JP3071824B2 - 生体液における全ドキセピンを定量するための試薬および方法 - Google Patents

生体液における全ドキセピンを定量するための試薬および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、試験試料におけるドキセピンの免疫分析測
定に関するものである。特に本発明は、試験試料におけ
る全ドキセピンを定量するための（好ましくは蛍光偏光
免疫分析に使用するための）免疫原、この種の免疫原か
ら作成される抗体、および標識された試薬に関するもの
である。
発明の背景 たとえば血清、血漿、全血、尿などの生体液における
治療薬剤レベルの監視は、患者管理に役立つ情報を医師
に与えるため極めて有用になっている。この種の薬剤レ
ベルの監視により患者への投与量を調製して最適治療効
果を達成することができ、さらに薬剤不足もしくは毒性
レベルを回避するのに役立つ。ドキセピンは三環式の抗
抑鬱剤であって、２種の異性型、すなわちＥ−ドキセピ
ン（式IA、Ｒ＝CH3）およびＺ−ドキセピン（式IB、Ｒ
＝CH3）： として存在する。
ドキセピンは慢性抑鬱症の処置に極めて有効であると
判明しているが、患者の血中濃度は治療範囲内に維持せ
ねばならない。投与量を一定にしても、ヒト血漿中には
一般に広範囲の患者間変動が存在する。しかして、高い
投与量は中枢神経系の障害、毒性、高血圧症、発作、昏
睡および死亡に関連する。個々の人間はドキセピンに対
するその反応が著しく異なるので、たとえば患者の血清
もしくは血漿におけるそのレベルを測定することにより
治療を監視する必要がある。
ドキセピンは、それぞれtrans−ドキセピンおよびcis
−ドキセピンとも呼ばれるＥ−ドキセピン異性体とＺ−
ドキセピン異性体との約85:15（E:Z）混合物として投与
される。投与されるとドキセピンはＮ−脱メチル化によ
り代謝されてデスメチルドキセピンを生成し、これも同
様に活性であってそのＥおよびＺ−異性体の両者（式IA
およびIB、Ｒ＝Ｈ）として存在する。デスメチルドキセ
ピンにつき、これら異性体の比は患者ごとに一定しない
旨が報告されている。
両ドキセピン（Ｅ−異性体およびＺ−異性体）並びに
デスメチルドキセピン（Ｅ−異性体およびＺ−異性体）
が抑鬱症候群を処置するのに活性であるため、ドキセピ
ンレベルを測定するための慣用の診断技術はドキセピン
およびデスメチルドキセピンの各異性体のレベルを測定
することに基づいているところ、患者血中濃度に定まる
治療範囲はドキセピンおよびデスメチルドキセピンの合
計であり、すなわちＥ−ドキセピン＋Ｚ−ドキセピン＋
Ｅ−デスメチルドキセピン＋Ｚ−デスメチルドキセピ
ン、即ち全ドキセピンによる。この範囲未満の濃度では
抑鬱症の処置につき治療レベル以下であり、この範囲よ
り高いレベルは心臓血管合併症、抗コリン性作用および
鎮静作用を包含する望ましくない作用が生じ、抗抑制効
果は別段増加しないことがある。
ドキセピンおよびデスメチルドキセピンのレベルはた
とえば高圧液体クロマトグラフィー［Park,J.of Chrom
atogr.,375,202−206（1986）］またはガスクロマトグ
ラフィー［Rosseel等,J.Pharm.Sci.,67,802−805（197
8）］のようなクロマトグラフ技術によって測定しうる
が、これら技術は職人芸的で熟練を要すると共に、時間
がかかりかつ面倒である。同様に、アミトリプチリンと
いて知られる三環式抗抑鬱剤の誘導体も、ドキセピンお
よびデスメチルドキセピンのレベルを測定する放射線免
疫分析系に使用するための抗血清および標識試薬を生成
させるべく使用されている［Midha及びCharette,Commun
ications In Psychopharmacol.,4,11−15（1980）;Vi
rtanen等,Acta.Pharmacol.Et.Toxicol.,47,274−278（1
980）］。しかしながら、非異性型型免疫原（すなわち
Ｎ−置換アミトリプチンを蛋白質キャリヤに結合させ
る）および非異性型の標識試薬を用いるこれら技術は、
ドキセピンおよびデスメチルドキセピンの異性体の認識
は応用できない。特に、４種の主たる三環式抗抑鬱剤を
検出するための非特異的な蛍光偏光免疫分析（FPIA）が
市販され、ヨーロッパ特許出願公開第226,730号および
米国特許第4,420,568号に記載されているが、この分析
により測定される濃度は血漿もしくは血清における三環
式抗抑鬱剤の全量の概算値に過ぎない。したがって、こ
の種の分析はドキセピンおよびデスメチルドキセピンの
４種全ての異性体の全量を正確に定量するには使用する
ことができない。
発明の要的 本発明によれば、試験試料における全ドキセピン（す
なわちＥ−ドキセピン、Ｚ−ドキセピン、Ｅ−デスメチ
ルドキセピンおよびＺ−デスメチルドキセピン）の定量
は、式（II）： ［式中、Ｙ−ＺはＣ＝CHもしくはＮ−CH2とすることが
でき、R1は１〜６個の炭素原子と０〜２個の異原子とを
有する結合基であり、R2はＨもしくはCH3とすることが
でき、Ｑは検出可能な部分もしくは免疫原キャリヤ物質
である］ のドキセピン誘導体で作成された抗体と標識試薬（ラベ
ル化された試薬ともいう）とを用いる簡単な免疫分析に
て行われる。当業者には了解されるように、Ｙ−ＺがＣ
＝CHである場合、この種の誘導体はＥ−異性体、Ｚ−異
性体またはＥ−異性体とＺ−異性体との混合物からなっ
ている。
試験試料は必ずしもドキセピンのＥ−異性体およびＺ
−異性体、並びにデスメチルドキセピンのＥ−およびＺ
−異性体の各々を含有してなくてもよく、これらは個々
に或いはその任意の組合せもしくは比にて存在しうるこ
とが了解されよう。したがって、ここで用いる「全ドキ
セピン」という用語およびその定量は、試験試料におけ
るドキセピンおよびデスメチルドキセピンの任意の１
種、その組合せまたは比の定量を包含すること意図す
る。
特に、本発明による全ドキセピンの免疫分析定量は、
先ず最初に試験試料を標識試薬および抗体試薬と同時的
に或いは任意の順序で順次に接触させて行われる。抗体
試薬は全ドキセピンに結合し或いは認識しうる抗体から
なり、これら抗体はＹ−ＺをＮ−CH2もしくはＣ＝CHと
することができ、R1が１〜６個の炭素原子と０〜２個の
異原子とを有する結合基であり、R2をＨもしくはCH3と
することができ、Ｑが免疫原キャリヤ物質である式IIの
ドキセピン誘導体から作成された１種もしくはそれ以上
の免疫原により生成される。標識試薬は、Ｙ−ＺがＣ＝
CHであり、R1が１〜６個の炭素原子と０〜２個の異原子
とを有する結合基であり、R2をＨもしくはCH3とするこ
とができ、Ｑが検出可能な部分である式IIのドキセピン
誘導体から作成される。抗体との結合反応に関与した或
いは関与しなかった標識試薬の量を、次いで試験試料に
おける全ドキセピンの関数として測定する。
１種もしくはそれ以上の免疫原におけるＹ−ＺがＮ−
CH2であり、標識試薬におけるＹ−ＺがＣ＝CHであれ
ば、抗体は単一の免疫原から生成されると共に全ドキセ
ピンに対し結合することができ、標識試薬はドキセピン
誘導体のＥ−異性体とＺ−異性体との混合物からなるこ
とが了解されよう。同様に、１種もしくはそれ以上の免
疫原におけるＹ−ＺがＣ＝CHであれば抗体試薬はドキセ
ピン誘導体のＥ−異性体とＺ−異性体とから生成される
