DE2618511A1 - Verfahren zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium und mittel zu dessen durchfuehrung - Google Patents

Description

Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium und Mittel zu dessen Durchführung

Die Erfindung betrifft ein Diagnostiziermittel, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu dessen Anwendung in einer homogenen spezifischen Bindungsbestimmung *)bei der eine Markierungs-Substanz zum Nachweis eines Liganden in einem flüssigen Medium angewandt wird, die die Fähigkeit besitzt, zu reagieren, d.h. ein Reagens. Das Diagnostiziermittel und die Vorrichtung umfassen ein Konjugat aus einer spezifisch bindenden Substanz, die an das Reagens gekuppelt ist. Das Reagens ist vorzugsweise ein enzymatisch.es Reagens, wie ein Enzymsubstrat oder Coenzym. Die Aktivität des konjugierten Reagenses als Bestandteil einer vorher bestimmten Reaktion wird beeinflußt durch die Reaktion zwischen der spezifisch bindenden Substanz in dem Konjugat und einem spezifisch bindenden Gegenstück dazu. Das Vorhandensein eines Liganden in einem flüssigen Medium kann bestimmt werden mit Hilfe der Konkurrenz oder verdrängenden Bindung oder aufeinanderfolgenden Sättigungsverfahren, wobei die spezi-

*) d.h. Nachweis bzw. Bestimmung einer Substanz durch spezifische Bindung.

8 O 9 8 L 5 / 1 O 7 3

26185

fisch, bindende Substanz in dem Kongugat der Ligand oder ein spezifisch, bindendes Analoges davon ist oder mit Hilfe eines direkten Bindungsverfahrens, bei dem die spezifisch. bindende Substanz ein spezifisch bindender Partner des Liganden ist. Die Wirkung der spezifischen Bindungsreaktion auf die Aktivität des konjugierten Eeagenses hängt zusammen mit dem Vorhandensein oder der Menge des Liganden in dem untersuchten flüssigen Medium.

Die Erfindung betrifft Mittel, Vorrichtungen und Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Liganden in einem

flüssigen Medium, beruhend auf der Affinität des Liganden für einen spezifisch bindenden Partner dazu. Die Erfindung betrifft besonders Mittel, Vorrichtungen und Verfahren zur Anwendung bei Untersuchungen mit Hilfe spezifischer Bindungsreaktionen, wobei keine Trennung erforderlich ist und keine radioaktiven Materialien oder modifizierten Enzyme als Markierungssubstanzen angewandt werden.

Der Wunsch nach bequemen zuverlässigen und nicht gefährlichen Mitteln zum Nachweis des Vorhandenseins geringer Konzentrationen von Substanzen in Flüssigkeiten ist selbstverständlich. Das trifft besonders zu auf das Gebiet der klinischen Chemie, wo Bestandteile von Körperflüssig-

—11 keiten, die in so geringen Konzentrationen, wie 10 m

vorkommen und von denen bekannt ist, daß sie pathologische Bedeutung besitzen. Die Schwierigkeit, so geringe Konzentrationen nachzuweisen, ist besonders deutlich auf dem Gebiet der klinischen Chemie, wo die Probengröße üblicherweise ziemlich begrenzt ist.

Klassischerweise wurden Substanzen in Flüssigkeiten nachgewiesen, aufgrund eines EeaktionsSchemas, bei dem die nachzuweisende Substanz ein notwendiger Eeaktionspartner ist. Das Vorhandensein der unbekannten Substanz wird angezeigt durch das Auftreten eines Eeaktionsproduktes oder

das Verschwinden eines bekannten Reaktionspartners. In bestimmten Fällen kann ein solches Bestimmungsverfahren quantitativ sein, beruhend auf einer Messung entweder der Geschwindigkeit, in der das Produkt auf-

,der Reaktionspartner

tritt oder/verschwmdet oder einer Messung der gesamten entstehenden Produktmenge oder des verbrauchten Reaktionspartners bei Erreichung des Gleichgewichtes. Jedes Reaktionssystem für Bestimmungen ist notwendigerweise entweder auf die Anwendung zum Nachweis nur einer kleinen Gruppe von Substanzen beschränkt oder es ist nicht spezifisch.

Die Suche nach Bestimmungssystemen, die hoch spezifisch sind aber auf den Nachweis eines weiten Bereiches von Substanzen anwendbar sind, hat zu den radioimmunologischen Bestimmungsverfahren geführt. Bei diesem System läßt man eine bekannte Menge einer radioaktiv markierten Form der zu bestimmenden bzw. nachzuweisenden Substanz mit der unbekannten Substanz um eine begrenzte Menge von . Antikörper zu der unbekannten Substanz in Konkurrenz treten. Die Menge der markierten Substanz, die an die Antikörper gebunden wird, ändert sich zwangsläufig mit der vorhandenen Menge an unbekannter Substanz. Mit den radioimmunologischen Bestimmungsverfahren ist immer die Notwendigkeit verbunden, die markierte Form der nachzuweisenden Substanz, die an die Antikörper gebunden wird, von dem nicht gebundenen Anteil abzutrennen. Während verschiedene Verfahren entwickelt worden sind, diese erforderliche Trennung herbeizuführen (US-PS 3 505 019,' 3 555 143, 3 646 346, 3 720 760 und 3 793 445) ist in jedem Falle zumindest eine Verfahrensstufe, wie Filtrieren, Zentrifugieren oder Vaschen erforderlich, um eine wirksame Trennung der gebundenen markierten Form von der nicht gebundenen markierten Form sicherzustellen. Die Eliminierung der Trennungsstufe würde die Untersuchung stark vereinfachen und sie für klinische Laboratorien ge-

609845/1073

eigneter machen.

Die Anwendung radioaktiver Substanzen für immunologische Bestimmungsverfahren wurde in gewissem Maße ausgeschaltet durch die Anwendung von mit Enzym markierten Substanzen anstelle der radioaktiven Markierung. Wie in den US-PS 3 654 090 und 3 791 932 angegeben, sind die für die Durchführung von immunologischen Bestimmungsverfahren mit Hilfe enzymmarkierter Substanzen erforderlichen Verfahrensstufen zum größten Teil die gleichen, wie sie für radioimmunologische Bestimmungen erforderlich sind und umfassen die mühsame Trennung. Ein weiterer Nachteil der Anwendung enzymmarkierter Substanzen besteht darin, daß jedes zur Markierung angewandte Enzym einzeln chemisch für die Bildung des markierten Konjugats modifiziert werden muß. Die Anwendung anderer Markierungssubstanzen wurde vorgeschlagen, wie die Anwendung von Coenzymen oder "Viren (Nature219:186 (1968) ) und die Anwendung von fluoreszierenden Markierungen (EE-PS 2 217 350).

Obwohl die immunologischen Bestimmungsverfahren mit Hilfe radioaktiv oder mit Enzymen markierter Substanzen bezüglich der Gruppe von Substanzen, die damit nachweisbar sind, oder bezüglich einer Vereinfachung des Verfahrens in der Zukunft möglicherweise noch, weiter entwickelt werden erfordern sie aufgrund ihrer Natur immer eine Trennung. Vor einiger Zeit wurde ein anderes Verfahren angegeben, bei dem keine Trennung erforderlich ist und das daher als homogenes System bezeichnet wurde, im Gegensatz zu einem heterogenen System, bei dem die Trennung wesentlich ist. Die US-PS 3 817 837 beschreibt ein Bestimmungsverfahren durch konkurrierende Bindung, umfassend das Zusammenbringen der zu untersuchenden Flüssigkeit mit einem löslichen Komplex, bestehend aus einem Enzym als Markierungssubstanz, das kovalent an den nachzuweisenden Liganden

609845/1073

gebunden, ist_f und mit einem löslichen Eeζeptor,üblicherweise einem Antikörper, für den Liganden; dann wird die Wirkung des zu bestimmenden Liganden auf die enzymatisch^ Wirksamkeit des Enzyms in dem Komplex bestimmt.

Während dieses Verfahren den Vorteil besitzt, daß keine Trennung erforderlich, ist, da die Reaktion zwischen dem enzymgebundenen Ligandenkomplex und dem Rezeptor zu einer Hemmung der Enzymaktivität des Enzyms in dem Komplex führt, ist das Verfahren trotzdem eng begrenzt bezüglich seiner Fähigkeit auf stark variierende Anforderungen bei der' Bestimmung angepaßt zu werden. Z.B. ist es selbstverständlich wesentlich, daß bei der Herstellung des enzymgebundenen Ligandenkomplexes die nachzuweisende Substanz bzw. der Ligand auf sorgfältig gesteuerte Weise mit dem Enzym gekuppelt werden muß, so daß die Kupplungsstelle nahe an der enzymatisch aktiven Stelle des Enzyms liegt. Das ist erforderlich, um zu erreichen, daß bei der Reaktion zwischen dem komplexierten Liganden und dem Rezeptor die enzymatisch aktive Stelle blockiert wird. Enzyme variieren stark in ihrer Größe und im Molekulargewicht von ungefähr 10 000 bis zu 1 000 000. So muß für einen Rezeptor in Form eines Antikörpers mit einem Molekulargewicht von 150 000 bis 300 000 die Kupplungsstelle genau geregelt werden, damit er imstande ist, die aktive Stelle eines Enzyms mit einem mittleren Molekulargewicht von 500 000 oder darüber zu blockieren. Aufgrund der komplexen chemischen Struktur von Enzymen ist eine genaue Regelung einer derartigen chemischen Bindung selbstverständlich schwierig und es wäre zu erwarten, daß;selbst bei Untersuchung einer großen Vielfalt von Enzymen,nur eine geringe Anzahl für dieses homogene Bestimmungsverfahren geeignet wäre.

Außerdem ist es, um quantitative Testergebnisse „zu erhalten,

/(Menge)

erforderlich, genau das Verhältnis der Anzahl'von Enzymen

609845/ 1073

zur Anzahl von Liganden in jedem enzymgebundenen Ligandenkomplex zu regeln. Auch hier macht die komplexe Peptidstruktur der Enzyme eine solche Regelung schwierig. Es wäre wieder zu erwarten, daß nur eine geringe Anzahl von Enzymen eine geeignete Molekularstruktur besitzen würde, um die notwendige Regelung des Liganden/Enzym-Verhältnisses zu ermöglichen.

Das bekannte homogene Bestimmungsverfahren soll eine Enzymerweiterung umfassen und dadurch sehr empfindlich sein. Da die Markierungssubstanz, nämlich das Enzym, jedoch selbst der begrenzende Faktor ist, der die Empfindlichkeit des bekannten Bestimmungsverfahrens bestimmt, ist die Anwendbarkeit des Verfahrens sehr begrenzt. Die Empfindlichkeit ist deutlich beschränkt auf die katalytische Aktivität des speziellen Enzyms in dem enzymgebundenen Ligandenkonjugat. Die Anwendbarkeit des bekannten Verfahrens ist daher nicht nur durch die Kupplungserfordernisse zur Bildung eines, "geeigneten Kon- «jugats begrenzt, sondern auch durch die Abhängigkeit der Empfindlichkeit der Bestimmung, bei der ein derartiges Konjugat angewandt wird, auf die Aktivität des speziellen konjugierten Enzyms.

Ein weiterer Nachteil des bekannten homogenen Bestimmungsverfahrens tritt auf bei seiner Anwendung zur Untersuchung von biologischen Flüssigkeiten, wie Urin und Serum. Es ist zu erwarten, daß deutliche Mengen der Enzymarten, die in dem enzymgebundenen Ligandenkonjugat enthalten sind,in der flüssigen, zu untersuchenden Probe auftreten können, wodurch eine nicht regelbare Hintergrundsaktivität entstehen würde, die die Genauigkeit des Bestimmungsverfahrens stark nachteilig beeinflussen würde. Daher müssen, um ein Bestimmungssystem herzustellen, das geeignet ist

50984 5/1073

zur Untersuchung von biologischen Flüssigkeiten von Menschen oder Tieren, ausgefallene Enzyme ausgewählt werden, die in derartigen Flüssigkeiten nicht vorkommen, um das enzymgebundene Ligandenkonjugat herzustellen mit der Folge, daß die Anwendbarkeit des Bestimmungsverfahrens noch weiter eingeschränkt wird.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Mittel, Vorrichtungen und Verfahren zu entwickeln zum Nachweis eines Liganden in einer Flüssigkeit, die keine Trennung erforderlich machen, bei denen keine unbequemen radioaktiven Substanzen oder modifizierte Enzyme als Markierungssubstanzen angewandt werden müssen und die vielseitiger anwendbar und bequemer sLrd als die bekannten homogenen spezifischen Bindungsverfahren. Dabei soll bei einem homogenen BeStimmungsverfahren bzw.-system mit Hilfe einer spezifischen Bindung eine Markierungs- . substanz angewandt werden, die mit dem Liganden oder einem spezifisch bindenden Partner davon bequemer gekuppelt werden kann als das Enzym nach dem bekannten Verfahren und wobei die Aktivität der Markierungssubstanz leichter durch eine spezifische Bindungsreaktion angegriffen wird als diejenige des Enzyms nach dem bekannten Verfahren. Außerdem soll das Verfahren besser anwendbar sein auf die Untersuchung biologischer Flüssigkeiten.

Die vorliegende Erfindung schafft ein sehr bequemes vielseitig anwendbares und empfindliches Bestimmungsverfahren mit Hilfe spezifischer Bindungen und ein System, bei dem als Markierungssubstanz eine Substanz angewandt wird, die eine bestimmte Reaktionsfähig/ a*xs Bestandteil einer vorher bestimmten Reaktion besitzt und die im folgenden als Reagens bezeichnet wird. Das Verfahren beruht teilweise auf der Tatsache, daß die Reaktion zwischen einem

609845/1073

I - 8 -

Iiiganden und einem spezifisch bindenden Partner dazu, wobei das Reagens an einen dieser Reaktionspartner gekuppelt ist, die Aktivität des Reagenses bei der vorher bestimmten Reaktion verändert und wodurch die Reaktion als Mittel zur Überwachung der spezifisch bindenden Reaktion dient. Im Hinblick auf dieses grundlegende Phänomen können verschiedene VerfahrensSchemen,umfassend verschiedene Diagnostiziermittel und Vorrichtungen_/angewandt werden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die bevorzugten grundlegenden Verfahrensschemata sindein direktes Bindungsverfahren und ein Konkurrenzbindungsverfahren.

Bei dem direkten Bindungsverfahren wird ein flüssiges Medium,von dem vermutet wird, daß es den nachzuweisenden Liganden enthält, mit einem Konjugat zusammengebracht, umfassend das Reagens, das an einen spezifisch bindenden Partner des Liganden gebunden ist und anschließend irgend eine Änderung der Aktivität des Reagenses bestimmt. Bei dem Konkurrenzbindungsverfahren wird das flüssige Medium mit einem spezifisch bindenden Partner des Liganden zusammengebracht und mit einem Konjugat, umfassend das Reagens, das an den Liganden und/oder ein spezifisch bindendes Analoges dazu gekuppelt ist und anschließend jede Änderung in der Aktivität des Reagenses bestimmt. Bei beiden Verfahren wird die Aktivität des Reagenses bestimmt, indem man das flüssige Medium mit. mindestens einem Reaktionspartner zusammenbringt, der mit dem ersten Reagens die vorher bestimmte Nachweisreaktion eingeht. Eine qualitative Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium umfaßt einen Vergleich einer charakteristischen Eigenschaft, üblicherweise der Geschwindigkeit der eintretenden Reaktion mit derjenigen der Nachweisreaktion in einem flüssigen Medium, das den Liganden nicht enthält₍ und der Unterschied zwischen den beiden ist ein Hinweis auf eine Änderung der Aktivität des Reagenses. Die quantitative Bestimmung des

609845/1073

Liganden in dem flüssigen Medium umfaßt einen ¥ergleich einer Eigenschaft der entstehenden Reaktion mit derjenigen der Vergleichsreaktion in einem flüssigen Medium, das bekannte Mengen des Liganden enthält.

Die Nachweisreaktion ist vorzugsweise enzymkatalysiert. Üblicherweise wird eine Nachweisreaktion gewählt, die für das Eeagens in dem Konjugat sehr empfindlich ist. In dieser Beziehung sind Lumineszens- oder Fluoreszensreaktionssysteme sehr geeignet. Besonders bevorzugt sind cyclische Reaktionssysteme,, besonders solche, bei denen das, Eeagens das cyclisierte Material ist. Bei den bevorzugten cyclischen Reaktionssystemen sind die enzymkatalysierten besonders vorteilhaft. Das Reagens in dem Konjugat ist üblicherweise ein enzymatisch.es Reagens, wie ein Eazymsubstrat oder - wie es besonders bevorzugt ist - ein Coenzym und besitzt vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als 9 000.

Bei den Figuren zeigt:

I¹Xg. 1 eine graphische Darstellung der Wirkung verschiedener Gehalte eines Liganden auf die Gesamt-R-eäktionsgeschwindigkeit bei einem Bestimmungsverfahren bei einer cyclischen direkten Bindungs-BeStimmung;

Fig. 2

bzw. 3 graphische Darstellungen der Wirkung verschiedener Gehalte an zwei unterschiedlichen Liganden auf die Gesamt-Reaktionsgeschwindigkeit

bei einem Konkurrenz-Bindungs-Gyc1i si erung sverfahren;

Fig. 4

bzw. 5 graphische Darstellungen der Wirkung ver-

i
B0984S/1073

schiedener Gehalt an zwei unterschiedlichen Liganden auf die Spitzenlichtintensität, die "bei einem Konkurrenzbindungs-Biolumineszens-Bestimmungsverfahren auftritt;

Fig. 6 eine graphische Darstellung der Wirkung verschiedener Gehalte an Liganden auf die Nettogeschwindigkeit von zwei unterschiedlichen Reaktionen einer enzymkatalysierten und einer anderen nicht enzymkatalysierten "bei einem direkten Bindungs-Fluoreszens-Bestimmungsverfahren;

Fig. 7

bzw. 8 . graphische Darstellungen der Wirkung verschiedener Gehalte an einem Liganden auf die !Reaktionsgeschwindigkeiten bei zwei unterschiedlichen Konkurrenzbindungs-Bestimmungsverfahren, beideneadas eine eine Fluoreszensnachweisreaktion umfaßt und das andere eine spektrophotometrische Nachweisreaktion;

KLg- 9

bzw.10 graphische Darstellungen der Wirkung verschiedener Gehalte an zwei unterschiedlichen Liganden auf die relative Intensität der Lumineszens, die bei direkten und konkurrierenden Bindungs-Biolumineszens-Bestimmungsverfahren auftritt ;

Fig. 11

bzw. 12 graphische Darstellungen der Wirkung verschiedener Gehalte an einem Liganden auf die Spitzenlichtintensität, die bei zwei unterschiedlichen Konkurrenzbindungs-Chemilumineszens-Bestimmungsverfahren auftritt.

609845/1073

Im Eahmen dieser Beschreibung besitzen die folgenden Ausdrücke die angegebene Bedeutung: Ligand ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorhandensein oder deren Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll. Spezifisch bindender Partner zu dem Liganden ist irgend eine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt. Spezifisch bindendes Analoges zu dem Liganden ist irgend eine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich bezüglich der Bindungsaffihität gegenüber dem spezifisch bindenden Partner zu dem Liganden im wesentlichen wie der Ligand verhält.

Allgemein können die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion, d.h. das flüssige Medium, von dem vermutet wird, , daß es den Liganden enthält, das Konjugat und/oder ein spezifisch bindender Partner zu dem Liganden in irgend einer beliebigen Menge, Weise und Reihenfolge zusammengegeben werden, vorausgesetzt, daß die Aktivität des Eeagenses in dem Konjugat meßbar geändert wird, wenn das flüssige Medium den Liganden in einer für die Zwecke . der Bestimmung ausreichenden Menge oder Konzentration enthält. Vorzugsweise sind alle Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion in dem flüssigen Medium löslich, wodurch man ein homogenes Bestimmungssystem erhält. Es kann gegebenenfalls jedoch auch ein heterogenes Bestimmungssystem angewandt werden, in dem das Konjugat oder ein . spezifisch bindender Partner zu dem Liganden unlöslich ist.

Wenn ein direktes Bindungsverfahren angewandt wird, sind die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion das flüssige Medium, von dem vermutet wird, daß es den Liganden enthält und eine Menge eines Konjugats, umfassend das

609845/1073

Reagens, das an einen spezifisch bindenden Partner zu dem Liganden gekuppelt ist. Die Aktivität des konjugierten Reagenses "bei Berührung mit dem flüssigen Medium ändert/ zwangsläufig mit dem Maß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifisch "bindenden Partner in dem Konjugat. So nimmt die Aktivität des konjugierten Eeagenses a"b, in dem Maße, wie die Menge an Liganden in dem flüssigen Medium zunimmt. Um quantitative Ergebnisse zu erzielen, ist die Menge an spezifisch bindendem Partner, die mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird, üblicherweise größer als diejenige Menge, die imstande ist, mit dem gesamten Liganden, wie er in dem flüssigen Medium vermutet wird, Bindungen einzugehend während der Zeit, die das Konjugat und das flüssige Medium in Berührung stehen, vor Beendigung der Bestimmung der Aktivitätsänderung des konjugierten Reagenses. Bei der praktischen Durchführung wird die Menge an spezifischem Partner entsprechend den oben angegebenen Kriterien ausgewählt, beruhend auf der Annahme, daß der Ligand in der größten Menge in dem flüssigen Medium vorhanden ist, in der er dort vorhanden sein kann. Ein direktes Bindungsverfahren ist besonders geeignet zum Nachweis von hochmolekularen Liganden, die spezifisch bindende Partner besitzen, die kleiner sind als sie selbst.

Wenn ein Konkurrenzbindungsverfahren angewandt wird, sind die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion das flüssige Medium, von dem angenommen wird, daß es den Liganden enthält, eine Menge eines Konjugats, umfassend das an den Liganden oder ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden gekoppelte Reagens, und eine Menge eines spezifisch bindenden Partners zu dem Liganden. Der spezifisch bindende Partner wird im wesentlichen gleichzeitig

sowohl mit dem Konjugat und dem flüssigen Medium zusammen gebracht.

f 609845/1073

Da irgend ein Ligand in dem flüssigen Medium mit dem Liganden oder dem spezifisch, bindenden Analogen davon in dem Konjugat um die Bindung mit dem spezifisch bindenden Partner in Konkurrenz tritt, ändert sich die Aktivität des konjugierten Eeagenses in Berührung mit dem flüssigen Medium direkt mit dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifisch bindenden Partner. So nimmt die Aktivität des konjugierten Reagenses zu mit einer Zunahme der Menge des Liganden in dem flüssigen Medium. Um quantitative Ergebnisse zu erhalten, ist die Menge an dem spezifisch bindenden 'Partner, die mit dem Konjugat und dem flüssigen Medium zusammengebracht wird, üblicherweise geringer als diejenige Menge, die imstande ist, Bindungen einzugehen mit dem gesamten in dem flüssigen Medium vermuteten Liganden und dem gesamten Liganden oder Analogen des Liganden in konjugierter Form innerhalb der Zeit, die der spezifisch bindende Partner,das Konjugat und das flüssige Medium miteinander in Berührung stehen, vor der Beendigung der Bestimmung der Aktivitätsänderung des konjugierten Eeagenses. In der Praxis wird eine solche Menge an spezifisch bindendem Partner ausgewählt, entsprechend den oben angegebenen Kriterien, beruhend auf der Annahme, daß die größte Menge an Liganden, die in dem flüssigen Medium vorhanden sein kann, tatsächlich vorhanden ist. Im allgemeinen geht die Menge an Liganden oder Analogen des Liganden in konjugierter Form,die mit dem flüssigen Medium in Berührung gebracht wird, nicht über die geringste Menge an nachzuweisenden Liganden in dem flüssigen Medium hinaus. Ein Konkurrenzbindung sverf ahr en ist besonders geeignet zum Nachweis von Liganden, die spezifische Bindepartner besitzen, die größer sind als sie selbst.

