DE2928048A1

DE2928048A1 - Chemilumineszente phthalhydrazid- markierte konjugate

Info

Publication number: DE2928048A1
Application number: DE19792928048
Authority: DE
Inventors: Robert Thomas Buckler; Hartmut Richard Schroeder
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1978-07-24
Filing date: 1979-07-11
Publication date: 1980-02-07
Also published as: FR2433517B1; FR2433517A1; IL57644A; GB2026159A; JPS5518996A; CA1137975A; GB2041920B; GB2041921A; IL57644A0; DE2928048C2; GB2026159B; US4334069A; GB2041920A; GB2041921B

Description

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) ■ DIPL.-ING. W.EITLE - DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

D1PL.-ING. K. FDCHSlE · DR. RE R. NAT. B. HAN SEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) - D-8000 MO NCH EN 81 · TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29619 (PATHE)

-■ 6 -

32 319 o/fg

Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana / USA

Chemilumineszente Phthalhydrazid-markierte Konjugate

Die Erfindung betrifft neue chemiluminüszent-markierte Konjugate, die in spezifischen Bindungsuntersuchungen für einen Linganden, wie-ein Antigen, Hapten oder einen Antikörper, in einem flüssigen Medium, wie einer Körperflüssigkeit, verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin Zwischenverbindungen, die bei der Synthese der neuen markierten Konjugate gebildet werden.

Spezifische Bindungsuntersuchungen sind technisch stark

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weiterentwickelt worden von dem ursprünglichen kompetitiven Bindungs-Radioimmuno-Test (Radioimmunoassay RIA) bei dem ein Radioisotop-markiertes Antigen kompetitiv mit einem Antigen in einer Versuchsprobe bei der Bindung an einen spezifischen Antikörper ist. In der RIA-Technik wird eine Antigenprobe quantitativ bestimmt, indem man das Verhältnis der Radioaktivität bestimmt, die in dem Antikörper durch Bindung an das radiomarkierte Antigen (der j gebundenen Spezies des markierten Antigens) vorliegt, zu der Radioaktivität, die unassoziiert vom Antikörper (der freien Spezies) vorliegt, und dann das Verhältnis mit einer Standardkurve vergleicht. Ein genauer Oberblick über die RIA-Technik findet sich bei Skelly et al in Clin. Chem. 19:146 (1973). Gemäss der Definition basiert RIA auf der Bindung von spezifischen Antikörpern an ein Antigen oder Hapten, jedoch sind radiomarkierte Bindungs-Analyse-Methoden entwickelt worden, die auf anderen spezifischen Bindungs-Wechselwirkungen beruhen, z.B. zwischen Hormonen und deren Bindungsproteinen.

Ausgehend von radiomarkierten Bindungs-Untersuchungsmethoden wurden nicht-radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden entwickelt, bei denen markierte Substanzen, wie Enzyme, verwendet werden (US-PS 3 654 090 und 3 817 837). In den deutschen Offenlegungsschriften 26 18 419 und 26 18 511 werden verbesserte nicht-radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden beschrieben, bei denen ganz einmalige Markierungssubstanzen, einschliesslich Coenzyme, cyclische Reaktanten, abspaltbare fluoreszente Enzymsubstrate und chemilumineszente Moleküle verwendet werden. Die chemilumineszente Markierung besteht aus einem organischen Molekül, das unter Ausbildung von Licht eine chemische Strukturveränderung erfährt.

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Spezifische Beispiele für als chemilumineszente Markierungen geeignete Substanzen finden sich in der DE-OS 26 18 511. Solche Verbindungen sind z.B. Luminol, Isoluminol, Pyrogallol und Luciferin. Insbesondere wird ein Beispiel in der DE-OS 26 18 511(und in Anal. Chera. 48:1933 (1976)) gezeigt, bei dem ein Isoluminol-markiertes Konjugat, bei welchem das Isoluminol durch seine Aminofunktion mittels einer 2-Hydroxypropylen-Brücke an den Liganden Biotin gebunden ist. Das Isoluminol-markierte Konjugat wird in dem Bindungsversuch durch Messen des entweder in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase oder von Kaliumsuperoxid produzierten Lichtes überwacht. Qiemilumineszente Phthalhydrazid-markierte Konjugate, bei denen ein Aminophthalhydrazid durch die Aminofunktion über eine 2-Hydroxyalkylen-Brücke an einen Liganden gekuppelt sind, werden in der US-Patentanmeldung gleichen Datums mit dem Titel "Chemilumineszent-markierte Konjugate und deren Verwendung in spezifischen Bindungsuntersuchungen" (Docket 11824) der Anmelderin beschrieben.

Die Effizienz von Aminophthalhydraziden als chemiluminiszente Markierungen ist nun dadurch verbessert worden, dass man sie über die Aminofunktion mit einer unsubstituierten geradkettigen Alkylenbrücke kuppelte. Die 'markierten Konjugate der vorliegenden Erfindung haben die Formel

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ORIGINAL INSPECTED

12 2

worin einer der Reste R und R , vorzugsweise R , Wasser-

3 4 3

stoff und der andere -NR R bedeuten, R Wasserstoff oder eine geradkettige Alky!kette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Äthyl, und R

L(CO)-NH-(CH₂-)—

bedeutet, worin η = 2 - 8, vorzugsweise 4 oder 6, ist und L(CO)-einen spezifisch bindungsfähigen Liganden oder ein Bindungsanalog davon, gebunden über eine Amidbindung, darstellt.