抗体の混合物からなり、標識試薬はドキセピン誘導体の
Ｅ−異性体とＺ−異性体との混合物で構成される。
図面の簡単な説明 第１図は本発明の（Ｅ）−ドキセピンから誘導される
免疫原と蛍光性標識試薬とを作成するための合成経路を
示す。
第２図は本発明の（Ｚ）−ドキセピンから誘導される
免疫原と蛍光性標識試薬とを作成するための合成経路を
示す。
第３図は本発明の免疫原および蛍光性標識試薬を作成
するための合成経路を示す。
第４図は本発明の蛍光性標識試薬を作成するための合
成経路を示す。
第５図はドキセピン誘導体から作成された抗体と標識
試薬とを用いるアボットTDx（登録商標）分析装置にお
けるドキセピンとデスメチルドキセピンとの蛍光偏光免
疫分析定量を示すグラフであり、実施例11に記載した蛍
光偏光免疫分析により測定されるドキセピンおよびデス
メチルドキセピンのＥ−およびＺ−異性体のそれぞれに
つき得られるmP値の変化を示す。
第６図はドキセピン誘導体から作成された抗体と標識
試薬とを用いるアボットTDx（登録商標）分析装置にお
ける全ドキセピンの蛍光偏光免疫分析定量を示すグラフ
であり、実施例11に記載した蛍光偏光免疫分析により測
定されるドキセピンおよびデスメチルドキセピンのＥ−
およびＺ−異性体のそれぞれにつき得られるmP値の変化
を示す。
第７図は本発明の全ドキセピンの定量につき実施例11
に記載したアボットTDx（登録商標）分析装置における
蛍光偏光免疫分析の方法の精度を高性能液体クロマトグ
ラフィーと対比して示すグラフである。
発明の説明 本発明によれば全ドキセピンの定量は、先ず最初に試
験試料を標識試薬および抗体試薬と同時的に或いは任意
の順序で順次に接触させ、次いで抗体試薬との結合反応
に関与した或いは関与しなかった標識試薬の量を試験試
料における全ドキセピン量の関数として測定することに
より行われる。特に本発明は、全ドキセピンを定量する
蛍光偏光免疫分析に使用するための免疫原、これら免疫
原から作成される抗体および標識試薬に関するものであ
る。
本発明の１具体例によれば、抗体はＥ−ドキセピン免
疫原で免疫化された１群の宿主動物で生成され、抗体は
Ｚ−ドキセピン免疫原で免疫された別の群の宿主動物に
て生成され、式IIのＥおよびＺ免疫原のそれぞれにおい
てR1は１〜６個の炭素全原子と０〜２個の異原子とを有
する結合基であり、R2はＨもしくはCH3とすることがで
き、Ｑは免疫原キャリヤ物質であり、Ｙ−ＺはＣ＝CHで
ある。標識試薬は、R1が１〜10個の炭素原子および／ま
たは異原子を有する結合基であり、R2をＨもしくはCH3
とすることができ、さらにＱが検出可能な部分である式
IIのＥ−ドキセピン誘導体およびＺ−ドキセピン誘導体
で作成され、これら２種の誘導体の組成物として使用さ
れる。抗血清は、それぞれ4:1〜1:4、好ましくは2:1〜
1:2の比におけるＥ−ドキセピン免疫原とＺ−ドキセピ
ン免疫原とから生成される各抗体の混合物（等力価に調
整）である組成物からなっている。組織試薬は、それぞ
れ2:1〜1:6、好ましくは1:1〜1:4の比におけるＥ−ドキ
セピン標識試薬とＺ−ドキセピン標識試薬との混合物の
組成を有する。より好ましくは、抗血清は約1:1の比に
おける組成で存在するＥ−ドキセピン免疫原とＺ−ドキ
セピン免疫原とから生成された各抗血清の混合物（等力
価に調整）の組成を有し、さらに標識試薬はそれぞれ約
2:1の比におけるＥ−ドキセピン標識試薬とＺ−ドキセ
ピン標識試薬との混合物の組成を有する。
本発明の好適具体例によれば、ドキセピンに基づく免
疫原および標識試薬（Ｙ−Ｚは式IIにおいてＣ＝CHであ
る）を用いる。特にＥ−ドキセピン免疫原（式IIにおい
てR2はCH3であり、R1はカルボキシメチルであり、Ｑは
牛血清アルブミンである）とＺ−ドキセピン誘導体（式
IIにおいてR2はCH3であり、R1はカルボキシメチルであ
り、Ｑが牛血清アルブミンである）とから生成された抗
体を、Ｅ−ドキセピン蛍光トレーサー（式IIにおいてR2
はCH3であり、R1はＣ＝Ｏであり、Ｑは６−フルオレセ
ンである）とＺ−ドキセピン蛍光トレーサ（式IIにおい
てR2はCH3であり、R1はＣ＝Ｏであり、Ｑは６−フルオ
レセンである）とからなる標識試薬と共に免疫分析系に
て用いる。この具体例によれば、抗血清は好ましくは約
1:1の比にて存在するＥ−ドキセピン免疫原とＺ−ドキ
セピン免疫原とから生成された各抗血清の混合物（等力
価に調整）の組成からなり、蛍光トレーサ試薬はそれぞ
れ約1:2の比におけるＥ−ドキセピン蛍光トレーサとＺ
ドキセピン標識試薬との混合物からなっている。本発明
の他の具体例によれば、異性型が存在しないジベンゾキ
サゼピン（式IIにおいてＹ−ＺがＮ−CH2であり、R2がC
H3である）に基づく免疫原と、ドキセピン（式IIにおい
てＹ−ＺがＣ＝CHである）に基づく蛍光トレーサ試薬と
を用いる。特に、ジベンゾキサゼピン免疫原（式IIにお
いてＹ−ＺがＮ−CH2であり、R2がCH3であり、R1がカル
ボキシメチルであり、Ｑが牛血清アルブミンである）か
ら生成された抗体を免疫分析系に用いると共に、標識試
薬はＥ−ドキセピントレーサ（式IIにおいてR2がCH3で
あり、R1がカルボキシメチルであり、Ｑがアミノメチル
フルオレセンである）とＺ−ドキセピントレーサ（式II
においてR2がCH3であり、R1がカルボキシメチルであ
り、Ｑがアミノメチルフルオレセンである）とからなる
蛍光トレーサ試薬で構成される。この具体例によれば、
抗血清はジベンゾキサゼピン免疫原から生成された抗血
清からなり、蛍光トレーサ試薬はそれぞれ2:1〜1:6、好
ましくは1:1〜1:4、より好ましくは約1:2の比における
Ｅ−ドキセピン蛍光トレーサとＺ−ドキセピン蛍光トレ
ーサとの混合物の組成を有する。
本発明によれば予想外かつ驚くことに、全ドキセピン
の定量につきR2がCH3であり、R1が−CH2−CO−であり、
Ｙ−ＺがＣ＝CHであり、配置がＥである新規な免疫原お
よびR2がCH3であり、R1が−CH2−CO−であり、Ｙ−Ｚが
Ｃ＝CHであり、配置がＺである新規な免疫原と、R2がCH
3であり、R1が−CO−であり、Ｙ−ＺがＣ＝CHであり、
配置がＥである新規な式IIの蛍光トレーサおよびR2がCH
3であり、R1が−CO−であり、Ｙ−ＺがＣ＝CHであり、
配置がＺである新規な蛍光トレーサとの組合せ物が本発
明の意図する全ドキセピンの定量に重要であることが、
見出された。これら独特な試薬の有利な組合せは、全ド
キセピンの定量につき当業界にて進歩をもたらす。異性
型免疫原と異性型トレーサとのこの組成物を用いて、第
５図および第６図に示した広範囲のＥ−ドキセピン（I
A、Ｒ＝CH3）:Z−ドキセピン（IB、Ｒ＝CH3）:E−デス
メチルドキセピン（IA、Ｒ＝Ｈ）:Z−デスメチルドキセ
ピン（IB、Ｒ＝Ｈ）の比を有することが知られた試験試
料における全ドキセピンの定量化を達成した。上記組合
せ物の性能を第７図に高性能液体クロマトグラフィー
（HPLC）との対比によって示す。
本発明のドキセピン誘導体（式II）を用いて、これら
を慣用のキャリヤ物質と結合させることにより免疫原を
作成し、次いで抗体を得るために使用することができ、
或いはこれを用いて標識試薬を作成し、これらを試験試
料における全ドキセピンを測定するための免疫分析で検
出試薬として作用させることもできる。得に本発明のド
キセピン誘導体は当業界で知られた各種の慣用技術によ
