben, der pH mit Triethylamin auf 9 eingestellt und das Reaktionsgemisch unter N&sub2; 40 Minuten gerührt. Dann wurden 15 mg (0,037 mmol) Aminomethylfluoresceinhydrochlorid zugegeben, der pH erneut mit Triethylamin auf 9 eingestellt, und die Lösung unter N&sub2; in der Dunkelheit 16 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt, und der rohe Rückstand auf einer einzelnen präparativen 1-mm-C18-Chromatographieplatte gereinigt unter Elution mit H&sub2;O/MeOH/HOAc (10190/0,4) und ergab 17 mg (0,025 mmol) des gewünschten Produkts [11] als einen orangen Feststoff; Massenspektrum (FAB): (M+H)&spplus; 667.
- Trichlorethylchlorformiat (0,90 ml, 6,53 mmol) wurde tropfenweise zu einer 0ºC-Lösung von N¹-(3-Dimethylaminopropyl)-dibenz[b,f]-[1,4]-oxazepin [12] (580 mg, 2,05 mmol), Triethylamin (Et&sub3;N) (1,02 ml, 7,18 mmol) und 6 ml Chloroform unter Stickstoff zugegeben und 10 Minuten bei 0ºC, dann 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 30 ml Wasser geschüttet, der pH mit 2 N NaOH auf 13 eingestellt, Schichten getrennt, mit 3 · 25 ml Ethylacetat (EtOAc) extrahiert, alle organischen Schichten zusammengefasst und über Kaliumcarbonat getrocknet. Entfernung der Lösungsmittel unter Vakuum ergab ein oranges Öl, das gereinigt wurde durch Säulenchromatographie (150 g Silicagel; 20% THF/79% Hexan/1% Et&sub3;N V/V), und 545 mg (60%) des gewünschten Carbamat-Zwischenprodukts wurden erhalten. ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 7,4-7,3 (m, 3H), 7,1-6,9 (m, 3H), 6,9-6,8 (m, 2H), 5,3 (s, 2H), 4,6 (d, 2H), 3,8 (t, 2H), 3,4 (t, 2H), 2,9 (s, 3H), 1,9 (p, 2H); Massenspektrum (DCl-NH&sub3;): (M+H)&spplus; 443.
- Zinkpulver (2,40 g, 36,6 mmol) wurde zu einer Lösung zugegeben, die das N-geschützte Zwischenprodukt (540 mg, 1,22 mmol) in 20 ml THF/3 ml 1,0 M KH&sub2;PO&sub4; (pH 4,4)-Puffer enthielt, und die Lösung 12,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gefiltert und der Feststoff mit 3 · 20 ml EtOAc und 1 · 5 ml 1 N HCl gewaschen; das Filtrat wurde mit 2 N NaOH auf pH 12 eingestellt, Schichten getrennt, das Filtrat mit 2 · 30 ml EtOAc extrahiert, die organischen Schichten zusammengefasst und über Kaliumcarbonat getrocknet. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt und ergaben ein gelbes Öl, das durch Säulenchromatographie (100 g Silicagel; 15% MeOH/84% CH&sub2;Cl&sub2;/1% Et&sub3;N V/V) gereinigt wurde und 262 mg (80%) des gewünschten sekundären Amins [13] N&sub1;-(3- Methylaminopropyl)-dibenz[b,f]-[1,4]-oxazepin ergab. ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 7,3-7,2 (m, 2H), 7,1-6,9 (m, 3H), 6,9-6,7 (m, 3H), 5,3 (s, 2H), 3,8 (t, 2H), 2,6 (t, 2H), 2,4 (s, 3H), 2,2 (s, 1H), 1,8 (p, 2H); Massenspektrum (DCl-NH&sub3;): (M+H)&spplus; 269.