Eine Variante des Konkurrenzbindungsverfahrens ist das Verdrängungsbindungsverfahren, bei dem das Konjugat zunächst mit dem spezifisch bindenden Partner des Liganden

6098 4 5/10 73

und anschließend mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird. Dann tritt Konkurrenz um den spezifisch bindenden Partner ein. Bei einem solchen Verfahren ist die Menge an Konjugat, die mit dem spezifisch bindenden Partner zusammengebracht xfird, üblicherweise so, daß der Ligand oder das Analoge davon in einem Überschuß vorhanden ist gegenüber derjenigen Menge, die imstande ist, mit der vorhandenen Menge des spezifisch bindenden Partners in der Zeit zu reagieren, die das Konjugat und der spezifisch bindende Partner in Berührung stehen, vor der Berührung mit dem flüssigen Medium, in dem der Ligand vermutet wird. Diese Reihenfolge des Inberührungbringens kann auf eine von zwei unterschiedlichen Arten erreicht werden. Bei einem Verfahren wird das Konjugat mit dem spezifisch bindenden Partner in einer flüssigen Umgebung in Berührung gebracht, bevor es mit dem flüssigen Medium in Berührung gebracht wird, in dem der Ligand vermutet wird. Bei dem zweiten Verfahren wird das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, mit einem Komplex in Berührung gebracht, umfassend das Konjugat und den spezifisch bindenden Partner, wobei die spezifisch bindende Substanz . in dem Konjugat und der spezifisch bindende Partner reversibel aneinander gebunden sind. Die Menge des Konjugats, die bei der ersten Arbeitsweise an den spezifisch bindenden Partner gebunden wird sowie die Menge davon, die nach der zweiten Arbeitsweise in komplexierter Form vorliegt, ist üblicherweise größer als diejenige Menge, die imstande ist, durch den gesamten Liganden in dem flüssigen Medium in der Zeit ersetzt zu werden, die der spezifisch bindende Partner oder Komplex und das Medium in Berührung stehen, vor Beendigung der Bestimmung irgend einer Änderung der Aktivität in dem konjugierten Reagens.

Eine andere Variante des Konkurrenzbindungsverfahrens ist ein aufeinanderfolgendes Sättigungsverfahren, bei dem die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion die gleichen sind, wie sie angewandt werden für das Kon-

609845/1Q73

kurrenzbindungsverfahren, aber die Reihenfolge der Zugabe oder des Zusammengebens der Komponenten und die relativen Mengen der Komponenten sind unterschiedlich. Bei einem aufeinanderfolgenden Sättigungsverfahren wird der spezifisch bindende Partner des Liganden mit dem flüssigen Medium, in dem der Ligand vermutet wird, zusammengebracht eine Zeit lang, bevor das flüssige Medium mit dem Konjugat zusammengebracht wird. Die Menge an spezifisch bindendem Partner, die mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird, ist üblicherweise größer als diejenige Menge, die mit dem gesamten, in dem flüssigen. Medium vermuteten Liganden innerhalb der Zeit Bindungen eingehen kann, die der spezifisch bindende Partner und das flüssige Medium in Berührung stehen, bevor das flüssige Medium mit dem Konjugat in Berührung gebracht wird. Außerdem ist die Menge an Liganden oder Ligandenanalogen in konjugierter Form üblicherweise größer als diejenige Menge, die imstande ist, mit der restlichen nicht gebundenen Menge des spezifisch bindenden Partners während der Zeit Bindungen einzugehen, die das flüssige Medium und das Konjugat in Berührung steht , vor Abschluß der Bestimmung einer Aktivitätsänderung in dem konjugierten Reagens. In der Praxis werden die Mengen an spezifisch bindendem Partner und Liganden oder Ligandenanalogen in konjugierter Form entsprechend dem oben angegebenen Kriterium ausgewählt, wobei man davon ausgeht, daß die größte Menge an Liganden in dem flüssigen Medium vorhanden ist, die vorhanden sein könnte.

Verfahrensweisen, die andere Reihenfolgen der Zugabe und andere relative Mengen der spezifischen Komponenten der Bindungsreaktion anwenden, können für ein homogenes Bestimmungsverfahren mit Hilfe spezifischer Bindungen ebenfalls angewandt werden.

609845/1073

Die Bestimmung der Aktivitätsänderung des konjugierten Reagenses als Bestandteil einer vorher bestimmten Nachweisreaktion wird günstigerweise durchgeführt, indem man das Reaktionsgemisch der spezifischen Bindungsreaktion mit mindestens einer Substanz zusammenbringt, die mit dem konjugierten Reagens die Nachweisreaktion eingeht und die Wirkung der spezifischen Bindungsreaktion auf eine Eigenschaft dieser Reaktion bestimmt. Die Nachweisreaktion kann eine einzelne chemische Umxrandlung oder eine Vielzahl oder Reihe chemischer Umwandlungen umfassen. Wenn nicht anders angegeben, bedeutet der Ausdruck "Reaktionssystem" hier die ganze oder einen Teil der vorher-bestimmten Nachweisreaktion.

Wenn ein enzym-katalysiertes Reaktionssystem angewandt wird, umfaßt es neben dem konjugierten Reagens mindestens ein Enzym und kann auch ein oder mehrere enzymatisch^ Reagentien, wie Substrate und Coenzyme umfassen. Ein derartiges enzymkatalysiertes Reaktionssystem kann eine einzelne einfache enzymatisch^ Reaktion oder eine komplexe Reihe von enzymatischen und nichtsenzymatischen Reaktionen umfassen. Z.B. kann das enzymkatalysierte Reaktionssystem aus einem einzigen enzymkatalysierten Abbau oder einer Dissoziationsreaktion bestehen. In einem solchen System ist das konjugierte Reagens das Enzymsubstrat, das abgebaut oder dissoziiert wird und die einzige Komponente des Reaktionssystems, die mit dem spezifisch bindenden Reaktionsgemisch in Berührung gebracht werden muß, ist ein Enzym, das den Abbau oder die Dissoziationsreaktion katalysiert. Ein komplexeres enzymkatalysiertes Reaktionssystem kann aus einer einzelnen enzymatischen Reaktion bestehen, · umfassend zwei oder mehrere Reaktionsteilnehmer, oder es kann aus einer Reihe von Reaktionen bestehen, umfassend verschiedene Reaktionsteilnehmer, von denen mindestens eine Reaktion enzymkataly-

609845/1073

'■ - 17 -

siert ist. In einem solchen System wäre das konjugierte Reagens einer der enzymatisehen Reaktionsteilnehmer der enzymkatalysierten Reaktion und das Gemisch der spezifischen Bindungsreaktion würde mit dem entsprechenden Enzym und den anderen Komponenten der Reaktion aufer dem Konjugat zusammengebracht, die erforderlich sind, um das.gewünschte enzymkatalysierte Reaktionssystem zu ergeben.

Das enzymkatalysierte Reaktionssystem kann ferner ein biochemisches System umfassen, das so komplex ist wie das Stoffwechselsystem einer biologischen Zelle, wie eines Mikroorganismus. Z.B. kann eine Nährsubstanz, die für das Wachstum eines speziellen Mikroorganismus wesentlich ist, als Reagens in dem Konjugat angewandt werden. Irgend eine Änderung der Aktivität des Reagenses würde zu einer Änderung der Wachstumseigenschaften des Mikroorganismus führen, wenn ein solcher Mikroorganismus in eine Umgebung gebracht v/erden würde, in der die einzige Quelle für die Nährsubstanz das Konjugat ist. So würde z.B. eine Änderung in der Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus, wenn er mit dem Gemisch der spezifischen Bindungsreaktion zusammengebracht wird, das Vorhandensein des Liganden anzeigen.

Die entsprechenden Reaktionsbestandteile, die zusammen mit dem Reagens in dem Konjugat das Nachweisreaktionssystem bilden, können mit dem Gemisch der spezifischen

Bindungsreaktion einzeln oder in irgend einer Kombination

_, . , ... , _, . ,,' ,. /Auslösung der. vorher,gLeiohzeitig oder anschließend an die'spezifischen

BiP-dungsreaktion zusammengebracht werden. Nach Beginn der spezifischen Bindungsreaktion wird das Reaktionsgemisch, das irgend eine oder alle der erforderlichen Bestandteile für die Nachweisreaktion enthalten kann, üblicherweise eine vorher-bestimmte Zeit inkubiert, bevor eine Änderung der -Aktivität des Reagenses in dem Konjugat

f
60984 5/1073

bestimmt wird. !fach, der Inkubationszeit werden irgend welche Bestandteile, die für die Nachweisreaktion erforderlich sind und die nicht schon in ausreichenden Mengen in dem Reaktionsgemisch vorhanden sind, zugegeben, und eine Wirkung auf die Nachweisreaktion bestimmt als Zeichen für das Vorhandensein oder die Menge des Liganden

in dem flüssigen Medium_J Wenn der Ligand in dem flüssigen Medium nicht vorhanden ist oder in einer nicht nachweisbar geringen Menge, besitzt die vorbestimmte Nachweisreaktion einen verhältnismäßig konstanten Charakter. Wenn der Ligand in dem flüssigen Medium vorhanden ist, wird mindestens ein ,Charakteristikum oder eine Eigenschaft der Nachweisreaktion verändert. Im allgemeinen ist die Aktivität des konjugierten Reagenses definiert als das Ausmaß oder die Geschwindigkeit, mit der das Reagens imstande ist, an der Nachweisreaktion teilzunehmen. So wird der Charakter der Nachweisreaktion verändert durch das Vorhandensein des Liganden in dem flüssigen Medium, üblicherweise im Hinblick entweder auf die Geschwindigkeit der

Gesamtreaktion oder auf die Menge eines oder mehrerer Reaktionsprodukte, die dabei im Gleichgewicht gebildet werden. Im üblichen Falle wird die Fähigkeit des konjugierten Reagenses,an der Nachweisreaktion teilzunehmen, herabgesetzt durch die Reaktion zwischen der spezifisch bindenden Substanz,mit der es konjugiert ist und einem spezifisch bindenden Gegenstück zu dieser spezifisch bindenden Substanz, d.h. das Konjugat ist in freier Form aktiver in der Nachweisreaktion als in gebundener Form. Die relativen Mengen an freiem und gebundenem Konjugat, die nach der Inkubation der spezifischen Bindungsreaktion vorhanden sind, sind eine Funktion der Menge des Liganden in dem flüssigen Medium und sind bestimmend für die Wirkung auf die Nachweisreaktion.

Wenn die Änderung in der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit der Nachweisreaktion das Charakteristikum ist, das angewandt

60984 5/107

wird, um das Vorhandensein des Liganden zu "bestimmen, wie es bevorzugt ist, wird eine derartige Geschwindigkeit üblicherweise "bestimmt durch Messung der Geschwindigkeit, in der ein Reaktionspartner verschwindet oder der Geschwindigkeit, mit der ein •Reaktionsprodukt auftritt. Eine derartige Messung kann durch viele verschiedene Verfahren durchgeführt werden, wie die üblichen chromatographischen, gravimetrischen, potentiometrischen, spektrophotometrischen, fluorometrisehen, Trübungsmessungen und volumetrisehen Bestimmungen. Da das erfindungsgemäße Verfahren in erster Linie bestimmt ist zum Nachweis geringer Konzentrationen an Liganden, wurden sehr empfindliche Reaktionssysteme entwickelt zur Anwendung im Zusammenhang mit dem neuen spezifischen BindungsreaktionssystemJJEine bevorzugte Form der Nachweisreaktion umfaßt ein Luminesζensreaktionssystem, vorzugsweise ein enzymkatalysiertes, wie eine Reaktion, die Bioluminesζens oder Chemilumineszens ergibt. Das Reagens in dem Eonjugat kann entweder ein Reagens·in der lichterzeugenden Reaktion sein oder in einer Reaktion, die einer enzymatisehen oder nichtenzymatischen Lumineszensreaktion vorausgeht. Irgend eine Änderung der Aktivität des konjugierten Reagenses, die bei der spezifischen Bindungsreaktion auftritt, führt zu einer Veränderung in der Geschwindigkeit der Lichtbildung oder der Gesamtmenge, Spitzenitensität oder dem Charakter des entstehenden Lichtes. Beispiele für Lumineszensreaktionssysteme sind in Tabelle A angegeben, bei der die folgenden Abkürzungen angewandt werden:

AIP Adenosintriphosphat AMP Adenosinmonophosphat • NAD Nicotinamidadenin-dinucleotid

609845/1073

f - 20 -

261851T

UADH reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid Elavinmononucleotid reduziertes ELavinmononucleotid

elektromagnetische Strahlung, üblicherweise im IR-, sichtbaren oder UV-Bereich*

TABELLE A:

609845/1073

TABELLE A Lumineszens-Reaktionssystem konjugiertes Reagens

A. ATP + reduziertes Luciferin ^{hV +} "^ ^{+ oxi}" ^{ATP oder} reduziertes

diertes Luciferin Luciferin

B. FMNH₉ + langkettiger Aldehyd + O₀ FMNHo oder langkettiger '

d d ^. iisnen; d Aldehyd

hS + FMN + langkettige Säure + HpO

ο ··— η ζ ^ κΓΛτιυ · TPMM ■ rr ^y JMAiJH Dehydrogenasc

cn 2) FMNH₂ + langkettiger Aldehyd + O₂

ο hV + FMN + langkettige Säure +

Sulfat-D. 1) 3'₅5'-Adenosin-diphosphat + reduziertes Luciferin-sulfat |^rans~

—^ Adenosin-3'-phosphat-^'-phosphosulfat + reduziertes Luciferin 2) reduziertes Luciferin + O₂ > h\) + oxidiertes Luciferin

3',5'-Adenosindiphosphat oder reduziertes Luciferin

Ports, zu TABELLE A

Lumineszens-Reaktionssystem

E. reduziertes Luminol +

reduziertes Pyrogallol +

Peroxidase hy + oxidiertes Luminol +

konjugierte s,-Reagens

reduziertes Luminol

Peroxidase *. hv + oxidiertes Pyrogallol + HO

O (O OO

G. reduziertes Luminol + Op —> hv + oxidiertes Luminol

H. reduziertes Pyrogallol + O₂ hv + oxidiertes Pyrogallol

τ τ „i,,_m-;v,„i ■ ix r> Lactoperoxidase■ I. Isoluminol + HpOp ^ :

J. Isoluminol + KO₀ ■

hv + Aminophthalat +

* oder Oatalase reduziertes Pyrogallol

reduziertes Luminol

reduziertes Pyrogallol

Isoluminol Isoluminol

^s5

CD

OO

■cn

¹ - 23 - " '

Weitere Einzelheiten und Diskussionen bezüglich von Lumineszensreaktionssystemen, die für das:erfindungs- ■ gemäße Verfahren angewandt werden können, sind angegeben in;

J. Biol, Chem, 236:48(1961).

J, Amer. Chem. Soc. 89:3944 (1967).

Cornier et al., Bioluminescence in Progress, Ed. Johnson et al.,. Princeton University Press (New Jersey, 1966), S. 363 - 84.

Kries, P. Purification and Properties of Renilla Luciferase, doctoral thesis University of Georgia (1967).

Am, J. Physiol. 41:454 (1916).

Biol. Bull. 51*89 (1926)..

J. Biol. Chem, 243:4714 (1968). ·

Eine andersartige bevorzugte empfindliche Uachweisreaktion umfaßt das Phänomen der Fluoreszens und ist enzymkatalysiert. Bei einem solchen Reaktionssystem ist das Reagens in dem Konjugat ein Substrat für eine . enzymatisch^ Reaktion^ die ein Produkt liefert, das yiuoreszenseigenschaften besitzt, die sich von denjenigen des konjugierten Substrats unterscheiden. Jede auftretende Änderung in der Aktivität des konjugierten enzyraatischen Reagens es, die durch die spezifische Bindungsreaktion bewirkt' wirdjfführt zu einer Änderung in den Pluoreszenseigenschaften des Reaktionsgemisches. Ein allgemeines Reaktionsschema für eine derartige enzymkatalysierte · Reaktion ist das folgende:

enzymatisches C]R₁₁₂W)

Reagens-X-Z —* · Produkt ,

(Substrat)

wobei X eine enzymatisch .spaltbare Bindung oder Bindungsgruppe ist, wie eine Ester- oder Amidogruppe und Z eine

609 8 45/1073

spezifisch bindende Substanz, die in Abhängigkeit von der angewandten spezifischen Bindungsreaktion der Ligand ein spezifisch bindendes Analoges des Idganden oder ein spezifisch bindender Partner des Idganden ist. Spezifische Kon^'ugate, die für ein derartiges Heaktionssystem angewandt werden, können, sind verschiedene durch Enzym spaltbare Derivate von Fluorescein, Umbelliferon, 3-Indol, ß-Maphthol, 3-Pyridol, Eesorufin, Bhodamin B usw.; Beispiele für mögliche Strukturformen derartiger Derivate sind;

Derivat

Formel

Fluorescein Ojnbelliferon

3-Indol

β-Naphthol

60984 5/1073

3-Pyridol

Resorufin .

wobei E' -OH oder -X-Z (wie oben angegeben), E -X-Z und E³ -H oder -GH₃ ist.

Ein Eeaktionssystem, das besonders bevorzugt ist zum Nachweis der neuen spezifischen Bindungsreaktion ist ein cyclisches Eeaktionssystem (Eingreaktion). Bei einem derartigen Eeaktionssystem wird ein Produkt einer ersten Eeaktion in einer zweiten Eeaktion umgesetzt, wobei in der zweiten Eeaktion ein Produkt entsteht, das auch ein Eeagens für die erste Eeaktion ist.

Das folgende Diagramm zeigt ein Modell für ein derartiges cyclisches Eeaktionssystem:

Produkte A ^. ^ cyclisiertes Material

^N/¹ (Form 1) EEAKTION A Y .

Eeägentien k/ ^ cyclisiertes Material^ ~*

(Eorm 2)

JEeagentien B

EEAKTION B Produkte B

Bei dem oben angegebenen Modell eines cyclischen Eeaktionssystems bildet eine kleine Menge des cyclisierten Materials, wenn ihr ausreichende Mengen der Eeaktionspartner A und B zur Verfügung stehen, große Mengen an Produkten A und B. Da die Eeaktionsgeschwindigkeit und Menge an Produkten, die

609845/1073

I. - 26 -

durch die Reaktionen/ dxe das cyclische Reaktionssystem bilden, sehr empfindlich sind gegenüber

der vorhandenen Menge an cyclisiertem Material, ist es besonders bevorzugt, dieses cyclisierte Material als Reagens in dem erfindungsgemäßen Konjugat zu verwenden. Beispiele für cyclische Reaktionssysteme,die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen spezifischen Bindungsreaktionssystem angewandt werden können, sind in den
folgenden Tabellen B, C und D angegeben.

t TABELLE B und G:

809845/107 3

	2	TABE	LLE B	Eeagens B
		Produkt A^«v yvm	U)*--1X /^-'Eeagens- B	oder
	3	Enzym1	Enzym	Produkt A
		Beagens' k/ \JJAI	)H*^/\^Produkt B	PjOpandiol
		Reagens A
		oder		Glutamat
Eeaktlon	3	Produkt B	Enzym
		Lactaldenyd	Alkonol-dehydro-	Malat-
I			- genäse
6	a-Ketoglutarat	Glutaininsäii-re-	Ätiianol
		dehydrogenase
	O^aloacetat	Äpfelsäure-	Isocitrat
7		dehydro genass e
	Acetaldenjd	itj-JiyiiviUvxljw-i. U^-
S		genäse
	cx-Ee toglutarat	Isoeitronen.-	phosphat
		säure-denj'dro-
	geaiase	Lactat
Behydr oxyac e t on-	a^ &lyc erl-iL-
piiospaat	pnosphat;-'	Gl^ceraldeltyd-
	denydrogenase	3-pliospnat
Pjrmmt	Milciisaiare-	+ Phospliat
	deiiydrogenase
1,3-Depnospno-	Glyeeraldehyd-
gijGerat	3-plLOsp33at-
	dehydrogenase

* Uie otrinamid-adeiiin-dinacle oibid ** reduziertes IiAB

609845/1073

A BE LLE

,Enz

Produkt A

Reagens

Reagens A

oder Reaktion Produkt B NADP* "-S. /^~ Reagens B

Enzym
NADPH** J \_ Produkt B

Enzym

Reagens B

öder Produkt A

6-Phö spho glue onat

oxidiertes Glutathion

ρ-Benzοchinon Glucöse-6- Gluöose-6-phospiiatphosphat

dehydrögenäse

Glutathion— reduGtase

Ghinonreductase

reduziertes Glutathion

Hydrochinon

Kitrat

oc-Ke t ο glut arat

Hitratreduetase

Glutaminsauredehydrogenäse

Hitrit

Glut am at

* Micotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat ** reduziertes BADP

609845/1073

Es ist zu "bemerken,daß die in den Tabellen B und C angegebenen cyclischen Reaktionssysteme eine Kombination irgend einer der in den jeweiligen Tabellen angegebenen Reaktionen mit einer anderen dort angegebenen Reaktion umfaßt. Z.B. kann die Reaktion 1 in Tabelle B mit irgend einer der Reaktionen 2 bis 9 kombiniert werden, um ein geeignetes cyclisches Reaktionssystem zu ergeben. So geben die Tabellen B und G 56 bzw. 20 mögliche Reaktionssysteme für das erfindungsgemäße Verfahren an.

Neben den in den Tabellen B und C angegebenen cyclischen Reaktionssystemen ist es möglich, daß eine der Reaktionen in dem cyclischen Reaktionssystem die enzymatische oder nicht-enzymatische Umwandlung eines spektrophotometrischen Indikators umfaßt, vorzugsweise kolorimetrisch. Bei einem derartigen System äußerst sich irgend eine Änderung der Reaktion oder der/Geschwindigkeit in einer Änderung der spektrophotometrischen'Eigenschaften des Indikators. Bei Verwendung der bevorzugten kolorimetrisehen Indikatoren ist eine solche Änderung eine Farbänderung. Ein Beispiel für eincyclisches Reaktionssystem, umfassend eine Änderung eines Indikators, ist das System, das gebildet wird durch Kombination der Reagenses B "Produkt B Reaktionen in Tabelle B mit einer Reaktion ,umfassend einen Oxidations-Reduktions-Indikator und ein elektronenübertragendes Mittel, Als elektronenubertragendes Mittel kann Phenazinmethosulfat angewandt werden. Geeignete Indikatoren umfassen die oxidierten !Formen von Nitrotetrazolium, Thiazoylblau und Dichlorphenolindophenol.

TABELLE D:

809845/1 073

TABELLE

reduziertes Cytochrom-C

Cytochrom-G-reductase

oxidiertes Cytocnrom-C

NADPH

Gy t ο chrom- G-reductase

ADP

Flavin-mononucleotid

Reduziertes 1'¹

D-Amino säure

D-Aminosäure- D-Aminosäureoxidase oxidase

FADH,

α-Ketosäure 3

'Flavin-adenin-dinucleotid reduziertes FAD

a-Ketoglutarat

a-Amino säure

Transaminase

L-Amino säureoxidase

a-Ke to säure I₂^₂

809845/1073

Forts* zu

T A B E L Ii E

Phosphat

ADP

Adeno s intriphosphataae

Phösphoenol-

kinase

Aaeno sin-dipho sphat Adenos in-tripho sphat

Suecinat +

a-Eetoglutarat

Ooenzym

Bernsteinsätire- a-Ketoglutaratthiokinase dehydroggnase

Phosphat + GDP

. coenzym-A

+ CO

-tri pho sphat

Guano sin-dipho sphat

Ascorbat

oxidiertes Glutathion

Dehydroasc orljat reductase

HADPS

Dehydroascorbat

Glut athion reductase

reduzier tes Glutathion

KADP

80.9 8 45/107

Ports- zu

TABELLE

oxidiertes Glutathion

Asoorbat

Behydroasc orbatreductase

reduziertes Glutathion

Äscörbat oxiäase λ

Behydroascorbat

ABP

Kucleosiddiphosphat- kinasei

ATP

GBP

Oxaloacetät

Phosphoenolpyruvat-kinas &

hösphoenolpyruvat

oxidiertes Öytochrom-C

HABPH

CytochroiQ-G-peroxidase

Cy to chrom-G-reduetase

reduziertes Cytochrom-G

NABP

HABPH

oxidiertes Eerridoxin

Pyridirtnucleotid-reductase Hydrogenase

NABP

reduziertes Ferridoxin

609845/1073

Bei Bildung irgend eines der in den Tabellen B, C und D angegebenen cyclischen Reaktionssysteme, wenn eine der Komponenten des Reaktionssystems in ionischer Form vorliegt, kann sie natürlich in Form des Salzes oder der Säure vorliegen, wenn diese bei Berührung mit dem flüssigen Medium ionisieren. Ein wasserlösliches Salz oder eine Säure ist natürlich bevorzugt.

