CH635438A5 - Test process operating using a specific bond for the investigation of a liquid medium on a ligand and reagent for carrying out the process - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung kann auf die Auffindung beliebiger Liganden angewandt werden, für die es einen spezifischen Bindungspartner gibt. Der Ligand ist gewöhnlich ein Peptid, Protein, Kohlehydrat, Glycoprotein, Steroid oder anderes organisches Molekül, für welches ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen vorhanden ist oder synthetisiert werden kann. Der Ligand besteht gewöhnlich aus Antigenen oder Antikörpern dazu, Haptenen oder Antikörpern dazu oder Hormonen, Vitaminen, Metaboliten und pharmakologischen Mitteln, deren Rezeptoren und Bindungssubstanzen. Spezifische Liganden, die erfindungsgemäss aufgespürt werden können, sind Hormone wie Insulin, chorionisches Gonadotropin, Thyroxin, Liothyronin und Östriol; Antigene und Haptene wie Ferritin, Bradykinin, Prostaglandine und tumorspezifische Antigene, Vitamine wie Biotin, Vitamin Bu, Folsäure, Vitamin E und Ascorbinsäure, Metaboliten wie 3',5'-Adenosinmonophos-phat und 3',5'-Guanosinmonophosphat, Pharmaka wie Dilan-tin, Digoxin, Morphin, Digitoxin und Barbiturate, Antikörper wie Mikrosom-Antikörper und Antikörper gegen Hepatitis und Allergene, und spezifische Bindungsrezeptoren wie Thyroxin, Bindungsglobulin, Avidin, intrinsischer Faktor und Transcobal-amin.

Im erfindungsgemässen Konjugat ist das Reagens an eine spezifische Bindungssubstanz gebunden oder mit dieser gekup-

11 635 438

pelt, die aus dem Liganden, einem spezifischen Bindungs-Ana- stanz in verschiedenen Kategorien untergebracht werden, da log des Liganden oder einem spezifischen Bindungspartner des sie auf mehrere Arten wirken kann in Abhängigkeit der chemi-Liganden besteht, je nach dem gewählten Testverfahren, wobei sehen Umgebung. Es handelt sich jedoch um die Aktivität die-eine messbare Menge der Aktivität des Reagenses erhalten ser Substanz bei der jeweiligen Monitor-Reaktion, die die funkbleibt. Die Bindung zwischen Reagens und spezifischer Bin- 5 tionelle Identität dieser Substanz im Rahmen vorliegender dungssubstanz ist gewöhnlich unter den Testbedingungen irre- Beschreibung bestimmt.

versibel, indem die Monitor-Reaktion, in der das Reagens Akti- Vorzugsweise ist das Reagens ein enzymatisches Reagens, vität aufweist, diese Bindung nicht chemisch zerstören soll wie wie zum Beispiel ein Enzymsubstrat, ein Coenzym oder eine zum Beispiel in obigen lumineszierenden und zyklischen Reak- aktive Modifikation oder ein Derivat davon. Ein Enzymsubstrat tionssystemen. In bestimmten Fällen jedoch wird die Bindung io ist eine Verbindung oder ein Rest, der, katalysiert durch ein bestimmungsgemäss durch die gewählte Monitor-Reaktion Enzym, eine chemische Umwandlung eingeht. Wird ein Sub-zuerstört oder anderweitig beeinflusst, wobei auf diese Weise strat als konjugiertes Reagens verwendet, so beträgt das bevor-die Veränderung der Aktivität des Reagenses festgestellt wird. zugte Molekulargewicht weniger als 9000 und vorzugsweise Ein solcher Fall sind die Reaktionssysteme mit enzymatisch weniger als 5000. Substrate dieser Grösse sind zur Verwendung fluoreszierendem Substrat, die vorstehend erwähnt wurden. is bei der Herstellung des Konjugats am günstigsten, da sie keine Das Reagens kann direkt auf die spezifische Bindungssub- komplexen Moleküle besitzen. Die Aktivität dieser Substrate, stanz gekuppelt werden, so dass das Molekulargewicht des gekuppelt mit einer spezifischen Bindungssubstanz, wird durch Konjugats gleich oder weniger als die Summe des Molekular- die Reaktion des Konjugats mit einer spezifischen Bindungsgewichts von Reagens und spezifischer Bindungssubstanz substanz leicht beeinflusst. Beispiele für Enzymsubstrate zur betragen. Gewöhnlich werden Reagens und spezifische Bin- 20 erfindungsgemässen Verwendung sind die durch Enzyme spalt-dungssubstanz jedoch über ein Brückenglied aus 1 bis 50 und baren fluoreszierenden Substrate der vorstehend erwähnten vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Heteroatomen Art wie zum Beispiel die Fluorescein- und Umbelliferonderi-wie Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor oder derglei- vate, pH-Indikatoren und spektrophotometrische Indikatorchen miteinander verknüpft. Beispiele für Brückenglieder aus farbstoffe, insbesondere chromogene Verbindungen.

einem Atom sind die Methylengruppe ( 1 Kohlenstoffatom) 25 Aus obigen Gründen und wegen der Vielseitigkeit und oder die Aminogruppe (1 Heteroatom). Das Brückenglied Anpassungsfähigkeit werden Coenzyme zur Verwendung als besitzt gewöhnlich ein Molekulargewicht von nicht mehr als Reagens im Konjugat besonders bevorzugt. Ein Coenzym ist 1000 und vorzugsweise von weniger als 200. Es besteht aus ein kein Protein darstellendes Molekül, welches von einem einer Kette aus Kohlenstoff- oder Heteroatomen oder einer Enzymprotein zum anderen wandert und die katalytische Funk-Kombination beider und ist an Reagens und spezifische Bin- 30 tion des Enzyms steigert. Alle bekannten Coenzyme besitzen dungssubstanz oder ein aktives Derivat davon gebunden über Molekulargewichte von weniger als 9000 und die bevorzugten eine verbindende Gruppe, die gewöhnlich aus einer Ester-, Coenzyme weisen Molekulargewichte von weniger als etwa

Amid-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Acetal-, Methylen- oder 5000 auf. Brauchbare Coenzyme sind zum Beispiel die Nucleo-Aminogruppe besteht. tid-Coenzyme, insbesondere solche mit Adeningruppen wie die

Das Reagens im Konjugat gemäss vorliegender Erfindung 35 Adenosinphosphate (das heisst Mono-, Di- und Tri-Phosphat), kann eine beliebige Substanz sein, die eine gegebene (das heisst Nicotinamid-Adenin-dinucleotid und dessen reduzierte Formen festgesetzte oder bekannte) Aktivität als Bestandteil einer und Nicotinamid-Adenin-dinucleotidphosphat und dessen redu-

bestimmten Monitor-Reaktion aufweist. Unter «Reagens» bzw. zierte Formen. Weitere nützliche Coenzyme sind die Guanosin-«Substanz mit Reaktionsaktivität» wird in vorliegender phosphate, Flavinmononucleotid und deren reduzierte For-

Beschreibung jede chemische Substanz verstanden, die einer 4Q men, Flavin-Adenin-dinucleotid und deren reduzierte Formen, endlichen messbaren chemischen Umwandlung unterliegen Coenzym A und dessen Thioester einschliesslich Succinyl-kann, bei der ein odier mehrere vom Ausgangsmaterial ver- coenzym A, 3',5'-Adenosindiphosphat und Adenosin-3'-phos-schiedene Produkte entstehen und die aufgrund der Einwir- phat-5 ' -phosphosulfat.

kung von reaktionseinleitenden Mitteln erfolgt zum Beispiel Brauchbare Coenzym-aktive Konjugate enthalten Nucleo-

einer chemischen Substanz (das heisst einem weiteren Rea- 45 tid-coenzyme mit einer Adeningruppe, an welche die spezifi-gens, einem Katalysator oder Material, das an derartigen sehe Bindungssubstanz, das heisst ein Ligand, ein spezifisches chemischen Umwandlungen teilnimmt), elektromagnetischer Bindungs-Analogon eines Liganden oder ein spezifischer Bin-Strahlung, thermischer oder Schallenergie. Zur Klasse von Sub- dungspartner eines Liganden in direkter Bindung oder über ein stanzen die somit als «Reagentien» bezeichnet werden, gehö- Brückenglied der vorstehend genannten Art gebunden ist. ren daher konventionelle anorganische und organische Rea- 50 Diese Coenzym-aktiven Konjugate, die ein Adenosinphosphat, gentien und verschiedene biochemische Stoffe, nicht jedoch Nicotinamid-Adenin-dinucleotid oder dessen reduzierte Form, Stoffe wie Katalysatoren einschliesslich Enzyme und radioak- - oder Nicotinamid-Adenin-dinucIeotidphosphat oder dessen tive Isotope, die keine Reagentien der Monitor-Reaktion dar- reduzierte Form enthalten, besitzen folgende allgemeine Forstellen. Selbstverständlich kann eine bestimmte chemische Sub- mei:

635 438

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und R5 = -Y-Z darstellen, wobei Y eine Bindung oder ein Brük-kenglied und Z ein Ligand, ein spezifisches Bindungs-Analogon eines Liganden oder ein spezifischer Bindungspartner eines Liganden ist. Die obige Formel gibt die ionisierte Form des Coenzym-aktiven Konjugats wieder, doch sind auch proto-nierte oder Säureform gleichermassen brauchbar. Das Ausmass der Protonierung hängt vom pH des Milieus ab. Gegebe-

conh2

nenfalls können auch die Salze dieser Konjugate verwendet werden.