- Bromethylacetat (0,22 ml, 1,95 mmol) wurde zu einer Lösung von Triethylamin (Et&sub3;N) (0,63 ml, 4,5 mmol), N¹-(3-Methylaminopropyl)-dibenz[b,f]-[1,4]-oxazepin [13] (260 mg, 0,97 mmol) und 7 ml Dimethylformamid (DMF) unter Stickstoff zugegeben und das Gemisch 19 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml Wasser geschüttet, der pH mit 2 N NaOH auf 13 eingestellt, das Gemisch mit 3 · 75 ml Diethylether extrahiert, die organischen Schichten zusammengefasst und über Kaliumcarbonat getrocknet. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt und zurück blieb ein gelbes Öl, das durch Säulenchromatographie (75 g Silicagel; 15% Methanol/85% Methylenchlorid/0,5% Et&sub3;N V/V) vereinigt wurde und 330 mg (96%) des gewünschten Aminoester-Zwischenprodukts ergab. H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): d 7,4-7,2 (m, 2H), 7,2-6,9 (m, 3H), 6,9-6,7 (m, 3H), 5,3 (s, 2H), 4,1 (q, 2H), 3,8 (t, 2H), 3,2 (s, 2H), 2,5 (t, 2H), 2,3 (s, 3H), 1,8 (p, 2H), 1,3 (t, 3H); Massenspektrum (FAB): (M+H)&spplus; 355.
- Eine wässerige Lösung von Natriumhydroxid (2,8 ml, 2,0 N NaOH, 5,6 mmol) wurde zu einer Lösung des gewünschten Aminoester-Zwischenproduks (245 mg, 0,69 mmol)/5 ml Dioxan und 2 ml destilliertem Wasser zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 30 ml Wasser geschüttet, der pH mit 2 N NaOH auf 13 eingestellt, mit 1 · 25 ml Toluol extrahiert, der pH mit 1 N HCl auf 4 eingestellt, mit 3 · 25 ml Chloroform extrahiert und die Chloroformextrakte zusammengefasst. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt und zurück blieben 65 mg (28%) der gewünschten Säure [14] als ein überweißer weißer Feststoff. ¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3; : CD&sub3;OD, 4 : 1): d 7,7 (s, 1H), 7,4-7,3 (m, 2H), 7,1-7,0 (m, 3H), 6,9-6,7 (m, 3H), 5,3 (s, 2H), 3,9 (t, 2H), 3,5 (s, 2H), 3,2 (t, 2H), 2,7 (s, 3H), 2,0 (p, 2H); Massenspektrum (FAB): (M+H)&spplus; 327.
- Ein Kolben wurde mit den folgenden Substanzen gefüllt: Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (44,8 mg, 0,217 mmol), N-Hydroxysuccinimid (24,7 mg, 0,215 mmol), Säure [14] (64 mg, 0,195 mmol) und 1,5 ml Dimethylformamid (DMF). Das Gemisch wurde 21 Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt und filtriert und lieferte eine klare Lösung des gewünschten aktiven Esters. Diese Lösung wurde zu einer 17ºC-Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) (207 mg, 0,00305 mmol) in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,8 und 1,5 ml DMF zugegeben und über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in der folgenden Reihenfolge dialysiert: 1 · 2 Liter pH 7,8, 0,1 M Phosphatpuffer, 5 · 2 Liter destilliertes Wasser, und der verbleibende Inhalt des Dialysebeutels lyophilisiert, und lieferte 202 mg des gewünschten Immunogens [15].
- Triethylamin (0,020 ml, 0,14 mmol) wurde zu einer Lösung von Säure [14] (15 mg, 0,046 mmol), Woodward-K (12,9 mg, 0,051 mmol), 0,9 ml DMF unter Stickstoff zugefügt und 1 Stunde gerührt, worauf Aminomethylfluorescein (19,2 mg, 0,048 mmol) und Triethylamin (0,03 ml, 0,21 mmol) zum Reaktionsgemisch zugegeben wurden. Die Lösung wurde 2 Tage gerührt, die Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und der resultierende orange Feststoff gereinigt, und ergab 15 mg des gewünschten Tracers [16]. Massenspektrum (FAB): (M+H)&spplus; 672.
- 6-Carboxyfluorescein (500 mg, 1,33 mmol) wurde in 7 ml DMF gelöst, 184 mg (1,59 mmol) N-Hydroxysuccinimid wurden hinzugefügt, dann 328 mg (1,59 mmol) 1,3- Dicyclohexylcarbodiimid wurden hinzugefügt und das Reaktionsgemisch 17 Stunden unter N&sub2; in der Dunkelheit gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann vakuumfiltriert, das Filtrat mit 353 mg (1,33 mmol) (E)-Desmethyldoxepin [3] kombiniert, 0,28 ml (2,0 mmol) Triethylamin zugegeben und die Lösung unter N&sub2; in der Dunkelheit 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt und das Rohöl durch Chromatographie über Silicagel unter Elution mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (90/10), dann CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (70/30) gereinigt und ergab 544 mg (0,872 mmol) des gewünschten Produkts [17] als einen orangen Feststoff. Massenspektrum (FAB): (M+H)&spplus; 624.
