DE2921782A1

DE2921782A1 - Chemilumineszente naphthalin-1,2- dicarbonsaeure-hydrazid-markierte konjugate und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2921782A1
Application number: DE19792921782
Authority: DE
Inventors: Robert Thomas Buckler; Hartmut Richard Schroeder
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1978-07-24
Filing date: 1979-05-29
Publication date: 1980-01-31
Also published as: GB2042513A; FR2432038B1; IL57642A; GB2043051A; GB2043051B; JPS5519266A; GB2042513B; IL57642A0; DE2921782C2; FR2432038A1; CA1137974A; GB2026158B; US4225485A; GB2026158A

Description

HOFFMANN · EITLS & PARTNER

PATENTANWÄLTE 9 Q 9 1 7 P }

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DIPL.-ING. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN . DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · D-8000 MÖNCHEN 81 · TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29419 (PATHE)

⁰ . .32 11.9. o/wa

MILES LABORATORIES INC., ELKHART, INDIANA / USA

Chemilumineszente Naphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid-markierte Konjugate und Verfahren zu deren Herstellung

Die Erfindung betrifft neue Chemilumineszent-markierte Konjugate, die in spezifischen Bindungsuntersuchungen für einen Liganden, wie ein Antigen, Hapten oder einen Antikörper, in einem flüssigen Medium, wie einer Körperflüssigkeit, verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin Zwischenverbindungen, die bei der Synthese der neuen markierten Konjugate gebildet werden.

Spezifische Bindungsuntersuchungen sind technisch stark

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— y —

weiterentwickelt worden von dem ursprünglichen kompetitiven Bindungs-Radio iinmuno-Test (Radi ο immunoassay RIA) bei dem ein Radioisotop-markiertes Antigen kompetitiv mit einem Antigen in einer Versuchsprobe bei der Bindung an einen spezifischen Antikörper ist. In der RIA-Technik wird eine Antigenprobe quantitativ bestimmt, indem man das Verhältnis der Radioaktivität bestimmt, die in dem Antikörper durch Bindung an das radiomarkierte Antigen (der gebundenen Spezies des markierten Antigens) vorliegt, zu der Radioaktivität, die unassoziiert vom Antikörper (der freien Spezies) vorliegt, und dass das Verhältnis mit einer Standardkurve vergleicht. Ein genauer überblick über die RIA-Technik findet sich bei Skelly et al in Clin. Chem. 19:146 (1973). Gemäss der Definition basiert RIA auf der Bindung von spezifischen Antikörpern an ein Antigen oder Hapten, jedoch sind radiomarkierte Bindungs-Analyse-Methoden entwickelt worden, die auf anderen spezifischen Bindungs-Wechselwirkungen beruhen, z.B. zwischen Hormonen und deren Bindungsproteinen.

Ausgehend von radiomarkierten Bindungs-Untersuchungsmethoden wurden nicht-radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden entwickelt, bei denen markierte Substanzen, wie Enzyme, verwendet werden (US-PS 3 654 090 und 3 817 837). In den deutschen Offenlegungsschriften 26 18 419 und 26 18 511 werden verbesserte nicht-radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden beschrieben, bei denen ganz einmalige Markierungssubstanzen, einschliesslich Coenzyme, cyclische Reaktanten, abspaltbare fluoreszente Enzymsubstrate und chemilumineszente Moleküle verwendet werden. Die chemilumineszente Markierung besteht aus einem organischen Molekül, das unter Ausbildung von Licht eine chemische Strukturveränderung erfährt.

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Spezifische Beispiele für als chemilumineszente Markierungen geeignete Substanzen finden sich in der DE-OS 26 18 511. Solche Verbindungen sind z.B. Luminol, Isoluminol, Pyrogallol und Luciferin. Insbesondere wird ein Beispiel in der DE-OS 26 18 511(und in Anal. Chem. 48:1933 (1976)) gezeigt, bei dem ein Isoluminol-markiertes Konjugat, bei welchem das Isoluminol durch seine Aminofunktion mittels einer 2-Hydroxypropylen-Brücke an den Liganden Biotin gebunden ist. Das Isoluminol-markierte Konjugat wird in dem Bindungsversuch durch Messen des entweder in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase oder von Kaliumsuperoxid produzierten Lichtes überwacht. Chemilumineszente Phthalhydrazid-markierte Konjugate, bei denen ein Aminophthalhydrazid durch die Aminofunktion über eine 2-Hydroxyalkylen-Brücke an einen Liganden gekuppelt sind, werden in der US-Patentanmeldung gleichen Datums mit dem Titel "Chemilumineszent-markierte Konjugate und deren Verwendung in spezifischen Bindungsuntersuchungen" (Docket 11824) der Anmelderin beschrieben.

Die Effizienz von Aminophthalhydraziden als chemilumineszente Markierungen wurde dadurch verbessert, dass man sie über die Aminofunktion mit einer geradkettigen Niedrigalkylenbrücke kuppeln konnte, wie in der US-Patentanmeldung gleichen Datums mit dem Titel "Chemilumineszente Phthalhydrazidmarkierte Konjugate (Docket 11825) der Anmelderin beschrieben wird. Die Verwendung von noch wirksameren Markierungen ermöglicht einen noch empfindlicheren Nachweis von Liganden.

Die Erfindung betrifft markierte Konjugate, die noch wirksamere chemilumineszente Markierungen darstellen der Formel

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worin R Wasserstoff oder ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Äthyl, η = 2 bis 6, vorzugsweise 4, und L (CO}- ein spezifisch bindungsfähiger Ligand oder ein Bindungsanalog dazu, gebunden durch eine Amidbindung, ist.