り免疫原キャリヤ物質に結合させることができ、式IIに
おいてR1は１〜６個の炭素原子と０〜２の異原子とを有
する結合基であり、Ｑは免疫原キャリヤ物質である。当
業者には了解されるように、免疫原キャリヤ物質は従来
公知のものから選択することができ、大抵の場合蛋白質
もしくはポリペプチドであるが、たとえば炭水化物、多
糖類、リポ多糖類、核酸など充分な大きさおよび免疫原
性を有する他の物質も用いることができる。好ましくは
免疫原キャリヤ物質はたとえば牛血清アルブミン、キー
ホールリンペットフェモシアニン、チログロブリンなど
の蛋白質である。本発明による免疫原は、本発明による
免疫分析系に使用するため当業界で知られた方法により
ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を作成す
べく使用することができる。一般に、たとえばウサギ、
ヤギ、ネズミ、モルモットまたはウマのような宿主動物
の種々の部位に、免疫原を一般にアジュバントとの混合
物として注射する。追加注射を同じ部位または異なる部
位に定期的もしくは不定期的な間隔で行い、採血により
最適力価に達したとされるまで続ける。抗体は、所定容
積の抗血清を得るため宿主動物を出血させることにより
或いは体細胞ハイブリッド化技術またはモノクローナル
抗体を得るための当業界で知られた他の技術によって得
られる。
本発明により全ドキセピンを定量するための免疫分析
を行うに察し、当業界で知られた各種の不均質および均
質免疫分析系の方式にしたがうことができる。この種の
免疫分析系方式は限定を意図するものではないが、競
合、サンドイッチ、免疫測定の各技術を包含する。一般
に、この種の免疫分析系は免疫グロブリン（すなわち全
抗体もしくはその断片）が試験試料からの特定被分析物
に結合する能力に依存し、本発明の抗体もしくはその断
片と標識もしくは検出しうる成分とからなる標識試薬を
用いて結合の程度を決定する。この種の検出しうる標識
は限定を意図するものではないが酵素、放射線指標、ビ
オチン、毒素、薬物、ハプテン、DNA、RNA、リポソー
ム、発色団、化学発光体、着色粒子および着色微小粒
子、蛍光性化合物、たとえばアミノメチルフルオレセ
ン、アミノフルオレセン、５−カルボキシフルオレセ
ン、６−カルボキシフルオレセン、５−フルオレセニ
ル、６−フルオレセニル、チオ尿素フルオレセンおよび
メトキシトリアジノリル−アミノフルオレセンなどを包
含する。ここに説明するように、試験試料は天然にある
ものまたは合成により生じた液体またはその抽出物とす
ることができ、限定を意図するものではないが、たとえ
ば全血、血清、血漿、尿、糞、唾液、脳髄液、脳組織な
どの生物試験試料を包含する。さらに、試験試料は試験
試料の抽出物またはその任意の誘導体とすることもでき
る。
典型的には、この種の免疫分析系方式における結合程
度は、被分析物との結合反応に関与した或いは関与しな
かった標識試薬に存在する検出可能な部分の量によって
決定され、ここで検出されかつ測定される検出可能な部
分の量を試験試料に存在する被分析物の量に対応させる
ことができる。たとえば競合免疫分析系においては、し
ばしばリガンドと称する測定される物質は、検出可能な
部分に同様に結合するしばしばトレーサと称する構造上
近似した物質に対し、この種の抗体を産生させるべく用
いる免疫原を共通にした構造類似性を有するリガンドお
よびトレーサの部分に特異的な抗体における限られた個
数の結合部位につき競合する。
本発明によれば、ここに説明した全ドキセピンの定量
はトレーサの検出可能な成分がフルオレセン、アミノフ
ルオレセン、アミノメチルフルオレセン、カルボキシフ
ルオレセンなどよりなる群から選択される蛍光性部分で
ある蛍光偏光免疫分析系にて特に有用である。抗体に結
合するトレーサの量は、試験試料に存在する全ドキセピ
ンの量とは逆方向に変化する。したがって、抗体結合部
位に対する全ドキセピンおよびトレーサの相対的（した
がって特徴的）な結合親和性が分析系の重要なパラメー
タである。一般に、蛍光偏光技術は、蛍光トレーサが特
徴的波長の面偏光により励起されると、入射刺激光に応
じた偏光の程度を保持しながら他の特徴的波長の光（す
なわち蛍光）を発生して、これは所定媒体におけるトレ
ーサの回転割合に逆相関するという原理に基づく。この
性質の結果、たとえば粘性溶液相におけるような回転制
限を伴う或いは他の溶液成分に対し結合して比較的低い
回転割合を伴う場合には、トレーサ物質は自由溶液にお
けるよりも比較的高程度の放出光の偏光を保持する。し
たがってリガンドとトレーサとが抗体への結合に対し競
合する時間範囲内で、トレーサとリガンドとの結合割合
はたとえば選択性、感度および精度のような重要な性能
パラメータを保持すると共に遊離および結合トレーサの
適当な比率をもたらすようにすべきである。
本発明により全ドキセピンを定量するための蛍光偏光
免疫分析を行う際、全ドキセピンを含むとされる試験試
料を、本発明による免疫原で作成された抗血清の存在に
対し検出可能な蛍光偏光反応を発生しうる適当に選択さ
れたフルオレセン誘導体の存在下に、本発明により免疫
原で作成された抗血清と接触させる。次いで面偏光を溶
液に通過させて蛍光偏光反応を得ると共に、この反応を
試験試料中に存在する全ドキセピンの量の尺度として検
出する。
本発明による試験キットは、ここに説明したドキセピ
ンの全量に関する所望の蛍光偏光免疫分析を行うのに要
する全ての必須試薬を含む。この試験キットは必要な試
薬を保持する１個もしくはそれ以上の容器の組合せとし
て或いは試薬の適合性が許す組成物もしくは混合物とし
て市販パッケージ型で提供される。ドキセピンの全量に
関する蛍光偏光免疫分析定量のための試験キットが特に
好ましく、これは蛍光トレーサ化合物と上記面積原で産
生された抗体とからなっている。勿論、試験キットは当
業界で知られかつ産業上の使用者の観点から望ましい他
の物質（たとえば緩衝剤、希釈剤、標準など）をも含み
うることが了解されよう。
以下、限定はしないが実施例により本発明をさらに説
明する。かぎ括弧内に示す数字は第１〜４図に用いた構
造式の番号を意味する。
実施例１ （Ｅ）−デスメチルドキセピン［３］の合成 溶剤の記号:CHCl3＝クロロホルム、MeOH＝メタノー
ル、DMF＝ジメチルホルムアミド、CH2Cl2＝塩化メチレ
ン、Et2O＝ジエチルエーテル、EtOAc＝酢酸エチル、Hex
＝ヘキサン、THF＝テトラヒドロフラン、HOAc＝酢酸。
ドキセピン塩酸塩［１］（E/Z＝85/15）（55.0g、0.1
74モル）を600mlのH2Oに溶解させ、6M NaOHで塩基性と
なし、CHCl3（３×600ml）で抽出した。CHCl3抽出物を
合し、Na2SO4で脱水し、次いで溶剤を減圧除去した。得
られた油状物を250mlのEtOHに溶解させ、次いで21.15g
（0.182モル）のマレイン酸を100mlのEtOHに溶解させて
徐々に攪拌しながら添加し、次いでさらに350mlのEtOH
を添加した。得られた濁った溶液を透明になるまで還流
させ、次いで室温にて１晩静置させ、得られた結晶を減
圧濾過によって単離した。さらにEtOHから再結晶化させ
て41.3g（0.104モル）の白色結晶生成物［２］を98/2の
E/Zの比にて得た（ウオータース・エムポラシル・カラ
ムにて0.7ml/minの流量でEtOAc/MeOH/NH4OH（90/10/0.