- 6-Carboxyfluorescein (762 mg, 202 mmol) wurde in 8 ml DMF gelöst, 280 mg (2,43 mmol) N-Hydroxysuccinimid wurde hinzugefügt, dann 501 mg (2,43 mmol) 1,3- Dicyclohexylcarbodiimid, und das Reaktionsgemisch wurde 17 Stunden unter N&sub2; in der Dunkelheit gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann vakuumfiltriert, das Filtrat mit 538 mg (2,03 mmol) (Z)-Desmethyldoxepin [8] kombiniert, 0,57 ml (4,1 mmol) Triethylamin zugegeben, und die Lösung unter N&sub2; in der Dunkelheit 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt und das Rohöl durch Chromatographie über Silicagel unter Elution mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (90/10), dann CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (70/30) gereinigt und ergab 281 mg (0,451 mmol) des gewünschten Produkts [18] als einen orangen Feststoff. Massenspektrum (FAB): (M+H)&spplus; 624.
- (a) Antiseren wurden von 6 Kaninchen, die immunisiert waren mit dem E-Doxepin- Immunogen [5], und 6 Kaninchen, die immunisiert waren mit dem Z-Doxepin-Immunogen [10], wie in den Beispielen 2 und 5 beschrieben, hergestellt. Die einzelnen Titer zeigten an, dass der mittlere Titer für jede Gruppe von 6 Kaninchen etwa gleich war. Die rohen Antiseren wurden in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 gemischt und mit einem Puffer verdünnt, der 109 mM Phosphatpuffer, 50 mM Dinatrium-EDTA, 0,01% Rindergammaglobulin und 0,105% Natriumazid enthielt (pH = 6,65).
- Der fluoreszierende Tracer (Beispiel 10) wurde gebildet durch Herstellung des E- Doxepintracers [17] bei 82 nM und des Z-Doxepintracers [18] bei 82 nM, beide in einem Puffer, der 50 mM ACES, 150 mM NaCl, 0,1% Natriumazid und 25% DMF (pH = 6,8) enthielt. Die beiden Lösungen wurden dann in einem Volumenverhältnis von 1 : 2 (E : Z) gemischt und es ergaben sich Endkonzentrationen von etwa 27 nM für das E-Isomer und 55 nM für das Z-Isomer.
- Vor der Analyse wurde jede Testprobe vorbehandelt wie in CA-A-2 098 307 beschrieben. In ein Polypropylenröhrchen wurden eine Testprobe (0,25 ml), 0,9 ml Heptan/Isoamylalkohol (35 : 1 V/V) und 0,1 ml einer 25% Natriumcarbonatlösung gefüllt. Das Gemisch wurde eine Minute kräftig verwirbelt und dann bei 9.500 · g 30 Sekunden zentrifugiert. In ein weiteres Polypropylenröhrchen wurden 0,5 ml der oberen Schicht des ersten Röhrchens, 0,1 ml 0,05 N HCl und 0,04 ml Chloramin T (0,04 mg/ml Wasser) eingefüllt. Das Gemisch wurde 30 Sekunden verwirbelt, 2 Minuten stehen gelassen und bei 9.500 · g 30 Sekunden zentrifugiert. Zuletzt wurden 0,085 ml der unteren Phase des zweiten Röhrchens in den Probeneinsatz eines Abbott TDx® Therapeutic Drug Monitoring System Analyzer (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA) überführt.
- Der Test wurde nach dem Standard-TDx-Protokoll auf einem TDx-Analyzer durchgeführt, bei dem die Probe (0,02 ml) mit 0,025 ml Antiseren und 0,025 ml Tracer in einem Gesamtpuffervolumen von 2 ml in Kontakt gebracht wurde. Die Ergebnisse sind in Millipolarisationseinheiten (mP) angegeben.
- Standardkurven wurden hergestellt unter Verwendung eines Kalibrators, der 42,5% E- Doxepin, 7,5% Z-Doxepin, 25% E-Desmethyldoxepin und 25% Z-Desmethyldoxepin (in einem molaren Verhältnis) enthielt in einem Puffer, der 50 mM Phosphatpuffer, 150 ml NaCl, 0,1% Natriumazid und 0,07% Rinderserumalbumin enthielt (pH 6,5). Jeder Analyt wurde einzeln mit dieser Standardkurve verglichen, wie in Abb. 5 dargestellt.