Die vorliegenden chemilumineszenten Naphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid-markierten Konjugate v/erden in spezifischen Bindungsversuchen zum Nachweis des Liganden oder eines Bindungspartners davon verwendet. Die markierten Konjugate werden in der Bindungs-Untersuchungsmethode (bindung assay) hinsichtlich ihres Verhaltens überwacht, indem man die markierten Konjugate oxidiert und das erzeugte Licht entweder als gesamtes erzeugtes Licht oder als Peak-Lichtintensität misst. Bei einem spezifischen Bindungsversuch zum Nachweis eines Haptens in einem flüssigen Medium kann man diese Untersuchung z.B. ausführen, indem man eine Probe des flüssigen Mediums mit einem Antikörper für das Hapten und mit einem markierten Konjugat der vorliegenden Erfindung, bei dem das Hapten oder ein Bindungsanalog davon

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mit der chemilumineszenten Gruppierung markiert ist, inkubiert. Während der Inkubierung steht jegliches Hapten, das in dem flüssigen Medium vorliegt, im Wettbewerb mit dem markierten Konjugat, hinsichtlich der Bindung an den Antikörper. Anschliessend bestimmt man die Menge des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies im Vergleich zu der freien Spezies (wobei diese Menge in umgekehrter Funktion zu der Menge des Haptens in der zu untersuchenden Flüssigkeit steht) und diese Bestimmung (d.h. Überwachung) erfolgt entweder in homogener Weise, wenn der Chemilumineszenz-Charakter des markierten Konjugats in der freien Spezies unterschiedlich ist gegenüber der gebundenen Spezies, oder die Bestimmung erfolgt in heterogener Weise, wenn in beiden Spezies dieser Charakter im wesentlichen gleich ist. In der homogenen Versuchsanordnung wird die nicht getrennte Reaktionsmischung, die beide Spezies des markierten Konjugats enthält, mit einem geeigneten Oxidationssystem für die chemilumineszente Markierung kombiniert und das gebildete Licht wird gemessen. Bei der heterogenen Versuchsanordnung wird die gebundene von der ungebundenen Spezies in üblicher Weise abgetrennt, das Oxidationssystem wird mit einer Spezies kombiniert und das gebildete Licht wird gemessen.

Die überwachbare chemilumineszente Reaktion kann wie folgt beschrieben werden:

Oxidations- χ j:00H

system

+ N, + hv

0OH

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worin h\> die emittierte elektromagnetische Strahlung bedeutet .

Brauchbare Oxidationssysteme schliessen Wasserstoffperoxid in Kombination mit einem der nachfolgenden Katalysatoren, Peroxidase (insbesondere Mikroperoxidase), Katalse, Deuterohämin, Hämatin oder Ferricyanidionen; Hypochloridionen kombiniert mit Kobaltionen; Persulfationen; Kaliumsuperoxid; Perjodationen; Hypoxanthin kombiniert mit Xanthinoxidase oder Kalium-t-butoxid, ein.

Die chemilumineszent markierten Konjugate können in allen üblichen homogenen oder heterogenen Bindungs-Untersuchungsmethoden, einschliesslich den kompetitiven Bindungsmethoden, Sequenz-Sättigungsmethoden, Direkt-Bindungsmethoden und "Sandwich"-Bindungsmethoden angewendet werden. Zum Stand der Technik über die verschiedenen Bindungs-Untersuchungsverfahren wird auf die schon erwähnten DE-OSen 26 18 419 und 26 18 511 verwiesen.

Die hier verwendeten Begriffe haben, wenn nicht anders angegeben, folgende Bedeutung: "spezifisch bindungsfähiger Ligand" ist eine organische Substanz von analytischem Interesse, für die ein spezifischer Bindungspartner vorliegt; "spezifischer Bindungspartner des Liganden" ist die Substanz, welche eine nicht-kovalente Bindungsäffinität für den Liganden unter Ausschluss von anderen Substanzen hat; und "Bindungsanalog des Liganden" ist eine organische Substanz, die sich in ihrer chemischen Struktur von dem Liganden unterscheidet, aber sich im wesentlichen genauso wie der Ligand hinsichtlich der Bindungsaffinität an den spezifischen Bindungspartner des Liganden verhält.

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Der spezifische bindungsfähige Ligand oder dessen Analog in den vorliegenden markierten Konjugaten ist hinsichtlich seiner chemischen Art im allgemeinen ein Protein, Polypeptid, Peptid, Kohlenwasserstoff, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für die ein spezifischer Bindungspartner erhältlich ist. Funktionell ausgedrückt ist der Ligand im allgemeinen ein Antigen oder ein Antikörper dazu, ein Hapten oder ein Antikörper dazu, oder ein Hormon, Vitamin, ein Arzneimittel oder ein Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür. Meistens ist der Ligand ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4.000.000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper, oder ist ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500.

Die vorliegenden markierten Konjugate werden im allgemeinen hergestellt, indem man eine Peptid- oder Amidkupplung zwischen (1) einem Aminoderivat eines chemilumineszenten Napthalin-1,2-dicarbonsäure-hydrazids und (2) entweder dem Liganden, falls dieser eine Carbonsäurefunktion enthält, oder einem Bindungsanalog des Liganden (d.h. einem Derivat des Liganden) welcher die gewünschte Carbonsäurefunktion enthält, herstellt. Solche Kondensationsreaktionen können durch Umsetzung des Aminoderivates der Markierung direkt mit dem Carbonsäure enthaltenden Liganden oder dem Analog des Liganden unter Anwendung üblicher Peptid-Kondensationsreaktionen durchgeführt werden, z.B. der Carbodiimidreaktion (Science 144:1344 (1964)), der Mischanhydridreaktion (Erlanger et al, Methods in Immunology and Immunochemistry, herausgegeben von Williams und Chase, Academic Press (New York 1967), S. 149), und den Säureazid- und Aktivesterreaktionen

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(Kopple, Peptides and Amino Acids, W.A. Benjamin, Inc. (New York 1966)). Ein allgemeiner überblick hierzu findet sich in Clin. Chem. 22/726 (1976).