Es kann auch ein exponentiales cyclisches Reaktionssystem bei der Nachweisreaktion angewandt werden. Ein Beispiel für ein exponentiales cyclisches Reaktionssystem ist das folgende:

ADP + PEP ATP + Pyruvat

Eine solche cyclische Reaktion ist autokatalytisch in dem Sinne, daß während jedes Cyelus die Menge an zurückgeführtem (cyclisiertem) Material verdoppelt wird. Die Cyclisierungsgeschwindigkeit nimmt daher exponential mit der Zeit zu und ergibt eine sehr hohe Empfindlichkeit. Weitere. Einzelheiten und eine nähere Diskussion bezüglich derartiger cyclischer Reaktionen findet sich in J. Biol. Ohem. 24-7, 3558-70 (1972). '

Wenn ein cyclisches Reaktionssystem angewandt wird als Mittel zur Bestimmung der- Aktivitätsänderung des konjugierten Reagenses kann die Geschwindigkeit, mit der ein Reagens verschwindet oder ein Reaktionsprodukt auftritt, durch übliche Verfahren bestimmt werden oder mit Hilfe eines oder mehrerer cyclischer Systeme und anschließende übliche Bestimmung der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit.

609845/1073

Die Anwendung eines cyclischen Reaktionssystems in Verbindung mit dem System der spezifischen Bindungsreaktion ergibt eine breite Anwendbarkeit sowie hohe Empfindlichkeit. Ein einziges Konjugat aus Reagens und spezifisch bindender Substanz kann für eine Vielzahl von Reaktionen angewandt werden, um cyclische Systeme zu bilden mit Empfindlichkeiten, die über einen weiten Bereich variieren und zu einer Vielzahl von Umwandlungen die mit Hilfe der Sinne oder künstlicher Mittel. nachgewiesen werden können. Eine derartige vielseitige Anwendbarkeit besitzt das bekannte homogene enzymatische Bestimmungssystem nicht.

Obwohl es bei der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht erforderlich ist, kann es günstig sein, ein heterogenes Bestimmungsverfahren anzuwenden, ■ selbst dort,- wo das Vorhandensein des Liganden in dem flüssigen Medium die Aktivität des konjugierten Reagenses beeinträchtigt. Eine solche Situation kann sich bieten, wenn ein heterogenes System besondere Vorteile bietet. Bestimmte heterogene Systeme besitzen die Fähigkeit, die wirksame Konzentration des Liganden in dem Bestimmungssystem und damit' die Empfindlichkeit zu erhöhen. Ein Beispiel für ein solches heterogenes System ist dasjenige, bei dem eine Säule angewandt wird,, die eine unlösliche Matrix enthält, umfassend entweder das Eonjugat oder einen spezifisch bindenden Partner des Liganden, je nach der speziellen gewählten Arbeitsweise. Alle anderen heterogenen Bestimmungsverfahren, bei denen eine radioaktive oder enzymmarkierte Substanz angewandt ,wird, können auch mit Hilfe des erfindungsgemäßen Reagenses als Markierungssubstanz durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewandt werden auf den Nachweis irgend eines Liganden, zu dem es einen spezifisch bindenden Partner gibt. Der Ligand ist üblicher-

609845/1073

-35 - . 2818511

weise ein Peptid,, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein, , Steroid oder ein anderes organisches Molekül» so daß es einen spezifisch "bindenden Partner in biologischen Systemen gibt oder ein solcher synthetisiert werden kamt, Eer Ligänd wird - allgemein gesprochen - ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen und Antikörpern dazu_t Haptenen und Antikörpern dazu, Hormonen, " YitamineB, Eetaboliten (StoffWechselprodukten) und pharmakologl sehen Mitteln und ihren !Rezeptoren und bindenden Substanzen. Spezifische Beispiele für Idganden, die erfindungsgemäß nachgewiesen werden können, sind Hormone,, wie Insulin, Choriongonadotropin, Thyroxin, Ifiothyronin und östriol,. Antigene und Haptene, wie lerritin, Bradykinnin, Prostaglandine und tumorspezi— fische Antigene, Vitamine, wie Biotin, Vitamin B^£, Folsäures Yitamin E und Ascorbinsäure, Metaholiten, wie 5^li^'-Ädenosinmonophosphat und J¹,5^F-Guanosinmonophosphat, pharmakologische Mittel, wie Bilantin, Eigoxin_t Morphin, Bigitoxin und Barbiturate, Antikörper, wie mdkrdsome Antikörper· und Antikörper gegen Heptatis und. Allergene und spezifisch bindende Rezeptoren,, wie thjroxinbindendes Globulin, Avidin, Intrinsicfaktor und üranseobalamin»

Im allgemeinen ist es beAFOvrzugt, daß das Reagens in dem Eonjugat an de:n kleineren Partner ,de η Iiiganden oder seineu spezifisch bindenden Partner , gebunden ist. Es ist bevorzugt,, ein direktes Bindungsverfahren anzuwenden, um den Liganden nachzuweisen, wenn das Molekulargewicht des gewählten spezifisch bindenden Partners ungefähr 1/10 des Liganden beträgt oder darunter liegt. So ist es, wenn der nachzuweisende Ligand ein Antikörper oder ein spezifisch bindender Rezeptor ist, bevorzugt, ein direktes Bindungsverfahren anzuwenden, bei dem das Konjugat ein enzymatisches Reagens umfaßt, das an ein Antigen oder

609845/107

Hapten zu dem Antikörper gebunden ist oder einen niedermolekularen bindenden Partner des Rezeptors. Wenn das Molekulargewicht des ausgewählten bindenden Partners 10 χ so hoch ist wie das des nachzuweisenden Liganden oder darüber, wie wenn ein Antigen_t Hapten, Hormon, Vitamin, Metabölit oder pharmakologisches Mittel nachgewiesen werden soll, ist es besonders "vorteilhaft, ein Eonkurrenzbindungsverfahren oder eine verdrängende Sättigungsreaktion anzuwenden, wobei das Eonjugat das Reagens an den kleineren Liganden gebunden umfaßt.

Bei dem erfindungsgemäßen Konjugat ist das Reagens an eine spezifisch bindende Substanz gekuppelt oder gebunden, die der Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner des Liganden ist, je nach dem ausgewählten Bestimmungsverfahren, so daß eine meßbare Menge an Aktivität des Reagenses erhalten bleibt. Die Bindung zwischen dem Reagens und der spezifisch bindenden Substanz ist üblicherweise im wesentlichen unter den Bestimmungsbedingungen irreversibel, wobei die Nachweisreaktion, in der das Reagens Aktivität besitzt, nicht so gestaltet ist, um eine solche Bindung chemisch zu zerstören, wie bei dem oben erwähnten Lumineszens- und cyclischen Reaktionssystem. In einigen Fällen wird jedoch eine solche Bindung (by design) zerstört oder auf andere Weise angegriffen durch die ausgewählte Eachweisreaktion als Mittel zur Bestimmung der Änderung der Reagensaktivität. Ein solcher Fall liegt vor bei dem oben erwähnten enzymatischen ifluoreszens-Substrat-Reaktions system.

Das Reagens kann direkt an die spezifisch bindende Substanz gekuppelt sein, so daß das Molekulargewicht des Conjugates geringer ist als oder gleich so groß ist wie das Gesamt-

609845/1073

molekulargewicht des Reagenses der spezifisch "bindenden Substanz. Üblicherweise sind jedoch das Reagens und die spezifisch bindende Substanz über eine Brückengruppe, enthaltend 1 bis 50? vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatom oder Heteroatome, wie Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Phosphoratome usw. miteinander, verbunden. Beispiele für eine Brückengruppe, umfassend

en

ein einziges Atom, ist die Methylgruppe (ein Kohlenstoffatom) und die Aminogruppe (ein Heteroatom). Die Brückengruppe besitzt üblicherweise ein Molekulargewicht von nicht mehr als 1 000 und vorzugsweise weniger als 200. Die Brückengruppe umfaßt eine Kette von Kohlenstoffatomen oder Heteroatomen oder eine Kombination von beiden und ist mit dem Reagens und der spezifisch bindenden Substanz oder einem aktiven Derivat davon über eine verbindende Gruppe gebunden, üblicherweise in Form einer Ester-, Amido-, Äther, Thioester-, Thioäther-, Acetal-, Methylenoder Aminogruppe.

Das Reagens in dem erfindungsgemäßen Konjugat kann irgend

eine Substanz sein mit einer vorgegeben (d.h. fixierten

/keiv oder bekannten) Reaktionsfähig⁷ als Bestandteil einer

vorher festgelegten Nachweisreaktion. Besonders bezeichnen im Rahmen dieser Beschreibung die Ausdrücke "Reagens" und "Substanz mit Reaktionsfähig/ irgend eine chemische Substanz, die imstande ist, am Ende eine meßbare chemische Umwandlung einzugehen, die ein oder mehrere Produkte liefert, die sich von der Substanz unterscheiden und die, nachdem eine Wechselwirkung oder Reaktion zwischen diesem Reagens und den die Reaktion einleitenden Mitteln, wie einer chemischen Substanz (d.h. einem anderen Reagens, einem Katalysator oder einer anderen Substanz, die in einer solchen chemischen Umwandlung teilnimmt), elektromagnetischer Strahlung, thermischer Energie oder Schallenergie auftritt. Die Gruppe von Substanzen, die hier als "Reagentien" bezeich-

609845/1073

net werden, umfaßt übliche anorganische und organische Eeagentien und verschiedene "biochemische Substanzen, aber nicht Substanzen, wie Katalysatoren, einschließlich Enzymen und radioaktiven Isotopen, die keine Eeagentien bzw. Reaktionspartner für die Nachweisreaktion darstellen. Es ist zu bemerken, daß, während eine spezielle chemische Substanz in verschiedene Kategorien eingeordnet werden kann, da sie imstande ist, in verschiedener Weise zu wirken, je nach der chemischen Umgebung, es die Aktivität einer solchen Substanz gegenüber der ausgewählten Nachweisreaktion ist, die bestimmt, was für eine funktioneile Identität eine solche Substanz im Zusammenhang mit der Erfindung besitzen soll.

Vorzugsweise ist das Reagens ein enzymatisehes Reagens, wie ein Enzymsubstrat, ein Coenzym oder eine aktive Modifikation oder ein Derivat davon. Ein Enzymsubstrat ist eine Verbindung oder Gruppe, die imstande ist, eine chemische Umwandlung einzugehen, die durch ein Enzym katalysiert wird. Wenn ein Substrat als konjugiertes Reagens angewandt wird, beträgt das bevorzugte Molekulargewicht vorzugsweise weniger als 9 000 und besonders weniger als 5 000. Substrate solcher Größe sind aufgrund ihres Mangels an Molekularkomplexität besonders bequem für die Herstellung eines solchen Konjugats. Außerdem wird die Aktivität der Substrate, die an eine spezifisch bindende Substanz gekuppelt sind, leicht angegriffen durch Umsetzung des Konjugats mit einem spezifisch bindenden Gegenstück einer derartigen spezifisch bindenden Substanz. Beispiele für Enzymsubstrate, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, umfassen die enzymatisch spaltbaren Fluoreszenssubstrate, die oben erwähnt sind, wie Fluorescein-und Umbelliferonderivate, pH-Indikatoren und spektrophotometrisehe Indikatorfarbstoffe, besonders chromogene Farbstoffe.

60984 5 /1073

Aus den oben angegebenen Gründen und aus Gründen der ' Anwendbarkeit und Anpaßbarkeit sind Coenzyme als Reagentien für die erfindungsgemäßen Konjugate besonders geeignet. Ein Coenzym ist ein Nichtprotein-Molekül, das von einem Enzymprotein zu einem anderen wandert und dadurch, die Wirksamkeit der katalytischen Funktion des Enzyms verbessert. Alle bekannten Coenzyme besitzen ein Molekulargewicht von weniger als 9 000, Die bevorzugten Coenzyme besitzen ein Molekulargewicht von weniger als 5 000. Geeignete Coenzyme umfassen die Nucleotideoenzmye, besonders solche,, enthaltend Adeningruppen, wie die Adenosinphosp'hate (d.h. die Mono-, Di- und Triphosphatformen.), Nicotinamidadenindinucieotid und dessen reduzierte Formen und Hicotinamidadenindinucleotidphosphat und dessen reduzierte Formen. Andere geeignete Coenzyme umfassen die Guanosinphosphate, Flavinmononucleotid und dessen reduzierte Formen,. Flavinadenindinucleotid und dessen reduzierte Formen, Coenzym A und dessen Thioester einschließlich · Suecinyl-Coenzym A, 3',^'-Adenosindiphosphat und Adenosin-5'-ph;osph.at-5^l-phosphosulfat.

Geeignete coenzymaktive Eon^ugate umfassen Nucleotidcoenzyme mit einer Adeningruppe,_: an die die spezifisch bindende Substanz, d.h. ein Ligand». ein spezifisch bindendes Analoges des lagernden oder ein spezifischbindender Partner eines Liganden über eine direkte Bindung oder über eine Brückengruppe, wie oben angegeben,, gebunden ist. Solche coenzymaktiven Eonjugate, die ein Adenosinphosphat, Nicotinamidadenindinucleotid oder dessen reduzierte Form oder Nieotinamidadenindinucleotidphosphat oder dessen reduzierte Form umfassen, besitzen die folgende allgemeine Formel:

5/1073

R¹-CH- ,0 2 /

OH R

wobei. R =

O"

-Ο-Ρ-Ο-Ρ-Ο O O

ο^Θ ο^θ ο^Θ

-0-Ρ-Ο-Ρ-Ο-Ρ-Ο® oder _ 0 0

0^Θ 0^Θ

-⁰T⁰I"⁰"'¹'²-⁰

ο ο

OH OH

wobei

0^Θ -OH or -0-P-0^w;

wobei R·⁵ =

NH.

R⁵

NH.

Ν-γ^

NHR

•Ν'

609845/1073

wobei R

CONH,

CONH,

ist,

in der Ir = -X-Z ist, wobei X eine Bindung oder eine Brückengruppe "bedeutet, und Z einen Liganden, ein spezifisch "bindendes Analoges eines Liganden oder einen spezifisch bindenden Partner eines Liganden bedeutet. Die oben angegebene Formel zeigt die ionisierten Formen der coenzymaktiven Konjugate, die protonisierten oder Säureformen sind jedoch gleichermaßen geeignet. Das Ausmaß der Protonisierung hängt von dem pH-Wert der Umgebung ab. Auch die Balze derartiger !Conjugate können angewandt werden. *)

Die Synthese derartiger Verbindungen kann auf eine Vielzahl von Arten erreicht werden. Es ist möglich, daß die Synthesewege, die schematisch unten angegeben sind, vorteilhaft angewandt werden zur Herstellung der geeigneten Verbindungen. Bei den gezeigten Synthesen sind die Stellungen an dem Adenxnringsystem entsprechend der folgenden Formel angegeben:

*) y ist vorzugsweise eine Brückengruppe mit einem Molekulargewicht von <.2000, besonders «£.200 und enthält besonders 1 bis 10 Kohlenstoffatome und/oder Heteroatome.

609845/ 1 073

Außerdem werden die folgenden Abkürzungen angewandt:

— CH, Rib ist die Ribosegruppe:

Rib' ist die phosphatierte
Ribosegruppe:

OH OH

-CH

OH PO

Pn ist eine Phosphatgruppe:

AP-Derivate bezeichnen Derivate von Adenosin-5¹-phosphat, d.h. die Mono- (AMP), Di- (ADP) oder Tri- (ATP) phosphatform; ·

NAD-Derivat bezeichnet ein Derivat von entweder Nicotinamidadenindinucleotid oder einer reduzierten Form davon;

MADP-Derivat bezeichnet ein Derivat von entweder Uicotinamidadenindinucleotidphosphat oder einer reduzierten Form davon;

R bezeichnet eine spezifisch bindende Substanz oder eine Modifikation davon und

X bezeichnet eine austretende Gruppe, üblicherweise ein Halogenatom.

609845/1073

1- D e r -i v a t von AP

HO-Rib Adenosin

(CH₂CH₂O)₃PO

^A-thylen-imin.

^{pH 6}>°> ^{60 h}

HO-Rib

Phosphorsäure Carbonyl-^ diimidazol

-(CH₂)₂-NHR

H-Ph-Rib

AMP-D er i vat

P/rophosphorsäure /Carbonyl— diimidazol

(1) Guilford, H., et al., Chemica Scripta 2:165 (1972). '(2) Trayer, I. P., et al., Bioahem. J. 139:609 (1974).

•λ - (CH₂) ₂ -NKR

HO-Rib

- (CH₂)₂-NHR

H-(Ph)₂-RIb

ADP-D erivat

-N -(CH₂) ₂-NKR

H-(Ph)₃-Rib

ATP-Derivat

rsi

OO

-in

rc ο

CM

<—> CM

K CJ

C^ y* \

AO

- 44 -

6 1 B 5 Ii

CTl

te

O CJ

νΟ

νθ

PM

cd >

•H 0)

CM

O CJ Pi

•H

co O

to

ca

■"Ο

cd

rH CL. Cd

(U ιΗ rH (D

Pi •Η

809845/1073

. D e r i v a't · von. NADP

■P- 'JTt

CONH,

,\^τ

Rib - Ph - Ph - Rib'

NADP

NH.

■N'

-JGH₂CO₂H

(4)

pH 6,5; 10 d

CONH,

Rib -Ph-Ph-

RNH,

Garbodiimid

CONH.

Rib - Ph - Ph - Rib

IT-CH₂-CONHR

NADP-Derivat.

(4) Lowe, CR. und Mosbach·, K., Eur. J. Biochem. 45:511 (1974).

N3

cn

OO

απ

von A?

(5)

cr> ο-

co •fccn

-_jj e r χ ν a ü

1) a-Ciilor-triacetyl- χ
ribofuranosid _v

Fhosnhor säure

(CH₃CH₂O)₃PO

H-Ph-Rib

AMP-Derivat

-NHR

2) NH,/CH^OH
NHR ^J ·>
NH₂

N.

NHR

Garbonyl-diimidazol H-(Ph)₂-Rib ADP-derivat

Py rophosphor.säure

(9)

Carbonyl—diimidazöl

(5) Acheson, R.M., An Introduction to the H-fPhi -Rib Chemistry of Heterocyclic Compounds ₃ Interscience Publ. (New York 1962), S. 308.

(6) Fischer, E., Ber. 30:2239 (1897).

(7) Davoll et al., J. Chem. Soc, 967 (1948).

(8) Guilford, H., et al., supra.

(9) Trayer, I.P., et al., supra.

NHR

NH.

cn

co

■on

2--D e r i ν a

XAD

NH.

NHR

Nicotinamid " ^¹⁰^ moüoi:ucleotid__ χ Dicyciohexyl-"" -^ carbodiimid

o;

H-Ph-Rib

AMP-Derivat Rib - Ph - Ph - Rib NAD-Derivat

(10) Hughes, N.A., et al., J. ehem. Soo., 3733 (1957) NHR

^4 2-Derivat _von KADP

NH

NHR

1) PCI.

2) Cl₂'

3) H₉O

N I H-Ph-Rib'

NHR Nicotinamid ^ ^
monpnucleotid ^,
JJicyclohexyl carbodiimid

AMP-D erivat

(11) Hughes, N.Α., et al., supra.

CONH,

NH.

Rib - Ph - Ph - Rib» NADP -lerivat

CD OO

cn

3-D e r i v a t. ,. von.

Äthylen-jaIn

(12,13) .N

NH,

1) α-Chlor-triacetyl ribofuranosid

2) NH_x(CH_xOH)

_C15)

N' I HO-Rib

■>

(CH₂)₂-NH₂

NH

POCl,/H₉O

(CH₃CH₂O)₃PO

(CH₉K-NHR

L·* Lt

(CH₂)₂-NHR

P
Ag (CH₂)₂-NHR

P hosphor säure
CaTbonyldiimidazol

(12) Lister, J.H., in Advances in Heterocyclic Chemistry, ed. Kabritzky et al., Academic Press (New York, 1966), S-33.

(13) Leonard, N.J., and Fujii, T.J., J. Amer. Chem. Soc. 85:3719 (1963).

(14) Fischer, E., supra.

(15) Davoll et al., supra.

(16) Guilford, H., et al., supra.

(17) Trayer, I.P., et al., supra.

H-Ph-Rib (CH₂)₂-NHR

AMP-D erivat
Pyrophosphor säure

H-(Ph)₂-RXb fcH^-NHR

ADP-Derivat

NH.

Carbonyl-diimidazol

(17)

H-(Ph)₃-Rib

ATP-Derivat

-NHR

3-.D e τ i-v a t ' vcm NAD

NH₂

N-

N icotinamid-^¹⁸-' mononucleotid

Li cyclohexylcarbodiimid

H-Ph-Rib

P-D'er ivat

-XHR

cn (IS) Hughes, X.Α., et al., supra.

CONH,

Ph-Ph- Rib
NAD-D erivat

(CH₉),-NHR

3--Derivat - von * NADP

	NH- ι /	D	Ci2
X"^		2)	H9O
!	'ß	3)	L
H-Ph-Rib	(CH2)2	-NHR
ANiP-Der ivat

NH,

',Yh Nicotinamid -^Γ19 ^
mononucleotid
ilcyclohexylcarbodiimid

H-Ph-Rib' CCH₂)₂-NHR

₂)₂ Rib

CONH,

Ph - Ph - Rib' NADP-Derivat.'

(19) Hughes, N.Α., et al., supra.

e r ι ν

von

. AP

NH-(CH₂)₆-NH₂

co' crt

H-Ph-Rib

(2 0)

RX XH-(CH₂)₆-NHR

/ύΛ'Γί~^\ ^ Phosphorsäure

vr-^-O-—'V Ca-bonyl—diimidazol'

H-Ph-Rib ^Y-

AMP-Dej: ivat'

Pyrophosphorsäure ^{( 1}^
Carbonyl—diimidazol

NH:(CH₂)₆-NHR

Φ)

V N

ADP-Derivat

(20) Guilford, H., et. al., supra.

(21) Trayer, Γ.Ρ., et al., supra.

NH-(CH₂)₆-NHR

H-(Ph)₃-Rib

ATP-D'erivat

CM

OJ

co

CSl

cd 2

LO

00

►ε;

■Ρ

cn

CSI

«ο IO

Ä O

cd

(D ΐΗ ΐ-Ι

O)

ε d

•Η /—\

CS]

6098Λ5/1 073

6— Derivat von -NADP

NH,

ο -α co

Rib -

CONH.

Ph-Ph- Rib' NADP

1) Glucose-6-phosphat dehydrogenase \

2) pH 11, 70⁰C, 1 h 5) C-lutamat- dehydrogenase

pH 6.5:

CONH.

Rib - Ph - Ph - Rib

-CH₂-CO₂H

Rib - Ph - Ph - Rib

CONH,

Rib - Ph - Ph - Rib'
NADP-D erivat

NH-CH₂-CONHR N '

(23) Lowe, CR., und Mosbach, K., supra.

χ:

•rl f-1

•Ρ cd

XD

ρ!,

CNJ

cd p< in

Oj

(U

cd !-i

•H f-l (D

+J

cd

Q
■<
2

to

CNI

LO CN)

60984 5/1073

8— D e r i v a

von NADP

COXH,

'% ^N

Rib - Ph - Ph ^: Rib' NADP

NH.

