DE2618511C3 - Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium und Mittel zu dessen Durchführung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Der Wunsch nach bequemen zuverlässigen und nicht gefährlichen Mitteln zum Nachweis und zur Bestimmung geringer Konzentrationen von Substanzen in Flüssigkeiten ist selbstverständlich. Das trifft besonders

zu auf das Gebiet der klinischen Chemie, wo Bestandteile von Körperflüssigkeiten, die in so geringen Konzentrationen, wie 10-¹¹ m vorkommen von denen bekannt ist, daß sie pathologische Bedeutung besitzen. Die Schwierigkeit, so geringe Konzentrationen nachzuweisen und zu bestimmen, ist besonders deutlich auf dem Gebiet der klinischen Chemie, wo die Probengröße üblicherweise ziemlich begrenzt ist

Klassischerweise werden Substanzen in Flüssigkeiten nachgewiesen, aufgrund eines Reaktionsschemas,, bei ;o dem die nachzuweisende Substanz ein notwendiger Reaktionspartner ist Das Vorhandensein der unbekannten Substanz wird angezeigt durch das Auftreten eines Reaktionsproduktes oder das Verschwinden eines bekannten Reaktionspartners. In bestimmten Fällen kann ein solches Verfahren quantitativ sein, beruhend auf einer Messung entweder der Geschwindigkeit mit der das Produkt auftritt oder der Reaktionspartner verschwindet oder einer Messung der gesamten entstehenden Produktmenge oder des verbrauchten Reaktionspartners bei Erreichung des Gleichgewichtes. Jedes Reaktionssystem für Bestimmungen ist notwendigerweise entweder auf die Anwendung zum Nachweis nur einer kleinen Gruppe von Substanzen beschränkt oder es ist nicht spezifisch.

Die Suche nach Bestimmungssystemen, die hoch spezifisch sind aber auf den Nachweis und die Bestimmung eines weiten Bereiches von Substanzen anwendbar sind, hat zu den radioimmunologischen Bestimmungsverfahren geführt. Bei diesem System läßt man eine bekannte Menge einer radioaktiv markierten Form der zu bestimmenden bzw. nachzuweisenden Substanz mit der unbekannten Substanz um eine begrenzte Menge Bindungspartner zu der unbekannten Substanz in Konkurrenz treten. Bei den radioimmunologischen Bestimmungsverfahren ist es immer erforderlich, die gebundene Substanz, von dem nicht gebundenen Anteil abzutrennen. Während hierfür verschiedene Verfahren entwickelt worden sind (US-PS 35 05 019,

35 55 143, 36 46 346, 37 20 760 und 37 93 445), ist in jedem Fall zumindest eine zusätzliche Verfahrensstufe erforderlich, um eine wirksame Trennung der gebundenen markierten Substanz von der nicht gebundenen sicherzustellen. Die Ausschaltung dieser Trennstufe würde die Untersuchung stark vereinfachen und sie für klinische Laboratorien geeigneter machen.

Die Notwendigkeit radioaktive Substanzen für immunologische Bestimmungsverfahren anzuwenden, wurde in gewissem Maße ausgeschaltet durch die Anwendung von mit Enzym markierten Substanzen anstelle der radioaktiven Markierung. Wie in den US-PS

36 54 090 und 37 91 932 angegeben, sind die für die Durchführung derartiger immunologischen Bestimmungsverfahren erforderlichen Verfahrensstufen zum größten Teil die gleichen, wie für radioimmunologische Bestimmungen und umfassen die mühsame Trennung. Ein weiterer Nachteil der Anwendung enzymmarkierter Substanzen besteht darin, daß jedes zur Markierung angewandte Enzym einzeln chemisch für die Bildung des markierten Konjugats modifiziert werden muß.

Es wurde auch die Anwendung anderer Markierungssubstanzen vorgeschlagen, wie von Coenzymen oder Viren (Nature 219:186 (1968)) und von fluorexzierenden Markierungen (FR-PS 22 17 350).

Vor einiger Zeit wurde ein anderes Verfahren angegeben, bei dem keine Trennung erforderlich ist und das daher als homogenes System bezeichnet wurde, im Gegensatz zu einem heterogenen System, bei dem die Trennung wesentlich ist Die US-PS 38 17 837 beschreibt ein Bestimmungsverfahren durch konkurrierende Bindung, umfassend das Zusammenbringen der zu untersuchenden Flüssigkeit mit einem löslichen Komplex, bestehend aus einem Enzym als Markierungssubstanz, das kovalent an den nachzuweisenden Liganden gebunden ist, und mit einem löslichen Rezeptor, üblicherweise einem Antikörper, für den Liganden; dann wird die Wirkung des zu bestimmenden Liganden auf die enzymatische Wirksamkeit des Enzyms in dem Komplex bestimmt

Obwohl dieses Verfahren den Vorteil besitzt daß keine Trennung erforderlich ist da die Reaktion zwischen dem enzymgebundenen Ligandenkomplex und dem Rezeptor zu einer Hemmung der Enzymaktivitäc des Enzyms in dem Komplex führt, ist es trotzdem nur begrenzt anwendbar, da es schwer an stark variierende Anforderungen bei der Bestimmung angepaßt werden kann. Zum Beispiel ist es selbstverständlich wesentlich, daß bei der Herstellung des enzymgebundenen Ligandenkomplexes die nachzuweisende Substanz bzw. der Ligand sorgfältig mit dem Enzym gekuppelt werden muß, so daß die Kupplungsstelle nahe an der enzymatisch aktiven Stelle des Enzyms liegt, um zu erreichen, daß bei der Reaktion zwischen dem komplexierten Liganden und dem Rezeptor die enzymatisch aktive Stelle blockiert wird. Enzyme variieren stark in ihrer Größe und im Molekulargewicht von ungefähr 10 000 bis zu 1 000 000. So muß für einen Rezeptor in Form eines Antikörpers mit einem Molekulargewicht von 150 000 bis 300 000 die Kupplungsstelle genau geregelt werden, damit er imstande ist, die aktive Stelle eines Enzyms mit einem mittleren Molekulargewicht von 500 000 oder darüber zu blockieren. Aufgrund der komplexen chemischen Struktur von Enzymen ist eine genaue Regelung einer derartigen chemischen Bindung selbstverständlich schwierig und es wäre zu erwarten, daß, selbst bei Untersuchung einer großen Vielfalt von Enzymen, nur eine geringe Anzahl für dieses homogene Bestimmungsverfahren geeignet wäre.

Außerdem ist es, um quantitative Testergebnisse zu erhalten, erforderlich, genau das Verhältnis der Anzahl von Enzymmolekülen zur Anzahl von Liganden in jedem enzymgebundenen Ligandenkomplex zu regeln. Auch hier macht die komplexe Peptidstruktur der Enzyme eine solche Regelung schwierig. Es ist wieder zu erwarten, daß nur eine geringe Anzahl von Enzymen eine geeignete Molekularstruktur besitzen, um die notwendige Regelung des Liganden/Enzym-Verhältnisses zu ermöglichen.

Da die Markierungssubstanz, nämlich das Enzym, selbst der begrenzende Faktor ist, der die Empfindlichkeit des bekannten Verfahrens bestimmt, ist seine Anwendbarkeit sehr begrenzt. Die Empfindlichkeit ist deutlich beschränkt auf die katalytische Aktivität des speziellen Enzyms in dem enzymgebundenen Ligandenkonjugat.

Ein weiterer Nachteil des bekannten homogenen Bestimmungsverfahrens tritt auf bei seiner Anwendung zur Untersuchung von biologischen Flüssigkeiten, wie Urin und Serum. Es ist zu erwarten, daß deutliche Mengen der Enzymarten, die in dem enzymgebundenen L'eandenkonjugat enthalten sind, in der flüssigen zu untersuchenden Probe auftreten können, wodurch eine nicht regelbare Hintergrundsaktivität entsteht, die die Genauigkeit des Bestimmungsverfahrens stark nachteilig beeinflußt. Daher müssen, um ein Bestimmungssy-

stem herzustellen, das geeignet ist zur Untersuchung von biologischen Flüssigkeiten von Menschen oder Tieren, ausgefallene Enzyme ausgewählt werden, die dort nicht vorkommen, um das enzymgebundene Ligandenkonjugat herzustellen mit der Folge, daß die Anwendbarkeit des Bestimmungsverfahrens noch weiter eingeschränk 1 wird.

In der DE-OS 23 05 775 ist unter anderem angegeben, daß immunologische Bestimmungen durchgeführt werden können unter Verwendung einer Markierungssubstanz einer bestimmten Formel, von der nach Durchführung der eigentlichen Bestimmung eine »Indikatorgruppe« abgespalten werden kann, die fluoreszierend ist und/oder elektromagnetische Schwingungen im sichtbaren Bereich abgibt oder radioaktiv ist. Die Menge dieser Indikatorgruppe ist dann ein Maß für den gebundenen oder nicht gebundenen Anteil der markierten Substanz. Die Abspaltung der Indikatorgruppe erfolgt mit starken Oxidationsmitteln, insbesondere Perjodat. Bei dieser Bestimmung muß auf jeden Fall eine Trennung zwischen dem gebundenen und dem nicht gebundenen Teil der markierten Substanz durchgeführt werden. Außerdem können die harten Bedingungen, die bei der Anwendung von Perjodat erforderlich sind, möglicherweise zu einer Zerstörung der gebundenen Phase des markierten Konjugats führen, d. h. des markierten Antigen-Antikörper-Komplexes.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden in einer so Flüssigkeit zu entwickeln, bei dem keine Trennung erforderlich ist, keine unbequemen radioaktiven Substanzen oder modifizierten Enzyme als Markierungssubstanzen angewandt werden müssen und das vielseitiger anwendbar und bequemer ist als die bekannten S5 homogenen spezifischen Bindungsverfahren- Dabei soll bei einem homogenen Bestimmungsverfahren bzw. -system mit Hilfe einer spezifischen Bindung eine Markierungssubstanz angewandt werden, die mit dem Liganden oder einem spezifisch bindenden Partner davon bequemer gekuppelt werden kann als das Enzym bei dem bekannten Verfahren und wobei die Aktivität der Markierungssubstanz leichter durch eine spezifische Bindungsreaktion angegriffen wird als diejenige des Enzyms nach dem bekannten Verfahren. Außerdem soll das Verfahren besser anwendbar sein auf die Untersuchung biologischer Flüssigkeiten.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, wobei man 1.) das Medium zusam- so menbringt mit a) einem Konjugat aus einer spezifisch bindenden Substanz; die an eine markierende Sbustanz gekoppelt ist, die eine vorbestimmte Eigenschaft besitzt, und wobei die spezifisch bindende Substanz der Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner zu dem Liganden ist und, wenn die spezifisch bindende Substanz der Ligand oder ein spezifisch bindendes Analoges dieses Liganden ist mit b) einem spezifisch bindenden Partner für den Liganden, wobei die vorbestimmte Eigenschaft der markierenden Substanz beeinflußt wird durch die Bindung der spezifisch bindenden Substanz des Konjugats durch einen entsprechenden Bindungspartner, und 2.) anschließend die Wirkung auf die vorbestimmte Eigenschaft als Zeichen für das Vorhan- h5 densein des Liganden in dem Medium bestimmt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als markierende Substanz eine solche verwendet, die als vorbestimmte Eigenschaft eine vorbestimmte Aktivität als Substrat in einer enzymkatalysierten Reaktion, als Reaktionspartner in einer Chemolumineszens-Reaktion und/oder als Coenzym in einer chemischen Reaktion besitzt, und daß die Wirkung auf die vorbestimmte Eigenschaft bestimmt wird, indem man a) die chemische Reaktion in mindestens einem Teil des in Stufe 1 entstehenden Gemisches durchführt und b) diese Eigenschaft nach der Reaktion mit derjenigen vergleicht, die bei dem gleichen Verfahren unter Verwendung eines flüssigen Mediums, das eine bekannte Menge des Liganden enthält, auftritt.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben.

Das Verfahren beruht auf der Tatsache, daß die Reaktion zwischen einem Liganden und einem spezifisch bindenden Partner dazu, wobei das Reagens an einen dieser Reaktionspartner gekuppelt ist, die Aktivität des Reagenses bei der vorher bestimmten Reaktion verändert, wodurch die Reaktion als Mittel zur Überwachung der spezifisch bindenden Reaktion dient. Im Hinblick auf dieses grundlegende Phänomen können verschiedene Verfahrensschemen und verschiedene Mittel angewandt werden. Die bevorzugter grundlegenden Verfahrensschemata sind ein direktes Bindungsverfahren und ein Konkurrenzverbindungsverfahren.

Bei dem direkten Bindungsverfahren wird ein flüssiges Medium in dem der Ligand bestimmt werden soll, mit einem Konjugat aus dem Reagens und einem spezifisch bindenden Parnter des Liganden zusammengebracht und anschließend irgend eine Änderung dei Aktivität des Reagenses bestimmt. Bei dem Konkurrenzbindungsverfahren wird das flüssige Medium mil einem spezifisch bindenden Partner des Liganden unc mit einem Konjugat aus dem Reagens und den· Liganden und/oder einem spezifisch bindenden Analogen dazu zusammengebracht und anschließend die Änderung der Aktivität des Reagenses bestimmt Be beiden Verfahren wird die Aktivität des Reagenses bestimmt indem man das flüssige Medium mil mindestens einem Reaktionspartner zusammenbringt der mit dem ersten Reagens die vorher bestimmte Nachweisreaktion eingeht. Eine qualitative Bestimmung des Liganden in einem flüssigen Medium umfaßt einer Vergleich einer charakteristischen Eigenschaft üblicherweise der Geschwindigkeit der eintretender Reaktion mit derjenigen der Nachweisreaktion in einen flüssigen Medium, das den Liganden nicht enthält unc der Unterschied zwischen den beiden ist ein Hinweis au: eine Änderung der Aktivität des Reagenses. Dit quantitative Bestimmung des Liganden in dem flüssiger Medium umfaßt einen Vergleich einer Eigenschaft dei entstehenden Reaktion mit derjenigen der Vergleichs reaktion in einem flüssigen Medium, das bekannt« Mengen des Liganden enthält

Im Folgenden wird die Erfindung anhand der Figur« näher erläutert:

Bei den Figuren zeigt

F i g. 1 eine graphische Darstellung der Wirkunj verschiedener Gehalte eines Liganden auf die Gesamt Reaktionsgeschwindigkeit bei einem Bestimmungsver fahren bei einer cyclischen direkten Bindungs-Bestim mung;

F i g. 2 bzw. 3 graphische Darstellungen der Wirkunj verschiedener Gehalte an zwei unterschiedlich« Liganden auf die Gesamt-Reaktionsgeschwindigkeit be einem Konkurrenz-Bindungs-Cyclisierungsverfahren; F i g. 4 bzw. 5 graphische Darstellungen der Wirkunj

verschiedener Gehalt an zwei unterschiedlichen Liganden auf die Spitzenlichtintensität, die bei einem

Konkurrenzbindungs-Biolumineszens-Bestimmungsverfahren auftritt;

Fig.6 eine graphische Darstellung der Wirkung verschiedener Gehalte an Liganden auf die Nettogeschwindigkeit von zwei unterschiedlichen Reaktionen, einer enzymkatalysierten und einer anderen nicht enzymkatalysierten bei einem direkten Bindungs-Fluoreszens-Bestimmungsverfahren;

F i g. 7 bzw. 8 graphische Darstellungen der Wirkung verschiedener Gehalte an einem Liganden auf die Reaktionsgeschwindigkeiten bei zwei unterschiedlichen Konkurrenzbindungs-Bestimmungsverfahren, bei denen das eine eine Fluoreszensnachweisreaktion umfaßt und das andere eine spektrophotometrische Nachweisreaktion;

F i g. 9 bzw. 10 graphische Darstellungen der Wirkung verschiedener Gehalte an zwei unterschiedlichen Liganden auf die relative Intensität der Lumineszenz die bei direkten und konkurrierenden Bindungs-Biolumineszens-Bestimmungsverfahren auftritt;

F i g. 11 bzw. 12 graphische Darstellungen der Wirkung verschiedener Gehalte an einem Liganden auf die Spitzenlichtintensität, die bei zwei unterschiedlichen Konkurrenzbindungs-Chemilumineszens-Bestimmungsverfahren auftritt

Im Rahmen dieser Beschreibung besitzen die folgenden Ausdrücke die angegebene Bedeutung: Ligand ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorhandensein oder deren Mengen in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll. Spezifisch bindender Partner zu dem Liganden ist irgend eine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Auschluß anderer Substanzen besitzt. Spezifisch bindendes Analoges zu dem Liganden ist irgend eine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich bezüglich der Bindungsaffinität gegenüber dem spezifisch bindenden Partner zu dem Liganden im wesentlichen wie der Ligand verhält

Allgemein können die Komponenten der spezifischen Bindungsrekation, d.h. das flüssige Medium, von dem vermutet wird, daß es den Liganden enthält, das Konjugat und/oder ein spezifisch bindender Partner zu dem Liganden in irgend einer beliebigen Menge, Weise und Reihenfolge zusammengegeben werden, vorausgesetzt, daß die Aktivität des Reagenses in dem Konjugat meßbar geändert wird, wenn das flüssige Medium den Liganden in einer für die Zwecke der Bestimmung ausreichenden Menge oder Konzentration enthält Vorzugsweise sind alle Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion in dem flüssigen Medium löslich, wodurch man ein homogenes Bestimmungssystem erhält Es kann gegebenenfalls jedoch auch ein heterogens Bestimmungssystem angewandt werden, in dem das Konjugat oder ein spezifisch bindender Partner zu dem Liganden unlöslich ist

Wenn ein direktes Bindungsverfahren angewandt wird, sind die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion das flüssige Medium, von dem vermutet wird, daß es den Liganden enthält und eine Menge eines Konjugats, umfassend das Reagens, das an einen spezifisch bindenden Partner zu dem Liganden gekuppelt ist Die Aktivität des konjugierten Reagenses bei Berührung mit dem flüssigen Medium ändert sich zwangsläufig mit dem Maß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifisch bindenden Partner in dem Konjugat. So nimmt die Aktivität des konjugierten Reagenes ab, in dem Maße, wie die Menge an Liganden in dem flüssigen Medium zunimmt. Um quantitative Ergebnisse zu erzielen, ist die Menge an spezifisch bindendem Partner, die mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird, üblicherweise größer als diejenige Menge, die imstande ist, mit dem gesamten Liganden, wie er in dem flüssigen Medium

to vermutet wird, Bindungen einzugehen, während der Zeit, die das Konjugat und das flüssige Medium in Berührung stehen, vor Beendigung der Bestimmung der Aktivitätsänderung des konjugierten Reagenses. Bei der praktischen Durchführung wird die Menge an spezifischem Partner entsprechend den oben angegebenen Kriterien ausgewählt beruhend auf der Annahme, daß der Ligand in der größten Menge in dem flüssigen Medium vorhanden ist in der er dort vorhanden sein kann. Ein direktes Bindungsverfahren ist besonders geeignet zum Nachweis von hochmolekularen Liganden, die spezifisch bindende Partner besitzen, die kleiner sind als sie selbst.

Wenn ein Konkurrenzbindungsverfahren angewandt wird, sind die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion das flüssige Medium, von dem angenommen wird, daß es den Liganden enthält, eine Menge eines Konjugats, umfassend das an den Liganden oder ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden gekoppelte Reagens, und eine Menge eines spezifisch bindenden Partners zu dem Liganden. Der spezifisch bindende Partner wird im wesentlichen gleichzeitig sowohl mit dem Konjugat und dem flüssigen Medium zusammengebracht

Da irgend ein Ligand in dem flüssigen Medium mit dem Liganden oder dem spezifisch bindenden Analogen davon in dem Konjugat um die Bindung mit dem spezifisch bindenden Partner in Konkurrenz tritt, ändert sich die Aktivität des konjugierten Reagenses in Berührung mit dem flüssigen Medium direkt mit dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifisch bindenden Partner. So nimmt die Aktivität des konjugierten Reagenses zu mit einer Zunahme der Menge des Liganden in dem flüssigen Medium. Um quantitative Ergebnisse zu erhalten, ist die Menge an dem spezifisch bindenden Partner, die mit dem Konjugat und dem flüssigen Medium zusammengebracht wird, üblicherweise geringer als diejenige Menge, die imstande ist, Bindungen einzugehen mit dem gesamten in dem

so flüssigen Medium vermuteten Liganden und dem gesamten Liganden oder Analogen des Liganden in konjugierter Form innerhalb der Zeit die der spezifisch bindende Partner, das Konjugat und das flüssige Medium miteinander in Berührung stehen, vor der Beendigung der Bestimmung der Aktivitätsänderung des konjugierten Reagenses. In der Praxis wird eine solche Menge an spezifisch bindendem Partner ausgewählt entsprechend den oben angegebenen Kriterien, beruhend auf der Annahme, daß die größte Menge an Liganden, die in dem flüssigen Medium vorhanden sein kann, tatsächlich vorhanden ist Im allgemeinen geht die Menge an Liganden oder Analogen des Liganden in konjugierter Form, die mit dem flüssigen Medium in Berührung gebracht wird, nicht über die geringste Menge an nachzuweisenden Liganden in dem flüssigen Medium hinaus. Ein Konkurrenzbindungsverfahren ist besonders geeignet zum Nachweis von Liganden, die spezifische Bindepart-

ner besitzen, die größer sind als sie selbst.

