DE2921782C2 - - Google Patents
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Description
Spezifische Bindungsuntersuchungen sind technisch stark
weiterentwickelt worden von dem ursprünglichen kompetitiven
Bindungs-Radioimmuno-Test (Radioimmunoassay RIA) bei
dem ein Radioisotop-markiertes Antigen kompetitiv mit
einem Antigen in einer Versuchsprobe bei der Bindung an
einen spezifischen Antikörper ist. In der RIA-Technik wird
eine Antigenprobe quantitativ bestimmt, indem man das Verhältnis
der Radioaktivität bestimmt, die in dem Antikörper
durch Bindung an das radiomarkierte Antigen (der gebundenen
Spezies des markierten Antigens) vorliegt, zu der
Radioaktivität, die unassoziiert vom Antikörper (der
freien Spezies) vorliegt, und daß das Verhältnis mit
einer Standardkurve vergleicht. Ein genauer Überblick über
die RIA-Technik findet sich bei Skelly et al in Clin.
Chem. 19 : 146 (1973). Gemäß der Definition basiert RIA auf
der Bindung von spezifischen Antikörpern an ein Antigen oder
Hapten, jedoch sind radiomarkierte Bindungs-Analyse-Methoden
entwickelt worden, die auf anderen spezifischen Bindungs-Wechsel
wirkungen beruhen, z. B. zwischen Hormonen und deren
Bindungsproteinen.
Ausgehend von radiomarkierten Bindungs-Untersuchungsmethoden
wurden nicht-radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden
entwickelt, bei denen markierte Substanzen, wie Enzyme,
verwendet werden (US-PS 36 54 090 und 38 17 837). In der
DE-OS 26 18 419 und 26 18 511 werden verbesserte nicht-
radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden beschrieben,
bei denen ganz einmalige Markierungssubstanzen, einschließlich
Coenzyme, cyclische Reaktanten, abspaltbare fluoreszente
Enzymsubstrate und chemilumineszente Moleküle verwendet
werden. Die chemilumineszente Markierung besteht aus einem
organischen Molekül, das unter Ausbildung von Licht eine
chemische Strukturveränderung erfährt.
Spezifische Beispiele für als chemilumineszente Markierungen
geeignete Substanzen finden sich in der DE-OS
26 18 511. Solche Verbindungen sind z. B. Luminol, Iso
luminol, Pyrogallol und Luciferin. Insbesondere wird ein
Beispiel in der DE-OS 26 18 511 (und in Anal. Chem. 48 : 1933
(1976)) gezeigt, bei dem ein Isoluminol-markiertes Konjugat,
bei welchem das Isoluminol durch seine Aminofunktion
mittels einer 2-Hydroxypropylen-Brücke an den Liganden
Biotin gebunden ist. Das Isoluminol-markierte Konjugat
wird in dem Bindungsversuch durch Messen des entweder in
Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase oder von
Kaliumsuperoxid produzierten Lichtes überwacht. Chemilumineszente
Phthalhydrazid-markierte Konjugate, bei denen
ein Aminophthalhydrazid durch die Aminofunktion über eine
2-Hydroxyalkylen-Brücke an einen Liganden gekuppelt sind,
werden in der DE-OS 29 21 781 der Anmelderin beschrieben.
Die Effizienz von Aminophthalhydraziden als chemilumineszente
Markierungen wurde dadurch verbessert, daß man sie über
die Aminofunktion mit einer geradkettigen Niedrigalkylenbrücke
kuppeln konnte.
Die in Liebigs Annalen der Chemie (1974), Seiten 789-808
beschriebenen sind ähnliche Verbindungen wie die erfindungsgemäßen,
weisen aber eine wesentlich geringere Chemilumineszenz
auf.
Die Erfindung betrifft nun Verbindungen der allgemeinen
Formel
worin R einen geradkettigen Alkylrest mit 1 bis 4
Kohlenstoffatomen und n=2 bis 6 bedeutet, wobei
n=4 bevorzugt ist. Als besonders bevorzugt gilt
die Verbindung 7-N-Äthyl-N-(4-aminobutyl)-aminonaphthalin-1,2-carbon
säure-hydrazid.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung dieser
Verbindungen zur Chemilumineszenzmarkierung.
Ein unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen
herstellbares Konjugat hat die Formel
worin R ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Äthyl, n=2 bis 6, vorzugsweise
4, und L(CO ein spezifisch bindungsfähiger Ligand
oder ein Bindungsanalog dazu, gebunden durch eine Amidbindung,
ist.