Br,

(26)

CONH

-Ph-Ph- Rib'

1) Glucose-ö-phosphat-^·²⁷-¹ dehydrogenase

2) RNH₂; Δ

3) G-lutamatdehydrogenase

(26) Lee, C-Y, et al., supra.

(27) Lowe, C.R.und Mosbach, R., supra.

Μ!20

r I

Rib - Ph - Ph - Rib'
NADP-Derivat.

9—. Derivat von

Äthylen- imin

Adenin

RHN-(CH₂)₂

RHN-(CH₉ RHN-(CH₂)

'N

H,

*N' RHN-(CH₂)₂NH₂

V^Vv^ (CH₇CH₉OUPO

I HO-Rib

N AgOH

ribofuranosid

2) NH,/CH,OH

RHN-(CH₉)

Phosphorsäure

Carbonyl-diimidazol

H-Ph-Rib

AMP^-Le ri vat

(28) Leonard, N.J., Fujii, T.J., supra.

(29) Lister, J.H., supra.

(30) Fischer, E., supra.

(31) Davoll, et al., supra.

(32) Guildford, H., et al., supra. (35) Trayer, I.P., et al., supra.

•Pyrophosphor.säure ^v

G arbonyl-diimidazol

RX _v

H-(Ph)₂-Rib
RHN- (CH₉)^^H? ADP-Derivat.

H-(Ph)₃-Rib

ATP- Derivat

D e r i v a

■von NAD

RHN-(CH₂)2

Nicotinamid- ' mononucleotid' ^ I/icyclohexyl- ·' carbodiimid

\- Ph -Rib
AMP-Derivat

(34) Hughes, N.A., et al., supra.

9—Derivat von .NADP

MH

RHN-(CH₂)₂ ι 2

RHN-

CONH

NH, RHN-(CH₉)₉ I '

Rib - Ph - Ph - Rib NAD-Deirivat.

H-Ph-Rib

AMP-Derivat

H-Ph-Rib'

(3 5) Hughes, N.A., et al., supra.

j Nicotinamid-^ ^ mononucleotid D !,cyclohexylcarbodiimid

NADPrDerivat

Außer den oben erwähnten Verbindungen umfassen geeignete cοenzymaktive Konjugate die Adenosinphosphate, an die die spezifisch, bindende Substanz über die Phosphatgruppierung gebunden ist. Derartige Verbindungen besitzen die folgende allgemeine Formel:

1 '2 I ' ?

in der R is -0-P-O-R -O-P-O-P-O-R^z oder

o ο ο

ο^Θ ο^Θ ο^Θ

III 2 -0-P-O-P-O-P-O-R^ ist Il Il Il ^SG

0 0 0

wobei E = -X-Z ist und Y eine Bindung oder eine Brückengruppe und Z ein Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner eines Liganden ist. Auch die protonisierten oder Säureformen sowie die Salzformen können angewandt werden.

Die Synthese derartiger Verbindungen kann auf verschiedene Weise erfolgen. Die im folgenden schematisch gezeigten Synthesewege können vorteilhaft zur Herstellung der geeigneten Verbindungen angewandt werden. Die oben angegebenen Abkürzungen treffen auf die folgenden ßeaktionsschemata. ebenfalls zu.

609845/1073

Derivate von. ap

Phosphor, säure ' RX

1) H₉N-CCH₉) -OH > H₉X-CCH₉) -Ph-H ~* RHX-CCH₉) -Ph-H

ζ l xv Δ L l χι ^ Zn

n=l-10

*" Carbonyl-diimidazol

,H RHN-CCH₂)_n-CPh)₂-Rib

ο
-J ADP-Lerivat

C36) Trayer, I.P., et al., Bioohem. J. 139:609 (1974).

monophosphat. (C j.\( ) j oo

■ ro

Derivate von AP C Ports. 0

	2) H2N-CCH2Dn-OH	Pyrophosphorsäu^e	P hosphor.säure	CH2Dn-CPi	RX
	71=1-10	λ > H0N-C Δ 2 *■	Δ y H2N-CCH2		I)2-H- I
				Ψ2
	A denosin- ^ ^ ^monophosphat		Ό)
σ> cd ·	Carbonyl-diimidazo1	<Q	N
CD OO
cn		RHN-CCH2)n-CPhD3-Rib
		ATP-L er ivat.
	3D H2N-CCH2Dn-OH		Dn-Ph-H
	Adenosin
	Dicyclohexyl- carbodiimid

RHN-CCH₂)_n-CPh)₂-H

RHN-CCH₉D^-Ph-RIb AMP-D.erivat

C37) Trayer, I.P., et al., supra.·

Bei einer Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion, die mit dem flüssigen Medium, in dem der Ligand vermutet x^ird, zusammengegeben werden sollen, in flüssiger oder fester Form vor. Bei dem bevorzugten homogenen Bestimmungssystem sind die Komponenten üblicherweise in Lösung oder in fester, in dem flüssigen Medium leicht löslicher Form. Da das zu untersuchende flüssige Medium üblicherweise wäßrig ist, sind die Komponenten im allgemeinen in wasserlöslicher Form, d.h. entweder in wäßriger Lösung oder in wasserlöslicher fester Form, z.B. ein Pulver oder Harz. Das Bestimmungsverfahren kann in einem Standardlaborgefäß, wie einem Reagensglas, durchgeführt werden, wobei die Bestandteile der spezifischen Bindungsreaktion und die Komponenten des Reaktionssystems in fester oder flüssiger Form zugegeben werden.

Es ist auch möglich, daß eine oder mehrere der Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion und/oder eine oder mehrere der Komponenten der Nachweisreaktion zusammen mit einem Träger zugegeben werden. Der Träger kann ein Flüssigkeitsbehälter, wie ein Reagensglas oder eine Kapsel, enthaltend eine solche Komponente oder Komponenten in einem unteren Teil, z.B. in Form einer Flüssigkeit oder eines losen Feststoffs oder eines Überzugs auf der Innenseite des Gefäßes _f sein. Der Träger kann auch die Form einer Matrix besitzen, die unlöslich und porös ist und vorzugsweise in Beziehung auf das zu untersuchende flüssige Medium absorbierend ist. Eine solche Matrix kann in Form von saugfähigen Papieren, polymeren Filmen, Folien, Membranen, Flächen oder Blöcken, Gelen usw. vorliegen. Bei einer solchen Form würde das Prüfmittel bzw. die Vorrichtung ein bequemes Mittel darstellen, um das zu untersuchende flüssige Medium zur Durchführung der spezifischen

60984 5/1073

Bindungsreaktion und/oder der Nachweisreaktion und zur Beobachtung der auftretenden Veränderung zusammenzubringen.

Das zu untersuchende flüssige Medium kann eine natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Flüssigkeit sein, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält und ist üblicherweise eine biologische Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die durch Verdünnung oder andere Behandlung einer solchen biologischen Flüssigkeit entsteht. Biologische Flüssigkeiten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden können, umfassen Serum, Plasma, Urin und amniotische Flüssigkeit, Cerebralflüssigkeit und Spinalflüssigkeit. Andere Substanzen, wie Feststoffe, z.B. Gewebe oder Gase, können untersucht werden, indem man sie in flüssige Form überführt, z.B. durch Lösen des Feststoffs oder Gases in einer Flüssigkeit oder durch die Flüssigkeitsextraktion des Feststoffes.

Im Gegensatz zu dem bekannten homogenen Bestimmungssystem können biologische Flüssigkeiten, die Substanzen enthalten, die eine ähnliche oder identische Reagensaktivität besitzen wie diejenige der konjugierten Markierungssubstanz, auf dem Liganden untersucht werden, ohne Störung durch Hintergrundreaktionen. Endogene Hintergrund-Reagensaktivität kann leicht auf verschiedene Weise eliminiert werden. Die biologische Flüssigkeit kann behandelt werden, um die endogene Reagensaktivität selektiv zu zerstören. Eine solche Behandlung kann die Wirkung eines Klärmittels (clearing agent) umfassen, das chemisch die endogene Aktivität zerstört und anschließende Behandlung, um die zerstörende Wirkung eines solchen Klärmittels zu inaktivieren.

609845/1073

Z.B. kommen reagensabbauende Enzyme häufig natürlich in biologischen Flüssigkeiten vor, besonders wenn das Reagens ein Goenzym, wie NAD, NADP oder ATP ist. Es gibt viele Hemmstoffe für solche coenzymabbauenden Enzyme,z.B. Chelatierungsmittel, die so wirken, daß sie wesentliche Hetallionei-Aktivatoren aus den Enzymen entfernen. Als spezielles Beispiel finden sich NAD-abbaubare Enzyme im normalen Serum und besitzen ausreichend Enzymaktivität, um im wesentlichen alle endogene NAD-Aktivität von isoliertem Serum innerhalb weniger Stunden zu entfernen. Die Abbauaktivität solcher Enzyme kann wirksam gehemmt werden durch Zugabe eines Chelatierungsmittel, wie Äthylendiamintetraessigsäure. Die Eliminierung der abbauenden Aktivität kann auch erreicht werden durch Zugabe eines spezifischen Enzymhemmstoffes. Z.B. können ATP-abbauende Enzyme gehemmt werden durch Zugabe von βγ-Methylen-ATP oder α,β-Methylen-ATP.

Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Beispiel 1_

Herstellung von Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)-purin-dinucleotid

2 g Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADJ wurden in 10 ml Wasser gelöst und 0,6 ml Äthylenimin zugetropft und der pH-Wert durch Zugabe von 1m Perchlorsäure

<7 gehalten. Nach vollständiger Zugabe des Athylenimins wurde der" pH-Wert auf 4,5 eingestellt und die Reaktion bei 20 bis 25°C inkubiert. In Intervallen von 24 h wurden 0,6 ml Äthylenimin zugegeben und der pH-Wert erneut auf 4,5 eingestellt. Nach 96 h wurde die Lösung in 10 Volumina Aceton von -10⁰C gegossen. Das entstehende Öl

609845/1073

wurde gesammelt, mit Äther gewaschen und in ungefähr 50 ml Wasser in einem Kolben gelöst.

Die entstehende Lösung wurde mit 1n Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7_?0 bis 7,5 gebracht und 1 g Natriumbicarbonat zugegeben. Dann wurde 4 bis 5 min lang Stickstoff durch die Lösung geleitet und 1 g Natriumhydrosulfit zugegeben. Der Kolben v/urde dicht verschlossen und 45 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde dann 15 min mit Sauerstoff behandelt und mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 11,3 gebracht. Die Lösung

' ο

wurde 1 h auf 75 C erhitzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, 0,6 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan zugegeben und anschließend 5*1 Salzsäure, um den pH-Wert auf 7>5 einzustellen. Zu der entstehenden Lösung wurden 1 000 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase und 1 ml Acetaldehyd gegeben. Die Abnahme der optischen Dichte des Reaktionsgemisches wurde bei 340 nm überwacht und als keine weitere Abnahme beobachtet wurde, wurde der pH-Wert auf 3,5 eingestellt. Die Lösung wurde in 10 Volumina Aceton von -10 G gegossen. Das entstehende Öl wurde abgetrennt und mit Äther gewaschen und anschließend in 10 bis 15 ml Wasser gelöst.

Die entstehende Lösung wurde in eine 2,5 x 90 cm-Säule von Sephadex G-10 der Pharmacia AB, Uppsala, Schweden, die mit Wasser äquilibriert war, gegeben. Fraktionen von 12 ml wurden gesammelt. Die Wellenlänge der maximalen optischen Absorption im UV-Bereich und die optische Dichte bei einer derartigen Wellenlänge wurden für jede Fraktion bestimmt. Außerdem wurde die optische Dichte bei 340 nm für "jede Fraktion nach Reduktion mit Alkoholdehydrogenase bestimmt. Die Fraktionen, die ein optisches Absorptionsmaximum bei 264 nm besaßen und ein Verhältnis der optischen Dichte bei 340 nm zu derjenigen bei 264 nm von mehr als

609845/1073

0,05 wurden zusammengegeben. Die zusammengegebenen Substanzen wurden auf 15 bis 20 ml auf einem Rotationsverdampfer eingedampft und durch, eine 2,5 x 28 cm-Säule mit Dowex 1-X8 der Bio-Rad Laboratories, Eichmond, California, die mit Wasser äquilibriert war, gegeben. Es wurde weiteres Wasser zugegeben, um die zusammengegebenen Substanzen durch die Säule zu waschen und Fraktionen von 10 ml gesammelt. Die Fraktionen, die eine maximale optische Absorption bei 264 mn und ein Verhältnis von optischer Dichte bei 3^-0 mn zu optischer Dichte bei 264 nm von mehr als 0,1 besaßen, wurden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Substanzen wurden durch eine 5 x 45 cm-Säule mit Dowex 5O-X2 der Bio-Ead Laboratories, Eichmond, Kalifornien, die mit Wasser äquilibriert war, geleitet. Es wurde weiteres Wasser zugegeben und die zusammengegebenen Substanzen durch die Säule gewaschen und 20 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen mit einem Maximum der optischen Absorption bei 264 nm und einem Verhältnis der optischen Dichte bei 340 nm zu derjenigen bei 264 nm von mehr als 0,18 wurden zusammengegeben. Die zusammengegebenen Substanzen wurden auf 4 bis 5 ml eingeengt und folgendermaßen durch Elektrophorese gereinigt:

Die konzentrierten Substanzen wurden auf ein Blatt Whatman JMM-Papier der Eeeve Angel, Clifton, New Jersey in 1 bis 2 cm breiten Streifen senkrecht zu der Eichtung des Stromes aufgebracht. Das Papier wurde dann mit 0,02m Natriumphosphat bei einem pH-Wert von 6,0 behandelt. Die Elektrophorese wurde nach dem Verfahren von Durrum mit hängendem Papier (Science 121", 829 (1955) ) 4- bis 7 h mit einem Potentialgradienten von ungefähr 8,5 V/cm durchgeführt. Die Lage des gewünschten Pyridinnucleotid-

609845/1073

- 65 -

derivats wurde bestimmt durch die iTuoreszens, die sich nach Besprühen eines Teststreifens des Papiers mit O,5m Natriumcyanid entwickelte (J. Biol. Chem. 191, 447 (1951) )· Der Bereich, der das gewünschte Derivat enthielt, wurde aus dem Papier ausgeschnitten und mit 3 x 50 ml Wasser extrahiert. Die entstehenden Auszüge, enthaltend Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)purindinucleotid wurden zusammengegeben, auf 3 bis 4 ml eingeengt und bei -20°C gelagert.

B e i s ρ i el 2

Herstellung vonNicotinamidadenindinucleotid-Biotin-Konjugat

16 mg Biotin wurden in 1ml Wasser, enthaltend 22 mg Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)purindinucleotid,

entsprechend Beispiel 1, suspendiert. Zur Erleichterung

/des Biotins der Lösung'wurden einige Tropfen 0,1n Natriumhydroxid

zugegeben. Dann wurden 240 mg 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat zu der entstehenden Lösung zugegeben und durch Zutropfen von 0,1n Salzsäure in Lösung gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann in 10 ml Aceton von -10⁰G gegossen. Das entstehende Öl wurde

5 bis 1Ό..
abgetrennt, 2 χ mit ml Äther gewaschen und in 1 bis 2 ml Wasser gelöst. Die entstehende Substanz wurde durch Elektrophorese auf Papier, entsprechend Beispiel 1, gereinigt. Es erschienen zwei Fluoreszensbänder nach Besprühen mit Natriumcyanid. Das eine wanderte gegen die Kathode und das andere gegen die Anode. Das zuletzt genannte enthielt das NAD-Biotiik-Koijugat und wurde mit Wasser eluiert und bei -20°G gelagert.

609845/1073

- 66 -

Beispiel 3_

Herstellung von Nicotinamidadenindinucleotid^^-Dinitrophenyl-i£ on j ugat

26 mg Natriumbicarbonat wurden in 1,5 ml Wasser, enthaltend 23 mg Nicotinamid 6-(2-aminoäthylamino)purindinucleotidentsprechend Beispiel 1, gelöst. Zu der entstehenden Lösung wurden 3 ml Äthanol, enthaltend 17/Ul 2,4-Dinitrofluorbenzol gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 5 fain der Dunkelheit bei Raumtemperatur gerührt und anschließend 45 ml Aceton von -10⁰C zugegeben. Der entstehende Niederschlag wurde abgetrennt, 2 χ mit 10 ml Aceton gex^aschen und mit 5 ml Wasser gerührt. Die gelbe lösliche Substanz,die sich abschied, wurde durch Elektrophorese auf Papier entsprechend Beispiel 1_; 5 b- gereinigt. Das gegen die Anode wandernde Band, das das NAD-2,4-QLnitrophenylKonjugat enthielt, itfurde mit Wasser eluiert, auf 3 bis 5 ml eingeengt und bei -20°C gelagert.

Beispiel 4

Herstellung von Biotin-Umbelliferon-Eonjugat

Es wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt durch Lösen von 100 mg Umbelliferon, 167 mg Biotin und 141 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dimethylformamid. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 4 h bei -18 C inkubiert und über Nacht bei 7°C und 3 "bis 4 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurden weitere 141 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch 3 bis 4 h bei 7°C gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen. Zu dem Eiltrat

wurden ^^> ml Eiswasser gegeben und das entstehende Gemisch 1 h bei O⁰C inkubiert. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wurde zur Trockene

809845/1073

- 67 -

eingedampft und der Rückstand in 3 "bis 4 ml Methylenchlorid gelost. Zu der entstellenden Lösung wurden 5 ml Diäthyläther gegeben. Der entstehende Niederschlag,' der das Biotin-Umbelligeron-Konjugat enthielt, wurde abfiltriert, getrocknet und "bei Raumtemperatur aufbewahrt .

Beispiel 5

Wirkung von Avidin und Biotin auf die enzymatisch^ Cyclisierungsgeschwindigkeit von NAD- und NAD-Biotin-Konjugaten.

Das in diesem Beispiel angewandte cyclische Reaktionssystem beruhte auf den folgenden Reaktionen:

(a) NAD-Ligand + Lactat

d' ehydr ο g ena s e NADH-Ligand + Pyruvat

(b) ■ NADH-Ligand + Thiazolyl-blau (oxidiert)

NAB-Ligand + Thiazolyl-blau (reduziert)

Acht spezifisch bindende Reaktionsgemische wurden hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,5 ml und enthaltend 0,12m N,N-Bis-2-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8 und die in Tabelle I angegebenen Konzentrationen und Aktivitäten an NAD, NAD-Biotin-Konjugat, entsprechend Beispiel 2, Biotin und Avidin, wobei das zuletzt genannte eine Affinität zur Bindung von Biotin besitzt. Eine Einheit Avidinaktivität ist die Menge Avidin, die imstande ist, 1 /ug Biotin zu binden. Die Reaktionsgemische wurden 2 bis 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit einem, wäßrigen Enzym/Substrat-Gemisch durch Zugabe von 0,1 ml

609845/1073

1m Lithiumlactat, 0,05 ml 10 mm . Thiazolyl "blau in oxidierter Form und einer ausreichenden Menge 0,12 ι N,N-■Bis-2-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, enthaltend 0,38 internationale Einheiten Rinderherz-Milchsäuredehydrogenase und 1,5 internationale Einheiten Schweineherzdiaphorase, zusammengebracht und ein Gesamtreaktionsvolumen von 1 ml erhalten. Die relative Bildungsgeschwindigkeit der reduzierten Form von Thiazolylblau wurde dann in jedem der Reaktionsgemische bestimmt durch Messung der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedemder Gemische bei 570 nm während 24 min innerhalb der ersten Stunde nach Zugabe des Enzym/Substrat-Gemisches. Das gesamte Verfahren wurde doppelt durchgeführt und das Mittel der Ergebnisse ist in Tabelle I angegeben.

TABELLE I:

60984 5/1073

TABELLE

Reak- Konzentra- Konzentration von tion tion von NAD-Biotin-Konju-

NAD (nm) gat (um)

Konzentration Avidin-Aktivon Biotin vität

(Einheiten)

mittlere Zunahme der optischen Dichte (570 nm)

	0
ο ·--	4
CD
OO	5
	6
in
	7
O	8
-J
co

220

220

360

360 360 360

360

	0,002
	0,103
	0,079
	0,003
0,11	0,103
0,11	0,025
0,11	0,069
0,11	0,001

- 70 -

Die Reaktionen 1, 4 und 8 waren Vergleiche und zeigen, daß "bei Abwesenheit von NAD und dem NAD-Biotin-Konjugat im wesentlichen keine Cyclisierung eintrat. Die Ergebnisse der Reaktionen 2 und 3 zeigen, daß das NAD-Biotin-Konjugat eine wesentliche Gbenzymaktivität besitzt. gegenüber ursprünglichem (nativem) NAD. Aus den Ergebnissen der Reaktionen 3 und 6 kann man sehen, daß das Vorhandensein von Avidin in dem Reaktionsgemisch die Bildung von Thiazolylblau (reduzierte Form) hemmt, wenn das vorhandene NAD mit Biotin konjugiert ist. Bei, einem Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 6 und 7 kann man sehen, daß das Vorhandensein von freiem Biotin die Hemmung der Ihiazolylblau-(reduzierte IPorm)-Bildung im Verhältnis zu der Konzentration von Biotin im Reaktionsgemisch verringert.

In diesem Beispiel wurde damit gezeigt, daß die Aktivität des NAD in dem NAD-Biotin-Konjugat relativ zu dem cyclischen Reaktionssystem abnahm in Gegenwart von Avidin und daß die Stärke dieser Abnahme der Aktivität verringert wurde durch das zusätzliche Vorhandensein von Biotin.

Beispiel 5

Direkte Bindungs-C.yclisierungs-Bestimmung von Avidin; Wirkung von unterschiedlichen Gehalten an Avidin auf die Gyclisierungsgeschwindigkeit

Das in diesem Beispiel angewandte cyclische Reaktionssystem war das gleiche wie in Beispiel 5 ausgeführt. Sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische wurden hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,6 ml und jeweils enthaltend 0,12 m N,N-Bis-2-hydroxyäthylglycin-

609845/1073

hydrochlorid-Puffer, pH 7,8 und 250 mn NAD-Biotin- .. Konjugat, entsprechend Beispiel 2. Sechs der Reaktionsgemische enthielten auch Avidin in den in Tabelle II angegebenen Mengen.

Die- Reaktionsgemische wurden 2 "bis 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jedes.Reaktionsgemisch wurde mit einem wäßrigen Enzym/Substrat-Gemisch zusammengebracht durch Zugabe von 0,1 ml.1m Lithiumlactat, 0,05 ml 10 mm Thiazolylblau in oxidierter Form und eine ausreichende Menge 0,12 m M",N-Bis-2-hydroxyäthylglyeinhydrochlorid-

Puffer, pH 7,8, enthaltend 0,38 internationale Einheiten Rinderherz-Milchsäuredehydrogenase und 1,5 internationale Einheiten Schweineherz-diaphorase, um ein gesamtes Reaktionsvolumen von 1 ml zu erhalten. Die relative , Bil.dungsgeschwindigkeit der reduzierten Form von Thiazolylblau wurde dann in jedem der Reaktionsgemische bestimmt durch Messung der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedem der Reaktionsgemische bei 570 nm 24 min lang während der ersten Stunde nach Zugabe des Enzym/Substrat-Gemisches. Das Verhältnis, ausgedrückt als %, der Änderung der optischen Dichte in jedem Reaktionsgemiseh, enthaltend Avidin, zu derjenigen des Reaktionsgemisches, das kein Avidin enthielt, wurde berechnet und ist in Tabelle II und Fig. 1 als relative Cyclisierungsgeschwindigkeit angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle II und in graphischer Form in Fig. 1 der Zeichnungen angegeben.