Ausser obigen Verbindungen sind brauchbare Coenzym-65 aktive Konjugate die Adenosinphosphate, an die die spezifische Bindungssubstanz über die Phosphatgruppe gebunden ist. Diese Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel:

13

635 438

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A fi wobei R2 = -Y-Z bedeutet und Y eine Bindung oder ein Brük-kenglied und Z ein Ligand, ein spezifisches Bindungs-Analogon eines Liganden oder ein spezifischer Bindungspartner eines Liganden ist. Auch die protonierte oder Säureform und Salze können gegebenenfalls verwendet werden.

Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung liegen die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion, die mit dem flüssigen Medium, in dem man den Liganden vermutet, vereinigt werden sollen, in flüssiger oder fester Form vor. Im bevorzugten homogenen Testsystem liegen die Komponenten gewöhnlich in Lösung oder in einer festen Form vor, die sich leicht im flüssigen Medium löst. Da das zu testende flüssige Medium gewöhnlich wässrig ist, sind die Komponenten im allgemeinen wasserlöslich, das heisst, sie liegen als wässrige Lösung oder in wasserlöslicher fester Form, zum Beispiel als Pulver oder Harz, vor. Die Testmethode kann in einem üblichen Laborgefäss wie zum Beispiel einem Reagensrohr durchgeführt werden, wobei die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion und die Komponenten des Reaktionssystems in fester oder flüssiger Form zugegeben werden.

Auch können eine oder mehrere Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion und/oder ein oder mehrere Komponenten der Monitor-Reaktion mit einem Träger zugegeben werden. Der Träger kann ein Flüssigkeit enthaltendes Gefäss wie ein Reagensrohr oder eine die Komponente (n) im Inneren enthaltende Kapsel sein, wobei diese Komponenten in Form einer Flüssigkeit oder eines losen Feststoffs oder Überzug auf der Innenfläche des Gefässes vorliegen. Ferner kann der Träger die Form einer Matrix haben, die unlöslich und porös ist und vorzugsweise das zu testende flüssige Medium absorbiert. Die Matrix kann beispielsweise aus saugfähigem Papier, Polymerfilm, Membranen, Vliessen oder Blöcken, Gelen und dergleichen bestehen. In dieser Form liefert die entsprechende Vorrichtung ein bequemes Mittel, um den Kontakt mit dem zu testenden flüssigen Medium herzustellen, die spezifische Bindungsreaktion und/oder die Monitor-Reaktion durchzuführen und die resultierenden Veränderungen zu beobachten.

Das zu testende flüssige Medium kann eine natürlich vorkommende oder künstlich gebildete Flüssigkeit sein, in der man den Liganden vermutet. Gewöhnlich handelt es sich um eine biologische Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die durch Verdünnen oder Behandlung einer solchen resultiert. Biologische Flüssigkeiten, die erfindungsgemäss getestet werden können, sind zum Beispiel Serum, Plasma, Urin, Fruchtwasser, Cerebral- und Rückenmarkflüssigkeit. Auch andere Stoffe wie zum Beispiel Feststoffe, beispielsweise Gewebe, oder Gase können getestet werden, indem man sie auf eine flüssige Form zurückführt, zum Beispiel durch Auflösen von Feststoff oder Gas in einer Flüssig-25 keit oder Flüssigkeitsextraktion des Feststoffes.

Im Gegensatz zu früheren homogenen Testsystemen können biologische Flüssigkeiten, die eine Reaktionsaktivität besit- • zen, welche der der konjugierten markierenden Substanz ähnlich oder gleich ist, ohne Hintergrundstörung auf den Liganden 30 getestet werden. Die Aktivität des endogenen Hintergrunds kann auf verschiedenen Wegen leicht eliminiert werden. Man kann die biologische Flüssigkeit behandeln, um endogene Aktivität selektiv zu zerstören. Zu derartigen Behandlungen gehören die Einwirkung eines Klärungsmittels, welches die endo-35 gene Aktivität chemisch zerstört, gefolgt von einer Behandlung zur Inaktivierung der zerstörenden Wirkung des Klärungsmittels.

So kommen beispielsweise das Reagens abbauende Enzyme häufig in biologischen Flüssigkeiten vor, insbesondere 40 wenn das Reagens ein Coenzym ist wie NAD, NADP oder ATP. Es gibt zahlreiche Inhibitoren für Coenzym-abbauende Enzyme, zum Beispiel Chelatbildner, die die Enzyme der essentiellen Metallionen-Aktivatoren berauben. Als spezifisches Beispiel werden NAD-abbauende Enzyme in normalem Serum 45 gefunden, die ausreichende enzymatische Wirkung besitzen, um im wesentlichen sämtliche endogene NAD-Aktivität aus isoliertem Serum innerhalb weniger Stunden zu beseitigen. Die . abbauende Wirkung dieser Enzyme kann wirksam inhibiert werden durch Zusatz eines Chelatbildners wie Äthylendiamin-5o tetraessigsäure. Die Eliminierung der abbauenden Aktivität kann auch durch Zusatz eines spezifischen Enzyminhibitors stattfinden. Beispielsweise kann man ATP-abbauende Enzyme inhibieren durch Zusatz von ß y-Methylen-ATP oder aß-Methy-len-ATP.

55

Beispiel 1 : Herstellung eines Konjugats aus Nicotinamid-Ade-nin-dinucleotid-Biotin

6o A. Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)-purindinucleotid

2 g Nicotinamid-Adenin-dinucleotid (NAD) werden in 10 ml Wasser gelöst und 0,6 ml Äthylenimin werden zugetropft,

wobei der pH-Wert durch Zusatz von 1-m-Perchlorsäure unterhalb 7 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe des Äthylenimins 65 wird der pH-Wert auf 4,5 eingestellt und die Reaktion wird bei 20 bis 25 °C inkubiert. In Abständen von 24 Stunden erfolgt Zusatz von 0,6 ml Äthylenimin und der pH-Wert wird erneut auf 4,5 eingestellt. Nach 96 Stunden wird die Lösung in 10 Volu-

635 438 14

mina Aceton von -10 °C eingegossen. Das sich bildende Öl 264 nm und einem Verhältnis von optischer Dichte bei 340 nm wird gesammelt, mit Äther gewaschen und in etwa 50 ml Was- zu 264 nm von mehr als 0,18 werden vereinigt und das so ser in einem Kolben gelöst. gewonnene Material wird auf 4 bis 5 ml eingeengt und wie folgt

Die resultierende Lösung wird mit 1-m-Natriumhydroxidlö- durch Elektrophorese gereinigt:

sung auf pH 7,0 bis 7,5 eingestellt und dann wird 1 g Natriumbi- s Das konzentrierte Material wird auf einen Bogen aus What-carbonat zugesetzt. Dann wird 4 bis 5 Minuten Stickstoff durch man 3MM-Papier (Vertrieb Reeve Angel, Clifton, New Jersey) die Lösung geperlt und 1 g Natriumhydrosulfit zugesetzt. Der in Form eines 1 bis 2 cm breiten Streifens aufgetragen, der Kolben wird fest verschlossen und bei Raumtemperatur 45 senkrecht zur Fliessrichtung verläuft. Das Papier wird dann mit Minuten stehengelassen. Die Lösung wird dann 15 Minuten 0,02molarer Natriumphosphatlösung vom pH 6,0 benetzt. Die belüftet und mit Natriumhydroxid auf pH 11,3 eingestellt. Dann "> Elektrophorese wird nach der Hängemethode nach Durrum, S. wird 1 Stunde auf 75 °C erwärmt. Danach wird das Reaktions- Science 121:829 (1955) während 4 bis 7 Stunden bei einem gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 0,6 g Potentialgradienten von etwa 8,5 Volt/cm durchgeführt. Die

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan versetzt und dann mit Lage des gewünschten Pyridinnucleotid-Derivats wird auf

5-n-Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt. Zur resultierenden Lösung Grund der Fluoreszenz ermittelt, die sich nach Besprühen eines werden 1000 internationale Einheiten Alkohol-Dehydrogenase 15 Teststreifens mit 0,5-m-Natriumcyanidlösung nach dem in J. und 1 ml Acetaldehyd zugegeben. Die abnehmende optische Biol. Chem. 191:447 (1951) beschriebenen Verfahren entwik-Dichte des Reaktionsgemischs wird bei 340 nm verfolgt und, kelt. Der das gewünschte Derivat enthaltende Bereich wird sobald keine weitere Abnahme beobachtet wird, wird der ausgeschnitten und dreimal mit je 50 ml Wasser extrahiert. Die pH-Wert auf 3,5 eingestellt. Die Lösung wird in 10 Volumina resultierenden Extrakte, die das Nicotinamid-6-(2-aminoäthyl-Aceton von -10 °C eingegossen. Das sich bildende Öl wird 20 amino)-purin-Dinucleotid enthalten, werden vereinigt, auf 3 bis abgesondert und mit Äther gewaschen und dann in 10 bis 15 ml 4 ml eingeengt und bei - 20 °C gelagert.