Diese chemilumineszenten Naphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid-
markierten Konjugate werden in spezifischen
Bindungsversuchen zum Nachweis des Liganden oder eines
Bindungspartners davon verwendet. Die markierten Konjugate
werden in der Bindungs-Untersuchungsmethode (bindung assay)
hinsichtlich ihres Verhaltens überwacht, indem man die markierten
Konjugate oxidiert und das erzeugte Licht entweder
als gesamtes erzeugtes Licht oder als Peak-Lichtintensität
mißt. Bei einem spezifischen Bindungsversuch zum
Nachweis eines Haptens in einem flüssigen Medium kann man
diese Untersuchung z. B. ausführen, indem man eine Probe
des flüssigen Mediums mit einem Antikörper für das Hapten
und mit einem markierten Konjugat der vorliegenden Erfindung,
bei dem das Hapten oder ein Bindungsanalog davon
mit dem chemilumineszenten Gruppierung markiert ist,
inkubiert. Während der Inkubierung steht jegliches Hapten,
das in dem flüssigen Medium vorliegt, im Wettbewerb
mit dem markierten Konjugat, hinsichtlich der Bindung an
den Antikörper. Anschließend bestimmt man die Menge des
markierten Konjugats in der gebundenen Spezies im Vergleich
zu der freien Spezies (wobei diese Menge in umgekehrter
Funktion zu der Menge des Haptens in der zu untersuchenden
Flüssigkeit steht) und diese Bestimmung (d. h.,
Überwachung) erfolgt entweder in homogener Weise, wenn
der Chemilumineszenz-Charakter des markierten Konjugats
in der freien Spezies unterschiedlich ist gegenüber der
gebundenen Spezies, oder die Bestimmung erfolgt in heterogener
Weise, wenn in beiden Spezies dieser Charakter im
wesentlichen gleich ist. In der homogenen Versuchsanordnung
wird die nicht getrennte Reaktionsmischung, die
beide Spezies des markierten Konjugats enthält, mit einem
geeigneten Oxidationssystem für die chemilumineszente
Markierung kombiniert und das gebildete Licht wird gemessen.
Bei der heterogenen Versuchsanordnung wird die gebundene
von der ungebundenen Spezies in üblicher Weise abgetrennt,
das Oxidationssystem wird mit einer Spezies
kombiniert und das gebildete Licht wird gemessen.
Die überwachbare chemilumineszente Reaktion kann wie folgt
beschrieben werden:
worin H ν die emittierte elektromagnetische Strahlung be
deutet.
Brauchbare Oxidationssysteme schließen Wasserstoffperoxid
in Kombination mit einem der nachfolgenden Katalysatoren,
Peroxidase (insbesondere Mikroperoxidase), Katalse, Deuterohämin,
Hämatin oder Ferricyanidionen; Hypochloridionen
kombiniert mit Kobaltionen; Persulfationen; Kaliumsuperoxid;
Perjodationen; Hypoxanthin kombiniert mit Xanthinoxidase
oder Kalium-t-butoxid, ein.
Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen herstellbaren
chemilumineszent markierten Konjugate können in allen
üblichen homogenen oder heterogenen Bindungs-Untersuchungsmethoden,
einschließlich den kompetitiven Bindungsmethoden,
Sequenz-Sättigungsmethoden, Direkt-Bindungsmethoden und
"Sandwich"-Bindungsmethoden angewendet werden. Zum Stand
der Technik über die verschiedenen Bindungs-Untersuchungs
verfahren wird auf die schon erwähnten DE-OS 26 18 419
und 26 18 511 verwiesen.
Die hier verwendeten Begriffe haben, wenn nicht anders
angegeben, folgende Bedeutung: "spezifisch bindungsfähiger
Ligand" ist eine organische Substanz von analytischem
Interesse, für die ein spezifischer Bindungspartner vor
liegt; "spezifischer Bindungspartner des Liganden" ist
die Substanz, welche eine nicht-kovalente Bindungsaffinität
für den Liganden unter Ausschluß von anderen Substanzen
hat; und "Bindungsanalog des Liganden" ist eine organische
Substanz, die sich in ihrer chemischen Struktur von dem
Liganden unterscheidet, aber sich im wesentlichen genauso
wie der Ligand hinsichtlich der Bindungsaffinität an den
spezifischen Bindungspartner des Liganden verhält.
Der spezifische bindungsfähige Ligand oder dessen Analog
in den vorliegenden markierten Konjugaten ist hinsichtlich
seiner chemischen Art im allgemeinen ein Protein, Polypeptid,
Peptid, Kohlenwasserstoff, Glycoprotein, Steroid oder ein
anderes organisches Molekül, für die ein spezifischer
Bindungspartner erhältlich ist. Funktionell ausgedrückt ist
der Ligand im allgemeinen ein Antigen oder ein Antikörper
dazu, ein Hapten oder ein Antikörper dazu, oder ein Hormon,
Vitamin, ein Arzneimittel oder ein Rezeptor oder
eine Bindungssubstanz dafür. Meistens ist der Ligand ein
immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem
Molekulargewicht zwischen 1000 und 4 000 000, wie ein antigenisches
Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper, oder
ist ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100
und 1500.
Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen erhältlichen
markierten Konjugate werden im allgemeinen
hergestellt, indem man eine Peptid- oder Amidkupplung
zwischen (1) einem Aminoderivat eines chemilumineszenten
Naphthalin-1,2-dicarbonsäure-hydrazids und (2) entweder
dem Liganden, falls dieser eine Carbonsäurefunktion enthält,
oder einem Bindungsanalog des Liganden (d. h., einem
Derivat des Liganden) welcher die gewünschte Carbonsäurefunktion
enthält, herstellt. Solche Kondensationsreaktionen
können durch Umsetzung des Aminoderivates der Markierung
direkt mit dem Carbonsäure enthaltenden Liganden oder dem
Analog des Liganden unter Anwendung üblicher Peptid-Konden
sationsreaktionen durchgeführt werden, z. B. der Carbodiimidreaktion
(Science 144 : 1344 (1964)), der Mischanhydridreaktion
(Erlanger et al, Methods in Immunology and Immunochemistry,
herausgegeben von Williams und Chase, Academic Press (New
York 1967), S. 149), und den Säureazid- und Aktivesterreaktionen
(Kopple, Peptides and Amino Acids, W. A. Benjamin, Inc.
(New York 1966)). Ein allgemeiner Überblick hierzu findet
sich in Clin. Chem. 22/726 (1976).
Selbstverständlich können andere bekannte Verfahren zum
Kuppeln des Liganden oder eines Derivates davon an das
Aminoderivat der Markierung angewendet werden. Insbesondere
können übliche bifunktionelle Kupplungsmittel zum Kuppeln
eines Liganden oder dessen Derivates, enthaltend eine
Carbonsäure oder eine Aminogruppe, an das Aminoderivat der
Markierung verwendet werden. Zum Beispiel können Amin-Amin-
Kupplungsmittel, wie Bis-isocyanate, Bis-imidoester und
Glutaraldehyde (Immunochem. 6 : 53 (1969)) zum Kuppeln eines
Liganden oder eines Derivates davon, enthaltend eine Amino
gruppe, an das Aminoderivat der Markierung verwendet werden.
Es sind auch geeignete Kupplungsreakionen bekannt,
bei denen eine Brückengruppe zum Kuppeln eines Amins
(z. B. des Aminoderivates der Markierung) an eine Carbonsäure
(z. B. den Liganden oder dessen Derivat) verwendet wird.
Kupplungsreaktionen dieser Art werden ausführlich in der
Literatur beschrieben und zwar beispielsweise in der schon
erwähnten Monografie von Koppel, in Lowe & Dean, Affinity
Chromatography, John Wiley & Sons (New York 1974).
Solche Kupplungsverfahren sind äquivalent zu den vorher
erwähnten Peptid-Kondensationsreaktionen bei der Herstellung
geeigneter markierter Konjugate. Die Wahl des
Kupplungsverfahrens hängt von den für die Kupplung verfügbaren
Funktionalitäten in dem Liganden oder dessen Analog
zum Kuppeln an das Markierungsderivat und von der Länge
der gewünschten Brückengruppe ab. In allen Fällen besteht
das erhaltene markierte Konjugat aus dem markierten Derivat
gebunden an den Rest des Konjugates über eine Amidbindung.
Ein solcher Rest des Konjugats wird als Rest eines Bindungs
analog des Liganden angesehen, sofern der Ligand nicht
selbst direkt an das Markierungsderivat gekuppelt ist.
In der Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet die
Abkürzung L(CO den Liganden oder ein Bindungsanalog davon,
gekuppelt über eine Amidbindung, worin ein solches
Analog ein Derivat des durch Peptidkondensation an das Markierungsderivat
gekuppelten Liganden sein kann oder der
Ligand oder ein Derivat davon sein kann, das über eine
Brückengruppe, die durch Kupplung des Liganden oder dessen
Derivates an das Markierungsderivat mit einem bifunktionellen
Kupplungsmittel sein kann.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen bis hin
zu den chemilumineszent markierten Konjugaten verläuft nach
der folgenden allgemeinen Synthesesequenz:
Bei der Umsetzung eines N-(ω-Bromalkyl)-phthalimids (I)
(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin USA, siehe
auch Derscherl und Weingarten, Justus Liebig′s Annalen der
Chemie 574 : 131 (1951)) mit Dimethyl-7-aminonaphthalin-1,2-
dicarboxylat (Gunderman et al, Justus Liebig′s Annalen
der Chemie 684 : 127 (1965)) bildet sich das Zwischenprodukt
Dimethyl-7-[ω-(phthalimido)-alkyl]-aminonaphthalin-1,2-
dicarboxylat (II)
Durch Alkylierung der Aminogruppe des Zwischenprodukt-
Dicarboxylats (II) durch Umsetzung mit einem Dialkylsulfat
(III) (Rodd, Chemistry of Carbon Compounds, Bd. 1, Elsevier
Publ. Co. (New York 1951) S. 337)
erhält man das alkylierte Derivat (IV)
worin R′ ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen
ist.