2）で溶出させて行うHPLCにより測定）；融点:171〜172
℃。
（Ｅ）−ドキセピンマレイン酸塩［２］（2.50g、6.3
2ミリモル）を60mlのH2Oに部分溶解させ、6M NaOHにて
塩基性となし、次いでCHCl3（３×60ml）で抽出した。C
HCl3抽出物を合し、60mlのブラインで洗浄し、Na2SO4で
脱水し、次いで溶剤を減圧除去した。得られた油状物を
10mlのCHCl3に再溶解させ、1.8ml（13ミリモル）のトリ
エチルアミンを添加し、1.8ml（13ミリモル）の2,2,2−
トリクロルエチルクロルホルメートを添加し、次いで反
応物を窒素下で3.5時間攪拌した。次いで完結した反応
物を140mlのEt2Oで希釈し、順次に0.5MのHCl（２×140m
l）とH2O（140ml）とブライン（140ml）とで洗浄し、次
いでMgSO4で脱水し、溶剤を減圧除去した。得られた物
質をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより
精製し、EtOAc/Hex（20/80）で溶出させて1.48g（3.36
ミリモル）の所望の生成物を透明油状物として得た;1H
NMR（200MHz,CDCl3）：δ2.5（q,2H）,2.8（d,3H）,3.5
（t,2H）,4.6−4.7（m,2H）,4.8−5.7（幅広s,2H）,6.0
（t,1H）,6.8−6.9（m,2H）,7.1−7.4（m,6H）；質量ス
ペクトル（FAB）：（Ｍ）+440。
Ｎ−保護された（Ｅ）−デスメチルドキセピン中間体
（1.44g、3.27ミリモル）を12mlのTHFに溶解させ、2.88
gの亜鉛粉末を添加し、2.3mlの1M燐酸ナトリウム（pH＝
5.5）を添加し、次いで反応物を17時間攪拌した。この
反応物を次いで減圧濾過し、濾液溶剤を減圧除去し、得
られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに
より精製し、THF/MeOH/NH4OH（85/15/0.4）、次いでTHF
/MeOH/NH4OH（75/25/0.4）で溶出させて744mg（2.80ミ
リモル）の所望の生成物［３］を淡黄色固体として得
た;1H NMR（200MHz,CDCl3）：δ2.5（s,3H）,2.7（m,2
H）,3.5（m,2H）,4.7−5.8（幅広s,2H）,6.0（t,1H）,
6.8−6.9（m,2H）,7.1−7.4（m,6H）；質量スペクトル
（FAB）：（Ｍ＋Ｈ）+266。
実施例２ 牛血清アルブミンに対する酸［４］の結合による免疫原
［５］の合成 10mlのDMFにおける（Ｅ）−デスメチルドキセピン
［３］で（724mg、2.73ミリモル）の溶媒に0.838ml（6.
01ミリモル）のトリエチルアミンと0.605ml（5.46ミリ
モル）のブロモ酢酸エチルと添加し、反応物を窒素下で
17時間攪拌した。次いで完結した反応物を60mlのH2Oに
注ぎ入れ、6M NaOHで塩基性となし、Et2O（３×60ml）
で抽出した。エーテル抽出物を合して60mlのブラインで
洗浄し、MgSO4で脱水し、次いで溶剤を減圧除去した。
粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより
精製し、EtOAc/Hex（50/50）で溶出させて511mg（1.45
ミリモル）の所望の精製分を透明油状物として得た:1H
NMR（200MHz,CDCl3）：δ1.2（t,3H）,2.3（s,3H）,2.4
（m,2H）,2.6（t,2H）,3.2（s,2H）,4.2（q,2H）,4.7−
5.8（広幅s,2H）,6.0（t,1H）,6.8−6.9（m,2H）,7.1−
7.4（m,6H）；質量スペクトル（DCI−NH3）：（Ｍ＋
Ｈ）+352。
中間体エステル（460mg、1.31ミリモル）を8.4mlのMe
OHに溶解させ、4.2mlの10％NaOHを添加し、次いで溶液
を30分間攪拌した。この反応混合物を次いで30mlのH2O
で希釈し、pHを1M HClにより３〜４に調整し、次いでC
HCl3（３×35ml）で抽出した。CHCl3抽出物を合し、35m
lのブラインで洗浄し、Na2SO4で脱水し、次いで溶剤を
減圧除去して424mg（1.31ミリモル）の所望の生成物
［４］を白色固体として得た;1H NMR（200MHz,CDC
l3）：δ2.5−2.7（m,2H）,2.6（s,3H）,3.2（m,2H）,
3.4（s,2H）,4.7−5.8（幅広s,2H）,6.0（t,1H）,6.5
（幅広s,2H）,6.8−6.9（m,2H）,7.1−7.4（m,6H）；質
量スペクトル（DCI−NH3）：（Ｍ＋Ｈ）+324。
遊離酸［４］（59mg、0.18ミリモル）を0.86mlのDMF
に溶解させ、25mg（0.22ミリモル）のＮ−ヒドロキシス
クシンイミドを添加し、45mg（0.22ミリモル）の1,3−
ジシクロヘキシカルボジイミドを添加し、次いで反応物
を窒素下で17時間攪拌した。次いで反応物を、306mgの
牛血清アルブミン（BSA）を5.35mlの0.1M燐酸ナトリウ
ム（pH＝7.8）および1.4mlのDMFに溶かした溶液の中に
濾過した。この反応物を１晩攪拌し、次いで２リットル
の0.1M燐酸ナトリウム（pH＝7.8）に対し２時間、次い
でH2O（８×２リットル）に対して透析した。凍結乾燥
の後、276mgの所望の免疫原［５］が綿毛状固体として
得られた。
実施例３ アミノメチルフルオレセンに対する酸［４］の結合によ
るトレーサ［６］の合成 遊離酸［４］（11mg、0.034ミリモル）を0.50mlのDMF
に溶解させ、9mg（0.04ミリモル）の２−エチル−５−
フェニルイソキサゾリウム−３′−スルホネート（ウッ
ドワーズＫ）を添加し、pHをトリエチルアミンにより９
に調整し、反応物を窒素下で40分間攪拌した。次いで14
mg（0.034ミリモル）のアミノメチルフルオレセン塩酸
塩を添加し、反応物を再びトリエチルアミンによりpH9
に調整し、溶液を窒素下で暗所中にて16時間攪拌した。
次いで溶剤を減圧除去し、粗製残留物を1mm分取C18クロ
マトグラフ板１枚で精製し、H2O/MeOH/HOAc（20/80/0.
4）で溶出させて9mg（0.01ミリモル）の所望の生成物
［６］を橙色固体として得た；質量スペクトル（FA
B）：（Ｍ＋Ｈ）+667。
実施例４ （Ｚ）−デスメチルドキセピン［８］の合成 ドキセピン塩酸塩［１］（E/Z＝85/15）（100g、0.31
7モル）を800mlのH2Oに溶解させ、6M NaOHで塩基性と
なし、次いでCHCl3（３×800ml）で抽出した。CHCl3抽
出物を合し、Na2SO4で脱水し、溶剤を減圧除去した。得
られた油状物を700mlのEtOHに溶解し、次いで36.7g（0.
317モル）のマレイン酸を600mlのEtOHに溶解させて徐々
に攪拌しながら添加した。得られた濁った溶液を透明に
なるまで還流させ、次いで室温にて１晩静置した。結晶
を減圧濾過によって単離し、母液は保存した。結晶を上
記と同様にさらに２回再結晶化させ、３回の保存母液を
合して溶剤を減圧除去した。還流EtOHからの母液物質の
再結晶化により最終的に24gの母液生成物を得、これは
組成が65％Ｚ−異性体であったウオータース・エムポラ
シルカラムで行い、EtOAc/MeOH/NH4OH（90/10/0.2）に
て0.7ml/minの流量で溶出させるHPLCにより測定）。450
mlのEtOHからこの物質を再結晶化させて結晶（9.1g）を
得、これは80％Ｚ−異性体であった。この物質を170ml
のCHCl3/CCl4（50/50）から４℃で再結晶化させて、組
成が87％Ｚ−異性体である7.65gの結晶物質を得た。さ
らに３回のCHCl3/CCl4からの再結晶化により最終的に4/
96のE/Z比における5.12g（12.9ミリモル）の所望の生成
物［７］を得た；融点162〜163℃。
（Ｚ）−ドキセピンマレイン酸塩［７］（1.00g、2.5
3ミリモル）を35mlのH2Oに部分溶解させ、6M NaOHで塩
基性となし、次いでCHCl3（３×35ml）で抽出した。CHC
l抽出物を合して35mlのブラインで洗浄し、Na2SO4で脱
水し、次いで溶剤を減圧除去した。得られた抽状物を4m
lのCHCl3に再溶解し、0.65ml（4.7ミリモル）のトリエ
チルアミンを添加し、0.65ml（4.7ミリモル）の2,2,2−
トリクロルエチル−クロルホルメートを添加し、反応物
を窒素下で3.5時間攪拌した。次いで完結した反応物を5
0mlのEt2Oで希釈し、順次に0.5MのHCl（２×50ml）とH2
O（50ml）とブライン（50ml）とで洗浄し、MgSO4で脱水
し、溶剤を減圧除去した。得られた物質をさらにシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、EtOAc/He
x（20/80）で溶出させて710mg（1.61ミリモル）の所望
の生成物を透明油状物として得た;1H NMR（200MHz,CDCl
3）：δ2.7（q,2H）,2.9（d,3H）,3.5（t,2H）,4.6−4.
