DE2928048C2 - - Google Patents

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DE2928048C2
DE2928048C2 DE2928048A DE2928048A DE2928048C2 DE 2928048 C2 DE2928048 C2 DE 2928048C2 DE 2928048 A DE2928048 A DE 2928048A DE 2928048 A DE2928048 A DE 2928048A DE 2928048 C2 DE2928048 C2 DE 2928048C2
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Description

Spezifische Bindungsuntersuchungen sind technisch stark weiterentwickelt worden von dem ursprünglichen kompetitiven Bindungs-Radioimmuno-Test (Radioimmunoassay RIA) bei dem ein Radioisotop-markiertes Antigen kompetitiv mit einem Antigen in einer Versuchsprobe bei der Bindung an einen spezifischen Antikörper ist. In der RIA-Technik wird eine Antigenprobe quantitativ bestimmt, indem man das Verhältnis der Radioaktivität bestimmt, die in dem Antikörper durch Bindung an das radiomarkierte Antigen (der gebundenen Spezies des markierten Antigens) vorliegt, zu der Radioaktivität, die unassoziiert vom Antikörper (der freien Spezies) vorliegt, und dann das Verhältnis mit einer Standardkurve vergleicht. Ein genauer Überblick über die RIA-Technik findet sich bei Skelly et al. in Clin. Chem., 19, 146 (1973). Gemäß der Definition basiert RIA auf der Bindung von spezifischen Antikörpern an ein Antigen oder Hapten, jedoch sind radiomarkierte Bindungs-Analyse-Methoden entwickelt worden, die auf anderen spezifischen Bindungs- Wechselwirkungen beruhen, z. B. zwischen Hormonen und deren Bindungsproteinen.
Ausgehend von radiomarkierten Bindungs-Untersuchungsmethoden wurden nicht-radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden entwickelt, bei denen markierte Substanzen, wie Enzyme, verwendet werden (US-PS 36 54 090 und 38 17 837). In der DE-OS 26 18 419 und 26 18 511 werden verbesserte nicht-radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden beschrieben, bei denen ganz einmalige Markierungssubstanzen, einschließlich Coenzyme, cyclische Reaktanten, abspaltbare fluoreszente Enzymsubstrate und chemilumineszente Moleküle verwendet werden. Die chemilumineszente Markierung besteht aus einem organischen Molekül, das unter Ausbildung von Licht eine chemische Strukturveränderung erfährt.
Spezifische Beispiele für als chemilumineszente Markierungen geeignete Substanzen finden sich in der DE-OS 26 18 511. Solche Verbindungen sind z. B. Luminol, Isoluminol, Pyrogallol und Luciferin. Insbesondere wird ein Beispiel in der DE-OS 26 18 511 [und in Anal. Chem., 48, 1933 (1976)] gezeigt, bei dem ein Isoluminol-markiertes Konjugat, bei welchem das Isoluminol durch seine Aminofunktion mittels einer 2-Hydroxypropylen-Brücke an den Liganden Biotin gebunden ist. Das Isoluminol-markierte Konjugat wird in dem Bindungsversuch durch Messen des entweder in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase oder von Kaliumsuperoxid produzierten Lichtes überwacht. Chemilumineszente Phthalhydrazid-markierte Konjugate, bei denen ein Aminophthalhydrazid durch die Aminofunktion über eine 2-Hydroxyalkylen- Brücke an einen Liganden gekuppelt sind, werden in der DE-OS 29 21 781 der Anmelderin beschrieben.
Die Effizienz von Aminophthalhydraziden als chemiluminiszente Markierungen ist dadurch verbessert worden, daß man sie über die Aminofunktion mit einer unsubstituierten geradkettigen Alkylenbrücke kuppelte.
Die Erfindung betrifft nun Verbindungen der allgemeinen Formel
in welcher
neine Zahl zwischen 2 und 8 bedeutet und Rfür eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen steht.
Bevorzugt steht für n die Zahl 4 oder 6. Bevorzugt steht R für eine Ethylgruppe.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Verbindungen zur Chemilumineszenzmarkierung.
Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Phthalhydrazide herstellbaren Konjugate werden in spezifischen Bindungsversuchen zum Nachweis des Liganden oder eines Bindungspartners davon verwendet. Die markierten Konjugate werden in der Bindungsuntersuchungsmethode (binding assay) hinsichtlich ihres Verhaltens überwacht, indem man die markierten Konjugate oxidiert und das erzeugte Licht entweder als gesamtes erzeugtes Licht oder als Peak-Lichtintensität mißt. Bei einem spezifischen Bindungsversuch zum Nachweis eines Haptens in einem flüssigen Medium kann man diese Untersuchung z. B. ausführen, indem man eine Probe des flüssigen Mediums mit einem Antikörper für das Hapten und mit einem markierten Konjugat der vorliegenden Erfindung, bei dem das Hapten oder ein Bindungsanalog davon mit der chemilumineszenten Gruppierung markiert ist, inkubiert. Während der Inkubierung steht jegliches Hapten, das in dem flüssigen Medium vorliegt, im Wettbewerb mit dem markierten Konjugat, hinsichtlich der Bindung an den Antikörper. Anschließend bestimmt man die Menge des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies im Vergleich zu der freien Spezies (wobei diese Menge in umgekehrter Funktion zu der Menge des Haptens in der zu untersuchenden Flüssigkeit steht) und diese Bestimmung (d. h. Überwachung) erfolgt entweder in homogener Weise, wenn der Chemilumineszenz-Charakter des markierten Konjugats in der freien Spezies unterschiedlich ist gegenüber der gebundenen Spezies, oder die Bestimmung erfolgt in heterogener Weise, wenn in beiden Spezies dieser Charakter im wesentlichen gleich ist. In der homogenen Versuchsanordnung wird die nicht getrennte Reaktionsmischung, die beide Spezies des markierten Konjugats enthält, mit einem geeigneten Oxidationssystem für die chemilumineszente Markierung kombiniert und das gebildete Licht wird gemessen. Bei der heterogenen Versuchsanordnung wird die gebundene von der ungebundenen Spezies in üblicher Weise abgetrennt, das Oxidationssystem wird mit einer Spezies kombiniert, und das gebildete Licht wird gemessen.
Die überwachbare chemilumineszente Reaktion kann wie folgt beschrieben werden:
worin h · ν die emittierte elektromagnetische Strahlung bedeutet.
Brauchbare Oxidationssysteme schließen Wasserstoffperoxid in Kombination mit einem der nachfolgenden Katalysatoren, Peroxidase (insbesondere Mikroperoxidase), Katalyse, Deuterohämin, Hämatin oder Ferricyanidionen; Hypochloritionen kombiniert mit Kobaltionen; Persulfationen; Kaliumsuperoxid; Perjodationen; Hypoxynthin kombiniert mit Xanthinoxidase oder Kalium-t-butoxid, ein.
Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Phthalhydrazide herstellbaren chemilumineszent markierten Konjugate können in allen üblichen homogenen oder heterogenen Bindungs- Untersuchungsmethoden, einschließlich den kompetitiven Bindungsmethoden, Sequenz-Sättigungsmethoden, Direkt- Bindungsmethoden und "Sandwich"-Bindungsmethoden angewendet werden. Zum Stand der Technik über die verschiedenen Bindungs- Untersuchungsverfahren wird auf die schon erwähnte DE-OS 26 18 419 und 26 18 511 verwiesen.
Die hier verwendeten Begriffe haben, wenn nicht anders angegeben, folgende Bedeutung: "Spezifisch bindungsfähiger Ligand" ist eine organische Substanz von analytischem Interesse, für die ein spezifischer Bindungspartner vorliegt; "spezifischer Bindungspartner des Liganden" ist die Substanz, welche eine nicht-kovalente Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß von anderen Substanzen hat; und "Bindungsanalog des Liganden" ist eine organische Substanz, die sich in ihrer chemischen Struktur von dem Liganden unterscheidet, aber sich im wesentlichen genauso wie der Ligand hinsichtlich der Bindungsaffinität an den spezifischen Bindungspartner des Liganden verhält.
Der spezifische bindungsfähige Ligand oder dessen Analog in den markierten Konjugaten ist hinsichtlich seiner chemischen Art im allgemeinen ein Protein, Polypeptid, Peptid, Kohlenwasserstoff, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für die ein spezifischer Bindungspartner erhältlich ist. Funktionell ausgedrückt ist der Ligand im allgemeinen ein Antigen oder ein Antikörper dazu, ein Hapten oder ein Antikörper dazu, oder ein Hormon, Vitamin, ein Arzneimittel oder ein Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür. Meistens ist der Ligand ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4 000 000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper, oder ist ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500.
Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen erhältlichen markierten Konjugate werden im allgemeinen hergestellt, indem man eine Peptid- oder Amidkupplung zwischen (1) einem Aminoderivat eines chemilumineszenten Aminophthalhydrazids (z. B. Luminol oder Isoluminol) und (2) entweder dem Liganden, falls dieser eine Carbonsäurefunktion enthält, oder einem Bindungsanalog des Liganden (d. h. einem Derivat des Liganden), welcher die gewünschte Carbonsäurefunktion enthält, herstellt. Solche Kondensationsreaktionen können durch Umsetzung des Aminoderivates der Markierung direkt mit dem Carbonsäure enthaltenden Liganden oder dem Analog des Liganden unter Anwendung üblicher Peptid-Kondensationsreaktionen durchgeführt werden, z. B. Carbodiimidreaktion [Science 144, 1344 (1964)], der Mischanhydridreaktion [Erlanger et al., Methods in Immunology and Immunochemistry, herausgegeben von Williams und Chase, Academic Press (New York, 1967), S. 149], und den Säureazid- und Aktivesterreaktionen [Kopple, Peptides and Amino Acids, W. A. Benjamin, Inc. (New York, 1966)]. Ein allgemeiner Überblick hierzu findet sich in Clin. Chem., 22/726 (1976).
Selbstverständlich können andere bekannte Verfahren zum Kuppeln des Liganden oder eines Derivates davon an das Aminoderivat der Markierung angewendet werden. Insbesondere können übliche bifunktionelle Kupplungsmittel zum Kuppeln eines Liganden oder dessen Derivates, enthaltend eine Carbonsäure oder eine Aminogruppe, an das Aminoderivat der Markierung verwendet werden. Zum Beispiel können Amin-Amin- Kupplungsmittel, wie Bis-isocyanate, Bis-imidoester und Glutaraldehyd [Immunochem., 6, 53 (1969)] zum Kuppeln eines Liganden oder eines Derivates davon, enthaltend eine Aminogruppe, an das Aminoderivat der Markierung verwendet werden. Es sind auch geeignete Kupplungsreaktionen bekannt, bei denen eine Brückengruppe zum Kuppeln eines Amins (z. B. des Aminoderivates der Markierung) an eine Carbonsäure (z. B. den Liganden oder dessen Derivat) verwendet wird. Kupplungsreaktionen dieser Art werden ausführlich in der Literatur beschrieben, und zwar beispielsweise in der schon erwähnten Monografie von Koppel, in Lowe & Dean, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons (New York, 1974).
Solche Kupplungsverfahren sind äquivalent zu den vorher erwähnten Peptid-Kondensationsreaktionen bei der Herstellung geeigneter markierter Konjugate. Die Wahl des Kupplungsverfahrens hängt von den für die Kupplung verfügbaren Funktionalitäten in dem Liganden oder dessen Analog zum Kuppeln an das Markierungsderivat und von der Länge der gewünschten Brückengruppe ab. In allen Fällen besteht das erhaltene markierte Konjugat aus dem markierten Derivat gebunden an den Rest des Konjugates über eine Amidbindung. Ein solcher Rest des Konjugats wird als Rest eines Bindungsanalogs des Liganden angesehen, sofern der Ligand nicht selbst direkt an das Markierungsderivat gekuppelt ist. In der Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet die Abkürzung den Liganden oder ein Bindungsanalog davon, gekuppelt über eine Amidbindung, worin ein solches Analog ein Derivat des durch Peptidkondensation an das Markierungsderivat gekuppelten Liganden sein kann oder der Ligand oder ein Derivat davon sein kann, die über eine Brückengruppe, die durch Kupplung des Liganden oder dessen Derivates an das Markierungsderivat mit einem bifunktionellen Kupplungsmittel eingeschoben wurden, gebunden sein können.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen und der damit erhältlichen chemilumineszent markierten Konjugate verläuft nach der folgenden allgemeinen Synthesesequenz:
Das Ausgangsmaterial für die Synthese ist 3- oder 4-Amino- N-methylphthalimid (I), wobei die 3-Aminoverbindung [Wang et al., JACS, 72, 4487 (1950), und Flitsch, Chem. Ber., 94, 2494 (1961)] zur Herstellung von auf Luminol basierenden markierten Konjugaten verwendet wird, und die 4-Aminoverbindung [Flitsch, Chem. Ber., 94/2494 (1961)] zur Herstellung von markierten Konjugaten auf Isoluminolbasis verwendet wird.