Behandelt man das Zwischenprodukt-Docarboxylat (II) oder
das alkylierte Derivat (IV) mit Hydrazin, so erhält man das
Aminohydrazid (V)
worin R Wasserstoff oder ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen bedeutet.
Durch Kondensation des Aminohydrazids (V) mit (a) dem
zu markierenden Liganden, sofern dieser eine Carboxylsäurefunktion
enthält, (b) einem Bindungsanalog des Liganden,
wobei das Bindungsanalog ein Carbonsäurederivat des
Liganden darstellt, oder (c) dem Liganden oder einem geeigneten
Derivat des Liganden in Gegenwart eines bifunktionellen
Kupplungsmittels, erhält man das chemilumineszent
markierte Konjugat (VI)
worin R die vorher angegebene Bedeutung hat und L(CO
den spezifisch bindungsfähigen Liganden oder ein Bindungsanalog
davon (durch Ableitung des Liganden und/oder Einführung
einer Brücke mittels eines bifunktionellen Kupplungsmittels
gebildet), gebunden über eine Amidbindung.
Andere Variationen von markierten Konjugaten, die auf
der vorerwähnten Synthese beruhen, liegen auf der Hand.
So kann man insbesondere verschiedene ringsubstituierte
7-Aminonaphthalin-1,2-dicarboxylate als Ausgangsmaterialien
verwenden unter Bildung von ringsubstituierten markierten
Konjugaten, die im wesentlichen die gleichen qualitativen
Eigenschaften haben, wie die nach dem vorstehend
beschriebenen Reaktionsschema hergestellten Konjugate.
Wie bereits festgestellt, ist der Ligand in dem markierten
Konjugat oder dessen Bindungsanalog in dem markierten
Konjugat in den meisten Fällen ein immunologisch aktives
Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen
1000 und 4 000 000, wie ein antigenisches Polypeptid oder
Protein oder ein Antikörper; oder ein Hapten mit einem Molekular
gewicht zwischen 100 und 1500. Nachfolgend werden ver
schiedene Kupplungsmethoden für solche Liganden und deren
Analoge an das Aminoderivat (V) der Markierung über eine
Amidbindung beschrieben.
Typische und spezifische bindungsfähige Proteinliganden
sind im allgemeinen Antikörper, insbesondere
solche der IgG, IgE, IgM und IgA Klasse, z. B. Hepatitis
B-Antikörper und antigenische Proteine, wie
Insulin, chorionisches Gonadotropin (z. B. HCG), car
cinoembrionisches Antigen (CEA).
Da Liganden dieser allgemeinen Kategorie als Peptide
zahlreiche verfügbare Carbonsäure- und Aminogruppen
aufweisen, kann die Kupplung des Aminoderivates der chemilumineszenten
Markierung mittels üblicher Peptid-Kondensationsreaktionen
erfolgen, wie durch eine Carbodiimid-Reaktion,
der Mischanhydrid-Reaktion und dergleichen, wie
sie bereits vorher erwähnt wurden, oder unter Verwendung
von üblichen bifunktionellen Reagentien, die in der
Lage sind, eine Carbonsäurefunktion oder eine Aminofunktion
an einer Aminogruppe in dem Markierungsderivat zu bewirken,
wie bereits erwähnt wurde. Allgemeine Hinweise bezüglich
der Kupplung von Proteinen an primäre Amino oder Carbonsäuren
wurden bereits vorher gegeben.
Haptene stellen eine große Klasse organischer Substanzen
dar, die eine immunochemische Reaktion in einem Gasttier
nur dann entwickeln, wenn sie in Form eines immunogenen
Konjugates aus dem Hapten, gekuppelt an ein Trägermolekül,
und zwar in den meisten Fällen einem Protein, wie Albumin
injiziert werden. Die Kupplungsreaktionen zur Bildung der
immunogenen Konjugate sind aus dem Stand der Technik bekannt
und bestehen im allgemeinen aus der Kupplung eines
Carbonsäure-Liganden oder eines Carbonsäurederivates des
Liganden an eine verfügbare Aminogruppe des Proteinträgers
unter Bildung einer Amidbindung. Solche bekannten Kupplungs
reaktionen sind direkte Analoge zu der vorliegenden
Bildung von markierten Konjugaten durch Kupplung von Carbonsäure
liganden oder deren Bindungsanalogen an die Aminoderivate
der chemilumineszenten Markierung.
