DE69610716T2

DE69610716T2 - Topiramate-immunoassay, sowie analoge und antikörper

Info

Publication number: DE69610716T2
Application number: DE69610716T
Authority: DE
Inventors: B. Cawley; E. Maryanoff; L. Sorgi; J. Stenglein
Original assignee: OPUS DIAGNOSTICS Inc
Current assignee: Seradyn Inc
Priority date: 1995-12-01
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 2001-05-10
Anticipated expiration: 2016-11-28
Also published as: CA2239224A1; AU721665B2; US5952187A; CA2239224C; DE69610716D1; EP0876385A1; JP2000502888A; AU1141697A; ES2153134T3; WO1997019950A1; JP4435305B2; ATE197052T1; EP0876385B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Immunoassays für Topiramat und Topiramat-Analoga, die als Immunogene und Tracer brauchbar sind, und Anti-Topiramat-Antikörper, die in den Immunoassays brauchbar sind.

Beschreibung von verwandtem Stand der Technik

Topiramat (2,3 : 4,5-Bis-O-(1-methylethyliden)-β-D-fructopyranosesulfamat) ist eine kürzlich entwickelte anti-epileptische Arznei, welche bei der klinischen Behandlung von Krampfstörungen als brauchbar offenbart worden ist. Die Überwachung von Blutspiegeln von therapeutischen Arzneien ist eine Routinepraxis, welche auf die Therapie folgt und Sicherheit in Patienten sicherstellt. Quantitätsbestimmung von Arzneien in Geweben oder Körperflüssigkeiten ist ebenfalls in pharmakokinetischen Studien und beim Überwachen von Patienten-Komplianz wichtig. Somit gibt es einen Bedarf an analytischen Verfahren, um die Konzentration von Topiramat in Patientenproben, insbesondere Plasma und Serum, zu bestimmen.
Gegenwärtig stehen zwei analytische Verfahren zum Messen von Topiramat zur Verfügung. Beide verwenden Gaschromatographie. Das erste bezieht Gaschromatographie, gekoppelt mit Flammenionisationsdetektion ein, das zweite Gaschromatographie mit Massenspektroskopie. Diese Verfahren sind zeitaufwendig, erfordern spezialisierte Ausrüstung, hochgradig geschulte Analytiker und umfangreiche Probenpräparierung und sind teuer. Diese Verfahren erfordern ebenfalls Probenvolumina, die zu gross sind, um in pädiatrischen Tests verwendet zu werden, ausser wenn die Topiramatkonzentrationen abnorm hoch sind. Kurz gesagt: die bestehenden Verfahren für Topiramat sind zur Routineverwendung in einem typischen klinischen Chemielabor oder Krankenhauslabor nicht geeignet.
Immunoassays sind seit über 20 Jahren zum Überwachen von Serum- oder Plasmaspiegeln von therapeutischen Arzneien im klinischen Labor und Krankenhaus verwendet worden (siehe zum Beispiel EP-A-218010 und US-A-5051361). Einige Vorteile von Immunoassays sind, dass solche Tests akkurat, sensitiv und in vielen kommerziellen Testformaten leicht zu gebrauchen sind. Ein Immunoassay, um Topiramat zu messen, würde die Verfügbarkeit eines analytischen Verfahrens sicherstellen, das routinemässig verwendet werden könnte, um Arzneispiegel in Patientenproben zu messen. Jedoch kann es schwierig oder unmöglich sein, ein Arznei- Analog zu konstruieren, der für die Konjugation an ein grosses Molekül (wie Protein) geeignet ist, um ein Immunogen zu entwickeln, das einen Antikörper auslöst, der mit der Arznei reagiert. Häufig verändert die zum Erzeugen eines Immunogens notwendige Derivatisation die Arznei auf solch hinlängliche Weise, dass die sich ergebenden Antikörper das Analog erkennen, aber nicht die Arznei. Daher ist die Herstellung von Analoga erforderlich, die für die Konjugation an ein Protein geeignet sind und Antikörper auslösen, die sowohl das Analog, als auch die Arznei erkennen, um ein Immunoassay zu entwickeln.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung sieht ein Topiramat-Analog vor, das derivatisiert ist, um eine Verbindungsgruppe einzuschliessen. In einer Ausführungsform ist das Topiramat-Analog an eine Markierung konjugiert, um ein Topiramat-Analog zu bilden, das als Tracer fungiert. In einer weiteren Ausführungsform wird das Topiramat-Analog an einen Träger konjugiert, um ein Topiramat- Analog zu bilden, das als Immunogen fungiert. In einer Ausführungsform ist das Topiramat-Analog von der Formel:
In der Formel steht eines von R&sub1; und R&sub2; für H. Das andere steht für R-Y. R stellt eine Verbindungsgruppe dar und Y stellt einen Träger oder eine Markierung da. Wenn R&sub1; für H steht, steht X für H. Wenn R&sub1; nicht für H steht, steht X für H oder eine Alkylgruppe. In einer weiteren Ausführungsform ist das Topiramat-Analog von der Formel:
In der Formel steht R&sub3; für R'-Y. R' ist eine Verbindungsgruppe, die eine heterocyclische Gruppe einschliesst, worin das N der Sulfamatgruppe von Topiramat ein Ringglied ist. Y stellt einen Träger oder eine Markierung dar.
Die Erfindung sieht auch Anti-Topiramat-Antikörper vor, ausgelöst unter Verwendung eines Immunogens dieser Erfindung. Ein Topiramat-Immunoassayverfahren dieser Erfindung basiert auf dem Wettbewerb zwischen Topiramat in der Probe und einem Tracer dieser Erfindung um Anti-Topiramat-Antikörper. In einer Ausführungsform ist das Immunoassay ein Fluoreszenz-Polarisations- Immunoassay. Immunoassay-Ausrüstungen werden ebenfalls vorgesehen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung sieht neuartige Analoga für Topiramat vor. In einer Ausführungsform wird das Topiramat-Analog derivatisiert, um eine Verbindungsgruppe einzuschliessen, um die Konjugation an einen Träger oder eine Markierung zu erleichtern, um Topiramat-Analoga zu bilden, die als Immunogene und Tracer verwendet werden können. Topiramat-Analoga, die einen Träger einschliessen, lösen Antikörper aus, die mit dem Analog und mit Topiramat reagieren. Topiramat-Analoga, die eine Markierung einschliessen, können als Tracer in einem Wettberwerbs-Immunoassay- Format verwendet werden. Anti-Topiramat-Antikörper und Immunoassays für Topiramat unter Verwendung der Reagentien dieser Erfindung werden ebenfalls vorgesehen.

Topiramat-Analoga

Ein Topiramat-Analog dieser Erfindung ist Topiramat, das derivatisiert wurde, um eine chemische Komponente einzuschliessen, welche die Bindung eines Trägers oder einer Markierung an das Topiramat-Analog erleichtert. Die Topiramat-Analoga dieser Erfindung werden an der Sulfamatkomponente oder an der 9- Kohlenstoffmethylgruppe oder an der funktionell äquivalenten 10- Kohlenstoffmethylgruppe von Topiramat derivatisiert. (Die Struktur von Topiramat, welche die Kohlenstoffnummerierung und die Stelle der Sulfamatkomponente zeigt, kann hiernach in Tabelle 1 gefunden werden.) Zur Bequemlichkeit wird hiernach die Erörterung der Topiramat-9-Kohlenstoffgruppe so verstanden werden, als dass sie sich auch auf die äquivalente 10-Kohlenstoffposition bezieht. Derivatisieren eher der Sulfamatkomponente, als der 9- Kohlenstoffmethylgruppe, kann vorteilhaft sein, weil der zur Antikörperauslösung und Erkennung verfügbare Anteil des Topiramat- Analogs der Bereich ist, der sich in dem Topiramat-Metaboliten 9-Hydroxy-topiramat (in Tabelle 1 gezeigt) unterscheidet. Somit produziert die Konjugation eines Trägers durch eine Verbindungsgruppe durch die Sulfamatkomponente von Topiramat ein Immunogen, das Antikörper mit minimaler Überkreuz-Reaktivität mit 9- Hydroxy-topiramt auslösen kann.
Derivatisierung von Topiramat an der Sulfamatkomponente oder der 9-Kohlenstoffmethylgruppe sieht ein Topiramat-Analog vor, das immunologisch ausreichend ähnlich mit Topiramat ist, dass durch das Analog ausgelöste Antikörper sowohl mit dem Analog, als auch mit Topiramat reagieren. Daher sind die Topiramat- Analoga dieser Erfindung, die einen Träger einschliessen, in der Lage, Anti-Topiramat-Antikörper auszulösen. Zusätzlich können die Topiramat-Analoga zur Verwendung als Tracer in einem Immunoassay markiert werden, wie hiernach ausführlicher beschrieben. Zwei allgemeine Formel für Topiramat-Analoga dieser Erfindung werden unten gezeigt.
In dieser Formel steht eines von R&sub1; und R&sub2; für H. Das andere ist eine Verbindungsgruppe. Wenn R&sub1; für H steht, steht X für H. Wenn R&sub1; nicht für H steht, steht X für H oder eine Alkylgruppe.
In der Formel stellt R&sub3; eine Verbindungsgruppe dar, die eine heterocyclische Gruppe einschliesst, worin das N der Sulfamatgruppe von Topiramat ein Ringglied ist.
Wie gut bekannt ist, können Arzneien oder andere Haptene derivatisiert werden, um eine Verbindungsgruppe mit einer chemischen Komponente einzuschliessen, welche die Bindung des Haptens an einen Träger oder eine Markierung erleichtert. Verbindungsgruppen zum Herstellen von Immunogenen und/oder Tracern aus Haptenen sind gut bekannt und werden zum Beispiel in U. S. -Patent Nr. 5051361 (erteilt am 24. September 1991 an Stenglein et al.) und in Wong, S., Chemistry of Protein Coniugation and Cross- Linking, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1991) beschrieben. Geeignete chemische Komponenten in den Verbindungsgruppen für Konjugation schliessen Carboxy, Amino, Imino, Amido, Carbonyl, Nonoxocarbonyl, Azido, Phosphonium, Thio, Hydroxy, Alkoxy, Halogen, Sulfonyloxy, Hydroxyphenyl, Imidazolyl, Maleimido ebenso, wie andere gesättigte oder ungesättigte Gruppen ein. Solche Verbindungsgruppen sind gut bekannt, wie auch die verschiedenen Chemien zum Synthetisieren von Hapten-Analoga, die solche Verbindungsgruppen tragen. In einigen Ausführungsformen kann die Verbindungsgruppe mit einem Topiramat-Vorläufer reagiert werden, so dass Topiramat (ohne ein oder mehrere Wasserstoffe) an die Verbindungsgruppe gebunden gebildet wird, wie unten ausführlicher beschrieben.
Die Verbindungsgruppen können bis zu 30 Kohlenstoffatome und 0 bis 10 Heteroatome, ausgewählt aus Saüerstoff, Schwefel, Stickstoff und Halogenen einschliessen. Im allgemeinen setzt sich die Verbindungsgruppe aus 1-15 anderen Atomen als Wasserstoff, üblichererweise aus 1-10 anderen Atomen als Wasserstoff zusammen. Längere Verbindungsarme können verwendet werden, wenn es wünschenswert ist, die Markierung oder den Träger in grösserer Entfernung vom Topiramatmolekül zu binden.
Wenn X eine Alkylgruppe darstellt, hat die Alkylgruppe üblicherweise 1-5, üblichererweise 1-3 und am üblichsten 1-2 Kohlenstoffe. Um Topiramat-Analoga herzustellen, worin X eine Alkylgruppe darstellt, wird bequemerweise ein Topiramat-Vorläufer verwendet. Insbesondere der Säurechlorid-Vorläufer von Topiramat (Diisopropylidenfructopyranose-chlorsulfat) kann wie in Maryanoff et al., J. Med. Chem. 30: 880-887 (1987) beschrieben hergestellt, und mit einem Alkylamin umgesetzt werden, um das N- Alkyl-Topiramat-Analog zu bilden. Kurz: das Säurechlorid kann wie folgt hergestellt werden. Eine Lösung aus Sulfurylchlorid (93 ml, 1,15 mol) in Methylenchlorid (100 ml) wird tropfenweise zu einer kalten Lösung (-35ºC) aus Diacetonfructose (150 g, 0,58 mol) in Methylenchlorid (400 ml) und Pyridin (150 ml) zugegeben, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. Das Umsetzungsgemisch wird gerührt und darf sich auf Raumtemperatur erwärmen. Das Umsetzungsgemisch wird für zwei zusätzliche Stunden gerührt. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt, um den Säurechlorid- Topiramat-Vorläufer zu bilden.
Der Säurechlorid-Vorläufer kann dann mit einem Alkylamin umgesetzt werden, um ein Topiramat-Analog herzustellen, worin X eine Alkylgruppe darstellt. Noch spezifischer kann der Säurechlorid-Vorläufer mit einem Alkylamin, wie Methylamin, 6-Aminocapronsäure, N-Methylglycin, oder N-Ethylglycin umgesetzt werden, um ein Topiramat-Analog herzustellen, worin X eine Alkylgruppe darstellt. Zum Beispiel kann der Säurechlorid-Vorläufer von Topiramat mit Methylamin umgesetzt werden, wie in Maryanoff et al., J. Med. Chem. 30: 880-887 (1987) beschrieben, um N- Methyl-topiramat zu bilden. Der wie oben beschrieben hergestellte Topiramat-Säurechlorid-Vorläufer (35 g, 0,10 mol) wird in wasserfreiem Acetonitril (150 ml) gelöst und Methylamin wird zugegeben. Das sich ergebende Umsetzungsgemisch wird für 3 Tage fest verschlossen und dann wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der sich ergebende Sirup wird Flüssigkeitschromatographie unterworfen (trockene Säule von Silica-Gel, Ethylacetat/- Hexan, 4 : 1), um einen hellgelben Sirup (4,1 g, 12%) zu ergeben, welcher durch Dünnschichtchromatographie und ¹H NMR homogen ist. Ähnliche Verfahren könne mit anderen Alkylaminen verwendet werden, um andere N-Alkyl-Topiramat-Analoga zu bilden.
Die Verbindungsgruppe kann eine heterocyclische Gruppe einschliessen, worin das N der Sulfamatgruppe von Topiramat ein Ringglied ist. Eine heterocyclische Gruppe ist eine geschlossene Ringstruktur, üblicherweise aus entweder fünf oder sechs Gliedern, in welcher ein oder mehrere Atome in dem Ring ein anderes Element als Kohlenstoff ist. Ein geeignete exemplarische heterocyclische Gruppe ist zum Beispiel Pyrrolidin, Piperidin, Piperazin oder Morpholin.
Um die heterocyclische Gruppe zu bilden, wird im allgemeinen ein Topiramat-Vorläufer verwendet. Insbesondere der Säurechlorid-Vorläufer von Topiramat kann mit einem Heterocyclus umgesetzt werden, um ein heterocyclisches Topiramat-Analog zu bilden.
Die Topiramat-Analog-Verbindungsgruppe kann eine austretende Gruppe einschliessen. Die austretende Gruppe ist eine chemische Komponente, die beim Konjugieren des Topiramat-Analogs an eine Markierung oder einen Träger aktiv ist. Als Teil des Konjugationsprozesses werden ein oder mehrere Atome der austretenden Gruppe aufgegeben. Ferner ergibt Konjugation einer Markierung oder eines Trägers im allgemeinen ein Modifizieren der austretenden Gruppe, so dass die Verbindungsgruppe in dem Konjugat den Rest nach solchen Modifikationen einschliesst. Zur Bequemlichkeit wird sich der Begriff "Verbindungsgruppe" hierin auf die an Topiramat gebundene Verbindungsgruppe, um ein Topiramat-Analog zu bilden, und auf den Rest der Verbindungsgruppe nach Konjugation an eine Markierung oder einen Träger beziehen.
In verschiedenen hierin beispielhaft dargestellten Ausführungsformen wird Topiramat mit einer Verbindungsgruppe derivatisiert, die eine Carboxylgruppe einschliesst, die verwendet wird, um die Analoga an eine Markierung oder einen Träger zu binden. In einem exemplarischen Konjugationsprozess wird die Carboxylgruppe an dem Topiramat-Analog mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) umgesetzt, um einen aktiven Ester zu bilden. Der aktive Ester reagiert mit Aminogruppen, um Topiramat-Analog-Konjugate zu bilden. Die Aminogruppen können in kleinen Molekülen, wie Fluorescein oder Biotin-Derivaten oder in Makromolekülen, wie Proteinen oder Rinderserum-Albumin oder alkalischen Phosphatasen anwesend sein. Wenn das Konjugat einen Träger oder eine Markierung enthält, kann das Topiramat-Analog als ein Immunogen oder als ein Tracer verwendet werden.
Obwohl die hierin beschriebenen Topiramat-Analoga beispielhaft mit einer Carboxylgruppe dargestellt werden, die an dem Konjugationsprozess beteiligt ist, sind andere chemische Komponenten, die an der Konjugation teilnehmen können, gut bekannt und ebenfalls geeignet. Zum Beispiel können Aminderivate oder Thiolderivate von Topiramat unter Verwendung von den Fachleuten gut bekannten Verfahren an Träger oder Markierungen gekoppelt werden. Exemplarische Topiramat-Analoga werden unten in Tabelle 1 aufgelistet, gefolgt von den Strukturen für die Verbindungen. Verbindung Nr. 5, 9-Hydroxy-topiramat, ist ein bekannter Topiramat-Metabolit.