Die vorliegende chemilumineszenten Phthalhydrazid-markierten Konjugate werden in !spezifischen Bindungsversuchen zum Nachweis des Linganden oder eines Bindungspartners davon verwendet. Die markeirten Konjugate werden in.der-Bin-■ dungsuntersuchungsmethode (binding assay) hinsichtlich ihres Verhaltens überwacht, indem man die markierten Konjugate oxidiert und das erzeugte Licht entweder als gesamtes erzeugtes Licht oder als Peak-Lichtintensität misst. Bei einem spezifischen Bindungsversuch zum Nachweis eines Haptens in einem flüssigen Medium kann man diese Untersuchung z.B. ausführen, indem man eine Probe des flüssigen Mediums mit einem Antikörper für das Hapten und mit einem markierten Konjugat der vorliegenden Erfindung, bei dem das Hapten oder ein Bindungsanalog davon

-1ο-

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mit der chemilumineszenten Gruppierung markiert ist, inkubiert. Während der Inkubierung steht jegliches Hapten, das in dem flüssigen Medium vorliegt, im Wettbewerb mit dem markierten Konjugat, hinsichtlich der Bindung an den Antikörper. Anschliessend bestimmt man die Menge des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies im Vergleich zu der freien Spezies (wobei diese Menge in umgekehrter Funktion zu der Menge des Haptens in der zu untersuchenden Flüssigkeit steht) und diese Bestimmung (d.h. Überwachung) erfolgt entweder in homogener Weise, wenn der Chemilumineszenz-Charakter des markierten Konjugats in der freien Spezies unterschiedlich ist gegenüber der gebundenen Spezies, oder die Bestimmung erfolgt in heterogener Weise, wenn in beiden Spezies dieser Charakter im wesentlichen gleich ist. In der homogenen Versuchsanordnung wird die nicht getrennte Reaktionsmischung, die beide Spezies des markierten Konjugats enthält, mit einem geeigneten Oxidationssystem für die chemilumineszente Markierung kombiniert und das gebildete Licht wird gemessen. Bei der heterogenen Versuchsanordnung wird die gebundene von der ungebundenen Spezies in üblicher Weise abgetrennt, das Oxidationssystem wird mit einer Spezies kombiniert und das gebildete Licht wird gemessen.

Die überwachbare chemilumineszente Reaktion kann wie folgt beschrieben werden:

Oxidations- £ ^COOH system

" + hv"

0OH

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worin h\> die emittierte elektromagnetische Strahlung bedeutet .

Brauchbare Oxidationssysteme schliessen Wasserstoffperoxid in Kombination mit einem der nachfolgenden Katalysatoren, Peroxidase (insbesondere Mikroperoxidase), Katalase, Deutero— hämin, Hämatin oder Ferricyanidionen; Hypochloritionen kombiniert mit Kobaltionen; Persulfationen; Kaliumsuperoxid; Perjodationen; Hypoxanthin kombiniert mit Xanthinoxidase oder Kalium-t-butoxid, ein.

Die chemilumineszent markierten Konjugate können in allen üblichen homogenen oder heterogenen Bindungs-Untersuchungsmethoden, einschliesslich den kompetitiven Bindungsmethoden, Sequenz-Sättigungsmethoden, Direkt-Bindungsmethoden und "Sandwich"-Bindungsmethoden angewendet werden. Zum Stand der Technik über die verschiedenen Bindungs-Untersuchungsverfahren wird auf die schon erwähnten DE-OSen 26 18 419 und 26 18 511 verwiesen.

Die hier verwendeten Begriffe haben, wenn nicht anders angegeben, folgende Bedeutung: "spezifisch bindungsfähiger Ligand" ist eine organische Substanz von analytischem Interesse, für die ein spezifischer Bindungspartner vorliegt; "spezifischer Bindungspartner des Liganden" ist die Substanz, welche eine nicht-kovalente Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluss von anderen Substanzen hat; und "Bindungsanalog des Liganden" ist eine organische Substanz, die sich in ihrer chemischen Struktur von dem Liganden unterscheidet, aber sich im wesentlichen genauso" wie der Ligand hinsichtlich der Bindungsaffinität an den spezifischen Bindungspartner des Liganden verhält.

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ORIGINAL INSPECTED

Der spezifische bindungsfähige Ligand oder dessen 7inalog in den vorliegenden markierten Konjugaten ist hinsichtlich seiner chemischen Art im allgemeinen ein Protein, Polypeptid, Peptid, Kohlenwasserstoff. Glycoproteine Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für die ein spezifischer Bindungspartner erhätlich ist. Funktionell ausgedrückt ist der Lingand im allgemeinen ein Antigen oder ein Antikörper dazu, ein Hapten oder ein Antikörper dazu, oder ein Hormon, Vitamin, ein Arzneimittel oder ein Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür. Meistens ist der Lingand ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4.000.000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper, oder ist ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500.

Die vorliegenden markierten Konjugate werden im allgemeinen hergestellt, indem man ein Peptid- oder Amidkupplung zwischen (1) einem Aminoderivat eines chemilumineszenten Aminophthalhydrazids (z.B. Luminol oderlsoluminol) und (2) entweder dem Liganden, falls dieser eine Carbonsäurefunktion enthält, oder einem Bindungsanalog des Linganden (d.h. einem Derivat des Linganden), welcher die gewünschte Carbonsäurefunktion enthält, herstellt. Solche Kondensationsreaktionen können durch Umsetzung des Aminoderivates der Markierung direkt mit dem Carbonsäure enthaltenden Liganden oder dem Analog des Liganden unter Anwendung üblicher Peptid-Kondensationsreaktionen durchgeführt werden, z.B. Carbodiimid-reaktion (Science 144:1344 (1964)), der Mischanhydridreaktion (Erlanger et... al, Methods in Immunology and Immunochemistry, herausgegeben von Williams und Chase, Academic Press (New York 1967) S. 149), und den Säureazid- und Aktivesterreaktionen

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(Kopple, Peptides and Amino Acids, W.A. Benjamin, Inc. (New York 1966)). Ein allgemeiner Überblick hierzu findet sich in Clin. Chem. 22/726 (1976).