Selbstverständlich können andere bekannte Verfahren zum Kuppeln des Liganden oder eines Derivates davon an das Aminoderivat der Markierung angewendet werden. Insbesondere können übliche bifunktionelle Kupplungsmittel zum Kuppeln eines Liganden oder dessen Derivates, enthaltend eine Carbonsäure oder eine Aminogruppe, an das Aminoderivat der Markierung verwendet werden. Zum Beispiel können Amin-Amin-Kupplungsmittel, wie Bis-isocyanate, Bis-imidoester und Glutaraldehyde (Immunochem. 6:53 (1969)) zum Kuppeln eines Liganden oder eines Derivates davon, enthaltend eine Aminogruppe, an das Aminoderivat der Markierung verwendet werden. Es sind auch geeignete Kupplungsreaktionen bekannt, bei denen eine Brückengruppe zum Kuppeln eines Amins (z.B. des Aminoderivates der Markierung) an eine Carbonsäure (z.B. den Liganden oder dessen Derivat) verwendet wird. Kupplungsreaktionen dieser Art werden ausführlich in der Literatur beschrieben und zwar beispielsweise in der schon erwähnten Monografie von Koppel, in Lowe & Dean, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons (New York 1974).

Solche Kuppiungsverfahren sind äquivalent zu den vorher erwähnten Peptid-Kondensationsreaktionen bei der Herstellung geeigneter markierter Konjugate. Die Wahl des Kupplungsverfahrens hängt von den für die Kupplung verfügbaren Funktionalitäten in dem Liganden oder dessen Analog zum Kuppeln an das Markierungsderivat und von der Länge der gewünschten Brückengruppe ab. In allen Fällen besteht das erhaltene markierte Konjugat aus dem markierten Derivat

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gebunden an den Rest des Konjugates über eine Amidbindung. Ein solcher Rest des Konjugats wird als Rest eines Bindungsanalog des Liganden angesehen, sofern der Ligand nicht selbst direkt an das Markierungsderivat gekuppelt ist. In der Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet die Abkürzung L(COf den Liganden oder ein Bindungsanalog davon, gekuppelt über eine Amidbindung, worin ein solches Analog ein Derivat des durch Peptidkondensation an das Markierungsderivat gekuppelten Liganden sein kann oder der Ligand oder ein Derivat davon sein kann, das über eine Brückengruppe, die durch Kupplung des Liganden oder dessen Derivates an das Markierungsderivat mit einem bifunktionellen Kupplungsmittel sein kann.

Die Herstellung der vorliegenden chemilumineszent markierten Konjugate verläuft nach der folgenden allgemeinen Synthesesequenz:

n=2-6

Bei der Umsetzung eines N-(CJ-Bromalkyl)-phthalimids (I) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin USA, siehe auch Derscherl und Weingarten, Justus Liebig¹s Annalen der Chemie 574:131 (1951)) mit Dimethyl-7-aminonaphthalin-i,2-dicarboxylat (Gunderman et al, Justus Liebig ¹S Annalen der Chemie 684:127 (1965)) bildet sich das Zwischenprodukt

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Dimethyl-7-^üi -N- (phthalimide») -alkylZ-aminonaphthalin-i ,2-dicarboxylat (II)

OOCH,

(II)

«=2-6

Durch Alkylierung der Aminogruppe des Zwischenprodukt-Dicarboxylats (II) durch Umsetzung mit einem Dialkylsulfat (III) (Rodd, Chemistry of Carbon Compounds, Bd. 1, Elsevier Publ. Co. (New York 1951) S. 337)

(III)

m = 0-3

erhält man das alkylierte Derivat (IV)

-6CH

(IV)

n=2-6

worin R¹ ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.

Behandelt man das Zwischenprodukt-Docarboxylat (II) oder das alkylierte Derivat (IV) mit Hydrazin, so erhält man das

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Aminohydrazid (V)

<^v>

n=2-6

worin R Wasserstoff oder ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Durch Kondensation des Aminohydrazids (V) mit (a) dem zu markierenden Liganden, sofern dieser eine Carboxylsäurefunktion enthält, (b) einem Bindungsanalog des Liganden, wobei das Bindungsanalog ein Carbonsäurederivat des Liganden darstellt, oder (c) dem Liganden oder einem geeigneten Derivat des Liganden in Gegenwart eines bifunktionellen Kupplungsmittels, erhält man des chemilumineszent markierte Konjugat (VI)

n=2-6

(VI) - 19 -

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worin R die vorher angegebene Bedeutung hat und L(COf den spezifisch bindungsfähigen Liganden oder ein Bindungsanalog davon (durch Ableitung des Liganden und/oder Einführung einer Brücke mittels eines bifunktionellen Kupplungsmittels gebildet), gebunden über eine Amidbindung.

Andere Variationen von markierten Konjugaten, die auf der vorerwähnten Synthese beruhen, liegen auf der Hand. So kann man insbesondere verschiedene ringsubstituierte 7-Aminonaphthalin-1,2-dicarboxylate als Ausgangsmaterialien verwenden unter Bildung von ringsubstituierten markierten Konjugaten, die im wesentlichen die gleichen qualitativen Eigenschaften haben, wie die nach dem vorstehend beschriebenen Reaktionsschema hergestellten Konjugate. Solche Konjugate werden als äquivalent angesehen und sind beispielsweise solche, bei denen ein, zwei oder mehr einfache Substituenten an einer verfügbaren Stelle des aromatischen Ringes eingefügt werden. Geeignete Substituenten sind, ohne dass dies begrenzend ist, z.B. Alkyl, wie Methyl, Äthyl und Butyl, Halogen, wie Chlor und Brom, Nitro, Hydroxyl, Alkoxy, wie Methoxy und Äthoxy, und dergleichen.