Tabelle 1

Topiramat und seine AnaloQa
1.2,3-4,5-Bis-O-(1-methylethyliden)-(3-D- fructopyranosansulfamat (Topiramat)
2. N-Carboxymethyl-topiramat, Natriumsalzmonohydrat (auch als Topiramatglycin-Analog oder TGA bezeichnet)
3. N-(5-Carboxypentyl)-topiramat, Natriumsalz (auch als Topiramat-Capronsäure-Analog, Natriumsalz oder TCA bezeichnet.
4. 9-Carboxymethyl-topiramat (auch als Topiramat- Lävulinsäureketal-Analog oder 9-CMT bezeichnet)
5. 9-Hydroxy-topiramat (9-OH-T)
Die Topiramat-Analoga dieser Erfindung wurden unter Verwendung chemischer Standardsyntheseverfahren hergestellt.
Exemplarische Verfahren zum Herstellen der Analoga 2-4 werden detailliert in den Beispielen 1-3 beschrieben. Die Herstellung von Topiramat und von mehreren Topiramat-Analoga, die als Ausgangsstoffe verwendet werden können, wird in Maryanoff et al., J. Med. Chem. 30: 880-887 (1987) beschrieben. Zusätzlich wird Topiramat unter dem Handelsnamen TOPAMATM durch Ortho/McNeil Pharmaceuticals verkauft.
Die Topiramat-Analoga dieser Erfindung schliessen auch Topiramat ein, das an einen Träger oder eine Markierung gebunden ist, um ein Immunogen oder einen Tracer zu bilden. In den Immunogenen dieser Erfindung ist ein Topiramat-Analog, das eine Verbindungsgruppe einschliesst, an einen Träger konjugiert. In den Tracern dieser Erfindung ist ein Topiramat-Analog, das eine Verbindungsgruppe einschliesst, an eine Markierung konjugiert. Diese Topiramat-Analoga können durch die unten gezeigten zwei allgemeinen Formeln repräsentiert werden.
In der Formel steht eins von R&sub1; und R&sub2; für H. Das andere steht für R-X. R stellt eine Verbindungsgruppe dar und Y stellt einen Träger oder eine Markierung dar. Wenn R&sub1; für H steht, steht X für H. Wenn R&sub1; nicht für H steht, steht X für H oder eine Alkylgruppe
In einer weiteren Ausführungsfarm ist das Topiramat-Analog von der Formel:
In der Formel steht R&sub3; für R'-Y. R' stellt eine Verbindungsgruppe dar, die einen heterocyclische Ringgruppe einschliesst, worin das N der Sulfamatgruppe vorn Topiramat ein Ringglied ist. Y stellt einen Träger oder eine Markierung dar.
Ein Immunogen dieser Erfindung ist ein Topiramat-Analog, das einen Träger einschliesst. Der Begriff "Träger" wird hier wie in dem Stand der Technik verwendet, um eine Substanz anzuzeigen, die in einem ausgewählten Wirtstier immunogen ist. Die Herstellung von Immunogenen durch Binden eines Haptens an einen Träger ist gut bekannt. Auswahl des Trägers und Verabreichungsweg variieren je nach Wirtstier. Träger sind im allgemeinen grosse Moleküle, üblicherweise Polymere, am üblichsten grosse Proteine von einer anderen Spezies als dem Wirtstier. Rinderserum- Albumin (BSA) und Keyhole-Limpet-Hemocyanin (KLH) werden häufig als Träger zum Auslösen von Antikörpern in Mäusen, Ratten, Ziegen, Kaninchen, Hühnern und Schafen verwendet. Exemplarische Herstellungen von immunogenen Topiramat-Analoga zum Auslösen von Anti-Topiramat-Antikörpern werden in den Beispielen beschrieben. In jenen exemplarischen Immunogen-Herstellungen steht R-Y für (CH&sub2;)nCO-NH-(Träger), worin n von 1 bis 9 ist. Spezifischer gibt es Beispiele, worin n 1 oder 5 ist und BSA der exemplarische Träger ist.
Der Begriff "Tracer" wird hierin wie nach Stand der Technik verwendet, um sich auf ein markiertes Analyt-Analog zu beziehen, das in einem Wettbewerbs-Immonassay-Format verwendet wird. Ein Tracer dieser Erfindung ist ein Topiramat-Analog, das eine Markierung einschliesst, welche durch eine Verbindungsgruppe an das Topiramat gebunden ist. Der Begriff "Markierung" wird verwendet, um sich auf Substanzen zu beziehen, die direkt oder indirekt nachgewiesen werden können. Markierungen, die direkt nachgewiesen werden können, schliessen zum Beispiel ein Radionuklid oder ein Fluorochrom ein. Markierungen können auch indirekt durch eine oder mehrere Reaktionen nachgewiesen werden. Solche Markierungen schliessen Enzyme ein, die durch Herstellung eines gefärbten Produkts nachgewiesen werden. Solche Enzymmarkierungen und ihre Farbentwicklungssysteme sind gut bekannt. Andere solcher Markierungen schliessen die Verwendung eines Glieds eines spezifischen Bindungspaars, wie Biotin/Avidin ein. Markierungen, die zur Verwendung in Immunoassay-Verfahren geeignet sind, sind gut bekannt und schliessen zum Beispiel Enzyme, Radionuklide, Fluorochrome, Biotin und ähnliches ein. Bequemerweise ist die Markierung ein Fluorochrom.
Geeignete Fluorochrome schliessen Rhodamin (z. B. Tetramethylrhodamin-isothiocyanat - TRTTC), Phycoerythrin (PE), Allophycocyanin (APC), Texas Red (Molecular Probes, Eugene OR) und vorzugsweise Fluorescein ein. Obwohl Allophycocyanin und Phycoerythrin geeignete Fluorochrome sind, können sie nicht für Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays verwendet werden, weil sie zu gross sind. Geeignete Fluoresceine schliessen Fluoresceinisothiocyanat (FITC), 2-(Aminoethyl)-thioureido-fluorescein (FTED), Fluorescein-thiosemicarbazid (FTSC), (2-Aminoethyl) - ureido-fluorescein (FAMCO-E), Erythrocin (Tetra-iodofluorescein) und Fluoresceinamin (FAM) ein.
Das Fluorochrom kann an die Verbindungsgruppe durch eine zur Verfügung stehende Position an dem Fluorochrom-Nukleus gebunden werden. Fluorescein-Markierungen, die aus an die 5-, 6-, 4'- und 5'-Postitionen gebundene Verbindungsgruppe bestehen, werden bevorzugt. Markierungen, die durch die 5- und/oder 6- Postition gebunden sind, werden am meisten bevorzugt. (Siehe zum Beispiel Tabelle 2, Tracer 4-10.)
Aus Bequemlichkeit werden Tracer mit einem Fluoresceinrest, der an die Verbindungsgruppe durch die 5-Position der Fluorescein-Komponente gebunden ist, als Isomer I bezeichnet. Tracer mit einem Fluoresceinrest, der an die Verbindungsgruppe durch die 6-Position von Fluorescein gebunden ist, werden als Isomer 11 bezeichnet. Sofern nicht anders spezifiziert, wird keine Unterscheidung zwischen Isomeren oder einem Gemisch aus Isomeren gemacht. Für Fluorescein- und Rhodamin-markierte Tracer existiert wenig oder nichts der Lactonform während Fluoreszenzmessungen und die carboxylierte Form kommt primär als Salze vor. Das Fluorochrom kann eine homogene Zusammensetzung oder ein Gemisch aus Isomeren sein. Zusätzlich kann das Fluorochrom in seiner Lactonform oder als ein biologisch annehmbares Salz (z. B. Na, K, Ammonium oder ähnliche Salze) verwendet werden, so dass das Fluorochrom in seinem ionisierten Zustand in dem Immunoassay vorkommen kann.
Tabelle 2 unten listet Topiramat-Analog Immunogene und Tracer auf, die wie in den Beispielen beschrieben hergestellt wurden: diese wurden aus exemplarischen, in Tabelle 1 aufgelisteten Topiramat-Analoga abgeleitet. Bei der Herstellung von Immunogenen und Tracern wurden Topiramat-Analoga von Tabelle 1 durch Standardverfahren aktiviert, um den N-Hydroxysuccinimidester der Carbonsäuregruppe zu bilden. Der aktive Ester seinerseits reagierte mit einem primären Amin in dem Träger oder der Markierung, um ein Amid zu bilden.
Alternativ können Carbonsäuren unter Verwendung anderer nach Stand der Technik bekannter Verfahren mit Aminen kondensiert werden. Syntheseverfahren zur Bildung der Amide von Carbonsäuren sind gut bekannt und werden zum Beispiel in U. S. - Patent Nr. 5051361 (an Stenglein et al., erteilt am 24. September 1991) beschrieben. Verfahren zum Herstellen immunogener Konjugate werden auch in Methods in Immunology and Immunochemistry, (Curtis A. Williams und Merrill W. Chase eds., Volume 1, 1967) beschrieben. Jene Verweise werden durch Verweis in ihrer Gesamtheit hier eingeschlossen. Zusätzlich werden exemplarische Verfahren zum Herstellen exemplarischer Topiramat-Analoga, die als Tracer oder Immunogene brauchbar sind, detailliert in den Beispielen beschrieben. Die exemplarischen Topiramat-Analoga, die als Immunogene und Tracer brauchbar sind, werden unten in Tabelle 2 und gefolgt von der Struktur für diese Verbindungen aufgelistet. Tabelle 2 Topiramat-Koni uQate