- (b) Antiseren wurden hergestellt von 6 Kaninchen, die mit dem Dibenzoxazepinimmunogen [15], wie in Beispiel 8 beschrieben, immunisiert waren. Die rohen Antiseren wurden mit einem Puffer verdünnt, der 109 mM Phosphatpuffer, 50 mM Dinatrium-EDTA, 0,01% Rindergammaglobulin und 0,105% Natriumazid enthielt (pH = 6,65).
- Der fluoreszierende Tracer wurde gebildet durch Herstellung des E-Doxepintracers [6] (Beispiel 3) bei 82 nM und des Z-Doxepintracers [11] (Beispiel 6) bei 82 nM, beide in einem Puffer, der 50 mM ACES, 150 mM NaCl, 0,1% Natriumazid und 25% DMF enthielt (pH 6,8). Die beiden Lösungen wurden dann in einem Volumenverhältnis von 1 : 2 (E : Z) gemischt und es ergaben sich Endkonzentrationen von etwa 27 nM für das E-Isomer und 55 nM für das Z- Isomer.
- Vor der Analyse wurde jede Probe vorbehandelt, wie unter (a) beschrieben. In ein Polypropylenröhrchen wurden eine Testprobe (0,25 ml), 0,9 ml Meptan/Isoamylalkohol (35 : 1 V/V) und 0,1 ml einer 25% Natriumcarbonatlösung gefüllt. Das Gemisch wurde eine Minute kräftig verwirbelt und dann bei 9.500 · g 30 Sekunden zentrifugiert. In ein weiteres Polypropylenröhrchen wurden 0,5 ml der oberen Schicht des ersten Röhrchens, 0,1 ml 0,05 N HCl und 0,04 ml Chloramin T (0,04 mg/ml Wasser) eingefüllt. Das Gemisch wurde 30 Sekunden verwirbelt, 2 Minuten stehen gelassen und bei 9.500 · g 30 Sekunden zentrifugiert. Zuletzt wurden 0,085 ml der unteren Phase des zweiten Röhrchens in den TDx- Probeneinsatz überführt.
- Der Test wurde nach dem Standard-TDx-Protokoll auf einem TDx-Analyzer durchgeführt, bei dem die Probe (0,02 ml) mit 0,025 ml Antiseren und 0,025 ml Tracer in einem Gesamtpuffervolumen von 2 ml in Kontakt gebracht wurde. Die Ergebnisse sind in Millipolarisationseinheiten (mP) angegeben.
- Standardkurven wurden hergestellt unter Verwendung eines Kalibrators, der 42,5% E- Doxepin, 7,5% Z-Doxepin, 25% E-Desmethyldoxepin und 25% Z-Desmethyldoxepin (in einem molaren Verhältnis) enthielt in einem Puffer, der 50 mM Phosphatpuffer, 150 ml NaCl, 0,1% Natriumazid und 0,07% Rinderserumalbumin enthielt (pH 6,5). Jedes Analyt wurde einzeln mit dieser Standardkurve verglichen, wie in Abb. 6 dargestellt.
- Die relative Genauigkeit des TDx-Assays für Gesamtdoxepine wurde durch Korrelation mit HPLC unter Verwendung von Patientenprobenextrakten bestimmt. Die Extrakte für die HPLC-Analyse wurden wie weiter unten beschrieben hergestellt, und es wurden die trizyklischen Antidepressiva Loxapin und Amoxapin verwendet, jeweils bei einer Konzentration von 4 mg/ml in Acetonitril als internem Standard.
- 1. 1,0 ml Patientenstandard in ein 16 · 125 silyliertes Röhrchen pipettieren, das mit einem Teflonschraubverschluss versehen ist. Tiefgefrorene Aliquote der geeigneten Standardkalibrierkurve aus dem Gefrierschrank entnehmen und auftauen lassen. 0,75 ml Acetonitril, das den internen Standard enthält, in jedes Röhrchen einfüllen.
- 2. 1,0 ml 0,25 N NaOH zugeben, gefolgt von 0,200 ml Isoamylalkohol, kräftig verwirbeln und Röhrchen 5,0 Minuten stehen lassen.