Selbstverständlich können andere bekannte Verfahren zum Kuppeln des Liganden oder eines Derivates davon an das Aminoderivat der Markierung angewendet werden. Insbesondere können übliche bifunktionelle Kupplungsmittel zum Kuppeln eines Liganden oder dessen Derivates, enthaltend eine Carbonsäure oder eine Aminogruppe, an das Aminoderivat der Markierung verwendet werden. Zum Beispiel können Amin-Amin-Kupplungsmittel, wie Bis-isocyanate, Bis—imidoester und Glutaraldehyd (Immunochem. 6:53 (1969)) zum Kuppeln eines Liganden oder eines Derivates davon, enthaltend eine Aminogruppe , an das Aminoderivat der Markierung verwendet werden. Es sind auch geeignete Kupplungsreaktionen bekannt, bei denen eine Brückengruppe zum Kuppeln eines Amins (z.B. des Aminoderivates der Markierung) an eine Carbonsäure (z.B. den Liganden oder dessen Derivat) verwendet wird. Kupplungsreaktionen dieser Art werden ausführlich In der Literatur beschrieben und zwar beispielsweise in der schon erwähnten Monografie von Koppel, in Lowe & Dean, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons (New York 1974).

Solche Kupplungsverfahren sind äquivalent zu den vorher erwähnten Peptid-Kondensationsreaktionen bei der Herstellung geeigneter markierter Konjugate. Die Wahl des Kupplungsverfahrens hängt von den für die Kupplung verfügbaren Funktionalitäten in dem Liganden oder dessen Analog zum Kuppeln an das Markierungsderivat und von der Länge der gewünschten Brückengruppe ab. In allen Fällen besteht das erhaltene markierte Konjugat aus dem markierten Derivat

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gebunden an den Rest des Konjugates über eine Amidbindung. Ein solcher Rest des Konjugats wird als Rest eines Bindungsanalog des Liganden angesehen, sofern der Ligand nicht selbst direkt an das Markierungsderivat gekuppelt ist. In der Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet die Abkürzung L(CO)- den Liganden oder ein Bindungsanalog davon, gekuppelt über eine Amidbindung, worin ein solches Analog ein Derivat des durch Peptidkondensation an das Markierungsderivat gekuppelten Liganden sein kann oder der Ligand oder ein Derivat davon sein kann, die über eine Brückengruppe, die durch Kupplung des Liganden oder dessen Derivates an das Markierungsderivat mit einem bifunktionellen Kupplungsmittel eingeschoben wurden, gebunden sein können.

Die Herstellung der vorliegenden chemilumineszent markierten Konjugate verläuft nach der folgenden allgemeinen Synthesesequenz:

(D

Das Ausgangsmaterial für die Synthese ist 3- oder 4-Amino-N-methylphthalimid (I), wobei die 3-Aminoverbindung (Wang et al, JACS 72:4487 (195o) und Flitsch, Chem. Ber. 94:2494 " (1961)) zur Herstellung von auf Luminol basierenden markierten Konjugaten verwendet wird, und die 4-Aminoverbindung"' (Putsch, Chem. Ber.· 94/2494(1961)) zur Herstellung von markierten Konjugaten auf Isoluminolbasis verwendet wird.

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Die Umsetzung von Phthalimid (I) mit N- (cU-bromoalkyl)-phthalimid (II) (erhältlich von der Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA, siehe auch Derscherl und Weingarten, Justus Liebig's Annalen der Chemie 574/131(1951))

η = 2-8

ergibt das Bisphthalimid-Zwischenprodukt (III)

(II)

-(CH, 3—NH 2 η

-CH,

(III)

Durch Alkylierung der Aminogruppe des Bisphthalimid-Zwischenproduktes (III) mittels Umsetzung mit einem Dialkylsulfat (IV) (Rodd, Chemistry of Carbon Compounds, Bd. 1, Elsevier Publ. Co. (New York 1951) S. 337).

(IV)

m = 0 - 3

-16 -

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erhält man das N-alkylierte Derivat (V)

n=2-8

R¹

N-CH₃

(V)

worin R¹ eine geradkettige Alkylkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.

Behandelt man das Bisphthalimid-Zwischenprodukt (III) oder dessen N-alkyliertes Derivat (V) mit Hydrazin, so erhält man das Aminohydrazid (VI)

(VI)

m=2-8

worin R Wasserstoff oder eine geradkettige Alkylkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Durch Kondensation des Aminohydrozids (VI) mit (a) dem zu markierenden Liganden, sofern dieser eine Carboxylsäurefunktion enthält, (b) einem Bindungsanalog des Liganden,

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darstellt/ oder (c) dem Liganden oder einem geeigneten Derivat des Liganden in Gegenwart eines bifunktionellen Kupplungsmittels, erhält man das chemilumineszent markierte Konjugat (VII)

(VII)

n=2-8 0

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat und L(CO-)-den spezifisch bindungsfähigen Liganden öder ein Bindungsanalog davon (durch Ableitung des Liganden und/oder Einführung einer Brücke mittels eines bifunktionellen Kupplungsmittels gebildet), gebunden über eine Amidbindung, bedeutet.

Andere Variationen von markierten Konjugaten, die auf der vorerwähnten Synthse beruhen, liegen auf der Hand. So kann man insbesondere verschiedene ringsubstituierte Amino-N-methyl-phthalimide als Ausgangsmaterialien unter Bildung von ringsubstituierten markierten Konjugaten, die im wesentlichen die gleichen qualitativen Eigenschaften haben, wie die nach dem vorstehend beschriebenen Reaktionsschema hergestellten Konjugate verwenden. Solche Konjugate werden als äquivalent angesehen und sind beispielsweise solche, bei denen ein, zwei oder mehr einfache Substituenten an einer verfügbaren Stelle des aromatischen Ringes eingeführt werden. Geeignete Substituenten sind, ohne dass dies begrenzend ist, z.B. Alkyl,- wie Methyl, Äthyl und Butyl, Halogen, wie Chlor und Brom, Nitro, Hydroxyl, Alkoxy, wie Methoxy und Äthoxy, und dergleichen.