TABELLE II:

60984B/1073

	ABELLE	II	relative Gycli- sierungsgeschwin- digkeit (%)
Reaktiohs- gemisch	zugesetzte Avidinmenge (Einheiten)	100
1	0,000	96
2	0,005	93
3	0,010	84
4	0,045	68
5	0,090	51
6	0,120	8
7	0,180

In diesem Beispiel konnte gezeigt werden, daß die relative Gyclisierungsgeschwindigkeit des cyclischen Reaktionssystemes und damit die Aktivität des IiAD in dem NAD-Biοtin-Konjugat eine umgekehrte .Funktion ist der in dem spezifischen bindenden Reaktionsgemisch enthaltenen Avidinmenge. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit ein Prüfmittel und Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins des Liganden Avidin in einem flüssigen Medium mit Hilfe eines direkten Bindungs-Cyclisierungs-Bestimmungsverfahren dar.

Beispiel

_Z

Eonkurrenz-Bindungs-Cyclisierungs-Bestimmung für Biotin; Wirkung unterschiedlicher Gehalte an Biotin auf die Cyclisierungsgeschwindigkeit

Das in diesem Beispiel angewandte Cyclisierungsreaktions-

609845/1073

system war das gleiche wie in Beispiel 5 angegeben. Sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische wurden hergestellt jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,45 ml und jeweils enthaltend 0,12 m N,N-Bis-2-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8 und 180 nm EAD-Biotin-Konjugat, entsprechend Beispiel 2. Sechs der Reaktionsgemische, d.h. die Wummern 1 bis 6 in Tabelle III enthielten zusätzlich 0,11 Einheiten Avidin. Fünf der sechs Avidin enthaltenden Reaktionsgemische enthielten auch Biotin in den in Tabelle III angegebenen Konzentrationen, d.h. die Gemische 2 bis 6 in Tabelle III.

Die Reaktionsgemische wurden 2 bis 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jedes der Reaktionsgemische wurde mit einem wäßrigen Enzym/Substrat-Gemisch zusammengebracht durch Zugabe von 0,1 ml 1m Lithiumlactat, 0,05 ml 10 mm Thiazolyl blau in oxidierter Form und einer ausreichenden Menge 0,12 m NjN-Bis^-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, enthaltend 0,38 internationale Einheiten Rinder

Die reduzierte Form von Thiazolylblau wurde dann in jedem der Reaktionsgemische bestimmt durchMessung der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedem der Gemische bei 570 nm innerhalb von 24 min in der ersten Stunde nach der Zugabe des Enzym/Substrat-Gemisches. Das Verhältnis, ausgedrückt in ^L/o dieser Änderung der optischen Dichte in jedem Reaktionsgemisch, enthaltend Biotin, zu derjenigen in dem Reaktionsgemisch, das weder Biotin noch Avidin enthielt, wurde berechnet und ist in Tabelle III und Fig. 2 als relative Cyclisierungsgeschwindigkeit angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle III und in graphischer Form in Fig. 2 der Zeichnungen angegeben.

TABELLE III:

60984 5/1073

	TABELLE III	relative Cyclisierungs- ge schwindigkeit O)
Reaktions- gemisch	Biοtin Konzentrat ion (um)	8
1	0	22
2	80	35
3	160	• 63
, 4-	320	80
5	400	92
6	800

In diesem Beispiel konnte gezeigt werden,daß die relative Cyclisierungsgeschwindigkeit des Reaktionssystems und
damit die Aktivität des WAD in dem NAD-Biotin-Konjugat
eine direkte .Punktion war der in dem spezifisch, bindenden Reaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge. Die Erfindung stellt daher ein Prüfmittel und Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins des Liganden Biotin in einem flüssigen Medium mit Hilfe einer Konkurrenz-Gyclisierungs-Bestimmung dar.

Beispiel 8_

Direktes Bindungs-Gyclisierungsverfahren zur Bestimmung von Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl und Derivaten davon

Das Cyclisierungs-Reaktionssystem in diesem Beispiel
war das gleiche wie in Beispiel 5 angegeben. Acht
spezifisch bindende Reaktionsgemische von jeweils 0,6 ml wurden hergestellt, jeweils enthaltend 0,12 m N,N-Bishydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7*8 und die in

609845/1073

2818511

Tabelle IV angegebenen Mengen und Konzentrationen an NAD, NAD^j^-Dinitrophenyl-Konjugat, entsprechend Beispiel 31 Antiserum zu 2,4-Dinitrophenyl und Nicotinamidmononücleotid (HMN). Die Eeaktionsgemische wurden 3 bis 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit einem wäßrigen Enzym/Üubstrat-Gemisch zusammengebracht durch Zugabe von 0,1 ml 1m Lithiumlaetat, 0,05 ml 10 mm Thiazolylblau in oxidierter Form und einer ausreichenden Menge 0,12 m N,N-Bishydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7>8, enthaltend 0,38 internationale Einheiten Rinderherz-Milchsäuredehydrogenase und 1,5 internationale Einheiten Schweineherz-Diaphorase, um ein .Gesamtreaktionsvolumen von 1ml zu erhalten. Die relative Geschwindigkeit der Bildung der reduzierten Form von Thiazolylblau wurde in jedem der Reaktionsgemische bestimmt durch Messung der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedem Reaktionsgemisch bei 570 nm innerhalb von 24- min während der ersten Stunde nach Zugabe des Enzym/Substrat-Gemisches. Das gesamte Verfahren wurde doppelt durchgeführt und die Mittelwerte sind in Tabelle IV angegeben.

TABELLE IV:

609845/1073

A B E I. LE

Reaktion

1
2

5
6

7
8

NAD-Konzentration (/■um)

1,75 1,75 1,75 1,75

phenyl-^g Konzentration (nm)

190

290 290

MIN-Konzen-*·
tration
(/um)

50
50
50

Antiserummenge
()

100
100
100
100

mittlere Zunahme der optischen Dichte

(570 nm)

0,005

0,164 0,608 0,699 0,275 0,648

0,021 0,037

Die Reaktion 1 war ein Vergleich und zeigt, daß in Abwesenheit von WAD und dem NAD-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat im wesentlichen keine Cyclisierung auftrat. Aus den Ergebnissen der Reaktion 2 geht hervor, daß das NAD-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat in dem enzymatisehen Gyclisierungssystem aktiv ist. Die Ergebnisse der Reaktionen 3 und 5 zeigen, daß das Vorhandensein von Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl die Cyclisierung von NAD hemmt. Wie aus den Ergebnissen der Reaktion 6 hervorgeht, wird eine solche Hemmung umgekehrt durch Zugabe von EHN. Aus den Ergebnissen der Reaktionen 3 und 4 kann man ersehen, daß di.e Cyclisierungsgeschwindigkeit in Gegenwart von NMN ungefähr 15 % größer ist als in Abwesenheit dieser Substanz. Dieses Ergebnis beruht vermutlich auf der Verunreinigung durch äußeres NAD, da andere Messungen gezeigt haben, daß HMN die Cyclisierungsgeschwindigkeit in Abwesenheit von Antikörpern nicht beeinflußt. Trotzdem enthält das Antiserum eine gewisse Aktivität, bezogen auf NAD selbst, die gehemmt wird durch das Vorhandensein von NMN.

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die Aktivität des NAD in dem NAD-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat, bezogen auf das Cyclisierungsreaktionssystem, gemindert wurde in Gegenwart von Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl. Die vorliegende Erfindung liefert damit ein Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins des Liganden, Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl in einem flüssigen Medium mit Hilfe eines direkten Bindungs-Cyclisierungs-Bestimmungsverfahrens.

609845/1073

Beispiel °/.

Konkurrenz-Bindungs-Cyclisierungs-Bestimmung von 2,4-Dinitrobenzol und dessen Derivaten; Wirkung verschiedener Gehalte an N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat auf die Cyclisierungsgeschwindigkeit

Das Gyclisierungsreaktionssystem, das in diesem Beispiel angewandt wurde, war das gleiche wie in Beispiel 5 angegeben. Sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische wurden hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,6 ml und jeweils enthaltend 0,12 ι N,U-Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puff er, pH 7,8, 300 nm NAD-Dinitrophenyl-Xonjugat, entsprechend Beispiel 3 und. 50/um Nicotinamidmononucleotid. Sechs der sieben Reaktionsgemische, d.h. die Gemische 1 bis 6 in Tabelle V enthielten auch eine Menge an Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl, die ausreichte, um die Cyclisierungsgeschwindigkeit des anderen Reaktionsgemisches um 85 V° zu hemmen. Ν-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat, ein Derivat von 2,4-Dinitrobenzol, das hergestellt worden war wie in Biochem. J. 4-2, 287 (1948) beschrieben, wurde zu fünf der sechs antikörperhaltigen Reaktionsgemische zugesetzt, d.h. den Gemischen 2 bis 6 in Tabelle V in den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen.

Die Eeaktionsgemische wurden ungefähr 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit einem wäßrigen Enzym/Substrat-Gemisch zusammengebracht durch Zugabe von 0,1 ml1m Lithiumlactat, 0,05 ml 10 nun Thiazolylblau in oxidierter !Torrn und einer ausreichenden Menge 0,12 m Ν,Ν-Bis-hydroxyäthylglycin-

609845/1073

hydrochlorid-Puffer, pH 7_?8, enthaltend 0,38 inter- . nationale Einheiten Rinderherz-Milchsäuredehydrogenase und 1,5 internationale Einheiten Schweineherzdiaphorase, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erhalten. Die relative Bildungsgeschwindigkeit der reduzierten Form von Thiazolylblau wurde in jedem der Reaktionsgemische bestimmt durch Messung.der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedem der Gemische bei 570 nm innerhalb der ersten 24 Minuten während der ersten Stunde nach Zugabe des Enzym/Substrat-Gemisches. Das Verhältnis, ausgedrückt in % ,dieser Änderung der optischen Dichte in jedem Reaktionsgemisch,. enthaltend N-(2>4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat zu derjenigen des Reaktionsgemisches, enthaltend weder U-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat noch Antikörper zu 2,4—Dinitrophenyl wurde berechnet und ist in Tabelle V und Fig. als relative Gyclisierungsgeschwindigkeit angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle V und in graphischer Form in Figur 3 der Zeichnungen angegeben.

	TABELLE Y	relative Gycli sierungsge schwindigkeit Qp)
Reaktions gemisch	Έ-(2,4-Dinitrophenyl)- 6-aminocaproat-Konzen- tration (nm)	16
1	0	19
2	17	30
3	42	35
4	83	41
5	166	76
6	415

809845/1073

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die relative Cyclisierungsgeschwindigkeit des Cyclisierungsreaktionssystems und damit die Aktivität des NAD in dem NAD-Dinitrophenyl-Konjugat eine direkte ITunktion war der Menge an N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat, die in dem spezifischen Bindungsreaktionsgemisch vorhanden war. Die Erfindung liefert damit ein Prüfmittel und Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins des Liganden N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat in einem flüssigen Medium mit Hilfe eines Konkurrenz-Bindungs-Cyclisierungs BeStimmungsVerfahrens.

Beispiel 10

Direktes Bindungs-Biolumineszens-Bestimmungsverfahren für Avidin; Wirkung des Vorhandenseins von Biotin auf die öpitzenlichtintensität.

Das Biolumineszens-Reaktionssystem dieses Beispiels beruhte auf folgenden Gleichungen:

Cc) NAD-Ligand ₊ Äthanol

NADH-Ligand + Acetaldehyd

(d) HADH-Ligand + ITW* + H® NADH-

dehydrogenäse

NAD-Ligand + ₂

(e) S¹MNH₂ + langkettiger Aldehyd + O

ITQi + langkettige Säure + H₂O + hV

* Plavinmononucleotid
Eine licht erzeugende Lösung zur Durchführung der

609845/1073

Reaktionen (d) und (e) wurde folgendermaßen hergestellt. Ein Reagensgemisch wurde hergestellt,enthaltend 0,13 m Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,67 Gew.-% Rinders erumalbumin, 15,7/um Flavinmononucleotid ■ (E¹MN), enthaltend 13,3 m.m. Natriumacetat und dieses Gemisch in der Dunkelheit bei -2O⁰C aufbewahrt. Eine Emulsion von 5/ul Dodecanal in 5/U-l Wasser wurde an dem Tag hergestellt, an dem die lichtentwickelnde Lösung angewandt werden sollte. Lyophilisierte Luciferase, extrahiert aus Photobacterium fisheri (Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey) wurde zu o',O13 in· Phosphatpuff er, pH 7,3» "bis zu einer Konzentration von 20 mg/ml zugegeben. Nach 30 min wurde die entstehende Suspension mit 1500 g 10 min zentrifugiert und die Perle verworfen. Die lichtentwickelnde Lösung wurde dann 5 min vor Anwendung hergestellt durch Zusammengeben von 75/¹I cLes Reagensgemisches, 5/u.l Dodecanalemulsion und 20/ul Luciferaselösung.

Um das durch die Reaktion (b) gebildete Licht nachzuweisen, wurde ein Photometer konstruiert, bestehend aus einem Photodetektor und einer 6 χ 50 mm Küvette in einer lichtintegrierenden Kugel, so daß das in der Küvette gebildete Licht auf den Photodetektor reflektiert wurde. Das durch den Photodetektor gebildete elektronische Signal wurde auf einen Streifenrecorder übertragen. Die Spitzenlichtintensität, wie der Ausdruck hier verwendet wird, wurde aus der Kurve des Schreibers bestimmt und in willkürliche Einheiten entsprechend den Teilungen des Papiers bezeichnet.

Es wurden neun verschiedene spezifische Bindungs-Reaktionsgemische

hergestellt mit jeweils einem Gesamtvolumen von 0,2 ml und jeweils enthaltend 0,1m Tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, 0,01 m

Ϊ
609845/1073

Semicarbazidhydrochlorid lind jeweils die Mengen oder Konzentrationen, die in Tabelle VI angegeben sind an Äthanol, NAD, NAD-Biotin-Konjugat entsprechend Beispiel 2, Biotin und Avidin. Die Reaktionsgemische wurden 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 0,025 internationale Einheiten αehydrogenäse zu jedem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reduktionsreaktion einzuleiten. Semicarbazid reagierte mit dem Acetaldehyd, der in Reaktion (c) entstand unter Bildung eines Semicarbazone und führte damit die Reaktion (c) in die gewünschte Richtung.

Die Reaktionsgemische wurden ungefähr 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. 10 /ul jedes Reaktionsgemisches wurden dann in eine einzelne Küvette eingespritzt, die in dem oben beschriebenen Photometer angebracht war und -100/ul der vorher hergestellten lichterzeugenden Lösung enthielt, die vorher 2 bis 3 min bei 28°C inkubiert worden war. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben.

TABELLE VI:

60984B/1075

TABELLE

Reaktion

1 2 3 4

7 8

Athanolkonzen- tration (m)

0,6 0,6

0,6 0,6

0,6 0,6

NAD-Konzentra·™ tion (um)

375 375 375 NAD-Blotin-Kon-*· Biotinkongugat-Konzentrazentration tion (mn) ()

343 343 343 343 343 343

200 200 200

Avidin- aktivität (Einheiten)	Spitzenlicht- intensität
— MM	2
	136
0,054	: 140
,.—	: 2
~—	56
0,054	15 . t
0,054 .
0,054	■ 32' :·:
■f· ^H aas	CU

Die Reaktionen 1, 4- und 7 waren Vergleiche und zeigen, daß in Abwesenheit von Äthanol im wesentlichen keine Reaktion eintrat. Die Ergebnisse der Reaktion 5 zeigen_t daß das HAB-Biotin-Konjugat in dem Biolumineszens-Reaktionssystem aktiv ist. Aus den Ergebnissen der Reaktionen 5 und 6 kann man sehen, daß das "Vorhandensein von Avidin in dem Reaktionsgemisch die Menge an entstehendem Licht hemmt. Aus einem Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 6 und 8 sieht man, daß das Vorhandensein von freiem Biotin die Lichtbildung hemmt mit zunehmender Konzentration an Biotin in dem ReaktionsgemisGh. Die Reaktion/έ und 3 zeigen, daß Avidin die Aktivität von freiem NAD nicht hemmt und die Reaktionen 5 und 9 zeigen, daß das Vorhandensein von Biotin allein die Aktivität des MAD-Biotin-Eonjugats nicht angreift.

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die Aktivität des NAD in dem NAD-Biοtin-Konjugat, bezogen auf das Biolumineszensreaktionssystem abnahm in Gegenwart von Avidin und daß die Stärke dieser Abnahme der Aktivität verringert wurde durch das zusätzliche Vorhandensein von Biotin.

B eis ρ i e 1 11

Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszens-Bestimmung von Biotin^ Wirkung unterschiedlicher Gehalte von Biotin auf die Spitzenlichtintensität

Das in diesem Beispiel angewandte Biolumineszens-Reaktionssystem war das gleiche wie im Beispiel 10 angegeben. Es wurden sieben spezifische Bindungsreaktionsgemisehe hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,2 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, 0,6 m Äthanol, 0,01 m Semicarbazidhydrochlorid, 3^3 nm NAD-Biotin-Konjugat, ent-

609845/1073

sprechend Beispiel 2, 0,025 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase und 0,055 Einheiten Avidin. Biotin wurde zu sechs der sieben Reaktionsgemische und zwar die Kümmern 2 bis 7 in TabelleVH in den dort angegebenen Konzentrationen zugegeben. Die Reihenfolge und Art der Zugabe war die gleiche wie in Beispiel 10 angegeben.

Die Reaktionsgemische wurden ungefähr 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Jeweils 10 ,ul jedes Reaktionsgemisches wurden in eine einzelne Küvette injiziert, die in dem in. Beispiel 10 beschriebenen Photometer angebracht war und 100/ul einer lichterzeugenden Lösung, die entsprechend Beispiel 10 hergestellt und 2 bis 3 min bei 28°C inkubiert worden war, enthielt. Das gesamte Verfahren wurde doppelt durchgeführt und die mittleren Ergebnisse sind in Tabelle VII und in graphischer Form in J'ig. 4 der Zeichnungen angegeben.

	TABELLE	VII
Reaktions gemisch	Biotin-Kon- zentration (nm)	mittlere Spitzenlicht intensitat
1-· ..	0	• 36
2	25	44
3	50	37
4	100	79
5	150	90
6	200	97
7	300	1o4

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die Stärke der Spitzenlichtintensitat, die durch das Bio-

60984 5/1073

I. - 86 -

lumineszensreaktionssystem erzeugt wurde und damit die Aktivität des NAD in dem NAD-Biotin-Konjugat eine direkte Funktion war der in dem spezifischen Bindungs-Reaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt daher ein Prüfmittel und Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins des Idganden Biotin in einem flüssigen Medium dar mit Hilfe einer Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszens-Bestimmung.

Beispiel 12,

Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszens-Bestinuiiung von 2,4-Dinitrobenzol und dessen Derivaten; Wirkung verschiedener Gehalte an N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat auf die Spitzenlichtintensität.

Das in diesem Beispiel angewandte Biolumineszens-Reaktionssystem war das gleiche, wie in Beispiel 10 angegeben. Es wurden sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,1 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, 0,01 m Semicarbazidhydrochlorid, 0,6 m Äthanol, 55/^™ Nicotinamidmononucleotid und 367 um HAD-DinitrophenylrKonjugat, entsprechend Beispiel 3· N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat wurde zu sechs von sieben Reaktionsgemischen, nämlich die Nummern 2 bis 7 in Tabelle VJECLn den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen zugegeben und zu jedem der sechs
Reaktionsgemische wurde auch eine Menge an Antikörper
zu 2,4-Dinitrophenyl zugegeben, die ausreichte, um die
Spitzenlichtintensität auf 39 % derjenigen herabzusetzen, die in Abwesenheit von N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat und Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl gebildet
.wurde.

Die Reaktionsgemische wurden 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 0,025 internationale Einheiten Alkoholdehydro-

609845/1073

genäse zu dem Eeaktionsgemisch zugegeben, um die Eeduktibnsreaktion einzuleiten. Die Eeaktionsgemische wurden dann ungefähr 30 min bei Eaumtemperatur inkubiert. Dann wurden jeweils ΛQAiI jedes Heaktionsgemiscb.es in eine einzelne Küvette injiziert, die in dem in Beispiel 10 beschriebenen Photometer angebracht war, enthaltend 100 λιΙ einer lichterzeugenden Lösung, die entsprechend Beispiel 10 hergestellt worden war und vorher 2 bis 3 min bei 28⁰C inkubiert worden war. Das gesamte Verfahren wurde zweimal durchgeführt und das Mittel der Ergebnisse ist in Tabelle VIII und in graphischer JPorm in JB'ig. 5 <ler Zeichnungen angegeben.

TABELLE VIII

Eeafctions- gemiseh - .	H-(2,4-Dinitrophenyl)- 6-aminocaproat-Kon- zentration (/um)	mit ti * Spitz e,n— lichtintensität
1	0,00	14
2	0,125	17
3	0,25	20
4	0,50	22
VJl	0,75	24
6	1,00	27
7	1,50	28

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die Stärke der Spitzenlichtintensität, die durch das Biolumineszensreaktionssystem gebildet wurde und damit die Aktivität des HAD in dem NAD-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat eine direkte Funktion ist der Menge an N-(2,4-

609845/10 73

I. - 88 -

Dinitrophenyl)-6-aminocaproat in der spezifischen Bindungsreaktion. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert somit ein Prüfmittel und Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins des Liganden H-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat in einem flüssigen Medium mit Hilfe einer Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszens-BeStimmung.

Beispiel 13

Spezifische BindungsbeStimmung für Biotin und Avidin unter Anwendung eines Enzymsubstrats als Markierungssubstanz.

Das spezifische Bindungs-Bestimmungssystem dieses Beispiels beruhte auf der folgenden Reaktion:

pH 8_?Q-

-Umhelliferon-Biotin-Konjugat (maximale Eluoreszens bei 378 nm)

+ Biotin

(maximale Fluoreszens bei 448 nm)

Es wurden zehn verschiedene Bindungs-Reaktionssysteme hergestellt, jeweils in einem .Gesamtvolumen von 0,3 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0 und die in Tabelle IX an-

60984S/1073

gegebenen Mengen oder Konzentrationen an Umbelliferon-Biotin-Konjugat entsprechend Beispiel 4, Biotin und Avidin. Die Reaktionsgemische wurden 1 bis J min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsgemische 2 bis 10 in Tabelle IX enthielten auch 0,26 internationale Einheiten Rinderleber-carboxylat-hydrolase (Esterase). Die relative Reaktionsgeschwindigkeit in jedem der Reaktionsgemische wurde dann bestimmt durch Überwachung der jeweils entstehenden Fluoreszens bei 448 nm mit einem Fluorometer, Modell 111 Turner (G.K. Turner Assoc, 2524 Pulgas Street, PaIo Alto, California), das eingestellt war auf eine: .Anregung bei 364 nm. Das durch das IPluorometer erzeugte elektronische Signal wurde auf einen Papierstreifenschreiber übertragen und die· pro min erzeugte i'luoreszens aus der Schreiberkurve gemessen und in willkürlichen Einheiten auf der Grundlage der Papiereinteilung bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX angegeben.

TABELLE IX:

609845/1073

TABELLE

	Reaktion	Esterase (i.e.;	Uinbellif eron- Biotin-Konju- gat-Eonzentra tion (um)	Biotin- Konzen- tration (mn)	Avidin Aktivität- Einheiten)	Änderung der ETuoreszens je min
	1	...	750		**-_ —	0,000
	2	0,26	565			0,077
	5	0,26	750			0,145
to	4	0,26	750		0,0022	0,103
OO .«>	5	0,26	750		0,022	0,058
in ■·>«,	6	0,26	750	——	0,055	0,000
	7	0,26	750		0,055	0,027
--a	8	0,26	750		0,055	0,026
w	9	0,26	730	670	0,055	0,057
	10	0,26	750	1540	0,055	0,115

2818511

Die Reaktion Λ war ein Vergleich und zeigte, daß in Abwesenheit von Esterase keine Reaktion eintritt. Die Ergebnisse der Reaktionen 2 und 3 zeigen, daß das Umbelliferon-Biotin-Konjugat in der enzymatisehen Reaktion wirksam ist und ein Vergleich der Ergebnisse mit denjenigen der Reaktionen 4 bis 8 zeigt, daß das Vorhandensein von Avidin die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zu der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Avidinmenge hemmt. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 8, 9 und 10 zeigt, daß die Stärke der Hemmung der Reaktionsgeschwindigkeit durch Avidin eine direkte !Punktion ist der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge.