- 3. In jedes Röhrchen 10,0 ml n-Heptan pipettieren und jedes Röhrchen mit dem Deckel dicht verschließen. Das zweiphasige Heptan/Plasma-Gemisch 1,0 Stunde kräftig schütteln.
- 4. Die Röhrchen vom Rüttelbrett nehmen und in eine Zentrifuge überführen. Das Heptan/Plasma-Gemisch 30 Minuten bei mindestens 2000 · Gravität zum Klären der Schicht zentrifugieren.
- 5. Die Röhrchen aus der Zentrifuge entfernen und die obere Heptanschicht in ein weiteres silyliertes Röhrchen gleicher Form überführen, das 1,0 ml 0,1 M Glycyl-Glycin- Puffer, pH 3, enthält. Diese Röhrchen verschließen und 1,0 Stunde kräftig schütteln.
- 6. Die Röhrchen vom Rüttelbrett nehmen und in eine Zentrifuge überführen. Das zweiphasige Glycyl-Glycin/Heptan-Gemisch 30 Minuten bei mindestens 2000 · g zentrifugieren.
- 7. Die Röhrchen aus der Zentrifuge nehmen, öffnen, und die obere Heptanschicht absaugen oder abpipettieren und verwerfen.
- 8. 2,0 ml 0,25 N NaOH zu jeder verbleibenden unteren Glycyl-Glycin-Phase zugeben. 5,0 ml n-Pentan zu jedem wässerigen Extrakt zufügen, Röhrchen verschließen und 1,0 Stunde schütteln.
- 9. Die Röhrchen vom Rüttelbrett nehmen und in eine Zentrifuge überführen. Das Pentan/wässerige-Phase-Gemisch 30 Minuten bei 200 · g zentrifugieren.
- 10. Die Röhrchen aus der Zentrifuge nehmen und die obere Pentanschicht in ein 16 · 100 silyliertes Reagenzröhrchen mit konischem Schraubverschluss überführen. Deckel dicht auf die Reagenzröhrchen aufsetzen und mit ¹/&sub4; Umdrehung zuschrauben. Die Röhrchen in ein warmes Sandbad überführen, das Sandbad mit den Röhrchen in einen Vakuumtrockenschrank überführen und Vakuum herstellen. Es dauert etwa 25-30 Minuten, bis das Pentan verdampft ist.
- 11. Die Röhrchen in dem Sandbad aus dem Trockenschrank nehmen und in jedes Röhrchen 1,0 ml Pentan pipettieren, erneut verschließen und jedes Röhrchen kurz verwirbeln. Die Deckel mit ¹/&sub4; Umdrehung öffnen, und die Röhrchen in den Trockenschrank zurückbringen und erneut Vakuum für 10-15 Minuten anlegen, bis das Pentan verdampft ist.
- 12. Die trockenen Röhrchen aus dem Trockenschrank entfernen und 0,070 ml mobiler HPLC-Phase hineinpipettieren. Jedes Röhrchen etwa 30 Sekunden verwirbeln, dabei darauf achten, dass die Wände des Röhrchens benetzt werden.
- 13. Die Röhrchen auf eine Zentrifuge überführen und 2-3 Minuten bei 200 · g zentrifugieren.
- 14. Die Röhrchen aus der Zentrifuge nehmen und den gesamten Inhalt in die WISP Autokarussellprobenküvetten überführen. Das Injektionsvolumen ist auf 0,050 ml pro Injektion auf eine 10 cm · 0,6 cm Säule, gepackt mit 3 um Silica mit einer Porengröße von 80 Angström, eingestellt. Die mobile chromatographische Phase besteht aus einem Gemisch aus 80 Teilen 0,025 M zweibasigem Natriumphosphat, auf pH 3 mit konzentrierter Phosphorsäure/20 Teilen Acetonitril/0,021 M n-Nonylamin (pH-Bereich 7,4-7,8) eingestellt. Der analytischen Säule ist eine trocken gepackte Vorsäule mit 40 um schalenporösem Silica vorgeschaltet. Die Strömungsgeschwindigkeit des Lösungsmittels beträgt 1,6 ml/min.
- Eine lineare Regressionsanalyse zeigte eine gute Korrelation zwischen dem TDx-Assay für Gesamtdoxepine und dem HPLC-Assay (N = 103, R = 0,9612, S = 0,93667). Die Ergebnisse sind in Abb. 7 dargestellt.