Eine Variante des Konkurrenzbindungsverfahrens ist das Verdrängungsbindungsverfahren, bei dem das Konjugat zunächst mit dem spezifisch bindenden Partner des Liganden und anschließend mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird. Dann tritt Konkurrenz um den spezifisch bindenden Partner ein. Bei einem solchen Verfahren ist die Menge an Konjugat, die mit dem spezifisch bindenden Partner zusammengebracht wird, üblicherweise so, daß der Ligand oder das Analoge davon in einem Überschuß vorhanden ist gegenüber derjenigen Menge, die im imstande ist, mit der vorhandenen Menge des spezifisch bindenden Partners in der Zeit zu reagieren, die das Konjugat und der spezifisch bindende Partner in Berührung stehen, vor der Berührung mit dem flüssigen Medium in dem der Ligand vermutet wird. Diese Reihenfolge des Inberührungbringes kann auf eine von zwei unterschiedlichen Arten erreicht werden. Bei einem Verfahren wird das Konjugat mit dem spezifisch bindenden Partner in einer flüssigen Umgebung in Berührung gebracht, bevor es mit dem flüssigen Medium in Berührung gebracht wird, in dem der Ligand vermutet wird. Bei dem zweiten Verfahren wird das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, mit einem Komplex in Berührung gebracht, umfassend das Konjugat und den spezifisch bindenden Partner, wobei die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat und der spezifisch bindende Partner reversibel aneinander gebunden sind. Die Menge des Konjugats, die bei der ersten Arbeitsweise an den spezifisch bindenden Parnter gebunden wird sowie die Menge davon, die nach der zweiten Arbeitsweise in komplexierter Form vorliegt, ist üblicherweise größer als diejenige Menge, die imstande ist, durch den gesamten Liganden in dem flüssigen Medium in der Zeit ersetzt zu werden, die der spezifisch bindende Parnter oder Komplex und das Medium in Berührung stehen, vor Beendigung der Bestimmung irgend einer Änderung der Aktivität in dem konjugierten Reagens.

Eine andere Variante des Konkurrenzbindungsverfahrens ist ein aufeinanderfolgendes Sättigungsverfahren, bei dem die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion die gleichen sind, wie sie angewandt werden für das Konkurrenzbindungsverfahren, aber die Reihenfolge der Zugabe oder des Zusammengebens der Komponenten und die relativen Mengen der Komponenten sind unterschiedlich. Bei einem aufeinanderfolgenden Sättigungsverfahren wird der spezifisch bindende Parnter des Liganden mit dem flüssigen Medium, in dem der Ligand vermutet wird, zusammengebracht eine Zeit lang, bevor das flüssige Medium mit dem Konjugat zusammengebracht wird. Die Menge an spezifisch bindendem Partner, die mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird, ist üblicherweise größer als diejenige Menge, die mit dem gesamten, in dem flüssigen Medium vermuteten Liganden innerhalb der Zeit Bindungen eingehen kann, die der spezifisch bindende Partner und das flüssige Medium in Berührung stehen, bevor das flüssige Medium mit dem Konjugat in Berührung gebracht wird. Außerdem ist die Menge an Liganden oder Ligandenanalogen in konjugierter Form üblicherweise größer als diejenige Menge, die imstande ist, mit der restlichen nicht gebundenen Mengen des spezifisch bindenden Partners während der Zeit Bindungen einzugehen, die das flüssige Medium und das Konjugat in Berührung steht, vor Abschluß der Bestimmung einer Aktivitätsänderung in dem konjugierten Reagens. In der Praxis werden die Mengen an spezifisch bindendem Partner und Liganden oder Ligandenanalogen in konjugierter Form entsprechend dem oben angegebenen Kriterium ausgewählt, wobei man davon ausgeht, daß die größte Menge an Liganden in dem flüssigen Medium vorhanden ist, die vorhanden sein könnte.

Verfahrensweisen, die andere Reihenfolgen der Zugabe und andere relative Mengen der spezifischen Komponenten der Bindungsreaktion anwenden, können für ein homogenes Bestimmungsverfahren mit Hilfe spezifischer Bindungen ebenfalls angewandt werden.

Die Bestimmung der Aktivitätsänderung des konjugierten Reagenses als Bestandteil einer vorher bestimmten Nachweisreaktion wird günstigerweise durchgeführt, indem man das Reaktionsgemisch der spezifischen Bindungsreaktion mit mindestens einer Substanz zusammenbringt, die mit dem konjugierten Reagens die Nachweisreaktion eingeht und die Wirkung der spezifischen Bindungsrekation auf eine Eigenschaft dieser Reaktion bestimmt. Die Nachweisreaktion kann eine einzelne chemische Umwandlung oder eine Vielzahl oder Reihe chemischer Umwandlungen umfassen. Wenn nicht anders angegeben, bedeutet der Ausdruck »Reaktionssystem« hier die ganze oder einen Teil der vorherbestimmten Nachweisreaktion.

Wenn ein enzym-katalysiertes Reaktionssystem angewandt wird, umfaßt es neben dem konjugierten Reagens mindestens ein Enzym und kann auch ein oder mehrere enzymatische Reagentien, wie Substrate und Coenzyme umfassen. Ein derartiges enzymkatalysiertes Reaktionssystem kann eine einzelne einfache enzymatische Reaktion oder eine komplexe Reihe von enzymatischen und nicht-enzymatischen Reaktionen umfassen. Zum Beispiel kann das enzymkatalysierte Reaktionssystem aus einem einzigen enzymkatalysierten Abbau oder einer Dissoziationsreaktion bestehen. In einem solchen System ist das konjugierte Reagens das Enzymsubstrat, das abgebaut oder dissoziiert wird und die einzige Komponente des Reaktionssystems, die mit dem spezifisch bindenden Reaktionsgemisch in Berührung gebracht werden muß, ist ein Enzym, das den Abbau oder die Dissoziationsreaktion katalysiert. Ein komplexeres enzymkatalysiertes Reaktionssystem kann aus einer einzelnen enzymatischen Reaktion bestehen, umfassend zwei oder mehrere Reaktionsteilnehmer, oder es kann aus einer Reihe von Reaktionen bestehen, umfassend verschiedene Reaktionsteilnehmer, von denen mindestens eine Reaktion enzymkatalysiert ist In einem solchen System wäre das konjugierte Reagens einer der enzymatischen Reaktionsteilnehmer der enzymkatalysierten R.eaktion und das Gemisch der spezifischen Bindungsreaktion würde mit dem entsprechenden Enzym und den anderen Komponenten der Reaktion außer dem Konjugat zusammengebracht, die erforderlich sind, um das gewünschte enzymkatalysierte Reaktionssystem zu ergeben.

Die entsprechenden Reaktionsbestandteile, die zusammen mit dem Reagens in dem Konjugat das Nachweisreaktionssystem bilden, können mit dem Gemisch der spezifischen Bindungsreaktion einzeln oder in irgend einer Kombination vorher, gleichzeitig oder anschließend an die Auslösung der spezifischen Bindungsreaktion zusammengebracht werden. Nach Beginn der spezifischen Bindungsreaktion wird das Reaktionsgemisch, das irgend eine oder alle der erforderlichen Bestandteile für die Nachweisreaktion enthalten kann, üblicherweise eine vorherbestimmte

Zeit inkubiert, bevor eine Änderung der Aktivität des Reagenses in dem Konjugat bestimmt wird. Nach der Inkubationszeit werden irgend welche Bestandteile, die für die Nachweisreaktion erforderlich sind und die nicht schon in ausreichenden Mengen in dem Reaktionsgemisch vorhanden sind, zugegegeben, und eine Wirkung auf die Nachweisreaktion bestimmt als Zeichen für das Vorhandensein oder die Menge des Liganden in dem flüssigen Medium.

Wenn der Ligand in dem flüssigen Medium nicht vorhanden ist oder in einer nicht nachweisbar geringen Menge, besitzt die vorbestimmte Nachweisreaktion einen verhältnismäßig konstanten Charakter. Wenn der Ligand in dem flüssigen Medium vorhanden ist, wird mindestens ein Charakteristikum oder eine Eigenschaft der Nachweisreaktion verändert. Im allgemeinen ist die Aktivität des konjugierten Reagenses definiert als das Ausmaß oder die Geschwindigkeit, mit der das Reagens imstande ist, an der Nachweisreaktion teilzunehmen. So wird der Charakter der Nachweisreaktion verändert durch das Vorhandensein des Liganden in dem flüssigen Medium, üblicherweise im Hinblick entweder auf die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion oder auf die Menge eines oder mehrerer Reaktionsprodukte, die dabei im Gleichgewicht gebildet werden. Im üblichen Falle wird die Fähigkeit des konjugierten Reagenses, an der Nachweisreaktion teilzunehmen, herabgesetzt durch die Reaktion zwischen der spezifisch bindenden Substanz, mit der es konjugiert ist und einem spezifisch bindenden Gegenstück zu dieser spezifisch bindenden Substanz, d. h. das Konjugat ist in freier Form aktiver in der Nachweisreaktion als in gebundener Form. Die relativen Mengen an freiem und gebundenem Konjugat, die nach der Inkubation der spezifischen Bindungsreaktion vorhanden sind, sind eine Funktion der Menge des Liganden in dem flüssigen Medium und sind bestimmend für die Wirkung auf die Nachweisreaktion.

Wenn die Änderung in der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit der Nachweisreaktion das Charakteristikum ist, das angewandt wird, um das Vorhandensein des

Tabelle A

Liganden zu bestimmen, wie es bevorzugt ist, wird eine derartige Geschwindigkeit üblicherweise bestimmt durch Messung der Geschwindigkeit, in der ein Reaktionspartner verschwindet oder der Geschwindigkeit, mit der ein Reaktionsprodukt auftritt. Eine derartige Messung kann durch viele verschiedene Verfahren durchgeführt werden, wie die üblichen chromatographischen, gravimetrischen, potentiometrischen, spektrophotometrischen, fluormetrischen, Trübungsmessungen und volumetrischen Bestimmungen. Da das erfindungsgemäße Verfahren in erster Linie bestimmt ist zum Nachweis geringer Konzentration an Liganden, wurden sehr empfindliche Reaktionssysteme entwickelt zur Anwendung im Zusammenhang mit dem neuen spezifischen Bindungsreaktionssystem.

Die Nachweisreaktion umfaßt gemäß einem der erfindungsgemäßen Lösungswege ein Chemolumineszenzreaktionssystem, vorzugsweise ein enzymkatalysiertes. Das Reagens in dem Konjugat kann entweder ein Reagens in der lichterzeugenden Reaktion sein oder in einer Reaktion, die einer enzymatischen oder nichtenzymatischen Lumineszenzreaktion vorausgeht. Irgend eine Änderung der Aktivität des konjugierten Reagenses, die bei der spezifischen Bindungsreaktion auftritt, führt zu einer Veränderung in der Geschwindigkeit der Lichtbildung oder der Gesamtmenge, Spitzenintensität oder dem Charakter des entstehenden Lichtes. Beispiele für Chemolumineszenzreaktionssysteme sind in Tabelle A angegeben, bei der die folgenden Abkürzungen angewandt werden:

ATP Adenosintriphosphat

AMP Adenosinmonophosphat

NAD Nicotinamidadenin-dinucleotid

NADH reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid

FMN Fiavinirionoiiudeotid

FMNH2 reduziertes Flavinmononucleotid

hv elektromagnetische Strahlung, üblicherweise im IR-, sichtbaren oder UV-Bereich.

Lumineszenz-Reaktioriisystem konjugiertes Reagens

ATP + reduziertes Luciferin hv + AMP

(Leuchtkäfer)

+ oxidiertes Luciferin

FMNH₂ + langkeiiiger Aldehyd + O_{2 Yli> + FiviN}

(P. fisheri)

+ langkettige Säure + H₂O

1) NADH + H® ^NADH Pehydrogenase ₍

2) FMNH₂ + langkettiger Aldehyd + O₂
+ langkettige Säure + H₂O ATP oder reduziertes Luciferin

Aldehyd

NADH oder FMN

(P. fisheri) hv + FMN

Sulfat-

ί T3 "Π ^ mP "Πίΐ ^^

1) 3',5'-Adenosin-diphosphat + reduziertes Luciferin-sulfat >

—► Adenosin-ß'-phosphat-S'-phosphosulfat + reduziertes Luciferin

2) reduziertes Luciferin + O₂ » hv + oxidiertes Luciferin

3',5'-Adenosindiphcsphat oder reduziertes Luciferin

Fortsetzung

Lumineszenz-Reaktionssystem

konjugiertes Reagens

E. reduziertes Luminol + H₂O₂ — hv + oxidiertes Luminol + H₂O

F. reduziertes Pyrogallol + H₂O₂
+ H₂O

reduziertes Luminol

+ hv + oxidiertes Pyrogallol reduziertes Pyrogallol

OxV2Gn3.SG

G. reduziertes Luminol + O₂ — * hv + oxidiertes Luminol

H. reduziertes Pyrogallol + O₂ —_> ^ _{+ ox};_dj_ertes py_rog_an_oi

I. Isoluminol + H₂O₂ hv + Aminophthalat + N₂

J. Isoluminol + KO₂ * hv + Aminophthalat + N₂

*) oder Catalase

reduziertes Luminol
reduziertes Pyrogallol

Isoluminol
Isoluminol

Derivat Umbelliferon

3-Indol

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Reagens in dem Konjugat ein Substrat für eine enzymatische Reaktion, die ein Produkt liefert, das Fluoreszenseigenschaften besitzt, die sich von denjenigen des konjugierten Substrats unterscheiden. Jede auftretende Änderung in der Aktivität des konjugierten enzymatischen Reagenses,, die durch die spezifische Bindungsreaktion bewirkt wird, führt zu einer Änderung in den Fluoreszenseigenschaften des Reaktionsgemisches. Ein allgemeines Reaktionsschema für eine derartige enzymkatalysierte Reaktion ist das folgende:

enzymatisches _ .

Reagens—X-Z Produkt

(Substrat) '

wobei X eine enzymatisch spaltbare Bindung oder Bindungsgruppe ist, wie eine Ester- oder Amidogruppe und Z eine spezifisch bindende Substanz, die in jg-Naphthol

Abhängigkeit von der angewandten spezifischen Bindungsreaktion der Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner des Liganden ist Spezifische Konjugate, die für ein derartiges Reaktionssystem angewandt werden können, sind verschiedene durch Enzym spaltbare Derivate von Fluorescein, Umbelliferon, 3-hdol, /^-Naphthol, 3-Pyridol, Resorufin, Rhodamin B usw.; Beispiele für mögliche Strukturformen derartiger Derivate sind:

Formel

3-Pyridol

55

Derivat

Formel

Fluoresain

Resorufin wobei R¹ — OH oder — X — Z (wie oben angegeben), R² -X-ZundR3 -Hoder -CH₃ist

Ein Reaktionssystem, das bei Verwendung eines Enzymsubstrats oder eines Coenzyms als Markierungssubstanz besonders bevorzugt ist zum Nachweis der spezifischen Bindungsreaktion ist ein cyclisches Reaktionssystem (Ringreaktion). Bei einem derartigen Reaktionssystem wird ein Produkt einer ersten Reaktion in einer zweiten Reaktion umgesetzt, wobei in der zweiten Reaktion ein Produkt entsteht, das auch ein Reagens für die erste Reaktion ist.

15 16

Das folgende Diagramm zeigt ein Modell für ein derartiges cyclisches Reaktionssystem:

Produkte
Reaktion A
Reagenzien A

cyclisiertes Material-^ ^—Reagenzien B (Form 1) \Y

] Reaktion B

cyclisiertes Material*-^ ^-»Produkte B (Form 2)

Bei dem oben angegebenen Modell eines cyclischen Reaktionssystems bildet eine kleine Menge des cyclisierten Materials, wenn ihr ausreichende Mengen der Reaktionspartner A und B zur Verfügung stehen, große Mengen an Produkten A und B. Da die Reaktionsgeschwindigkeit und Menge an Produkten, die durch die Reaktionen entstehen, die das cyclische Reaktionssystem bilden, sehr empfindlich sind gegenüber der vorhanden Menge an cyclisiertem Material, ist es besonders bevorzugt, dieses cyclisierte Material als Reagens in dem erfindungsgemäßen Konjugat zu verwenden. Beispiele für cyclische Reaktionssysteme, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden können, sind in den folgenden Tabellen B, C und D angegeben.

Tabelle B
Produkt A«--. ^-* NAD*) —^ /- Reagens B

V V

Enzym Enzym

Reagens A—^ ^~ NADH**)*^ ^—Produkt B

Reaktion Reagens A oder Produkt B

Enzym Reagens U oder Produkt A

Lactaldehyd

a-Ketoglutarat + NH₃ Oxaloacetat

Acetaldehyd

ff-Ketoglutarat + CO₂ Dehydroxyacetonphosphat Pyruvat

1,3-Dephosphoglycerat

Alkohol-dehydrogenase

G lutam insäure-dehy drogenase

Äpfelsäure-dehydrogenase

Alkohol-dehydrogenase

Isocitronensäure-dehydrogenase

ar-Glycerinphosphat-dehydrogenase

Milchsäure-dehydrogenase

Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase Propandiol

Glutamat

Malat

Äthanol

Isocitrat

L-ff-Glycerinphosphal

Laclat

Glyceraldehyd-3-phosphat + Phosphat

*) Nicotinamid-adenin-dinucleotid.
**) Reduziertes NAD.

Tabelle C	r-> NADP*,-	-Reagens B	Reagens B oder Produkt A
Produkt A«-	V V Enzym Enzvm /V '/*■		Glucose-6-phosphat reduziertes Glutathion Hydrochinon Nitrit Glutamat
	■^ ^-NADPH**)-^ ^	"-»Produkt B
Reagens A-	Reagens A oder Produkt B	Enzym
Reaktion	6-Phosphogluconat oxidiertes Glutathion p-Benzochinon Nitrat a-Keioglutaral + NH1	Glucose-o-phosphat-dehydrogenase GI utathionreductase Chinonreductase Nitratreductase Glutaminsäure-dehydrogenase
1 2 3 4 5

*) Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat. ♦*t Reduziertes NADP.

Es ist zu bemerken, daß die in den Tabellen B und C angegebenen cyclischen Reaktionssystem eine Kombination irgend einer der in den jeweiligen Tabellen angegebenen Reaktionen mit einer anderen dort angegebenen Reaktion umfaßt Zum Beispiel kann die Reaktion 1 in Tabellelle B mit irgend einer der Reaktionen 2 bis 9 kombiniert werden, um ein geeignetes cyclisches Reaktionssystem zu ergeben. So geben die Tabellen B und C 56 bzw. 20 mögliche Reaktionssysteme für das erfindungsgemäße Verfahren an.

Neben den in den Tabellen B und C angegebenen cyclischen Reaktionssystemen ist es möglich, daß eine der Reaktionen in dem cyclischen Reaktionssystem die enzymatische oder nicht-enzymatische Umwandlung eines spektrophotometrischen Indikators umfaßt, vorTabelle D

Reduziertes Cytochrom-C*

Cytochrom-C-reductase

10

15

zugsweise kolorimetrisch. Bei einem derartigen System äußerst sich irgend eine Änderung der Reaktion oder der Cyclusgeschwindigkeit in einer Änderung der spektrophotometrischen Eigenschaften des Indikators. Be« Verwendung der bevorzugten kolorimetrischen Indikatoren ist eine solche Änderung eine Farbänderung. Ein Beispiel für ein cyclisches Reaktionssystem, umfassend eine Änderung eines Indikators, ist das System, das gebildet wird durch Kombination der Reagenz B-Produkt B-Reaktionen in Tabelle B mit einer Reaktion, umfassend einen Oxidations-Reduktions-Indikator und ein elektronenübertragendes Mittel. Als elektronenübertragendes Mittel kann Phenazinmethosulfat angewandt werden. Geeignete Indikatoren umfassen die oxidierten Formen von Nitrotetrazolium, Thiazoylblau und Dichlorphenolindophenol.

-NADPH

Cytochrom-C-reductese

Oxidiertes Cytochrom-C

^a) Flavin-mononucleotid.

^b) Reduziertes FMN.

-FMNH₂")* NADP

H₂O₂

»FAD^C)

-D-Aminosäure

D-Aminosäureoxidase

D-Aminosäureoxidase

FADH₂")

^c) Flavin-adenin-dinucleotid.

^d) Reduziertes FAD.

*cr-Ketosäure + NH₃

<r-Ketoglutarat*^ ^.«-Aminosäure-^ ^- O₂

Transaminase
Glutamat^ ^- ir-Ketosäure

L-Aminosäure-_Qxidase

Phosphat^

^ADP=) -

.,~ Phosphoenolpyruvat

Adenosintriphosphatase

^c) Adenosin-diphosphat.
^r) Adenosin-triphosphat.

Pyruvatkinase

/V

^ Py ru vat

Succinat + GTP^g)'

Coenzym A -a-Ketoglutarat + NAD

Bernsteinsäurethiokinase

ff-Ketoglutaratdehydrogenase

Phosphat + GDP^h)-

^e) Guanosin-triphosphat.
^h) Guanosin-diphosphat.