Weitere Liganden sind die Carbonsäurederivate von
Carbamazepin (gemäß US-PS 40 58 511);
Chinidin (nach dem Verfahren von Cook et al, Pharmacologist 17 : 219 (1975);
Digoxin und Digitoxin (nach dem Verfahren von Oliver et al, J. Clin. Invest. 47 : 1035 (1968);
Theophyllin (nach dem Verfahren von Cook et al, Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 13 : 497 (1976);
Phenobarbital und Primidon (Cook et al, Quantitative Analytic Studies in Epilepsy, herausgegeben von Kelleway und Peterson, Raven Press (New York 1976), S. 39-58);
Diphenylhydantoin (nach dem Verfahren von Cook et al, Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 5 : 767 (1973));
Morphin (nach dem Verfahren von Spector et al, Science 168 : 1347 (1970));
Nikotin (nach dem Verfahren von Langone et al, Biochem 12 (24): 5025 (1973)),
Androgene; Östrogene und Progesterone (nach dem Verfahren von Bauminger et al, J. Steroid Biochem. 5 : 739 (1974)).
Carbamazepin (gemäß US-PS 40 58 511);
Chinidin (nach dem Verfahren von Cook et al, Pharmacologist 17 : 219 (1975);
Digoxin und Digitoxin (nach dem Verfahren von Oliver et al, J. Clin. Invest. 47 : 1035 (1968);
Theophyllin (nach dem Verfahren von Cook et al, Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 13 : 497 (1976);
Phenobarbital und Primidon (Cook et al, Quantitative Analytic Studies in Epilepsy, herausgegeben von Kelleway und Peterson, Raven Press (New York 1976), S. 39-58);
Diphenylhydantoin (nach dem Verfahren von Cook et al, Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 5 : 767 (1973));
Morphin (nach dem Verfahren von Spector et al, Science 168 : 1347 (1970));
Nikotin (nach dem Verfahren von Langone et al, Biochem 12 (24): 5025 (1973)),
Androgene; Östrogene und Progesterone (nach dem Verfahren von Bauminger et al, J. Steroid Biochem. 5 : 739 (1974)).
Die hier erwähnte allgemeine Synthese zur Herstellung der
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen herstellbaren
chemilumineszent markierten Konjugate wird nachfolgend
anhand der Herstellung des markierten Thyroxin-Konjugats
7-/N-Äthyl-N-(4-thyroxinylamido)-butyl/-aminonaphthalin-1,2-
dicarbonsäurehydrazid erläutert. Die Reaktionsfolge für diese
Synthese wird in der nachfolgenden Tab. 1 gezeigt.
Eine Lösung aus 14,1 g (0,05 mol) N-(4-Brombutyl)phthal
imid (1) und 25,0 g (0,1 mol) Dimethyl-7-aminonaphthalin-
1,2-dicarboxyalat (2) (Gundermann et al, Justus Liebig′s
Annalen der Chemie 684 : 127 (1965)) in 100 ml 2,2,2-Trifluor
äthanol wurde unter Argon 16 Stunden unter Rückfluß behandelt.
Beim Verdampfen erhielt man einen Rückstand, der
zwischen 400 ml Äther und 300 ml Wasser (H₂O) zugeteilt
wurde. Die Ätherphase wurde abgetrennt, getrocknet und
abgedampft. Der erhaltene dunkelrote Rückstand wurde über
eine Säule von 1200 g Kieselgel (E. Merck, Darmstadt,
Westdeutschland) chromatografiert und mit einer 19 : 1
Mischung (V/V) Benzol und Methanol eluiert. Die ersten
700 ml des Eluats wurden verworfen und dann wurden 20 ml
Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 219 bis 251 wurden
vereint und eingedampft, wobei man 9 g des substituierten
Carboxylats (3) als klares rotes Öl erhielt.