Anti-Topiramat-Antikörper

Anti-Topiramat-Antikörper dieser Erfindung reagieren mit Topiramat und mit dem Topiramat-Analog, das verwendet wurde, um die Antikörper auszulösen. Anti-Topiramat-Antikörper können unter Verwendung eines Immunogens dieser Erfindung, formuliert in einer wässerigen Lösung wie Wasser, normaler Salzlösung, Phosphat-gepufferter Salzlösung und ähnlichem oder in einem Hilfsstoff oder einer ähnlichen Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, ausgelöst werden. Die ausgelösten Antikörper können getestet werden, um zu bestimmen, ob die Zusammensetzung für Topiramat spezifisch ist.
Falls eine polyklonale Anti-Topiramat-Antikörperzusammensetzung nicht die gewünschte Spezifität liefert (z. B. unannehmbare Grade von Überkreuz-Reaktivität mit Topiramat-Metaboliten bei Proben mit hohen Graden an Metaboliten aufweist), können die Antikörper verwendet werden um Proben mit niedrigen Graden an Metaboliten zu testen oder können in Verfahren verwendet werden, wo Überkreuz-Reaktivität mit Metaboliten nicht von Belang ist, wie unten ausführlicher beschrieben.
Monoklonale Anti-Topiramat-Antikörper können auch durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Einer Maus kann eine Zusammensetzung, die ein Immunogen dieser Erfindung enthält, injiziert werden und Milzzellen werden erhalten. Jene Milzzellen können mit einem Verschmelzungspartner verschmolzen werden, um Hybridome herzustellen. Antikörper, die durch die Hybridome ausgeschieden werden, können gescreent werden, um ein Hybridom auszuwählen, worin die Antikörper mit Topiramat reagieren. Bequemerweise können Antikörper gescreent werden, um minimale Reaktion mit Topiramat-Metaboliten aufzuweisen, wie 9-Hydroxytopiramat. Hybridome, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, werden durch Standardverfahren kultiviert. Hybridom-Herstellungstechniken und Kultivierungsverfahren sind gut bekannt und bilden keinen Teil der vorliegenden Erfindung.
Exemplarische Herstellungen von monoklonalen und polyklorralen Anti-Topiramat-Antikörpern werden in den Beispielen beschrieben. Es wird vermerkt, dass in den meisten Patientenproben ein einzelner Topiramat-Metabolit in einer kleinen Fraktion (üblicherweise weniger als 4%) der Konzentration von Topiramat in der Probe vorhanden ist. Jedoch können mehrere Metaboliten vorkommen und insgesamt können sie bis zu 20% der Arzneidosis in normalen Patienten und bis zu 50% in Fällen bei Patienten mit erhöhtem Metabolismus oder medizinischen Problemen, wie beispielsweise Nierenversagen darstellen.
Abwohl Überkreuz-Reaktivität von Anti-Topiramat-Antikörpern mit dem Metabolit von geringer Konsequenz bei Erhalten eines genauen Immunoassay-Wertes in Proben mit geringen Mengen an Topiramat-Metaboliten ist, reagieren die Anti-Topiramat-Antikörper vorzugsweise nicht wesentlich überkreuz mit Topiramat-Metaboliten. Mit "reagieren vorzugsweise nicht wesentlich überkreuz" ist gemeint, dass wenn die Antikörper in einem Wettbewerbs- Immunoassay-Format verwendet werden, mindestens etwa 5-mal mehr 9-Hydroxy-topiramat benötigt wird, um die gleiche Menge an Antikörperhemmung wie Topiramat zu erreichen.

Immunoassays

Zahlreiche quantitative Immunoassay-Formate zum Nachweisen eines Haptens, wie einer Arznei oder anderen kleinen Molekülen in einer Körperflüssigkeit sind bekannt. Ein Testverfahren für Topiramat hat die folgenden Bestandteile. Das Verfahren schliesst Vereinigen der Probe mit einem Anti-Topiramat- Antikörper und Nachweisen der Menge des Anti-Topiramat- Antikörper-Topiramat-Komplexes als indikativ bezüglich der Menge an Topiramat in der Probe ein. Die bestimmte Weise, auf welche Topiramat nachgewiesen wird, ist für den Zweck dieser Erfindung nicht bedeutsam, so lange das Verfahren den gewünschten Grad an Sensitivität und Verlässlichkeit vorsieht. Verschiedene Verfahren zum Ausführen von Immunoassays werden in Tijssen, P., Practice and Theorv of Enzyme Immurioassays, (R. H. Burdon and P. H. von Kniffenberg eds., Volume 15, 1985); und The Immunoassay Handbook, (David Wild ed., 1994) beschrieben.
Die Probe für ein Topiramat-Immunoassay ist eine Körperflüssigkeit, im allgemeinen Blut, spezifischer Serum oder Plasma. Jedoch wird die Verwendung anderer Körperflüssigkeiten wie Urin oder Speichel ebenfalls erwogen.
Eine Anzahl verschiedener Typen von Immunoassays unter Verwendung einer Vielfalt an Protokollen und Markierungen sind gut bekannt. Die Testbedingungen und Reagentien können jede von einer Vielfalt sein, die nach Stand der Technik gefundenen werden. Der Test kann heterogen oder homogen und bequemerweise ein Wettbewerbstest sein. Wie angezeigt durch die Auslösung von Antikörpern, die Topiramat-Analoga erkennen, derivatisiert an entweder der Sulfamatkomponente von Topiramat oder an der 9-Kohlenstoffmethylgruppe von Topiramat, hat Topiramat mindestens zwei verschiedene Epitope, die zur Antikörpererkennung in der Lage sind. Jedoch ist, wie bei anderen kleinen Molekülen, wenn sich ein Antikörper an Topiramat oder ein Topiramat-Analog bindet, die Erkennung von Topiramat durch einen zweiten Antikörper blockiert, was die Verwendung von herkömmlichen Immunoassays vom Sandwich- Typ ausschliesst, worin sich zwei Antikörper an zwei Epitope an dem Analyt binden.
Ein Topiramat-Immunoassay bezieht Anti-Topiramat-Antikörper ein, die polyklonal oder monoklonal sein können. Bequemerweise kann der Test auf Wettbewerb basiert sein, wo Topiramat in der Probe mit einer festen Menge eines Topiramat-Tracers dieser Erfindung konkurriert. Die für jeden Wettbewerbstest benötigte Menge an Tracer variiert in Abhängigkeit von einer Anzahl gut bekannter Faktoren. Zum Beispiel wird die für einen Test benötigte Menge an Tracer empirisch bestimmt, wenn der Tracer mit einem Fluorochrom markiert ist. Die Menge an verwendetem Tracer muss ein angemessenes Signal für den verwendeten Detektor in Relation zu dem Hintergrundsignal vorsehen und muss eine Menge an Tracer vorsehen, so dass die Affinität der Anti-Topiramat- Antikörper für den Tracer und für die Bandbreite an Topiramat, die in der Probe vorhanden sein kann, die gewünschte Sensitivität vorsehen.
In Wettbewerbs-Immunoassays wird die verwendete Antikörperherstellung durch ein Immunogen ausgelöst, das ein an der gleichen Position derivatisiertes Topiramat-Analog, wie das als Tracer verwendete Topiramat-Analog, einschliesst. Also schliessen sowohl das zum Auslösen der Antikörperzusammensetzung verwendete Immunogen, als auch der Tracer, beide an entweder der Sulfamatkomponente oder 9-Kohlenstoffmethylgruppe von Topiramat derivatisiertes Topiramat-Analog ein.
Bindung zwischen den Antikörpern und Topiramat in der Probe kann durch eine Anzahl von Wegen bestimmt werden. Zum Beispiel kann jedes in der Probe vorhandene Topiramat mit einer vorher bestimmten, festen Menge an markiertem Topiramat-Analog (Tracer) um Anti-Topiramat-Antikörperbindungsstellen konkurrieren. Die Menge an Tracer, die an die feste Phase angehängt ist oder in der Lösung verbleibt, kann bestimmt werden. In einer Ausführungsform wird ein mit Biotin markierter Tracer an die feste Phase durch Binden an Festphasen-angehängtes Avidin angehängt. Topiramat in der Probe konkurriert mit Festphasen-angehängtem Topiramat-Tracer um Anti-Topiramat-Antikörper. Markierte Anti- Topiramat-Antikörper, die an die Festphase angehängt sind oder in der Lösung verbleiben, können nachgewiesen werden. Die Anti- Topiramat-Antikörper können direkt markiert werden, oder können unter Verwendung markierter zweiter Antikörper, die für die Spezies der Anti-Topiramat-Antikörper spezifisch sind, nachgewiesen werden.
Zahlreiche andere Formate können verwendet werden. Zum Beispiel können Anti-Topiramat-Antikörper Festphasen-angehängt sein. Eine feste Menge an Topiramat-Tracer kann mit Topiramat in der Probe um Antikörperbindung konkurrieren. Die Menge an Festphasen-angehängtem Tracer oder in der Lösung verbleibendem Tracer wird bestimmt. Der Tracer kann eine Markierung haben, die direkt, wie mit einem Radionuklid, einem Fluorochrom oder ähnlichem, oder indirekt, wie mit einem Enzym nachgewiesen wird. Alternativ kann der Topiramat-Tracer mit Biotin markiert und mit Enzym-markiertem Avidin oder Avidin-markierten Antikörpern nachgewiesen werden. Jene Avidin-markierten Antikörper können direkt markiert sein, oder mit markierten zweiten Antikörpern nachgewiesen werden.
In einer anderen Ausführungsform ist das Immunoassay ein Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay, das Topiramat in Patientenproben misst. Bequemerweise kann das Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay in einem automatisierten System wie TDx®- und TDxFlx®-Analysatoren (im Handel erhältlich von Abbott Laboratories) verwendet werden, das zur Arzneiüberwachung in dem klinischen Chemielabor und Krankenhaus ersonnen wurde.
Ein Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay verwendet einen fluoreszierend markierten Tracer mit einem kleinen Molekulargewicht (typischerweise weniger als 5000). Der Tracer wird in einen Einfallsstrahl von linear polarisiertem Licht plaziert. Das Licht wird absorbiert und kann als Fluoreszenz reemittiert werden. Aufgrund der schnellen Brown'schen Bewegung von kleinen Molekülen wird die emittierte Fluoreszenz depolarisiert. Ein starker Anstieg in der Grösse des Tracers erhöht stark seine Rotationszeit, was bewirkt, dass das emittierte Fluoreszenzlicht polarisiert bleibt. Die Bindung von Antikörpern an einen Flourescein-markierten Tracer bewirkt somit Polarisation des emittierten Lichts. Das Analyt in der Probe konkurriert mit dem Tracer um Antikörperbindung und erhöht somit die Depolarisation der Fluoreszenz. Das Depolarisationsausmass hängt von der Konzentration des Analyts in der Probe ab. Somit kann eine Standardkurve für ein Wettbewerbs-Immunoassay, worin die Menge an Depolarisation von Fluoreszenz mit steigender Analytkonzentration korreliert, hergestellt werden.
Reagentien zum Testen von Topiramat können bequem in Ausrüstungen paketierte sein. Eine Immunoassay-Ausrüstung zum Testen von Topiramat kann einen Anti-Topiramat-Antikörper und einen Topiramat-Analog-Tracer dieser Erfindung einschliessen.
Diese Erfindung wird durch die folgenden spezifischen, aber nicht eingrenzenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Temperaturen werden in Grad Celsius und Konzentrationen als Gewichtsprozent angegeben, sofern nicht anderweitig spezifiziert. Verfahren, die konstruktiv auf die Praxis sind reduziert, werden in Gegenwartsform beschrieben und Verfahren, die im Labor durchgeführt worden sind, werden in der Vergangenheitsform dargestellt. Alle Zitate in der obigen Spezifikation und den folgenden Beispielen sind hierin durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.

Beispiel 1

Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat

In einem exemplarischen Verfahren wurde N-Carboxymethyltopiramat (Topiramatglycin-Anälog oder TGA) wie unten beschrieben aus Topiramat (Maryanoff et al., J. Med. Chem. 30: 880-887 (1987)) hergestellt.
33,9 g (0,1 mol) Topiramat, 16,1 g (0,1 mol) Hexamethyldisilazan und etwa 1 ml Chlortrimethylsilan wurden zu 150 ml Tetrahydrofuran zugegeben, um eine Lösung zu bilden. Die Lösung wurde für 5 Stunden unter Rückfluss gekocht und auf Raumtemperatur gekühlt. Unter Rühren wurden 3,0 g (0,1 mol) von 80% NaH portionsweise über einen etwa zehnminütigen Zeitraum zugegeben, um eine Umsetzungsgemisch zu bilden. Das Umsetzungsgemisch wurde sehr dick und 20 ml Dimethylformamid und 100 ml Tetrahydrofuran wurden zugegeben, um den Niederschlag in dem Umsetzungsgemisch zu lösen und das Umsetzungsgemisch wurde eine homogene Lösung. Dann wurden 19,5 g (0,1 mol) Tert.-Butyl-bromaceatat tropfenweise über 30 Minuten zu dem Umsetzungsgemisch zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde über Nacht gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde mit 500 ml Ethylacetat verdünnt und mit Wasser (2 · 100 ml), dann gesättigter Kochsalzlösung (gesättigtes NaCl in Wasser) (100 ml) gewaschen, getrocknet (unter Verwendung von MgSO&sub4;) und das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt, um rohes Tert.- Butylglycinat-Analog als einen klebrigen weissen Feststoff zu ergeben. Der rohe Feststoff, enthaltend Tert.-Butylgycinat- Analog, wurde an Silica-Gel unter Verwendung von 18% Ethylacetat/Hexan (v/v) als Eluent chromatographiert, um 17,2 g (38% Ausbeute) des Tert.-Butylglycinat-Analogs als ein weisser Feststoff zu ergeben.
Etwa 9,0 g (19,9 mmol) des Tert.-Butylglycinat-Analogs wurden portionsweise zu 90 ml Trifluoressigsäure unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. Nach 10 Minuten wurde das Umsetzungsgemisch filtriert, um eine kleine Menge an ungelöstem Material zu entfernen, und das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt, um das rohe Glycin-Analog als ein dickes Öl zu ergeben. Das Öl wurde in 150 ml 1 N NaOH gelöst und mit Diethylether (2 · 50 ml) gewaschen. Die wässerige Schicht wurde unter Verwendung von 3 N HCl auf pH 3 gesäuert und mit Methylenchlorid (3 · 100 ml) extrahiert. Die verbundenen organischen Extrakte wurden in vacuo konzentriert, um 6,68 g (84% Ausbeute) des Glycin-Analogs als einen weissen Schaum zu ergeben.
Der Glycin-Analog (6,0 g, 15,1 mmol) wurde in 13,6 ml von 1,0 N NaOH gelöst. Das Wasser wurde in vacuo entfernt und der sich ergebende Rückstand wurde unter Verwendung von Toluol azeotroph getrocknet, um das rohe Natriumglycinat 4 als ein weisser Feststoff zu ergeben. Der weisse Feststoff wurde mit Diethylether (2 · 50 ml) pulverisiert und der sich ergebende Feststoff durch Vakuumfiltration isoliert, um 5,3 g (80% Ausbeute) des Natriumglycinathydrats (N-Carboxymethyl-topiramat) zu ergeben. Der Schmelzpunkt des N-Carboxymethyl-topiramats betrug 169,0 bis 170,0ºC. Die für N-Carboxymethyl-topiramat (C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub2;NO&sub1;&sub0;SNa·H&sub2;O) errechnete Elementaranalyse beträgt: C, 38,44; H, 5,53; N, 3,20; S, 5,26; und Na, 5,26. Die für das N-Carboxymethyl-topiramat-Analog bestimmte Elementaranalyse betrug C, 38,27; H, 5,59; N, 3,08; S, 5,50; Na, 5,50; %H&sub2;O (KF); 4,12%. (KF zeigt an, dass der Wassergehalt unter Verwendung des Karl- Fischer-Verfahrens bestimmt wurde und wird als %-Gew./Gew. angegeben).
N-Carboxymethyl-topiramat (TGA) wurde als das Natriumsalz, Monohydrat, erhalten, um Immunogene, Tracer und Biotin-Konjugate in den folgenden Beispielen herzustellen.