Wasser gelöst.

Die resultierende Lösung wird auf eine 2,5 x 90-cm-Säule B. Nicotinamid-Adenin-dinucleotid-Biotin-Konjugat aus Sephadex G-10 (Pharmacia AB, Uppsala), welche mit Was- 16 mg Biotin werden in 1 ml Wasser, welches 20 mg Nicotin-ser äquilibriert ist, aufgegeben. Fraktionen von je 12 ml werden 25 amid-6-(2-aminoäthylamino)-purin-Dinucleotid (siehe Teil A) aufgefangen. Für jede Fraktion werden die Wellenlängen der enthält, suspendiert. Um die Lösung des Biotins zu unterstüt-maximalen optischen Absorption im Ultraviolett-Bereich und zen, werden einige Tropfen 0,1-n-Natriumhydroxidlösung zuge-die optische Dichte bei dieser Wellenlänge bestimmt. Ferner setzt. Dann werden der resultierenden Lösung 240 mg 1-Cyclo-wird die optische Dichte jeder Fraktion bei 340 nm nach der hexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfo-Reduktion mit Alkohol-Dehydrogenase ermittelt. Diejenigen 30 nat zugegeben, wobei durch Zutropfen von 0,1 -n-Salzsäure Fraktionen, die ein Absorptionsmaximum bei 264 nm aufweisen Lösung bewirkt wird. Das Reaktionsgemisch wird 5 Stunden und ein Verhältnis von optischer Dichte bei 340 nm zu 264 nm bei Raumtemperatur stehengelassen und dann in 10 ml Aceton von mehr als 0,05, werden vereinigt. Dieses vereinigte Material von -10 °C eingegossen. Das sich bildende Öl wird abgeson-wird auf einem Rotationsverdampfer auf 15 bis 20 ml eingeengt dert, zweimal mit 5 bis 10 ml Äther gewaschen und in 1 bis 2 ml und durch eine mit Dowex 1-X8 gefüllte Säule von 2,5 x 28 cm 35 Wasser gelöst. Das resultierende Material wurde wie vorste-(Vertrieb Bio-Rad Laboratories, Richmond, California), die mit hend beschrieben durch Papierelektrophorese gereinigt. Nach Wasser äquilibriert worden war, geführt. Mit zusätzlichem dem Besprühen mit Natriumcyanid erscheinen 2 fluoreszie-Wasser wird das vereinigte Material durch die Säule gewa- rende Banden, von denen die eine zur Kathode und die andere sehen, wobei 10-ml-Fraktionen aufgefangen werden. Die Frak- zur Anode gewandert ist. Die letztere Bande, die das NAD-Bio-tionen mit einem Absorptionsmaximum bei 264 nm und einem 40 tin-Konjugat enthält, wird mit Wasser gewaschen und bei Verhältnis von optischer Dichte bei 340 nm zu 264 nm von -20 °C gelagert.

mehr als 0,1 werden vereinigt.

Dieses vereinigte Material wird durch eine mit Doweg Beispiel 2 : Homogener spezifischer Bindungstest; Wirkung von

50-X2 gefüllte Säule von 5x45 cm (Vertrieb Bio-Rad Laborato- Avidin und Biotin auf die enzymatische Kreislaufgeschwindig-ries, Richmond, California), die mit Wasser äquilibriert worden 45 keit von NAD und NAD-Biotin-Konjugaten war, geleitet. Mit zusätzlichem Wasser wird das Material durch Das in diesem Beispiel verwendete Kreislaufsystem basiert die Säule gewaschen, wobei 20-ml-Fraktionen aufgefangen wer- auf folgenden Reaktionen:

den. Die Fraktionen mit einem Absorptionsmaximum bei

/ \ t.» j . r Milchsäure -

(a) NAD-Ligand + Lactat De hydrogenase ^

NADH-Ligand + Pyruvat

(b) NADH-Ligand + Thiazolylblau (oxidiert) DiaPhorase ^

NAD-Ligand + Thiazolylblau (reduziert)

Es wurden 8 Reaktionsgemische hergestellt, von denen wurden bei Raumtemperatur 2 bis 3 Stunden lang inkubiert,

jedes ein Gesamtvolumen von 0,5 ml aufwies und 0,12 m Jedes Reaktionsgemisch wurde mit einem wässrigen

N,N-Bis-2-hydroxyäthylglycin-hydrochlorid-Puffer von pH 7,8 Enzym-Substrat-Gemisch in Berührung gebracht durch Zusatz enthielt. Konzentrationen bzw. Aktivitäten von NAD, NAD- von 0,1-ml 1 m-Lithiumlactat, 0,05 ml 10 mM Thiazolylblau in Biotin-Konjugat (s. Beispiel 1), Biotin und Avidin, welch letzte- 65 oxidierter Form und einer zum Auffüllen auf 1 ml Reaktionsvo-

res Bindungsaffinität zum Biotin besitzt, zeigt Tabelle 1. Eine lumen ausreichenden Menge von 0,12 m N,N-Bis-2-Hydroxy-

Einheit der Avidin-Aktivität ist diejenige Avidinmenge, die zur äthylglycin-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,8, der 0,38 interatio-

Bindung von 1 p,g Biotin befähigt ist. Die Reaktionsgemische naie Einheiten Rinderherz-Milchsäuredehydrogenase und 1,5

15 635 438

internationale Einheiten Schweineherz-Diaphorase enthielt. Dichte bei 570 nm während einer 24-Minuten-Periode inner-

Die relative Produktionsgeschwindigkeit der reduzierten Form halb der ersten Stunde nach Zusatz des Enzym-Substrat-

des Thiazolylblaus wurde dann in allen Reaktionsgemischen Gemischs ermittelte. Das gesamte Verfahren wurde im Doppel bestimmt, indem man die Gesamtveränderung der optischen ausgeführt und die Mittelwerte zeigt Tabelle 1.

Tabelle 1

Reaktion

Konzentration

Konzentration an

Konzentration

Avidin-Aktivität mitti. Zunahme

an NAD (nM)

NAD-Biotin-Konjugat (nM)

an Biotin (nM)

(Einheiten)

der optischen Dichte (570 nm)

1

0,002

2

220

-

-

-

0,103

3

-

360

-

-

0,079

4

-

-

360

-

0,003

5

220

-

-

0,11

0,103

6

-

360

-

0,11

0,025

7

-

360

360

0,11

0,069

8

-

-

-

0,11

0,001

Die Reaktionen 1,4 und 8 sind Vergleichsversuche, die zei- dung vermindert proportional der Konzentration des Biotins gen, dass in Abwesenheit von NAD und dem NAD-Biotin-Kon- im Reaktionsgemisch.

jugat im wesentlichen kein Kreisprozess stattfindet. Die Ergeb- Das Beispiel zeigt somit, dass die Aktivität von NAD im nisse der Reaktionen 2 und 3 zeigen, dass das NAD-Biotin-Kon- 25 NAD-Biotin-Konjugat bezüglich des Kreislaufreaktionssy-jugat eine signifikante Coenzym-Aktivität gegenüber nativem stems in Gegenwart von Avidin vermindert ist und das Aus-NAD ausübt. Aus den Ergebnissen der Reaktionen 3 und 6 mass dieser Verminderung durch die zusätzliche Anwesenheit ersieht man, dass die Anwesenheit von Avidin im Reaktionsge- von Biotin verkleinert wird.

misch die Bildung des Thiazolylblau (reduzierte Form) inhibiert, wenn das vorhandene NAD mit Biotin konjugiert ist. 30 Beispiel 3: Homogener konkurrierende Bindung/Biolumines-Durch Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 6 und 7 zenztest; Einfluss verschiedener Biotinmengen auf die maxi erkennt man, dass die Anwesenheit von freiem Biotin das Aus- male Lichtintensität mass der Inhibierung der Thiazolylblau (reduzierte Form-)Bil- Das Reaktionssystem dieses Beispiels basiert auf folgenden

Reaktionen:

(c) NAD-Ligand + Äthanol ^ ^-^ohol-- >

Dehydrogenase

NADH-Ligand + Acetaldehyd

(d) NADH-Ligand + FMN* + H® ^ v *?ADH .