Analyse:
NMR-Spektrum (CDCl₃): δ 1,7 (m, 4H), 3,9 (s, 3H), 4,0 (s, 3H)
IR-Spektrum (CDCl₃): 1720 cm-1 (Carbonyl)
Massenspektrum (70 eV) m : e : 461 [MH⁺], 460 [M⁺], 429 [M⁺ minus OCH₃]
NMR-Spektrum (CDCl₃): δ 1,7 (m, 4H), 3,9 (s, 3H), 4,0 (s, 3H)
IR-Spektrum (CDCl₃): 1720 cm-1 (Carbonyl)
Massenspektrum (70 eV) m : e : 461 [MH⁺], 460 [M⁺], 429 [M⁺ minus OCH₃]
Eine Mischung aus 9 g (0,02 mol) des substituierten Carboxylats
(3) und 20 ml Diäthylsulfat wurde 2 Stunden unter
Argon auf 830°C erhitzt. Die dunkle Lösung wurde
in ein Becherglas mit zerstossenem Eis, enthaltend 200 ml
einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung, gegossen.
Nachdem das gesamte Eis geschmolzen war, wurde
die Mischung mit 3 250 ml Volumina Äther extrahiert. Die
Ätherextrakte wurden vereint, getrocknet und eingedampft,
wobei man ein rotes Öl erhielt. Das Öl wurde über eine
Säule von 600 g Kieselgel mit einer 9 : 1 (V/V) Mischung
Benzol und Methanol eluiert und die hellgelben Fraktionen
wurden vereint und eingedampft. Überschüssiges Diäthylsulfat
wurde durch Sublimation bei 50°C und einem verminderten
Druck von 0,01 mm Quecksilber abgedampft, wobei ein Rück
stand von 4 g N-Äthyl-substituierten Carboxylat (4) als
hellgelbes Öl zurückblieb.
Analyse:
NMR-Spektrum (CDCl₃): δ 3,9 (s, 3H), 4,1 (s, 3H)
Massenspektrum (70 eV) m/e: 489 [MH⁺], 488 [M⁺], 457 [M⁺ minus OCH₃]
NMR-Spektrum (CDCl₃): δ 3,9 (s, 3H), 4,1 (s, 3H)
Massenspektrum (70 eV) m/e: 489 [MH⁺], 488 [M⁺], 457 [M⁺ minus OCH₃]
Eine Mischung aus 4 g (0,008 mol) des N-äthylierten
substituierten Carboxylats (4), 15 ml 85%igem Hydrazin
und 50 Methanol wurde 3 Stunden unter Rückfluß gehalten.
Nach dem Abkühlen wurde die Mischung auf einem Drehverdampfer
zur Trockne eingedampft und der kristalline
Rückstand abgeschabt und über Nacht bei 80°C im Hochvakuum
getrocknet. Der entstandene dunkle Feststoff wurde
über eine Säule aus 200 g Kieselgel (Merck, Darmstadt,
Westdeutschland) mit einer 7 : 3 (V/V) Mischung aus
Äthanol und 1m Trimethylammoniumbicarbonat eluiert und
20 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen Nr. 25
bis 75 wurden vereint und eingedampft, wobei man einen
gelben Feststoff erhielt. Nach zweimaligem Umkristallisieren
aus Pyridin erhielt man 1,1 g Aminohydrazid (5)
in Form von feinen gelben Kristallen mit dem Schmelzpunkt
246 bis 247°C.
Analyse für C₁₈H₂₂N₄O₂:
Berechnet:C 66,24 H 6,80 N 17,17 Gefunden:C 66,05 H 6,69 N 17,65 NMR-Spektrum (d₆-DMSO): δ 1,1 (m, 3H), 1,5 (m, 4H)
IR-Spektrum (KCl): 1615 cm-1 (Carbonyl)
Berechnet:C 66,24 H 6,80 N 17,17 Gefunden:C 66,05 H 6,69 N 17,65 NMR-Spektrum (d₆-DMSO): δ 1,1 (m, 3H), 1,5 (m, 4H)
IR-Spektrum (KCl): 1615 cm-1 (Carbonyl)
Zur Bestimmung der Effizienz wurde das Markierungsderivat
und Luminol (5-Amino-2,3-dihydrophthalizin-1,4-dion)
individuell mit verschiedenen Niveaus im pikomolaren Bereich
oxidiert und verglichen mit den Peak-Lichtintensitätenmittels
einer grafischen Aufzeichnung. Lineare Anteile
der entstandenen Kurve ermöglichten eine Berechnung
der Veränderung der Peak-Lichtintensität pro Konzentrationseinheit
für das Markierungsderivat und für Luminol. Die
Effizienz des Markierungsderivats wurde als Prozentsatz
der Luminol-gebildeten Steigung ausgedrückt.