Die Umsetzung von Phthalimid (I) mit N-(ω-bromalkyl)- phthalimid (II) [erhältlich von der Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA, siehe auch Derscherl und Weingarten, Justus Liebigs Annalen der Chemie, 574/131 (1951)]
ergibt das Bisphthalimid-Zwischenprodukt (III)
Durch Alkylierung der Aminogruppe des Bisphthalimid- Zwischenproduktes (III) mittels Umsetzung mit einem Dialkylsulfat (IV) [Rodd, Chemistry of Carbon Compounds, Bd. 1, Elsevier Publ. Co. (New York, 1951), S. 337]
erhält man das N-alkylierte Derivat (V)
worin R′ eine geradkettige Alkylkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
Behandelt man das Bisphthalimid-Zwischenprodukt (III) oder dessen N-alkyliertes Derivat (V) mit Hydrazin, so erhält man das Aminohydrazid (VI)
worin R Wasserstoff oder eine geradkettige Alkylkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.
Durch Kondensation des Aminohydrozids (VI) mit (a) dem zu markierenden Liganden, sofern dieser eine Carboxylsäurefunktion enthält, (b) einem Bindungsanalog des Liganden, darstellt, oder (c) dem Liganden oder einem geeigneten Derivat des Liganden in Gegenwart eines bifunktionellen Kupplungsmittels, erhält man ein chemilumineszent markierte Konjugat (VII)
worin R die vorher angegebene Bedeutung hat und den spezifisch bindungsfähigen Liganden oder ein Bindungsanalog davon (durch Ableitung des Liganden und/oder Einführung einer Brücke mittels eines bifunktionellen Kupplungsmittels gebildet), gebunden über eine Amidbindung, bedeutet.
Andere Variationen von markierten Konjugaten, die auf der vorerwähnten Synthese beruhen, liegen auf der Hand. So kann man insbesondere verschiedene ringsubstituierte Amino-N- methyl-phthalimide als Ausgangsmaterialien unter Bildung von ringsubstituierten markierten Konjugaten, die im wesentlichen die gleichen qualitativen Eigenschaften haben, wie die nach dem vorstehend beschriebenen Reaktionsschema hergestellten Konjugate verwenden.
Wie bereits festgestellt, ist der Ligand in dem markierten Konjugat oder dessen Bindungsanalog in dem markierten Konjugat in den meisten Fällen ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4 000 000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper; oder ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500. Nachfolgend werden verschiedene Kupplungsmethoden für solche Liganden und deren Analoge an das Aminoderivat (VI) der Markierung über eine Amidbindung beschrieben.
Polypeptide und Proteine
Typische und spezifische bindungsfähige Proteinliganden sind im allgemeinen Antikörper, insbesondere solche der IgG-, IgM- und IgA-Klasse.
Da Liganden dieser allgemeinen Kategorie als Peptide zahlreiche verfügbare Carbonsäure- und Aminogruppen aufweisen, kann die Kupplung des Aminoderivates der chemilumineszenten Markierung mittels üblicher Peptid-Kondensationsreaktionen erfolgen, wie durch eine Carbodiimid- Reaktion, der Mischanhydrid-Reaktion und dergleichen, wie sie bereits vorher erwähnt wurden, oder unter Verwendung von üblichen bifunktionellen Reagentien, die in der Lage sind, eine Carbonsäurefunktion oder eine Aminofunktion an einer Aminogruppe in dem Markierungsderivat zu bewirken, wie bereits erwähnt wurde. Allgemeine Hinweise bezüglich der Kupplung von Proteinen an primäre Amino- oder Carbonsäuren wurden bereits vorher gegeben.
Haptene
Haptene stellen eine große Klasse organischer Substanzen dar, die eine immunochemische Reaktion in einem Gasttier nur dann entwickeln, wenn sie in Form eines immunogenen Konjugates aus dem Hapten, gekuppelt an ein Trägermolekül, und zwar in den meisten Fällen einem Protein, wie Albumin, injiziert werden. Die Kupplungsreaktionen zur Bildung der immunogenen Konjugate sind aus dem Stand der Technik bekannt und bestehen im allgemeinen aus der Kupplung eines Carbonsäure-Liganden oder eines Carbonsäurederivates des Liganden an eine verfügbare Aminogruppe des Proteinträgers unter Bildung einer Amidbindung. Solche bekannten Kupplungsreaktionen sind direkte Analoge zu der vorliegenden Bildung von markierten Konjugaten durch Kupplung von Carbonsäureliganden oder deren Bindungsanalogen an die Aminoderivate der chemilumineszenten Markierung.