Dehydrogenase"

NAD-Ligand + FMNH^

(e) FMNH2 + langkettiger Aldehyd + 02 Luciferas e—^

J?MN + langkettige Säure + H20 + hV

Flavimaononucleotid

Eine lichterzeugende Lösung zur Durchführung der Reak- Suspension bei 1500xg 10 Minuten zentrifugiert und der tionen (d) und (e) wurde wie folgt zubereitet: Ein 0,13- m-Phos- Kuchen wurde verworfen. Die lichterzeugende Lösung wurde phatpuffer vom pH 7,0,0,67 Gewichts-% Rinderserumalbumin, dann innerhalb 5 Minuten bis zur Verwendung hergestellt 15,7 (xM Flavinmononucleotid (FMN) und 13,3 mM Natrium- 60 durch Vereinigen von 75 jxl des Reagensgemischs, 5 |il oder acetat enthaltendes Reaktionsgemisch wurde im Dunkeln bei Dodecanal-Emulsion und 20 jxl der Luciferaselösung. -20 °C gelagert. Eine Emulsion aus 5 p.1 Dodecanal in 5 ml Was- Um die durch Reaktion (e) erzeugte Lichtmenge zu bestim-ser wurde an dem Tag, an dem die lichterzeugende Lösung ver- men, wurde ein Photometer gebaut, das aus einem Photodetek-wendet werden sollte, hergestellt. Aus Photobacterium fisheri tor und einer 6 x 50-mm-Küvette bestand, welche innerhalb (Vertrieb Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jer- 65 einer lichtintegrierenden Kugel derart angebracht war, dass sey) extrahierte, lyophilisierte Luciferase wurde zu 0,013-m- das in der Küvette erzeugte Licht auf den Photodetektor Phosphatpuffer vom pH 7,3 in einer Konzentration von reflektiert wurde. Das durch den Photodetektor erzeugte elek-

20 mg/ml zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde die resultierende tronische Signal wurde zu einem Linienschreiber weitergelei-

635 438

16

tet. Die maximale Lichtstärke wurde aus den Aufzeichnungen des Schreibers und auf dem Streifen angebrachten willkürlichen Einheiten entnommen.

Es wurden 7 Reaktionsgemische hergestellt, von denen jedes ein Gesamtvolumen von 0,2 ml aufwies und 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid-Puffer vom pH 8,0,0,6 m Äthanol, 0,01 m Semicarbazid-hydrochlorid, 343 nM NAD-Biotin-Konjugat (s. Beispiel 1), 0,025 internationale Einheiten Alkohol-Dehydrogenase und 0,055 Einheiten Avidin enthielt. Zu 6 der 7 Reaktionsgemische, das heisst zu den Gemischen 2 bis 7 von Tabelle 2, wurde Biotin in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt.

Die Reaktionsgemische wurden bei Raumtemperatur etwa 30 Minuten lang inkubiert. 10 jxl von jedem Reaktionsgemisch wurden in einzelne Küvetten eingespritzt, die wie im vorangehenden Beispiel in einem Photometer angeordnet waren und 100 jil der vorstehenden lichterzeugenden Lösung enthielten, die 2 bis 3 Minuten bei 28 °C vorinkubiert worden war. Das gesamte Verfahren wurde im Doppel ausgeführt, die Mittelwerte zeigt Tabelle 2.

Tabelle 2

Reaktionsgemisch

Konzentration an Biotin (nM)

maximale

Lichtintensität

(Mittelwert)

1

0

36

2

25

44

3

50

57

4

100

79

5

150

90

6

200

97

7

300

104

gen Medium unter Anwendung einer konkurrierenden Bindungsreaktion in einem Biolumineszenztest.

Beispiel 4: Herstellung von 2,4-Dinitrophenyl-fluorescein-Kon-5 jugat; Fluorescein-3'[6-(2,4-dinitroanilino)hexanoat]

Bei der Synthese wird das Säurechlorid der 6-(2,4-Dinitro-anilino)-hexansäure mit dem Dinatriumsalz des Fluoresceins umgesetzt. Die 6-(2,4-Dinitroanilino)-hexansäure wurde nach dem in Biochem. J. 42:287-294 (1948) beschriebenen Verfahren io hergestellt.

1,5 g (5 Millimol) 6-(2,4-Dinitroanilino)-hexansäure wurden in Lösung in das Säurechlorid überführt durch Umsetzung mit 10 ml warmem Thionylchlorid während 15 Minuten; anschliessend wurde abgekühlt und mit 20 ml Hexan verdünnt. Das so i5 entstandene feste Säurechlorid wurde abfiltriert und sorgfältig getrocknet und dann zu 600 mg des Dinatriumsalzes von Fiuorescein in 10 ml trockenem Aceton zugegeben. Nach 5stündi-gem Kochen am Rückfluss wurde die Reaktion durch Zusatz von 2 ml Wasser und 5 ml Aceton abgebrochen. Nach 30 Minu-20 ten bei 25 °C wurde das Gemisch zur Trockene eingeengt und der Rückstand wurde zwischen Äthylacetat und wässriger Natriumbicarbonatlösung verteilt. Die organische Phase wurde abgesondert und mit l%iger wässriger Schwefelsäure gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet 25 und eingeengt. Das rote Öl wurde an 60 g Silikagel 60 (Vertrieb E. Merck, Darmstadt, BRD) chromatographiert unter Verwendung von 20 Volumen-% Aceton in Tetrachlorkohlenstoff als Eluierungsmittel. Die dabei erhaltenen 1,2 g unreiner Bis-Ester wurden erneut an 60 g Silikagel mit 10 Volumen-% Aceton in 3o Tetrachlorkohlenstoff chromatographiert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt, wobei 180 mg eines gelben glasartigen Feststoffs erhalten wurden.

Analyse: Ber. für GwHssNsChs: C: 59,33; H: 4,30; N: 9,43; Gef.: C: 60,92; H: 4,35; N: 6,65.

35 Das Infrarotspektrum zeigte die erwartete Ester-Carbonyl-Absorption bei 1765 cm-1.

Dieses Beispiel zeigt somit, dass der Peak der Lichtintensität, die die Biolumineszenzreaktion erzeugt, und damit die Aktivität des NAD im NAD-Biotin-Konjugat, eine direkte Funktion der im Reaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge sind. Die Erfindung liefert daher ein Testgemisch und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Liganden Biotin in einem flüssiBeispiel 5: Homogener spezifischer Bindungstest für Derivate von 2,4-Dinitrobenzol und Antikörper dagegen unter Verwen-4o dung eines Enzymsubstrats (modifiziertes Fiuorescein) als markierender Substanz

Die verwendeten Testsysteme basierten auf der Reaktion von Schema 1.

17

2 ,4 - Dinitrophenyl-fluorescein-K.onjugat

635 438

+ andereProdukte

(naximaleFluoreszen ze bei 510 nn)

r =-

-(ch2)5

nh

0„N

C

r

//

.no,

A. Homogener Test mit direkter Bindung/Fluoreszenz auf Antikörper gegen 2,4-Dinitrophenyl; Einfluss verschiedener Mengen des Antikörpers auf die Reaktionsgeschwindigkeit

7 spezifische Reaktionsgemische wurden zubereitet und analysiert. Für jedes Gemisch wurden 20 jil 1 jxM 2,4-Dinitro-phenyl-fluorescein-Konjugate (siehe Beispiel 4) in Dimethylsul-foxid mit einem Volumen Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl gemäss Tabelle 3 und mit einer für ein Gesamtvolumen von 2,0 ml ausreichenden Volumenmenge an 0,1 m Bis-hydroxy-äthylglycin-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,0 vereinigt. Die Hintergrund-Hydrolysengeschwindigkeit der Esterbindung im Konjugat wurde für jedes Reaktionsgemisch 3 Minuten lang verfolgt, indem man die Zunahme der Fluoreszenzintensität bei 510 nm mit einem auf die Anregung bei 470 nm eingestellten Fluorometer bestimmte. Dann wurden zu jedem Reaktionsgemisch 10 nl 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycin-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,0, der 0,54 Einheiten Typ I-Esterase (E.C. No. 3.1.1.1, Vertrieb Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri) enthielt, zugegeben. Die resultierende Gesamtgeschwindigkeit wurde wie im Fall der Hintergrund-Hydrolysengeschwindigkeit gemessen, die Ergebnisse zeigt Tabelle 3.