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Wie in dem vorher angegebenen Syntheseschema gezeigt, haben die neuen Zwischenprodukte, die im Laufe der Herstellung der chemilumineszent markierten Konjugate erhalten werden, die folgenden allgemeinen Formeln (die Aminohydrazide (VI) entsprechen der Formel A unten und die Bisphthalimide (III) und (V) entsprechen der Formel B unten.

Formel A

CC C_x

worin einer der Reste R und R , vorzugsweise R , Wasser-

7 ft 7

stoff und der andere -NRR bedeutet, R Wasserstoff oder eine geradkettige Alkylkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,

vorzugsweise Äthyl, bedeutet und R

bedeutet, worin η = 2-8, vorzugsweise 4 oder 6 ist, und Formel B

worin einer der Reste R und R , vorzugsweise R , Wasserstoff

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-19-

1112 11

und der andere -NR R bedeutet, R Wasserstoff oder eine geradkettige Alkylkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen/ vor-

12

zugsweise Äthyl und R

bedeutet, worin η = 2-8, vorzugsweise 4 oder 6 ist.

Wie bereits festgestellt, ist der Ligand in dem markierten Konjugat oder dessen Bindungsanalog in dem markierten Konjugat in den meisten Fällen ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4.000.000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper; oder ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500. Nachfolgend werden verschiedene Kupplungsmethoden für solche Liganden und deren Analoge an das Aminoderivat (VI) der Markierung über eine Amidbindung beschrieben.

Polypeptide und Proteine

Typische und spezifische bindungsfähige Proteinliganden sind im allgemeinen Antikörper, insbesondere solche der IgG, IgM und IgA Klasse, z.B. Häpatitis B-Antikörper und antigenische Proteine, wie Insulin, chorionisches Gonodotropin _v (z.B. HCG), carcinoembrionisches Antigen (CEA),

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Myoglobin, Hämoglobin, follikelstimulierendes Hormon, humanes Wachstumshormon, thyroidstimulierendes'Hormon (TSH),. humanes Placentalactogen, Thyroxinbindungsglobulin (TBG), instrinsischer Faktor, Transcobalamin, Enzyme, wie alkalische Phosphatase und Milchsäuredehydrogenase, und hepatitisassoziierte Antigene, wie Hepatitis B-Oberflächenantigen (HB₅Ag), Hepatitis e-Antigen (HB_eAg) und Heptatis-Kernantigen (HB Ag). Typische Polypeptid-Liganden sind Angiotensin I und II, C-Peptid, Oxytocin, Vasopressin, Neurophysin, Gastrin, Secretin und Glucagon.

Da Liganden dieser, allgemeinen Kategorie als Peptide zahlreiche verfügbare Carbonsäure- und Aminogruppen aufweisen, kann die Kupplung des Aminoderivates der chemilumineszenten Markierung mittels üblicher Peptid-Kondensationsreaktionen erfolgen, wie durch eine Carbodiimid-Reaktion, der Mischanhydrid-Reaktion und dergleichen, wie sie bereits vorher erwähnt wurden, oder unter Verwendung von üblichen bifunktionellen Reagentien, die in der Lage sind, eine Carbonsäurefunktion oder eine Aminofunktion an einer Aminogruppe in dem Markierungsderivat zu bewirken, wie bereits erwähnt wurde. Allgemeine Hinweise bezüglich der Kupplung von Proteinen an primäre Amino oder Carbonsäuren wurden bereits vorher gegeben.

Haptene

Haptene stellen eine grosse Klasse organischer Substanzen dar, die eine immunochemische Reaktion in einem Gasttier nur dann entwickeln, wenn sie in Form eines immunogenen

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!Conjugates aus dem Hapten, gekuppelt an ein Trägermolekül, und zwar in den meisten Fällen einem Protein, wie Alimmin, injiziert werden. Die Kupplungsreaktionen zur Bildung der immunogenen Konjugate sind aus dem Stand der Technik bekannt und bestehen im allgemeinen aus der Kupplung eines Carbonsäure-Liganden oder eines Carbonsäurederivates des Liganden an eine verfügbare Aminogruppe des Proteinträgers unter Bildung einer Amidbindung. Solche bekannten Kupplungsreaktionen sind direkte Analoge zu der vorliegenden Bildung von markierten Konjugaten durch Kupplung von Carbonsäureliganden oder deren Bindungsanalogen an die Aminoderivate der chemilumineszenten Markierung.

Hapten-Liganden, die selbst Carbonsäurefunktionen aufweisen, mittels derer sie direkt an das Aminoderivat der Markierung gekuppelt werden können, sind z.B. Jodthyroninhormone, wie Thyroxin und Liothyronin, und auch andere Stoffe, wie Biotin, Valpronsäure, Folsäure und gewisse Prostaglandine. Es folgen typische Synthesewege zur Herstellung von Carbonsäure-Bindungsanalogen von Hapten-Liganden, die selbst keine verfügbaren Carbonsäurefunktionen enthalten, wodurch solche Analoge an das Aminoderivat der Markierung durch die vorerwähnte Peptid-Kondensationsreaktion oder eine bifunktionelle Kupplungsmittelreaktion gekuppelt werden kann (in der nachfolgenden Strukturformel bedeutet η eine ganze Zahl, gewöhnlich 1 bis 6).

Carbamazepin

Dibenz^b,f/azepin wird nacheinander mit Phosgen, einem CO-Aminoalkanol, und Jones-Reagens (Chromtrioxid in Schwefelsäure) nach dem Verfahren von Singh, gemäss US-PS 4 058

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behandelt, wobei man die folgende Reihe von Carbonsäuren erhält:

CONH-CCH₇ 3—COOH

i* Tit

Chinidin

Arbeitet man nach dem Verfahren von Cook et al, Pharmacologist 17:219 (1975), so wird Chinidin demethyliert und dann mit 5-Bromvalerat behandelt und anschliessend sauer hydrolysiert unter Bildung eines geeigneten Carbonsäurederivates.