Weitere Liganden sind die Carbonsäurederivate von:
Carbamazepin (gemäß US-PS 40 58 511),
Chinidin [nach dem Verfahren von Cook et al., Pharmacologist, 17, 219 (1975)],
Digoxin und Digitoxin [nach dem Verfahren von Oliver et al., J. Clin. Invest., 47, 1035 (1968)],
Theophyllin [nach dem Verfahren von Cook et al., Res. Comm. Chem. Path. Pharm., 13, 497 (1976)],
Phenobarbital und Primidon [nach dem Verfahren von Cook et al., Quantitative Analytic Studies in Epilepsy, herausgegeben von Kelleway und Peterson, Raven Press (New York, 1976),
S. 39-58],
Diphenylhydantoin [nach dem Verfahren von Cook et al., Res. Comm. Chem. Path. Pharm., 5, 767 (1973)],
Morphin [nach dem Verfahren von Spector et al., Science, 168, 1347 (1970)],
Nikotin [nach dem Verfahren von Langone et al., Biochem, 12 (24), 5025 (1973)],
Androgene, Östrogene und Progesterone [nach dem Verfahren von Bauminger et al., J. Steroid Biochem., 5, 739 (1974)].
Die vorerwähnten Verfahren sind lediglich Beispiele für die vielen geeigneten Verfahren zur Herstellung von Carbonsäurederivaten von Haptenen von analytischem Interesse.
Im folgenden wird ein allgemeines Syntheseschema zur Herstellung lumineszent markierter Konjugate anhand der Herstellung der markierten Thyroxin-Konjugate 6-{N-Äthyl- N-[4-(thyroxinyl-amido)butyl]amino}-2,3-dihydrophthalazin- 1,4-dion und 6-{N-Äthyl-N-[6-thyroxinylamido)hexyl]amino}- 2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion erläutert. Die Reaktionsfolge für diese Synthesen werden in den folgenden Tabellen 1 und 2 gezeigt.
Tabelle 1
Tabelle 2
A. Herstellung eines markierten Konjugates N-Trifluoracetylthyroxin (2)
Eine Lösung aus 20 g (25,6 mmol) L-Thyroxin in 240 ml trockenem Äthylacetat, enthaltend 46 ml Trifluoressigsäure und 7,6 ml Trifluoressigsäureanhydrid, wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur und Zugabe von 200 ml H₂O bildete sich eine Suspension, die mit Natriumchlorid gesättigt wurde. Die organische Phase der Mischung wurde abgetrennt, mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei man 21,3 g N-geschütztes Thyroxinderivat (2) erhielt. Eine Probe wurde aus Äther-Pentan umkristallisiert, wobei man feine Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 235°C (Zersetzung) erhielt.
Analyse für C₁₇H₁₀F₃J₄NO₅:
Berechnet:C 23,39  H 1,15  N 1,60; gefunden:C 23,23  H 1,12  N 1,56.
IR-Spektrum (KCl): 1700 cm-1 (Carbonyl),
optische Drehung [α]=-14,97° (c 1,0, Dimethylsulfoxid).
N-Methyl-4-{4-N-[N-Phthalimido)butyl]amino}-phthalimid (7)
Eine Mischung aus 42 g (0,15 Mol) N-(4-Bromobutyl)phthalimid (4), 51,5 g (0,29 Mol) 4-Amino-N-methylphthalimid (6) [Flitsch, Chem. Ber., 94, 2494 (1961)] und 300 ml Dimethylformamid wurde einen Tag unter Rückfluß gehalten. Beim Abkühlen bildete sich ein gelber Niederschlag, der gesammelt und getrocknet wurde, wobei man 38,5 g Bisphthalimid (7) erhielt. Eine Probe wurde aus wäßriger Essigsäure umkristallisiert, wobei man feine gelbe Nadeln, Schmelzpunkt 217-218°C, erhielt.