Tabelle 3

Reaktions

Menge

Hintergrund-

Gesamt-Reak-

gemisch

Antiserum (jil)

Hydrolysenge tionsgeschwin-

schwindigkeit digkeit

1

0

0,02

2,68

2

5

0,07

2,48

3

10

0,11

1,91

4

20

0,17

1,08

5

30

0,21

0,63

6

40

0,22

0,45

7

60

0,26

0,30

Dieser Teil des Beispiels zeigt, dass die Netto-Reaktionsge-35 schwindigkeit der Hydrolyse eine umgekehrte Funktion der Menge an Antikörper zu Ligand, 2,4-Dinitrophenyl, der im Reaktionsgemisch vorhanden ist, darstellt. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Reaktionsgeschwindigkeit der Hinter-grund-Hydrolysenreaktion eine direkte Funktion der Antikör-40 permenge im Reaktionsgemisch ist. Die Erfindung stellt daher ein Testgemisch und ein Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers gegen 2,4-Dinitrophenyl (Ligand) in einem flüssigen Medium unter Anwendung eines direkten Bindungstests (Fluoreszenzverfahren) dar.

45

B. Homogener Test (konkurrierende Bindung/Fluoreszenz) auf Derivate des 2,4-Dinitrobenzols; Einfluss verschiedener Mengen 2,4-Dinitrophenyl-ß-Alanin auf die Reaktionsgeschwindigkeit.

so 10 Reaktionsgemische wurden zubereitet, von denen jedes ein Gesamtvolumen von 2,0 ml aufwies und 0,1 m Bis-hydroxy-äthylglycin-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,0 und 2,4-Dinitrophe-nyl-ß-alanin (Herstellung s. J. Amer. Chem. Soc. 76:1328 (1954) in den in Tabelle 4 angegebenen Konzentrationen enthielt. Zu 9 55 der 10 Reaktionsgemische, das heisst zu den Proben 2 bis 10, wurde eine Menge Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl zugesetzt, die ausreichte zur Inhibierung der Geschwindigkeit der Esterase-katalysierten Reaktion im Gemisch Nr. 1 um 60%. Nach dem Mischen wurden 20 jjlI 1 n-m 2,4-Dinitrophenyl-fluo-60 rescein-Konjugat (s. Beispiel 4) in Dimethylsulfoxid zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben, gefolgt von 10 (il 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycin-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,0, der 0,54 Einheiten Typ I-Esterase (E.C. No. 3.1.1.1, Vertrieb Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri) enthielt. Die resultierende 65 Reaktionsgeschwindigkeit wurde wie in Teil A gemessen. Für die Reaktionen 2 bis 10 wurde die Reaktionsgeschwindigkeit in Prozent der Geschwindigkeit der Reaktion Nr. 1 (kein Antikörper vorhanden) berechnet, die Ergebnisse zeigt Tabelle 4.

635 438

18

Tabelle 4

Reaktions

Konzentration Reaktionsge-

% der gemisch an schwindigkeit

Reaktionsge

2,4-Dinitrophe schwindigkeit

nyl-ß-alanin (nM)

von Reaktion 1

1

0

2,78

2

0

1,04

37

3

5

1,01

36

4

10

1,04

37

5

20

1,24

45

6

30

1,51

54

7

50

1,54

56

8

75

1,80

65

9

100

1,85

67

10

150

2,33

84

Dieser Teil des Beispiels zeigt somit, dass die Geschwindigkeit der Hydrolyse eine direkte Funktion der Menge an 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin im Reaktionsgemisch ist. Die Erfindung stellt daher ein Testgemisch und ein Verfahren bereit zur Bestimmung von Liganden wie Derivaten des 2,4-Dinitroben-zols in einem flüssigen Medium unter Anwendung einer konkurrierenden Bindungsreaktion/Fluoreszenz.

C. Homogener spektrophotometrischer Test mit konkurrierender Bindung auf Derivate des 2,4-Dinitrobenzol; Einfluss verschiedener Mengen 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin auf die Reaktionsgeschwindigkeit

8 Reaktionsgemische wurden zubereitet, von denen jedes ein Gesamtvolumen von 1,0 ml aufwies und 0,1 m Tris-(hydroxy-methyl-)aminomethan-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,0 und 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin in den in Tabelle 5 angegebenen Konzentrationen enthielt. Zu 7 der 8 Reaktionsgemische, nämlich den Gemischen 2 bis 8, wurde eine Menge Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl zugesetzt, die ausreichte zur Inhibierung der Geschwindigkeit der Esterase-katalysierten Reaktion im Gemisch Nr. 1 um 82%. Nach dem Vermischen wurden zu jedem Reaktionsgemisch 10 (il 0,1 mM 2,4-Dinitrophenyl-fluo-rescein-Konjugat (siehe Beispiel 4) in Dimethylsulfoxid zugesetzt, dann wurden 20 p.1 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminome-than-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,0 zugegeben, der 2,16 internationale Einheiten Typ I-Esterase (E.C. No. 3.1.1.1, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) enthielt. Die Veränderung der Absorption wurde bei 489 nm pro Minute mit einem Spek-trophotometer Gilford 2000 verfolgt, die Ergebnisse zeigt Tabelle 5.

Tabelle 5

Reaktionsgemisch Konzentration an Veränderung der

2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin Absorption (UM)

1

0

0,0261

2

0

0,0047

3

1,25

0,0118

4

2,5

0,0131

5

5,0

0,0185

6

7,5

0,0202

7

10,0

0,0192

8

12,5

0,0223

Dieser Teil des Beispiels zeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit eine direkte Funktion der Menge an 2,4-Dinitrophenyl-ß-Alanin im Reaktionsgemisch ist. Die Erfindung liefert daher ein Testgemisch und ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Liganden wie Derivaten des 2,4-Dinitrobenzols in einem flüssigen Medium unter Verwendung eines spektrophotometrischen Tests und einer konkurrierenden Bindungsreaktion.

D. Homogener Test mit konkurrierender Bindung/Fluoreszenz auf Derivate des 2,4-Dinitrobenzol; Verwendung einer nicht-enzymatischen Monitor-Reaktion

Das Testsystem entsprach dem in Schema 1 gezeigten System, jedoch wurde keine Esterase zur Katalysierung der Hydrolyse der Esterbindung im Konjugat zugesetzt.

8 Reaktionsgemische wurden hergestellt, von denen jedes ein Gesamtvolumen von 2 ml aufwies und 0,1 m Tris-(hydroxy-methyl)-aminomethan-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,5 und 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin in den in Tabelle 6 angegebenen Konzentrationen enthielt. Zu jedem Reaktionsgemisch wurden 50 (il Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl zugesetzt, und nach dem Vermischen wurden 20 (j.12 jiM 2,4-Dinitrophenyl-fluores-cein-Konjugat (siehe Beispiel 4) in Dimethylsulfoxid zugesetzt, worauf die resultierende Reaktionsgeschwindigkeit wie in Teil A dieses Beispiels beschrieben gemessen wurde. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 6.

Tabelle 6

Reaktionsgemisch

Konzentration an

Reaktionsgeschwin-

2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin digkeit

(nM)

1

0

0,96

2

12,5

0,94

3

31,2

0,84

4

62,5

0,78

5

94,0

0,70

6

125

0,59

7

187

0,57

8

250

0,53

Dieser Teil dieses Beispiels zeigt, dass die Hintergrund-Hydrolysengeschwindigkeit in Abwesenheit von Esterase eine umgekehrte Funktion der Menge an 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin im Reaktionsgemisch ist. Vorliegende Erfindung stellt daher ein Testgemisch und Verfahren bereit zur Bestimmung der Anwesenheit von Liganden wie Derivaten des 2,4-Dinitrobenzols in flüssigem Medium unter Verwendung einer konkurrierenden Bindung/Fluoreszenz, wobei der Bindungspartner nach Bindung an den Liganden im Konjugat an der Monitor-Reak-tion teilnimmt.

Beispiel 6: Herstellung von 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (Derivat in 6-Stellung)

N6-[2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl]-adenosin-5'-triphos-phat.

A. N6-(2-Aminoäthyl)-adenosin-5 ' -monophosphat

2 g (7 Millimol) 6-Chlorpurin-ribosid (Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri) werden mit 17 ml Triäthylphosphat verrührt und mit Phosphorylchlorid in Gegenwart von Wasser nach der Vorschrift von Chem. Scrip. 19:165-170 (1972) umgesetzt. Nach der Hydrolyse des Phosphodichloridats werden 9,5 ml (140 Millimol) Äthylendiamin zugegeben und bei Raumtemperatur während 3 Stunden reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser auf 4 Liter verdünnt und mit Natriumhydroxid auf pH 12 eingestellt. Diese Lösung wird durch eine 5x30-cm-Säule, gefüllt mit Dowex 1 x8 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) in Acetatform, geleitet. Die Säule wird mit 310,01-m-Ammoniumchloridlösung gewaschen und das Chromatogramm wird mit einem linearen Gra-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

19 635438

dienten entwickelt, der aus 31 Wasser und 311-m-Essigsäure tet und das Chromatogramm wird mit einem linearen Gradien-erzeugt wird. Ein isolierter Peak an UV-absorbierendem Mate- tenaus 31 Wasser und 310,5-m-Ammoniumcarbonatlösung ent-rial, welcher zwischen 1800 und 2050 ml des Gradienten eluiert wickelt. Der zuerst eluierte Peak aus gelbem Material wird als wird, wird im Vakuum auf etwa 25 ml eingeengt. Beim Stehen das Diphosphat identifiziert. Ein zweiter Peak aus gelbem bei 7 °C bilden sich über Nacht weisse Kristalle, die gesammelt 5 Material, der zwischen 4,15 und 4,41 des Gradienten eluiert und getrocknet werden, wobei man 65% Ausbeute an Produkt wird, wird zur Trockene eingeengt und ergibt das gewünschte erhält. Eine Probe wird zur Analyse aus heissem Wasser umkri- Konkugat in 20%iger Ausbeute. Die Analyse zeigt 3,0 Phospha-stallisiert. treste pro Riboserest.