Beispiel 2

Herstellung von N-(5-Carboxypentyl)-topiramat (TCA)

In einem exemplarischen Verfahren wurde N-(5-Carboxypentyl)-topiramat (Topiramat-Capronsäure-Analog oder TCA) aus 2,3 : 4,5-Bis-O-(1-methylethylidin)-(3-D-fructopyranose-chlorsulfat (Maryanoff et al., J. Med. Chem. 30: 880-887 (1987)) wie unten beschrieben hergestellt.
Eine Lösung aus 2,3 : 4,5-Bis-O-(1-methylethylidin)-β-D- fructopyranose-chlorsulfat (35,8 g, 0,10 mol) in Methanol (200 ml) wurde tropfenweise zu einer Lösung aus 6-Aminocapronsäure (26,2 g, 0,20 mol) und Pyridin (7,91 g, 0,10 mol) in Methanol (300 ml) langsam über einen Zeitraum von 2,25 Stunden zugegeben, um ein Gemisch zu bilden. Das Gemisch wurde für 2,5 Stunden unter Rückfluss gekocht, dann unter reduziertem Druck konzentriert, um ein rot-oranges Öl zu ergeben. Das Öl wurde in destilliertem Wasser (300 ml) und Ethylacetat (200 ml) gelöst, dann mit einer 4 M NaOH-Lösung auf pH 10-12 basisch gemacht. Die Schichten wurden getrennt und die wässerige Schicht wurde wiederholt mit Ethylacetat (12 · 200 ml) extrahiert, bis das Nebenprodukt, Diacetonfructose entfernt war. Die wässerige Schicht wurde dann mit konzentrierter HCl auf pH 5,0 gesäuert und mit Ethylacetat (4 · 150 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden kombiniert, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und konzentriert, um das Capronsäurederivat als ein Öl in 19,5% Rohausbeute zu ergeben.
Das Öl wurde in 2-Propanol (230 ml) gelöst und mit einer 4 M NaOH-Lösung (13 ml) behandelt, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. Das Umsetzungsgemisch wurde konzentriert und der sich ergebende Feststoff über Nacht bei Raumtemperatur in ISOPAR-ETM (einem hoch kochenden Kohlenwasserstoff, im Handel erhältlich von EXXON Corporation) aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde filtriert und der wiedergewonnene Feststoff mit ISOPAR-ETM gewaschen. Lufttrocknen ergab 23,64 g (97,5% Ausbeute) des Natriumcaproat-Analogs (N-(5-Carboxypentyl)-topiramat) als einen weissen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 197,0-202,0ºC. Die für C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;NO&sub1;&sub0;SNa errechnete Elementaranalyse beträgt: C, 45,47; H, 6,36; N, 2,95; S, 6,74; Na, 4,83. Die für das Analog bestimmte Elementaranalyse betrug C, 44,87; H, 6,31; N, 2,89; S, 6,44; Na, 5,08.
N-(5-Carboxypentyl)-topiramat (TCA) wurde als das Natriumsalz verwendet, um Immunogene und Tracer in den folgenden Beispielen herzustellen.

Beispiel 3

Herstellung von 9-Carboxymethyl-topiramat (9-CMT)

In einem exemplarischen Verfahren wurde 9-Carboxymethyl- Topiramat (9-CMT) (das Lävulinsäureketal-Analog) wie unten beschrieben hergestellt.
Triethylorthoformat (24,6 g, 0,166 mol) wurde zu einer gerührten Lösung, enthaltend 24,0 g (0,166 mol) Ethyllävulinat, 0,8 ml Schwefelsäure und 300 ml absolutes Ethanol zugegeben, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. Nach Rühren des Umsetzungsgemisches für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden 16,4 g (0,055 mol) 2,3-O-(1-Methylethylidin)-B-D-fructopyranosesulfamat (Maryanoff et al., J. Med. Chem. 30: 880-887 (1987)) zugegeben und das Rühren wurde für 16-18 Stunden fortgesetzt. Festes Natriumcarbonat (80,0 g, 0,75 mol) wurde dem Umsetzungsgemisch zugegeben, gefolgt von destilliertem Wasser (100 ml), um ein Umsetzungsgemisch mit einem pH von 7,0 zu bilden. Das Umsetzungsgemisch wurde filtriert und mit Ethylacetat (etwa 500 ml) verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit einer gesättigten Natriumchloridlösung (3 · 200 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert, um ein Öl als ein Gemisch aus Ketal, einer kleinen Menge Diol und Ethyllävulinat zu ergeben. Das Öl wurde wiederholt mit Hexan pulverisiert, bis das überschüssige Ethyllävulinat entfernt war, dann wurde das Öl in 125 ml Methanol gelöst, um eine Methanollösung zu bilden. 1 N NaOH (250-300 ml) wurde zu der Methanollösung zugegeben und das sich ergebende Umsetzungsgemisch wurde unter Rückfluss für etwa 2 Stunden gekocht. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde das Umsetzungsgemisch mit Ethylacetat (3 · 100 ml) extrahiert. Die wässerige Schicht wurde unter Verwendung von 3 N Hei auf pH 4,0 gesäuert und mit Ethylacetat (3 · 100 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden verbunden, über Nacht getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und konzentriert, um 15,7 g (71,8% Ausbeute) des Lävulinsäureketalderivats (9-Carboxymethyltopiramat) als einen weissen, brüchigen Schaum mit einem Schmelzpunkt von 42, 0-45, 0ºC zu ergeben. Die für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub3;NO&sub1;&sub0;S errechnete Elementaranalyse betrug
C, 42,31; H, 5,83; N, 3,52; S, 8,07. Die bestimmte Elementaranalyse betrug
C, 42,55; H, 5,83; N, 3,38; S, 7,57.
9-Carboxymethyl-topiramat (9-CMT) wurde als die freie Säure zum Herstellen von Immunogenen und Tracern in den folgenden Beispielen verwendet.

Beispiel 4

Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat: Rinderserurn-Albumin Immunogen

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines exemplarischen Immunogens dieser Erfindung, worin N-Carboxymethyl-topiramat, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, an Rinderserum-Albumin (BSA) konjugiert wurde, um N-Carboxymethyltopiramat: Rinderserum-Albumin (TGA: BSA) zu bilden.
Eine Lösung aus 103 mg N-Carboxymethyl-topiramat und 34,9 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) in 1 ml Dimethylacetamid wurde auf einem Eis-Mentholbad gekühlt und mit 100 ul 3,15 M Dicyclohexylcarbodiimid (in Dimethylacetamid) behandelt, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. Das Umsetzungsgemisch wurde auf dem Eis- Methanolbad für 15 Minuten gerührt und weitere 50 ul Dicyclohexylcarbodiimidlösung wurden zugegeben. Rühren wurde fortgesetzt, während das Umsetzungsgemisch langsam auf Raumtemperatur gebracht wurde. Dann wurde das Rühren bei Raumtemperatur über Nacht fortgesetzt.
Nach dem Rühren über Nacht wurde der sich ergebende aktive Ester in dem Umsetzungsgemisch an Rinderserum-Albumin gekoppelt. Rinderserum-Albumin wurde vor der Verwendung in der Konjugation durch G-25 SEPHADEXTM Säulenchromatographie in entionisiertem Wasser entsalzt. Eine Lösung aus 109 mg des vorher entsalztem Rinderserum-Albumin in insgesamt 15 ml Wasser wurde auf einem Eiswasserbad gekühlt. Das den aktiven Ester enthaltende Umsetzungsgemisch wurde tropfenweise zu der Rinderserum-Albuminlösung unter Rühren zugegeben, während der pH durch Zugabe von 5% K&sub2;CO&sub3; zwischen 8 und 9 gehalten wurde, bis sich der pH stabilisierte (etwa 1 Stunde).
Das sich ergebende Umsetzungsgemisch wurde dann über Nacht bei 4ºC gehalten und die Feststoffe wurden durch Zentrifugation entfernt. Der sich ergebende Flüssigkeitsüberstand, der das Konjugat enthielt, wurde durch eine 0,8 um Polycarbonatmembran filtriert und über einer 2,5 · 41 cm G-25 SEPHADEXTM-Säule, äquilibriert und eluiert mit 0,01 M Kaliumphosphat, enthaltend 0,15 M NaCl, pH 7,4, chromatographiert. Insgesamt 97 mg Konjugat (als Protein) wurden in der Endausbeute erhalten. Das Konjugat wurde gefroren gelagert.
In diesem und den folgenden Beispielen wurde die Proteinkonzentration von Immunogenen unter Verwendung eines kommerziellen Biuret-Tests bestimmt, oder durch Annahme, dass eine 1 mg/ml Lösung von Rinderserum-Albumin eine Extinktion von 0,67 bei 280 nm in einer 1 cm Lichtpfadzelle in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 ergab.

Beispiel 5

Herstellung von 9-Carboxymethyl-topiramat: Rinderserum-Albumin- Immunogen
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines weiteren exemplarischen Immunogens dieser Erfindung, worin 9-Carboxymethyl-topiramat, hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, an Rinderserum-Albumin (BSA) konjugiert wurde, um 9-Carboxymethyltopiramat: Rinderserum-Albumin (9-TMC: BSA) zu bilden.
206 mg 9-Carboxymethyl-topiramat und 70 mg N-Hydroxysuccinimid wurden in 2 ml Dimethylacetamid gelöst, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. Das Umsetzungsgemisch wurde auf einem Eis-Methanolbad gekühlt und dann wurden 200 ul von 3,15 M Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylacetamid zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde auf dem Eis-Methanolbad für 15 Minuten gerührt und dann wurden zusätzliche 100 ul von 3,15 M Dicyclohexylcarbodiimidlösung zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde für zusätzliche 10 Minuten auf dem Eis-Methanolbad gerührt und 0,025 ml Pyridin wurden zugegeben. Das Gefäss, welches das Umsetzungsgemisch enthielt, wurde von dem Bad entfernt und für ein paar Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann über Nacht bei -10ºC gelagert. Am nächsten Tag wurde das Umsetzungsgemisch tropfenweise unter Rühren zu einer Lösung aus 200 mg Rinderserum- Albumin (vorher unter Verwendung einer G-25 SEPHADEXTM-Säule entsalzt) in einem Eisbad zugegeben. Der pH des Umsetzungsgemisches wurde durch Zugabe von 5% K&sub2;CO&sub3; zwischen 8 und 9 gehalten, bis sich der pH stabilisierte. Das Umsetzungsgemisch wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Am folgenden Tag wurden die Feststoffe durch Zentrifugation entfernt und der Flüssigkeitsüberstand wurde durch einen 0,2 um Filter filtriert, um eine geklärte Lösung zu ergeben, welche an einer G-25 SEPHADEXTM- Säule, äquilibriert in 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (Kpi), pH 7,4, enthaltend 0,15 M NaCl entsalzt wurde. Die Ausbeute an Protein betrug 189 mg. Das 9-CMT-BSA-Konjugat wurde gefroren gelagert.

Beispiel 6

Herstellung von N-(5-Carboxypentyl)-topiramat: Rinderserum- Albumin-Immunogen

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines weiteren exemplarischen Immunogens dieser Erfindung, worin N-(5-Carboxypentyl)-topiramat, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, an Rinderserum-Albumin (BSA) konjugiert wurde, um N-(5-Carboxypentyl)-topiramat:Rinderserum-Albumin (TCA: BSA) zu bilden.
250 mg des Natriumsalzes von N-(5-Carboxypentyl)-topiramat wurden in 2 ml Dimethylacetamid gelöst. 100 mg N-Hydroxysulfosuccinimid, Natriumsalz, wurden zugegeben, um eine Umsetzung zu bilden und das Umsetzungsgemisch wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. 200 ul von 3,15 M Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylacetamid wurden zugegeben und das Umsetzungsgemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. 50 mg N-Hydroxysuccinimid wurden zu dem Umsetzungsgemisch zugegeben, gefolgt von 100 ul von 3,15 M Dicyclohexylcarbodiimidlösung. Das Umsetzungsgemisch wurde für zusätzliche 10 Minuten gerührt und 0,025 ml Pyridin wurden zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um einen aktiven Ester herzustellen.
Am nächsten Tag wurde das den aktiven Ester enthaltende Umsetzungsgemisch tropfenweise unter Rühren zu einer Lösung aus 200 mg Rinderserum-Albumin (vor Verwendung durch G-25 SEPHADEXTM Säulenchromatographie in Wasser entsalzt) in insgesamt 20 ml Wasser in einem Eisbad zugegeben. Der pH des Umsetzungsgemisches wurde durch Zugabe von 5% K&sub2;CO&sub3; zwischen 8 und 9 gehalten, bis sich der pH stabilisierte (etwa 2 Stunden). Die sich ergebende Suspension wurde über Nacht bei 4ºC gelagert. Nicht lösliches Material wurde durch Filtration durch eine 0,2 um Polycarbonatmembran entfernt, um eine geklärte Lösung herzustellen. Die geklärte Lösung wurde an einer G-25 SEPHADEXTM-Säule, äquilibriert in 10 mM Kpi, pH 7,4, enthaltend 0,15 M NaCl chromatographiert. Die Endausbeute von TCA: BSA-Konjugat betrug 189 mg.