Wie bereits festgestellt, ist der Ligand in dem markierten Konjugat oder dessen Bindungsanalog in dem markierten Konjugat in den meisten Fällen ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4.000.000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper; oder ein Hapten mi't einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500. Nachfolgend werden verschiedene Kupplungsmethoden für solche Liganden und deren Analoge an das Aminoderivat (V) der Markierung über eine Amidbindung beschrieben.

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Polypeptide und Proteine

Typische und spezifische bindungsfähige Proteinliganden sind im allgemeinen Antikörper, insbesondere solche der IgG, IgE, IgM und IgA Klasse, z.B. Häpatitis B-Antikörper und antigenische Proteine, wie Insulin, chorionisches Gonadotropin (z.B. HCG)₇ carcinoembrionisches Antigen (CEA),

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Myoglobin, Hämoglobin, follikelstimulierendes Hormon, humanes Wachstumshormon, thyroidstimulierendes Hormon (TSH), humanes Placentalactogen, Thyroxinbindungsglobulin (TBG), instrinsischer Faktor, Transcobalamin, Enzyme, wie alkalische Phosphatase und Mxlchsäuredehydrogenase, und hepatitisassoziierte Antigene, wie Hepatitis B-Oberflächenantigen (HB Ag), Hepatitis e-Antigen (HB Ag) und Heptatis-Kernantigen (HB Ag). Typische Polypeptid-Liganden sind Angiotensin I und II, C-Peptid, Oxytocin, Vasopressin, Neurophysin, Gastrin, Secretin und Glucagon.

Da Liganden dieser, allgemeinen Kategorie als Peptide zahlreiche verfügbare Carbonsäure- und Aminogruppen aufweisen, kann die Kupplung des Aminoderivates der chemilumineszenten Markierung mittels üblicher Peptid-Kondensationsreaktionen erfolgen, wie durch eine Carbodiimid-Reaktion, der Mischanhydrid-Reaktion und dergleichen, wie sie bereits vorher erwähnt wurden, oder unter Verwendung von üblichen bifunktionellen Reagentien, die in der Lage sind, eine Carbonsäurefunktion, oder eine Aminofunktion an einer Aminogruppe in dem Markierungsderivat zu bewirken, wie bereits erwähnt wurde. Allgemeine Hinweise bezüglich der Kupplung von Proteinen an primäre Amino oder Carbonsäuren wurden bereits vorher gegeben.

Haptene

Haptene stellen eine grosse Klasse organischer Substanzen dar, die eine immunochemische Reaktion in einem Gasttier nur dann entwickeln, wenn sie in Form eines immunogenen

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Konjugates aus dem Hapten_# gekuppelt an ein Trägermolekül, und zwar in den meisten Fällen einem Protein, wie Albumin, injiziert werden. Die Kupplungsreaktionen zur Bildung der immunogenen Konjugate sind aus dem Stand der Technik bekannt und bestehen im allgemeinen aus der Kupplung eines Carbonsäure-Liganden oder eines Carbonsäurederivates des Liganden an eine verfügbare Aminogruppe des Proteinträgers unter Bildung einer Amidbindung. Solche bekannten Kupplungsreaktionen sind direkte Analoge zu der vorliegenden Bildung von markierten Konjugaten durch Kupplung von Carbonsäureliganden oder deren Bindungsanalogen an die Aminoderivate der chemilumineszenten Markierung.

Hapten-Llganden, die selbst Carbonsäurefunktionen aufweisen, mittels derer sie direkt an das Aminoderivat der Markierung gekuppelt werden können, sind z.B. Jodthyroninhormone, wie Thyroxin und Liothyronin, und auch andere Stoffe, wie Biotin, Valpronsäure, Folsäure und gewisse Prostaglandine. Es folgen typische Synthesewege zur Herstellung von Carbonsäure-Bindungsanalogen von Hapten-Liganden, die selbst keine verfügbaren Carbonsäurefunktionen enthalten, wodurch solche Analoge an das Aminoderivat der Markierung durch die vorerwähnte Peptid-Kondensationsreaktion oder eine bifunktionelle Kupplungsmittelreaktion gekuppelt werden kann (in der nachfolgenden Strukturformel bedeutet η eine ganze Zahl, gewöhnlich 1 bis 6).

Carbamazepin

Dibenz^b,f/azepin wird nacheinander mit Phosgen, einem CO-Aminoalkanol, und Jones-Reagens (Chromtrioxid in Schwefelsäure) nach dem Verfahren von Singh, cemäss US-PS 4 058

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behandelt, wobei man die folgende Reihe von Carbonsäuren erhält:

CONH-CCH₇ 3—COOH

Chinidin

Arbeitet man nach dem Verfahren von Cook et al, Pharmacologist 17:219 (1975), so wird Chinidin demethyliert und dann mit 5-Bromvalerat behandelt und anschliessend sauer hydrolysiert unter Bildung eines geeigneten Carbonsäurederivates.

Digoxin und Digitoxin

Das Aglycon des Herzglycosids wird mit Bernsteinsäureanhydrid und Pyridin nach dem Verfahren von Oliver et al, J. Clin. Invest. 47:1035 (1968) behandelt, wobei man folgende Verbindung erhält . · *

HOOC-{ CH

Z=H oder OH

- 24

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- 24 Theophyllin

Nach dem Verfahren von Cook et al. Res. Comm. Chem. Path. Pharm. .13:497 (1976) wird 4,5-Diamino-i ,3-dimethylpyrimi~ din-2,6-dion mit Glutarsäureanhydrid erhitzt, wobei man

H-COOH

Phenobarbital und Primidon

Natriumphenobarbital wird mit Methyl-5-bromovalerat erhitzt und das Produkt wird zu dem entsprechenden Säurederivat von Phenobarbital hydrolysiert (Cook et al, Quantitative Analytic Studies in Epilepsy, herausgegeben von Kelleway und Peterson, Raven Press (New York 1976), S. 39-58):

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Um das Säurederivat von Primidon zu erhalten unter Verwendung der gleichen Methode von Cook et al wird 2-Thiophenbarbital analysiert, hydrolysiert und das Produkt mit Raney-Nickel behandelt, wobei man

erhält.