Analyse: Ber. für C12H19N6O7P.2H2O: C: 33,8; H: 5,45; N:

19,7 ; Gef.: C: 34,3; H: 5,22; N : 19,7. 10 Beispiel 7 : Herstellung von 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat

(Derivat in 8-Stellung); 8-[2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl]ami-

Dünnschichtenchromatogramme werden mit 2 Lösungs- noadenosin-5'-triphosphat mittelsystemen entwickelt, wobei das erste aus 4 Teilen 0,5-m-

Ammoniumacetat zu 1 Teil Äthanol und das zweite aus 3 Teilen A. 8-(2-Aminoäthyl)aminoadenosin-5'-monophosphat Isobuttersäure zu 5 Teilen 1-m-Ammoniumhydroxid besteht. In 15 Ein Gemisch aus 2,2 Millimol 8-Bromadenosin-5'-mono-beiden Fällen zeigte sich eine Komponente, die die Fluorés- phosphat (Herstellung s. Biphys. 163:561-159 (1974)), 66 Milli-zenz dämpfte und mit Ninhydrin reagierte. Die Verbindung in mol Äthylendiamin und 25 ml Wasser wird im Ölbad 2 Stunden 0,1-n-Salzsäure besass ein Absorptionsmaximum bei 264 nm, auf 140 °C erhitzt. Das abgekühlte Gemisch wird mit Natrium-der millimolare Extinktionskoeffizient betrug 17,7. Die Spektral- hydroxid auf pH 11,5 eingestellt und auf eine 2,5 x 55-cm-Säule eigenschaften entsprechen somit den Charakteristika von 20 aus Dowex 1x8 (Teilchengrösse 0,074 bis 0,037 mm, Bicarbo-N6-alkylierten Adenosinderivaten. natform) aufgegeben. Die Säule wird mit 300 ml Wasser und dann mit einem linearen Gradienten aus 31 Wasser und 31

B. N6-[2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl]-adenosin-5 ' -monophos- 0,5-m-Ammoniumbicarbonatlösung gewaschen. Die Absorp-phat tion der auslaufenden Lösung bei 25 nm wird verfolgt und ein

250 mg (0,65 Millimol) N6-(2-Aminoäthyl)adenosin-5'-mono- 25 Hauptpeak an absorbierendem Material wird zwischen 4,6 und phosphat gemäss Teil A dieses Beispiels werden in 20 ml Was- 5,81 des Gradienten eluiert.

ser bei pH 8 gelöst. Dann werden 168 mg Natriumbicarbonat Das Ammoniumbicarbonat wird durch wiederholtes Ein-

und anschliessend 0,2 ml l-Fluor-2,4-dinitrobenzol (1,58 Milli- dunsten im Vakuum zur Trockene (5mal, jeweils 20 bis 30 ml mol, in 2 ml Äthanlol gelöst) zugegeben. Das Reaktionsgemisch Wasser) entfernt und der Rückstand wird in 20 ml Wasser unter wird im Dunkeln bei Raumtemperatur 4 Stunden gerührt, dann 30 Zusatz von Ammoniumhydroxid bis pH 8,0 gelöst. Die Lösung wird noch 0,1 ml l-Fluor-2,4-dinitrobenzol in 1 ml Äthanol zuge- wird filtriert, mit Ameisensäure auf pH 5,0 eingestellt und einen geben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht gerührt, dann Tag bei 5 °C stehengelassen. Die sich bildenden Kristalle wer-mit Salzsäure auf pH 21,0 eingestellt und in 200 ml Methanol den gesammelt, bei pH 8,0 gelöst und erneut bei pH 5,0 umkri-gegossen. Der sich bildende Niederschlag wird in 200 ml Was- stallisiert. Die Ausbeute an Zwischenprodukt beträgt 27%. Im ser gelöst und die Lösung wird mit Natriumhydroxid auf pH 8,0 35 Dünnschichtenchromatogramm wandert das Produkt in einem eingestellt und an einer 2,5 x 30 cm Säule aus DEAE-Cellulose in Lösungsmittel aus 4 Teilen 0,5-m-Ammoniumacetatlösung zu Bicarbonatform (Reeve Angel, Clifton, New Jersey) chromato- 1 Teil Äthanol als ein Ninhydrin-positiver Fleck, der Fluores-graphiert. Das Chromatogramm wird mit einem linearen Gra- zenz dämpft. Das Absorptionsmaximum in 0,02-n-SaIzsäure dienten aus 1,51 Wasser und 1,510,7-m-Ammoniumbicarbonat- liegt bei 275 nm und der millimolare Extinktionskoeffizient lösung entwickelt. Ein Hauptpeak aus gelbem Material, das 40 beträgt 17,5. Diese Spektraleigenschaften sind charakteristisch UV-Licht absorbiert, wird zwischen 1200 und 1500 ml des Gra- für alkylierte 8-Aminoadenosinderivate.

dienten eluiert. Das Ammoniumbicarbonat wird durch wieder- Analyse: Ber. für C12H20N7O7P.H2O: C: 3,40; H: 5,33; N: 23,2. holtes Eindampfen zur Trockene entfernt, wobei man 40% Aus- Gef.: C: 34,1 ; H: 5,28; N: 23,9.

beute des gewünschten Produkts erhält. Dieses Produkt wandert als ein gelber Fleck in Dünnschichtenchromatogrammen, 45 B. 8-[2<2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl]aminoadenosin-5'-monodie mit den in Teil A genannten Lösungsmittelsystemen entwik- phosphat kelt werden, sowie auf Epichlorhydrin/Triäthanolamin-Anion- 0,64 Millimol 8-(2-Aminoäthyl)aminoadenosin-5'-monophos-

austauscherpapier, das mit 0,25-m-Natriumacetat/Essigsäure- phat (siehe Teil A) werden in 20 ml Wasser unter Zusatz von Puffer vom pH 5,0 entwickelt wird. In 0,02-n-Salzsäure weist Ammoniumhydroxid bis pH 8,0 gelöst. Dann werden 168 mg das Produkt Absorptionsmaxima bei 264 und 363 nm auf, milli- 50 Natriumbicarbonat und anschliessend 0,2 ml l-Fluor-2,4-dinitro-molare Extinktionskoeffizienten 21,8 bzw. 14,2. benzol (1,58 Millimol in 2 ml Äthanol) zugegeben. Das Reak tionsgemisch wird 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt,

C. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat dann wird noch 0,1 ml l-Fluor-2,4-dinitrobenzol in 1 ml Äthanol

0,3 Millimol N6-[2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoäthyl]-adenosin- zugesetzt. Nach weiterem 4stündigem Rühren wird das 5'-monophosphat (siehe Teil B) werden in das Pyridiniumsalz 55 Gemisch mit Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und in 200 ml kaiüberführt durch Chromatographieren an einer 1,5 x 20-cm- tes Aceton (-10 °C) gegossen. Der sich bildende gelbe Nieder-Säule aus Dowex 50 x 2 in Pyridiniumform (Bio-Rad Laborato- schlag wird abfiltriert, in 200 ml Wasser gelöst und auf eine ries, Richmond, California). Die gelbe ausfliessende Lösung 2,5 x 45-cm-Säule aus DEAE-Cellulose in Bicarbonatform gege-wird zur Trockene eingeengt und mit 15 ml Dimethylformamid ben. Das Chromatogramm wird mit einem linearen Salzgra-und 0,3 Millimol Tri-n-butylamin versetzt. Dieses Gemisch wird eo dienten aus 21 Wasser und 21.0,7-m-Ammoniumcarbonatlösung zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird durch wieder- entwickelt. Ein Peak aus gelbem Material mit einem Absorp-holtes Eindunsten weiter getrocknet. Das als Zwischenprodukt tionsmaximum bei 275 nm wird zwischen 2 und 31 des Gradien-erhaltene Monophosphat wird dann nach der in J. Amer. Chem. ten eluiert. Das Ammoniumbicarbonat wird aus diesem Mate-Soc. 87:1785-1788 (1965) beschriebenen Methode in das Tri- rial durch Eindunsten im Vakuum entfernt, die Ausbeute an phosphat überführt. Die in Dimethylformamid löslichen Reak- 65 gewünschtem Zwischenprodukt beträgt 37%. Optische Absorptionsprodukte werden zu 250 ml Wasser zugegeben, das dann tionsmaxima in 0,02-n-Salzsäure erscheinen bei 275 und 373 nm, auf pH 8,0 eingestellt wird. Diese Lösung wird durch eine millimolare Extinktionskoeffizienten 21,8 bzw. 15,5. Die weitere 2,5 x 58-cm-Säule aus DEAE-Cellulose in Bicarbonatform gelei- Analyse ergibt 1,07 Phosphatreste pro Ribosereste.