Beispiel 7

Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat:(2-Aminoethyl)- thioureido-fluorescein

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat:(2-Aminoethyl)-thioureido-fluorescein, welches als ein Tracer (TGA: FTED-Tracer) in einem Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay brauchbar ist.
22 mg N-Carboxymethyl-topiramat, wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, wurden in 200 ul Dimethylacetamid gelöst. 20 mg N-Hydroxysuccinimid und 100 ul (100 umol) 1 M Dicyclohexylcarbodiimid (in Tetrahydrofuran) wurden zugegeben, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden, welches für 90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde, um den aktiven Ester (TGA: NOS) zu bilden. 2 ml MeOH und 0,1 ml 1 N NaOH wurden zu einer Teströhre zugegeben. 21,6 mg (2-Aminoethyl)-thioureido-fluorescein (FTED) (hergestellt wie in Pourfarzeneh et al., Clinical Chemistry 26 : 730 (1980) beschrieben) wurden in der Methanollösung gelöst und wurden nachfolgend zu dem Umsetzungsgemisch, das den aktiven TGA: NOS-Ester enthielt, zugegeben. Ein Niederschlag bildete sich, welcher sich nach Zugabe von 4 · 50 ul Aliquoten von 1 N NaOH wieder löste. Der pH des sich ergebenden Umsetzungsgemisches betrug 8,5. Das Umsetzungsgemisch wurde dann für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der pH wurde durch weitere Zugabe von 1 N NaOH, wie erforderlich, zwischen 7,5 und 8,5 gehalten, bis sich der pH stabilisierte (etwa 1 Stunde). Proben des Umsetzungsgemisches wurden für Chromatographie nach 1 Stunde und so lange wie bis zu 4 Stunden entfernt.
Das sich ergebende N-Carboxymethyl-topiramat: (2-Aminoethyl)-thioureido-fluorescein wurde durch Dünnschichtchromatographie an Silica-Gel (SGF-250) in einem Lösungsmittelsystem aus CHCl&sub3;/MeOH/Wasser (4+4+1) gereinigt, gefolgt von Chromatographie an Umkehrphasen-Dünnschichtplatten (RPF-250) in einem Lösungsmittelsystem aus MeOH/Wasser/15 M NH&sub4;OH (25+75+2), wie unten beschrieben.
Während der Beispiele wurde Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Silica-Gel Platten, enthaltend einen Fluoreszent-Indikator, der bei 254 nm absorbiert, durchgeführt. Platten waren entweder 250 um (bezeichnet mit SGF-250) oder 1000 um (bezeichnet als SGF-1000) dick. C-18 Umkehrphasen-Silica-Gel Platten, die einen Fluorezent-Tndikator enthielten, der bei 254 nm absorbiert, waren 250 um dick (bezeichnet mit RPF-250). Dünnschichtchromatographie-Lösungsmittelsysteme und Silica und Umkehrphasen-Säulenchromatographie-Lösungsmittelsysteme werden alle in Volumen/Volumen Zusammensetzung ausgedrückt. Eine Verbindungen wurden an TLC-Platten durch ihre Extinktion (254 nm oder 366 nm) oder durch Verwenden verschiedener Sprühindikatoren visualisiert. Viele der Fluoreszent-Derivate und farbigen Verbindungen waren ohne jede Behandlung sichtbar.
Ungefähre Konzentrationen von gereinigten Tracern (N- Acylamidofluoresceine) wurden unter Annahme eines molaren Extrinktinskoeffizienten von 67000 an der Wellenlänge, die maximale Extinktion aufwies (490-500 nm, eingesetzt durch Scannen) für eine in 0,05 M Carbonatpuffer verdünnte Lösung, pH 9,6 und in einem 1 cm Lichtpfad gelesen, bestimmt. Während der Beispiele wurden die pH Messungen in organischen Lösungsmitteln unter Verwendung von mit Wasser befeuchtetem pH-Papier bestimmt.

Beispiel 8

Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat: Fluoresceinthiosemicarbazid

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N- Carboxymethyl-topiramat: Fluorescein-thiosemicarbazid, welches als Tracer (TGA-FTSC-Tracer) in einem Fluoreszenz-Polarisations- Immunoassay brauchbar ist.
22,8 mg N-Carboxymethyl-topiramat, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in 0,25 ml Dimethylacetamid gelöst. 14,8 mg N-Hydroxysuccinimid wurden zugegeben, gefolgt von 0,1 ml von 1 M Dicyclohexylcarbodiimid (in Tetrahydrofuran), um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. Das Umsetzungsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um den aktiven Ester zu bilden.
Fluorescein-thiosemicarbazid (10 mg, erhalten von Sigma Chemical Company) wurde in (0,1 ml MeOH + 0,05 ml 1 N NaOH) gelöst und zu dem Umsetzungsgemisch, das den aktiven Ester von N- Carboxymethyl-topiramat enthielt, zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde für 15 Minuten gerührt, bei welcher Zeit 0,05 ml von 10% Triethylamin (in MeOH) zugegeben wurden und Rühren wurde für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt, um N-Carboxymethyl-topiramat: Fluorescein-thiosemicarbazid zu bilden. Das N- Carboxymethyl-topiramat: Fluorescein-thiosemicarbazid wurde durch aufeinanderfolgende Dünnschichtchromatographieschritte an Silica-Gel-Platten (SGF-250) in dem Lösungsmittel MeOH/CHCl&sub3;/H&sub2;O (4+4+1) gereinigt und dann an Umkehrphasenplatten (RPF-250) in dem Lösungsmittelsystem MeOH/wasser/Triethylamin (20+80+1).

Beispiel 9

Herstellung von (2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von (2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein (FAMCO-E), welches an Topiramat- Analoga konjugiert wurde, wie in den folgenden Beispielen beschrieben.
Um FAMCO-E herzustellen, wurden 3,25 g Fluoresceinamin- Isomer I in 17,5 ml Dimethylacetamid gelöst und 2,5 g 1,1'- Carbonyldiimidazol wurden zugegeben, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. (Isomere I und 11 von Fluoresceinderivaten werden so definiert, als dass sie Substituenten an Position 5, beziehungsweise Position 6 des Fluoresceinnukleus aufweisen. Sofern nicht anderweitig vermerkt, sind alle beschriebenen Fluoresceinderivate Isomer I Derivate. Jedoch können das Isomer II und Gemische aus I und II verwendet werden, um geeignete Reagentien herzustellen.) Das Umsetzungsgemisch wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 5 ml Ethylendiamin wurden zu 500 ml Methylenchlorid in einen 1 Liter Kolben zugegeben, um eine Ethylendiaminlösung zu bilden, und diese Lösung wurde auf einem Eis- Methanolbad gekühlt. Das 1,1'- Carbonyldiimidazol/Fluoresceinamin-Umsetzungsgemisch wurde dann tropfenweise unter starkem Rühren zu der gekühlten Ethylendiaminlösung zugegeben. Es bildete sich ein organger Niederschlag. Das Umsetzungsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der orange Niederschlag wurde an einem Buchner-Trichter gesammelt und aufeinanderfolgend mit Methylenchlorid, Methylenchlorid/Aceton/MeOH (100+10+1 v/v) und Methylenchlorid ausgedehnt gewaschen. Das gewaschene Niederschlagsprodukt wurde getrocknet, dann in Aceton suspendiert, filtriert, mit Petroleumether gewaschen und das rohe Pulver durfte lufttrocknen. 5 ml Me- OH und 0,15 ml von 15 M NH&sub4;OH wurden zu 0,5042 g des trockenen, rohen Pulvers zugegeben, um eine klare, dunkelrote Lösung herzustellen. Diese Lösung wurde tropfenweise unter Rühren zu 200 Volumen von MeOH/Wasser/Essigsäure (10+90+1 v/v) zugegeben. Etwas Niederschlag trat auf. Nicht lösliches Material wurde gesammelt, in MeOH/15 M NH&sub4;OH (100+2, v/v) gelöst und wieder tropfenweise unter Rühren zu 200 Volumen von MeOH/Wasser/Essigsäure (10+90+1 v/v) zugegeben. Der Niederschlag wurde gesammelt und verworfen. Die vereinigten MeOH/Wasser/Essigsäure-Lösungen wurden für Klärung filtriert und Niedrigdruck-C18 Umkehrphasenchromatographie in einer Säule, äquilibriert mit MeOH/Wasser/Essigsäure (10-90- 1) unterworfen. FAMCO-E band sich an die Säule und wurde mit Me- OH/Wasser/Essigsäure (15+85+1) eluiert. Das eluierte FAMCO-E wurde durch rezirkulieren an der C18-Säule unter den gleichen Bedingungen konzentriert, ausser dass ein 7,5% Methanol Waschungsschritt (um die Essigsäure zu entfernen) vor der Elution durchgeführt wurde, und Elution mit Methanol (100%) erzielt wurde. Die eluierten Fraktionen, die das FAMCO-E enthielten, wurden vereinigt und ausreichend Triethylamin wurde zugegeben, um einen pH zwischen 8 und 9 zu ergeben. Das gereinigte FAMCO-E wurde als eine Lösung in Methanol bei -10ºC gelagert.

Beispiel 10

Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat: (2-Aminoethyl)-ureidofluorescein

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat:(2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, welches als Tracer (TGA; FAMCO-E-Tracer) in einem Fluoreszenz-Polarisations- Immunoassay brauchbar ist.
10 mg N-Carboxymethyl-topiramat, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, und 5 mg N-Hydroxysuccinimid wurden in 0,2 ml Dimethylacetamid gelöst. 0,05 ml von 1 M Dicyclohexylcarbodiimid (in Tetrahydrofuran) wurden zugegeben und das sich ergebende Umsetzungsgemisch wurde für 2,5 Stunden gerührt, um einen aktiven Ester herzustellen. 0,1 ml des Umsetzungsgemisches, das den aktiven Ester enthielt, wurden zu 0,5 ml einer Lösung aus (2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein (FAMCO-E), hergestellt wie in Beispiel 9 beschreiben, zugegeben. Nach 15 Minuten wurden 5 ul Triethylamin zugegeben, um den pH zwischen 8 und 9 zu halten. Das Umsetzungsgemisch wurde für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das sich ergebende N-Carboxymethyl-topiramat:(2- Aminoethyl)-ureido-fluorescein wurde dann in aufeinanderfolgenden Dünnschichtchromatographieschritten an Silica-Gel (SGF-250) in dem Lösungsmittelsystem CHCl&sub3;/MeOH/Wasser (4+4+1) und Umkehrphasen-Dunnschichtchromatographie in dem Lösungsmittelsystem Me- OH/Wasser/15 M NH&sub4;OH(20+80+2) gereinigt.

Beispiel 11

Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat: Glycyl-fluoresceinamin

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat: Glycyl-fluoresceinamin, welches als Tracer (TGA: Gly-FAM-Tracer) in einem Fluoreszenz-Polarisations- Immunoassay brauchbar ist.
5 mg Aminoacetamido-fluorescein (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon) wurden in 0,1 ml Dimethylacetamid gelöst. 0,15 ml eines aktiven Esters von N-Carboxymethyl-topiramat, hergestellt wie in Beispiel 10 beschrieben, wurden zugegeben und die sich ergebende Umsetzung durfte sich für 1 Stunde bei Raumtemperatur fortsetzen. Der pH wurde durch Zugabe geringer Volumina an Triethylamin zwischen 6,5 und 8 gehalten. Das sich ergebende N- Carboxymethyl-topiramat: Glycyl-fluoresceinamin wurde in aufeinanderfolgenden Schritten von Dünnschichtchromatographie an Silica-Gel (SGF-250) in dem Lösungsmittelsystem CHCl&sub3;/MeOH/Wasser (4+4+1) und Umkehrphase (RPF-250) in dem Lösungsmittelsystem Me- OH/Wasser/15 M NH&sub4;OH (20+80+2) gereinigt.