7（m,2H）,5.0−5.4（幅広s,2H）,5.7（t,1H）,6.9（m,
2H）,7.1−7.4（m,6H）；質量スペクトル（FAB）：
（Ｍ）+440。
Ｎ−保護された（Ｚ）−デスメチルドキセピン（679m
g、1.54ミリモル）を5.7mlのTHFに溶解させ、1.36mgの
亜鉛粉末を添加し、1.1mlの1M燐酸ナトリウム（pH＝5.
5）を添加し、次いで反応物を17時間攪拌した。この反
応混合物を次いで減圧濾過し、濾液溶剤を減圧除去し、
次いで得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィーにより精製し、THF/MeOH/NH4OH（85/15/0.4）、
次いでTHF/MeOH/NH4OH（82/18/0.4）で溶出させて364mg
（1.37ミリモル）の所望の生成物［８］を淡黄色固体と
して得た;1H NMR（200MHz,CD3OD）：δ2.7（s,3H）,2.8
（q,2H）,3.2（t,2H）,5.1−5.3（幅広s,2H）,5.7（t,1
H）,6.8−7.0（m,2H）,7.1−7.4（m,6H）；質量スペク
トル（DCI−NH3）：（Ｍ＋Ｈ）+266。
実施例５ 牛血清アルブミンに対する酸［９］の結合による免疫原
［10］の合成 （Ｚ）−デスメチルドキセピン［８］（336mg、1.27
ミリモル）を4mlのDMF中で攪拌し、0.39ml（2.8ミリモ
ル）のトリエチルアミンを添加し、0.28ml（2.5ミリモ
ル）のブロモ酢酸エチルを添加し、次いで反応物を窒素
下で17時間攪拌した。次いで完結した反応物を30mlのH2
Oに注ぎ入れ、6M NaOHで塩基性となし、次いでEt2O
（３×30ml）で抽出した。エーテル抽出物を合して30ml
のブラインで洗浄し、MgSO4で脱水し、次いで溶剤を減
圧除去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィーにより精製し、EtOAc/Hex（50/50）で溶出させて
191mg（0.543ミリモル）の所望の生成物を黄色油状物と
して得た;1H NMR（200MHz,CDCl3）：δ1.2（t,3H）,2.4
（s,3H）,2.5−2.8（m,4H）,3.2（s,2H）,4.2（q,2H）,
5.1−5.3（広幅s,2H）,5.7（t,1H）,6.8−7.0（m,2H）,
7.1−7.4（m,6H）；質量スペクトル（DCI−NH3）：（Ｍ
＋Ｈ）+352。
中間体エステル（180mg、0.51ミリモル）を3.3mlのMe
OHに溶解し、1.64mlの10％NaOHを添加し、次いで溶液を
30分間攪拌した。反応混合物を次いで10mlのH2Oで希釈
し、pHを1M HClにより３〜４に調整し、CHCl3（３×10
ml）で抽出した。CHCl3抽出物を合して10mlのブライン
で洗浄し、Na2SO4で脱水し、次いで溶剤を減圧除去して
166mg（0.51ミリモル）の所望の生成物［９］を白色フ
ォームとして得た;1H NMR（200MHz,CDCl3）：δ2.7（s,
3H）,2.7−2.9（m,2H）,3.2−3.4（m,2H）,3.5（s,2
H）,5.1−5.3（幅広s,2H）,5.7（t,1H）,5.9−6.3（幅
広s,2H）,6.8−7.0（m,2H）,7.1−7.4（m,6H）；質量ス
ペクトル（DCI−NH3）：（Ｍ＋Ｈ）+324。
遊離酸［９］（65mg、0.20ミリモル）を0.94mlのDMF
に溶解し、28mg（0.24ミリモル）のＮ−ヒドロキシスク
シンイミドを添加し、50mg（0.24ミリモル）の1,3−ジ
シクロヘキシカルボジイミドを添加し、次いで反応物を
窒素下で17時間攪拌した。次いで反応物を、342mgの牛
血清アルブミンを5.8mlの0.1M燐酸ナトリウム（pH＝7.
8）および1.5mlのDMFに溶かした溶液の中に濾過した。
この反応物を１晩攪拌し、次いで２リットルの0.1M燐酸
ナトリウム（pH＝7.8）に対し３時間、次いでH2O（７×
２リットル）に対し透析した。凍結乾燥の後、317mgの
所望の免疫原［10］が綿毛状白色固体として得られた。
実施例６ アミノメチルフルオレセンに対する酸［９］の結合によ
るトレーサ［11］の合成 酸［９］（12mg、0.037ミリモル）を0.50mlのDMFに溶
解し、10mg（0.041ミリモル）の２−エチル−５−フェ
ニルイソキサゾリウム−３′−スルホネートを添加し、
トリエチルアミンによりpHを９に調整し、次いで反応物
を窒素下で40分間攪拌した。次いで15mg（0.037ミリモ
ル）のアミノメチルフルオレセン塩酸塩を添加し、反応
pHを再びトリエチルアミンにより９に調整し、溶液を窒
素下で暗所中にて16時間攪拌した。次いで溶剤を減圧除
去し、粗製残留物を1mm分取C18クロマトグラフ板１枚で
精製し、H2O/MeOH/HOAc（10/90/0.4）で溶出させて17mg
（0.025ミリモル）の所望の生成物［11］を橙色固体と
して得た。質量スペクトル（FAB）：（Ｍ＋Ｈ）+667。
実施例７ N1−（３−メチルアミノプロピル）−ジベンズ［b,f］
−［1,4］−オキサゼピン［13］の合成 トリクロルエチルクロルホルメート（0.90ml、6.53ミ
リモル）をN1−（３−ジメチルアミノプロピル）−ジベ
ンズ［b,f］−［1,4］−オキサゼピン［12］（580mg,2.
05ミリモル）とトリエチルアミン（Et3N）（1.02ml、7.
18ミリモル）6mlのクロロホルムとの０℃溶液に窒素下
で滴下し、０℃にて10分間、次いで室温にて16時間攪拌
した。この反応混合物を30mlの水に注ぎ入れ、pHを2N
NaOHで13に調整し、相を分離させ、３×25mlの酢酸エチ
ル（EtOAc）で抽出し、全有機相を合して炭酸カリウム
で脱水した。溶剤を減圧除去して橙色油状物を得、これ
をカラムクロマトグラフィー（150gシリカゲル;20％THF
/79％ヘキサン/1％Et3N;v/v）により精製して545mg（60
％）の所望の中間体カルバメートを得た。1H NMR（200M
Hz,CDCl3）δ7.4−7.3（m,3H）,7.1−6.9（m,3H）,6.9
−6.8（m,2H）,5.3（s,2H）,4.6（d,2H）,3.8（t,2H）,
3.4（t,2H）,2.9（s,3H）,1.9（p,2H）；質量スペクト
ル（DCI,NH3）（Ｍ＋Ｈ）+443。
亜鉛粉末（2.40g、36.6ミリモル）を、20ml THF/3ml
1.0M KH2PO4（pH4.4）緩衝液にＮ−保護中間体（540
mg、1.22ミリモル）を含有する溶液に添加し、室温にて
12.5時間攪拌した。反応物を濾過し、固体を３×20mlの
EtOAcと１×5mlの1NHClとで洗浄した。濾液を2N NaOH
によりpH12に調整し、層を分離させ、濾液を２×30mlの
EtOAcで抽出し、有機層を合し、次いで炭酸カリウムで
脱水した。溶剤を減圧除去して黄色油状物を得、これを
カラムクロマトグラフィー（100gシリカゲル、15％MeOH
/84％CH2Cl2/1％Et3N、v/v）により調製して262mg（80
％）の所望の第二アミン［13］、N1−（３−メチルアミ
ノプロピル）−ジベンズ［b,f］−［1,4］−オキサゼピ
ンを得た。1H NMR（200MHz,CDCl3）δ7.3−7.2（m,2
H）,7.1−6.9（m,3H）,6.9−6.7（m,3H）,5.3（s,2H）,
3.8（t,2H）,2.6（t,2H）,2.4（s,3H）,2.2（s,1H）,1.