Analyse für C₂₁H₁₉N₃O₄:
Berechnet:C 66,83  H 5,07  N 11,14; gefunden:C 66,46  H 4,99  N 11,61.
N-Methyl-4-{6-N-[(N-phthalimido)hexyl]amino}-phthalimid (8)
Diese Verbindung wird in gleicher Weise wie (7) durch die Umsetzung von (6) und N-(Bromohexyl)phthalimid (5) erhalten. Beim Umkristallisieren aus wäßriger Essigsäure erhält man Bisphthalimid (8) als feine gelbe Nadeln, Schmelzpunkt 178-197°C.
Analyse für C₂₃H₂₃N₃O₄:
Berechnet:C 68,13  H 5,72  N 10,37; gefunden:C 68,22  H 5,82  N 10,36.
4-{N-Äthyl-N-[4-(N-phthalimido)butyl]amino}-N-methylphthalimid (9)
Eine Mischung aus 38 g (0,1 Mol) Bisphthalimid (7) und 100 ml Diäthylsulfat wurde auf 160°C während 45 Minuten erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt und zu 3 l Eiswasser gegossen. Der gebildete gelbe Niederschlag wurde aus wäßriger Essigsäure mitkristallisiert, wobei man 29 g des N-Äthyl- Derivates (9) in Form von feinen gelben Nadeln erhielt, Schmelzpunkt 164-165°C.
Analyse für C₂₃H₂₃N₃O₄:
Berechnet:C 68,13  H 5,72  N 10,37; gefunden:C 68,01  H 5,70  N 10,56.
4-{N-Äthyl-N-[6-(N-phthalimido)hexyl]amino}-N-methylphthalimid (10)
Diese Verbindung wird in gleicher Weise wie (9) durch Umsetzung von (8) hergestellt, wobei man feine gelbe Nadeln aus wäßriger Essigsäure mit dem Schmelzpunkt von 135°C erhält.
Analyse für C₂₅H₂₇N₃O₄:
Berechnet:C 69,26  H 6,28  N 9,69; gefunden:C 68,90  H 6,04  N 9,48.
6-[N-(4-Aminobutyl)-N-äthylamino]-2,3-dihydrophthalazin- 1,4-dion (11)
Eine Mischung aus 29 g (0,072 Mol) N-Äthyl-bis-phthalimid (9), 80 ml 95%iges Hydrazin und 300 ml Äthanol wurde 2 h unter Rückfluß gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und dann über Nacht stehengelassen. Beim Abdampfen unter vermindertem Druck erhielt man einen schwach gelben Feststoff, der 8 h bei 110°C unter einem Druck von 0,1 mm Hg getrocknet wurde. Der Feststoff in einer Menge von 31,5 g wurde 90 Minuten in 150 ml 10%iger Chlorwasserstoffsäure gerührt und dann filtriert. Nach dem Neutralisieren des Filtrates mit Kaliumhydroxid fiel ein schwerer Niederschlag aus, der filtriert, getrocknet und aus wäßrigem Dimethylformamid umkristallisiert wurde, und 6,5 g des Amino-phthalazindions (11) in Form eines weißen Pulvers, Schmelzpunkt 255-257°C, ergab.
Analyse für C₁₄H₂₀N₄O₂:
Berechnet:C 60,85  H 7,30  N 20,28; gefunden:C 60,67  H 7,30  N 20,18.
Die Effizienz des Aminoderivates (11) der Markierung in einer chemilumineszenten Reaktion und die Nachweisgrenze eines solchen Derivates wurde wie folgt bestimmt:
Zur Bestimmung der Effizienz wurde das Markierungsderivat und Luminol (5-Amino-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion) individuell mit verschiedenen Niveaus im pikomolaren Bereich oxidiert und verglichen mit den Peak-Lichtintensitäten mittels einer grafischen Aufzeichnung. Lineare Anteile der entstandenen Kurven ermöglichten eine Berechnung der Veränderung der Peak-Lichtintensität pro Konzentrationseinheit für das Markierungsderivat und für Luminol. Die Effizienz des Markierungsderivates wurde als Prozentsatz der Luminol-gebildeten Steigung ausgedrückt.