Digoxin und Digitoxin

Das Aglycon des Herzglycosids wird mit Bernsteinsäureanhydrid und Pyridin nach dem Verfahren von Oliver et al, J. Clin. Invest. 47:1035 (1968) behandelt, wobei man folgende Verbindung erhält

Z S= H oder OH

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Theophyllin

Nach dem Verfahren von Cook et al. Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 33:497 (1976) wird 4,5-Diamino-1,3-dimethylpyrimidin-2,6-dion mit Glutarsäureanhydrid erhitzt, wobei man

Phenobarbital und Primidon

Natriumphenobarbital wird mit Methyl-5-bromovalerat erhitzt und das Produkt wird zu dem entsprechenden Säurederivat von Phenobarbital hydrolysiert (Cook et al, Quantitative Analytic Studies in Epilepsy, herausgegeben von Kelleway und Peterson, Raven Press (New York 1976), S. 39-58):

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Ö09886/066A

Um das Säurederivat von Primidon zu erhalten unter Verwendung der gleichen Methode von Cook et al wird 2-Thiophenbarbital analysiert, hydrolysiert und das Produkt mit Raney-Nickel behandelt, wobei man

erhält.

(CH₂ $j» COOH

Diphenylhydantoin

Nach dem Verfahren von Cook et al, Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 5:767 (1973) wird Natriumdiphenylhydantoin mit Methyl-5-bromovalerat umgesetzt und anschüessend sauer hydrolysiert, wobei man

erhält.

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Morphin

Freie Morphinbase wird mit Natrium-ß-chloracetat nach dem Verfahren von Spector et al, Science 168:1347 (1970) behandelt, wobei man ein geeignetes Carbonsäurederivat erhält.

Nikotin

Nach dem Verfahren von Langone et al, Biochem 12 (24): 5025 (1973) werden trans-HydroxymethyInikotin und Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt, wobei man

HOOC-^CH₂

erhält.

Androgene

Geeignete Carbonsäurederivate von Testosteron und Androstendion, die über einer der 1- oder 7-Stellungen des Steroidkerns verknüpft sind, erhält man nach dem Verfahren von Bauminger et al, J. Steroid Biochem. 5:739 (1974). Typische Testosteronderxvate sind

- 26

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1-Stellung

7-Stellung

9—COOH

Tl

östrogene

Geeignete Carbonsäurederivate von Östrogenen, z.B. Östron, Östradiol und Östriol, erhält man nach dem Verfahren von Bauminger et al. Ein typisches östronderivat ist

N-OCH₂-COOH

- 27= -

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Progesterone

Geeignete Carbonsäurederivate von Progesteron und dessen Metaboliten, die über eine der 3-, 6- oder 7-Stellungen im Steroidkern verknüpft sind, erhält man nach dem Verfahren von Bauminger et al. Ein typisches Beispiel hierfür sind

H,

HOOC-CH₂O-N

6-Stellung

f^H3 C=O

S-CH₂-COOH.

7-Stellung

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- 23 -

Die vorerwähnten Verfahren sind lediglich Beispiele für die vielen geeigneten Verfahren zur Herstellung von Carbonsäurederivaten von Haptenen., von analytischem Interesse. Die grundsätzlichen Verfahren zur Herstellung von Derivaten sind in Clin. Chem. 22:726 (1976) beschrieben und schliessen die Veresterung eines primären Alkohols mit Bernsteinsäureanhydrid (Abraham und Grover, Principles of Competitive Protein-Binding Assays, herausgegeben von Odell und Daughaday, J. B. Lippincott Co. (Philadelphia 1971), S. 140-'

157), die Bildung eines Oxims aus der Umsetzung einer Ketongruppe mit einem Carboxymethylhydroxylamin (J. Biol. Chem. 234:1090 (1959), die Einführung einer Carbonsäuregruppe in einen Phenolrest unter Verwendung von Chloracetat (Science 168:1347 (197O))und das Kuppeln an diazotierte p-Aminobenzoesäure in der in J. Biol Chem. 235:1051 (1960) beschriebenen Verfahrensweise ein.

Das hier erwähnte allgemeine Syntheseschema zur Herstellung der vorliegenden chemilumineszent markierten Konjugate wird nachfolgend anhand der Herstellung der markierten Thyroxin-Konjugate 6—{N-Äthy 1-11-/4- (thyroxinylamidojbutyl^-amino} -2 ,3-dihydrophthalazin-1 ,4-dion und 6-^N-Äthyl-N-76-thyroxinylamido) hexyJL.7 aminoj -2,3,dihydrophthalazin-1,4-dion erläutert. Die Reaktionsfolge für diese Synthesen werden in den folgenden Tabellen 1 und 2 gezeigt.

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Tabelle 1

CH₀CH-COOH NH₀

CF₃COOH

_oCH-COOH ²I
NHCCF^

Carbonyl diimidazol

HO

O CH₂CH-C-

NHCCF, J ^ό

(3)

909886/0664 - 3o -

- 3ο -

Tabelle

N—6CH_?-3—Br +

H₂N.

(S),η=6

-f CH₂^- NH

-CH,

(C₂H₅O)₂SO₂

N-(CH₂)_n-N

C₉H₁. /25

η=4

-CH,

NH₂NH₂

909*86/0664 . - 31 -

Fortsetzung Tabelle 2 A. Herstellung des markierten Konjugates

Eine Lösung aus 2O g (25,6 mmol) L-Thyroxin in 240 ml trockenem Äthylacetat, enthaltend 46 ml Trifluoressigsäure und 7,6 ml Trifluoressigsäureanhydrid, wurde 1 Stunde bei 0 C gerührt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur und Zugabe von 200 ml H₂O bildete sich eine Suspension, die mit Natriumchlorid gesättigt wurde. Die organische
Phase der Mischung wurde abgetrennt, mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei man 21,3 g N-geschütztes Thyroxinderivat (2) erhielt. Eine Probe wurde aus Äther-Pentan umkristallisiert, wobei man feine Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 235°C (Zersetzung) erhielt.