Claims (25)
1. Eine Immunoassaymethode für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine in
einer Testprobe, worin diese Gesamtdoxepine eine oder mehrere der Komponenten E-
Doxepin, Z-Doxepin, E-Desmethyldoxepin und Z-Desmethyldoxepin enthalten, und wobei die
Methode aus den Schritten besteht:
(a) Testprobe mit dem E-Isomer und dem Z-Isomer eines markierten Reagenzes und einem
Antikörperreagenz in Kontakt bringen zur Bildung einer Reaktionslösung, wobei das
Antikörperreagenz Antikörper enthält, die in der Lage sind, sich an alle Doxepine zu binden,
worin
(i) diese Antikörper hergestellt werden mit Immunogenen der Formeln:
und
worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist, und worin
(ii) das markierte Reagenz eine Zusammensetzung eines Gemischs ist aus
und
worin Q' eine nachweisbare Komponente ist; und
(b) Messen der Menge des markierten Reagenzes in dieser Reaktionslösung, die als
Funktion der Gesamtdoxepine in dieser Testprobe entweder an einer Bindungsreaktion
mit diesen Antikörpern beteiligt war oder nicht.
2. Eine Immunoassaymethode für die quantitative Bestimmung der Gesamtdoxepine in einer
Testprobe, worin diese Gesamtdoxepine eine oder mehrere der Komponenten E-Doxepin, Z-
Doxepin, E-Desmethyldoxepin und Z-Desmethyldoxepin enthalten, und wobei die Methode
aus den Schritten besteht:
(a) Testprobe mit einem Antikörperreagenz und dem E-Isomer und dem Z-Isomer eines
markierten Reagenzes in Kontakt bringen zur Bildung einer Reaktionslösung, wobei das
Antikörperreagenz Antikörper enthält, die in der Lage sind, sich an alle Doxepine zu
binden, worin
(i) diese Antikörper hergestellt werden mit einem Immunogen der Formel:
worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist, und worin
(ii) das markierte Reagenz eine Zusammensetzung eines Gemischs ist aus
und
worin Q' eine nachweisbare Komponente ist; und
(b) Messen der Menge des markierten Reagenzes in dieser Reaktionslösung, die als
Funktion der Gesamtdoxepine in dieser Testprobe entweder an der Bindungsreaktion mit
diesen Antikörpern beteiligt war oder nicht.
3. Die Methode nach Anspruch 1 oder 2, worin die Immunoassaymethode ein
Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay ist, in dem die nachweisbare Komponente des
markierten Reagenzes ein fluoreszierendes Molekül ist, das in der Lage ist, eine
nachweisbare Fluoreszenzpolarisationsantwort als Reaktion auf das Vorhandensein der
Antikörper hervorzurufen.
4. Die Methode nach Anspruch 3, worin die Menge des markierten Reagenzes gemessen
wird (a) indem man eine Ebene von polarisiertem Licht durch die Reaktionslösung leitet, um
eine Fluoreszenzpolarisationsantwort zu erhalten, und (b) Bestimmung der
Fluoreszenzpolarisationsantwort auf diese Reaktionslösung als Funktion der
Gesamtdoxepine in der Testprobe.
5. Die Methode nach Anspruch 3, worin die fluoreszierende Komponente aus der Gruppe
gewählt ist, die aus Aminomethylfluorescein, Aminofluorescein, 5-Fluorescein, 6-
Fluorescein, Thioharnstofffluorescein und Methoxytriazinolylaminofluorescein besteht.
6. Die Methode nach Anspruch 1, 2 oder 5, worin die Zusammensetzung des markierten
Reagenzes ein Verhältnis zwischen 2 : 1 (E : Z) und 1 : 6 (E : Z) für das E-Isomer dieses
markierten Reagenzes und das Z-Isomer dieses markierten Reagenzes aufweist, besser ein
Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 4.
7. Die Methode nach Anspruch 6, worin das Verhältnis für die Zusammensetzung des
markierten Reagenzes 1 : 2 ist.
8. Die Methode nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung des Antikörperreagenzes ein
Verhältnis zwischen 4 : 1 (E : Z) und 1 : 4 (E : Z) für Antikörper aufweist, die vom E-Isomer des
Immunogens und dem Z-Isomer des Immunogens produziert werden, vorzugsweise ein
Verhältnis von
2 : 1 bis 1 : 2.