635 438

20

C. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat

0,5 Millimol des Monophosphats werden in das Tri-n-buty-lammoniumsalz überführt, indem man 0,8 Millimol Tri-n-butyla-min zusetzt. Das Gemisch wird durch wiederholtes Eindampfen aus trockenem Dimethylformamid (4mal, jeweils 10 bis 15 ml) 5 getrocknet. Der letzte Rückstand wird in 1 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,0 Millimol Carbonyldiimidazol, das ebenfalls in 1 ml Dimethylformamid vorliegt, versetzt und 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Überschüssiges Carbonyldiimidazol wird durch 'Astündige Umsetzung mit 15 [il io Methanol zerstört. Schliesslich werden 3 Millimol Tri-n-butyl-ammoniumpyrophosphat in 4 ml Dimethylformamid zugesetzt und 20 Stunden damit reagieren gelassen. Der sich bildende feste Rückstand wird abzentrifugiert und 2mal mit je 5 ml Dimethylformamid gewaschen. Die vereinigten überstehenden is Lösungen werden zu 200 ml Wasser zugegeben, dann wird auf pH 8 eingestellt und an einer 2,5x25-cm-Säule aus DEAE-Cellu-lose in Bicarbonatform chromatographiert. Das Chromatogramm wird mit einem linearen Gradienten aus 21 Wasser und 210,5-m-Ammoniumbicarbonatlösung entwickelt. Ein Peak aus 20 gelbem Material mit Absorptionsmaxima bei 275 und 363 nm wird zwischen 2,0 und 2,91 des Gradienten eluiert. Das Ammoniumbicarbonat wird durch Abdunsten entfernt, dabei erhält man das gewünschte Konjugat in 22%iger Ausbeute. Die Analysenwerte ergeben, dass dieses Produkt 3,2 Phosphatreste pro 25 Riboserest aufweist.

Beispiel 8: Homogener Test mit konkurrierender Bindung/Biolumineszenz auf Derivate des 2,4-Dinitrobenzols; Verwendung von ATP als markierende Substanz

Das in diesem Beispiel verwendete Reaktionssystembe-ruhte auf folgender Umsetzung:

B. Test unter Verwendung des in 8-Stellung gebundenen ATP-Derivats

4 Reaktionsgemische wurden hergestellt, von denen jedes ein Gesamtvolumen von 100 jxl aufwies und 20 mM Tris-(hydro-xymethyl)-aminomethan-hydrochIorid-Puffer vom pH 7,4, 10 mM Äthylendiamintetraessigsäure, 20 p.1 Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl, 594 nM 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (in 8-Stellung gebundenes Derivat, Herstellung siehe Beispiel 7) sowie 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin in den in Tabelle 8 angegebenen Konzentrationen enthielt. Nach 2stündiger Inkubation bei 25 °C wurden 10-fil-Proben jedes Reaktionsgemischs im Doppel wie in Teil A getestet und der Mittelwert der maximalen Lichtintensität wurde berechnet. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 8.

Tabelle 8

Tabelle 7

Reaktions-

Konzentration an maximale gemisch

2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin Lichtintensität

(UM)

(Mittelwert!)

1

0

7

2

25

14

3

2500

185

Reaktions

Konzentration an maximale gemisch

2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin Lichtintensität

ftiM)

(Mittelwert)

1

0

18

2

25

51

3

250

191

4

2500

190

ATP-Ligand + reduziertes Luciferin Luciferase;

AMP-Ligand + oxidiertes Luciferin + h 0

A. Test mit dem in 6-Stellung gebundenen ATP-Derivat

3 Reaktionsgemische wurden hergestellt, von denen jedes ein Gesamtvolumen von 100 |xl aufwies und 10 mM Tris-(hydro-xymethyl-)aminomethan-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,4, 10 mM Äthylendiamintetraessigsäure, 20 jxl Antiserum gegen 2,4-Dinitrophenyl, 512 mM 2,4-Dinitrophenyl-ATP-Konjugat (Derivat in 6-Stellung, Herstellung siehe Beispiel 6) und die in Tabelle 7 angegebenen Mengen 2,4-Dinitrophenyl-ß-alanin enthielt. Nach 2stündiger Inkubation bei 25 °C wurden 10-jj.l-Pro-ben jedes Reaktionsgemischs im Doppel getestet durch Injektion in 0,1 ml der vorstehend beschriebenen lichterzeugenden Lösung, die vorgängig bei 25 °C mindestens 2 Minuten inkubiert worden war und sich in einem Reagensrohr befand, welches in ein Biolumineszenz-Photometer von Dupont Modell 760 (E.I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware) eingebaut war. Die maximale Lichtintensität wurde am Photometer abgelesen. Sowohl der Mittelwert der maximalen Lichtintensität wie die relative Intensität (100%x Verhältnis von maximaler Lichtintensität der Probe zu maximaler Lichtintensität in Abwesenheit des Antiserums) wurden berechnet. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 7.

35

40

45

55

60

65

Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, dass die markierende Substanz ATP nach Derivatbildung in verschiedenen Stellungen zur Herstellung eines Konjugats dient, das im erfin-1 dungsgemässen Testverfahren brauchbar ist.

Beispiel 9: Herstellung von Biotin-Isoluminol-Konjugat. 6-(3-

Biotinoylamido-2-hydroxypropylamin)-2,3-dihydrophthalazin-

1,4-dion

A.4-(3-Chlor-2-hydroxypropylamino)-N-methylphthalimid

25 g (0,142 Mol) 4-Amino-N-methylphthalimid (Herstellung siehe J. Chem. Soc. 26: (1937)) und 20,7 g (0,21 Mol) l-Chlor-2,3-epoxypropan wurden zu 150 ml 2,2,2-Trifluoräthanol zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren 48 Stunden am Rückfluss erhitzt. 70 bis 80 ml des 2,2,2-Trifluoräthanols wurden abdestilliert, und es entstand ein schwerer gelber Niederschlag beim Abkühlen der zurückbleibenden Lösung auf Raumtemperatur. Dieser Niederschlag wurde mit Äthylacetat verrieben, abfiltriert und getrocknet, wobei 29,5 g (77% Ausbeute) des gewünschten Zwischenprodukts vom F.

136-138,5 °C erhalten wurden.

Analyse: Ber. für C12H13CN2O3: C: 53,64; H: 4,88; N: 10,45. Gef.: C: 53,87; H: 4,85; N: 10,81.

B. 4-[3-(N-Phthalimido)-2-hydroxypropylamino]-N-methyl-phthalimid

13,5 g (0,05 Mol) des gemäss Teil A dargestellten Zwischenprodukts und 15,7 g (0,085 Mol) Kaliumphthalimid werden unter Rühren in 150 ml Dimethylformamid 24 Stunden am Rückfluss gekocht. Das Dimethylformamid wird entfernt und der Rückstand wird mit Wasser gewaschen und abfiltriert. Der gelbe Filterkuchen wird aus Essigsäure/Wasser umkristallisiert, dabei erhält man 12,8 g Produkt (67% Ausbeute) vom F. 247-248,5 °C.

Analyse: Ber. für C20H17N3O5: C: 63,32; H: 4,52; N : 11,08. Gef.: C: 63,16; H: 4,38; N: 10,93.

C. 6-[3-Amino-2-hydroxypropylamino]-2,3 dihydrophthalazin-1,4-dion

5,0 g (13,2 Millimol) des Zwischenprodukts gemäss Teil B, 90 ml absolutes Äthanol und 35 ml 95%iges Hydrazin werden unter Rühren 4 Stunden am Rückfluss gekocht. Das Lösungs-

21

635 438

mittel wird im Vakuum entfernt und der resultierende Feststoff wird 24 Stunden im Vakuum bei 120 °C getrocknet. Dieses Material wird dann 1 Stunde mit 70 ml 0,1-n-Salzsäure verrührt. Das unlösliche 2,3-Dihydroxyphthalazin-l,4-dion wird abfiltriert und das Filtrat wird mit gesättigter Natriumbicarbonatlö- 5 sung auf pH 6,5 eingestellt. Der sich bildende weisse Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wobei man 2,2 g Produkt (67% Ausbeute) erhält. Nach dem Umkristallisieren aus Wasser zersetzt sich die Verbindung bei 273 °C.

Analyse: Ber. für ChHmNjOî: C: 52,79; H: 5,64; N: 22,39. io Gef.: C: 52,73; H: 5,72; N: 22,54.