Analyse für C	C	¹IO	F₃J₄N	H	1	/1	5	N	1	,60
Berechnet:		23	/39		1	/1	2		1	,56
Gefunden:	23	,23

IR-Spektrum (KCl): 1700 cm"¹ (Carbonyl)

optische Drating

&7

- -14/97° (c 1,0, Dimethylsulfoxid)

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- 32- -■

im

Eine Mischung aus 42 g (o,15 Mol) N-(4-Bromobutyl)phthalimid (4), 51,5 g (o,29 Mol) 4-Amino-N-methylphthalimid (6)
(Flitsch, Chem. Ber. 94:2494 (1961)) und 3oo ml Dimethylformamid wurde einen Tag unter Rückfluss gehalten. Beim
Abkühlen bildete sich ein gelber Niederschlag, der gesammelt und getrocknet wurde, wobei man 38,5 g Bisphthalimid (7)
erhielt. Eine Probe wurde aus wässriger Essigsäure umkristallisiert, wobei man feine gelbe Nadeln,Schmelzpunkt 217 - 218°C erhielt.

Analyse ür C₂₁H₁₉N₃O₄:

Berechnet: C 66,83 H 5,o7 N 11,14

Gefunden: 66,46 4,99 11,61

NrM§thYl-4₌{6-N₌/TN-Ehthalimidg)^

Diese Verbindung wird in gleicher Weise wie (7) durch die
Umsetzung von (6) und N-(-Bromohexy1)phthalimid (5) erhalten. Beim Umkristallisieren aus wässriger Essigsäure erhält man
Bisphthalimid (8) als feine gelbe Nadeln, Schmelzpunkt
178 - 197°C.

Analyse für C₂₃H₃₃N₃O₄:

Berechnet: C 68,13 H 5,72 N Ίο,37
Gefunden: 68,22 5,82 1o,36

Eine Mischung aus 38 g (o,1 Mol) Bisphthalimid (7) und loo ml

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- 33 -

Diäthylsulfat wurde auf 16O°C während "45 Minuten erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt und zu 3 1 Eiswasser gegossen. Der gebildete gelbe Niederschlag wurde aus wässri ger Essigsäure umkristallisiert, wobei man 29 g des N-Äthyl Derivates (9) in Form von feinen gelben Nadeln erhielt, Schmelzpunkt 164 - 165°C.

Analyse fur C	68	H₂₃N.	3°4^:	5	,72	N	Ίο,	37
Berechnet: C	68	,13	H	5	,7o		1o,	56
Gefunden:	,ο1

Diese Verbindung wird in gleicher Weise wie (9) durch Umsetzung von (8) hergestellt, wobei man feine gelbe Nadeln aus wässriger Essigsäure mit dem Schmelzpunkt von 135 C erhält.

Analyse für: C	69	^H27^N:	5°4^:	6	,28	N	9	,69
Berechnet: C	68	,26	H	6	,o4		9	,48
Gefunden:	,9o

Eine Mischung aus 29 g (o,o72 Mol) N-Äthyl-bis-phthalimid (9), 80 ml 95 %-iges Hydrazin und 3oo ml Äthanol wurde 2 h unter Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und dann über Nacht stehen gelassen. Beim Abdampfen unter vermindertem Druck erhielt man einen schwach gelben Feststoff, der 8 h bei Ho C unter einem Druck von

- 34 -

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von o,1 ininHg getrocknet wurde. Der Feststoff in einer Menge von 31,5 g wurde 9o Minuten in 15o ml 1o %-ige.r Chlorwasserstoffsäure gerührt und dann filtriert. Nach dem Neutralisieren des Filtrates mit Kaliumhydroxid fiel ein schwerer Niederschlag aus, der filtriert, getrocknet und aus wässrigem Dimethylformamid umkristallisiert wurde, und 6,5 g des Ämino-phthalazindions (11) in Form eines weissen Pulvers, Schmelzpunkt 255-257°C, ergab.

Analyse für: ^ci4^H2o^4^2^:

Berechnet: C 60,85 H 7,3o N 2o,28 Gefunden: 60,67 7,3o 2o,18

Die Effizienz des Aminoderivates (11) der Markierung in einer chemilumineszenten Reaktion und die Nachweisgrenze eines solchen Derivates wurde wie folgt bestimmt:

Zur Bestimmung der Effizienz wurde das Markierungsderivat und Luminol (5-Amino-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion) individuell mit verschiedenen Niveaus im pikomolaren Bereich oxidiert und verglichen mit den Peak-Lichtintensitäten mittels einer grafischen Aufzeichnung. Lineare Anteile der entstandenen Kurven ermöglichten eine Berechnung der Veränderung der Peak-Lichtintensität pro Konzentrationseinheit für das Markierungsderivat und für Luminol. Die Effizienz des Markierungsderivates wurde als Prozentsatz der Luminol-gebildeten Steigung ausgedrückt.

Reaktionsmischungen (15o,ul) der folgenden Zusammensetzung wurden in 6 χ 5o mm Reagenzgläser gefüllt und in einen Dupont 76o Luminiszenz-Biometer mit einer Empfindlichkeitseinstellung von 82o gegeben. Die Mischungen hatten folgende Zusammensetzung:

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5o mMol Natriumhydroxid, o,o7 ,uMol Hämatin und entweder das Aminoderivat der Markierung oder Luminol in verschiedenen Konzentrationen im pikomolaren Bereich (verdünnt mit H₂O aus einer Vorratslösung von 1 mMol o,1 m Natriumcarbonat, pH 1o,5). Jede Mischung wurde 1o Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurden 9o mMol Wasserstoffperoxid zugegeben, um die chemilumineszente Reaktion einzuleiten, Die Peak-Lichtintensitätswerte wurden aus den Instrumentenablesungen aufgezeichnet. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und das Mittel genommen. Die Effizienz des Markierungsderivates (11) betrug 84 %.