Beispiel 12

Herstellung von N-(5-Carboxypentyl-topiramat:(2-Aminoethyl) - thioureido-fluorescein

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-(5- Carboxypentyl-topiramat:(2-Aminoethyl)-thioureido-fluorescein, welches als Tracer (TCA: FTED-Tracer) in einem Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay brauchbar ist.
250 mg des Natriumsalzes von N-(5-Carboxypentyl)-topiramat, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zu 2 ml Dimethylacetamid zugegeben. 0,1 g N-Hydroxysulfosuccinimid, Natriumsalz, wurden zugegeben, das sich ergebende Umsetzungsgemisch für 10 Minuten gerührt und 0,2 ml von 3,15 M Dicyclohexylcarbodiimid (in Dimethylacetamid) wurden zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde für 30 Minuten gerührt und 0,05 g N-Hydroxysuccinimid und 0,1 ml von 3,15 M Dicyclohexylcarbodiimid (in Dimethylacetamid) wurden aufeinanderfolgend zugegeben. Nach Rühren für weitere 10 Minuten wurden 0,025 ml Pyridin zugegeben und das Umsetzungsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um den aktiven Ester zu bilden.
Ein Überschuss an (2-Aminoethyl)-thioureido-fluorescein (in Methanol mit NaOH alkalisch gemacht) wurde zu 0,5 ml des Reaktionsgemisches, das den aktiven Ester enthielt, zugegeben. Die Umsetzung durfte sich für 30 Minuten bei Raumtemperatur fortsetzen. Das sich ergebende N-(5-Carboxypentyl-topiramat: (2-Aminoethyl)-thioureido-fluorescein wurde in aufeinanderfolgenden Schritten von Dünnschichtchromatographie an Silica-Gel (SGF-250) in dem Lösungsmittelsystem CHCl&sub3;/MeOH/Wasser (4+4+1) und Umkehrphase (RPF-250 Platten) in dem Lösungsmittelsystem MeOH/Wasser/- 15 M NH&sub4;OH (27,5+72,5+2) gereinigt.

Beispiel 13

Herstellung von N-(5-Carboxypentyl)-topiramat:(2-Aminoethyl) - ureido-fluorescein

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-(5- Carboxypentyl)-topiramat:(2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, welches als ein Tracer (TCA: FAMCO-E-Tracer) in einem Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay brauchbar ist.
473 mg N-(5-Carboxypentyl)-topiramat, Natriumsalz, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zu 5 ml Dimethylacetamid zugegeben, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. 399 mg N-Hydroxysuccinimid wurden zugegeben und das Umsetzungsgemisch wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, dann unter Rühren für 5 Minuten in einem Eisbad gekühlt. 1 ml von 1 M Dicyclohexyldicarbodiimid (in Tetrahydrofuran) wurden zugegeben und das Umsetzungsgemisch wurde für 15 Minuten auf einem Eisbad gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur.
20 ml MeOH, enthaltend 0,108 mmol FAMCO-E, hergestellt wie in Beispiel 9 beschrieben, wurden zu dem Umsetzungsgemisch zugegeben. Der pH wurde durch Zugabe geringer Volumina an Triethylamin zwischen 8 und 9 gehalten. Die Umsetzung durfte für 2 Stunden bei Raumtemperatur fortfahren, zum TCA: FAMCO-E-Tracer herzustellen, dann wurde das Umsetzungsgemisch mit 9 Volumen von 0,5% NHQOH (0,075 M) verdünnt und auf eine Niedrigdruck-C18 HPLC Sorbenssäule (20 g), äquilibriert in MeOH/Wasser/15 M NH&sub4;OH (10+90+0,5) aufgetragen. Die Säule wurde mit etwa 10 Säulenvolumen von MeOH/Wasser/15 M NHQOH (10+90+0,5) gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und dann wurde der TCA: FAMCO-E-Tracer mit MeOH/Wasser/15 M NHQOH (15+85+0,5) eluiert. Der TCA: FAMCO-E- Tracer wurde durch Chromatographie an C18 unter ähnlichen Bedingungen konzentriert, aber die Elution wurde mit Methanol/- Triethylamin (10+0,04 v/v) durchgeführt. Der TCA: FAMCO-E-Tracer wurde dann durch Dünnschichtchromatographie an Silica-Gel (SGF- 1000) Platten in dem Lösungsmittelsystem MeOH/CHCl&sub3;/Wasser (4+4+1) gereinigt, wo der Tracer einen Rf von etwa 0,6 aufwies. Das Tracer-Band wurde aus den Silica-Platten mit Methanol/- Triethylamin (10+0,04) eluiert, der pH der Lösung wurde mit Triethylamin auf zwischen 8 und 9 angepasst und der Tracer wurde bei -10ºC gelagert.

Beispiel 14

Herstellung von N-(5-Carboxypentyl)-topiramat:(2-Aminoethyl) - ureido-fluorescein, Isomer 11

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-(5- Carboxypentyl)-topiramat:(2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, Isomer 11, welches als Tracer (TCA: FAMCO-E-Tracer, Isomer 11) in einem Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay brauchbar ist. Das in diesem Beispiel verwendete FAMCO-E, Isomer 11, wurde unter Verwendung der zum Herstellen von FAMCO-E, Isomer I in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren synthetisiert und gereinigt, ausser dass Fluoresceinamin Isomer 11 (6-Aminofluorescein) in der Synthese verwendet wurde, statt Fluoresceinamin Isomer I (5- Aminofluorescein) und das Rohpulver unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie an Umkehrphasenplatten unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Methanol/Wasser/15 M NH&sub4;OH (10+90+2) gereinigt wurde. Das FAMCO-E wurde bei -10ºC als eine Lösung in Methanol gelagert.
25 mg N-(5-Carboxypentyl)-topiramat, Natriumsalz, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zu 0,25 ml Dimethylacetamid zugegeben, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. 10 mg N-Hydroxysuccinimid wurden zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde gerührt und auf einem Eisbad gekühlt und dann wurden 0,05 ml von 1 M Dicyclohexylcarbodiimid (in Tetrahydrofuran) zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde für 30 Minuten auf einem Eisbad gerührt und dann für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Überschuss an FAMCO-E (Isomer 11) Lösung wurde zugegeben und die Umsetzung durfte sich für 1 Stunde bei Raumtemperatur fortsetzen, wobei der pH durch die Zugabe von Triethylamin, wie notwendig, über 7 gehalten wurde. Das Umsetzungsgemisch wurde für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert, um TCA: FAMCO-E-Tracer, Isomer 11 herzustellen. Der Tracer wurde dann durch Dünnschichtchromatographie an Umkehrphasenplatten (RPF-250) in dem Lösungsmittelsystem MeOH/Wasser/15 M NH&sub4;OH (25+75+2) gereinigt.

Beispiel 15

Herstellung von 9-Carboxymethyl-topiramat: (2-Aminoethyl)-ureidofluorescein

Dies Beispiel beschreibt die Herstellung von 9-Carboxymethyl-topiramat:(2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, welches als ein Tracer (9-CMT: FAMCO-E-Tracer) in einem Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay brauchbar ist.
12,4 mg 9-Carboxymethyl-topiramat, hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden zu 0,20 ml Dimethylacetamid zugegeben. 12,9 mg N-Hydroxysuccinimid wurden zugegeben, gefolgt von 0,05 ml von 1 M Dicyclohexylcarbodiimid (in Tetrahydrofuran) und das Umsetzungsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2,5 Stunden inkubiert. Ein Überschuss an FAMCO-E (in Methanol) wurde zugegeben, gefolgt von Zugabe von Triethylamin (9 ul), um den pH an 8,5 anzupassen. Das Umsetzungsgemisch wurde für 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann wurden 0,05 ml von 1 N NaOH zugegeben und das Umsetzungsgemisch wurde durch Schütteln gemischt. Nach zusätzlichen 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,05 ml von 1 N HCl zugegeben, um einen End-pH von 8,5 zu ergeben, um 9-CMT: FAMCO-E-Tracer herzustellen. Der Tracer wurde durch Silica-Gel Dünnschichtchromatographie (SGF-250) in dem Lösungsmittelsystem CHCl&sub3;/MeOH/Wasser (50+50+2,5) gereinigt.

Beispiel 16

Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat:5-(((N-(Biotinoyl) - amino)hexanoyl)amino)pentylamin

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-Carboxymethyl-topiramat: 5-(((N-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)amino) - pentylamin-Konjugat (TGA-R: Biotin), welches als ein Tracer in einem Biotin-Avidin basierten Immunoassay brauchbar ist.
9 mg N-Carboxymethyl-topiramat (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben), 3,3 mg N-Hydroxysuccinimid und 8,4 mg 5-(((N- (Biotinoyl(amino)hexanoyl)amino)pentylamin (Molecular Probes, Eugene, Oregon) wurden in 0,3 ml Dimethylacetamid verbunden, um ein Umsetzungsgemisch zu bilden. Das Umsetzungsgemisch wurde auf einen Eis/Methanolbad gekühlt und 0,025 ml von 1 M Dicyclohexylcärbodiimid (in Tetrahydrofuran) wurden zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde ein paar Minuten in dem Eis/Methanolbad gerührt und dann wurden 0,05 ml Methanol zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Kühlen bildeten sich Kristalle. Das Umsetzungsgemisch wurde für 1 Stunde bei -20ºC plaziert und nicht lösliche Substanzen wurden durch Zentrifugation entfernt. Das N-Carboxymethyl-topiramat:- Biotinderivat wurde aus der löslichen Fraktion durch Dünnschichtchromatographie an Silica-Gel (SGF-250) unter Verwendung des Lösungsmittelsystems MeOH/CHCl&sub3;/Wasser (20+80+1) gereinigt. Das Produkt wurde durch Sprühen eines kleinen Anteils der TLC- Platte mit einer Lösung aus 0,2% KMnO&sub4; in 1 N H&sub2;SO&sub4; visualisiert. Das zugehörige Band wurde von dem Überbleibsel der Platte (nicht für Visualisierung gesprüht) gekratzt und aus dem Silica mit Methanol eluiert. Ein Wettbewerbs-Avidin-Biotin-Fluoreszenz- Polarisationstest wurde verwendet, um die Konzentration von Biotin (als Topiramat-Konjugat) in dem Präparat abzuschätzen. Es wurde geschätzt, dass die Konzentration bei etwa 1, 2 mM lag. Das TGA: R-Biotin-Konjugat wurde als Stammlösung bei -10ºC in Methanol gelagert.

Beispiel 17

ELISA-Immunoassay unter Verwendung von N-Carboxymethyltopiramat: 5-(((N-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)amino)pentylamin- Konjugat

Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches ELISA- Immunoassay für Topiramat unter Verwendung von 5-(((N- (Biotinoyl)amino)hexanoyl)amino)pentylamin-Konjugat (TGA: R- Biotin).
Eine Hybridomzellinie, bezeichnet mit 7B10, die monoklonalen Anti-Topiramat-Antikörper produziert, wurde aus den Milzzellen einer Balb/c weiblichen Maus, immunisiert mit N-Carboxymethyl-topiramat: BSA (TGA: BSA), hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt. Das Tier wurde einmal intraperitoneal mit 50 ug TGA-BSA, emulgiert in einem kompletten Freund'schen- Andjuvans, immunisiert. Danach wurden dem Tier alle 3 bis 5 Wochen 50 ug TGA: BSA, emulgiert in unvollständigem Freund'schen- Adjuvans für insgesamt 5 Immunisierungen intraperitoneal injiziert. Das Tier wurde dann einmal mit 50 ug N-(5-Carboxypentyl)- topiramat: BSA (hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben) intraperitoneal verstärkt. Milzzellen wurden verwendet, um Hybridomzellinien unter Verwendung der NS1-Maus-Myelomlinie als Fusionspartner herzustellen. Hybridom-Kulturmedien wurden auf die Anwesenheit von Topiramat-Antikörpern unter Verwendung des unten beschriebenen ELISA-Verfahrens gescreent. Antikörper, welche sich an TGA: R-Biotin, immobilisiert an Streptavidin binden, aber nicht an Streptavidin allein, wurden zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Die 7B10-Zellinie wurde zum Klonen gewählt, basierend auf den Screening-Ergebnissen und Subklon 7B10.2 und ein Klon des letzteren, 7B10.2.1 wurden geschaffen und kryopräserviert.
Eine Lösung aus 0,1 ug/ml Streptavidin (Molecular Probes, Eugene, Oregon) wurde in PBS (0,01 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,15 M NaCl und 0,01% Thimersol) hergestellt und 0,1 ml der Streptavidinlösung wurde in jeder Mulde einer Pierce IMMUNOWARETM Polystyrol-Multimuldenplatte pipettiert. Die Streptavidinlösung wurde auf der Platte über Nacht bei 4ºC inkubiert. Alle weiteren Schritte wurden bei Umgebungstemperatur ausgeführt.
Die Mulden wurden 4 mal mit PBS, enthaltend 0,1% (v/v) TWEEN 20 (hiernach PBS/Tween) gewaschen und leicht geschlagen, um alle Schüttflüssigkeit zu entfernen. Eine Stammlösung aus TGA: R-Biotin, hergestellt wie in Beispiel 16 beschrieben (etwa 1, 2 mM in Methanol) wurde 1/5000 in PBS/Tween verdünnt und 0,1 ml der verdünnten TGA: R-Biotinlösung wurde zu allen Mulden zugegeben. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wurde die TGA: R-Biotinlösung abgesaugt und die Platten wurden 4 mal mit PBS/Tween gewaschen. Stammlösung aus Topiramat in PBS/Tween wurde hergestellt, um Topiramat-Standards mit Konzentrationen von 20, 200 und 2000 ng/ml herzustellen. Die Topiramat-Standards (0,05 ml) wurden den Mulden zugegeben, um Endkonzentrationen von 0, 10, 100 und 1000 ng/ml zu ergeben. Der Topiramat-Metabolit 9- Hydroxy-topiramat (Ortho/McNeil Pharmaceuticals, Katalog Nr. RJW-38214-000) wurde in eine Serie von Mulden gegeben, um Endkonzentrationen von 100, 1000 und 10000 ng/ml zu ergeben.
Zellkulturmedium aus Hybridomzellinie 7B10 wurde 1/128 in PBS/Tween verdünnt und 0,05 ml wurden jeder Mulde zugegeben (Endverdünnung der Antikörper 1/256). Die Platte wurde für 2 Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert. Dann wurde die Platte 4 mal mit PBS/Tween gewaschen. Ziegen-Anti-Maus IgG-Meerrettich- Peroxidasekonjugat (CALTAG Laboratories, South San Francisco, California) wurde 1/500 in PBS/Tween verdünnt und zu jeder Mulde (0,1 ml) zugegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Platten 4 mal mit PBS/Tween gewaschen und die Peroxidaseaktivität wurde durch Zugeben von 0,1 ml von 0,31 mg/ml Tetramethylbenzidin, enthaltend 2,6 mM H&sub2;O&sub2; in 0,125 M Natriumacetat/0,075 M Citronensäurepuffer, pH 4,0, getestet. Nach 4 Minuten wurde die Umsetzung durch Zugabe von 0,1 ml von 1 M Schwefelsäure zu jeder Mulde gestoppt. Das gelbe Produkt wurde in einem Dynatech MR5000 Plattenleser bei 450 nm gelesen. Die Ergebnisse des Tests werden unten in Tabelle 3 veranschaulicht. In der Tabelle ist B/B&sub0; das Verhältnis des Extinktionswerts bei 450 nm für die Testprobe (B), geteilt durch den in Anwesenheit von konkurrierendem Analyt erhaltenen Extinktionswert (B&sub0;). Tabelle 3
*ND: nicht bestimmt
Wie in Tabelle 3 gezeigt, hemmte Topiramat Antikörperbindung grösser als 50% bei weniger als 100 ng/ml, während weniger als 50% Hemmung bei 10000 ng/ml des Metaboliten 9-Hydroxytopiramat beobachtet wurde. Der Test demonstrierte, dass die Überkreuz-Reaktivität des 7B10 monoklonalen Antikörpers für das Topiramat-Metabolitprodukt 9-Hydroxy-topiramat weniger als 1% betrug.