8（p,2H）；質量スペクトル（DCI−NH3）（Ｍ＋Ｈ）+26
9。
実施例８ 免疫原［15］の合成 ブロモ酢酸エチル（0.22ml、1.95ミリモル）をトリエ
チルアミン（Et3N）（0.63ml、4.5ミリモル）とN1−
（３−メチルアミノプロピル）−ジベンズ［b,f］−
［1,4］−オキサゼピン［13］（260mg、0.97ミリモル）
と7mlのジメチルホルムアミド（DMF）との溶液に窒素下
で添加し、室温にて19時間攪拌した。反応混合物を100m
lの水に注ぎ入れ、pHを2N NaOHにより13に調整し、３
×75mlのジエチルエーテルで抽出し、有機層を合し、次
いで炭酸カリウムで脱水した。溶剤を減圧除去して黄色
油状物を得、これをカラムクロマトグラフィー（75gシ
リカゲル;15％メタノール/85％塩化メチレン/0.5％Et
3N;v/v）で精製して330mg（96％）の所望の中間体アミ
ノエステルを得た。1H NMR（200MHz,CDCl3）δ7.4−7.2
（m,2H）,7.2−6.9（m,3H）,6.9−6.7（m,3H）,5.3（s,
2H）,4.1（q,2H）,3.8（t,2H）,3.2（s,2H）,2.5（t,2
H）,2.3（s,3H）,1.8（p,2H）,1.3（t,3H）；質量スペ
クトル（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+355。
水酸化ナトリウムの水溶液（2.8ml、2.0N NaOH、5.6
ミリモル）を所望の中間体アミノエステル（245mg、0.6
9ミリモル）/5mlジオキサン、2ml蒸留水の溶液に添加
し、室温にて１時間攪拌した。反応物を30mlの水に注ぎ
入れ、pHを2M NaOHにより13に調整し、１×25mlのトル
エンで抽出し、1N HClでpH4に調整し、３×25mlのクロ
ロホルムで抽出し、次いでクロロホルム抽出物を合し
た。溶剤を減圧除去して65mg（28％）の所望の酸［14］
をオフホワイト色固体として得た。1H NMR（200MHz,CDC
l3;CD3OD,4:1）δ7.7（s,1H）,7.4−7.3（m,2H）,7.1−
7.0（m,3H）,6.9−6.7（m,3H）,5.3（s,2H）,3.9（t,2
H）,3.5（s,2H）,3.2（t,2H）,2.7（s,3H）,2.0（p,2
H）；質量スペクトル（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+327。
フラスコに次の物質を充填した：ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（DCC）（44.8mg、0.217ミリモル）、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド（24.7mg、0.215ミリモ
ル）、酸［14］（64mg、0.195ミリモル）および1.5mlジ
メチルホルムアミド（DMF）。室温にて窒素下で21時間
攪拌し、次いで濾過して所望の活性エステルの透明溶液
を得た。この溶液を5mlのpH7.8の0.1M燐酸塩緩衝液/1.5
ml DMFにおける牛血清アルブミン（BSA）（207mg、0.0
0305ミリモル）の17℃溶液に添加し、１晩攪拌した。反
応混合物を次の順序で透析した。１×２リットルのpH7.
8の0.1M燐酸塩緩衝液、５×２リットルの蒸留水。次い
で透明袋の残留内容物を凍結乾燥して202mgの所望の免
疫原［15］を得た。
実施例９ トレーサ［16］の合成 トリエチルアミン（0.020mg、0.14ミリモル）を酸［1
4］（15mg、0.046ミリモル）／ウッドワーズＫ（12.9m
g、0.051ミリモル）/0.9ml DMFの溶液に窒素下で添加
して１時間攪拌し、次いでアミノメチルフルオレセン
（19.2mg、0.048ミリモル）とトリエチルアミン（0.03m
l、0.21ミリモル）とを反応混合物に添加した。この溶
液を２日間攪拌し、溶剤を減圧除去し、得られた橙色固
体を精製して15mgの所望のトレーサ［16］を得た。質量
スペクトル：（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+672。
実施例10 トレーサ［17］および［18］の合成 ６−カルボキシフルオレセン（500mg、1.33ミリモ
ル）を7mlのDMFに溶解し、184mg（1.59ミリモル）のＮ
−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、328mg（1.59ミ
リモル）の1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミドを添
加し、反応物を窒素下で暗所中にて17時間攪拌した。こ
の反応混合物を次いで減圧濾過し、濾液を353mg（1.33
ミリモル）の（Ｅ）−デスメチルドキセピン［３］と合
し、0.28ml（2.0ミリモル）のトリエチルアミンを添加
し、次いで溶液を窒素下で暗所中にて24時間攪拌した。
次いで反応溶剤を減圧除去し、粗製油状物をシリカゲル
クロマトグラフィーにより精製し、CH2Cl2/MeOH（90/1
0）、次いでCH2Cl2/MeOH（70/30）で溶出させて544mg
（0.872ミリモル）の所望の生成物［17］を橙色固体と
して得た；質量スペクトル（FAB）：（Ｍ＋Ｈ）+624。
６−カルボキシフルオレセン（762mg、2.02ミリモ
ル）を8mlのDMFに溶解し、280mg（2.43ミリモル）のＮ
−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、501mg（2.43ミ
リモル）の1,3−ジシクロヘキシカルボジイミドを添加
し、次いで反応物を窒素下で暗所中にて17時間攪拌し
た。次いで反応物を減圧濾過し、濾液を538mg（2.03ミ
リモル）の（Ｚ）−デスメチルドキセピン［８］と合
し、0.57ml（4.1ミリモル）のトリエチルアミンを添加
し、次いで溶液を窒素下で暗所中にて24時間攪拌した。
次いで反応溶剤を減圧除去し、粗製油状物をシリカゲル
クロマトグラフィーにより精製し、CH2Cl2/MeOH（90/1
0）、次いでCH2Cl2/MeOH（70/30）で溶出させて281mg
（0.451ミリモル）の所望の生成物［18］を橙色固体と
して得た；質量スペクトル（FAB）：（Ｍ＋Ｈ）+624。
実施例11 全ドキセピンに関する蛍光偏光免疫分析 （ａ）６匹のウサギをＥ−ドキセピン免疫原［５］で
免疫化し、一方６匹のウサギをＺ−ドキセピン免疫原
［10］で免疫化して、実施例２および５に記載したよう
に抗血清を作成した。個々の力価は、６匹のウサギの各
群における平均力価がほぼ等しいことを示した。原料抗
血清を1:1の容量比で混合し、109mMの燐酸塩緩衝液と50
mMの二ナトリウムEDTAと0.01％牛γ−グロブリンと0.10
5％ナトリウムアジドとを含有する緩衝液（pH＝6.65）
で希釈した。
Ｅ−ドキセピントレーサ［17］82nMとＺ−ドキセピン
トレーサ［18］82nMとを、いずれも50mM ACESと150mM
NaClと0.1％ナトリウムアジドと25％DMFとを含有する
緩衝液（pH＝6.8）中に調製して蛍光トレーサ（実施例1
0）を処方した。次いで両溶液を1:2（E:Z）の容量比で
混合して、それぞれＥ−およびＺ−異性体につき約27nM
および55nMの最終濃度とした。
分析に先立ち、各試験試料を1990年12月14日付け出願
の米国特許出願第627,282号に記載されたように予備処
理した。ポリプロピレンチューブに試験試料（0.25ml）
と0.9mlのヘプタン／イソアミルアルコール（35:1、v/
v）と0.1mlの25％炭酸ナトリウム溶液とを添加した。こ
の混合物を激しく１分間にわたり回動させ、次いで9500
×ｇにて30秒間にわたり遠心分離した。他のポリプロピ
レンチューブに0.5mlの第１チューブからの上層と0.1ml
の0.05N HClと0.04mlのクロラミンＴ（0.04mg/ml水）
とを添加した。この混合物を30秒間回動させ、２分間静
置させ、次いで9,500×ｇにて30秒間遠心分離した。最
後に、0.085mlの第２チューブからの下層をアボットTDx
（登録商標）セラピューチック・ドラグ・モニタリング
・システム・アナライザ（本出願人）の試料カートリッ
ジに移した。
TDxアナライザーにて標準TDx手順にしたがって分析を
行い、ここで試料（0.02ml）を0.025mlの抗血清および
0.023mlのトレーサと2mlの全緩衝剤溶液中で接触させ
た。結果をミリ偏光度（mP）単位として現す。
42.5％Ｅ−ドキセピンと7.5％Ｚ−ドキセピンと25％
Ｅ−デスメチルドキセピンと25％Ｚ−デスメチルドキセ
ピン（モル比）とを、50mM燐酸塩緩衝液と150mM NaCl
と0.1％ナトリウムアジドと0.07％牛血清アルブミンと
を含有する緩衝液（pH6.5）に含有するよう調製した較
正試料を用い、標準曲線を作成した。各被分析物を個々
に標準曲線とを比較し、これを第５図に示す。
（ｂ）６匹のウサギを、実施例８に記載したようにジ
ベンゾキサゼピン免疫原［15］で免疫化して抗血清を作
成した。原料抗血清を、109mMの燐酸塩緩衝液と50mMの
二ナトリウムEDTAと0.01％の牛γ−グロブリンと0.105
％のナトリウムアジドとを含有する緩衝液（pH＝6.65）
で希釈した。
Ｅ−ドキセピントレーサ［６］（実施例３）82nMとＺ
−ドキセピントレーサ［11］（実施例６）82nMとを50mM
ACESと150mM NaClと0.1％ナトリウムアジドと25％DM
Fとを含有する緩衝液（pH＝6.8）中に調製して、蛍光ト
レーサを処方した。次いで両溶液を1:2（E:Z）の容量比
で混合し、それぞれＥ−およびＺ−異性体につき約27nM
および55nMの最終濃度とした。
分析に先立ち、各試験試料を上記（ａ）に記載したよ
うに予備処理した。ポリプロピレンチューブに試験試料
（0.25ml）と0.9mlのヘプタン／イソアミルアルコール
（35:1、v/v）と0.1mlの25％炭酸ナトリウム溶液とを添
加した。この混合物を激しく１分間にわたり回動させ、
次いで9500×ｇにて30秒間遠心分離した。他のポリプロ
ピレンチューブに0.5mlの第１チューブからの上層と0.1
mlの0.05N HClと0.04mlのクロラミンＴ（0.04mg/ml
水）とを添加した。この混合物を30秒間回動させ、２分
間静置し、次いで9,500×ｇにて30秒間遠心分離した。
最後に0.085mlの第２チューブからの下層をTDx試料カー
トリッジに移した。
TDxアナライザーにて標準TDx手順にしたがって分析を
行い、ここで試料（0.02ml）を0.02mlの抗血清および0.