*NADH + CO₂

Fortsetzung

Ascorbat*

^oxidiertes Glutathion- -NADPH

Dehydroascorbatreductase

Glutathionreductase

Dehydroascorbat-

' reduziertes Glutathion«

Oxidiertes Glutathion*^

Ascorbat

Dehydroascorbatreductase

-O,

Ascorbatoxidase

Reduziertes Glutathion-

-Dehydroascorbat*

Nucleosiddiphosphat-

kinase

ATP

.. -Oxaloacetat

Phosphoenol-

pyruvat-

kinase

■•Phosphoenolpyruvat

₂O^ ^»oxidiertes Cytochrom-C-^ ^NADPH

Cytochrom-C- Cytochrom-C-

peroxidase reductase

-reduziertes Cytochrom-C *

*NADP

NADPH'

♦oxidiertes Ferridoxin

Pyridin-nucleotidreductase

NADP'

-reduziertes Ferridoxin

Bei Bildung irgend eines der in den Tabellen B, C und D angegebenen cyclischen Reaktionssysteme, wenn eine der Komponenten des Reaktionssystems in ionischer Form vorliegt, kann sie natürlich in Form des Salzes oder der Säure vorliegen, wenn diese bei Berührung mit den flüssigen Medium ionisieren. Ein wasserlösliches Salz oder eine Säure ist natürlich bevorzugt.

Es kann auch ein exponentiales cyclisches Reaktionssystem bei der Nachweisreaktion angewandt werden. Ein Beispiel für ein exponentiales cyclisches Reaktionssystem ist das folgende:

AMP + ATP

ADP + PEP

Myokinase

-> 2 ADP

Pyru' at-kmase

ATP + Pyruvat

Eine solche cyclische Reaktion ist autokatalytisch in dem Sinne, daß während jedes Cyclus die Menge an zurückgeführtem (cyclisiertem) Material verdoppelt wird. Die Cyclisierungsgeschwindigkeit nimmt daher exponential mit der Zeit zu und ergibt eine sehr hohe Empfindlichkeit.

Wenn ein cyclisches Reaktionssystem angewandt wird als Mittel zur Bestimmung der Aktivitätsänderung des konjugierten Reagenses, kann die Geschwindigkeit, mit der ein Reagens verschwindet oder ein Reaktionsprodukt auftritt, durch übliche Verfahren bestimmt werden oder mit Hilfe eines oder mehrerer cyclischer Systeme und anschließende übliche Bestimmung der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit.

Die Anwendung eines cyclischen Reaktionssystems in Verbindung mit dem System der spezifischen Bindungsreaktion ergibt eine breite Anwendbarkeit sowie hohe Empfindlichkeit. Ein einziges Konjugat aus Reagens und spezifisch bindender Substanz kann für eine Vielzahl von Reaktionen angewandt werden, um cyclische Systeme zu bilden mit Empfindlichkeiten, die über einen weiten Bereich variieren und zu einer Vielzahl von Umwandlungen führen, die mit Hilfe der Sinne oder künstlicher Mittel nachgewiesen werden können. Eine derartige vielseitige Anwendbarkeit besitzt das bekannte homogene enzymatische Bestimmungssystem nicht.
Obwohl es bei der bevorzugten Ausführungsform des

erfindungsgemäßen Verfahrens nicht erforderlich ist, kann es günstig sein, ein heterogenes Bestimmungsverfahren anzuwenden, selbst dort, wo das Vorhandensein des Liganden in dem flüssigen Medium die Aktivität des konjugierten Reagenses beeinträchtigt. Eine solche Situation kanr sich bieten, wenn ein heterogenes System besondere Vorteile bietet. Bestimmte heterogene Systeme besitzen die Fähigkeit, die wirksame Konzentration des Liganden in dem Bestimmungssystem und damit die Empfindlichkeit zu erhöhen. Ein Beispiel für ein solches heterogenes System ist dasjenige, bei dem eine Säule angewandt wird, die eine unlösliche Matrix enthält, umfassend entweder das Konjugat oder einen spezifisch bindenden Partner des Liganden, je nach der speziellen gewählten Arbeitsweise. Alle anderen heterogenen Bestimmungsverfahren, bei denen eine radioaktive oder enzymmarkierte Substanz angewandt wird, können auch mit Hilfe des erfindungsgemäßen Reagenses als Markierungssubstanz durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewandt werden auf den Nachweis irgend eines Liganden, zu dem es einen spezifisch bindenden Partner gibt. Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, so daß es einen spezifisch bindenden Partner in biologischen Systemen gibt oder ein solcher synthetisiert werden kann. Der Ligand wird — allgemein gesprochen— ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen und Antikörpern dazu, Haptenen und Antikörpern dazu, Hormonen, Vitaminen, Metaboliten (Stoffwechselprodukten) und pharmakologischen Mitteln und ihren Rezeptoren und bindenden Substanzen. Spezifische Beispiele für Liganden, die erfindungsgemäß nachgewiesen werden können, sind Hormone, wie Insulin, Choriongonadotropin, Thyroxin, Liothyronin und Östriol, Antigene und Haptene, wie Ferritin, Bradykinnin, Prostaglandine und tumorspezifische Antigene, Vitamine, wie Biotin, Vitamin B12, Folsäure, Vitamin E und Ascorbinsäure, Metaboliten, wie 3',5'-Adenosinmonophosphat und 3',5'-Guanosinmonophosphat, pharmakologische Mittel, wie Dilantin, Digoxin, Morphin, Digitoxin und Barbiturate, Antikörper, wie mikrosome Antikörper und Antikörper gegen Hepatatis und Allergene und spezifisch bindende Rezeptoren, wie thyroxinbindendes Globulin, Avidin, Intrinsicfaktor und Transcobalamin.

Im allgemeinen ist es bevorzugt daß das Reagens in dem Konjugat an den kleineren Partner, den Liganden oder seinen spezifisch bindenden Partner, gebunden ist. Es ist bevorzugt, ein direktes Bindungsverfahren anzuwenden, um den Liganden nachzuweisen, wenn das Molekulargewicht des gewählten spezifisch bindenden Partners ungefähr 1/10 des Liganden beträgt oder darunter liegt. So ist es, wenn der nachzuweisende Ligand ein Antikörper oder ein spezifisch bindender Rezeptor ist, bevorzugt, ein direktes Bindungsverfahren anzuwenden, bei dem das Konjugat ein enzymatisches Reagens umfaßt, das an ein Antigen oder Hapten zu dem Antikörper gebunden ist oder einen niedermolekularen bindenden Partner des Rezeptors. Wenn das Molekulargewicht des ausgewählten bindenden Partners 1Ox so hoch ist wie das des nachzuweisenden Liganden oder darüber, wie wenn ein Antigen, Hapten, Hormon, Vitamin, Metabolit oder pharmakologisches Mittel nachgewiesen werden soll ist es besonders vorteilhaft, ein Konkurrenzbindungsverfahren oder eine verdrängende Sättigungsreaktion anzuwenden, wobei das Konjugat das Reagens an den kleineren Liganden gebunden umfaßt.

Die Bindung zwischen dem Reagens und der spezifisch bindenden Substanz ist üblicherweise im wesentlichen unter den Bestimmungsbedingungen irreversibel, wobei die Nachweisreaktion, in der das Reagens Aktivität besitzt, nicht so gestaltet ist, um eine solche Bindung chemisch zu zerstören, wie bei dem oben erwähnten Lumineszens- und cyclischen Reak-

Ki tionssystem. In einigen Fällen wird jedoch eine solche Bindung zerstört oder auf andere Weise angegriffen durch die ausgewählte Nachweisreaktion als Mittel zur Bestimmung der Änderung der Reagensaktivität. Ein solcher Fall liegt vor bei dem oben erwähnten enzymatischen Fluoreszens-Substrat-Reaktionssystem.

Das Reagens kann direkt an die spezifisch bindende

Substanz gekuppelt sein, so daß das Molekulargewicht des Konjugates geringer gleich groß ist wie die addierten Molekulargewichte des Reagenses und der

2» spezifisch bindenden Substanz. Üblicherweise sind jedoch das Reagens und die spezifisch bindende Substanz über eine Brückengruppe, enthaltend 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatome oder Heteroatome, wie Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Phosphoratome usw. miteinander verbunden. Beispiele für eine Brückengruppe, umfassend ein einziges Atom, ist die Methylengruppe (ein Kohlenstoffatom) und die Aminogruppe (ein Heteroatom). Die Brückengruppe besitzt üblicherweise ein Molekulargewicht von nicht mehr als

jo 1000 und vorzugsweise weniger als 200. Die Brückengruppe umfaßt eine Kette von Kohlenstoffatomen oder Heteroatomen oder eine Kombination von beiden und ist mit dem Reagens und der spezifisch bindenden Substanz oder einem aktiven Derivat davon über eine verbindende Gruppe gebunden, üblicherweise in Form einer Ester-, Amido-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Acetal-, Methylen- oder Aminogruppe.

Wenn ein Substrat als markierende Substanz angewandt wird, beträgt das bevorzugte Molekulargewicht weniger als 9000 und besonders weniger als 5000 Substrate solcher Größe sind aufgrund ihres Mangels ar Molekularkomplexität besonders bequem für die Herstellung eines solchen Konjugats. Außerdem wird die Aktivität der Substrate, die an eine spezifisch bindende Substanz gekuppelt sind, leicht angegriffen durch Umsetzung des Konjugats mit einem spezifisch bindenden Gegenstück einer derartigen spezifisch bindenden Substanz. Beispiele für Enzymsubstrate, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind umfassen die enzymatisch spaltbaren Fluoreszenssubstrate, die oben erwähnt sind, wie Fluorescein- und Umbclliicföndefiväie, pH-Indikatoren und spektrophotometrische Indikatorfarbstoffe, besonders chromogene Farbstoffe.

Aus den oben angegebenen Gründen und au« Gründen der Anwendbarkeit und Anpaßbarkeit sine Coenzyme als Reagentien für die erfindungsgemäßer Konjugate besonders geeignet Ein Coenzym ist eir . Nichtprotein-Molekül, das von einem Enzymprotein zi einem anderen wandert und dadurch die Wirksamker der katalytischen Funktion des Enzyms verbessert Alle bekannten Coenzyme besitzen ein Molekulargewich von weniger als 9000. Die bevorzugten Coenzym« besitzen ein Molekulargewicht von weniger als 5000 Geeignete Coenzyme umfassen die Nucleotidcoenzyme besonders solche, enthaltend Adeningruppen, wie di< Adenosinphosphate (d. h. die Mono-, Di- und Triphos phatformen), Nicotinamidadenindinucleotid und desser

24

reduzierte Formen und Nicotinamidadenindinucleotid- wobei R-¹ = phosphat und dessen reduzierte Formen. Andere geeignete Coenzyme umfassen die Guanosinphosphate, Flavinmononucleotid und dessen reduzierte Formen, Flavinadenindinucleotid und dessen reduzierte Formen, Coenzym A und dessen Thioester einschließlich Succinyl-Coenzym A, 3',5'-Adenosindiphosphat und Adenosin-3'-phosphat-5'-phosphosulfat.

Geeignete coenzymaktive Konjugate umfassen Nucleotidcoenzyme mit einer Adeningruppe, an die die ι ο spezifisch bindende Substanz, d. h. ein Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner eines Liganden über eine direkte Bindung oder über eine Brückengruppe, wie oben angegeben, gebunden ist. Solche coenzymaktiven is Konjugate, die ein Adenosinphosphat, Nicotinamidadenindinucleotid oder dessen reduzierte Form oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat oder dessen reduzierte Form umfassen, besitzen die folgende allgemeine Formel: Jl)

R¹ —H,C /O_v R³

25

	N I	0Θ I	Λ
	OH R	Ρ — Οθ Il	2
wobei R1 =		Il O
	οθ ι
— O —	I Ρ —Ο — Il
	Il O
	οθ I	οθ
— O —	I Ρ—Ο — Μ	Ρ—Οθ M
	Il O	Il O
	οθ οθ I
—o—	I P—O—P — Οθ Il Il
	Il Il O O

35

40

oder

45

50

NH₂

R⁵

wobei R

— O—P — O—P—O—H₂C

Il Il

ο ο

R⁴

CONH₂

OH OH

60

wobei R²

Ο^θ

CONH₂

— OH or —Ο—Ρ —Ο^θ

Il ο

65 ist, in der R⁵= —Υ—Z ist, wobei Y eine Bindung oder eine Brückengruppe bedeutet, und Z einen Liganden, ein

spezifisch bindendes Analoges eines Liganden oder einen spezifisch bindenden Partner eines Liganden bedeutet. Die oben angegebene Formel zeigt die ionisierten Formen der coenzymaktiven Konjugate, die protonisierten oder Säureformen sind jedoch gleichermaßen geeignet. Das Ausmaß der Protonisierung hängt von dem pH-Wert der Umgebung ab. Auch die Salze derartiger Konjugate können angewandt werden, y ist vorzugsweise eine Brückengruppe mit einem Molekulargewicht von <2000, besonders <200, und enthält besonders 1 bis 10 Kohlenstoff atome und/oder Heteroatome.

Die Synthese derartiger Verbindungen kann auf eine Vielzahl von Arten erreicht werden. Es ist möglich, daß die Synthesewege, die schematisch unten angegeben sind, vorteilhaft angewandt werden zur Herstellung der geeigneten Verbindungen. Bei den gezeigten Synthesen sind die Stellungen an dem Adeninringsystem entsprechend der folgenden Formel angegeben:

NH₂

Rib	ist	die Ribosegruppe:	H	H
		-H2C /Ov	OH OH
		H	die phosphatierte Ribosegruppe -Η'ϊ/Ο\|
			rc fl
Rib'	ist	H

Außerdem werden die folgenden Abkürzungen angewandt:

IO

OH POf

Ph ist eine Phosphatgruppe:

AP-Derivate bezeichnen Derivate von Adenosin-5'-phosphat, d. h. die Mono- (AMP), Di- (ADP) oder Tri-(ATP) phosphatform;

NAD-Derivat bezeichnet ein Derivat von entweder Nicotinamidadenindinucleotid oder einer reduzierten Form davon;
NADP-Derivat bezeichnet ein Derivat von entweder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat oder einer reduzierten Form davon;

R bezeichnet eine spezifisch bindende Substanz oder eine Modifikation davon und
X bezeichnet eine austretende Gruppe, üblicherweise ein Halogenatom.

1-Derivat von AP
NH₂

NH₂ NH₂

Ä,»,_y,e„,_mi.

pH6,o_;6Oh

—(CH₂)2—NH₂

N_xA Ν®— (CH₂J₂- NHR

⁰I⁰J

HO —Rib

Adenosin

HO —Rib HO —Rib

NH₂

Phosphorsäure/

Carbonyl-

diimidazol

POCl₃ZH₂O')
(CH₂CH₂O)₃PO'

NH₂

N⁸WCHj)₂-NHR

H—Ph— Rib

AMP-Derivat Pyrophosphorsäure/

Carbonyl-

diimidazol²)

H-(Ph)₂-RJb

ADP-Derivat

NH₂

— (CHj)₂- NHR

') Guilford, H., et al., Chemica Scripte 2 :165 (1972).
²) Trayer, I. P., et al., Biochem. J. 1939 :609 (1974).

H—(Ph)₃- Rib

ADP-Derivat

27

1-Derivat von NAD

NH₂ NH₂

,^C0NH2 I CONH₂

^e— (CH₂J₂-OH

^N ^nA_nV pH 6,0; 60 h k_N > XnA^

Rib -Ph -Ph -Rib _R[_b_p_h_p_h__R!_b

NAD

NH₂ CONH₂ RC0.H ' - ,._■ -'-(CHa-CO₂R

Carbodiimid

NN^ \n^AN

Rib — Ph — Ph — Rib

NAD-Derivat ³) Windmueller, H. G., und Kaplan, N.O., J. Biol. Chem. 236:2716 (1961).

1-Derivat von NADP

NH₂ NH₂

CONH₂ I CONH, I

/\y /Nn/n JCH₂CO₂H⁴) /\y /NsAn^-CH₂-CO₂H

IS ι ie ι

Rib — Ph — Ph — Rib' Rib — Ph — Ph — Rib'

NADP

NH₂

CONH₂

» — CH₂-CONHR

^TT- O

(o/ <(oYoJ

Carbodiimid

Rib — Ph — Ph — Rib'

NADP-Derivat ⁴) Lowe, C. R. und Mosbach, K., Eur. J. Biochem. 49 :511 (1974).

2-Derivat von AP

O Cl NH₂

ci—< ΟΙΟ I Ci^oTo

X_nA_n

O Cl Cl

Harnsäure

NH₂ NH₂

- ci-< OiOl _HEU

\°ϊ°1

NHR NHR

NH₂ NH₂

χτ Axt 1) or-Chlor-triacetyl- _XT /L_x,

I NHR I NHR

Ag HO—Rib

29

POCl₃ZH₂O⁸) _t (CH₃CH₂O)₃PO

NHR

H-(Ph)₃-RIb

ADP-Derivat Carbonyl-diimidazol

NHR

Η—Ph—Rib

AMP-Derivat

Pyrophosphorsäure/ Carbonyl-diimidazol⁹

NHR

H-(Ph)₃-RIb

ATP-Derivat

⁵) Acheson, R. M., An Introduction to the Chemistry of Heterocyclic Compounds, Interscience Publ. (New York 1962), S. 308

⁶) Fischer, E., Ber. 30 : 2239 (1897).

⁷) Davoll et al., J. Chem. Soc,. 967 (1948).

⁸) Guilford, H., et al., supra.

⁹) Trayer, I. P., et al., supra.

2-Derivat von NAD NH₂

NHR

Nicotinamid-

mononucleotid¹⁰)

Dicyclohexyl-

carbodiimid CONH₂

Η—Ph—Rib

AMP-Derivat

^l0) Hughes, N. Α., et al., J. Chem. Soc, 3733 (1957). 2-Derivat von NADP

NH₂

1) PCl₃") 2) Cl₂ 3) H₂O

Rib — Ph — Ph — Rib
NAD-Derivat

NHR

NHR Η —Ph—Rib

AMP-Derivat

NHR

H —Ph —Rib'

Nicotinamid-

mononucleotid")

Dicyclohexyl-

carbodiimid CONH₂

) Hughes, N. Α., et al., supra.

-N

Rib — Ph —Ph— Rib' NAD-Derivat

3-Derivat von AP NH₂

Adenin

AgOH¹⁴)

31

Äthylen-imin¹²-¹³J

26 18511	RX1	32	NH2 An 0J
NH2 /NnAn 19		\Ν/	(CH2J2-NHR
(CH2J2-NH2	<° \Ν/
1) α-Chlor-triacetyl- ribofuranosid15)	NH2 An
2JNH3/CH3OH

Ag (CH₂J₂-NHR

HO—Rib (CH₂J₂-NHR

POCl₃ZH₂O¹⁶J,

(CH₃CH₂O)₃PO

Phosphorsäure Carbonyl-diimidazol

Η—Ph—Rib (CH₂J₂-NHR AMP-Derivat

H-(Ph)₂-Rib (CH₂J₂-NHR ADP-Derivat

NH₂

Pyrophosphorsäure") Carbonyl-diimidazol H-(PhJ₃-RIb (CH₂J₂-NHR ATP-Derivat

¹²) Lister, J. H., in Advances in Heterocyclic Chemistry, ed. Kabrilzky et al., Academic Press (New York, 1966), S. 33.

¹³) Leonard, N. J., and Fujii, T. J., J. Amer. Chem. Soc. 85 : 3719 (1963).

¹⁴) Fischer, E., supra.

¹⁵) Davoll et al., supra.

¹⁶) Guilford, H., et al., supra.

¹⁷) Trayer, I. P., et al., supra.

3-Derivat von NAD

NH₂

Nicotinamid-

mononucleotid¹⁸)

Dicyclohexyl-

carbodiimid CONH₂

H— Ph — Rib (CH₂J₂-NHR AMP-Derivat

^l8) Hughes, N. A., et al., supra.

Rib — Ph-Ph—Rib (CH₂I₂ — NHR NAD-Derivat

33

34

3-Derivat von NADP NH₂

N_nAn

⁰I⁰J _N/\_N/ NH₂

I)PCl₃ ¹⁹) 2) Cl₂ 3) H₂O

°X°J

H—Ph—Rib (CH₂)Z-NHR AMP-Derivat

") Hughes, N. Α., et al., supra.

Η—Ph—Rib' (CHj)₂-NHR

NH₂

CONH₂

Nv/XN

Nicotinamid-

mononucleotid¹⁹) ₍ ι ^
Dicyclohexylcarbodiimid Ve "ι ie

Rib — Ph — Ph — Rib' (CHi)₂-NHR NAD-Derivat

6-Derivat von AP

NH-(CHj)₆-NH₂

v_N/\_N

Ή—Ph—Rib

20)

RX

X^⁰X⁰J X_nA_n/

H—Ph—Rib

AMP-Derivat

--NHR

Phosphorsäure

Carbonyl-diimidazol

NH-(CH₂)₆—NHR

<°X°J

X_nA_n/

H-(Ph)₂-RIb

ADP-Derivat

Pyrophosphorsäure 21) Carbonyl-diimidazol

X_nA_n/

NH-(CH₂)₆—NHR

H-(Ph)₃-RIb

ATP-Derivat

²⁰) Guilford, H., et al., supra.