Reaktionsmischungen (150 µl) der folgenden Zusammensetzung
wurden in 6×50 mm Reagenzgläser gefüllt und in
einen Dupont 760 Luminiszenz-Biometer mit einer Empfindlichkeits
einstellung von 820 gegeben. Die Mischungen hatten
folgende Zusammensetzung: 50 mmol Natriumhydroxid,
57,5 mmol Barbital, eingestellt auf pH 8,6, 0,27µm
Mikroperoxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri
USA) und entweder das Aminoderivat der Markierung oder
Luminol in variierenden Konzentrationen im pikomolaren
(pM) Bereich (verdünnt mit H₂O aus einer Vorratslösung
von 1 mmol in 0,1M Natriumcarbonat, pH 10,5). Der End-pH
der Reaktionsmischung betrug 12,6. Jede Mischung wurde
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zum Einleiten
der Chemilumineszenz-Reaktion wurden 10 µl 90 mmol
Wasserstoffperoxid in 10 mmol Tris-HCl-Puffer [Tris-(hydroxymethyl)-
aminomethan-hydrochlorid], pH 7,4, zugegeben. Die
Peak-Lichtintensitätswerte wurden anhand der Instrumentablesungen
aufgezeichnet. Alle Reaktionen wurden dreifach
durchgeführt und der Durchschnitt wurde genommen. Die
Effizienz des Markierungsderivates (5) betrug 420%.
Die Nachweisgrenze wurde als die Konzentration des Markierungsderivates
bestimmt, welche eine Peak-Lichtintensität
vom 1,5fach Wert der Hintergrund-Chemilumineszenz in
dem Reaktionsgemisch ergab. Die Nachweisgrenze für das
Markierungsderivat (5) betrug 0,1 pM.
Eine Lösung aus 20 g (25,6 mmol) L-Thyroxin in 240 ml
trockenem Äthylacetat, enthaltend 46 ml Trifluoressigsäure
und 7,6 ml Trifluoressigsäureanhydrid, wurde 1 Stunde
bei 0°C gerührt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur und
Zugabe von 200 ml H₂O bildete sich eine Suspension, die
mit Natriumchlorid gesättigt wurde. Die organische
Phase der Mischung wurde abgetrennt, mit einer gesättigten
wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und
eingedampft, wobei man 21,3 g N-geschütztes Thyroxinderivat
(6) erhielt. Eine Probe wurde aus Äther-Pentan
umkristallisiert, wobei man feine Kristalle mit einem
Schmelzpunkt von 233 bis 235°C (Zersetzung) erhielt.
Analyse für C₁₇H₁₀F₃J₄NO₅:
Berechnet:C 23,39 H 1,15 N 1,60 Gefunden:C 23,23 H 1,12 N 1,56 IR-Spektrum (KCl): 1700 cm-1 (Carbonyl)
optische Drehung [α]=-14,97°C (c 1,0, Dimethylsulfoxid)
Berechnet:C 23,39 H 1,15 N 1,60 Gefunden:C 23,23 H 1,12 N 1,56 IR-Spektrum (KCl): 1700 cm-1 (Carbonyl)
optische Drehung [α]=-14,97°C (c 1,0, Dimethylsulfoxid)
Eine Lösung aus 1,746 g (2 mmol) N-Trifluoracetylthyroxin
(6) in 20 ml trockenem Pyridin wurde unter Argon und unter
Rühren auf -10°C gekühlt. Zu dieser Lösung wurden 450 mg
(2,2 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und 45 Minuten
später 980 mg (3 mmol) des Aminohydrazids (5). Nach
3stündigem Rühren bei -10°C ließ man das Reaktionsgemisch
über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Die Reaktionsmischung
wurde mit 10 ml Pyridin verdünnt, 10 g Kieselgel
wurden zugegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakuum
eingedampft. Der imprägnierte Kieselgel wurde auf eine
Säule aus 200 g Kieselgel, die mit einer 7 : 3 (V/V) Mischung
aus Äthanol und 1 M Triäthylammoniumbicarbonat behandelt
worden war, gegeben und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch
eluiert. Die ersten 400 ml des Eluats wurden verworfen
und dann wurden 20 ml Fraktionen gesammelt. Die
Fraktionen 19 bis 30 wurden vereint und eingedampft, wobei
man einen gelben kristallinen Rückstand erhielt. Dieses
Produkt wurde 3 Stunden in 300 ml 1 m Triäthylamminiumbicarbonat
rückflußbehandelt, um die Trifluoracetyl-
Schutzgruppe vollständig zu entfernen. Die Lösung wurde
dann noch heiß filtriert. Nach dem Abkühlen wurden 15 g
Kieselgel zugegeben und das Lösungsmittel wurde abgedampft.