025mlのトレーサと2mlの全緩衝剤溶液にて接触させた。
結果をミリ偏光度（mP）単位として現す。
42.5％Ｅ−ドキセピンと7.5％Ｚ−ドキセピンと25％
Ｅ−デスメチルドキセピンと25％Ｚ−デスメチルドキセ
ピン（モル比）を50mM燐酸塩緩衝液と150mM NaClと0.1
％ナトリウムアジドと0.07％牛血清アルブミンとを含有
する緩衝液（pH6.5）に含有するよう処方した較正試料
を用い、標準曲線を作成した。各被分析物を個々に第６
図に示したように標準曲線と比較した。
実施例14 全ドキセピンのTDx分析とHPLCとの対比 全ドキセピンTDx分析の相対的精神を、患者試料の抽
出物を用いHPLCとの相関関係により決定した。HPLC分析
のための抽出物を下記するように作成し、三環式の抗抑
鬱剤ロキサピンおよびアモキサピンをそれぞれアセトニ
トリルにおける4mg/mlの濃度で内部標準として用いた。
1.1.0mlの患者標準をテフロンネジキャップが装着され
た16×125シリル化チューブにピペットで導入する。適
当な標準検量曲線の凍結部分をフリーザから取出して解
凍させる。内部標準を含有する0.75mlのアセトニトリル
を各チューブに添加する。
2.1.0mlの0.25N NaOHに続き0.200mlのイソアミルアル
コールを添加し、激しく回動させ、次いで各チューブを
5.0分間載置させる。
3.各チューブに10.0mlのｎ−ヘプタンをピペットで入
れ、各チューブのキャップを密閉する。ヘプタン／血漿
の二相混合物を1.0時間にわたり激しく振とうする。
4.振とう器から各チューブを取出して遠心分離器に移
す。ヘプタン／血漿混合物を少なくとも2000×重力
（ｇ）で30分間遠心分離して層を静澄させる。
5.各チューブを遠心分離器から取出し、ヘプタン上層を
1.0mlの0.1M（pH3）グリシルグリシン緩衝液を含有する
同一仕様の他のシリル化チューブに移す。これらチュー
ブに蓋を施し、激しく1.0時間にわたり振とうする。
6.各チューブを振とう器から取出して遠心分離器に移
す。二相グリシルグリシン／ヘプタン混合物を少なくと
も2000×ｇにて30分間にわたり遠心分離する。
7.各チューブを遠心分離器から取出し、ネジを外し、ヘ
プタン上層を吸引除去またはピペットで除去して捨て
る。
8.2.0mlの0.25N NaOHをそれぞれの残留グリシルグリシ
ン下層に添加する。各水性抽出物に5.0mlのｎ−ペンタ
ンを添加し、チューブにキャップし、次いで1.0時間振
とうする。
9.各チューブを振とう器から取出し、遠心分離器に移
す。ペンタン／水混合物を200×30分間遠心分離する。
10.各チューブを遠心分離器から取出してペンタン上層
を16×100シリル化円錐ネジ付試験チューブに移す。試
験チューブを密栓し、1/4回転戻す。チューブを暖かい
砂浴に入れ、チューブを入れた砂浴を減圧デシケータ箱
に移し、次いで減圧を加える。ペンタンを蒸発させるの
に約25〜30分間を要する。
11.砂浴におけるチューブをデシケータから取出して各
チューブに1.0mlのペンタンをピペットで導入し、再び
キャップを施して各チューブを短時間回動させる。キャ
ップを1/4回転開き、次いで各チューブをデシケータに
戻して減圧を再び10〜15分間加え、ペンタンを蒸発させ
る。
12.乾燥チューブをデシケータから取出して0.070mlのHP
LC移動相にピペットで入れる。各チューブを約30秒間回
動させ、チューブの面がを濡れるよう注意する。
13.各チューブを遠心分離器に移して200×ｇで２〜３分
間遠心分離する。
14.各チューブを遠心分離器から取出して全内容物をWIS
P自動回転盤試料キュベットに移す。注入容積を１回の
注入当り0.050mlに設定して、80オングストロームの孔
経を有する３μｍのシリカが充填された10cm×0.6cmカ
ラムに注入する。クロマトグラフ移動相を80部の0.025M
二塩基性燐酸ナトリウム（濃燐酸によりpH3に調整）と2
0部のアセトニトリル/0.021M ｎ−ノニルアミン（pH範
囲＝7.4〜7.8）との混合物で構成する。分析カラムに
は、40μｍの薄膜シリカを含有する乾燥充填保護カラム
を装着する。溶剤の流量を1.6ml/minとした。
直線回帰分析は、全ドキセピンTDx分析とHPLC分析と
の間で良好な相関関係を示した（Ｎ＝103、Ｒ＝0.961
2、Ｓ＝0.93667）。結果を第７図に示す。
ここに開示した本発明につき、発明の思想および範囲
を逸脱することなく多くの改変も可能であることが明か
であろう。それ故に発明を制限するのは、添付する請求
の範囲に示されたもののみである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/535 Ｇ０１Ｎ 33/535 (72)発明者 ルースカ，ロバート・イー アメリカ合衆国、イリノイ・60648、リ バテイビル、メイフエアー・ドライブ・ 1010 (72)発明者 ジヨンソン，ドナルド アメリカ合衆国、イリノイ・60046、リ ンデンハースト、サンセツト・レーン・ 2309 (56)参考文献 特開 平２−250（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−78292（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−132362（ＪＰ，Ａ) Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉ ｎｔ．，24（２），168−71（1982) Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ. Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，28（９）, 1037−47（1990) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07D 313/12 C07D 267/18 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試験サンプル中の全ドキセピンを定量する
    ためのイムノアッセイ法であって、該全ドキセピンが、
    １以上のＥ−ドキセピン、Ｚ−ドキセピン、Ｅ−デスメ
    チルドキセピン、およびＺ−デスメチルドキセピンから
    成り、 （ａ）前記試験サンプルをラベル化された試薬のＥ−異
    性体およびＺ−異性体ならびに抗体試薬と接触させ、反
    応溶液を形成する工程であり、該抗体試薬が前記全ドキ
    セピンに結合することができる抗体を含み、 （ｉ）該抗体が、式： ［式中、Ｙ−ＺはＮ−CH2あるいはＣ＝CHであり、R1は
    １〜６個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子から成
    る結合基であり、R2はＨあるいはCH3であり得、Ｑは免
    疫原性キャリアー物質である］のドキセピン誘導体を用
    いて調製された１以上の免疫原により産生され、 （ii）該ラベル化された試薬が式： ［式中、Ｙ−ＺはＮ−CH2あるいはＣ＝CHであり、R1は
    １〜６個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子から成
    る結合基であり、R2はＨあるいはCH3であり得、Ｑは検
    出可能な成分である］の化合物を含むことを特徴とする
    工程、および （ｂ）試験サンプル中の全ドキセピンの量の関数とし
    て、前記抗体との結合反応に関係した、あるいはしなか
    った反応溶液中の前記ラベル化された試薬の量を測定す
    る工程、 を含む前記イムノアッセイ法。
  2. 【請求項２】工程１（ａ）（ｉ）の１以上の免疫原中の
    Ｙ−ＺがＣ＝CHであり、これにより前記抗体試薬が前記
    免疫原のＥ−異性体およびＺ−異性体から産生される抗
    体の混合物を含み、工程１（ａ）（ii）のラベル化され
    た試薬中のＹ−ＺがＣ＝CHであり、これにより該ラベル
    化された試薬が該ドキセピン誘導体のＥ−異性体および