²¹) Trayer, I. P., et al., supra.

35

6-Derivat von NAD

NH₂

CONH₂ I NH₂

/N_nAn CONH₂

< ΟΙΟ I v_t. , · -η, /\/ /Νχ/^Ν®—(CH₂J₂-NH₂

XnAw/ Athylen-imin'"). /χ/

Rib—Ph-Ph—Rib j

pH 6.0; 3d

Rib —Ph—Ph—Rib

NAD

NH₂

CONH₂ I

Na,S.O.°, , (Y ,^λ^-Κ^-ηη, NH-(CH^-NH₁

pH 8.0; 45 min \_N/ XnA_n/ CONH₂

Rib—Ph—Ph —Rib ~75^CMh

Rib—Ph—Ph—Rib

NH-(CHj)₂-NH₂ CONH₂

Alcohol-dehydrogenase. | ,-.

CH₃CHO

Γ ι

NH-(CHj)₂-NHCOR

Carbodiimid

I I

Rib—Ph-Ph—Rib

NAD-Derivat

²²) Windmueller H. G., und Kaplan, N.O., J.Biol. Chem. 236 : 2716 (1961). 6-Derivat von NADP

NH₂ NH₂

CONH₂ I CONH₂

O O O| ° <O O

pH 6.5 : 10 d

Rib—Ph—Ph —Rib' Rib—Ph—Ph —Rib'

NADP NH-CH₂-CO₂H

CONH₂

1) Glucose-o-phosphat-dehydrogenase

2) pH 11, 70⁰C, lh *

3) Glutamat-dehydrogenase

Rib—Ph—Ph —Rib' NH-CH₂-CONHR

CONH₂

(oY <SYoT

^VN/ ^N^N/

RNH₂

\N^AN

²³) Lowe. C. R., und Mosbach, K., supra.

I I

Rib—Ph—Ph —Rib'

NADP-Derivat

37

8-Derivat von AP	Rib 24)	NH2 I
		An [p\
H3N-(CHj)nIlN^
H-(Ph)3-

38

RX RHN-(CH₂)₆—HN-< O

NH₂

Nv/AN

⁰X⁰J

N^N⁷

H-(Ph)₃-RIb

ATP-Derivat

²⁴) Trayer, I.P., et al., supra.

8-Derivat von NAD

CONH₂
O I H₂N-(CH₂)₆—NH

Ph

Ph

^2ä)

NH₂

Nw^N

οίο ι

Rib

CONH₂
O I RHN-(CH₂)₆—HN

Rib

Ph

Ph

NAD-Derivat

N_nAn ⁰I⁰J

Rib

") Lee, C-Y., et. al.. Arch. Biochem. Biophys. 163 : 561 (1974).

8-Derivat von NADP

NH,

CONH₂

Rib—Ph—Ph—Rib' NADP

1) Glucose-o-phosphat-dehydrogenase²⁷)

2) RNH; Λ

3) Glutamat-dehydrogenase

CONH
O I Br

NH₂

^N\

1

Rib—Ph —Ph —Rib'

NH₂

CONH₂

RHN

⁰JL⁰J

Rib—Ph—Ph—Rib'
NADP-Derivat

-⁶) Lee. C-Y-, et al., supra. ²⁷I Lowe. C. R. und Mosbach, R-, supra.

9-Derivat von AP

NH₂

N_nAn
⁰X⁰J

Adenin

NH₂

CH₂Cl²⁸) .N_nAn

> <oYoj Äthylen-imin²⁹)

CH₂-C O

H₂N-(CH₂),

NH

CH

RHN-(CH₂),

NII

CH

RHN-(CH₂J₂

RHN-(CH₂),

AgOH³⁰)

1) g-Chlor-triacetyl-ribofuranosid³¹) 2) NH3/CH3OH *

RHN-(CHj)₂

HO—Rib

POCl₃ZH₂O³²) _?
(CH₃CH₂O)₃Po'

RHN-(CH₂),

NH₂

H—Ph—Rib AMP-Derivat

Pyrophosphorsäure³³) Carbonvl-diimidazol

²⁸) Leonard, N.J., Fujii, T.J^ supra.

²⁹) Lister, J. H., supra.

³⁰) Fischer, E., supra.

³¹) DavolL et aL, supra.

³²) Guildford, H., et aL, supra.

³³) Trayer, I. P-, et al^ supra.

Phosphorsäure
Carbonyl-diimidazol

RHN-(CH₂),

NH₂

H-(Ph)₂-RIb
ADP-Derivat

9-Derivat von NAD

RHN-(CHz)₂

NH₂

ρ. τ ρ. ι Nicotinamid-mononucleotid³⁴^ ι ^

^n An/

Dicyclohexyl-carbodiimid

H—Ph—Rib

AMP-Derivat
³⁴) Hughes, N. Α., et al., supra.

Rib

RHN-(CHj)₂

NH₂

Rib

NAD-Derivat

9-Derivat von NADP

RHN-(CHj)₂

NH₂

2) Cl₂

3) H₂)

RHN-(CH₂J₂

Η—Ph—Rib
AMP-Derivat

³⁵) Hughes, N. Α., et al., supra.

H-Ph —Rib' RHN-(CHj)₂

Nicotinamid-mononucleotid³⁵^ If-Of Dicyclohexyl-carbodiimid \w/'

CONH₂

Rib

-Ph Ph

NADP-Derivat

Außer den obenerwähnten Verbindungen umfassen geeignete coenzymaktive Konjugate die Adenosinphosphate, an die die spezifisch bindende Substanz über die Phosphatgruppierung gebunden ist Derartige Verbindungen besitzen die folgende allgemeine Formel:

Ο^θ

O^e

NH₂

OH OH

in der R¹ ist

Ο^θ
— Ο—Ρ —O—R²

Il ο

oder

50

55

— Ο—Ρ —Ο—Ρ—Ο —R²

Il Il

ο ο

ο^θ ο^θ ο^θ

I I I

— Ο—Ρ—Ο—Ρ —Ο—Ρ —Ο —R'

ist, wobei R²= -Y-Z ist und Y eine Bindung oder eine Brückengruppe und Z ein Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner eine? Liganden ist Auch die protonisierten oder Säureformen sowie die Salzformen können angewandt werden.

Die Synthese derartiger Verbindungen kann auf verschiedene Weise erfolgen. Die im folgenden schematisch gezeigten Synthesewege können vorteilhaft zur Herstellung der geeigneten Verbindungen angewandt werdea Die oben angegebenen Abkürzungen treffen auf die folgenden Reaktionsschemata ebenfalls zu.

43 44

Derivate von AP

I)H₂N- (CH₂)„ — OH H₂N- (CH₂).- Ph — H -^ RHN-(CH₂)„—Ph —H (η= 1-10)

Adenosin-monophosphat³⁶) Carbonyl-diimidazol

RHN-(CH₂)„—(Ph)₂-RIb ADP-Derivat

³⁶) Trayer, I. P., et al., Biochem. J. 139 : 609 (1974). .

(η 1-10)

NH₂

Adenosin;monophosphat³⁷) Carbonyl-diimidazol

RHN —(CH^_n-(Ph)₃-Rib
ATP-Derivat

3) H₂N-(CH₂^-OH H₂N-(CHd₁-Ph-H ^

Adenosin /oYo"

Dicyclohexyl-carbodiimid \jm A n,

RHN-(CHz)_n-Ph-RIb ³⁷) Trayer, I.P., et al., supra. AMP-Derivat

Bei einer Diirchführungsform des erfindungsgemäßen Es ist auch möglich, daß eine oder mehrere der Verfahrens liegen die Komponenten der spezifischen Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion Bindungsreaktion, die mit dem flüssigen Medium, in dem und/oder eine oder mehrere der Komponenten der

der Iigand vermutet wird, zusammengegeben werden 55 Nachweisreaktion zusammen mit einem Träger zugege-

sollen, in flüssiger oder fester Form vor. Bei dem ben werden. Der Träger kann ein Flüssigkeitsbehälter,

bevorzugten homogenen Bestimmungssystem sind die wie ein Reagensglas oder eine Kapsel, enthaltend eine

Komponenten üblicherweise in Lösung oder in fester, in solche Komponente oder Komponenten in einem

dem flüssigen Medium leicht löslicher Form. Da das zu unteren Teil, z. B. in Form einer Flüssigkeit oder eines

untersuchende flüssige Medium üblicherweise wäßrig 60 losen Feststoffes oder eines Überzugs auf der Innenseite

ist, sind die Komponenten im allgemeinen in wasserlös- des Gefäßes sein. Der Träger kann auch die Form einer

licher Form, d. h. entweder in wäßriger Lösung oder in Matrix besitzen, die unlöslich und porös ist und

wasserlöslicher fester Form, z. B. ein Pulver oder Harz. vorzugsweise in Beziehung auf das zu untersuchende

Das Bestimmungsverfahren kann in einem Standardla- flüssige Medium absorbierend ist Eine solche Matrix

borgefäß, wie einem Reagensglas, durchgeführt werden, 65 kann in Form von saugfähigen Papieren, polymeren

wobei die Bestandteile der spezifischen Bindungsreak- Filmen, Folien, Membranen, Flächen oder Blöcken,

tion und die Komponenten des Reaktionssystems in Gelen usw. vorliegen. Bei einer solchen Form würde das

fester oder flüssiger Form zugegeben werden. Prüfmittel bzw. die Vorrichtung ein bequemes Mittel

darstellen, um das zu untersuchende flüssige Medium zur Durchführung der spezifischen Bindungsreaktion und/oder der Nachweisreaktion und zur Beobachtung der auftretenden Veränderung zusammenzubringen.

Das zu untersuchende flüssige Medium kann eine natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Flüssigkeit sein, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält und ist üblicherweise eine biologische Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die durch Verdünnung oder andere Behandlung einer solchen biologischen Flüssigkeit entsteht Biologische Flüssigkeiten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden können, umfassen Serum, Plasma, Urin und amniotische Flüssigkeit, Cerebralflüssigkeit und Spinalflüssigkeit. Andere Substanzen, wie Feststoffe, z. B. Gewebe oder Gase, können untersucht werden, indem man sie in flüssige Form überführt, z.B. durch Lösen des Feststoffes oder Gases in einer Flüssigkeit oder durch die Flüssigkeitsextraktion des Feststoffes.

Im Gegensatz zu dem bekannten homogenen Bestimmungssystem können biologische Flüssigkeiten, die Substanzen enthalten, die eine ähnliche oder identische Reagensaktivität besitzen wie diejenige der konjugierten Markierungssubstanz, auf dem Liganden untersucht werden, ohne Störung durch Hintergrundreaktionen. Endogene Hintergrund-Reagensaktivität kann leicht auf verschiedene Weise eliminiert werden. Die biologische Flüssigkeit kann behandelt werden, um die endogene Reagensaktivität selektiv zu zerstören. Eine solche Behandlung kann die Wirkung eines Klärmittels umfassen, das chemisch die endogene Aktivität zerstört und anschließende Behandlung, um die zerstörende Wirkung eines solchen Klärmittels zu inaktivieren.

Zum Beispiel kommen reagensabbauende Enzyme häufig natürlich in biologischen Flüssigkeiten vor, besonders wenn das Reagens ein Coenzym, wie NAD, NADP oder ATP ist. Es gibt viele Hemmstoffe für solche coenzymabbauenden Enzyme, z.B. Chelatierungsmittel, die so wirken, daß sie wesentliche Metallionen-Aktivatoren aus den Enzymen entfernen. Als spezielles Beispiel finden sich NAD-abbaubare Enzyme im normalen Serum und besitzen ausreichend Enzymaktivität, um im wesentlichen alle endogene NAD-Aktivität von isoliertem Serum innerhalb weniger Stunden zu entfernen. Die Abbauaktivität solcher Enzyme kann wirksam gehemmt werden durch Zugabe eines Chelatierungsmittels, wie Äthylendiamintetraessigsäure. Die Eliminierung der abbauenden Aktivität kann auch erreicht werden durch Zugabe eines spezifischen Enzymhemmstoffes. Zum Beispiel können ATP-abbauende Enzyme gehemmt werden durch Zugabe von /?y-Methylen-ATP oder «^-Methylen-ATP.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Beispiel 1

Herstellung von

Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)-purin-dinucleotid

60

2 g Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) wurden in 10 ml Wasser gelöst und 0,6 ml Äthylenimin zugetropft und der pH-Wert durch Zugabe von Im Perchlorsäure <7 gehalten. Nach vollständiger Zugabe des Äthylen- b5 imins wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt und die Reaktion bei 20 bis 25⁰C inkubiert. In Intervallen von 24 h wurden 0,6 ml Äthylenimin zugegeben und der pH-Wert erneut auf 4,5 eingestellt Nach 96 h wurde die Lösung in 10 Volumina Aceton von — 10⁰C gegossen. Das entstehende öl wurde gesammelt, mit Äther gewaschen und in ungefähr 50 ml Wasser in einem Kolben gelöst

Die entstehende Lösung wurde mit In Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 gebracht und 1 g Natriumbicarbonat zugegeben. Dann wurde 4 bis 5 min lang Stickstoff durch die Lösung geleitet und 1 g Natriumhydrosulfit zugegeben. Der Kolben wurde dicht verschlossen und 45 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde dann 15 min mit Sauerstoff behandelt und mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 11,3 gebracht Die Lösung wurde lh auf 75°C erhitzt Dann wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, 0,6 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan zugegeben und anschließend 5n Salzsäure, um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen. Zu der entstehenden Lösung ,wurden 1000 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase und 1 ml Acetaldehyd gegeben. Die Abnahme der optischen Dichte des Reaktionsgemisches wurde bei 340 nm überwacht und als keine weitere Abnahme beobachtet wurde, wurde der pH-Wert auf 3,5 eingestellt Die Lösung wurde in 10 Volumina Aceton von — 10°C gegossen. Das entstehende öl wurde abgetrennt und mit Äther gewaschen und anschließend in 10 bis 15 ml Wasser gelöst

Die entstehende Lösung wurde in eine 2,5x90-cm-Säule von Sephadex G-10 der Pharmacia AB, Uppsala, Schweden, die mit Wasser äquilibriert war, gegeben. Fraktionen von 12 ml wurden gesammelt. Die Wellenlänge der maximalen optischen Absorption im UV-Bereich und die optische Dichte bei einer derartigen Wellenlänge wurden für jede Fraktion bestimmt Außerdem wurde die optische Dichte bei 340 nm für jede Fraktion nach Reduktion mit Alkoholdehydrogenase bestimmt. Die Fraktionen, die ein optisches Absorptionsmaximum bei 264 nm besaßen und ein Verhältnis der optischen Dichte bei 340 nm zu derjenigen bei 264 nm von mehr als 0,05 wurden zusammengegeben. Die zusammengegebenen Substanzen wurden auf 15 bis 20 ml auf einem Rotationsverdampfer eingedampft und durch eine 2,5 χ 28-cm-Säule mit Dowex 1-X8 der Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, die mit Wasser äquilibriert war, gegeben. Es wurde weiteres Wasser zugegeben, um die zusammengegebenen Substanzen durch die Säule zu waschen und Fraktionen von 10 ml gesammelt. Die Fraktionen, die eine maximale optische Absorption bei 264 .im und ein Verhältnis von optischer Dichte bei 340 nm zu optischer Dichte bei 264 nm von mehr als 0,1 besaßen, wurden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Substanzen wurden durch eine 5 χ 45-cm-Säule mit Dowex 50-X2 der Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, die mit Wasser äquilibriert war, geleitet. Es wurde weiteres Wasser zugegeben und die zusammengegebenen Substanzen durch die Säule gewaschen und 20-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen mit einem Maximum der optischen Absorption bei 264 nm und einem Verhältnis der optischen Dichte bei 340 nm zu derjenigen bei 264 nm von mehr als 0,18 wurden zusammengegeben. Die zusammengegebenen Substanzen wurden auf 4 bis 5 ml eingeengt und folgendermaßen durch Elektrophorese gereinigt:

Die konzentrierten Substanzen wurden auf ein Blatt Whatman 3MM-Papier der Reeve Angel, Clifton, New Jersey, in 1 bis 2 cm breiten Streifen senkrecht zu der

Richtung des Stroms aufgebracht Das Papier wurde dann mit 0,02m Natriumphosphat bei einem pH-Wert von 6,0 behandelt Die Elektrophorese wurde nach dem Verfahren von Durrum mit hängendem Papier (Science 121,829 [1955]) 4 bis 7 h mit eirem Potentialgradienten von ungefähr 8,5 V/cm durchgeführt Die Lage des gewünschten Pyridinnucleotidderivats wurde bestimmt durch die Fluoreszens, die sich nach Besprühen eines Teststreifens des Papiers mit 03m Natriumcyanid entwickelte (J. Biol. Chem. 191,447 [1951]). Der Bereich, der das gewünschte Derivat enthielt, wurde aus dem Papier ausgeschnitten und mit 3 χ 50 ml Wasser extrahiert Die entstehenden Auszüge, enthaltend

Nico tin amid-6-(2-aminoäthylamino)purindinucleotid
wurden zusammengegeben, auf 3 bis 4 ml eingeengt und bei-20° C gelagert

Beispiel 2

Herstellung von Nicotinamidadenindinucleotid-Biotin-Konjugat

16 mg Biotin wurden in ι ml Wasser, enthaltend 22 mg Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)purindinucleotid, entsprechend Beispiel 1, suspendiert Zur Erleichterung der Lösung des Biotins wurden einige Tropfen 0,1 η Natriumhydroxid zugegeben. Dann wurden 240 mg l-CycIohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat zu der entstehenden Lösung zugegeben und durch Zutropfen von O₁In Salzsäure in Lösung gebracht Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann in 10 ml Aceton von — 10⁰C gegossen. Das entstehende Öl wurde abgetrennt, 2 χ mit 5 bis 10 ml Äther gewaschen und in 1 bis 2 ml Wasser gelöst. Die entstehende Substanz wurde durch Elektrophorese auf Papier, entsprechend Beispiel 1, gereinigt. Es erschienen zwei Fluoreszensbänder nach Besprühen mit Natriumcyanid. Das eine wanderte gegen die Kathode und das andere gegen die Anode. Das zuletzt genannte enthielt das NAD-Biotin-Konjugat und wurde mit Wasser eluiert und bei -20° C gelagert.

Beispiel 3

Herstellung von

Nicotinamidadenindinucleotid-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat

26 mg Natriumbicarbonat wurden in 1,5 ml Wasser, enthaltend 23 mg Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)purindinudeotid, entsprechend Beispiel 1, gelöst Zu der entstehenden Lösung wurden 3 ml Äthanol, enthaltend 17 μΐ 2,4-Dinitrofluorbenzol gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h in der Dunkelheit bei Raumtemperatur gerührt und anschließend 45 ml Aceton von — 10⁰C zugegeben. Der entstehende Niederschlag wurde abgetrennt, 2 χ mit 10 ml Aceton gewaschen und mit 5 ml Wasser gerührt Die gelbe lösliche Substanz, die sich abschied, wurde durch Elektrophorese auf Papier, entsprechend Beispiel 1,5 h gereinigt Das gegen die Anode wandernde Band, das das NAD-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat enthielt, wurde mit Wasser eluiert, auf 3 bis 5 ml eingeengt und bei -20° C gelagert

Beispiel 4
Herstellung von Biotin-Umbelliferon-Konjugat

Es wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt durch Lösen von 100 mg Umbelliferon, 167 mg Biotin und 141mg Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dimethylformamid. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 4 h bei -18° C inkubiert und über Nacht bei 7° C und 3 bis 4 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurden weitere 141 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch 3 bis 4 h bei 7° C gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen. Zu dem Filtrat wurden 75 ml Eiswasser gegeben und das entstehende Gemisch 1 h bei O⁰C inkubiert. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 3 bis 4 ml Methylenchlorid gelöst. Zu der entstehenden Lösung wurden 5 ml Diäthyläther gegeben. Der entstehende Niederschlag, der das Biotin-Umbelligeron-Konjugat enthielt, wurde abfiltriert, getrocknet und bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Beispiel 5

Wirkung von Avidin und Biotin auf die
enzymatischeCyclisierungsgeschwindigkeit
von NAD- und NAD-Biotin-Konjugaten

Das in diesem Beispiel angewandte cyclische Reaktionssystem beruhte auf den folgenden Reaktionen:

(a) NAD-Ligand + Lactat ——_> NADH-Ligand + Pyruvat

dehydrogenase

(b) NADH-Ligand + Thiazolyl-blau (oxidiert) NAD-Ligand + Thiazolyl-blau (reduziert)

Acht spezifisch bindende Reaktionsgemische wurden hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,5 ml und enthaltend 0,12m N,N-Bis-2-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8 und die in Tabelle I angegebenen Konzentrationen und Aktivitäten an NAD, NAD-Biotin-Konjugat, entsprechend Beispiel 2, Biotin und Avidin, wobei das zuletzt genannte eine Affinität zur Bindung von Biotin besitzt. Eine Einheit Avidinaktivität ist die Menge Avidin, die imstande ist, 1 μg Biotin zu binden. Die Reaktionsgemische wurden 2 bis 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit einem wäßrigen Enzym/Substrat-Gemisch durch Zugabe von 0,1 ml Im Lithiumlactat, 0,05 ml 10mm Thiazolylblau in oxidierter Form und einer ausreichenden Menge 0,12m N,N-Bis-2-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, enthaltend 0,38 internationale Einheiten Rinderherz-Milchsäuredehydrogenase und 1,5 internationale Einheiten Schweineherzdiaphorase, zusammengebracht und ein Gesamtreaktionsvolumen von 1 ml erhalten. Die relative Bildungsgeschwindigkeit der reduzierten Form von Thiazolylblau wurde dann in jedem der Reaktionsgemi-

sehe bestimmt durch Messung der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedem der Gemische bei 570 nm während 24 min innerhalb der ersten Stunde nach

Tabelle I

Zugabe des Enzym/Substrat-Gemisches. Das gesamte Verfahren wurde doppelt durchgeführt und das Mittel der Ergebnisse ist in Tabelle I angegeben.