Es.konnte.so in diesem Beispiel gezeigt werden,daß die Ge* scnwmaigkeit ° ° -

der durch die Esterasereaktion erzeugten Fluoreszens · und damit die Substrataktivität des Umbelliferon-Biotin-> Eonjugats herabgesetzt wurde durch das Vorhandensein von Avidin und daß die Stärke dieser Aktivitätsvermin·" derung verringert wurde durch das Vorhandensein von Biotin. Die vorliegende Erfindung liefert damit ein Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins der Liganden Biotin und Avidin in einem flüssigen Medium mit Hilfe eines spezifischen Bindungs-«· Bestimmungs-Verfahrens unter Anwendung eines Enzymsubtrats als Markierungssubstanz.

Beispiel 14

Herstellung von 2,4— Dinitrophenyl-Fluorseein-Konjugat. Fluoreseein-3¹,6'-bis-/"6- (2,4-dinitroanilino)hexanoat J,

Die Synthese umfaßte grundsätzlich die Umsetzung des

6^|V0984S/1073

Säurechlorids von 6-(2,4-Dinitroanilino)hexansäure mit dem Dinatriumsalz von Fluorescein. 6-(2,4-Dinitroanilino )hexansäure wurde nach dem in Biochem. J. 42, 287-94 (1948) angegebenen Verfahren hergestellt.

Eine Lösung von 1,5 S (5 mMol) 6-(2,4-Dinitroanilino)-hexansäure wurde durch 15 min lange Umsetzung mit/warmem Thionylchlorid und anschließendes Kühlen und Verdünnen mit 20 ml Hexan in das Säurechlorid umgewandelt. Das entstehende feste Säurechlorid wurde abfiltriert und nach sorgfältigem Trocknen zu 600 mg Dinatriumsalz von Fluorescein in 10 ml trockenem Aceton gegeben. Wach 5 h langem Sieden unter Rückfluß wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml Wasser und 5 ¹¹Il Aceton abgebrochen.

Nach 30 min bei 25 0 wurde das Gemisch zur Trockene eingedampft und der Rückstand zwischen Äthylacetat und wäßriger Natriumbicarbonatlösung verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit i%iger wäßriger Schwefelsäure gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Das rote Öl wurde über 60 g Silieagel 60 (E, Merck, Darmstadt) mit 20 ^c/o Aceton in Tetrachlorkohlenstoff als Eluens chromatographiert. Die 1,2 g unreiner Bis-ester wurden erneut über 60 g Silieagel mit Hilfe von 10 % Aceton in Tetrachlorkohlenstoff chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden zusammengegeben und eingedampft, wobei man 180 mg eines gelben glasartigen Feststoffes erhielt.

Analyse: 0 H if

Berechnet für G₄₄H₅₈N₆O₁₅ : · 59733 4,30 9^43

Gefunden: 60,92 4,35 6,65

Das Infrarot-Spektrum zeigte die erwartete Ester-Carbonyl-Streckabsorption bei 1765 cm .

6 09845/1073

Beispiel Ij?

Spezifische Bindungsverfahren für Derivate von 2,4-Dinitrophenyl und Antikörpern dazu unter Verwendung eines Enzymsubstrats (modifiziertes .Fluorescein) als Markierungssubstanz.

Das in diesem Beispiel angewandte spezifische Bindungs-Bestimmungs-System beruht auf der im Diagramm 1 angegebenen Reaktion.

A. Direkte Bindungs-Fluoreszens-Bestimmung von Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl; Wirkung verschiedener Gehalte an Antikörper auf die Reaktionsgeschwindigkeit.

Es wurden sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt und analysiert. Für jedes Reaktionsgemisch wurden 20 /ul 1 /um 2,4-Dinitrophenyl-Fluorescein-lionöugat (entsprechend Beispiel 14) in Dimethylsulfoxid mit einem Volumeii-Antiserum zu 2,4-Dinitrophenyl, wie in Tabelle X angegeben,und mit einem ausreichenden Volumen 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7)0 um ein Gesamtvolumen von 2,0 ml zu erhalten, zusammengegeben. Die Hintergrundhydrolysegesehwindigkeit für die Esterbindungen in dem Konjugat wurde 3 min für jedes Reaktionsgemisch durch Bestimmung der Geschwindigkeit der Zunahme der iTuoreszensintensität bei 510 nm nach dem allgemeinen in Beispiel 13 beschriebenen Verfahren bestimmt mit einem HTuorometer, das ausgelegt war für eine Airegüng bei 470 nm. 10 /ul 0,1 m Bishydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7₅O? enthaltend 0,54 Einheiten -Esterase Typ I (E.G. Kr. 3·1·1·1 der Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) wurden zu jedem Reaktionsgemisch gegeben. Die entstehende Gesamtreaktionsgeschwindigkeit wurde auf die gleiche Weise ge-

- 93a $03845/1073

DIAGRAMM 4

sterase

H₂O, pH 7,0

2 ,4 — lUnitrophenyl-fkuorescein-Kon jugat

+ andere Produkte

(maximale j.luoresceii£j "bei 510 run)

R = -(CH₂) ₅ NH f >

°2^d9845/1073

messen wie die Hintergrundhydrolysegeschwindigkeit. Die Ergebnisse sind in Tabelle X angegeben. Die Geschwindigkeit der Hintergrundhydrolyse wurde abgezogen von der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit, um die Nettoreaktionsgeschwindigkeit zu erhalten, die der esterasekatalysierten Reaktion zuzuschreiben ist. Die Beziehung zwischen der netto enzymkatalysierten Reaktionsgeschwindigkeit und der Hintergrundhydrolysegeschwindigkeit im Alkalischen und der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Serummenge ist in graphischer Form in ider Fig. 6 der Zeichnungen angegeben.

T	Reaktionsge misch	A B E L L E	X	Gesamt reaktionsge schwindigkeit
1	Antiserum menge (/Ul)	Ilintergrund- hydrolyse- gesehwindig- keit	2,68
2	0	0,02	2,48
3	5	0,07	1,91
4	10	0,11	1,08
5	20	0,17	0,63
6	30	0,21	0,45
7	40	0,22	0,30
60	0,26

In diesem Teil des Beispiels konnte gezeigt werden, daß die Nettoreaktionsgeschwindigkeit der Hydrolysereaktion eine umgekehrte lunktion der Antikörpermenge zu dem Ligan-

Ö09845/1073

den_r2,4-Dinitrophenyl ist, die in dem spezifischen Bindungsreaktionsgemisch vorhanden ist. Es wurde ebenso gezeigt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit der Hintergrundhydrolysereaktion eine direkte Funktion ist der Menge an Antikörper, die in, dem spezifischen Bindungsreaktionsgemisch vorhanden ist. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert damit ein Prüfmittel und ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins des Liganden_r Antikörper gegen 2,4-Dinitrophenyl in einem flüssigen Medium mit Hilfe eines direkten Bindungs-Fluoreszens-BeStimmungsverfahrens.

B. Konkurrenzbindungs-i'luoreszens-Bestimmung von Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl; Wirkung verschiedener Gehalte an 2,4-Dinitrophenyl-ß-Alanin auf die Reaktionsgeschwindigkeit .

Es wurden zehn spezifische Bindungsreaktionsgemisehe hergestellt, jeweils mit einem Geaamtvolumen von 2,0 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,0 und 2,4-Dinitrophenyl-ßalanin, hergestellt entsprechend dem in J.Amer .Chem.ßoc. 76, 1328 (1954) beschriebenen Verfahrenen den in der Tabelle XI angegebenen Konzentrationen. Zu neun der zehn Reaktionsgemische, d.h. den Nummern 2 bis 10 in Tabelle XI wurde eine Menge an Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl zugegeben, die ausreichte, um die Geschwindigkeit der esterasekatalysierten Reaktion in dem anderen Gemisch, d.h. bei Nr. 1,um 60 % herabzusetzen Nach dem Vermischen wurden 20/ul 1 /um 2,4-Dinitrophenyl-Fluorescein-Konjugat (entsprechend Beispiel 14) in Dimethylsulfoxid zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. 10/Ul 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,0^ enthaltend 0,54 Einheiten Esterase Typ I

6Ö9845/1073

(E.G. Hr. 3«1-1«1der Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) wurden, zu jedem Reaktionsgemisch gegeben. Die entstehende Reaktionsgeschwindigkeit wurde wie im Teil A dieses Beispiels beschrieben, gemessen. Der Prozentsatz der Geschwindigkeit der Reaktionen 2 bis 10 zu demjenigen der Reaktion 1 (kein Antikörper vorhanden) wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI und in graphischer Form in IPig. 7 cLer Zeichnungen angegeben.

I	TABELLE	XI	Reaktions geschwin digkeit	prozentuale Geschwindig keit, bezogen auf Reaktion 1
Reaktions gemisch	2,4-Dinitrophenyl- xo-al anin-Konz entra- tion (nm)	2,78
1	0	1,04	37
2	0	1,01	36
3	5	1,04	37
4	10	1,24	45
5	20	1,51	54
6	30	1,54	56
7	50	1,80	65
8	75	1,85	67
9	. 100	2,33	84
10	150

In diesem Teil des Beispiels wurde gezeigt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit der Hydrolysereaktion eine direkte l^unktion ist der Menge an 2,4-Dinitrophenyl-ßalanin in dem Reaktionsgemisch. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung

6b9845/1073

des Vorhandenseins von Liganden, wie Derivaten von 2,4—Dinitrophenyl in einem flüssigen Medium mit; Hilfe einer Konkurrenz-Bindungs-Fluoreszens-Bestiiamung dar.

C. Konkurrenz-Bindungs-photometrische-Bestimmung von Derivaten von 2,4- Dinitrophenyl; Wirkung verschiedener Gehalte an 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin auf die Reaktionsgeschwindigkeit.

Es wurden acht spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt jeweils mit einem Gesamtvolumen von 1,0 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,0, und 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin in den .in Tabelle XII angegebenen Konzentrationen. Zu sieben der acht Reaktionsgemische, d.h. die Nummern 2 bis 8 in Tabelle XII, vmrde eine Menge an Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl zugegeben, die ausreichte, um die Geschwindigkeit der esterasekatalysierten Reaktion in dem anderen Gemisch, d.h. Nr. 1,' um 82 % herabzusetzen. Nach dem Vermischen wurden 10 /Ul 0,1 mm 2,4-Dinitrophenyl-Fluorescein-Konjugat (entsprechend Beispiel 14) in Dimethylsulfoxid zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. 20/Ul 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,0, enthaltend 2,16 internationale Einheiten Esterase Typ I (E.C. Nr. 3-1.1-1 der Sigma Chemical Co., St. Louis Missouri) wurden dann zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. Die Änderung der Absorption jedes Reaktionsgemisches bei 489 nm pro min wurde mit einem Gilford-2000-Spektrophotometer überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle XII und in graphischer I'orm in Fig. 8 der Zeichnungen angegeben.

TABELLE XII:

009845/1073

— ns —

TABELLE

XII

Reaktions— gemisch	2,4-Dinitrophenyl- ß-alanin-Konzen- tration (/um) ,	Änderung der Absorption
1	O	0,0261
2 "	0	0,0047
3"	1,25	0,0118
4	2,5	0,0131
5	5,0	0,0185
6		0,0202
7	10,0	0,0192
8	12,5	0,0223

In diesem Teil des Beispiels wurde gezeigt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit eine direkte iunktion ist der Menge an 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin in dem Reaktionsgemisch. Die vorliegende Erfindung liefert damit ein Prüfmittel und ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von Liganden, wie Derivaten von 2,4-DinitrophenyL, in einem flüssigen Medium mit Hilfe einer Konkurrenz-Bindungs-photometrischen-BeStimmung.

D. Konkurrenz-Bxndungs-iluoreszens-Bestimmung von Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl; Anwendung einer nichtenzymatisehen Nachweisreaktion.

Das in diesem Teil angewandte spezifische Bindungs-Bestimmungssystem war das gleiche wie in dem Diagramm 1 angegeben mit der Ausnahme, daß keine Esterase angewandt wurde, um die Hydrolyse der Esterbindungen in dem Konjugat

Ö09845/1073

zu hydrolysieren.

Es wurden acht spezifische Bindungsreaktionsgemische herge stellt, jeweils, mit einem Gesamtvolumen von 2 ml und
jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminO-methanhydrochlorid-Puffer, pH 7,5 und 2,4-Dinitrophenylß-alanin in den in der Tabelle XIII angegebenen Konzentrationen. Zu jedem Eeaktionsgemisch wurden 50yUl Antiserum zu 2,4-Dinitrophenyl gegeben. Mach dem Vermischen wurden 20/Ul 2/um 2,4-Dinitrophenyl-Fluorescein-Eonjugat (entsprechend Beispiel 14) in Dimethylsulfoxid zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und die entstehende Reaktionsgeschwindigkeit entsprechend Teil A dieses Beispiels bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XIII angegeben.

	TABELLE XIII	Reaktions geschwin digkeit
Reaktions gemisch	. 2,4-Dinitrophenyl- ß- al anin-Eonz en- tration (mn)	0,96
1	O	0,94
2	12,5	0,84
3	31,2	0,78
4	62,5	0,70
5	94,0	0,59
6	125	0,57
7	187	0,53
8	250

Es konnte in diesem Teil des Beispiels gezeigt werden, daß die Hintergrundhydrolysegeschwindigkeit in Abwesen-

009845/1073

hext von Esterase eine umgekehrte Funktion der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen 2,4-Dinitrophenyl-ßalaninmenge war. Die vorliegende Erfindung liefert damit ein Prüfmittel und "Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von Liganden, wie Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl in einem flüssigen Medium mit Hilfe eines Konkurrenz-Bindungs-Fluoreszens-Verf ahrens, wobei der Bindungspartner, nachdem er an den Liganden in dem Konjugat gebunden ist, an der Nachweisreaktion teilnimmt. '

Be i s ρ i e 1 16>

Herstellung von Gortisol-Umbelliferon-Konjugat. Cortisol-21-hemisuccinat-linbellif er on.

A. Cortisol-21-hemmisuccinat

0,5 g Bernsteinsäureanhydrid wurden zu einer Lösung von 0,5 g Cortisol in 10 ml trockenem Pyridin gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 100 ml Wasser zugegeben und das Gemisch mit 100 ml Äthylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit Wasser gewaschen und mit 100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit iO%iger Salzsäure auf einen pH-Wert von 4- angesäuert. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert, getrocknet und aus einem Hexan-Aceton-Gemisch umkristallisiert. Man erhielt das gewünschte Zwischenprodukt (£p. 171 bis 172 0).

B. Cortisol-Umbelliferon-Konjugat

50 mg Carbodiimid wurden zu einer Lösung von 100 mg

des Zwischenproduktes entsprechend Teil A dieses Beispiels

609845/1073

in 3 ml trockenem Dimethylformamid gegeben und 30 min gerührt. Eine Lösung von 5>0 mg 7-Hydroxycumarin in 2 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch über Wacht bei Raumtemperatur gerührt. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen. Zu dem JFiltrat wurde Wasser zugegeben und das Gemisch mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit Wasser gewaschen,abgetrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus einem Aceton-Hexan-Gemisch umkristallisiert. Man erhielt das gewünschte Konjugat (ip. 126 C).

Beispiel 1£

Spezifische Bindungsbestimmung für Cortisol unter Verwendung eines Enzymsubstrats (modifiziertes Umbelliferon) als Markierungssubstanz.

Das spezifische Bindungsbestimmungssystem dieses Beispiels beruhte auf der folgenden Gleichung:

Cortisol-Umbelliferon- > Umbelliferon

Konjugat H₂UpM ö^

Es wurden acht spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 2 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 8,5i und Cortisol in den in Tabelle XIV angegebenen Konzentrationen. Zu sieben der acht Reaktionsgemische, bezeichnet mit den Nr. 2 bis 8 in Tabelle XIV, wurde eine Menge an Antiserum gegen Cortiscl zugegeben, die ausreichte, um die Geschwindigkeit

609845/1073

der esterasekatalysierten Reaktion in dem anderen Reaktionsgemisch, d.h. Hr. 1, um 70 °/° zu hemmen, lach dem Vermischen wurden 20 ,ul . 2/Um. Cortisol-Umbelliferon-Konjugat (entsprechend Beispiel 16) in 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 8,5, zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben..Nach erneutem Vermischen wurden 15/Ul Schweineesterase (0,81 Einheiten pro ml) zu jedem Reaktionsgemisch ' gegeben. Die entstehende Reaktionsgeschwindigkeit wurde in jedem Reaktionsgemisch ähnlich wie in·Beispiel 13 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle-XIV angegeben.

TABELLE XIV

Reaktions-	Cortisol kon	Reaktionsge
gemisch ·	zentrat ion (nm)	schwindigkeit
1 ·	0	0,0838
2	0	0,0256
3	2,5	0,0296
4	10	Q,0306
5	20	0,0381
6	30	0,0408
7	50	0,0654
8	100	0,0603

In diesem Beispiel wurde gezeigt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit eine direkte Funktion war der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Cortisolmenge. Die vorliegende Erfindung liefert damit ein Prüfmittel und ·

6b-9845/107

261851T

Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von Cortisol in einem flüssigen Medium mit Hilfe einer Eonkurrenz-Bindungs-Fluoreszens-BeStimmung,

Beispiel 18

Herstellung von 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (6-Derivat).

U -/~2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl 7-adenosin-5'-triphosphat.

A.' Ii -(2-Aminoäthyl)-adenosin-5'-monophosphat.

2 g (7 mMol)6-Chlorpurin-ribosid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) wurden mit 1? ml Triäthylphosphat gerührt und mit Phosphorylchlorid in Gegenwart von Wasser umgesetzt (Chem. Scrip., 19, 165 "bis 170 (1972) ) Nach Hydrolyse des Phosphodichloridats wurden 9₅5 ml Äthylendiamin (14OmIVbI) zugegeben und 3 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser auf 4 1 verdünnt und mit Natriumhydroxid auf einen pH-V/ert von 12 gebracht. Diese Lösung wurde durch eine 5 x 30 cm-Säule von Dowex 1x8 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien) in Acetatform geleitet. Dann wurde die Säule mit 3 1 0,01 m Ammoniumchloridlösung gewaschen und das Chromatogramm mit einem linearen Gradienten,gebildet durch 3 1 Wasser und

3 1 1m Essigsäure, entwickelt. Eine isolierte Spitze eines UV-absorbierenden Materials, die zwischen 1800 und 2050 ml mit dem Gradienten eluiert worden war, wurde auf ungefähr 25 ml unter Vakuum eingedampft. Während diese Lösung über Nacht bei 7°C stand, bildeten sich weiße Kristalle, die gesammelt und getrocknet wurden. Man erhielt das Produkt in 65%iger Ausbeute.

609845/1073

Eine Probe wurde aus heißem Wasser zur Analyse umkristallisiert.

Analyse: . C H N

Berechnet für	33	,8	5	,45	19	,7
C12H19N6O7P.2H2O:	34	,3	5	,22	19	,7
Gefunden:

Getrennte Dunnschichtchromatogramme, die mit zwei Lösungsmittelsystemen entwickelt wurden, wobei das erste aus vier Teilen 0,5 m Ammoniumacetat zu einem Teil Äthanol und das zweite aus drei Teilen Isobuttersäure zu 5 Teilen 1m Ammoniumhydroxid bestand, zeigten jeweils eine Komponente, die die iTuoreszens auslöschte und mit JYinhydrin reagierte. Die Verbindung in 0,1 η Salzsäure besaß ein Absorptionsmaximum bei 264 nm und der millimolare Extinktionskoeffizient war 17,7 vmä. die spektralen Eigenschaften charakteristisch für N -alkylierte. Adenosinderivate.

B. N -/~2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl_7-adenosin~5'-monophosphat

250 mg N -(2-Aminoäthyl)adenosin-5'-monophosphat (0,65 mm)., entsprechend Teil A dieses Beispiels, wurden in 20 ml Wasser bei einem pH-Wert von 8 gelöst. Dann wurden 168 mg Natriumbicarbonat zugegeben und anschließend 0,2 ml 1-£Tuor-2,4-dinitrobenzol (1,58 mMol) in 2 ml Äthanol). Das Reaktionsgemisch wurde in der Dunkelheit bei Raumtemperatur 4 h gerührt und dann weitere 0,1 ml 1-J¹IuOr-2,4-dinitrobenzol in 1 ml Äthanol zugegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt worden war, wurde es mit Salzsäure auf

9845/1073

einen ΛΟβ

pH-Wert von 2,0 gebracht und in 200 ml Äthanol

gegossen. Der entstehende Niederschlag wurde in 200 ml V/asser gelöst und diese Lösung mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8 gebracht und über eine 2,5 x 30 cm-Säule von DEAE-Cellulose in Bicarbonatform (Reeve Angel, Clifton, New Jersey) chromatographiert. Das Chromatogramm wurde mit einem linearen Gradienten entwickelt, der gebildet worden war durch 1,5 1 Wasser und 1,5 1 0,7 m Ammoniumbicarbonat. Eine Hauptspitze einer gelben Substanz, die das UV-Licht absorbierte, wurde zwischen 1200 und 1500 ml des Gradienten eluiert. Ammoniumbicarbonat wurde durch wiederholtes Eindampfen zur Trockene entfernt, wobei man das gewünschte Produkt in 40%iger Ausbeute erhielt. Dieses Produkt wanderte als einzelner gelber Punkt in Dünnschichtchromatogrammen, die entwickelt wurden mit den beiden in Teil A erwähnten Lösungsmitteln und auf einem Epichlorhydrintriäthanolamin-Anionenaustauscher-Papier, das entwickelt wurde mit 0,25 m Natriumacetat-Essigsäure-Puffer, pH 5jO· In 0,02 η Salzsäure besaß· das Produkt optische Absorptionsmaxima bei 264 mn und 363 nm mit millimolaren Extinktionskoeffizienten von 21,8 bzw. 14,2.

G. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-E:onjugat

N -/~2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl_7adenosin-5'-monophpsphat (entsprechend Teil B dieses Beispiels) (0,JmIYbI) wurde durch Chromatographie über eine 1,5 x 20 cm-Säule mit Dowex 50 χ 2 in Pyridinform (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien) in das Pyridinsalz umgewandelt. Die gelbe auslaufende Flüssigkeit wurde

6Ό9845/1073

zur Trockene eingedampft und 15 ml Dimethylformamid und 0, JmMoI Tri-n-butylamin zugegeben. Das Gemisch, wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand weiter durch wiederholtes Eindampfen getrocknet. Das als-Zwischenprodukt auftretende Monopho sphat wurde dann nach dsm in J.Amer. Chem. Soc, 87, 1785 bis 1788 (1965) angegebenen Verfahren in das Triphosphat umgewandelt. Die Reaktionsprodukte, die in Dimethylformamid löslich waren, wurden zu 250 ml Wasser zugegeben, das auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt wurde. Diese lösung wurde durch eine 2^5 x 58 cm-Säule von DEAE-Cellulose in der Bicarbonatform geleitet und das Ghromatogramm mit einem linearen Gradienten entwickelt, der gebildet worden war mit 3 1 Wasser und 3 1 0,5 m Ammoniumcarbonat. Die, zuerst eluierte Spitze eines gelben Materials wurde als das Diphosphatderivat identifiziert. Eine zxireite Spitze eines gelben Materials, die zwischen 4,15 und 4,4 1 des Gradienten eluiert wurde, wurde zur Trockene eingedampft, wobei man das gewünschte Eonjugat in 20%iger Ausbeute erhielt, bei dem es .sich durch die Analyse zeigte, daß es 3,0 Phosphatreste pro Riboserest enthielt. ·

Beispiel 12.

Herstellung von 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (8-Derivat).

8-/~2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl 7aminoadeno sin-5'-triphosphat.