Beispiel 18

Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von N- Carhoxymethyl-topiramat:(2-Aminoethyl)-thioureido-fluorescein

Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay (FPIA) für Topiramat unter Verwendung von N-Carboxymethyl-topiramat: (2-Aminoethyl)-thioureidofluorescein als einen Tracer (TGA: FTED-Tracer). Ein in diesem und den folgenden Beispiel verwendetes exemplarisches, automatisiertes Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassaysystem wird unten beschrieben, gefolgt von einer Beschreibung der Herstellung von in diesen Beispielen verwendeten Antikörpern.

Automatisiertes Fluoreszenz-Polarisations-Tmmunoassay

Das Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay wurde unter Verwendung eines automatisierten TDx®-Polarisationsanalysators (Abbott Laboratories aus Irving, Texas) unter Verwendung eines Wettbewerbs-Immunoassayformats ausgeführt. Reagentien, um den automatisierten Test auszuführen, schlossen Anti-Analyt Antikörper (Anti-Topiramat Antikörper) oder "A", ein Fluorescein:- Topiramat-Analog Konjugat (Tracer oder "T") und einen Vorbehandlungspuffer oder "B" ein. Die in den Beispielen beschriebene Kalibrierung des automatisierten Tests wurde mit einer Serie von sechs Kalibratoren erreicht, die bestimmte Konzentrationen an Topiramat, versetzt in menschliches Serum, einschliessen.
Der automatisierte Test wird detailliert in von Abbott Laboratories, Irving, Texas erhältlicher Literatur beschrieben. Alle hierin beschriebenen Beispiele verwendeten die "Modus 1"- Pipettierungssequenz an dem Gerät. Patientenproben (reines Serum oder Plasma) werden in Probenschalen aus Plastik in einem für das TDx®-Gerät entworfenem runden Karussell plaziert. Das Karussell wird zusammen mit der Reagenz-Ausrüstung, enthaltend das A, T und B, in das Gerät plaziert. In dem ersten Testzyklus wird eine Vorverdünnung der Patientenprobe mit TDx-Systems®-Puffer in einer zweiten Mulde in der Probenschale bereitet und die Hälfte des Gesamtvolumens der Probe (in Puffer verdünnte Patientenprobe) wird in die Probenküvette plaziert (insgesamt etwa 1 ml), zusammen mit 0,025 ml des Vorbehandlungspuffers B aus der Reagenz-Ausrüstung. Eine leere Fluoreszenzablesung wird vorgenommen. In dem zweiten Pipettierungszyklus wird ein zweites Volumen der verdünnten Patientenprobe zusammen mit 0,025 ml Tracer (typischerweise 0,5-10 umol pro Röhre) und 0,025 ml Antikörper in einem Gesamtvolumen von etwa 2 ml in der Küvette zugegeben. Nachdem sich die Umsetzung abgeschlossen hat, liest der Analysator die Polarisation der Fluoreszenz in der Glasküvette und vergleicht diesen Wert mit einer Kalibrationskurve, die durch Messen von sechs Arzneikonzentrationen, formuliert in menschlichem Serum (Kalibratoren) bestimmt wurde. Das Äquivalent von 0,5 bis 5 Mikrolitern Patientenserum oder Plasma ist eine typische Probengrösse (zugegeben zu den 2 ml Probengesamtvolumen) in dem automatisierten Test. Die Polarisation der Fluoreszenz wird in Millipolarisationseinheiten (mP) angegeben. Der TDx®-Analysator berechnet automatisch die Konzentration von Analyt in der Probe durch Vergleich mit der Kalibrationskurve.
In den Beispielen werden die Anti-Topiramat- Antikörperverdünnungen für sowohl das Antikörper-Reagens in der Immunoassay-Ausrüstung (eine 80x Stammlösung), als auch die Endverdünnung in der Glasküvette beschrieben. Tracer-Verdünner und Vorbehandlungspuffer (B) werden in den Beispielen als die 80x Stammlösungen des in der Immunoassay-Ausrüstung vorhandenen Reagenses beschrieben.

Polyklonale Schaf-Anti-Topiramat Antikörper

Alle Immunogene wurden als Emulsionen in vollständigem Freund'schem Adjuvans für die erste Injektion und in unvollständigem Freund'schem Adjuvans für nachfolgende Injektionen hergestellt. Tiere wurden entweder subkutan mit 1 mg Immunogen (als Protein) oder direkt in den Lymphknoten mit 50 ug Immunogen immunisiert. Die Tiere wurden typischerweise alle 3 Wochen injiziert. Seren wurden unter Verwendung von ELISA, wie für das obige monoklonale Mauspräparat beschrieben, gescreent, mit der Ausnahme, dass Schaf-Antikörper, die an TGA: R-Biotin, immobilisiert an Streptavidin in Mikrotiterplatten banden, unter Verwendung eines Kaninchen Anti-Schaf IgG-Meerrettich-Peroxidase Konjugats nachgewiesen wurden (Chemicon International, Temecula, California).
Anti-Seren von 3 Schafen wurden in den Beispielen verwendet. Die Schafe wurde wie unten beschrieben immunisiert.
Drei Antikörperpräperate, abstammend von Schaf Nr. 787, wurden in den Beispielen verwendet. Diese Präparate sind kodiert als 787-1, 787-2 und 787-3. TGA: BSA, das verwendet wurde, um Schaf 787 zu immunisieren, wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. 9-CMT: BSA, das verwendet wurde, um Schaf 662 zu immunisieren, wurde wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt. TCA: BSA, das verwendet wurde, um Schaf 650 zu immunisieren, wurde wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt.
In einem Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von TGA: FTED-Tracer wurde eine Kalibrationskurve unter Verwendung von Schaf-Antikörper Nr. 787-1, hergestellt wie oben · beschrieben und 1/24 verdünnt (Endverdünnung 1/1920) in TDx- Systems® Puffer (0,1 M Kpi, pH 7,5, enthaltend 0,1% Natriumazid und 0,01 mg/ml Rinder-Gamma-Globulin, pH 7,0-7,5), erzeugt. TGA: FTED-Tracer, hergestellt wie in Beispiel 7 beschrieben und in 0,01 M Kpi, 0,15 M NaCl, 0,1% w/v Natriumazid, 1 mg/ml Rinder-Gamma-Globulin, pH 7,4-7,5, verdünnt, wurde als Tracer verwendet. Der Vorbehandlungspuffer war TDx-Systems®-Puffer. Das Probenvolumen für die Kalibratoren betrug 1 ul.
Tabelle 4 zeigt Polarisationswerte, die unter Verwendung von sechs Topiramat-Kalibratoren erhalten wurden. In dieser und den folgenden Tabellen werden Polarisationswerte in Millipolarisationseinheiten angegeben. Tabelle 4

Beispiel 19

Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von N- Carboxymethyl-topiramat: Fluorescein-thiosemicarbazid

Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay für Topiramat unter Verwendung von N- Carboxymethyl-topiramat: Fluorescein-thiosemicarbazid, hergestellt wie in Beispiel 8 als ein Tracer (TGA: FTSC-Tracer) beschrieben. Das Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassäy wurde unter Verwendung eines automatisierten TDx®-Polarisationsanalysators ausgeführt, um eine Kalibrationskurve unter Verwendung von TGA: FTSC-Tracer herzustellen, wie in Beispiel 18 beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen. In diesem Beispiel war der Antikörper Schaf-Antikörper Nr. 787-1, hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben und 1/24 verdünnt (Antikörper-Endverdünnung 1/1920). Der Tracer-Verdünner war TDx-Systems® Puffer. Das Probenvolumen für die Kalibratoren betrug 1,3 ul. Die Ergebnisse des Tests werden in Tabelle 5 unten veranschaulicht. Tabelle 5

Beispiel 20

Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von N- Carboxymethyl-topiramat:(2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein

Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay für Topiramat unter Verwendung von N- Carboxymethyl-töpiramat:(2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, hergestellt wie in Beispiel 10 beschreiben, als ein Tracer (TGA: FAMCO-E-Tracer). Das Fluoreszenz-Polarisations-Immunoässay wurde unter Verwendung eines automatisierten TDx®- Polarisationsanalysators, um eine Kalibrationskurve unter Verwendung von TGA-FAMCO-E-Tracer, wie in Beispiel 18 beschrieben herzustellen, mit den folgenden Ausnahmen ausgeführt. In diesem Beispiel war der Antikörper Antikörper Nr. 787-2, hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben und 1/80 verdünnt (Antikörper- Endverdünnung 1/6400). Die Ergebnisse des Tests werden in Tabelle 6 unten veranschaulicht. Tabelle 6

Beispiel 21

Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von N- Carboxymethyl-topiramat: Glycyl-fluoresceinamin

Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay für Topiramat unter Verwendung von N- Carboxymethyl-topiramat: Glycyl-fluoresceinamin, hergestellt wie in Beispiel 11 beschreiben, als ein Tracer (TGA: Gly-Fam-Tracer). Das Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay wurde unter Verwendung eines automatisierten TDx®-Polarisationsanalysators, um eine Kalibrationskurve unter Verwendung von TGA: Gly-FAM-Tracer, wie in Beispiel 18 beschrieben herzustellen, mit den folgenden Ausnahmen ausgeführt. In diesem Beispiel war der Antikörper Antikörper Nr. 787-2, hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben und 1/80 verdünnt (Endverdünnung 1/6400). Die Ergebnisse des Tests werden in Tabelle 7 unten veranschaulicht. Tabelle 7

Beispiel 22

Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von N-(5- Carboxypentyl)-topiramat: (2-Aminoethyl)-thioureido-fluorescein

Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches Fluoreszenz- Pölarisations-Immunoassay für Topiramat unter Verwendung von N- (5-Carboxypentyl)-topiramat: (2-Aminoethyl)-thioureidofluorescein, hergestellt wie in Beispiel 12 beschreiben, als ein Tracer (TCA: FTED-Tracer). Das Fluoreszenz-Polarisations- Immunoassay wurde unter Verwendung eines automatisierten TDx®- Polarisationsanalysators, um eine Kalibrationskurve unter Verwendung von TCA-FTED-Tracer, wie in Beispiel 18 beschrieben herzustellen, mit den folgenden Ausnahmen ausgeführt. In diesem Beispiel war der Antikörper Antikörper Nr. 787-2, hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben und 1/100 verdünnt (Endverdünnung 1/8000). Der Tracer war in 0,01 M Kpi, pH 7,5, 0,1% w/v Natriumazid, 1 mg/ml Rinder-Gamma-Globulin verdünnt. Die Ergebnisse des Tests werden unten in Tabelle 8 veranschaulicht. Tabelle 8

Beispiel 23

Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von N-(5- Carboxypentyl)-topiramat: (2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von N-(5-Carboxypentyl)-topiramat: (2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, hergestellt wie in Beispiel 13 beschrieben, als ein Tracer (TCA: FAMCO-E- Tracer). Das Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay wurde unter Verwendung eines automatisierten TDx®-Polarisationsanalysators ausgeführt, um eine Kalibrationskurve unter Verwendung von TCA: FAMCO-E-Tracer herzustellen, wie in Beispiel 18 beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen. In diesem Beispiel war der Antikörper Antikörper Nr. 787-2, hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben und 1/90 verdünnt (Endverdünnung 1/7200). Der Tracer- Verdünner war TDx-Systems® Puffer. Das Probenvolumen für die Kalibratoren betrug 0,7 ul. Die Ergebnisse des Tests werden unten in Tabelle 9 veranschaulicht. Tabelle 9

Beispiel 24

Fluoxeszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von N-(5- Carboxypentyl)-topiramat:(2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, Isomer II

Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay für Topiramat unter Verwendung von N- (5-Carboxypentyl)-topiramat: (2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, Isomer 11, hergestellt wie in Beispiel 14 beschrieben, als ein Tracer (TCA: FAMCO-E-Tracer, Isomer 11). Das Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay wurde unter Verwendung eines automatisierten TDx®-Polarisationsanalysators ausgeführt, um eine Kalibrationskurve unter Verwendung von TCA: FAMCO-E-Tracer, Isomer 11 herzustellen, wie in Beispiel 18 beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen. In diesem Beispiel war der Antikörper Antikörper Nr. 787-3, hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben und 1/68 verdünnt (Endverdünnung 1/5440) in 0,1 M Kpi, 0,1% w/v Natriumazid, pH 7,4-7,6. Der Tracer-Verdünner war 0,1 M Kpi, 0,005% Dioctylnatriumsulfosuccinat (DOSS), 0,1% w/v Natriumazid, 1 mg/ml Rinder-Gamma-Globulin. Der Vorbehandlungspuffer war 20 mM Kpi, pH 4,0, 0,1% DOSS. Das Probenvolumen für die Kalibratoren betrug 1,4 ul. Die Ergebnisse des Tests werden unten in Tabelle 10 veranschaulicht. Tabelle 10