Reaktion

Konzentration von
NAD

(nm)

Konzentration von

NAD-Biotin-

Konjugat

(nm)

Konzentration von
Biotin

(nm) Avidin-Aktivität

(Einheiten)

Mittlere Zunahme
der optischen
Dichte

(570 nm)

1
2
3
4
5
6
7
8

220

220

360

360
360

360

360

Die Reaktionen 1', 4 und 8 waren Vergleiche und zeigen, daß bei Abwesenheit von NAD und dem NAD-Biotin-Konjugat im wesentlichen keine Cyclisierung eintrat. Die Ergebnisse der Reaktionen 2 und 3 zeigen, daß das NAD-Biotin-Konjugat eine wesentliche Coenzymaktivität besitzt gegenüber ursprünglichem (nativem) NAD. Aus den Ergebnissen der Reaktionen 3 und 6 kann man sehen, daß das Vorhandensein von Avidin in dem Reaktionsgemisch die Bildung von Thiazolylblau (reduzierte Form) hemmt, wenn das vorhandene NAD mit Biotin konjugiert ist. Bei einem Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 6 und 7 kann man sehen, daß das Vorhandensein von freiem Biotin die Hemmung der Thiazolylblau-(reduzierte Form)-Bildung im Verhältnis zu der Konzentration von Biotin im Reaktionsgemisch verringert

In diesem Beispiel wurde damit gezeigt, daß die Aktivität des NAD in dem NAD-Biotin-Konjugat relativ zu dem cyclischen Reaktionssystem abnahm in Gegenwart von Avidin und daß die Stärke dieser Abnahme der Aktivität verringert wurde durch das zusätzliche Vorhandensein von Biotin.

Beispiel 6

Direkte Bindungs-Cyclisierungs-Bestimmung

von Avidin; Wirkung von unterschiedlichen Gehalten an Avidin auf die Cyclisierungsgeschwindigkeit

Das in diesem Beispiel angewandte cyclische Reaktionssystem war das gleiche wie in Beispiel 5 ausgeführt Sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische wurden hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,6 ml und jeweils enthaltend 0,12m N,N-Bis-2-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, und 250 nm NAD-Biotin-Konjugat, entsprechend Beispiel 2. Sechs der Reaktionsgemische enthielten auch Avidin in den in Tabelle II angegebenen Mengen.

Die Reaktionsgemische wurden 2 bis 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit einem wäßrigen Enzym/Substrat-Gemisch zusammengebracht durch Zugabe von 0,1 ml Im Lithiumlactat, 0,05 ml 10mm Thiazolylblau in oxidierter Form und eine ausreichende Menge 0,12m N,N-Bis-2-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, enthaltend 0,38 internationale Einheiten Rinderherz-Milchsäuredehydrogenase und 1,5 internationale Einheiten

45

50

55

60 0,11
0,11
0,11
0,11

0,002
0,103
0,079
0,003
0,103
0,025
0,069
0,001

Schweineherz-diaphorase, um ein gesamtes Reaktionsvolumen von 1 ml zu erhalten. Die relative Bildungsgeschwindigkeit der reduzierten Form von Thiazolylblau wurde dann in jedem der Reaktionsgemische bestimmt durch Messung der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedem der Reaktionsgemische bei 570 nm 24 min lang während der ersten Stunde nach Zugabe des Enzym/Substrat-Gemisches. Das Verhältnis, ausgedrückt als %, der Änderung der optischen Dichte in jedem Reaktionsgemisch, enthaltend Avidin, zu derjenigen des Reaktionsgemisches, das kein Avidin enthielt, wurde berechnet und ist in Tabelle II und F i g. 1 als relative Cyclisierungsgeschwindigkeit angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle II und in graphischer Form in F i g. 1 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle II	Zugesetzte	Relative Cycli
Reaktions	Avidinmenge	sierungsgeschwin
gemisch		digkeit
	(Einheiten)	(%)
	0,000	100
1	0,005	96
2	0,010	93
3	0,045	84
4	0,090	68
5	0,120	51
6	0,180	8
7

In diesem Beispiel konnte gezeigt werden, daß die relative Cyclisierungsgeschwindigkeit des cyclischen Reaktionssystems und damit die Aktivität des NAD in dem NAD-Biotin-Konjugat eine umgekehrte Funktion ist der in dem spezifischen bindenden Reaktionsgemisch enthaltenen Avidinmenge.

Beispiel 7

Konkurrenz-Bindungs-Cyclisierungs-Bestimmung

für Biotin; Wirkung unterschiedlicher Gehalte an

Biotin auf die Cyclisierungsgeschwindigkeit

Das in diesem Beispiel angewandte Cyclisierungsreaktionüsystem war das gleiche, wie in Beispiel 5

angegeben. Sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische wurden hergestellt jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,45 ml und jeweils enthaltend 0,12m

N.N-Bis-i-hydroxyä&ylglyciiAydrocUorid-Puffer,
pH 7,8, und 180 nm NAD-Biotin-Konjugat, entsprechend Beispiel 2. Sechs der Reaktionsgemische, d. h. die Nummern 1 bis 6 in Tabelle III, enthielten zusätzlich 0,11 Einheiten Avidin. Fünf der sechs Avidin enthaltenden Reatkionsgemische enthielten auch Biotin in den in Tabelle IH angegebenen Konzentrationen, d.h. die Gemische 2 bis 6 in Tabelle III.

Die Reaktionsgemische wurden 2 bis 3 h bei Raumtemperatur inkubiert Jedes der Reaktionsgemische wurde mit einem wäßrigen Enzym/Substrat-Gemisch zusammengebracht durch Zugabe von 0,1 ml Im Lithiumlactat, 0,05 ml 10mm Thiazolylblau in oxidierter Form und einer ausreichenden Menge 0,12m N,N-Bis-2-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, enthaltend 038 internationale Einheiten Riiülerherz-Milchsäure-Dehydrogenase und 1,5 internationale Einheiten Schweineherz-Diaphorase auf ein Gesamt-Reaktionsvolumen von 1 mL Die relative Bildungsgeschwindigkeit der reduzierten Form von Thiazolylblau wurde dann in jedem der Reaktionsgemische bestimmt durch Messung der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedem der Gemische bei 570 nm innerhalb von 24 min in der ersten Stunde nach der Zugabe des Enzym/Substrat-Gemisches. Das Verhältnis, ausgedrückt in % dieser Änderung der optischen Dichte, in jedem Reaktionsgemisch, enthaltend Biotin, zu derjenigen in dem Reaktionsgemisch, das weder Biotin noch Avidin enthielt, wurde berechnet und ist in Tabelle III und Fig.2 als relative Cyclisierungsgeschwindigkeit angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle III und in graphischer Form in F i g. 2 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle III

Reaktionsgemisch

Biotin-Konzentration

(nm)

Relative Cyclisierungsgeschwin
digkeit

Tabelle IV

80

160

22
35

Reaktionsgemisch

Biotin-Konzentration

(mn)

Reiative Cyclisierungsgeschwin
digkeit

4
5
6

320
400
800

63
80
92

In diesem Beispiel konnte gezeigt werden, daß die relative Cyclisierungsgeschwindigkeit des Reaktionssystems und damit die Aktivität des NAD in dem NAD-Biotin-Konjugat eine direkte Funktion war der in dem spezifisch bindenden Reaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge.

Beispiel 8

Direktes Bindungs-Cyclisierungsverfahren zur

Bestimmung von Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl

und Derivaten davon

Das Cyclisierungs-Reaktionssystem in diesem Beispiel war das gleiche, wie in Beispiel 5 angegeben. Acht spezifisch bindende Reaktionsgemische von jeweils 0,6 ml wurden hergestellt, jeweils enthaltend 0,12m N.N-Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, und die in Tabelle IV angegebenen Mengen und Konzentrationen an NAD, NAD-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat, entsprechend Beispiel 3, Antiserum zu 2,4-Dinitrophenyl und Nicotinamidmononucleotid (NMN). Die Reaktionsgemische wurden 3 bis 4 h bei Raumtemperatur inkubiert Jedes Reaktionsgemisch wurde mit einem wäßrigen EnzynVSubstrat-Gemisch zusammengebracht durch Zugabe von 0,1 ml Im Lithiumlactat, 0,05 ml 10mm Thiazolylblau in oxidierter Form und einer ausreichenden Menge 0,12m N,N-Bishydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, enthaltend 0,38 internationale Einheiten Rinderherz-Milchsäuredehydrogenase und 1,5 internationale Einheiten Schweineherz-Diaphorase, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 1 ml zu erhalten. Die relative Geschwindigkeit der Bildung der reduzierten Form von Thiazolylblau wurde in jedem der Reaktionsgemische bestimmt durch Messung der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedem Reaktionsgemisch bei 570 nm innerhalb von 24 min während der ersten Stunde nach Zugabe des Enzym/Substrat Gemisches. Das gesamte Verfahren wurde doppelt durchgeführt und die Mittelwerte sind in

so Tabelle IV angegeben.

Reaktion NAD-Konzentration

(μτη)

NAD-2,4-dinitrophenyl-Konjugat-Konzentration

(nm)

NMN-Konzentration Antiserummenge

(μΐ)

Mittlere Zunahme
der optischen
Dichte

(570 nm)

1,75
1,75
1,75
1,75

290

290
290

100
100
100
100

0,005
0,164
0,608
0,699
0,275
0,648
0,021
0.037

Die Reaktion 1 war ein Vergleich und zeigt, daß in Abwesenheit von NAD und dem NAD-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat im wesentlichen keine Cyclisierung auftrat. Aus den Ergebnissen der Reaktion 2 geht hervor, daß das NAD-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat in dem enzymatisch en Cyclisierungssystem aktiv ist. Die Ergebnisse der Reaktionen 3 und 5 zeigen, daß das Vorhandensein von Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl die Cyclisierung von NAD hemmt. Wie aus den Ergebnissen der Reaktion 6 hervorgeht, wird eine solche Hemmung umgekehrt durch Zugabe von NMN. Aus den Ergebnissen der Reaktionen 3 und 4 kann man ersehen, daß die Cyclisierungsgeschwindigkeit in Gegenwart von NMN ungefähr 15% größer ist als in Abwesenheit dieser Substanz. Dieses Ergebnis beruht vermutlich auf der Verunreinigung durch äußeres NAD, da andere Messungen gezeigt haben, daß NMN die Cyclisierungsgeschwindigkeit in Abwesenheit von Antikörpern nicht beeinflußt. Trotzdem enthält das Antiserum eine gewisse Aktivität, bezogen auf NAD selbst, die gehemmt wird durch das Vorhandensein von NMN.

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die Aktivität des NAD in dem NAD-2,4-DinitrophenyI-Konjugat, bezogen auf das Cyclisierungsreaktionssystem, gemindert wurde in Gegenwart von Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl.

Beispiel 9

Konkurrenz-Bindungs-Cyclisierungs-Bestimmung
von 2,4-Dinitrobenzol und dessen Derivaten;

Wirkung verschiedener Gehalte an

N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat auf die

Cyclisierungsgeschwindigkeit

Das Cyclisierungsreaktionssystem, das in diesem Beispiel angewandt wurde, war das gleiche wie in Beispiel 5 angegeben. Sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische wurden hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,6 ml und jeweils enthaltend 0,12m N.N-Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, 300 nm NAD-Dinitrophenyl-Konjugat, entsprechend Beispiel 3, und 50 μπι Nicotinamidmononucleotid. Sechs der sieben Reaktionsgemische, d. h. die Gemische 1 bis 6 in Tabelle V, enthielten auch eine Menge an Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl, die ausreichte, um die Cyclisierungsgeschwindigkeit des anderen Reaktionsgemisches um 85% zu hemmen. N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat, ein Derivat von 2,4-Dinitrobenzol, das hergestellt worden war wie in Biochem. J. 42,287 (1948) beschrieben, wurde zu fünf der sechs antikörperhaltigen Reaktionsgemische zugesetzt d. h. den Gemischen 2 bis 6 in Tabelle V, in den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen.

Die Reaktionsgemische wurden ungefähr 4 h bei Raumtemperatur inkubiert Jedes Reaktionsgemisch wurde mit einem wäßrigen Enzym/Substrat-Gemisch zusammengebracht durch Zugabe von 0,1 ml Im Lithiumlactat, 0,05 ml 10mm Thiazolylblau in oxidierter Form und einer ausreichenden Menge 0,12m N,N-Bishydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,8, enthaltend 0,38 internationale Einheiten Rinderherz-Milchsäuredehydrogenase und 1,5 internationale Einheiten Schweineherzdiaphorase, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erhalten. Die relative Bildungsgeschwindigkeit der reduzierten Form von Thiazolylblau wurde in jedem

ίο der Reaktionsgemische bestimmt durch Messung der Gesamtänderung der optischen Dichte in jedem der Gemische bei 570 nm innerhalb der ersten 24 Minuten während der ersten Stunde nach Zugabe des Enzym/ Substrat-Gemisches. Das Verhältnis, ausgedrückt in %,

dieser Änderung der optischen Dichte in jedem Reaktionsgemisch, enthaltend N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat zu derjenigen des Reaktionsgemisches. enthaltend weder N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat noch Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl, wurde berechnet und ist in Tabelle V und F i g. 3 als relative Cyclisierungsgeschwindigkeit angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle V und in graphischer Form in F i g. 3 der Zeichnungen angegeben.

25 Tabelle V Reaktionsgemisch

35 N-<2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat-Konzentration

(nm)

Relative Cyclisierungsgeschwin
digkeit

17

42

83

166

415

16
19
30
35
41
76

40

45

50

55 Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daB die relative Cyclisierungsgeschwindigkeit des Cyclisierungsreaktionssystems und damit die Aktivität des NAD in dem NAD-Dinitrophenyl-Konjugat eine direkte Funktion war der Menge an N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat, die in dem spezifischen Bindungsreaktionsgemisch vorhanden war.

Beispiel 10

Direktes

Bindungs-Biolumineszenz-Bestimmungsverfahren
für Avidin; Wirkung des Vorhandenseins
von Biotin auf die Spitzenlichtintensität

Das Biolumineszenz-Reaktionssystem dieses Beispiels beruhte auf folgenden Gleichungen:

(c) NAD-Ligand + Äthanol _y NADH-Ligand + Acetaldehyd

(d) NADH-Ligand + FMN*) + H®

dehydrogenase

NADH

dehydrogenase -> NAD-Ligand + FMNH₂

(e) FMNH₂ + langkettiger Aldehyd + O₂ *) Flavinmononucleotid.

jge Säure + H₂O + hv

Eine Licht erzeugende Lösung zur Durchführung der Reaktionen (d) und (e) wurde folgendermaßen hergestellt. Ein Reagensgemisch wurde hergestellt, enthaltend 0,13m Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,67 Gew.-% Rinderserumalbumin, 15,7 μπι Flavinmononucleotid (FMN), enthaltend 13,3mm Natriumacetat, und dieses Gemisch in der Dunkelheit bei -20° C aufbewahrt. Eine Emulsion von 5 μΐ Dodecanal in 5 μΐ Wasser wurde an dem Tag hergestellt, an dem die lichtentwickelnde Lösung angewandt werden sollte. Lyophilisierte Luciferase, extrahiert aus Photobacterium fisheri (Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey) wurde zu 0,013m Phosphatpuffer, pH 7,3, bis zu einer Konzentration von 20 mg/ml zugegeben. Nach 30 min wurde die entstehende Suspension mit 1500 g 10 min zentrifugiert und die Perle verworfen. Die lichtentwickelnde Lösung wurde dann 5 min vor Anwendung hergestellt durch Zusammengeben von 75 μΐ des Reagensgemisches, 5 μΐ Dodecanalemulsion und 20 μΐ Luciferaselösung.

Um das durch die Reaktion (b) gebildete Licht nachzuweisen, wurde ein Photometer konstruiert, bestehend aus einem Photodetektor und einer 6x50-mm-Küvette in einer lichtintegrierenden Kugel, so daß das in der Küvette gebildete Licht auf den Photodetektor reflektiert wurde. Das durch den Photodetektor gebildete elektronische Signal wurde auf einen Streifenrecorder übertragen. Die Spitzenlichtintensität, wie der Ausdruck hier verwendet wird, wurde

aus der Kurve des Schreibers bestimmt und in willkürliche Einheiten entsprechend den Teilungen des Papiers bezeichnet.

Es wurden neun verschiedene spezifische Bindungs-Reaktionsgemische hergestellt mit jeweils einem Gesamtvolumen von 0,2 ml und jeweils enthaltend 0,1m Tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0,0,01m Semicarbazidhydrochlorid und jeweils die Mengen oder Konzentrationen, die in Tabelle VI angegeben sind an Äthanol, NAD, NAD-Biotin-Konjugat entsprechend Beispiel 2, Biotin und Avidin. Die Reaktionsgemische wurden 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 0,025 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase zu jedem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reduktionsreaktion einzuleiten. Semicarbazid reagierte mit dem Acetaldehyd, der in Reaktion (c) entstand unter Bildung eines Semicarbazone und führte damit die Reaktion (c) in die gewünschte Richtung.

Die Reaktionsgemische wurden ungefähr 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. 10 μΐ jedes Reaktionsgemisches wurden dann in eine einzelne Küvette eingespritzt, die in dem oben beschriebenen Photometer angebracht war und 100 μΐ der vorher hergestellten lichterzeugenden Lösung enthielt, die vorher 2 bis 3 min bei 28⁰C inkubiert worden war. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI	Äthanolkonzen-	NAD-Konzen-	NAD-Biotin-	Biotinkonzen-	Avidinaktivität	Spitzenlicht-
Reaktion	traüon	tration	Konjugat-Kon-	tration		intensität
			zentration
	(m)	(nm)	(nm)	(nm)	(Einheiten)
	—	375	_	—	_	2
1	0,6	375	-	-	-	136
2	0,6	375	-	-	0,054	140
3	-	-	343	-	-	2
4	0,6	-	343	-	-	56
5	0,6	-	343	-	0,054	15
6	-	-	343	200	0,054	5
7	0,6	-	343	200	0,054	32
8	0,6	-	343	200	—	52
9

Die Reaktionen 1, 4 und 7 waren Vergleiche und zeigen, daß in Abwesenheit von Äthanol im wesentlichen keine Reaktion eintrat. Die Ergebnisse der Reaktion 5 zeigen, daß das NAD-Biotin-Konjugat in dem Biolumineszens-Reaktiohssystern aktiv ist Aus den Ergebnissen der Reaktionen 5 und 6 kann man sehen, daß das Vorhandensein von Avidin in dem Reaktionsgemisch die Menge an entstehendem Licht hemmt. Aus einem Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 6 und 8 sieht man, daß das Vorhandensein von freiem Biotin die Lichtbildung hemmt mit zunehmender Konzentration an Biotin in dem Reaktionsgemisch. Die Reaktionen 2 und 3 zeigen, daß Avidin die Aktivität von freiem NAD nicht hemmt und die Reaktionen 5 und 9 zeigen, daß das Vorhandensein von Biotin allein die Aktivität des N AD-Biotin-Konjugats nicht angreift.

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die Aktivität des NAD in dem NAD-Biotin-Konjugat, bezogen auf das Biolumineszensreaktionssystem, abnahm in Gegenwart von Avidin und daß die Stärke dieser Abnahme der Aktivität verringert wurde durch das zusätzliche Vorhandensein von Biotin.

Beispiel 11

" Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszenz-Bestimmung von Biotin; Wirkung unterschiedlicher Gehalte von Biotin auf die Spitzenlichtintensität

Das in diesem Beispiel angewandte Biolumineszenz-Reaktionssystem war das gleiche wie im Beispiel 10 angegeben. Es wurden sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,2 ml und jeweils enthaltend 0,1m Tris-(hydroxymethyl)-aniinomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, 0,6m Äthanol, 0,01m Semicarbazidhydrochlorid, 343 nm NAD-Biotin-Konjugat entsprechend Beispiel 2, 0,025 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase und 0,055 Einheiten Avidin. Biotin wurde zu sechs der

sieben Reaktionsgemische, und zwar die Nummern 2 bis 7 in Tabelle VII, in den dort angegebenen Konzentrationen zugegeben. Die Reihenfolge und Art der Zugabe war die gleiche wie in Beispiel 10 angegeben.