A. 8-(2-Aminoäthyl)aminoadeno sin-5'-monopho sphat.

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 2,2mM3l8-Bromadenosin 5'-monophosphat (hergestellt entsprechend Arch.Biochem. Biophys. 163, 561 bis 569 (1974)), 66mMol Äthyl endxamin und 25 ml Wasser wurde in einem Ölbad 2 h auf 140⁰C er-

609845/1073

/fö?

wärmt. Das abgekühlte Gemisch wurde mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 11,5 gebracht und auf eine 2,5 x 55 cm-Säule von Dowex 1x8 (0,037 bis 0,074 mm, * Bicarbonatform) gegeben. Die Säule wurde mit JOO ml Wasser gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten, der gebildet worden war aus 3 1 Wasser und 3 1 0,5 m Ammoniumbicarbonatlösung. Die Absorption der auslaufenden Flüssigkeit bei 254· mn wurde überwacht und eine Hauptspitze eines absorbierenden Materials wurde zwischen 4,6 und 5,8 1 des. Gradienten eluiert.

Das Ammoniumbicarbonat wurde durch wiederholtes Eindampfen (5 x je 20 bis 30 ml Wasser) zur Trockene unter Vakuum entfernt und der verbleibende Rückstand in 20 ml Wasser unter Zugabe von Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 8,0 gelöst. Die Lösung wurde filtriert, auf einen pH-Wert von 5*0 mit Ameisensäure eingestellt und 1 Tag bei 5°0 stehengelassen. Die entstehenden Kristalle wurden gesammelt,bei einem pH-Wert von 8,0 gelöst und erneut bei einem pH-Wert von 5,0 auskristallisiert. Die Ausbeute an dem gewünschten Zwischenprodukt betrug 27 >. Bei untersuchung durch Dünnschichtchromatographie in einem Lösungsmittel, bestehend aus 4- Teilen 0,5 m Ammoniumacetat zu 1 Teil Äthanol

ein
wanderte das Produkt als ninhydrinpositiver. "Punkt, der die Fluoreszens auslöschte. Das optische Absorptionsmaximum in 0,02 η Salzsäure lag bei 275 um und der millimolare Extinktionskoeffizient betrug 17,5· Diese spektralen Eigenschaften sind charakteristisch für alkylierte 8-Aminoadenosinderivate.

Analyse: . __C H N

Berechnet für C₁₂H₂₀N₇O₇P₁H₂O: 34-,O 5,33 23,2 Gefunden: 34,1 5,28 23,9

^e>09845/1073

B. 8-/ 2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl_7aminoadenosin--5'-monophosphat

8-(2-Aminoäthyl)aminoadenosin-5'-inonophosphat aus Teil A dieses Beispiels (0,64 mm) wurde in 20 ml Wasser unter Zugabe von Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8,0 gelöst. Dann xvurden 168 mg Natriumbicarbonat zugegeben und anschließend 0,2 ml 1-Fluor-4-dinitrobenzol (1,58 mMol in 2 ml Äthanol). Das Reaktionsgemisch wurde 18 h bei Raumtemperatur gerührt und dann 0,1 ml 1-i^lluor-2,4-dinitrobenzol in 1 ml Äthanol zugegeben. Nach weiterem 4stündigem Rühren wurde das Gemisch mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 gebracht und in 200 ml kaltes Aceton (-10⁰C) gegeben. Der entstehende gelbe Niederschlag wurde abfiltriert, in 200 ml Wasser gelöst und durch eine 2,5 x 4-5 cm-Säule mit DEAE-Cellulose in der Bicarbonatform geleitet. Das Chromatogramm wurde entwickelt mit einem linearen SaIζgradienten, der gebildet worden war durch 2 1 Wasser und 2 10,7m Ammoniumcarbonat. Eine Spitze eines gelben Materials mit einem Absorptionsmaximum von 275 mn wurde zwischen 2 und 3 1 des Gradienten eluiert. Das Ammoniumbicarbonat wurde von diesem Produkt unter Eindampfen unter Vakuum entfernt. Man erhielt das gewünschte Zwischenprodukt in einer Ausbeute von 37 '/<>· Die optischen Absorptionsmaxima in 0,02 η Salzsäure traten bei 275 und 363 nm auf und die millimolaren Extinktionskoeffizienten xiraren 21,8 bzw. 15,5· Die weitere Analyse zeigte 1,07 Phosphatreste pro Riboserest.

C. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat

Das Monophosphat-Zwischenprodukt (0,5mlYbl) wurde in das Tri-n-butylammoniumsalz umgewandelt durch Zugabe von

6^09845/107

Ο,δπΜοΙ Tri-n-butylamin. Das Gemisch, wurde durch wiederholtes Eindampfen aus. trockenem Dimethylformamid (4- χ je 10 bis 15 ml) getrocknet. Der entstehende Rückstand wurde in 1 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,OmMd. Carbonyldiimidazol ebenfalls in 1 ml . Dimethylformamid vermischt und 4 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Das überschüssige Carbonyldiimidazol wurde durch Umsetzung mit 15/ul Methanol innerhalb von 30 min zerstört. Schließlich wurden SdVIoI Tri-n-butylammoniumpyrophosphat in 4.ml Dimethylformamid zugegeben und das Gemisch 20 h umgesetzt. Der entstehende Feststoff wurde abzentrifugiert und 2 χ mit'je 5 ml Dimethylformamid gewaschen. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten wurden zu 200 ml Wasser gegeben, das dann auf einen pH-Wert von 8 gebracht und über eine 2,5 x 25 cm-Säule von DEAE-Cellulose in Bicarbonatform chromatographiert wurde. Das Chromatogramm wurde entwickelt mit einem linearen Gradienten, der gebildet worden war mit 2 1 Wasser und 2 10,5m Ammoniumbicarbonat. Eine Spitze eines gelben Materials mit Absorptionsmaxima bei 275 und 363 nm wurde zxvischen 2,0 und 2,9 1 des Gradienten eluiert. Das Ammoniumbicarbonat würde durch Eindampfen entfernt, wobei man das gewünschte Konjugat in einer Ausbeute von 22 % erhielt. Die Ergebnisse der Analyse zeigten, daß dieses Produkt 3,2 Phosphatreste pro Riboserest enthielt.

Beispiel 20

Herstellung von 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (endständiges Phosphatderivat).

p"¹ [ 2-/~N- (2,4-Dinitrophenyl) amino/- äthyl] P- (5 * -adeno sin)-tetraphosphat.

βίο 984 5 /1073

/M

A. 2-/~N-(2,4-Dinitrophenyl)amino_7äthylphosphat

Eine Lösung, enthaltend 2OmMjL Äthanolaminphosphat, 0,4- Mol Natriumbicarbonat und 0,2 g BenzyltriäthylammoniumChlorid in 20 ml.Wasser wurde gerührt, während 20mMol1-Eluor-2,4-dinitrobenzol zugetropft wurden. Das entstehende zweiphasige Gemisch wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 600 ml Äthanol zugegeben, wobei über Macht bei O⁰C ein gelber Feststoff entstand. Dieser Feststoff wurde in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 3 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,5■gebracht. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und bei O⁰G mit 200 ml wasserfreiem Äthanol verrieben. Der feste Rückstand wurde bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet. Man erhielt 4- g eines gelben Produktes (65 % der Theorie). Dieses Material schmolz bei 200 bis 202°C und wanderte als einzelner gelber Punkt in Dünnschichtchromatogrammen, die entwickelt worden waren mit einem Lösungsmittel, bestehend aus 7 Teilen Äthanol zu 3 Teilen Triäthylammoniumbicarbonat (pH 7?5)· Das optische Absorptionsspektrum in 0,02 η Salzsäure besaß Maxima bei 359 und· 264 mn und die millimolaren Extinktionskoeffizienten wären 17iO bzw. 9?2. Das lleutralisationsäquivalent betrug 325 und entsprach dem für das Monohydrat berechneten Wert.

Analyse: C H N

Berechnet für OgH₁^₅OgP. H₃O: 29,55 3,72 12,92

Gefunden: 29,38 2,94 12,81

B. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat

Das in Teil A dieses Beispiels hergestellte Zwischenprodukt

6 0984 5/107 3

/a

wurde mit Diphenylphosphorchloridat nach dem in Eur.J.Biochem. 28, 492 bis 496 (1972) angegebenen Verfahren umgesetzt, um das aktivierte Pyrophosphat zu erhalten, das mit ATP umgesetzt wurde. 1 g 2-/~N-(2,4-Dinitrophenol)amino_7äthylphosphat (3,25 mMol) wurde in das Pyridiniumsalz umgewandelt durch Chromatographie über eine 2,5 x 25 cm-Säule mit Dowex 50 x 2 in der Pyridiniumform. Die gelbe ausfließende Flüssigkeit wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 50 ml Methanol suspendiert, zu dem 1,4 ml Tri-noctylamin (3,25mIVfol) zugegeben worden waren. Das Gemisch wurde gerührt, bis der Feststoff gelöst war und dann das Methanol unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Pyridin (20 bis 25 ml) aufgenommen und zur Trockene eingedampft (zweimal wiederholt). Dann wurde der Rückstand in 30 ml getrocknetem Dimethylformamid gelöst und zur Trockene eingedampft (dreimal wiederholt). Der getrocknete Rückstand wurde in 30 ml Dimethylformamid gelöst und 0,97 ml Diphenylphosphorchloridat (4,9 mMol) zugegeben und anschließend 1,6 ml Tri-n-butylamin (3125mMol).Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit 70 ml trockenem Diathyläther 2 min geschüttelt und dann 15Ο ml Petroläther zugegeben. Nach 1 h xirurde die überstehende gelbe Flüssigkeit abdekantiert, wobei ein gelbes Öl zurückblieb, das in, 30 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und zur Trockene eingedampft wurde. Das verbleibende Öl wurde in 100 ml Pyridin/Dimethylformamid (1:1 Vol/Vol) gelöst und die Hälfte dieser Lösung mit dem Tri-n-octylammoniumsalz von ATP umgesetzt.

0,7nMolATP wurden in das Pyridiniumsalz umgewandelt,

das durch Chromatographie über eine 2,5 x 25 cm-ßäule von

βίο 9845/1073

Dowex 50 x 2 in der Pyridiniumform. Die wäßrige Lösung dieses Salzes wurde zur Trockene eingedampft und 15 ml Methanol und 1,4 ml Tri-n-octylamin (1,4mMol) zugesetzt. Das Gemisch, wurde gerührt, bis das ATP gelöst war und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch wiederholtes Eindampfen von Pyridin und dann trockenes Dimethylformamid getrocknet. Schließlich wurde der ölige Rückstand mit dem aktivierten 2-/""N- (2,4-Dinitrophenyl)amino_7äthylphosphat zusammengegeben und das Reaktionsgemisch über Wacht bei Raumtemperaturgerührt. Dann wurde das Lösungsmittel durch Eindampfen unter Vakuum entfernt und der Rückstand mit 100 ml Wasser 1 h gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung bei 6,5 his 7?5 Sehalten wurde. Das lösliche Material wurde auf eine 3 x 45 cm-Säule von Sephadex A-50 (DEAE) in Bicarbonatform (Pharmacia i'ine Chemicals, Piscataway, New Hersey) aufgebracht. Das Chromatogramm wurde mit einem linearen Gradienten entwickelt, der gebildet worden war aus jeweils 2 1 0,1 m und 0,5 m Ammoniumcarbonat lösung. Das zwischen 0,18 und 0,26 m Ammoniumcarbonat eluierte Material wurde unter Vakuum eingedampft und das Ammoniumcarbonat durch wiederholtes Eindampfen zur Trockene aus Wasser entfernt. Eine weitere Reinigung wurde durchgeführt durch Dickschichtchromatographie auf Silicagel mit einem Lösungsmittel, bestehend aus 7 Teilen Äthanol zu 3 Teilen 1 m Triäthylammoniumcarbonat (pH 7_?5)· Es trennten sich zwei gelbe Hauptbanden, die Jeweils von der Platte abgekratzt wurden. Das Silicagel wurde 1 h mit Methanol/Wasser (1:1 Vol./Vol.) gerührt und der lösliche Anteil jeder Bande getrennt auf eine 2,5 x 20 cm-Säule mit DEAE-Cellulose in Bicarbonatform gegeben. Die Säulen wurden mit Wasser und anschliessend 0,5 m Ammoniumcarbonatlösung gewaschen. Die durch das Salz eluierten gelben Substanzen wurden unter Vakuum zur

09 84 5/1073

Trockene eingedampft. Die Verbindung, die auf dem Silicagel schneller lief, wurde identifiziert als nichtumgesetztes 2-/~N-(2,4-Dinitrophenyl)amino 7äthylph.osphat.

Die zweite Bande,R~ = 0,64,von der SiJjcagelplatte, besaß optische Absorptionsmaxima bei 257 und- 259 nm und millimolare Extinktionskoeffizienten einer Lösung in 0,02 η Salzsäure von 21,1 bzw. 16,2. Dieses Produkt, das gewünschte Konjugat, enthielt 4,3 Phosphatreste pro ßiboserest.

Beispiel 21_

Direkte Bindungs-Biolumineszens-Bestimmung für Antikörper gegen 2,4-Dinitrophenyl; Anwendung von ATP als Markierungssubstanz.

Das in diesem Beispiel angewandte Biolumineszens-Eeaktionssystem beruhte auf der folgenden Gleichung:

ATP-Ligand — ^ _{ATP +} modifizierter Ligand

ATP + reduziertes Luciferin —> AMP + oxidiertes Luciferin +

Eine lichtentv/ickelnde Lösung wurde hergestellt, enthaltend 10 mm Morpholinopropansulfonat-Puffer, pH 7,4-, 10 mm Magnesiumsulfat, 0,7 mm Luciferin und 0,15 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin.

Es wurden neun spezifische Bindungsreaktionssysteme hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 10 /Ul und jeweils enthaltend 20 mm Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrοchlorid-Puffer, pH 7,4, 10 mm Athylendiamin-

9 8 4 5 / 1 0 7 3

tetraessigsäure, 45 mm 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (endständiges Phosphatderivat entsprechend Beispiel 20) und Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl in den in Tabelle XV angegebenen Mengen. Nach 1,5 h langer Inkubation bei 25°C wurden jeweils 10/Ul Anteile jedes Reaktionsgemisches im Doppelreihenversuch untersucht durch Einspritzen in ein Volumen von 0,1 ml der oben angegebenen lichterzeugenden Lösung, die vorher mindestens 2 min bei 25°G inkubiert worden war und in einem Reagensglas enthalten war, das in einem Dupont Model 760 Bioluminescence Photometer (E.I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware) angeordnet war.

Die Spitzenlichtintensität wurde von dem Photometer abgelesen. Die mittlere Spitzenlichtintensitat für jedes Reaktionsgemisch wurde berehnnet sowie die relative Intensität (IOO % mal dem Verhältnis der mittleren Spitzenintensität für die Probe zu derjenigen in Abwesenheit von Antiserum). Die Ergebnisse sind in Tabelle XV und in graphischer Form in IPig. 9 der Zeichnungen angegeben.

TABELLE XV

Reaktions gemisch	Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl (/Ul)	mittl. Spitzen- lichtintensität	relative Intensität (%)
1	0	373	100
2	0,2	351	94
3	0,4 .	324	85
4	0,8	254	68
. 5	1,0	211	57
6	2,0	91	24
7	4,0	40	.11
8	6,8	40	.11
9	8,0	37	10

είθ 9845/1073

In diesem Beispiel konnte gezeigt werden, daß die Aktivität des ATP in dem 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat, bezogen auf das Biolumineszens-Reaktionssystem eine umgekehrte Funktion war zu der Antiserummenge gegen 2,4-Dinitrophenyl, die in dem Reaktionsgemisch vorhanden war. Me Erfindung liefert damit ein Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung des Liganden₍ Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl,in einem flüssigen Medium mit Hilfe eines direkten Bindungs-Biolumineszens-Bestimmungsverfahren.

Be'isp.iel 22

Konkurrenz-Biolumineszens-Bestimmung von Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl; Verwendung von ATP als Markierungssubstanz.

Das Biolumineszens-Reaktionssystem des Beispiels war das in Beispiel 21 "beschriebene.

Es wurden 13 spezifische Bindungs-Reaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 100 ,ul und jeweils enthaltend 20 mm Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, 10 mm Äthylendiamin tetraessigsäure, 45 mm 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (endständiges Phosphatderivat entsprechend Beispiel 20) und 2, 4<-Dinitrophenyl-B-alanin in den in Tabelle XVI angegebenen Konzentrationen. Zu 1.2 der 13 Reaktionsgemische, d.h. den Kümmern 2 bis 13 cLer Tabelle, wurde eine Menge Antiserum gegen 2,4-Dinitro-phenyl zugesetzt, die ausreichte, um die Spitzenlichtintensität, die durch

reaktion
die Biolumines ζ ens' in dem anderen Reaktionsgemisch

(d.h. Nr. 1) erzeugt wurde, um 75 Yo herabzusetzen. Nach 2 h langem Inkubieren bei 25°C wurden jeweils 10/Ul Anteile jedes Reaktionsgemisches im Doppelversuch ent-

·*- Bindungs -

61/9 845/1073

sprechend Beispiel 21 untersucht und die mittlere Lichtintensität und die relative Intensität für jedes Gemisch berechnet.. Die Ergebnisse sind in Tabelle XVI und in
graphischer Form in Pig. 10 der Zeichnungen angegeben.

TABELLE XVI

Eeaktions- 2,4-Dinitrophenyl- mittl. Spitzen- relative gemisch ß-alanin-Konzentra- lichtintensität Intensität tion (/Um) (%)

1 0,00 377 100

2 0,00 89 24

3 0,01 97 26

4 0,04 130 · 35

5 0,06 143 38

6 0,10 170 45

7 0,20 210 56

8 ' 0,30 257 68

9 0,60 314 83

10 0,80 334 89

11 1,0 344 91

12 2,0 363 96

13 4,0 385 102

In diesem Beispiel wurde gezeigt, daß die relative Intensität des entstehenden Lichts eine direkte Funktion ist der in dem Eeaktxonsgemisch vorhandenen 2,4-Dinitrophenyl-ßalaninmenge. Die Erfindung stellt daher ein Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung von Liganden, wie Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl_f in einem flüssigen Medium dar mit Hilfe einer Konkurrenz-Bindungs-Lumineszens-Bestimmung dar.

Beispiel 2J5

Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszens-BeStimmung von Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl; Anwendung von ATP als Markierungs sub stanz.

Das in diesem Beispiel angewandte Biolumineszens-Reaktionssystem "beruhte auf der folgenden Gleichung:

ATP-Ligand + reduziertes Luciferin —

AIlP-Ligand + oxidiertes Luciferin + IrU

A. Bestimmung mit Hilfe eines 6-Derivates von ATP

Es wurden drei spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 100yul und jeweils enthaltend 20 mm Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7 »4, 10,0 mm Äthylendiamintetraessigsäure, 20 /ul Antiserum zu 2,4-Dinitrophenyl, 512 nm 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (6-Derivat ent- sprechend Beispiel 18) und 2,4—Dinitrophenyl-ß-alanin in den in Tabelle XVII angegebenen Konzentrationen. Nach 2 h langer Inkubation bei 25°G wurden 10 /ul Anteile jedes Reaktionsgemisches im Hoppelversuch entsprechend Beispiel 21 untersucht und die mittlere ßpitzenlichtintensität für jedes Gemisch berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XVII angegeben.

TABELLE XVII

Reaktions- 2,4-Dinitrophenyl- mittl. Spitzengemisch ß-alanin-Konzentration lichtintensität

(/um)

10 7

2 25 14

3 2500 185

6^0 9845/1073

B. Bestimmung mit Hilfe eines 8-Derivats von ATP.

Es wurden vier spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils ^mi"t einem Gesamtvolumen von 100 /ul und jeweils enthaltend 20 min. Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, 10 mm Äthylendiamintetraessigsäure, 20 /ul Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl, 594 nm 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (8-Derivat entsprechend Beispiel 19) und 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin in den in Tabelle XVIII angegebenen Konzentrationen. Nach 2 h langer Inkubation bei 25°C wurden jeweils 10/Ul Anteile jedes Reaktionsgemisches entsprechend Beispiel 21 in Doppelversuchen untersucht und die mittlere Spitzenlichtintensität für jedes Gemisch berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XVIII angegeben.

TABELLE XVIII

Reaktions- 2,4-Dinitrophenyl- mittl. Spitzenlichtgemisch ß-alanin-Konzentra- intensität tion (/um)

1 0 · 18

2 25 51

3 250 191

4 25OO . 190

Die Ergebnisse dieses Beispiels und diejenigen des Beispiels 22 zeigen, daß die Markierungssubstanz ATP an verschiedenen Stellen ihrer Struktur substituiert sein kann, um als Konjugat für die spezifische Bindungsbestimmung nach der Erfindung geeignet zu sein.

Beispiel 24

Herstellung von Biotin-Isoluminol-Konjugat

6-(3-Biotinoylamido-2-hydroxypropylamin)-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion.

A. 4- (3-Chlor-2-hydroxypropylamino)-I\i-methylphthalimid.

25 g (0,142 Mol) 4-Amino-N-methylphthalamid (J.Ohem.Soc.

26 (I937).)und 20,7 g (0,21 Mol) 1-Chlor-2,3-epoxypropan wurden zu 150 ml 2,2,2-Trifluoräthanol gegeben und das Reaktionsgemisch unter 'Rühren 48 h auf Rückflußtemperatur erhitzt. 70 bis 80 ml 2,2,2-Trifluoräthanol wurden abdestilliert und es entstand ein schwerer gelber Niederschlag, wenn die verbleibende Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Dieser Niederschlag wurde mit Äthylacetat verrieben, abfiltriert und getrocknet. Man erhielt

29j5 S (77 %) des gewünschten Zwischenproduktes. Fp. 136 bis 138°C.

Analyse: C H N

Berechnet für O₁₂H₁₅ClN₂O₅: 53,64 4,88 10,45

Gefunden: 53,87 4,85 10,81

B. 4-/~3-(N-Phthalamido)-2-hydroxypropylamino 7-N-methylphthalimid

Das entsprechend Teil A hergestellte Zwischenprodukt (15,5 S, 0,05nMol)und 15,7 g (0,085mMi)Kaliuinphthalimid wurden unter Rühren in 150 ml Dimethylformamid 24 h auf Rückflußtemperatur erhitzt. Das Dimethylformamid wurde entfernt und der Rückstand mit Wasser gewaschen und filtriert. Der gelbe Filterkuchen wurde aus Essigsäure-Wasser umkristallisiert. Man erhielt 12,8 g (67 ^L/o) des Produktes. Fp. 247 bis 248,5°C

6^r0 9845/1073

Analyse: G H N

Berechnet für G₃₀H₁₇N₃O₅ : 63,32 4,52 11,08 Gefunden: 63,16 4,38 10,93

G. 6-/~3-Amino-2-hydroxypropylamino_7-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion

Das Zwischenprodukt aus Teil B (5,0 g, 13,2m]YfciL), 90 ml abs. Äthanol und 35 ml 95%iges Hydrazin wurden 4' h unter Rühren*erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der entstehende feststoff 24 h unter Vakuum bei 120⁰G getrocknet. Dieses Produkt wurde 1 h mit 70 ml 0,1 η Salzsäure gerührt; das unlösliche 2,3-Dihydroxyphthalazin-1,4-dion wurde abfiltriert und das Filtrat mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht. Der entstehende weiße Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 2,2 g des Produktes (67 %). Nach Umkristallisieren aus Wasser zersetzte sich die Verbindung bei 273°C.