Der imprägnierte Kieselgel wurde auf eine 200g
Säule aus Kieselgel gegeben und mit einer 7 : 3 (V/V) Mischung
Äthanol und 1 m Triäthylammoniumbicarbonat eluiert und
es wurden 20 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 30
bis 50 wurden vereint und eingedampft, wobei man 910 mg
des markierten Thyroxin-Konjugats (7) als gelben Feststoff
erhielt. Eine 110 mg Probe wurde auf einer 45×3,2 cm
Säule aus Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, Schweden) mit Methanol eluiert. Die Fraktionen
mit einem Volumen von 7 ml wurden gesammelt und die Fraktionen
64 bis 76 wurden vereint und eingedampft, wobei man
60 mg des markierten Konjugats (7) als gelben Feststoff
mit dem Schmelzpunkt 218°C (Zersetzung) erhielt.
Analyse für C₃₃H₃₁J₄N₅O₅:
Berechnet:C 36,52 H 2,88 J 46,77 N 6,45 Gefunden:C 35,61 H 3,02 J 44,60 N 6,25
Berechnet:C 36,52 H 2,88 J 46,77 N 6,45 Gefunden:C 35,61 H 3,02 J 44,60 N 6,25
Kompetitive Bindungsreaktionsmischungen (200 µl) wurden
dreifach angesetzt durch Kombination der folgenden Reagentien:
50 µl 10 nM markiertes Konjugat (7) in 75 ml
Barbital-Puffer (pH 8,6), 50 µl einer Zubereitung eines
Antikörpers für Thyroxid im gleichen Puffer, variierenden
Volumina von 54,8 nM Thyroxin im gleichen Puffer mit
einem ausreichenden Volumen an Puffer, um das Endvolumen
auf 200 µl zu bringen. Nach 10minütigem Inkubieren
bei Raumtemperatur wurden die freie und die gebundene Spezies
des markierten Konjugats aus jeder Reaktionsmischung
durch Aufbringen eines 150 µl aliquoten Teils auf kleine
Sephadex G-25 Kolonnen (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,
Schweden) getrennt. Die Kolonnen hatten ein Bettvolumen
von 1,5 µl und waren zuvor hintereinander mit 3 ml Volumina
7%iger Essigsäure (3 mal), H₂O, 0,1 N Natriumhydroxid
(3mal) und 75 mmol des Barbital-Puffers gewaschen
worden. Die gebundene Spezies des markierten Konjugats
wurde aus der Säule mit 1,5 ml des Barbital-Puffers
eluiert, so daß die freie Spezies in der Säule verblieb.
Ein aliquoter Teil (95 µl) des Abflusses aus jeder Säule
wurde zu 55 µl einer Lösung aus 134 mmol Natriumhydroxid,
0,73 µmol Mikroperoxidase und 27 mmol Barbital in ein
6×50 mm Reagenzglas gegeben. Nach 10minütiger Inkubierung
bei Raumtemperatur wurde jedes Reagenzglas in
ein Dupont 760 Biometer gegeben und dazu wurden 10 µl
von 90 mM Wasserstoffperoxid in 10 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,4) zugegeben. Die auftretende Peak-Intensität des
bei der Chemilumineszenz-Reaktion erzeugten Lichtes
wurde von den Instrumentenablesungen aufgezeichnet. Jede
Bindungsmischung wurde 3fach ausgewertet, so daß man
insgesamt neun individuelle Peak-Lichtintensitätswerte
maß, von denen man für jedes unterschiedliche Volumen an
zugegebenem Thyroxin zu der Anfangsreaktionsmischung
den Durchschnitt nahm.
Die Peak-Intensitätswerte wurden auch in bezug gesetzt
als Prozentsatz des gesamten markierten Konjugats in der
gebundenen Spezies, indem man das Verhältnis solcher
Werte zu den Peak-Lichtintensitätswerten, die in der
Chemilumineszenz-Reaktion unter Verwendung von 95 µl von
0,25 nM markiertem Konjugat anstelle des Säulenausflusses
gemessen hatte. Die Hintergrund-Chemilumineszenz bei der
Überwachungsreaktion betrug 0,3 Peak-Intensitätseinheiten.
Die Beziehung der Menge an Thyroxin bei der Bindungsreaktion
zu den Peak-Lichtintensitäten und der Prozentsatz
des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies werden
in der Tabelle 2 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, daß die unter Verwendung der erfindungsgemäßen
Verbindungen herstellbaren markierten Konjugate
geeignet sind, in Bindungsversuchen zum Bestimmen eines Liganden
in einem flüssigen Medium verwendet zu werden.
Claims (4)
1. Eine Verbindung der allgemeinen Formel
worin R einen geradkettigen Alkyrest mit 1 bis 4
Kohlenstoffatomen und n=2 bis 6 bedeutet.
2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin n=4 ist.
3. 7-N-Äthyl-N-(4-aminobutyl)-aminonaphthalin-1,2-carbon
säure-hydrazid.
4. Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 3
zur Chemilumineszenzmarkierung.
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