    Ｚ−異性体の混合物の組成物であることを特徴とする請
    求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】工程１（ａ）（ｉ）の免疫原中のＹ−Ｚが
    Ｎ−CH2であり、工程１（ａ）（ii）のラベル化された
    試薬中のＹ−ＺがＣ＝CHであり、これにより該ラベル化
    された試薬がドキセピン誘導体のＥ−異性体およびＺ−
    異性体の混合物の組成物であることを特徴とする請求項
    １に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記イムノアッセイ法が、前記ラベル化さ
    れた試薬の検出可能な成分が、該抗体の存在に対して検
    出可能な蛍光偏光応答を産生し得る蛍光分子である、蛍
    光偏光イムノアッセイであることを特徴とする請求項１
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】（ａ）蛍光偏光応答を得るために、前記反
    応溶液中に平面偏光を通過させ、 （ｂ）試験サンプル中の全ドキセピンの関数として、該
    反応溶液に対する該蛍光偏光応答を検出することによ
    り、前記ラベル化された試薬を測定する請求項４に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】前記蛍光成分が、アミノメチルフルオレセ
    イン、アミノフルオレセイン、５−カルボキシフルオレ
    セイン、６−カルボキシフルオレセイン、５−フルオレ
    セイニル、６−フルオレセイニル、チオウレアフルオレ
    セイン、およびメトキシトリアジノリルアミノフルオレ
    セインから成る群から選択されることを特徴とする請求
    項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】抗体試薬の組成が、前記免疫原のＥ−異性
    体およびＺ−異性体から産生された抗体の比率が4:1
    （E:Z）から1:4（E:Z）の範囲である、請求項２に記載
    の方法。
  8. 【請求項８】前記組成比が1:1である請求項７に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】前記ラベル化された試薬の組成が、ラベル
    化された試薬のＥ−異性体およびＺ−異性体の比率が約
    2:1（E:Z）から約1:6（E:Z）の範囲である、請求項２に
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記ラベル化された試薬の組成比が1:1
    である請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】工程１（ａ）（ｉ）の１以上の免疫原中
    のＹ−ＺがＣ＝CHであり、これにより抗体試薬が該免疫
    原のＥ−異性体およびＺ−異性体から産生される抗体の
    混合物を含み、工程１（ａ）（ii）のラベル化された試
    薬中のＹ−ＺがＣ＝CHであり、これにより該ラベル化さ
    れた試薬がドキセピン誘導体Ｅ−異性体およびＺ−異性
    体の混合物の組成物であることを特徴とする請求項６に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】請求項11に記載の全ドキセピンを定量す
    る方法であり、前記抗体試薬が式： および、式： の免疫原に対する応答により産生された抗体を含み、前
    記ラベル化された試薬組成物が式： および、式： ［式中、Ｑは６−フルオレセインである］の混合物であ
    ることを特徴とする前記方法。
  13. 【請求項１３】抗体試薬の組成が、前記免疫原のＥ−異
    性体およびＺ−異性体から産生された解体の比率が4:1
    （E:Z）から1:4（E:Z）の範囲であり、ラベル化された
    試薬の組成が前記ラベル化された試薬のＥ−異性体およ
    びＺ−異性体の比率が2:1（E:Z）から1:6（E:Z）の範囲
    である請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記抗体組成比が1:1であり、前記試薬
    組成比が1:1である請求項13に記載の全ドキセピンの定
    量法。
  15. 【請求項１５】ドキセピンに結合し得る抗体を含む抗体
    試薬であって、該抗体が式： ［式中、Ｙ−ＺはＮ−CH2あるいはＣ＝CHであり、R1は
    １〜６個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子から成
    る結合基であり、R2はＨあるいはCH3であり得、および
    Ｑは免疫原性キャリアー物質である］のドキセピン誘導
    体から調製された１以上の免疫原によって産生されたこ
    とを特徴とする前記抵抗試薬。
  16. 【請求項１６】Ｙ−ＺがＣ＝CHであり、前記抗体試薬が
    免疫原のＥ−異性体およびＺ−異性体から産生される抗
    体の混合物の組成から成ることを特徴とする請求項15に
    記載の抗体試薬。
  17. 【請求項１７】前記抗体の抗体混合物が、前記免疫原の
    Ｅ−異性体およびＺ−異性体から産生される抗体の比率
    が約4:1（E:Z）から約1:4（E:Z）の範囲である組成から
    成ることを特徴とする請求項16に記載の抗体試薬。
  18. 【請求項１８】抗体組成比が1:1である請求項17に記載
    の抗体試薬。
  19. 【請求項１９】式： ［式中、Ｙ−ＺはＣ＝CHのＥ−異性体、Ｃ＝CHのＺ−異
    性体あるいはＮ−CH2であり得、R1は１〜６個の炭素原
    子および０〜２個のヘテロ原子から成る結合基であり、
    R2はＨあるいはCH3であり得、Ｑは検出可能な成分ある
    いは免疫原性キャリアー物質であり得る］の化合物。
  20. 【請求項２０】Ｙ−ＺがＣ＝CHのＥ−異性体であり、R2
    がCH3であり、R1がCH2−CO−であり、Ｑがアミノメチル
    フルオレセインである請求項19に記載の化合物。
  21. 【請求項２１】Ｙ−ＺがＣ＝CHのＺ−異性体であり、R2
    がCH3であり、R1がCH2−CO−であり、Ｑがアミノメチル
    フルオレセインである請求項19に記載の化合物。
  22. 【請求項２２】Ｙ−ＺがＣ＝CHのＥ−異性体であり、R2
    がＨであり、R1がCH2−CO−であり、Ｑがアミノメチル
    フルオレセインである請求項19に記載の化合物。
  23. 【請求項２３】Ｙ−ＺがＣ＝CHのＺ−異性体であり、R2
    がＨであり、R1がCH2−CO−であり、Ｑがアミノメチル
    フルオレセインである請求項19に記載の化合物。
  24. 【請求項２４】試験サンプル中の全ドキセピンを測定す
    るための試験キットであって、該全ドキセピンが、１以
    上のＥ−ドキセピン、Ｚ−ドキセピン、Ｅ−デスメチル
    ドキセピン、およびＺ−デスメチルドキセピンから成
    り、 （ａ）該全ドキセピンに結合し得る抗体を含む１以上の
    抗体試薬であって、該抗体が、式： ［式中、Ｙ−ＺはＮ−CH2あるいはＣ＝CHであり得、R1
    は１〜６個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子から
    成る結合基であり、R2はＨあるいはCH3であり得、Ｑは
    免疫原性キャリアー物質である］のドキセピ誘導体から
    調製される１以上の免疫原によって産生されることを特
    徴とする前記抵抗試薬、および （ｂ）式： ［式中、Ｙ−ＺはＣ＝CHであり、R1は１〜６個の炭素原
    子および０〜２個のヘテロ原子から成る結合基であり、
    R2はＨあるいはCH3であり得、Ｑは検出可能な成分であ
    る］の化合物のＥ−異性体およびＺ−異性体の混合物か
    ら成る前記ラベル化された試薬、 を含むことを特徴とする前記試験キット。
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