Die Reaktionsgemische wurden ungefähr 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Jeweils 10 μΐ jedes Reaktionsgemisches wurden in eine einzelne Küvette injiziert, die in dem in Beispiel 10 beschriebenen Photometer angebracht war und 100 μΐ einer lichterzeugenden Lösung, die entsprechend Beispiel 10 hergestellt und 2 bis 3 min bei 28° C inkubiert worden war, enthielt. Das gesamte Verfahren wurde doppelt durchgeführt und die mittleren Ergebnisse sind in Tabelle VII und in graphischer Form in Fig.4 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle VII

Reaktionsgemisch

Biotin-Konzentration

(nm)

Mittlere Spitzenlichtintensität

or

25
50
100
150
200
300

36
44
57
79
90
97
104

HN NH

Ο—C— (CHi)₄-

Umbelliferon-Biotin-Konjugat
(maximale Fluoreszens bei 378 nm)

10

15

25

Tabelle VIII in den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen zugegeben und zu jedem der sechs Reaktionsgemische wurde auch eine Menge an Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl zugegeben, die ausreichte, um die Spitzenlichtintensität auf 39% derjenigen herabzusetzen, die in Abwesenheit von N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat und Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl gebildet wurde.

Die Reaktionsgemische wurden 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 0,025 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, um die Reduktionsreaktion einzuleiten. Die Reaktionsgemische wurden dann ungefähr 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden jeweils 10 μΐ jedes Reaktionsgemisches in eine einzelne Küvette injiziert, die in dem in Beispiel 10 beschriebenen Photometer angebracht war, enthaltend 100 μΐ einer lichterzeugenden Lösung, die entsprechend Beispiel 10 hergestellt worden war und vorher 2 bis 3 min bei 28° C inkubiert worden war. Das gesamte Verfahren wurde zweimal durchgeführt und das Mittel der Ergebnisse ist in Tabelle VIII und in graphischer Form in F i g. 5 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle VIII

Reaktionsgemisch

30

40

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die Stärke der Spitzenlichtintensität, die durch das Biolumineszensreaktionssystem erzeugt wurde und damit die Aktivität des NAD in dem NAD-Biotin-Konjugat eine direkte Funktion war der in dem spezifischen Bindungs-Reaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge.

Beispiel 12

Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszenz-Bestimmung
von 2,4-Dinitrobenzol und dessen Derivaten;

Wirkung verschiedener Gehalte an

N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat auf die

Spitzenlichtintensität

Das in diesem Beispiel angewandte Biolumineszenz-Reaktionssystem war das gleiche, wie in Beispiel 10 angegeben. Es wurden sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,1 ml und jeweils enthaltend 0,1m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, so 0,01m Sernicarbazidhydrochlorid 0.6m Äthanol. 35 μπι Nicotinamidmononucleotid und 367 nm NAD-Dinitrophenyl-Konjugat, entsprechend Beispiel 3. N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat wurde zu sechs von sieben Reaktionsgemischen, nämlich die Nummern 2 bis 7 in

N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat-Konzentration

(μπι)

Mittl. Spitzenlichtintensität

0,00

0,125

0,25

0,50

0,75

1,00

1,50

14 17 20 22 24 27 28

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die Stärke der Spitzenlichtintensität, die durch das Biolumineszenzreaktionssystem gebildet wurde und damit die Aktivität des NAD in dem NAD-2,4-Dinitrophenyl-Konjugat eine direkte Funktion ist der Menge an N-(2,4-Dinitrophenyl)-6-aminocaproat in der spezifischen Bindungsreaktion.

Beispiel 13

Spezifische Bindungsbestimmung für Bioiin und Avidin unier Anwendung eines Enzymsubstrats als Markierungssubstanz

Das spezifische Bindungs-Bestimmungssystem dieses Beispiels beruhte auf der folgenden Reaktion:

Esterase

O Ο^θ

ν°νΛ

H₂O, PH 8,0 I Jl J + Η® + Biotin

(maximale Fluoreszens bei 448 nm)

Es wurden zehn verschiedene Bindungs-Reaktionssysteme hergestellt, jeweils in einem Gesamtvolumen von 0,3 ml und jeweils enthaltend 0,1m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, und die in Tabelle IX angegebenen Mengen oder Konzentrationen an Umbelliferon-Biotin-Konjugat entsprechend Beispiel 4, Biotin und Avidin. Die Reaktionsgemische wurden 1 bis 3 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsgemische 2 bis 10 in Tabelle IX enthielten auch 0,26 internationale Einheiten Rinderleber-carboxylat-hydrolase (Esterase). Die relative Reaktionsgeschwindigkeit in jedem der Reaktionsgemische wurde dann bestimmt durch Überwachung der jeweils entstehenden Fluoreszens bei 448 nm mit einem Fluorometer, Modell 111 Turner (G. K. Turner Assoc, 2524 Pulgas Street, PaIo Alto, California), das eingestellt war auf eine Anregung bei 364 nm. Das durch das Fluorometer erzeugte elektronische Signal wurde auf einen Papierstreifenschreiber übertragen und die pro min erzeugte Fluoreszens aus der Schreiberkurve gemessen und in willkürlichen Einheiten auf der Grundlage der Papiereinteilung bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX angegeben.

Tabelle IX	Esterase	Umbelliferon-Biotin-	Biotin-Konzentration	Avidin-Aktivität	Äderung der
Reaktion		Konjugat-Konzen-			Fluoreszens je min.
		tration
	(I.E.)	(nm)	(nm)	(Einheiten)
	_	730	_	_	0,000
1	0,26	365	-	-	0,077
2	0,26	730	-	-	0,145
3	0,26	730	-	0,0022	0,103
4	0,26	730	-	0,022	0,058
5	0,26	730	-	0,055	0,000
6	0,26	730	-	0,033	0,027
7	0,26	730	-	0,033	0,026
8	0,26	730	670	0,033	0,057
9	0,26	730	1340	0,033	0,115
10

Die Reaktion 1 war ein Vergleich und zeigte, daß in Abwesenheit von Esterase keine Reaktion eintritt. Die Ergebnisse der Reaktionen 2 und 3 zeigen, daß das Umbelliferon-Biotin-Konjugat in der enzymatischen Reaktion wirksam ist und ein Vergleich der Ergebnisse mit denjenigen der Reaktionen 4 bis 8 zeigt, daß das Vorhandensein von Avidin die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zu der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Avidinmenge hemmt Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 8, 9 und 10 zeigt, daß die Stärke der Hemmung der Reaktionsgeschwindigkeit durch Avidin eine direkte Funktion ist der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge.

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die Geschwindigkeit der durch die Esterasereaktion erzeugten Fluoreszenz und damit die Substrataktivität des Umbelliferon-Biotin-Konjugats herabgesetzt wurde durch das Vorhandensein von Avidin und daß die Stärke dieser Aktivitätsverminderung verringert wurde durch das Vorhandensein von Biotin.

Beispiel 14

Herstellung von
2,4-Dinitrophenyl-Fluorscein-KonjugaL

Fluorescein-3',6'-bis-[6-(2,4-dinitroanüino)hexanoat]

Eine Lösung von 1,5 g (5 mMol) 6-(2,4-Dinitroanilino)-hexansäure wurde durch 15 min lange Umsetzung mit 10 ml warmem Thionylchlorid und anschließendes Kühlen und Verdünnen mit 20 ml Hexan in das Säurechlorid umgewandelt. Das entstehende feste Säurechlorid wurde abfiltriert und nach sorgfältigem Trocknen zu 600 mg Dinatriumsalz von Fluorescein in 10 ml trockenem Aceton gegeben. Nach 5 h langem Sieden unter Rückfluß wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml Wasser und 5 ml Aceton abgebrochen.

Nach 30 min bei 25° C wurde das Gemisch zur Trockene eingedampft und der Rückstand zwischen Äthylacetat und wäßriger Natriumbicarbonatlösung verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit l°/oiger wäßriger Schwefelsäure gewaschen, über wasserfreiem

so Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft Das rote Ol wurde über 60 g Silicagel 60 (E. Merck, Darmstadt) mit 2ö% Aceton in Tetrachiorkohienstoff als Eiuens Chromatographien. Die 1,2 g unreiner Bis-ester wurden erneut über 60 g Silicagel mit Hilfe von 10% Aceton in Tetrachlorkohlenstoff Chromatographien. Die entsprechenden Fraktionen wurden zusammengegeben und eingedampft, wobei man 180 mg eines gelben glasartigen Feststoffes erhielt

Analyse

Die Synthese umfaßte grundsätzlich die Umsetzung des Säurechlorids von 6-(2,4-Dinitroanilino)hexansäure mit dem Dinatriumsalz von Fluorescein. 6-(2,4-Dinitroanilino)hexansäure wurde nach dem in Biochem. J. 42, 287—94 (1948) angegebenen Verfahren hergestellt

Berechnet für

C₄₄H₃₈N₆O₁₅

Gefunden

59,33
60,92

4,30
4,35

9,43
6,65

Das Infrarot-Spektrum zeigte die erwartete Ester-Carbonyl-Streckabsorption bei 1765 cm-'.

61 62

Beispiel 15

Spezifische Bindungsverfahren für Derivate von 2,4-Dinitrophenyl und Antikörpern dazu unter Verwendung eines Enzymsubstrats (modifiziertes Fluorescein) als Markierungssubstanz

Das in diesem Beispiel angewandte spezifische Bindungs-Bestimmungs-System beruht auf der folgenden Reaktion.

2,4-Dinitrophenyl-fluorescein-Konjugat

O^{e Θ}Ο

Esterase

H₂O, pH 7,0

+ andere Produkte

(maximale Fluorescens bei 510 nm)

O₂N

A. Direkte Bindungs-Fluoreszenz-Bestimmung von
Antikörper zu 2,4-Dinitrophenyl; Wirkung

verschiedener Gehalte an
Antikörper auf die Reaktionsgeschwindigkeit

Es wurden sieben spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt und analysiert. Für jedes Reaktionsgemisch wurden 20 μΐ 1 μιτι 2,4-Dinitrophenyl-Fluorescein-Konjugat (entsprechend Beispiel 14) in Dimethylsulfoxid mit einem Volumen-Antiserum zu 2,4-Dinkrophenyl, wie in Tabelle X angegeben, und mit einem ausreichenden Volumen 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,0 um ein Gesamtvolumen von 2,0 ml zu erhalten, zusammengegeben. Die Hintergrundhydrolysegeschwindigkeit für die Esterbindungen in dem Konjugat wurde 3 min für jedes Reaktionsgemisch durch Bestimmung der Geschwindigkeit der Zunahme der Fluoreszenzintensität bei 510 nm nach dem allgemeinen in Beispiel 13 beschriebenen Verfahren bestimmt mit einem Fluorometer, das ausgelegt war für eine Anregung bei 470 nm. 10 μΐ 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,0, enthaltend 0,54 Einheiten Esterase Typ I (E. C. Nr. 3.1.1.1 der Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) wurden zu jedem Reaktionsgemisch gegeben. Die entstehende Gesamtreaktionsgeschwindigkeit wurde auf die gleiche Weise gemessen wie die Hintergrundhydrolysegeschwindig-

keit. Die Ergebnisse sind in Tabelle X angegeben. Die Geschwindigkeit der Hintergrundhydrolyse wurde abgezogen von der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit, um die Nettoreaktionsgeschwindigkeit zu erhalten, die der esterasekatalysierten Reaktion zuzuschreiben ist. Die Beziehung zwischen der netto enzymkatalysierten Reaktionsgeschwindigkeit und der Hintergrundhydrolysegeschwindigkeit im Alkalischen und der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Serummenge ist in graphischer Form in der Fig.6 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle X	Antiserum-	Hintergrund-	Gesamt-
Reaktions	menge	hydrolyse-	reaktions-
gemisch		geschwin-	geschwin-
	(μΐ)	digkeit	digkeit
	0	0,02	2,68
1	5	0,07	2,48
2	10	0,11	1,91
3	20	0,17	1,08
4	30	0,21	0,63
5	40	0,22	0,45
6	60	0,26	0,30
7

In diesem Teil des Beispiels konnte gezeigt werden, daß die Nettoreaktionsgeschwindigkeit der Hydrolysereaktion eipe umgekehrte Funktion der Antikörpermenge zu dem Liganden 2,4-Dinitrophenyl ist die in dem spezifischen Bindungsreaktionsgemisch vorhanden ist Es wurde ebenso gezeigt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit der Hintergrundhydrolysereaktion eine direkte Funktion ist der Menge an Antikörper, die in dem spezifischen Bindungsreaktionsgemisch vorhanden ist ίο

B. Konkurrenzbindungs-Fluoreszenz-Bestimmung von

Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl;

Wirkung verschiedener Gehalte an

2,4-Dinitrophenyl-jJ-Alanin auf die _]

Reaktionsgeschwindigkeit

Es wurden zehn spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt jeweils mit einem Gesamtvolumen von 2,0 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,0 und 2,4-Dinitrophenyi-/?- alanin, hergestellt entsprechend dem in J. Amer. Chem. Soa 76,1328 (1954) beschriebenen Verfahren, in den in der Tabelle XI angegebenen Konzentrationen. Zu neun der zehn Reaktionsgemische, d. h. den Nummern 2 bis 10 in Tabelle XI wurde eine Menge an Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl zugegeben, die ausreichte, um die Geschwindigkeit der esterasekatalysierten Reaktion in dem anderen Gemisch, d.h. bei Nr. 1, um 60% herabzusetzen. Nach dem Vermischen wurden 20 μΐ 1 pm 2,4-Dinitrophenyl-Fluorescein-Konjugat (entsprechend Beispiel 14) in Dimethylsulfoxid zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. 10 μΐ 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydiochlorid-Puffer, pH 7,0, enthaltend 0,54 Einheiten Esterase Typ I (ECNr. 3.1.1.1 der Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri) wurden zu jedem Reaktionsgemisch gegeben. Die entstehende Reaktionsgeschwindigkeit wurde wie im Teil A dieses Beispiels beschrieben, gemessen. Der Prozentsatz der Geschwindigkeit der Reaktionen 2 bis 10 zu demjenigen der Reaktion 1 (kein Antikörper vorhanden) wurde berechnet Die Ergebnisse sind in Tabelle Xl und in graphischer Form in F i g. 7 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle Xl

Reaktionsgemisch

2,4-Dinitrophenyl-jS-alanin-Konzentration

(nm)

Reaktionsgeschwin
digkeit

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0
0
5

10

20

30

50

75

100

150

2,78
1,04
1,01
1,04
1,24
1,51
1,54
1,80
1,85
2,33

37
36
37
45
54
56
65
67
84

C. Konkurrenz-Bindungs-photometrische-Bestimmung von Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl;

Wirkung verschiedener Gehalte an

2,4-Dinitrophenyl-fJ-alanin auf die

Reaktionsgeschwindigkeit

Es wurden acht spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt jeweils mit einem Gesamtvolumen von 1,0 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,0, und 2,4-DinitrophenyI-j3-alanin in den in Tabelle XII angegebenen Konzentrationen. Zu sieben der tcht Reaktionsgemische, d. h. die Nummern 2 bis 8 in Tabelle XII, wurde eine Menge an Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl zugegeben, die ausreichte, um die Geschwindigkeit der esterasekatalysierten Reaktion in dem anderen Gemisch, d. h. Nr. 1, um 82% herabzusetzen. Nach dem Vermischen wurden 10 μ] 0,1mm 2,4-Dinitrophenyl-Fluorescein-Konjugat (entsprechend Beispiel 14) in Dimethylsulfoxid zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. 20 μΐ 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,0, enthaltend 2,16 internationale Einheiten Esterase Typ I (E. C. Nr. 3.1.1.1 der Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri) wurden dann zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. Die Änderung der Absorption jedes Reaktionsgemisches bei 489 nm pro min wurde mit einem Gilford-2000-Spektrophotometer überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIl und in graphischer Form in F i g. 8 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle XII

Reaktionsgemisch

Prozentuale
Geschwindigkeit, bezogen auf Reaktion 1 -,0

55

60

In diesem Teil des Beispiels wurde gezeigt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit der Hydrolysereaktion eine direkte Funktion ist der Menge an 2,4-Dinitrophenyl-/?- alanin in dem Reaktionsgemisch.

2,4-Dinitro-

phcnyl-jß-alanin-

Konzentration

(μιη)

Änderung der
Absorption

1,25

2,5

5,0

7,5
10,0
12,5

0,0261
0,0047
0,0118
0,0131
0,0185
0,0202
0,0192
0,0223

In diesem Teil des Beispiels wurde gezeigt daß die Reaktionsgeschwindigkeit eine direkte Funktion ist der Menge an 2,4-Dinitrophenyl-j3-alanin in dem Reaktionsgemisch.

D.Konkurrenz-Bindungs-Fluoreszenz-Bestimmung
von Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl;

Anwendung einer
nichtenzymatischen N achweisreaktion

Das in diesem Teil angewandte spezifische Bindungs-Bestimmungssystem war das gleiche wie in dem Diagramm 1 angegeben mit der Ausnahme, daß keine Esterase angewandt wurde, um die Hydrolyse der Esterbindungen in dem Konjugat zu hydrolysieren.

Es wurden acht spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt jeweils mit einem Gesamtvolumen von 2 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-amino-methanhydrochlorid-Puffer, pH 7,5 und 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin in den in der Tabelle XIIl angegebenen Konzentrationen. Zu jedem Resktionsgemisch

wurden 50 μΐ Antiserum zu 2,4-Dinitrophenyl gegeben. Nach dem Vermischen wurden 20 μΐ 2 μΐη 2,4-Dinitrophenyl-Fluorescein-Konjugat (entsprechend Beispiel 14) in Dimethylsulfoxid zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und die entstehende Reaktionsgeschwindigkeit entsprechend Teil A dieses Beispiels bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XIIl angegeben.

Tabelle XIII	2,4-Dinitro-	Reaktions
Reaktions	phenyl-jff-alanin-	geschwindigkeit
gemisch	Konzentration
	(nm)
	0	0,96
1	12,5	0,94
2	31,2	0,84
3	62,5	0,78
4	94,0	0,70
5	125	0,59
6	187	0,57
7	250	0,53
8

Es konnte in diesem Teil des Beispiels gezeigt werden, daß die Hintergrundhydrolysegeschwindigkeit in Abwesenheit von Esterase eine umgekehrte Funktion der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen 2,4-Dinitrophenyl-/?-alaninmenge war.

Beispiel 16

. Herstellung von Cortisol-Umbelliferon-Konjugat. Cortisol-21 -hemisuccinat-Umbellif eron

A. Cortisol-21 -hemmisuccinat

0,5 g Bernsteinsäureanhydrid wurden zu einer Lösung von 0,5 g Cortisol in 10 ml trockenem Pyridin gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt Dann wurden 100 ml Wasser zugegeben und das Gemisch mit 100 ml Äthylacetat extrahiert Die organische Phase wurde einmal mit Wasser gewaschen und mit 100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit 10%iger Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 angesäuert Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert getrocknet und aus einem Hexan-Aceton-Gemisch umkristallisiert ίο Man erhielt das gewünschte Zwischenprodukt (Fp. 171 bis 172° C).

B. Cortisol-Umbelliferon-Konjugat

50 mg Carbodiimid wurden zu einer Lösung von 100 mg des Zwischenproduktes entsprechend Teil A dieses Beispiels in 3 ml trockenem Dimethylformamid gegeben und 30 min gerührt. Eine Lösung von 50 mg 7-Hydroxycumarin in 2 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen. Zu dem Filtrat

:^r> wurde Wasser zugegeben und das Gemisch mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit Wasser gewaschen, abgetrennt mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet filtriert und unter Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wurde aus einem Aceton-Hexan-Gemisch umkristallisiert. Man erhielt das gewünschte Konjugat (Fp. 126° C).

Beispiel 17

Spezifische Bindungsbestimmung für Cortisol

unter Verwendung eines
Enzymsubstrats (modifiziertes Umbelliferon)

als Markierungssubstanz.

Das spezifische Bindungsbestimmungssystem dieses Beispiels beruhte auf der folgenden Gleichung:

Cortisol-Umbelliferon-Konjugat

Es wurden acht spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 2 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycin-hydrochlorid-Puffer, pH 8,5, und Cortisol in den in Tabelle XIV angegebenen Konzentrationen. Zu sieben der acht Reaktionsgemische, bezeichnet mit den Nr. 2 bis 8 in Tabelle XIV, wurde eine Menge an Antiserum gegen Cortisol zugegeben, die ausreichte, um die Geschwindigkeit der esterasekatalysierten Reaktion in dem anderen Reaktionsgemisch, d. h. Nr. 1, um 70% zu hemmen. Nach dem Vermischen wurden 20 μΐ 2 μΐη Cortisol-Umbelliferon-Konjugat (entsprechend Beispie! 16) in 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 8,5, zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. Nach erneutem Vermischen wurden 15 μΐ Schweineesterase (0,81 Einheiten pro ml) zu jedem Reaktionsgemisch gegeben. Die entstehend? Reaktionsgeschwindigkeit wurde in jedem Re:4;lion.sgein:',ch ähnlich wie in Beispiel 1 ( beschriebe;], im ii!<!sseu. i):t- Ergebnisse sind in Tabelle X! V angegeben.

Esterase

H2O, pH 8,5	55	1	UlllUCllllCIUU.	Reaktions
Tabelle XIV	2		geschwindigkeit
	3
Reaktions	4	Cortisolkon
gemisch	bO 5	zentration	0,0838
	6	(nm)	0,0256
7		0,0296
8	O	0,0306
O	0,0381
2,5	0,0408
10	0,0654
20	0.0603
30
50
100

In diesem Beispiel wurde gezeigt, daB die Reaktionsgeschwindigkeit eine direkte Funktion war der in dem Reaktionsgciiusch vorhandenen Cortisolmenge.