9. Die Methode nach Anspruch 8, worin das Verhältnis für die Zusammensetzung 1 : 1 ist.
10. Ein Antiserum, das in der Lage ist, sich an Doxepine zu binden, und erhalten wird durch
Immunisierung mit Immunogenen der Formeln:
und
worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist.
11. Das Antiserum nach Anspruch 10, wobei das Antiserum mit einem Gemisch aus
Immunogenen bei einem Verhältnis zwischen 4 : 1 (E/Z) und 1 : 4 (E/Z) für das E-Isomer des
Immunogens und das Z-Isomer des Immunogens produziert wird.
12. Das Antiserum nach Anspruch 11, wobei das Verhältnis 1 : 1 ist.
13. Ein Antiserum, das in der Lage ist, sich an Doxepine zu binden, und erhalten wird durch
Immunisierung mit Immunogenen der Formel:
worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist.
14. Eine Verbindung mit der Formel:
oder
worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist.
15. Eine Verbindung mit der Formel:
worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist.
16. Eine Verbindung mit der Formel:
oder
worin Q' eine nachweisbare Komponente ist.
17. Eine Verbindung mit der Formel:
oder
worin Q' eine nachweisbare Komponente ist.
18. Die Verbindung von Anspruch 16 oder 17, worin Q' aus der Gruppe gewählt ist, die aus
Aminomethylfluorescein, Aminofluorescein, 5-Fluorescein, 6-Fluorescein,
Thioharnstofffluorescein und Methoxytriazinolylaminofluorescein besteht.
19. Ein Testkit für die Bestimmung der Gesamtdoxepine in einer Testprobe, wobei die
Gesamtdoxepine eine oder mehrere der Komponenten E-Doxepin, Z-Doxepin, E-
Desmethyldoxepin und Z-Desmethyldoxepin enthalten, und wobei das Testkit folgendes
enthält:
(a) ein Antikörperreagenz, das eine Zusammensetzung eines Gemischs von Antikörpern
enthält, die in der Lage sind, sich an Doxepine zu binden, und die produziert werden von
Immunogenen der Formeln:
und
worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist; und
(b) ein markiertes Reagenz, das eine Zusammensetzung eines Gemischs ist aus
und
worin Q' eine nachweisbare Komponente ist.
20. Ein Testkit für die Bestimmung der Gesamtdoxepine in einer Testprobe, wobei die
Gesamtdoxepine eine oder mehrere der Komponenten E-Doxepin, Z-Doxepin, E-
Desmethyldoxepin und Z-Desmethyldoxepin enthalten, und wobei das Testkit folgendes
enthält:
(a) ein Antikörperreagenz, das Antikörper enthält, die in der Lage sind, sich an Doxepine zu
binden, und die produziert werden von einem Immunogen der Formel:
worin Q ein immunogenes Trägermaterial ist; und
(b) ein markiertes Reagenz, das eine Zusammensetzung eines Gemischs ist aus
und
worin Q' eine nachweisbare Komponente ist.
21. Das Testkit von Anspruch 19 oder 20, worin Q' aus der Gruppe gewählt ist, die aus
Aminomethylfluorescein, Aminofluorescein, 5-Fluorescein, 6-Fluorescein,
Thioharnstofffluorescein und Methoxytriazinolylaminofluorescein besteht.
22. Das Testkit von Anspruch 19, 20 oder 21, worin die Zusammensetzung des markierten
Reagenzes ein Verhältnis zwischen 2 : 1 (E : Z) und 1 : 6 (E : Z) für das E-Isomer des markierten
Reagenzes und das Z-Isomer des markierten Reagenzes aufweist, vorzugsweise ein
Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 4.
23. Das Testkit von Anspruch 22, worin das Zusammensetzungsverhältnis des markierten
Reagenzes 1 : 2 ist.
24. Das Testkit von Anspruch 19, worin die Zusammensetzung des Antikörperreagenzes ein
Verhältnis zwischen 4 : 1 (E : Z) und 1 : 4 (E : Z) für Antikörper aufweist, die vom E-Isomer des
Immunogens und dem Z-Isomer des Immunogens produziert werden, vorzugsweise ein
Verhältnis von 2 : 1 bis 1 : 2.
25. Das Testkit von Anspruch 24, worin das Zusammensetzungsverhältnis des
Antikörperreagenzes 1 : 1 ist.
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