Die Nachweisgrenze wurde als Konzentration des Markierungsderivates bestimmt, welche eine Peak-Lichtintensität vom 1,5-fachen Wert der Hintergrundchemilumineszenz in dem Reaktionsgemisch ergab. Die Nachweisgrenze für das Markierungsderivat (11) betrug 2 pM.

Diese Verbindung wurde hergestellt aus N-Äthyl-bisphthalimid (To) in gleicher Weise wie (11). Beim Umkristalli sieren aus Wasser erhielt man in 53 %-iger Ausbeute Aminophthalazindion (12) als weisses Pulver, Schmelzpunkt 17o C.

Analyse für (	I O	24^N<	1°2^:	7	,95	N	1	8,	41
Berechnet: C	63,	13	H	8	,24		1	8,	74
Gefunden:	62,	82

Die Effizienz des Aminoderivates (12) der Markierung und dessen Nachweisgrenze wurde in gleicher Weise wie vorher für das markierte Derivat (11) bestimmt mit der Ausnahme,

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dass die Reaktionsmischung anstelle von Hämatin o,27 ,uMol Mikroperoxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis', Missouri, USA) enthielt, sowie auch 57,5 mMol Barbitalpuffer, eingestellt auf pH 8,6, und dass das Wasserstoffperoxidreagens in 1o mMol Tris-HCl-Puffer /_ Tris- (hydroxymethyl} aminomethan-hydrochlorid/, pH 7,4 enthalten war. Die Effizienz betrug 78 % und die Nachweisgrenze 2 pM.

amino--g^S^

Eine Mischung aus 4,36 g (5 mMol) N-Trifluoracety!thyroxin (2), ο,8 g (5mMol) Carbonyldiimidazol und 5o ml Tetrahydrofuran wurde 1o Minuten unter Rückfluss gehalten. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei ein fester Rückstand des Imidazolids (3) zurückblieb. Dieses Zwischenprodukt wurde nicht isoliert sondern direkt mit einer Suspension aus 1,38 g (5 mMol) des Aminoderivates (11) vereint. Nach zweitägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Hochvakuum entfernt und der feste Rückstand wurde mit 8o ml 1o %-iger Chlorwasserstoffsäure gewaschen.

Die Trifluoracetyl-Blockierungsgruppe wurde durch Auflösen von 2,o7 g des Rohproduktes in 35 ml o,5 m Natriumhydroxid entfernt. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde die Lösung auf pH 5,ο mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Der gebildete Niederschlag wurde mit ^O gewaschen und getrocknet. Der trockene Feststoff wurde über eine Säule aus 2oo g Kieselgel 6o (E. Merk, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) mit einem 3:3 Volumen zu Volumen Mischung— aus Äthanol und 1 m Triäthylammonium-bicarbonat eluiert, wobei 1o ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen

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" ³⁷ " . 2323048

49 bis 65 wurden vereint und eingedampft,, wobei man 68o mg eines cremefarbenen Feststoffes erhielt. Der Feststoff wurde in 5o ml 5o %-igem Dimethylformamid aufgenommen und durch Zugabe von I^O wieder ausgefällt. Nach dem Trocknen des Feststoffes wurden 2oo mg des markierten Konjugates (13) als weisses Pulver, Schmelzpunkt annähernd 2oo°C (Zersetzung) erhalten.

Analyse für: ^C29^H29^I4^N5°5^:

Berechnet: C 33,64 H 2,82 Ι·49,ο4 Ν 6,77 Gefunden: 34,o2 2,97 48,55 6,65

Diese Verbindung wurde aus dem Aminoderivat (12) in gleicher Weise wie (13) hergestellt, wobei man 2oo mg des markierten Konjugates (14) in Form eines weissen Pulvers, Schmelzpunkt ungefähr 2oo C (Zersetzung) erhielt.

Analyse für: ^i^^^^Oci

Berechnet: C 35,o2 H 3,13 N 6,59 Gefunden: 33,37 3,26 6,to

B. Bindungstest für Thyroxin

5 Pikomole des markierten Konjugates (13) (das markierte... Konjugat (14) kann ebenso verwendet werden) in 1oo Microlitern o,1 η Natriumhydroxid wurden auf jede von einer Reihe von kleinen Kolonnen, die mit Sephadex G-25 gefüllt waren, gegeben.

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Die Kolonnen hatten jeweils ein Bettvolumen von 1 ml und waren vorgewaschen worden mit nacheinander 4 ml Volumina 7 %-ige Essigsäure (dreimal), H₃O und o,1 m Natriumhydroxid (dreimal) . Dann wurde 1 ml o, 1m Natriumhydroxid oben auf jede Kolonne aufgegeben und in das Gel einsickern gelassen, und anschliessend wurden auf jede Säule 2oo,ul einer Lösung gegeben, die unterschiedliche Mengen an Thyroxin-Standards in 1o % Serum (zuvor thyroxinfrei durch Aktivkohlebehandlung gemacht) und 9o mMol Natriumhydroxid enthielt. Jede Kolonne wurde mit 4 ml eines 75 mMol Barbital-Puffers (pH 8,6) gewaschen, und danach wurden 3oo,ul einer Zubereitung eines Antikörpers für Thyroxin zu jeder Kolonne gegeben. Nach einstündiger Inkubierung wurde das Antikörper-gebundene, markierte Konjugat aus den Säulen mittels 0,8 ml des Barbital-Puffers herausgewaschen. Ein Aliquot (95 ,ul) eines jeden Abflusses wurde mit 55«ul einer 2:3,5 Mischung (v:v) von 2 ,uMol Mikroperoxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) in dem Barbital-Puffer und o,2 η Natriumhydroxid gemischt. Nach 1o-minütiger Inkubierung wurden "lOyUl von 9o mMol Wasserstoffperoxid zu jeder Mischung zum Einleiten der Chemilumineszenz-Reaktion gegeben. Das gebildete Licht wurde in einem Dupont 760 Biometer gemessen und in Peak-Lichtintensitätseinheiten aus den Instrumentenablesungen aufgezeichnet. Jede Reaktion wurde dreifach durchgeführt und der Durchschnitt wurde genommen.