(CH₂^COOH

Dipheny!hydantoin

Nach dem Verfahren von Cook et al, Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 5:767 (1973) wird Natriumdiphenylhydantoin mit Methyl-5-bromovalerat umgesetzt und anschliessend sauer hydrolysiert, wobei man

erhält.

COOH

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Morphin

Freie Morphinbase wird mit Natrium-ß-chloracetat nach dem Verfahren von Spector et al, Science 168:1347 (1970) behandelt, wobei man ein geeignetes Carbonsäurederivat erhält.

Nikotin

Nach dem Verfahren von Langone et al, Biochem 12 (24): 5025 (1973) werden trans-Hydroxymethylnikotin und Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt, wobei man

HOOC-6CH₂

erhält.

Androgene

Geeignete Carbonsäurederivate von Testosteron und Androstendion, die über einer der 1- oder 7-Stellungen des Steroidkerns verknüpft sind, erhält man nach dem Verfahren von Bauminger et al, J. Steroid Biochem. 5:739 (1974). Typische Testosteronderivate sind

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1-Stellung

7-Stellung

östrogene

Geeignete Carbonsäurederivate von östrogenen, z.B. östron, östradiol und Östriol, erhält man nach dem Verfahren von Bauminger et al. Ein typisches ostronderivat ist

N-OCH₂-COOH

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Progesterone

Geeignete Carbonsäurederivate von Progesteron und dessen Metaboliten, die über eine der 3-, 6- oder 7-Stellungen im Steroidkern verknüpft sind, erhält man nach dem Verfahren von Bauminger et al- Ein typisches Beispiel hierfür sind

H₃C OH

3-Stellung

HOOC-CH₂O-N

6-Stellung

-CH₂-COOH

7-Stellung

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Die vorerwähnten Verfahren sind lediglich Beispiele für die vielen geeigneten Verfahren zur Herstellung von Carbonsäurederivaten von Haptenen, von analytischem Interesse, Die grundsätzlichen Verfahren zur Herstellung von Derivaten sind in Clin. Chem. 22:726 (1976) beschrieben und schliessen die Veresterung eines primären Alkohols mit Bernsteinsäureanhydrid (Abraham und Grover, Principles of Competitive Protein-Binding Assays, herausgegeben von Odell und Daughaday, J. B. Lippincott Co. (Philadelphia 1971), S. 140- 157) ι die Bildung eines Oxims aus der Umsetzung einer Ketongruppe mit einem Carboxymethy!hydroxylamin (J. Biol. Chem. 234:1090 (1959), die Einführung einer Carbonsäuregruppe in einen Phenolrest unter Verwendung von Chloracetat (Science 168:1347 (1970))und das Kuppeln an diazotierte p-Aminobenzoesäure in der in J. Biol Chem. 235:1051 (1960) beschriebenen Verfahrensweise ein.

Die hier erwähnte allgemeine Synthese zur Herstellung der vorliegenden chemilumineszent markierten Konjugate wird nachfolgend anhand der Herstellung des markierten Thyroxin-Konjugats 7-/N-Äthyl-N-(4-thyroxinylamido)-butylZ-aminonaphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazxd erläutert. Die Reaktionsfolge für diese Synthese wird in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.

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Tabelle 1

Ό (J)

COOCH

COOCH.

(2)

COOCH

3 (3)

/2^Η5 COOCH

3 COOCH

3 CD

NH₂NH₂

p es)

H H

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ORIGINAL INSPECTED

Fortsetzung Tabelle 1 :

1. Sarbodiimid

HO

CH₂CH-COOH llHCOCFj

2. HCO₃-

I

H0-< ( ) y- °-(O)"^CH2 f^H" C-NH-^CH₂ ) ₄

- 32 -

909385/0632 ORIGINAL INSPECTED

(A) HERSTELLUNG DES MARKIERTEN KONJUGATS

DimethYl-7-/43N-Xphthalimido)_-butyl/-artiinona2hthalin-Ii2-dicarboxyj.at (3)

Eine Lösung aus 14,1 g (0,05 mol) N-(4-Brombutyl)phthalimid (1) und 25,0 g (0,1 mol) Dimethyl-7-aminonaphthalin-1,2-dicarboxyalat (2) (Gundermann et al, Justus Liebig's Annalen der Chemie 684:127 (1965)) in 100 ml 2,2,2-Trifluoräthanol wurde unter Argon 16 Stunden unter Rückfluss behandelt. Beim Verdampfen erhielt man einen Rückstand, der zwischen 400 ml Äther und 300 ml Wasser (H^O) zugeteilt wurde. Die Ätherphase wurde abgetrennt, getrocknet und abgedampft. Der erhaltene dunkelrote Rückstand wurde über eine Säule von 1200 g Kieselgel (E. Merck, Darmstadt, Westdeutschland) chromatografiert und mit einer 19:1 Mischung (V/V) Benzol und Methanol eluiert. Die ersten 700 ml des Eluats wurden verworfen und dann wurden 20 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 219 bis 251 wurden vereint und eingedampft, wobei man 9 g des substituierten Carboxylats (3) als klares rotes Öl erhielt.