Analyse·:· C H N

Berechnet für C₁₁H₁₄N₃O₃ : 52,79 5,64 22,39 Gefunden: 52,73 5,72 22,54-

D. Biotin-Isoluminol-Konjugat

Biotin (0,29 g, 1,2mM3l)und 0,17 ml Triäthylamin wurden in 20 ml trockenem Dimethylformamid unter wasserfreien Bedingungen gelöst und auf -1O°G gekühlt. Eine Lösung von 0,141 ml Äthylchlorformiat in 2,86 ml Äther wurde langsam zugegeben und das Reaktionsgemisch 30 min gerührt. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert. Eine Suspension, bestehend aus 600 mg (2,4njYfol) des Zwischen-

'*zum Rückfluß

6*0 9845/1073

Produkts aus Teil G, 20 ml trockenem Dimethylformamid lind 1ml trockenem Pyridin wurde schnell zu dem Filtrat zugegeben und das Gemisch 30 min bei -10⁰C und dann über Nacht bei Eaumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit trat Lösung ein. Das Dimethylformamid wurde bei 60°C und 0,1 mm Hg abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde mit 50 ml 0,1 η Salzsäure 1 h gerührt. Der entstehende weiße Niederschlag wurde abfiltriert, mit 0,1 η Salzsäure und dann mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen unter Vakuum bei Eaumtemperatur über Nacht erhielt man 0,55 S (97 %) des Produktes, ϊ'ρ. 1?0 bis 173°C. ·

HN

52	,92	5	,92	17	,64-
51	,69	5	,90	17	,63

Berechnet für
Gefunden:

Beispiel 2J?

Spezifisches Bindungs-Chemilumineszens-Bestimmungsverfahren; Wirkung von Avidin und Biotin auf die Aktivität eines Biotin-Isoluminol-Konjugats.

Das in diesem Beispiel angewandte Ghemilumineszens-Eeaktionssystem beruhte auf der folgenden Gleichung:

Biotin-Isoluminol + H₃O₃ ^

Biotin-Aminophthalat + N₂ + hv

Es wurden neun spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 140 /ul und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4 und Biotin, Biotin-Isoluminol-Konjugat (entsprechend Beispiel 24-) und Avidin

6 0 9845/1073

(zuletzt zugegeben) in den in Tabelle XIX angegebenen Konzentrationen. Mach 5 min langem Inkubieren bei 25°C wurden 10 Ail 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, enthaltend 20 Einheiten pro ml Lactoperoxidase (der Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri; bestimmt nach Methods in Enzymology XVIIA (1970), S. 655 - Assay 2) zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. Nach weiteren 2 min Inkubieren bei 25°C wurden 10/ul 0,95 mm Wasserstoffperoxid in 10 mm Tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, in jedes Reaktionsgemisch eingespritzt und die Spitzenlichtintensität, die in jedem Reaktionsgemisch erzeugt wurde, mit Hilfe eines Dupont Model 760 Bioluminescence Photometers (E.I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIX angegeben.

TABELLE XIX:

6 0 9845/1073

TABELLE XIX

Reaktionsgemisch Biotin-JXon- Biotin-Isoluminol- Avidin-Konzen- Spitzenlicht-

zentration Konjugat-Konzen- tration intensität

(/Um) tration (Einheiten/ml)
' (um)

1 0,8

2 . 0,14 0,9

g 3 84 1,9

*° 4 84 0,14 25,3

j> 5 4 0,8

cn .

-^ 6 4 84 2,2

ο 7 4 0,14 0,9

-* 8 · 4 84 0,14 6,1

9 1,3 84 0,14 10,4

Die Reaktionen 1, 2, 5 und 7 waren Vergleiche und zeigen, daß in Abwesenheit von Biotin-Isoluminol-Konjugat nur eine geringe Hintergrundlichtmenge gemessen wurde. Die Ergebnisse der Reaktionen 3 und 6 zeigen, daß das Biotin-Isoluminol-Korijugat aktiv war in der Chemilumineszens-Reaktion und daß das Vorhandensein von freiem Biotin keine wesentliche Wirkung auf diese Aktivität besaß. Das Ergebnis der Reaktion 4 zeigt, daß in Gegenwart von Avidin - einer biotinbindenden Substanz - die Aktivität des Biotin-Isoluminol-Konjugates zunahm. Dieses Ergebnis ist ziemlich unerwartet, da man annehmen müßte, daß eine Bindung von Avidin an das Konjugat die Verfügbarkeit der Isoluminolgruppe für die Chemilumineszens-Reaktion begrenzen würde. Der Grund für die beobachtete Verstärkung der Lichterzeugung ist noch nicht vollständig geklärt. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 4, 8 und 9 zeigt, daß die Verstärkung der Lichterzeugung verringert wird, umgekehrt zu der Menge an freiem vorhanden Biotin.

Dieses Beispiel zeigt, daß die Liganden Avidin und Biotin bestimmt werden können mit Hilfe spezifischer Bindungs-Ghemilumineszens-Bestimmungsverfahren und daß erfindungsgemäß die Wirkung einer Bindung zwischen der Markierungssubstanz in dem Konjugat und einem entsprechenden bindenden Partner verstärkend und nicht hemmend wirkt auf die Aktivität der Markierungssubstanz.

Beispiel 26,

Konkurrenz-Bindungs-Chemilumineszens-Bestimmung von Biotin; Wirkung verschiedener Gehalte an Biotin auf die Spitzenlichtintensität

Das in diesem Beispiel angewandte Chemilumineszens-

609845/107 3

reaktionssystem war das in Beispiel 25 beschriebene. Es wurden sechs spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 140/Ul und jeweils enthaltend 0,1 ι Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, 84 nm Biotinluminol-Konjugat (entsprechend Beispiel 24), Biotin in den in Tabelle XX angegebenen Konzentrationen und 0,035 Einheiten pro ml Avidin (zuletzt zugegeben). Nach 5 min Inkubieren bei 25°G wurden 10/Ul Lactoperoxidase (20 Einheiten pro ml) zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. Nach weiterem 20 min langem Inkubieren wurden 10/Ul 0,9!? mm Wasserstoffperoxid in 10 mm Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4-, in jedes Reaktionsgemisch eingespritzt und die Spitzenlichtintensitat, die in jedem Falle erzeugt wurde, entsprechend Beispiel gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle XX und in graphischer Form in Fig. 11 der' Zeichnungen angegeben.

	TABELLE	XX	Spitz enlicht intensi tat
Reaktions gemisch	Biotin- Konzentration (nm)	23,5
1	0	21,1
2	67	15,5
3	134-	12,6
4	200	12,3
5	268	8,1
6	400

Es konnte so gezeigt werden, daß die Stärke der Spitzenlichtintensität, die durch das Ghemilumineszens-Reaktions-

609845/1073

system gebildet wurde, eine umgekehrte Funktion war, der in dem spezifischen Bindungsreaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge. Die Erfindung liefert damit ein Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins des Liganden Biotin in einem flüssigen Medium mit Hilfe einer Konkurrenz-Bindungs-Chemilumineszens-BeStimmung.

Beispiel 27

Konkurrenz-Bindungs-Ghemilumineszens-Bestimmung für Biotin.

Das in diesem Beispiel angewandte Ohemilumineszens-Reaktionssystem beruhte auf folgender Gleichung:

Biotin-Isoluminol + KO- τ*

Biotin-Aminophthalat + N₂ + hv

Es wurden sechzehn spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 150/Ul und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid, pH 8,0, 42 nm Biotin-Luminol-Konjugat (entsprechend Beispiel 24), Biotin in den in Tabelle XXI angegebenen Konzentrationen und 0,12 Einheiten pro ml Avidin (zuletzt zugegeben). Nach 5 min langem Inkubieren bei 25°G wurden 10 /ul Dimethylformamid (enthaltend 0,15 m Kaliumperoxid) (KO2) (Alpha Products, Beverly, Massachusetts) und 0,10 m 1, 4,7,10,13,16-Hexaoxyacylcooctadecan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) in jedes Reaktionsgemisch eingespritzt und die Spitzenlichtintens'ität, die in jedem Falle erzeugt wurde,entsprechend Beispiel 25 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle XXI und in graphischer Form in Fig. 12 der Zeichnungen angegeben.

609845/1073

— IS?· —

	TABELLE	XXI
Reaktions	Biotin-Kon-	Spitz enlicht-
gemisch	zentration (mn)	intensität
1	0	38., 5
2	13	38,5
3	27	34,3
4	40	36,1
5	53	35,2
6	67	36,2
7	101	34,0
8	133	31,7
9	166	29,1
10	200	24,2
11	267	22,8
12	333	20,5
13	400	13,4
14	534	8,6
15	667	8,3
16	800	7,0

Es wurde gezeigt, daß die Stärke der Spitzenlichtintensität, die durch das Ghemilumineszens-Reaktionssystem erzeugt wurde, eine umgekehrte Funktion war der in dem spezifischen Bindungs-Reaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge. Die Erfindung liefert damit ein Prüfmittel und ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins des Liganden Biotin in einem flüssigen Medium mit Hilfe

-Bindungseiner Konkurrenz-Chemilumineszens-Bestimmung, bei der

keine enzymkatalysierte Nachweisreaktion angewandt wird.

PATENTANSPRÜCHE:

609845/1073

Claims (1)

1. \(ΐλ) Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet , daß. man

   (Ό das Medium zusammenbringt mit

   (a) einem Konjugat, umfassend eine Substanz, die eine "bestimmte Reaktionsfähigkeit als

   , Bestandteil eines vorbestimmten Reaktionssystems besitzt und die an eine spezifisch bindende Substanz gekuppelt ist, wobei die spezifisch bindende Substanz

   (i) der nachzuweisende Ligand,

   (ii) ein spezifisch bindendes Analoges zu

   diesem Liganden, oder

   (iii) ein spezifisch bindender Partner zu dem Liganden ist,

   (b) und, wenn die spezifisch bindende Substanz der Ligand oder das spezifisch bindende Analoge des Liganden ist, mit einem spezifisch bindenden Partner des Liganden und

   (2) die auftretende Änderung der Reaktionsfähigkeit als Indikator für das Vorhandensein des Liganden in dem flüssigen Medium bestimmt.

   (2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die zuerst genannte konjugierte Substanz ein Reagens in einer enzymatischen Reaktion ist.

   609845/1073

   (3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz ein Coenzym ist.

   (4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3₅ dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz ein Nucleotid-Coenzym ist.

   (5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet ., daß die konjugierte Substanz ein AdenosinphoJsphat, Nicotinamidadenindinucleotid oder eine reduzierte Form davon oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat oder eine reduzierte

   i'orm davon ist.

   (6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5? dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz Nicotinamidadenindinucleotid oder eine reduzierte Form davon ist.

   (7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz ein Reagens in einem lichterzeugenden Reaktionssystem ist.

   (8) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz Luminol, Isoluminol oder eine Modifikation davon ist.

   (9) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz ein Reagens in einem Reaktionssystem ist, bei dem ein Produkt entsteht, das Fluoreszenseigenschaften besitzt, die es von dem Konjugat unterscheiden.

   609845/1073

   (10) Verfahren nach Anspruch 9i dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz Uinbelliferon oder eine Modifikation oder ein Derivat davon oder Fluorescein oder eine Modifikation

   oder ein Derivat davon ist.

   (11) Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß die zuerst genannte konjugierte Substanz ein Molekulargewicht von weniger als 9 000, vorzugsweise weniger als 3 000 besitzt.

   (12) Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß man bei Bestimmung der Änderung der Reaktionsfähigkeit

   das Medium mit mindestens einer zweiten Substanz zusammenbringt, die mit der zuerst erxtfähnten konjugierten Substanz das vorher bestimmte Reaktionssystem ergibt und

   ein Charakteristikum des entstehenden Reaktionssystems mit demjenigen eines vorher bestimmten Reaktionssystems in einem flüssigen Medium, enthaltend bekannte Mengen des Liganden vergleicht.

   (13) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß man als Oharakteristikum die Reaktionsgeschwindigkeit heranzieht.

   Verfahren nach Anspruch 12 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß das vorbestimmte Reaktionssystem eine cyclische Reaktion umfaßt.

   (15) Verfahren nach Anspruch 14, dadurch g e k en η -

   6Ö98A5/1073

   zeichnet , daß die bei der cyclischen Reaktion cyclisierte (zurückgeführte) Substanz die zuerst erwähnte konjugierte Substanz ist.

   (16) Verfahren nach Anspruch 14- oder 15, dadurch gekennzeichnet , daß die cyclische Reaktion eine exponentielle cyclische Reaktion

   (17) Verfahren nach Anspruch 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet , daß das vorher bestimmte· Reaktions syst ein eine Lumineszensreaktion umfaßt.

   (18) Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß das Charakteristikum die Gesamtmenge, die Spitzenintensität oder die Art des entstehenden Lichtes ist.

   (19) Verfahren nach Anspruch 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz ein Enzymsubstrat ist und ein Produkt des vorher bestimmten Reaktionssystems I'luore sz ens eigenschaften besitzt, die von denjenigen des Konjugats unterscheidbar sind.

   (20) Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß das Charakteristikum die Geschwindigkeit der Fluoreszensbildung ist.

   (21) Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet , daß die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat der Ligand oder ein spezifisdi bindendes Analoges zu dem Liganden ist und der

   609845/1073

   spezifisch bindende Partner im wesentlichen gleichzeitig mit dem Konjugat und dem Medium zusammengebracht wird.

   (22) Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , daß der spezifisch bindende Partner mit dem Medium und dem Konjugat in einer geringeren Menge zusammengebracht wird, als sie imstande •ist, mit dem gesamten Liganden in dem Medium und dem gesamten Liganden oder dessen Analogen in konjugierter Form während der Zeit zu reagieren, die der spezifisch bindende Partner_;das Konjugat und das Medium vor der Stufe 2 in Berührung stehen.

   (23) Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet daß die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat ein spezifisch bindender Partner zu dem Liganden ist und mit dem Medium in einer Menge zusammengebracht wird, die größer ist als diejenige Menge, die imstande ist, den gesamten Liganden in dem Medium während der Zeit zu binden, die das Konjugat und das Medium vor der Stufe 2 in Berührung stehen.

   (24) Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet , daß die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat der Ligand oder ein spezifisch bindendes Analoges zu dem Liganden ist und der spezifisch bindende Partner mit dem Medium eine Zeit lang in Berührung gebracht wird vor dem Kontakt mit dem Jionjugat.

   (25) Verfahren nach Anspruch 24, dadurch g e k e η η -

   }
   609845/1073

   zeichnet , daß die Menge des spezifisch, bindenden Partners,die mit dem Medium in Berührung gebracht wird, größerist als diejenige, die imstande ist, den gesamten Liganden in dem Medium während der Zeit zu binden, die der spezifisch bindende Partner und das Medium in Berührung stehen vor dem Eontakt mit dem Konjugat und wobei die Menge des Liganden oder Analogen des Liganden in konjugierter Form größer ist als die Menge, die imstande ist, die verbleibende nicht gebundene Menge des spezifisch bindenden Partners während der Zeit zu binden, die das Medium und das Konjügat vor der,Stufe 2 miteinander in Berührung stehen.

   (26) Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet , daß die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat"der Ligand oder ein spezifisch bindendes Analoges zu dem Liganden ist und wobei das Konjugat mit dem spezifisch bindenden Partner in einer flüssigen Umgebung eine Zeit lang vor dem Kontakt mit dem Medium in Berührung steht.

   (27) Verfahren nach Anspruch 26, dadurch g e kennzeichnet , daß die Menge an Liganden oder dessen Analogen in konjugierter Form größer ist als die Menge, die imstande ist, die Menge des spezifisch bindenden Partners zu binden, die während der Zeit vorhanden ist, die das Konjugat und der spezifisch bindende Partner miteinander in Berührung stehen vor dem Kontakt mit dem Medium und wobei die Menge an Liganden oder dessen Analogen in konjugierter Form ^ie an den spezifisch bindenden Partner gebunden wird, größer ist als die Menge, die durch den gesamten Liganden in dem flüssigen Medium während der Zeit verdrängt werden kann, die der spezifisch bindende Partner und das Medium vor der Stufe 2 in Berührung stehen.

   609845/1073

   (28) Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet , daß die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat der Ligand oder ein spezifisch bindendes Analoges zu dem Liganden ist und wobei das Konjugat und der spezifisch bindende Partner in Form eines Komplexes vorliegen, wobei die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat und der spezifisch bindende Partner reversibel aneinander gebunden sind.

   (29) Verfahren nach Anspruch 28, dadurch g e k e η η - · zeichnet , daß die Menge des Liganden oder dessen Analogen in konjugierter Form größer ist als die Menge, die imstande ist, durch den gesamten Liganden in dem flüssigen Medium während der Zeit verdrängt zu werden, die der Komplex und das Medium vor der Stufe 2 miteinander in Berührung stehen.

   (30) Verfahren nach Anspruch 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet , daß der Ligand ein Antigen oder ein Antikörper dazu, ein Hapten'oder Antikörper dazu, ein Hormon, Vitamin, Metabolit, pharmakologisches Mittel oder Rezeptor dazu oder bindende Substanz ist.

   (31) Verfahren nach Anspruch 1 bis 30, dadurch g ekennzeichnet , daß das flüssige Medium eine biologische Flüssigkeit ist.

   (32) Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach

   Anspruch 1 ,bis 31, dadurch gekennzeichnet ,

   a)
   daß es aus einem Konjugat, umfassend eine Substanz,

   die eine bestimmte Reaktionsfähigkeit als Bestandteil eines vorher bestimmten Reaktionssystems besitzt und die an (i) den Liganden, (ii) ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder (iii) einen spezifisch binden-

   6098 4 5/1073

   den Partner des Liganden als spezifisch bindende Substanz gebunden ist und, wenn die spezifisch bindende Substanz der Ligand oder ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden ist, einem spezifisch bindenden Partner zu dem Liganden besteht und das, wenn es mit einem flüssigen Medium zusammengebracht wird, das den Liganden enthält, zu einer Änderung der Reaktionsfähigkeit der konjugierten Substanz in einem vorher bestimmten Reaktionssystem führt.

   (33) Mittel nach Anspruch 32, dadurch ge k e η η - ζ 'e i c .h η e t , daß es zusätzlich mindestens eine zweite Substanz enthält, die mit der zuerst erwähnten konjugierten Substanz die vorher bestimmte Reaktion ergibt.

   (34-) Mittel nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet , daß die zuerst erwähnte konjugierte Substanz Nicotinamidadenindinucleotid oder eine reduzierte Form davon ist und die zweite Substanz

   .Ά) (a) Lactaldehyd und Alkoholdehydrogenase;

   (b) oc-üetoglutai'at, eine Substanz, die imstande ist, bei Berührung mit dem flüssigen Medium Ammoniak freizusetzen _;und Glutaminsäuredehydrogenase;

   (c) Acetaldehyd und Alkoholdehydrogenase;

   (d) oc-Ketoglutarat, eine Substanz, die imstande ist, bei Berührung mit dem flüssigen Medium Kohlendioxid freizusetzen_;und Isocitronensäuredehydrogenase;

   (e) Dihydroxyacetonphosphat und oc-Glycerinphosphatdehydrogenäse: .

   (f) Pyruvat und Milchsäuredehydrogenase;

   609845/1073

   261851

   (g) 1", 3-Diphosphoglycerat und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase;und/oder

   (h) Oxalacetat und Apfelsäuredehydrogenase und

   (B) (a) Äthanol und Alkoholdehydrogenase;

   (b) Isocitrat und Isocitronensauredeliydrogenase;

   (c) L-Ot-Glycerinphosphat und oc-Glycerinphosphatdehydrogenase;

   (d) Lactat und Milchsäuredehydrogenase;

   ,(e) Glycerinaldehyd-3-phosphat, Phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase;

   (f) Propandiol und Alkoholdehydrogenase;

   (g) Malat und Apfelsäuredehydrogenase; und/oder (h) Glutamat und Glutaminsäuredehydrogenase,

   enthält.

   (35) Mittel nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet , daß die zuerst erwähnte konjugierte Substanz Mcotinamidadenindinucleotidphosphat oder eine reduzierte ϊοπη davon ist und die zweite Substanz:

   (A) (a) oxidiertes Glutathion und Glutathionreduktase;

   (b) p-Benzochinon und Chinonreduktase;

   (c) Hitrat und Nitratreduktase;

   (d) 6-Phosphogluconat und Glucose-6-phosphatdehydrogenäse; und/oder

   (e) oc-Ke to glut arat, eine Substanz, die imstande ist, bei Berührung mit dem flüssigen Medium Ammoniak freizusetzen.und Glutaminsäuredehydrogenase; und

   \
   6 0 9845/1073

   (B) (a) Glucose-6-phosphat und Glucose-6-phosphatd=hydrogena.se;

   (b) reduziertes Glutathion und Glutathionreduktase;

   (c) Hydrochinon und Chinonreduktase;

   (dj Nitrit und Nitratreduktase; und/oder (e) Glutamat und Glutamxnsäuredehydrοgenäse, enthält.

   (36) Hittel nach Anspruch 32 oder 33» dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz

   das Jiflavinmononucleotid oder eine reduzierte Form davon ist und die zuletzt genannte Substanz Nicotinamidadenindinucleotidphosphat," oxidiertes Cytochrom-C und Cytochrom-C-Reduktase umfaßt.

   (37) Mittel nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz Flavinadenindinucleotid oder eine reduzierte Form

   davon ist und die zweite Substanz D-Aminosäure und B-Aminosäureoxidase umfaßt.

   (38) Mittel nach Anspruch 32 oder 33» dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz eine a-Ketosäure ist und die zweite Substanz L-Aminosäureoxidase, Glutamat und Transaminase umfaßt.

   (39) Mittel nach Anspruch 32 oder 33» dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz Adenosindiphosphat oder Adenosintr!phosphat ist und die zweite Substanz Phosphoenolpyruvat, Pyruvatkinase und Adenosintriphosphatase umfaßt.

   (40) Mittel nach Anspruch 32 oder 33» dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz Coenzym A oder Succinyl-Coenzym A ist und die zweite Sub-

   }
   609845/1073

   stanz ά-Ketoglutarat, Nicotinamidadenindinucleotid, α-Ketoglutaratdehydrogenase, Phosphat, Guanosindiphosphat und Bernsteinsäurethiokinase umfaßt.

   (41) Mittel nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz oxidiertes oder reduziertes Glutathion ist und die zweite Substanz Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, Glutathionreduktase, Dehydroascorbatund Dehydroascorbatreduktase umfaßt.

   (42i) Mittel nach Anspruch 32 oder 33 > dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz Ascorbat oder Dehydroascorbat ist und die zweite Substanz Ascorbatoxidase, oxidiertes Glutathion und Dehydroascorbatreduktase umfaßt.

   (43) Mittel nach Anspruch 32 oder 33? dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz Guanosintriphosphat oder Guanosindiphosphat ist und

   die zweite Substanz Oxalacetat, Phosphoenolpyruvatkinase, Adenosintriphosphat und Wucleosiddiphosphatkinase umfaßt.

   (44) Mittel nach Anspruch 32 oder 33» dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz oxidiertes oder reduziertes Gytochrom C ist

   und die zweite Substanz Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, Cytochrom C-Eeduktase, Wasserstoffperoxid und Cytochrom C-Peroxiäase umfaßt.

   (45)- Mittel nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz oxidiertes oder reduziertes Perridoxin .ist und die zweite

   ι ■ ·

   609845/1073

   Substanz Wasserstoff, Hydrogenase, Nicotinamidadenindinucleotidphosphat und Pyridinnucleotidreduktase umfaßt.

   (46) Mittel nach Anspruch. 32 oder 33? dadurch gekennzeichnet , daß die konjugierte Substanz Adenosintriphosphat oder Adenosindiphosphat ist und

   die zweite Substanz Adenosinmonophosphat, Myokinase, Phosphoenolpyruvat und Pyruvatkinase umfaßt.

   (47) Mittel nach Anspruch 32 bis 46, dadurch gekennzeichnet , daß das Konj'ugat und, soweit vorhanden, der spezifisch bindende Partner wasserlöslich sind.

   (48) Mittel nach Anspruch 32 bis 47, dadurch gekennzeichnet , daß das Konjugat und, soweit vorhanden, der spezifisch bindende Partner in trockener Form vorliegen.

   (49) Mittel nach Anspruch 32 bis 48, dadurch gekennzeichnet , daß das Konjugat'in einen Träger eingebaut ist.

   (50) Mittel nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet , daß der Träger das flüssige Medium absorbiert.

   Mittel nach Anspruch 49 oder 50? dadurch gekennzeichnet , daß der bindende Partner ebenfalls in dem Träger enthalten ist.

   609845/1073