Die Beziehung zwischen der Thyroxin-Konzentration und der Peak-Lichtintensität wird in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt.

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³⁹ V 2923048

Tabelle 3

Thyroxinkonzentration Peak-Lichtintensität

(nM)

25 48,6

5o 46,4

loo 39,2

15o 34,ο

2oo 27,8

28 Serumproben, die unbekannte Konzentrationen enthielten, wurden hergestellt und unter Anwendung der vorerwähnten chemilumineszenz markierten Bindungsuntersuchungsmethode (unter Verwendung der aus der Aufzeichnung der Zahlenwerte

von Tabelle 3 erhaltenen Standardkurve) und unter Verwenig dung des im Handel erhältlichen TETRALUTE -Thyroxin-Radioassay-Sets (Arnes Company Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana 46515, USA) untersucht. Die erhaltene Korrelationskurve, welche die Chemilumineszenz-Assay-Werte in Radioassay-Werte gegenüberstellte, hatte eine Gleichung von y = o,95x + 5,9 nM mit einem Korrelationskoeffizienten von o,91 und einem Veränderungskoeffizienten von 13,1 % für die Chemilumineszenz-Untersuchung.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäss markierten Konjugate geeignet sind, in Bindungsversuchen zur Bestimmung von Liganden in flüssigen Medien verwendet zu werden.

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Claims

PATENTANWÄLTE

DR. !NG. E. HOFFMANN (1930-197(5) · DIPL.-tNG.W.EITLE · DR. RER. NAT.K.HOFFMANN - DIPt.-ING.W. IEHN

D1PL.-1NG. K. FOCHSLE - DR. RER. NAT. B.HANSEN ARABEUASTRASSE 4 (STERNHAUS) - D-8000 MD NCHEN 81 · TElEFON (089) 911087 . TEtEX 05-29519 (PATH E)

32-31? o/fg

Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana / USA

Chemilumineszente Phthalhydrazid-markierte Konjugate

Patentansprüche

^₅, Ein chemiliimineszentes Phthalhydrazid-markiertes

Konjugat der allgemeinen Formel

1 2

worin einer der Reste R und R Wasserstoff und der andere

3 4 3

-NR R bedeutet, R Wasserstoff oder eine geradkettige Alkyl-

4 kette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R

L (COf-NH-(CH_O·)-

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bedeutet, worin η = 2 - 8 und L (CO}- einen spezifisch bindungsfähigen Liganden oder ein Bindungsanalog davon, gebunden über
eine Amidbindung, bedeuten.
2. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Antigen oder Antikörper dazu, ein Hapten oder ein
Antikörper dazu oder ein Hormon, Vitamin, Arzneimittel, ein
Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür ist.
3. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein antigenisches Polypeptid oder Protein, ein Hapten
oder ein Antikörper ist.
4. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein antigenisches Polypeptid oder Protein mit einem
Molekulargewicht zwischen 1.ooo und 4.000.000 ist.
5. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Antikörper ist.
6. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 1oo und
1.5oo ist.
7. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Iodothyroninhormon ist.

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8. Markiertes Konjugat geinäss Anspruch 7, dadurch g e kennzeichnet, dass das Hormon Thyroxin ist.
9. Markiertes Konjugat gemäss einem der Ansprüche 1 bis

13 4 6, dadurch gekennzeichnet , dass R -NR R
10. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 9, worin η = 4 ist.
11. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1o, worin R Äthyl ist.
12. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 9, worin η =6 ist.
13. Markiertes Konjugat geinäss Anspruch 12, worin R

Äthyl ist. . .
14. 6-{ν-α thyl-N-,/4- (thy roxiny lamido) butyl/aminoj -2,3-dihydrophthalazin-1,4,dion.
15. 6-£N-iithyl-N-/6- (thyroxinylamido) hexyJL/aminoj-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion.
16. Eine Verbindung der allgemeinen Formel

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worin einer der Reste R und R Wasserstoff und der andere -NR R bedeutet, R Wasserstoff oder eine geradkettige Alkylkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, und R

bedeutet, worin η = 2-8 ist.

5 7 8
17. Verbindung gemäss Anspruch 16, worin R -NR R ist.
18. Verbindung gemäss Anspruch 17, worin η = 4 ist.
19. Verbindung gemäss Anspruch 18, worin R Äthyl ist
20. Verbindung gemäss Anspruch 17, worin η = 6 ist.
21. Verbindung gemäss Anspruch 2o, worin R Äthyl ist
22. Verbindung der allgemeinen Formel

9 1 ο
worin einer der Reste R und R Wasserstoff und der andere

1112 12

-NR R bedeutet, R Wasserstoff oder eine geradkettige -.

12 Alkylkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und R

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bedeutet, worin η = 2-8 ist.

9 1112
23. Verbindung gemäss Anspruch 22, worin R -NR R ist.
24. Verbindung gemäss Anspruch 23, worin η = 4 ist.
25. Verbindung gemäss Anspruch 24, worin R Äthylen ist.
26. Verbindung gemäss Anspruch 23, worin η = 6 ist.
27. Verbindung gemäss Anspruch 26, worin R Äthyl ist.

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