Analyse: NMR-Spektrum (CDCl₃): 61 Π (m. 4H), 3,9 (s, 3H),

4,0 (s, 3H)

IR-Spektrum (CDCl.,): 1720 cm (Carbonyl)

"— + — Massenspektrum (70 eV) m:e: 461 /MH _/,

460 ßUJ, 429 /M⁺ minus

och₃_7

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(4)

Eine Mischung aus 9 g (0,02 mol) des substituierten Carboxylate (3) und 20 ml Diäthylsulfat wurde 2 Stunden unter ARgon auf 83O°C erhitzt. Die dunkle Lösung wurde in ein Becherglas mit zerstossenem Eis, enthaltend 200 ml einer gesättigten wässrigen Natrxumbicarbonatlosung, gegossen. Nachdem das gesamte Eis geschmolzen war, wurde die Mischung mit 3 250 ml Volumina Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden vereint, getrocknet und eingedampft, wobeiman ein rotes Öl erhielt. Das öl wurde über eine Säule von 600 g Kieselgel mit einer 19:1 (V/V) Mischung Benzol und Methanol eluiert und die hellgelben Fraktionen wurden vereint und eingedampft. Überschüssiges Diäthylsulfat wurde durch Sublimation bei 50°C und einem verminderten Druck von 0,01 mm Quecksilber abgedampft, wobei ein Rückstand von 4 g N-Äthyl-substituierten Crboxylat (4) als hellgelbes Öl zurückblieb.

Analyse: NMR-Spektrum (CDCl₃): 63,9 (s, 3H), 4,1 (s, 3H) Massenspektrum (70 eV) m/e: 489 ^7 *J

457 /M⁺ minus OCH₃_7

(5)

Eine Mischung aus 4 g (0,008 mol) des N-äthylierten substituierten Carboxylats (4), 15 ml 85 %-igem Hydrazin und 50 Methanol wurde 3 Stunden unter Rückfluss gehalten.

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Nach dem Abkühlen wurde die Mischung auf einem Drehverdampfer zur Trockne eingedampft und der kristalline Rückstand abgeschabt und über Nacht bei 80 C im Hochvakuum getrocknet. Der entstandene dunkle Feststoff wurde über einer-.Säule aus 200 g Kieselgel (Merck, Darmstadt, Westdeutschland) mit einer 7:3 (V/V) Mischung aus Äthanol und 1m Trimethylammoniumbicarbonat eluiert und 20 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen Nr. bis 75 wurden vereint und eingedampft, wobei man einen gelben Feststoff erhielt. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Pyridin erhielt man 1,1 g Aminohydrazid (5) in Form von feinen gelben Kristallen mit dem Schmelzpunkt 246 bis 247°C.

Analyse für ^c-|q^H22^N4°2 ^:

Berechnet:	C	66	,24	H	6	,80	N	17	,17
Gefunden:		66	,05		6	,69		17	,65

NMR-Spektrum (dg-DMSO): cf1,1 (m, 3H) , 1,5 (m, 4H) IR-Spektrum (KCl): 1615 cm"¹ (Carbonyl)

Zur Bestimmung der Effizienz wurde das Markierungsderivat und Luminol (5-Amino-2,3-dihydrophthalizin-1,4-dion) individuell mit verschiedenen Niveaus im pikomolaren Bereich oxidiert und verglichen mit den Peak-Lichtintensitätenmittels einer grafischen Aufzeichnung. Lineare Anteile der entstandenenKurve ermöglichten eine Berechnung der Veränderung der Peak-Lichtintensität pro Konzentrationseinheit für das Markierungsderivat und für Luminol. Die

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Effizienz des Markierungsderivats wurde als Prozentsatz der Luminol-gebildeten Steigung ausgedrückt.

Reaktionsmischungen (15OuI) der folgenden Zusammensetzung" wurden in 6 χ 50 mm Reagenzgläser gefüllt und in einen Dupont 760 Luminiszenz-Biometer mit einer Empfindlichkeitseinstellung von 820 gegeben. Die Mischungen hatten folgende Zusammensetzung: 50 mmol Natriumhydroxid, 57,5 mmol Barbital, eingestellt auf pH 8,6, 0,27 um Mikroperoxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouiri USA) und entweder das Aminoderivat der Markierung oder Luminol in variierenden Konzentrationen im pikomolaren (pM) Bereich (verdünnt mit H₂O aus einer Vorratslösung von 1 mmol in 0,1M Natriumcarbonat, pH 10,5). Der EndpH der Reaktionsmischung betrug 12,6. Jede Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zum Einleiten der Chemilumineszenz-Reaktion wurden iOul 90 mmol Wasserstoffperoxid in 10 mmol Tris-HCl-Puffer /Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochloric^, pH 7/4, zugegeben. Die Peak-Lichtintensitätswerte wurden anhand der Instrumentablesungen aufgezeichnet. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und der Durchschnitt wurde genommen. Die Effizienz des Markierungsderivates (5) betrug 420 %.

Die Nachweisgrenze wurde als die Konzentration des Markierungsderivates bestimmt, welche eine Peak-Lichtintensität vom 1,5-fach Wert der Hintergrund-Chemilumineszenz in dem Reaktionsgemisch ergab. Die Nachweisgrenze für das Markierungsderivat (5) betrug 0,1 pM.

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^Z2Ei£iü2£ä2§tZi£ilZ£22iS ί ^ )

Eine Lösung aus 20 g (25,6 mmol) L~Thyroxin in 240 ml trockenem Äthylacetat, enthaltend 46 ml Trifluoressigsäure und 7,6 ml Trifluoressigsäureanhydrid, wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur und Zugabe von 200 ml H~O bildete sich eine Suspension, die mit Natriumchlorid gesättigt wurde. Die organische Phase der Mischung wurde abgetrennt, mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei man 21,3 g N-geschütztes Thyroxinderivat (6) erhielt. Eine Probe wurde aus Äther-Pentan umkristallisiert, wobei man feine Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 235°C (Zersetzung) erhielt.