Reaktionsmischungen (150 µl) der folgenden Zusammensetzung wurden in 6×50-mm-Reagenzgläser gefüllt und in einen Dupont- 760-Luminiszenz-Biometer mit einer Empfindlichkeitseinstellung von 820 gegeben. Die Mischungen hatten folgende Zusammensetzung: 50 mMol Natriumhydroxid, 0,07 µMol Hämatin und entweder das Aminoderivat der Markierung oder Luminol in verschiedenen Konzentrationen im pikomolaren Bereich (verdünnt mit H₂O aus einer Vorratslösung von 1 mMol 0,1 m Natriumcarbonat, pH 10,5). Jede Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und dann wurden 90 mMol Wasserstoffperoxid zugegeben, um die chemilumineszente Reaktion einzuleiten. Die Peak-Lichtintensitätswerte wurden aus den Instrumentenablesungen aufgezeichnet. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und das Mittel genommen. Die Effizienz des Markierungsderivates (11) betrug 84%.
Die Nachweisgrenze wurde als Konzentration des Markierungsderivates bestimmt, welche eine Peak-Lichtintensität vom 1,5fachen Wert der Hintergrundchemilumineszenz in dem Reaktionsgemisch ergab. Die Nachweisgrenze für das Markierungsderivat (11) betrug 2 pM.
6-[N-(6-Aminohexyl)-N-äthylamino]-2,3-dihydrophthalazin- 1,4-dion (12)
Diese Verbindung wurde hergestellt aus N-Äthyl-bis- phthalimid (10) in gleicher Weise wie (11). Beim Umkristallisieren aus Wasser erhielt man in 53%iger Ausbeute Aminophthalazindion (12) als weißes Pulver, Schmelzpunkt 170°C.
Analyse für C₁₆H₂₄N₄O₂:
Berechnet:C 63,13  H 7,95  N 18,41; gefunden:C 62,82  H 8,24  N 18,74.
Die Effizienz des Aminoderivates (12) der Markierung und dessen Nachweisgrenze wurde in gleicher Weise wie vorher für das markierte Derivat (11) bestimmt mit der Ausnahme, daß die Reaktionsmischung anstelle von Hämatin 0,27 µMol Mikroperoxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) enthielt, sowie auch 57,5 mMol Barbitalpuffer, eingestellt auf pH 8,6, und daß das Wasserstoffperoxidreagens in 10 mMol Tris-HCl-Puffer [Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlorid], pH 7,4, enthalten war. Die Effizienz betrug 78% und die Nachweisgrenze 2 pM.
6-{N-Äthyl-N-[4-(thyroxinylamido)butyl]amino}-2,3-dihydrophthalazin- 1,4-dion (13)
Eine Mischung aus 4,36 g (5 mMol) N-Trifluoracetylthyroxin (2), 0,8 g (5 mMol) Carbonyldiimidazol und 50 ml Tetrahydrofuran wurde 10 Minuten unter Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei ein fester Rückstand des Imidazolids (3) zurückblieb. Dieses Zwischenprodukt wurde nicht isoliert, sondern direkt mit einer Suspension aus 1,38 g (5 mMol) des Aminoderivates (11) vereint. Nach zweitägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Hochvakuum entfernt, und der feste Rückstand wurde mit 80 ml 10%iger Chlorwasserstoffsäure gewaschen.
Die Trifluoracetyl-Blockierungsgruppe wurde durch Auflösen von 2,07 g des Rohproduktes in 35 ml 0,5 m Natriumhydroxid entfernt. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde die Lösung auf pH 5,0 mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Der gebildete Niederschlag wurde mit H₂O gewaschen und getrocknet. Der trockene Feststoff wurde über eine Säule aus 200 g Kieselgel 60 (E. Merk, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) mit einem 3 : 3-Volumen zu Volumen-Mischung aus Äthanol und 1 m Triäthylammonium-bicarbonat eluiert, wobei 10-ml-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 49 bis 65 wurden vereint und eingedampft, wobei man 680 mg eines cremefarbenen Feststoffes erhielt. Der Feststoff wurde in 50 ml 50%igem Dimethylformamid aufgenommen und durch Zugabe von H₂O wieder ausgefällt. Nach dem Trocknen des Feststoffes wurden 200 mg des markierten Konjugates (13) als weißes Pulver, Schmelzpunkt annähernd 200°C (Zersetzung) erhalten.
Analyse für C₂₉H₂₉I₄N₅O₅:
Berechnet:C 33,64  H 2,82  I 49,04  N 6,77; gefunden:C 34,02  H 2,97  I 48,55  N 6,65.