Beispiel 18

Herstellung von

2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat(6-Derivat)

N⁶-[2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl]-

adenosin-5'-triphosphat

A. N⁶-(2-Aminoäthyl)-adenosin-5' monophosphat

2 g (7 mMol) 6-Chlorpurin-ribosid (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri) wurden mit 17 ml Triäthylphosphat gerührt und mit Phosphorylchlorid in Gegenwart von Wasser umgesetzt (Chem. Scrip, 19, 165 bis 170 (1972)). Nach Hydrolyse des Phosphodichloridats wurden 9,5 ml Äthylendiamin (140 mMol) zugegeben und 3 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser auf 4 1 verdünnt und mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 12 gebracht. Diese Lösung wurde durch eine 5 χ 30 cm-Säule von Dowex 1 χ 8 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CaIifornien) in Acetatform geleitet. Dann wurde die Säule mit 3 1 0,01 m Ammoniumchloridlösung gewaschen und das Chromatogramm mit einem linearen Gradienten, gebildet durch 31 Wasser und 31 Im Essigsäure, entwickelt Eine isolierte Spitze eines UV-absorbierenden Materials, die zwischen 1800 und 2050 ml mit dem Gradienten eluiert worden war, wurde auf ungefähr 25 ml unter Vakuum eingedampft. Während diese Lösung über Nacht bei 7° C stand, bildeten sich weiße Kristalle, die gesammelt und getrocknet wurden. Man erhielt das Produkt in 65%iger Ausbeute.

Eine Probe wurde aus heißem Wasser zur Analyse umkristallisiert.

Analyse

Berechnet für 33,8 5,45 19,7

C₁₂H₁₉N₆O₇P · 2H₂O

Gefunden 34,3 5,22 19,7

Getrennte Dünnschichtchromatogramme, die mit zwei Lösungsmittelsystemen entwickelt wurden, wobei das erste aus vier Teilen 0,5 m Ammoniumacetat zu einem Teil Äthanol und das zweite aus drei Teilen Isobuttersäure zu 5 Teilen 1 m Ammoniumhydroxid bestand, zeigten jeweils eine Komponente, die die Floureszenz auslöschte und mit Ninhydrin reagierte. Die Verbindung in 0,1 η Salzsäure besaß ein Absorptionsmaximum bei 264 nm und der millimolare Extinktionskoeffizient war 17,7 und die spektralen Eigenschaften charakteristisch für N⁶-alkylierte Adenosinderivate.

B. N⁶-[2-(2,4- Dinitrophenyl)aminoäthy I]-adenosin-5'-monophosphat

250 mg N⁶-(2-Aminoäthyl)adenosin-5'-monophosphat (0,65 mm), entsprechend Teil A dieses Beispiels, wurden in 20 ml Wasser bei einem pH-Wert von 8 gelöst. Dann wurden 168 mg Natriumbicarbonat zugegeben und anschließend 0,2 ml l-Fluor-2,4 dinitrobenzol (1,58 mMol) in 2 ml Äthanol. Das Reaktionsgemisch wurde in der Dunkelheit bei Raumtemperatur 4 h gerührt und dann weitere 0,1 ml l-Fluor-2,4-dinitrobenzol in 1 ml Äthanol zugegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt worden war. wurde es mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 gebrach! und in 200 ml Äthanol gegossen. Der entstehende Niederschlag wurde in 200 ml Wa .scr gelöst und diese Lösung mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert v>n 8 gebracht und über eine 2,5 χ 30 cm-Sau!e von DEAE-Cellulose in Bicarbonatform (Reeve Angel, Clifton, New Jersey) Chromatographien. Das Chromatogramm wurde mit einem linearen Gradienten entwickelt, der gebildet worden war durch 1,5 1 Wasser und 1,5 1 0.7 m Ammoniumbicarbonat Eine Hauptspitze einer gelben Substanz, die das UV-Licht absorbierte, wurde zwischen 1200 und 1500 ml des Gradienten eluiert. Ammoniumbicarbonat wurde durch wiederholtes Eindampfen zur

ίο Trockene entfernt wobei man das gewünschte Produkt in 40%iger Ausbeute erhielt. Dieses Produkt wanderte als einzelner gelber Punkt in Dünnschichtchromatogrammen, die entwickelt wurden mit den beiden in Teil A erwähnten Lösungsmitteln und auf einem Epichlorhy-

!5 drintriäthanolamin-Anionenaustauscher-Papier, das enrwickelt wurde mit 0,25 m Natriumacetat-Essigsäure-Puffer, pH 5,0. In 0,02 η Salzsäure besaß das Produkt optische Absorptionsmaxima bei 264 nm und 363 nm mit millimolaren Extinktionskoeffizienten von 21,8 bzw.

2() 14,2.

C. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat

N⁶-[2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl]adenosin-5'-monophosphat (entsprechend Teil B dieses Beispiels) (0,3 mMol) wurde durch Chromatographie über eine 1,5 χ 20cm-Säu!e mit Dowex 50 χ 2 in Pyridinform (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien) in das Pyridinsalz umgewandelt. Die gelbe auslaufende Flüssigkeit wurde zur Trockene eingedampft und !5 ml Dimethylformamid und 0,3 mMol Tri-n-butylamin zugegeben. Das Gemisch wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand weiter durch wiederholtes Eindampfen getrocknet. Das als Zwischenprodukt auftretende Monophosphat wurde dann nach dem in J. Amer. Chem.

Soc, 87, 1785 bis 1788 (1965) angegebenen Verfahren in das Triphosphat umgewandelt. Die Reaktionsprodukte, die in Dimethylformamid löslich waren, wurden zu 250 ml Wasser zugegeben, das auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt wurde. Diese Lösung wurde durch eine 2,5 χ 58 cm Säule von DEAE-Cellulose in der Bicarbonatform geleitet und das Chromatogramm mit einem linearen Gradienten entwickelt, der gebildet worden war mit 3 1 Wasser und 3 1 0,5 m Ammoniumcarbonat. Die zuerst eluierte Spitze eines gelben Materials wurde als das Diphosphatderivat identifiziert. Eine zweite Spitze eines gelben Materials, die zwischen 4,15 und 4,4 1 des Gradienten eluiert wurde, wurde zur Trockene eingedampft, wobei man das gewünschte Konjugat in 2O°/oiger Ausbeute erhielt, bei dem es sich durch die

ίο Analyse zeigte, daß es 3,0 Phosphatreste pro Riboserest enthielt.

Beispiel 19

Herstellung von

2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (8-Derivat)

8-[2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl]amino
adenosin-5'-triphosphat

A. 8-(2-Aminoäthyl)aminoadenosin-5'-monophosphat

W) Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 2,2 mMol 8-Bromadenosin-5'-monophosphat (hergestellt entsprechend Arch. Biochem. Biophys. 163, 561 bis 569 (1974)), 66 mMol Äthylendiamin und 25 ml Wasser wurde in ein^m ölbad ? h auf 140⁰C erwärmt. Das abgekühlte

·-.-, Gemisch wui-Je mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 11,5 gebracht und auf e^:ne 2,5 χ 55 cm-Säule von Dowex 1 χ 8 (0,037 bis 0,074 mm, 20(1 bis 400 mesh, nicj'bonatform) gegeben. Die Siuile wurde mit

300 ml Wasser gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten, der gebildet worden war aus 3 1 Wasser und 3 1 0,5 m Ammoniumbicarbonatlösung. Die Absorption der auslaufenden Flüssigkeit bei 254 nm wurde überwacht und eine Hauptspitze eines absorbierenden Materials wuni.· zwischen 4,6 und 5,8 1 des Gradienten eluiert.

Das Ammoniumbicarbonat wurde durch wiederholtes Eindampfen (5 χ je 20 bis 30 ml Wasser) zur Trockene unter Vakuum entfernt und der verbleibende Rückstand in 20 ml Wasser unter Zugabe von Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 8,0 gelöst. Die Lösung wurde filtriert, auf einem pH-Wert von 5,0 mit Ameisensäure eingestellt und 1 Tag bei 5° C stehengelassen. Die entstehenden Kristalle wurden gesammelt, bei einem pH-Wert von 8,0 gelöst und erneut bei einem pH-Wert von 5,0 auskristallisiert. Die Ausbeute an dem gewünschten Zwischenprodukt betrug 27%. Bei Untersuchung durch Dünnschichtchromatographie in einem Lösungsmittel, bestehend aus 4 Teilen 0,5 m Ammoniumacetat zu 1 Teil Äthanol wanderte das Produkt als ein ninhydrinpositiver Punkt, der die Fluoreszenz auslöschte. Das optische Absorptionsmaximum in 0,02 η Salzsäure lag bei 275 nm und der millimolare Extinktionskoeffizient betrug 17,5. Diese spektralen Eigenschaften sind charakteristisch für alkylierte 8-Aminoadenosinderivate.

Analyse

Berechnet für 34,0 5.33

Ci₂H₂₀N-O₇P · H₂O

Gefunden 34,1 5,28

23,2
23,9

B.8-[2-(2,4-DinitrophenyI)aminoäthyl]aminoadenosin-5'-monophosphat

8-(2-Aminoäthyl)aminoadenosin-5'-monophosphat aus Teil A dieses Beispiels (0,64 mm) wurde in 20 ml Wasser unter Zugabe von Natriumhydroxid auf einem pH-Wert von 8,0 gelöst Dann wurden 168 mg Natriumbicarbonat zugegeben und anschließend 0,2 ml l-Fluor-4-dinitrobenzol (1,58 mMol in 2 ml Äthanol). Das Reaktionsgemisch wurde 18 h bei Raumtemperatur gerührt und dann 0,1 ml l-Fluor-2,4-dinitrobenzol in 1 ml Äthanol zugegeben. Nach weiterem 4stündigem Rühren wurde das Gemisch mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 gebracht und in 200 ml kaltes Aceton (-10° C) gegeben. Der entstehende gelbe Niederschlag wurde abfiltriert, in 200 ml Wasser gelöst und durch eine 2,5 χ 45 cm-Säule mit DEAE-Cellulose in der Bicarbonatform geleitet Das Chromatogramm wurde entwikkelt mit einem linearen Salzgradienten, der gebildet worden war durch 21 Wasser und 210,7 m Ammoniumbicarbonat Eine Spitze eines gelben Materials mit einem Absorptionsmaximum von 275 nm wurde zwischen 2 und 3 1 des Gradienten eluiert Das Ammoniumbicarbonat wurde von diesem Produkt unter Eindampfen unter Vakuum entfernt Man erhielt das gewünschte Zwischenprodukt in einer Ausbeute von 37%. Die optischen Absorptionsmaxima in 0,02 η Salzsäure traten bei 275 und 363 nm auf und die millimolaren Extinktionskoeffizienten waren 21,8 bzw. 15,5. Die weitere Analyse zeigte 1,07 Phosphatreste pro Riboserest

C. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat

Das Monophosphat-Zwischenprodukt (0,5 mMo wurde in das Tri-n-butylammoniumsalz umgewandel durch Zugabe von 0,8 mMol Tri-n-butylamin. Da Gemisch wurde durch wiederholtes Eindampfen au trockenem Dimethylformamid (4 χ je 10 bis 15 ml getrocknet. Der entstehende Rückstand wurde in 1 m Dimethylformamid gelöst und mit 2,0 mMol Carbonyl diimidazol ebenfalls in 1 ml Dimethylformamid ver mischt und 4 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Da: überschüssige Carbonyldiimidazol wurde durch Umset zung mit 15 μΙ Methanol innerhalb von 30 min zerstör Schließlich wurden 3 mMol Tri-n-bulyl-ammoniumpy rophosphat in 4 ml Dimethylformamid zugegeben
das Gemisch 20 h umgesetzt. Der entstehende Feststof wurde abzentrifugiert und 2 χ mit je 5 ml Dimethyl formamid gewaschen. Die vereinigten überstehende Flüssigkeiten wurden zu 200 ml Wasser gegeben, da dann auf einen pH-Wert von 8 gebracht und über ein 2,5 χ 25 cm-Säule von DEAE-Cellulose in Bicarbonat form Chromatographien wurde. Das Chromatogramn wurde entwickelt mit einem linearen Gradienten, de gebildet worden war mit 21 Wasser und 21 0,5 π Ammoniumbicarbonat Eine Spitze eines gelben Mate rials mit Absorptionsmaxima bei 275 und 363 nm wurdi zwischen 2,0 und 2,91 des Gradienten eluiert. Da Ammoniumbicarbonat wurde durch Eindampfen ent fernt, wobei man das gewünschte Konjugat in eine Ausbeute von 22% erhielt. Die Ergebnisse der Analysi zeigten, daß dieses Produkt 3,2 Phosphatreste pr< Riboserest enthielt.

Beispiel 20

Herstellung von 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat

(endständiges Phosphatderivat).
P'{2-[N-(2,4-Dinitrophenyl)amino]-äthyl}P-

(5'-adenosin)-tetraphosphat

A.2-[N-(2,4-Dinitrophenyl)amino]äthylphosphat

Eine Lösung, enthaltend 20 mMol Äthanolaminphos phat, 0,4 Mol Natriumbicarbonat und 0,2 g Benzyltri äthylammoniumchlorid in 20 ml Wasser wurde gerührt während 2OmMoI l-Fluor-2,4-dinitrobenzol zugetropfi wurden. Das entstehende rweiphasige Gemisch wurde I Tage bei Raumtemperatur gerührt Dann wurden 600 ml Äthanol zugegeben, wobei über Nacht bei 0⁰C ein gelber Feststoff entstand. Dieser FcslSioff wurde iii 50 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 3 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,5 gebracht- Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und bei 0⁰C mit 200 m wasserfreiem Äthanol verrieben. Der feste Rückstand wurde bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet Man erhielt 4 g eines gelben Produktes (65% dei Theorie). Dieses Material schmolz bei 200 bis 202⁰C und wanderte als einzelner gelber Punkt in Dünnschichtchromatogrammen, die entwickelt worden waren mit einem Lösungsmittel, bestehend aus 7 Teilen Äthanol zu 3 Teilen Triäthylammoniumbicarbonat (pH 7,5). Das optische Absorptionsspektrum in 0,02 η Salzsäure besaß Maxima bei 359 und 264 nm und die millimolaren Extinktionskoeffizienten waren 17,0 bzw. 9,2. Das Neutralisationsäquivalent betrug 325 und entsprach dem für das Monohydrat berechneten Wert.

Analyse

Berechnet für 29,55 3,72 12,92

C₈H₁₀N₁OsP · H₂O

Gefunden 29,38 2,94 12,81

B. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat

Das in Teil A dieses Beispiels hergestellte Zwischenprodukt wurde mit Diphenylphosphorchloridat nach dem in Eur. J. Biochem. 28, 492 bis 496 (1972) angegebenen Verfahren umgesetzt, um das aktivierte Pyrophosphat zu erhalten, das mit ATP umgesetzt wurde. 1 g 2-[N-(2,4-Dinitrophenol)amino]äthylphosphat (3,25 mMol) wurde in das Pyridiniumsalz umgewandelt durch Chromatographie über eine 2,5 χ 25 cm-Säule mit Dowex 50 χ 2 in der Pyridiniumform. Die gelbe ausfließende Flüssigkeit wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 50 ml Methanol suspendiert, zu dem 1,4 ml Tri-n-octylamin (3,25 mMol) zugegeben worden waren. Das Gemisch wurde gerührt, bis der Feststoff gelöst war und dann das Methanol unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Pyridin (20 bis 25 ml) aufgenommen und zur Trockene eingedampft (zweimal wiederholt). Dann wurde der Rückstand in 30 ml getrocknetem Dimethylformamid gelöst und zur Trockene eingedampft (dreimal wiederholt). Der getrocknete Rückstand wurde in 30 ml Dimethylformamid gelöst und 0,97 ml Diphenylphosphorchloridat (4,9 mMol) zugegeben und anschließend 1,6 ml Tri-n-butylar.;in (3,25 mMol). Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann zur Trockene eingedampft Der Rückstand wurde mit 70 ml trockenem Diäthyläther 2 min geschüttelt und dann 150 ml Petroläther zugegeben. Nach 1 h wurde die überstehende gelbe Flüssigkeit abdekantiert, wobei ein gelbes öl zurückblieb, das in 30 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und zur Trockene eingedampft wurde. Das verbleibende öl wurde in 100 ml Pyridin/Dimethylformamid (1 :1 Vol/Vol) gelöst und die Hälfte dieser Lösung mit dem Tri-n-octylammoniumsalz von ATP umgesetzt

0,7 mMol ATP wurden in das Pyridiniumsalz umgewandelt, das durch Chromatographie über eine 2,5 χ 25 cm-Säule von Dowex 50 χ 2 in der Pyridiniumform. Die wäßrige Lösung dieses Salzes wurde zur Trockene eingedampft und 15 ml Methanol und 1,4 ml Tri-n-octylamin (1,4 mMol) zugesetzt Das Gemisch wurde gerührt, bis das ATP gelöst war und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch wiederholtes Eindampfen von Pyridin und dann trockenes Dimethylformamid getrocknet. Schließ-■j lieh wurde der ölige Rückstand mil dem aktivierten 2-[N-(2,4-Dinitrophenyl)amino]äthylphosphat zusammengegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel durch Eindampfen unter Vakuum entfernt und der

i" Rückstand mit 100 ml Wasser 1 h gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung bei 6,5 bis 7,5 gehalten wurde. Das lösliche Material wurde auf eine 3 χ 45 cm-Säule von SephadexA-50 (DEAE) in Bicarbonatform (Pharmacia Fine Chemicals, Piscata-

ii way, New Hersey) aufgebracht. Das Chromatogramm wurde mit einem linearen Gradienten entwickelt, der gebildet worden war aus jeweils 21 0,1 m und 0,5 m Ammoniumcarbonatlösung. Das zwischen 0,18 und 0,26 m Ammoniumcarbonat eluierte Material wurde unter Vakuum eingedampft und das Ammoniumcarbonat durch wiederholtes Eindampfen zur Trockene aus Wasser entfernt. Eine weitere Reinigung wurde durchgeführt durch Dickschichtchromatographie auf Silicagel mit einem Lösungsmittel, bestehend aus 7

Teilen Äthanol zu 3 Teilen 1 m Triäthylammoniumcarbonat (pH 7,5). Es trennten sich zwei gelbe Hauptbanden, die jeweils von der Platte abgekratzt wurden. Das Silicagel wurde 1 h mit Methanol/Wasser (1 :1 Vol./ Vol.) gerührt und der lösliche Anteil jeder Bande getrennt auf eine 2,5 χ 20 cm-Säule mit DEAE-Cellulose in Bicarbonatform gegeben. Die Säulen wurden mit Wasser und anschließend 0,5 m Ammoniumcarbonatlösung gewaschen. Die durch das Salz eluierten gelben Substanzen wurden unter Vakuum zur Trockene eingedampft. Die Verbindung, die auf dem Silicagel schneller lief, wurde identifiziert als nichtumgesetztes 2-[N-(2,4-Dinitrophenyl)amino]äthylphosphat.

Die zweite Bande, Rf = 0,64, von der Silicagelplatte, besaß optische Absorptionsmaxima bei 257 und 259 nm

to und millimolare Extinktionskoeffizienten einer Lösung in 0,02 η Salzsäure von 21,1 bzw. 16,2. Dieses Produkt, das gewünschte Konjugat, enthielt 4,3 Phosphatreste pro Riboserest

Beispiel 21

Direkte Bindungs-Biolumineszenz- Bestimmung für Antikörper gegen 2,4-Dinitrophenyl; Anwendung von ATP als Markierungssubstanz.

Das in diesem Beispiel angewandte Biolumineszenz-Reaktionssystem beruhte auf der folgenden Gleichung:

ATP-Ligand

(Enzym)

ATP + modifizierter Ligand

ATP + reduziertes Luciferin

Luciferase AMP + oxidiertes Luciferin + hv

Eine lichtentwickelnde Lösung wurde hergestellt enthaltend 10 mm Morpholinopropansulfonat-Puffer, pH 7,4, 10 mm Magnesiumsulfat, 0,7 mm Luciferin und 0,15% (GewTVoL) Rinderserumalbumin.