Analyse für C	C	¹IO	F₃J₄N	H	1	/1	5	N	1	,60
Berechnet:		23	/39		1	,1	2		1	,56
Gefunden:	23	,23

IR-Spektrum (KCl): 1700 cm"¹ (Carbonyl)

optische Drhung /3//_D = -14,97° (c 1,0, Dimethylsulfoxid)

Eine Lösung aus 1,746 g (2 mmol) N-Trifluoracetylthyroxin (6) in 20 ml trockenem Pyridin wurde unter Argon und unter

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Rühren auf -10⁰C gekühlt. Zu dieser Lösung wurden 450 mg (2,2 ininol) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und 45 Minuten später 980 mg (3 mmol) des Aminohydrazids (5). Nach 3-stündigem Rühren bei -10⁰C liess man das Reaktionsgemisch über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Die Reaktionsmischung wurde mit 10 ml Pyridin verdünnt, 10g Kieselgel wurden zugegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampft. Der imprägnierte Kieselgel wurde auf eine
Säule aus 200 g Kieselgel, die mit einer 7:3 (V/V) Mischung aus Äthanol und 1 M Triäthy!ammoniumbicarbonat behandelt worden war, gegeben und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Die ersten 400 ml des Eluats wurden verworfen und dann wurden 20 ml Fraktionen gesammelt. Die
Fraktionen 19 bis 30 wurden vereint und eingedampft, wobei man einen gelben kristallinen Rückstand erhielt. Dieses Produkt wurde 3 Stunden in 300 ml 1 m Triäthylamminiumbicarbonat rückflussbehandelt, um die Trifluoracetyl-Schutzgruppe vollständig zu entfernen. Die Lösung wurde dann noch heiss filtriert. Nach dem Abkühlen wurden 15g Kieselgel zugegeben und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Der imprägnierte Kieselgel wurde auf eine 200 g Säule aus Kieselgel gegeben und mit einer 7:3 (V/V) Mischung Äthanol und 1 m Triäthylammoniumbicarbonat eluiert und
es wurden 20 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 30 bis 50 wurden vereint und eingedampft, wobei man 910 mg des markierten Thyroxin-Konjugats (7) als gelben Feststoff erhielt. Eine 110 mg Probe wurde auf einer 45 χ 3,2 cm Säule aus Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, Schweden) mit Methanol eluiert. Die Fraktionen mit einem Volumen von 7 ml wurden gesammelt und die Fraktionen 64 bis 76 wurden vereint und eingedampft, wobei man 60 mg des markierten Konjugats (7) als gelben Feststoff mit dem Schmelzpunkt 218°C (Zersetzung) erhielt.

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Analyse für C₃₃H₃₁J₄N₅O₅:

Berechnet:	C	36	,52	H	2	,88	J	46	,77	N	6	,45
Gefunden:		35	,61		3	,02		44	,69		6	,25

(B) BINDUNGSTEST FÜR THYROXIN

Kompetitive Bindungsreaktionsmischungen (200 11I) wurden dreifach angesetzt durch Kombination der folgenden Reagent ien: 50ul 10 nM markiertes Konjugat (7) in 75 ml Barbital-Puffer (pH 8,6), 50ul einer Zubereitung eines Antikörpers für Thyroxid im gleichen Puffer, variierenden Volumina von 54,8 nM Thyroxin im gleichen Puffer mit einem ausreichenden Volumen an Puffer, um das Endvolumen auf 200 ul zu bringen. Nach 10-minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurden die freie und die gebundene Spezies des markierten Konjugats aus jeder Reaktionsmischung durch Aufbringen eines 150ul aliquoten Teils auf kleine Sephadex G-25 Kolonnen (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) getrennt. Die Kolonnen hatten ein Bettvolumen von 1,5 ul und waren zuvor hintereinander mit 3 ml Volumina 7 %-iger Essigsäure (3 mal), H₂O, 0,1 N Natriumhydroxid (3 mal) und 75 mmol des Barbital-Puffers gewaschen worden. Die gebundene Spezies des markierten Konjugats wurde aus der Säule mit 1,5 ml des Barbital-Puffers eluiert, so dass die freie Spezies in der Säule verblieb.

Ein aliquoter Teil (95 ul) des Abflusses aus jeder Säule wurde zu 55 ul einer Lösung aus 134 mmol Natriumhydroxid,

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0,73umolMikroperoxidase und 27nknol·: Barbital in ein 6 χ 50 mm Reagenzglas gegeben. Nach 10-minütiger Inkubierung bei Raumtemperatur wurde jedes Reagenzglas in ein Dupont 760 Biometer gegeben und dazu wurden 10ul von 90 mM Wasserstoffperoxid in 10 mM Tris-HCT-Puffer (pH 7,4) zugegeben. Die auftretende Peak-Intensität des bei der Chemilumineszenz-Reaktion erzeugten Lichtes wurde von den Instrumentenablesungen aufgezeichnet. Jede Bindungsmischung wurde 3-fach ausgewertet, so dass man insgesamt neun individuelle Peak-Lichtintensitätswerte mass, von denen man für jedes unterschiedliche Volumen an zugegebenem Thyroxin zu der Anfangsreaktionsmischung den Durchschnitt nahm.

Die Peak-Intensitätswerte wurden auch in bezug gesetzt als Prozentsatz des gesamten markiertenKonjugats in der gebundenen Spezies, indem man das Verhältnis solcher Werte zu den Peak-Lichtintensitätswerten, die in der Chemilumineszenz-Reaktion unter Verwendung von 95 ul von 0,25 nM markiertem Konjugat anstelle des Säulenausflusses gemessen hatte. Die Hintergrund-Chemilumineszenz bei der Überwachungsreaktion betrug 0,3 Peak-Intensitätseinheiten.