6-{N-Äthyl-N-[6-(thyroxinylamido)hexyl]amino}-2,3- dihydrophthalazin-1,4-dion (14)
Diese Verbindung wurde aus dem Aminoderivat (12) in gleicher Weise wie (13) hergestellt, wobei man 200 mg des markierten Konjugates (14) in Form eines weißen Pulvers, Schmelzpunkt ungefähr 200°C (Zersetzung) erhielt.
Analyse für C₃₁H₃₃I₄N₅O₅:
Berechnet:C 35,02  H 3,13  N 6,59; gefunden:C 33,37  H 3,26  H 6,10.
B. Bindungstest für Thyroxin
5 Pikomole des markierten Konjugates (13) (das markierte Konjugat (14) kann ebenso verwendet werden) in 100 Microlitern 0,1 n Natriumhydroxid wurden auf jede von einer Reihe von kleinen Kolonnen, die mit Sephadex G-25 gefüllt waren, gegeben. Die Kolonnen hatten jeweils ein Bettvolumen von 1 ml und waren vorgewaschen worden mit nacheinander 4 ml Volumina 7%ige Essigsäure (dreimal), H₂O und 0,1 m Natriumhydroxid (dreimal). Dann wurde 1 ml 0,1 m Natriumhydroxid oben auf jede Kolonne aufgegeben und in das Gel einsickern gelassen, und anschließend wurden auf jede Säule 200 µl einer Lösung gegeben, die unterschiedliche Mengen an Thyroxin-Standards in 10% Serum (zuvor thyroxinfrei durch Aktivkohlebehandlung gemacht) und 90 mMol Natriumhydroxid enthielt. Jede Kolonne wurde mit 4 ml eines 75 mMol Barbital-Puffers (pH 8,6) gewaschen, und danach wurden 300 µl einer Zubereitung eines Antikörpers für Thyroxin zu jeder Kolonne gegeben. Nach einstündiger Inkubierung wurde das Antikörper-gebundene, markierte Konjugat aus den Säulen mittels 0,8 ml des Barbital- Puffers herausgewaschen. Ein Aliquot (95 µl) eines jeden Abflusses wurde mit 55 µl einer 2 : 3,5-Mischung (v : v) von 2 µMol Mikroperoxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) in dem Barbital-Puffer und 0,2 n Natriumhydroxid gemischt. Nach 10minütiger Inkubierung wurden 10 µl von 90 mMol Wasserstoffperoxid zu jeder Mischung zum Einleiten der Chemilumineszenz-Reaktion gegeben. Das gebildete Licht wurde in einem DuPont-760-Biometer gemessen und in Peak-Lichtintensitätseinheiten aus den Instrumentablesungen aufgezeichnet. Jede Reaktion wurde dreifach durchgeführt, und der Durchschnitt wurde genommen.
Die Beziehung zwischen der Thyroxin-Konzentration und der Peak-Lichtintensität wird in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt.
Thyroxinkonzentration (nM)Peak-Lichtintensität
 2548,6  5046,4 10039,2 15034,0 20027,8
28 Serumproben, die unbekannte Konzentrationen enthielten, wurden hergestellt und unter Anwendung der vorerwähnten chemilumineszenz-markierten Bindungsuntersuchungsmethode (unter Verwendung der aus der Aufzeichnung der Zahlenwerte von Tabelle 3 erhaltenen Standardkurve) und unter Verwendung des im Handel erhältlichen TETRALUTE®-Thyroxin- Radioassay-Sets (Ames Company Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana 46515, USA) untersucht. Die erhaltene Korrelationskurve, welche die Chemilumineszenz-Assay-Werte in Radioassay-Werte gegenüberstellte, hatte eine Gleichung von y=0,95 x+5,9 nM mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,91 und einem Veränderungskoeffizienten von 13,1% für die Chemilumineszenz-Untersuchung.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen herstellbaren markierten Konjugate geeignet sind, in Bindungsversuchen zur Bestimmung von Liganden in flüssigen Medien verwendet zu werden.

Claims (4)

1. Verbindung der allgemeinen Formel in welcherneine Zahl zwischen 2 und 8 bedeutet und Rfür eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen steht.
2. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß n für eine der Zahlen 4 oder 6 steht.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für eine Ethylgruppe steht.
4. Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Chemilumineszenzmarkierung.
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