Es wurden neun spezifische Bindungsreaktionssysteme hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 10 μΐ und jeweils enthaltend 20 mm Tris-(hydroxymethyl)-amino-methanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, 10 mm Äthyiendiamintetraessigsäure, 45 mm 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (endständiges Phosphatderivat entsprechend Beispiel 20) und Antiserum gegen 2,4-Dmitrophenyl in den in Tabelle XV angegebenen Mengen. Nach 1,5 h langer Inkubation bei 25° C wurden jeweils 10 μ] Anteile jedes Reaktionsgemisches im Doppelreihenversuch untersucht durch Einspritzen in ein Volumen von 0,1 ml der oben angegebenen lichterzeugenden Lösung, die vorher mindestens 2 min bei 25° C inkubiert worden war und in einem Reagensglas enthalten war, das in einem Dupont Model 760 Bioluminescence Photometer (E. I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware) angeordnet war.
Die Spitzenljchtintensität wurde von dem Photome-

ter abgelesen. Die miniere Spitzenlichtintensitäi für jedes Reaktionsgemisch wurde berechnet sowie die relative Intensität (100% mal dem Verhältnis der mittleren Spitzeniniensität für die Probe zu derjenigen in Abwesenheit von Antiserum). Die Ergebnisse sind in Tabelle XV und in graphischer Form in F i g. 9 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle XV

Reaktionsgemisch

Antiserum
gegen 2,4-Dinitrophenyl

(μΐ)

Mittl. Spitzenlichtintensität

Relative
Intensität

0,2

0,4

0,8

1,0

2,0

4,0

6,8

8,0

373

351

324

254

211

100
94
85
68
57
24
11
11
10

12 der 13 Reaktionsgemische, d. h. den Nummern 2 bis

13 der Tabelle, wurde eine Menge Antiserum gegen 2,4-Dinitro-phenyl zugesetzt, die ausreichte, um die Spitzenlichtintensität. die durch die Biolumineszenzre-

■> aktion in dem anderen Reaktionsgemisch (d.h. Nr. 1) erzeugt wurde, um 75% herabzusetzen. Nach 2 h langem Inkubieren bei 25° C wurden jeweils 10 μΙ Anteile jedes Reaktionsgemisches im Doppelversuch entsprechend Beispiel 21 untersucht und die mittlere Lichtintensität und die relative Intensität für jedes Gemisch berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XVl und in graphischer Form in Fig. 10 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle XVl

20

In diesem Beispiel konnte gezeigt werden, daß die Aktivität des ATP in dem 2,4-Dinitrophenyl-ATP-K.onjugat, bezogen auf das Biolumineszens-Reaktionssystem jo eine umgekehrte Funktion war zu der Antiserummenge gegen 2,4-Dinitrophenyl, die in dem Reaktionsgemisch vorhanden war.

B e i s ρ i e 1 22

Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszenz-Bestimmung

von Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl;
Verwendung von ATP als Markierungssubstanz

Das Biolumineszenz-Reaktionssystem des Beispiels -to war das in Beispiel 21 beschriebene.

Es wurden 13 spezifische Bindungs-Reaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 100 μΐ und jeweils enthaltend 20 mm Tris-(hydroxymethylj-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, 10 mm Äthylendiamintetraessigsäure, 45 mm 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (endständiges Phosphalderivat entsprechend Beispiel 20) und 2,4-Dinitrophenyl-^-alanin in den in Tabelle XVI angegebenen Konzentrationen. Zu

Reaktions	2,4-Dinitro-	Mittl. Spitzen	Relative I	(%)
gemisch	phenyl-/-	licht	Intensität Il	100
	alanin-Kon-	intensität	I	24
	zentration		I	26
	(μτη)		35
1	0,00	377	38
2	0,00	89	45
3	0,01	97	56
4	0,04	130	68
5	0,06	143	83
6	0,10	170	89
7	0,20	210	91
8	0,30	257	96 1
9	0,60	314	102 fl
10	0,80	334
11	1,0	344
12	2,0	363
13	4,0	385

In diesem Beispiel wurde gezeigt, daß die relative Intensität des entstehenden Lichts eine direkte Funktion ist der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen 2,4-Dinitrophenyl-jS-alaninmenge.

Beispiel 23

Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszenz-Bestimmung

von Derivaten von 2,4-Dinitrophenyl; Anwendung yon ATP als Markierungssubstanz

Das in diesem Beispiel angewandte Biolumineszenz-Reaktionssystem beruhte auf der folgenden Gleichung:

ATP-Ligand + reduziertes Luciferin

Luciferase AMP-Ligand + oxidiertes Luciferin + hv

A. Bestimmung mit Hilfe eines
6-Derivates von ATP

Es wurden drei spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 100 μΐ und jeweils enthaltend 20 mm Tris-(hydroxymethylj-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4,10,0 mm Äthylendiamintetraessigsäure, 20 μΐ Antiserum zu 2,4-Dinitrophenyl, 512 nm 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (6-Derivat entsprechend Beispiel 18) und 2,4-DinitrophenyI-0-alanin in den in Tabelle XVfI angegebenen Konzentrationen. Nach 2 h langer Inkubation bei 25° C wurden ΙΟμΙ Anteile jedes Reaktionsgemisches im Doppelversuch entsprechend Beispiel 21 untersucht und die mittlere Spitzenlichtintensität für jedes Gemisch berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XVII angegeben.

60

Tabelle XVII	2,4-Dinitro- phenyl^S- alanin-Konzen- tration (fan)	Mittl. Spitzen lichtintensität
Reaktions gemisch	0 25 2500	7 14 185
1 2 3

B. Bestimmung mit Hilfe eines 8-Derivats von ATP

Es wurden vier spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 100 μΐ und jeweils enthaltend 20 mm Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, 10 mm Äthylendiamintetraessigsäure, 20 μΐ Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl, 594 nm 2,4-Dinitiophenyl-ATP-K.ori· jugat (8-Derivat entsprechend Beispiel 19) und 2,4-Dinitrophenyl-j3-alanin in den in Tabelle XVIlI angegebenen Konzentrationen. Nach 2 h langer Inkubation bei 25°C wurden jeweils 10 μΙ Anteile jedes Reaktionsgemisches entsprechend Beispiel 21 in Doppelversuchen untersucht und die mittlere Spitzenlichtintensität für jedes Gemisch berechnet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle XVIlI angegeben.

Tabelle XVIIl

Keaktionsgemisch

2,4-Dinitrophenyl-j8-alanin-Konzentration

(um)

Mittl. Spitzenlichüntensitat

25

250

2500

18

51

191

190

Die Ergebnisse dieses Beispiels und diejenigen des Beispiels 22 zeigen, daß die Markierungssubstanz ATP an verschiedenen Stellen ihrer Struktur substituiert sein kann, um als Konjugat für eine spezifische Bindungsbestimmung geeignet zu sein.

B. 4-[3-(N-Phthalamido)-2-hydroxypropylamino]-N-methylphthalimid

Das entsprechend Teil A hergestellte Zwischenprodukt (13,5 g, 0,05 mMol) und 15,7 g (0,085 mMol) Kaliumphthalimid wurden unter Rühren in 150 ml Dimethylformamid 24 h iuf Rückflußtemperatur erhitzt. Das Dimethylformamid wurde entfernt und der Rückstand mit Wasser gewaschen und filtriert. Der gelbe Filterkuchen wurde aus Essigsäure-Wasser umkristallisiert. Man erhielt 12,8 g (67%) des Produktes. Fp. 247 bis 248,5° C.

Analyse

Berechnet für

C₂₀H₁₇N₅O₅

Gefunden

63,32 4,52

63.16

4,38

11,08

10,93

C. 6-[3-Amino-2-hydroxypropylamino]-2,3-dihydrophthalazin-l,4-dion

Das Zwischenprodukt aus Teil B (5,0 g, 13,2 mMol), 90 ml abs. Äthanol und 35 ml 95%iges Hydrazin wurden 4 h unter Rühren zum Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der entstehende Feststoff 24 h unter Vakuum bei 120°C getrocknet. Dieses Produkt wurde 1 h mit 70 ml 0,1 η Salzsäure gerührt; das unlösliche 2,3-Dihydroxyphthalazin-1.4 dion wurde abfiltriert und das Filtrat mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung auf einen pH-Wert von b.5 gebracht. Der entstehende weiße Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 2,2 g des Produktes (67%). Nach Umkristallisieren aus Wasser zersetzte sich die Verbindung bei 273⁰C.

Beispiel 24
Herstellung von Biolin-Isoluminol-Konjugat

6-(3-Biotinoylamido-2-hydroxypropylamin)-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion

A. 4-(3-Chlor-2-hydroxypropylamino)-N-methylphthalimid

25 g (0,142 Mol) 4-Amino-N-methylphthalamid (J. Chem. Soc. 26 (1937) und 20,7 g (0,21 Mol) 1-Chlor-2,3-epoxypropan wurden zu 150 ml 2,2,2-Trifluoräthanol gegeben und das Reaktionsgemisch unter Rühren 48 h auf Rückflußtemperatur erhitzt. 70 bis 80 ml 2.2,2-Trifluoräthanol wurden abdestilliert und es entstand ein schwerer gelber Niederschlag, wenn die verbleibende Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Dieser Niederschlag wurde mit Äthylacetat verrieben, abfiltriert und getrocknet Man erhielt 29,5 g (77%) des gewünschten Zwischenproduktes. Fp. 136 bis 138° C.

Analyse CHN

Berechnet für
C₁₂H₁₃CIN₂O₃
Gefunden

53,64 4,88
53,87 4,85

10,45
10,81 Analyse

Berechnet für 52,79 5,64 22,39

CnH₁₄N₂O,

Gefunden 52,73 5,72 22.54

D. Biotin-Isoluminol-Konjugat

Biotin (0,29 g, 1,2 mMol) und 0,17 ml Triäthylamir wurden in 20 ml trockenem Dimethylformamid unter wasserfreien Bedingungen gelöst und auf -IOC gekühlt Eine Lösung von 0,141 ml Äthylchlorformia: in 2,86 ml Äther wurde langsam zugegeben und das Reaktionsgemisch 20 min gerührt Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert. Eine Suspension, bestehend aus 600 mg (2,4 mMol) des Zwischenprodukts aus Teil C, 20 ml trockenem Dimethylformamid und i mi trockenem Pyridin wurde schnell zu dem Filtrat zugegeben und das Gemisch 30 min bei —10° C unc dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit trat Lösung ein. Das Dimethylformamid wurde bei 60°C und 0,1 mm Hg abdestilliert. Der ölig-. Rückstand wurde mit 50ml 0,1 η Salzsäure 1 h gerührt Der entstehende weiße Niederschlag wurde abfilmen. mit 0,1 η Salzsäure und dann mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen unter Vakuum bei Raumtemoei a-

tür über Nacht erhielt man 0,55 g (97%) des Produktes, Fp. 170 bis 173° C.

Analvse

Berechnet für

C₂₁H₂₈N₆O₅S

Gefunden

52,92
51,69

5,92
5,90

17,64
17,63

Beispiel 25

Spezifisches

Bindungs-Chemielumineszenz-Bestimmungsverfahren;

Wirkung von Avidin und Biotin auf die Aktivität

eines Biotin-Isoluminol-Konjugats

Das in diesem Beispiel angewandte Chemolumineszenz-Reaktionssystem beruhte auf der folgenden Gleichung:

Biotin-lsoluminol +

Lactoperoxidase

Biotin-Aminophthalat + N₂ + hv

Es wurden neun spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 140ul und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethylj-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4 und Biotin, Biotin-lsoluminol-Konjugat (entsprechend Beispie! 24) und Avidin (zuletzt zugegeben) in den in Tabelle XIX angegebenen Konzentrationen. Nach 5 min langem Inkubieren bei 25°C wurden 10 μΐ 0,1 m Tris-ihydroxymethylJaminornethan-hydrochlorid-Puffer, pH 7.4, enthaltend 20 Einheiten pro ml Lactoperoxidase (der Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri; is bestimmt nach Methods in Enzymology XVIIA (1970), S. 653 — Assay 2) zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. Nach weiteren 2 min Inkubieren bei 25° C wurden 10 μί 0,95 mm Wasserstoffperoxid in 10 mm Tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, in jedes Reaktionsgemisch eingespritzt und die Spitzenlichtintensität, die in jedem Reaktionsgemisch erzeugt wurde, mit Hilfe eines Dupont Model 760 Bioluminescence Photometers (E I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle Xl>' angegeben.

Tabelle XIX

Reaktionsgemisch

Biotin-Konzentration

{um)

Biotin-lsoluminol- Avidin-tionzentration Spitzenlichtintensität

Konjugat-Konzentration

(nm) (Einheiten/ml)

4
4
4
4
1,3

84 84

84 84

Die Reaktionen 1, 2, 5 und 7 waren Vergleiche und zeigen, daß in Abwesenheit von Biotin-lsoluminol-Konjugat nur eine geringe Hintergrundlichtmenge gemessen wurde. Die Ergebnisse der Reaktionen 3 und 6 zeigen, daß das Biotin-lsoluminol-Konjugat aktiv war in der Chemolumineszenz-Reaktion und daß das Vorhandensein von freiem Biotin keine wesentliche Wirkung auf diese Aktivität besaß. Das Ergebnis der Reaktion 4 zeigt, daß in Gegenwart von Avidin — einer biotinbindenden Substanz — die Aktivität des Biotin-Isoluminol-Konjugates zunahm. Dieses Ergebnis ist ziemlich unerwartet, da man annehmen müßte, daß eine Bindung von Avidin an das Konjugat die Verfügbarkeit der Isoluminolgruppe für die Chemolumineszenz-Reaktion begrenzen würde. Der Grund für die beobachtete Verstärkung der Lichterzeugung ist noch nicht vollständig geklärt. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 4, 8 und 9 zeigt, daß die Verstärkung der Lichterzeugung verringert wird, umgekehrt zu der Menge an freiem vorhandenen Biotin.

Dieses Beispiel zeigt, daß die Liganden Avidin und Biotin bestimmt werden können mit Hilfe spezifischer

—	0,8
0,14	0,9
-	1,9
0,14	25,3
-	0,8
-	2,2
0,14	0,9
0,14	6,1
0,14	10,4

Bindungs-Chemolumineszenz-Bestimmungsverfahren und daß die Wirkung einer Bindung zwischen der Markierungssubstanz in dem Konjugat und einem so entsprechenden bindenden Partner verstärkend und nicht hemmend wirkt auf die Aktivität der Markierungssubstanz.

55

60

Beispiel 26

Konkurrenz-Bindungs-Chemolumineszenz-

Bestimmung von Biotin;

Wirkung verschiedener Gehalte an Biotin

auf die Spitzenlichtintensität

Das in diesem Beispiel angewandte Chemolumineszenzreaktionssystem war das in Beispiel 25 beschriebene. Es wurden sechs spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 140 μΙ und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7,4, 84 nm Biotin-Luminol-Konjugat (entsprechend Beispiel 24), Biotin in den in Tabelle XX angegebenen Konzentrationen und 0.035 Einheilen pro ml Avidin (zuletzt

angegeben). Nach 5 min Inkubieren bei 25° C wurden 10 μΐ Lactoperoxidase (20 Einheiten pro ml) zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben. Nach weiterem 20 min langem Inkubieren wurden ΙΟμΙ 0,95 mm Wasserstoffperoxid in 10 mm Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 7/., in jedes Reaktionsgemisch eingespritzt und die Spitzenlichtintensität, die in jedem Falle erzeugt wurde, entsprechend Beispiel 25 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle XX und in graphischer Form in F i g. 11 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle XX

Reaktionsgemisch

Biotin-Konzentration

(nm)

Spitzenlichtintensität

67
134

23,5
21,1
15,5

80

Reaktionsgemisch

Biotin-Konzentration

(nm)

Spitzenlichtintensität

200 268 400

12,6

12,3

8,1

ίο Es konnte so gezeigt werden, daß die Stärke der Spitzenlichtintensität, die durch das Chemolumineszenz-Reaktionssystem gebildet wurde, eine umgekehrte Funktion war, der in dem spezifischen Bindungs₄eaktionsgeniisch vorhandenen Biotinmenge.

Beispiel

Konkurrenz-Bindungs-Chemolumineszenz-Bestimmung für Biotin

Das in diesem Beispiel angewandte Chemolumineszenz-Reaktionssystem beruhte auf folgender Gleichung:

Biotin-Isoluminol + KO₃ Biotin-Aminophthalat + N₂ + hv

Es wurden sechzehn spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 150 μΐ und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid, pH 8,0, 42 nm Biotin-Luminol-Konjugat (entsprechend Beispiel 24), Biotin in den in Tabelle XXI angegebenen Konzentrationen und 0,12 Einheiten pro ml Avidin (zuletzt zugegeben). Nach 5min langem Inkubieren bei 25°C wurden ΙΟμΙ Dimethylformamid (enthaltend 0,15 m Kaliumperoxid) (KO2) (Alpha Products, Beverly, Massachusetts) und 0,10 m 1,4,7,10,13,16-Hexaoxyacylcooctadecan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) in jedes Reaktionsgemisch eingespritzt und die Spitzenlichtintensität, die in jedem Falle erzeugt wurde, entsprechend Beispiel 25 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle XXI und in graphischer Form in F i g. 12 der Zeichnungen angegeben.

Tabelle XXI

Reaktionsgemisch

Biotin-Konzcntration

(nm)

Spitzenlichtintensität

0
13

27

38,5
38,5
34,3 Reaktionsgemisch

Biotin-Konzentration

(nm)

Spitzenlichtintensität

40 53 67 101 133 166 200 267 333 400 534 667 800

36,1

35,2

36,2

34,0

31,7

29,1

24,2

22,8

20,5

13,4

8,6

8,3

7,0

Es wurde gezeigt, daß die Stärke der Spitzenlichtintensität, die durch das Chemolumineszenz-Reaktionssystcm er7CUgt wurde, eine umgekehrte Funktion war der in dem spezifischen Bindungs-Reaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims (16)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, wobei man 1.) das Medium zusammenbringt mit a) einem Konjugat aus einer spezifisch bindenden Substanz, die an eine markierende Substanz gekoppelt ist, die eine vorbestimmte Eigenschaft besitzt, und wobei die spezifisch bindende Substanz der Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner zu dem Liganden ist und, wenn die spezifisch bindende Substanz der Ligand oder ein spezifisch bindendes Analoges dieses Liganden ist, mit b) einem spezifisch bindenden Partner für den Liganden, wobei die vorbestimmte Eigenschaft der markierenden Substanz beeinflußt wird durch die Bindung der spezifisch bindenden Substanz des Konjugats durch einen entsprechenden Bindungspartner, und 2.) anschließend die Wirkung auf die vorbestimmte Eigenschaft als Zeichen für das Vorhandensein des Liganden in dem Medium bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man als markierende Substanz eine solche verwendet, die als vorbestimmte Eigenschaft eine vorbestimmte Aktivität als Substrat in einer enzymkatalysierten Reaktion, als Reaktionspartner in einer Chemolumineszenz-Reaktion und/oder als Coenzym in einer chemischen Reaktion besitzt, und daß die Wirkung auf die vorbestimmte Eigenschaft bestimmt wird, indem man a) die chemische Reaktion in mindestens einem Teil des in Stufe 1 entstehenden Gemisches durchführt und b) diese Eigenschaft nach der Reaktion mit derjenigen vergleicht, die bei dem gleichen Verfahren unter Verwendung eines flüssigen Mediums, das eine bekannte Menge des Liganden enthält, auftritt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als markierende Substanz ein Substrat für eine enzymkatalysierte Reaktion verwendet, bei der ein Produkt entsteht, das eine nachweisbare Eigenschaft besitzt die sich von der des Konjugats unterscheidet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Substrat verwendet, das eine in einer enzymkatalysierten Reaktion spaltbare Gruppe enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substanz verwendet, die nach Ablauf der enzymkatalysierten Reaktion ein fluoreszierendes Produkt liefert.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substanz verwendet, bei der die spaltbare Brückengruppe eine durch eine Esterase spaltbare Estergruppe ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungssubstanz Umbelliferon, Fluorescein oder ein Derivat davon verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als markierende Substanz ein Enzymsubstrat oder ein Coenzym verwendet und eine cyclische (Kreis)-Reaktion durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mar. eine cyclische Reaktion durchführt die autokatalytisch ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Markierungssubstanz verwendet, die in einer cyclischen Reaktion wieder rückgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine markierende Substanz verwendet, die ein Reaktionsteilnehmer in einer Chemolumineszenz-Reaktion ist und diese Eigenschaft bestimmt durch Messung der Gesamtlichtmenge, die erzeugt wird oder der Spitzenintensität des erzeugten Lichtes.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungssubstanz Luminol oder Isoluminol oder ein Derivat davon verwendet

IZ Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungssubstanz ein Nucleotidcoenzym verwendet

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungssubstanz ein Adenosinphosphat, Nicotinamid-adenin-dinucleotid oder eine reduzierte Form davon oder Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat oder eine reduzierte Form davon verwendet

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungssubstanz Adenosintriphosphat oder Flavinadenindinucleotid verwendet

15. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 14, bestehend aus

a) einem Konjugat aus einer spezifisch bindenden Substanz, die an eine markierende Substanz gekoppelt ist, die eine vorbestimmte Eigenschaft besitzt, und wobei die spezifisch bindende Substanz der Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner zu dem Liganden ist und

b) einem spezifischen Bindungspartner zu dem Liganden, wenn die spezifisch bindende Substanz der Ligand ist oder ein spezifisch bindendes Analoges davon; wobei die vorbestimmte Eigenschaft der markierenden Substanz beeinflußt wird durch die Bindung der spezifisch bindenden Substanz des Konjugats durch einen entsprechenden Bindungspartner, dadurch gekennzeichnet, daß die vorbestimmte Eigenschaft der markierenden Substanz eine vorbestimmte Aktivität als Substrat in einer enzymkatalysierten Reaktion, als Reaktionspartner in einer Chemolumineszenz-Reaktion und/oder als Coenzym in einer chemischen Reaktion ist.

16. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 14 oder des Mittels nach Anspruch 15 zur Bestimmung von Antigenen und deren Antikörpern; Haptenen und deren Antikörpern; Hormonen, Vitaminen, Metaboliten und pharmakologischen Mitteln sowie deren Rezeptoren und bindenden Substanzen.