Beispiel 25

Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von 9- Carboxymethyl-topiramat:(2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein

Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay für Topiramat unter Verwendung von 9- Carboxymethyl-topiramat: (2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, hergestellt wie in Beispiel 15 beschrieben, als ein Tracer (9- CMT: FAMCO-E-Tracer). Das Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay wurde unter Verwendung eines automatisierten TDx®-Polarisationsanalysators ausgeführt, um eine Kalibrationskurve unter Verwendung von 9-CMT: FAMCO-E-Tracer herzustellen, wie in Beispiel 18 beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen. In diesem Beispiel war der Antikörper Schaf-Antikörper Nr. 662, hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben und 1/10 verdünnt (Endverdünnung 1/800). Der Tracer-Verdünner war TDx-Systems® Puffer. Das Probenvolumen für die Kalibratoren betrug 5 ul. Die Ergebnisse des Tests werden unten in Tabelle 11 veranschaulicht. Tabelle 11

Beispiel 26

Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay unter Verwendung von N- Carboxymethyl-topirarnat:(2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein
Dieses Beispiel beschreibt ein exemplarisches Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay für Topiramat unter Verwendung von N- Carboxymethyl-topiramat: (2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein, hergestellt wie in Beispiel 10 beschrieben, als ein Tracer (TGA: FAMCO-E-Tracer). Das Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay wurde unter Verwendung eines automatisierten TDx®-Polarisationsanalysators ausgeführt, um eine Kalibrationskurve unter Verwendung von TGA: FAMCO-E-Tracer herzustellen, wie in Beispiel 18 beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen. In diesem Beispiel war der Antikörper Schaf-Antikörper Nr. 650, hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben und 1/10 verdünnt (Endverdünnung 1/800). Der Tracer-Verdünner war TDx-Systems® Puffer. Das Probenvolumen für die Kalibratoren betrug 2 ul. Die Ergebnisse des Tests werden unten in Tabelle 12 veranschaulicht. Tabelle 12

Beispiel 27

Vergleich von Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay und Gaschromatographieanalyse von Topiramat

Dieses Beispiel beschreibt einen Vergleich von Ergebnissen aus einem exemplarischen Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay für Topiramat mit Gaschromatographieanalyse unter Verwendung von 117 Plasmaproben, erhalten von Patienten, die sich einer Topiramat-Therapie unterziehen.
Das verwendete Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay war N- (5-Carboxypentyl)-topiramat: (2-Aminoethyl)-ureido-fluoreszein- Tracer (TCA: FAMCO-E-Tracer), verdünnt in 0,1 M KPi, pH 7,4-7,6, 0,005% Dioctylnatriumsulfosuccinat (DOSS), 0,1% w/v Natriumazid, 1 mg/ml Rinder-Gamma-Globulin. Der verwendete Antikörper war Schaf-Antikörper NR. 787-3, hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben und 1/68 verdünnt (Endverdünnung 1/5440) in 0,1 M KPi, pH 7,4-7,6, enthaltend 0,1% w/v Natriumazid. Der Vorbehandlungspuffer war 20 mM KPi, pH 4,0, enthaltend 0,1% Dioctylnatriumsulfosuccinat (DOSS). Das Probenvolumen betrug 1,4 ul. Eine Kalibrationskurve wurde an dem TDx®-Analysator unter Verwendung des in Beispiel 18 beschriebenen, automatisierten Tests aufgestellt. Die sechs Kalibratoren waren 0, 2, 4, 8, 16 und 32 ug/ml Topiramat in menschlichem Serum.
Die Proben wurden im Duplikat getestet und der Durchschnittswert wurde für das Vergleichsverfahren verwendet. Das Gaschromatographieverfahren mit Stickstoff-Phosphor- Nachweis wurde wie in Cooper, JM, Stubbs, RJ und Palmer, ME, Pharmaceutical Research 8(10 Suppl.): 519 (1991) beschrieben ausgeführt. Dieses Verfahren ist technisch anspruchsvoll und wurde als sensitiv, präzise und spezifisch befunden.
Ein direkter Vergleich der zwei Verfahren wurde unter Verwendung einer Kalibration über die Bandbreite von 2-32 ug/ml Topiramat für die Proben ausgeführt. Ein Vergleich der Ergebnisse des Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay (FPIA) mit der Gaschromatographie anhand der 117 Patientenproben zeigte das Verhältnis: (FPIA-Wert) = -0,147 + 0,985 (GC-Wert) r = 0,9935.
Wie in diesem Beispiel demonstriert, sah das Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassay-Verfahren unter Verwendung der exemplarischen Reagentien dieser Erfindung eine ausgezeichnete Korrelation zu dem Gaschromatographieverfahren der Analyse von Topiramat vor.

Beispiel 28

Bestimmung von Antikörper-Überkreuz-Reaktivität

Dieses Beispiel beschreibt eine Bestimmung der Menge an Überkreuz-Reaktivität von polyklonalen und monoklonalen Antikörperzusammensetzungen mit dem Topiramat-Metaboliten 9-Hydroxytopiramat.
Zwei in Schafen erzeugte polyklonale Antikörperpräparate (Schaf-Antikörper Nr. 662 und 787-3) wurden wie in Beispiel 18 beschrieben hergestellt. Aufstellung einer Standardkurve unter Verwendung von Antikörper Nr. 662 und 9-Carboxymethyl- Topiramat: (2-Aminoethyl)-ureido-fluorescein-Tracer (9-CMT: FAMCO- E-Tracer) wird in Beispiel 25 beschrieben. Bekannte Mengen an 9- Hydroxy-Topiramat in menschlichem Serum wurden unter Verwendung dieser Kalibrationskurve getestet.
Aufstellung von Standardkurven für Schaf-Antikörper Nr. 787-3 und N-(5-Carboxypentyl)-topiramat: (2-Aminoethyl)-ureidofluorescein-Tracer (TCA: FAMCO-E-Tracer) wurde wie in Beispiel 27 beschreiben ausgeführt. Bekannte Mengen an 9-Hydroxy-topiramat in menschlichem Serum wurden unter Verwendung der Kalibrationskurven getestet.
Die beobachtete Konzentration an Topiramat wurde verwendet, um die Menge an Überkreuz-Reaktivität der Antikörperpräparate mit 9-Hydroxy-topiramat wie folgt zu berechnen. Die (% -Überkreuz-Reaktivität) gleicht (100 mal die beobachtete Topiramatkonzentration in ug/ml) geteilt durch (die Konzentration von zugegebenem 9-Hydroxy-topiramat in ug/ml). Die Ergebnisse dieser Tests werden unten in Tabelle 13 veranschaulicht. Tabelle 13*
*In der Tabelle ist 9-Hydroxy-topiramat die Konzentration von 9- Hydroxy-topiramat in der Probe in ug/ml. Topiramat ist die beobachtete Konzentration von Topiramat in ug/ml.
Dieses Beispiel demonstriert, dass die Antikörperpräparate ausreichend spezifisch zur Verwendung in einem kommerziellen Test waren, wenn ein Immunogen verwendet wird, worin das Topiramat-Analog an der Sulfamatkomponente von Topiramat derivatisiert war. Das unter Verwendung eines Immunogens hergestellte Antiserum, worin das Topiramat-Analog an der 9-Kohlenstoff-methylgruppe derivatisiert war, sah brauchbare Antikörper für Immunoassays vor, worin die Menge an 9-Hydroxy-topiramat im Vergleich mit der Menge an Topiramat in der Probe relativ klein ist.

Claims

1. Topiramat-Analog einer Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

worin eins von R&sub1; und R&sub2; für H steht und das andere für R-Y steht, R eine Verbindungsgruppe darstellt und Y einen Träger oder eine Markierung darstellt, wenn R&sub1; für H steht, X für H steht, wenn R&sub1; nicht für H steht, X für H oder eine Alkylgruppe steht; und

worin R&sub3; für R'-Y steht, R' eine heterocyclische Verbindungsgruppe umfasst, worin das N der Sulfamatgruppe von Topiramat ein Ringglied ist und Y einen Träger oder eine Markierung darstellt.

2. Topiramat-Analog von Anspruch 1, worin R' in dem Analog vorhanden ist und eine heterocyclische Ringverbindungsgruppe einschliesst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pyrrolidin, Piperidin, Piperazin und Morpholin.

3. Topiramat-Analog von Anspruch 1 oder 2, worin R' eine heterocyclische Ringverbindungsgruppe mit einem fünf- oder sechsgliederigen heterocyclischen Ring einschliesst.

4. Topiramat-Analog von einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R-Y oder R'-Y in dem Analog vorhanden ist.

5. Topiramat-Analog von Anspruch 4, worin Y einen Träger darstellt.

6. Topiramat-Analog von einem der Ansprüche 1 bis 5, worin R-Y in dem Analog vorhanden ist und R-Y für (CH&sub2;)nCO-[NH-Träger] steht, worin n = 1-9.

7. Topiramat-Analog von Anspruch 5 oder 6, worin der Träger ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Rinderserum-Albumin und Keyhole-Limpet-Hemocyanin.

8. Topiramat-Analog von Anspruch 4, worin Y eine Markierung darstellt.

9. Topiramat-Analog von einem der Ansprüche 1 bis 8, worin eines von R&sub1; und 1% für (CH&sub2;)nCO-[NH-Markierung] steht, worin n = 1- 9.

10. Topiramat-Analog von Anspruch 9, worin R&sub2; für (CH&sub2;)nCO-[NH- Markierung] steht, worin n = 1-9.

11. Topiramat-Analog von Anspruch 8, 9 oder 10, worin die Markierung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Fluorochrom, einem Enzym und Biotin.

12, Topiramat-Analog von Anspruch 8, 9, 10 oder 11, worin die Markierung ein Fluorochrom ist.

13. Topiramat-Analog von Anspruch 11 oder 12, worin das Fluorochrom Fluorescein ist.

14. Topiramat-Analog von Anspruch 13, worin das Fluorescein ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 2-(Aminoethyl)- thioureido-fluorescein, Fluorescein-thiosemicarbazid, (2- Aminoethyl)-ureido-fluorescein und Fluoresceinamin.

15. Topiramat-Analog von einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die Markierung direkt an das Topiramat-Analog gebunden ist.

16. Topiramat-Analog von Anspruch 15, worin die Markierung ein Radionuklid ist.

17, Topiramat-Analog, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N- Carboxymethyl-topiramat, Natriumsalzmonohydrat oder Topiramatglycin-Analog der Formel

N-(5-Carboxypentyl)-topiramat, Natriumsalz oder Topiramat- Capronsäure-Analog, Natriumsalz der Formel:

9-Carboxymethyl-topiramat oder Topiramat-Lävulinsäureketal- Analog der Formel:

18. Topiramat-Analog der Formel:

worin eins von R&sub1; und R&sub2; Wasserstoff darstellt und das andere R-Y darstellt, R eine Verbindungsgruppe darstellt und Y für einen Träger oder eine Markierung steht, insbesondere der Formel (CH&sub2;)nCO-[NH-immunogener Träger oder -nachweisbare Markierung], und X für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe steht, worin n von 1 bis 9 ist.

19. Topiramat-Analog von Anspruch 18, worin R&sub2; Wasserstoff darstellt und Y für einen Träger steht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rinderserum-Albumin und Keyhole-Limpet-Hemocyanin.

20. Topiramat-Analog von Anspruch 19, worin R&sub2; Wasserstoff darstellt und Y für eine Markierung steht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Fluorochrom, einem Enzym und Biotin.

21. Topiramat-Analog, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: TGA: BSA der Formel:

22. Anti-Topiramat Antikörper, insbesondere gegen das Topiramat aufgestellt, wie in einem der Ansprüche 1 bis 21 definiert.

23. Anti-Topiramat Antikörper von Anspruch 22, worin der Antikörper polyklonal ist.

24. Anti-Topiramat Antikörper von Anspruch 22, worin der Antikörper monoklonal ist.

25. Anti-Topiramat Antikörper von einem der Ansprüche 22 bis 24, worin der Antikörper mit einem Topiramat-Analog, derivatisiert an der Sulfamat-Komponente von Topiramat reagiert.

26. Immunoassay-Ausrüstung zum Prüfen von Topiramat, umfassend:

a. einen Anti-Topiramat Antikörper; und

b. ein Topiramat-Analog der Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

worin eins von R&sub1; und R&sub2; für H steht und das andere für R-Y steht, R eine Verbindungsgruppe darstellt und Y eine Markierung darstellt, wenn R&sub1; für H steht, X für H steht, wenn R&sub1; nicht für H steht, X für H oder eine Alkylgruppe steht.

27. Immunoassay-Ausrüstung von Anspruch 26, worin R&sub2; für R-Y steht.

28. Immunoassay-Ausrüstung von Anspruch 26 oder 27, worin R-Y für (CH&sub2;)nCO-[NH-Markierung] steht, worin n = 1-9.

29. Immunoassay-Ausrüstung von einem der Ansprüche 26 bis 28, worin die Markierung ein Fluorochrom ist.

30. Verfahren zum Prüfen von Topiramat in einer Probe, umfassend die Schritte:

a) Kombinieren der Probe mit einem Topiramat-Analog, wie in einem der Ansprüche 1 bis 21 definiert und Anti- Topiramat-Antikörpern, insbesondere wie in einem der Ansprüche 22 bis 29 definiert.

b) Bestimmen der Antikörpermenge, die als eine Indikation der Topiramatmenge in der Probe an das Topiramat- Analog gebunden ist.

31. Verfahren von Anspruch 30, worin das Topiramat-Analog mit einem Fluorochrom markiert ist.