Die Beziehung der Menge an Thyroxin bei der Bindungsreaktion zu den Peak-Lichtintensitäten und der Prozentsatz des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies werden in der Tabelle 2 gezeigt.

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Tabelle 2

Volumen an zugege bener Thyroxin-Lö- sung (ul)	Peak-Licht- intensität	Prozent in der ge bundenen Spezies
0	26,5	63,1
5	25,3	59,5
10	23,3	55,5
20	23,7	56,4
40	19,1	45,4
60	14,7	35,0
80	13,7	32,6

Die Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemässe markierte Konjugat geeignet ist, in Bindungsversuchen zum Bestimmen eines Liganden in einem flüssigen Medium.

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Claims

ECOPFMANN · EITLE & PARTNER g % 2 1 18

PATENTANWÄLTE

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPL-ING. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · Dl PL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · D-8000 MO NCHEN 81 · TELEFON (089) »11087 · TELEX 05-29619 (PATHE)

. .32 .11 9 o/wa

MILES LABORATORIES INC., ELKHART, INDIANA / USA

Chemilumineszerrte Naphthalin-1 ,2-dicarbonsäurehydrazid-markierte Konjugate und Verfahren zu deren Herstellung

PATENTANSPRÜCHE

1. Ein chemilumineszentes Naphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid-markiertes Konjugat der allgemeinen Formel

L(CO)-NH^CH₂) R

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worin R Wasserstoff oder ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, η 2 bis 6 und L(CO)- ein spezifisch bindungsfähiger Ligand oder ein Bindungsanalog davon, gebunden über eine Amidbindung, bedeuten. "

2. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Antigen oder ein Antikörper dazu, ein Hapten oder ein Antikörper dazu, oder ein Hormon, Vitamin, Arzneimittel , ein Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür ist.

3. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein antigenisches Polypeptid oder Protein, ein Hapten oder ein Antikörper ist.

4. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein antigenisches Polypeptid oder ein Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4.000.000 ist.

5. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Antikörper ist.

6. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500 ist.

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7. Markiertes Konjugat geraäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Jodothyroninhormon ist.

8. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 7, dadurch g e kennzeichnet , dass das Hormon Thyroxin ist.

9. Markiertes Konjugat gemäss Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , dass η = 4 ist.

10. Markiertes Konjugat gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass R Äthyl bedeutet.

11. 7-/N-Äthyl-H-(4-thyroxinylamido)-butylZ-aminonaphthalin-1f2-dicarbonsäure-hydrazid.

12J Eine Verbindung der Formel

worin R Wasserstoff oder eine geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und η■ = 2 bis 6 bedeutet.

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13. Verbindung gemäss Anspruch 12, worin η = 4 ist.

14. Verbindung gemäss Anspruch 13, worin R Alkyl bedeutet.

15. Eine"Verbindung der Formel

COOCH₃

OOCH

worin R Wasserstoff oder ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und η 2 bis 6 bedeuten.

16. Verbindung gemäss Anspruch 15, worin η = 4 ist.

17. Verbindung gemäss Anspruch 16, worin R Äthyl bedeutet.

18. Verfahren zur Herstellung eines chemilumineszenten Naphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid-markierten Konjugats gemäss Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

(a) Umsetzen eines N-(CJ-Bromalkyl)-phthalimids, worin die Alkylgruppen aus 2 bis 6 Methylengruppen bestehen, mit Dimethyl-7-aminonaphthalin-1 ,2-dicarboxylat unter Bildung des Zwischenproduktes Dimethyl-7-/CJ -N-(phthalimid)-alkyl/~aminonaphthalin-1,2-dicarboxylat, worin die Alkylgruppe aus 2 bis 6 Methylengruppen besteht,

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(b) Behandeln des Zwischenprodukt-Dicarboxylats oder dessen durch Behandeln mit einem Dialkylsulfat der. Formel /CH₃-fCH₂-}^j-g72^SO2 , worin m = 0 bis 3 ist, gebildeten, alkylierten Produktes mit Hydrazin unter Überführung der Phthaiimidogruppe in eine Aminogruppe und Ausbildung eines Aminohydrazid-Zwischenproduktes, und

(c) Kuppeln des spezifisch bindungsfähigen Ligandenoder eines Bindungsanalog davon an die Aminogruppe in dem Aminohydrazid-Zwischenprodukt unter Ausbildung einer Amidbindung und Bildung eines chemilumineszent markierten Konjugates.

19. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Antigen oder ein Antikörper dazu, ein Hapten oder ein Antikörper dazu, ein Hormon, Vitamin, ein Arzneimittel, ein Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür ist.

20. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein antigenisches Polypeptid oder Protein, ein Hapten oder ein Antikörper ist.

21. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein antigenisches Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4.000.000 ist.

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22. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Antikörper ist.

23. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500 ist.

24. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand ein Jodothyroninhormon ist.

25. Verfahren gemäss Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet , dass das Hormon Thyroxin ist.

26. Verfahren gemäss Anspruch 18 oder 25, dadurch gekennzeichnet , dass die Alkylgruppe in dem N-(CJ-Bromalkyl)-phthalimid aus 4 Methylengruppe besteht.

27. Verfahren gemäss Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , dass das Dialkylsulfat Diäthylsulfat ist.

28. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifisch bindungsfähige Ligand oder dessen Analog eine Carboxylgruppe enthält und an die Aminogruppe in dem Aminohydrazid-Zwischenprodukt durch eine Peptidkondensation gebunden wird.

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29. Verwendung einer Verbindung gemäss Ansprüchen 1 bis 8 bei einem spezifischen Bindungsverfahren zur Bestimmung des Liganden oder eines spezifischen Bindungspartners davon in einem flüssigen Medium.

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