D. Biotin-isoluminol-Konjugat

0,29 g (1,2 Millimol) Biotin und 0,17 ml Triäthylamin werden in 20 ml trockenem Dimethylformamid unter wasserfreien 15 Bedingungen gelöst und auf -WC abgekühlt. Langsam wird dann eine Lösung von 0,141 ml Chlorameisensäureäthylester in 2,86 ml Äther zugegeben und das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten gerührt. Ein sich abscheidender Niederschlag wird abfiltriert. Zum Filtrat wird rasch eine Suspension zugegeben, 20 die aus 600 mg (2,4 Millimol) des Zwischenprodukts gemäss Teil C, 20 ml trockenem Dimethylformamid und 1 ml trockenem Pyridin besteht. Dieses Gemisch wird 30 Minuten bei -10 °C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Während dieses Zeitraums wird eine Lösung erhalten. Das Dimethylformamid wird bei 60 °C und 0,10 mm Hg abdestilliert, der ölige Rückstand wird mit 50 ml n-Salzsäure 1 Stunde lang gerührt. Ein sich bildender weisser Feststoff wird abfiltriert und mit 0,1-n-Salzsäure und dann mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum über Nacht bei Raumtemperatur erhält man 0,55 g Produkt (97% Ausbeute) vom F. 170-173 °C.

Analyse: Ber. für C21H28N6O5S: C: 52,92; H: 5,92; N: 17,64. Gef.: C: 51,69; H: 5,90; N: 17,63.

Beispiel 10: Homogener Test mit konkurrierender Bindung/ Chemilumineszens auf Biotin

Das in diesem Beispiel angewandte Reaktionssystem basierte auf folgender Umsetzung:

Biotin-Isoluminol + KO2 -*

Biotin-Aminophthalat + N2 + H 0

16 Reaktionsgemische wurden hergestellt, von denen jedes ein Gesamtvolumen von 150 ja,l aufwies und 0,1 m Tris-(hydro-xymethyl)-aminomethan-hydrochlorid vom pH 8,0,42 nM Bio-tin-Luminol-Konjugat (Herstellung siehe Beispiel 9) sowie Biotin in den in Tabelle 9 angegebenen Konzentrationen und 0,12 Einheiten/ml Avidin (Zugabe an letzter Stelle) enthielt. Nach 5minütiger Inkubation bei 25 °C werden 10 jxl Dimethylformamid, welches 0,15 M Kaliumsuperoxid (KO2) (Alpha Products, Beverly, Massachusetts) und 0,10 M 1,4,7,10,13,16-Hexaoxy-cyclooctadecan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) enthält, in jedes Reaktionsgemisch eingespritzt. Nach weiterer 2minütiger Inkubation bei 25 °C werden 10 (xl 0,95 mM Wasserstoffperoxid in 10 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,4 in jedes Reaktionsgemisch ein- 55 gespritzt und die maximale Lichtintensität wird mit einem Bio-lumineszens-Photometer Dupont Modell 760 (E.I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware) gemessen. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 9.

60

Tabelle 9

Reaktionsge

Konzentration an Biotin maximale misch

(nM)

Lichtintensität (Mittelwert)

1

0

38,5

2

13

38,5

3

27

34,3

4

40

36,1

5

53

35,2

6

67

36,2

7

101

34,0

8

133

31,7

9

166

29,1

10

200

24,2

11

267

22,8

12

333

20,5

13

400

13,4

14

534

8,6

15

667

8,3

16

800

7,0

25

30

35

45

50

Es wurde somit gezeigt, dass die Höhe der maximalen Lichtintensität, welche vom chemilumineszenten Reaktionssystem gebildet wird, die umgekehrte Funktion der im spezifischen Bindungsreaktionsgemisch vorhandenen Biotinmenge ist. Die Erfindung liefert daher ein Testgemisch und ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit des Liganden Biotin in einem flüssigen Medium unter Verwendung einer Technik mit konkurrierender Bindung-Chemilumineszenz, das keine Enzym-katalysierte Monitor-Reaktion verwendet.

Beispiel 11 : Herstellung von Biotin-Umbelliferon-Konjugat;

(2-Oxo-2-H-l-benzopyran-7-yl)-5-[cis-hexahydro-2-oxo-lH-

thieno-(3,4-d-)-imidazol]valeriansäureester

Eine Lösung von 300 mg (1,2 Millimol) wasserfreiem Biotin in 20 ml trockenem Dimethylformamid wird bei -10 °C unter Stickstoffgas gerührt und mit 0,17 ml (1,2 Millimol) rockenem Triäthylamin versetzt. Dann wird die Lösung von frisch destilliertem Chlorameisensäureäthylester (0,141 ml in 3 ml trockenen Äthers) zugetropft. Nach 'Astündiger Inkubation unter Rühren wird der resultierende Niederschlag in trockener Stick-stoffatmosphäre abfiltriert und sofort auf -10 °C abgekühlt. Zum Rückstand wird eine Lösung von 197 mg (1,2 Millimol) wasserfreiem 7-Hydroxycumarin in 3 ml Pyridin zugesetzt,

dann wird 1 Stunde bei -10 °C und 20 Stunden bei 25 °C gerührt. Die Lösungsmittel werden im Hochvakuum bei 40 °C abdestilliert. Nach dem Abkühlen wird der resultierende Feststoff abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert, wobei man das gewünschte Produkt vom F. 216-218 °C erhält.

Analyse: Ber. für C19H20N2P5S: C: 48,75; H: 4,19; N: 7,21. Gef.: C: 58,4; H: 5,12; N: 6,86.

Beispiel 12: Heterogener Test mit konkurrierender Bindung/ Biolumineszenz auf Biotin; Einfluss verschiedener Biotinmengen auf das Maximum der Lichtintensität

Das Reaktionssystem dieses Beispiels basierte auf den in Beispiel 3 angegebenen Umsetzungen.

A. Herstellung der lichterzeugenden Lösung

Die lichterzeugende Lösung wurde nach der Vorschrift von Beispiel 3 hergestellt.

65 B. Herstellung eines unlöslich gemachten Bindungspartners Avidin, das eine Bindungsaffinität für Biotin besitzt, wurde unlöslich gemacht, indem es wie folgt an ein wasserunlösliches Polymer gebunden wurde: Sepharose 4B (Pharmacia AB, Upp-

635 438 22

sala, Schweden) wurde nach dem Verfahren von March et al., NAD, NAD-Biotin-Konjugat, Avidin-gebundener Sepharose

Analytical Biochemistry 60:149 (1974) zur Bindung an Avidin 4B-Suspension (Herstellung siehe Teil B) und Sepharose aktiviert. Etwa 4 ml der aktivierten Sepharose 4B wurden in 4B-Suspension (erhalten durch Suspendieren von 1 ml gepack-

8 ml 0,1-m-Zitratpuffer vom pH 7,0 suspendiert. Zur Suspension ter Sepharose 4B in 60 ml 0,1 m Tris-(hydroxymethyI)-aminome-

wurden 6 mg Avidin mit einer Aktivität von 9,9 Einheiten pro s than-hydrochlorid-Puffer vom pH 8,0) enthielt. Die Reaktions-

mg in 3 ml Wasser zugesetzt. Eine Einheit Avidinaktivität ist gemische wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur gelinde diejenige Avidinmenge, die zur Bindung von 1 (ig Biotin befä- geschüttelt. Dann wurden 0,22 internationale Einheiten Alko-

higt ist. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden hol-Dehydrogenase zu jedem Reaktionsgemisch zugegeben,

bei 7 °C gerührt. Dann wurde die an Avidin gebundene Sepha- um die Reduktionsreaktion einzuleiten. Semicarbazid verbin-

rose 4B abfiltriert, mit 100 ml 0,1-m-Natriumbicarbonatpuffer io det sich mit dem in Reaktion (c) erzeugten Acetaldehyd unter vom pH 9,0 gewaschen und erneut in 240 ml 0,1 M Tris-(hydro- Bildung eines Semicarbazons, wodurch die Reaktion (c) in die xymethyl)-aminomethan-hydrochlorid-Puffer vom pH 8,0 gewünschte Richtung gedrängt wird.

suspendiert. Die Reaktionsgemische wurden nochmals 15 Minuten bei

Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurden 10 ixl der in jedem

C. Vergleichsversuche 15 Reaktionsgemisch überstehenden Flüssigkeit in die Küvette

9 Reaktionsgemische wurden hergestellt, von denen jedes eines Biolumineszenz-Photometers DuPont Modell 760 (E.I.

ein Gesamtvolumen von 0,19 ml aufwies und 0,1 m Tris-(hydro- duPont de Nemours, Willmington, Delaware) eingespritzt, die xymethyl>aminomethan-hydrochlorid-Puffer vom pH 8,0,0,6 M bereits 100 jxl der vorgängig hergestellten lichterzeugenden

Äthanol, 0,01 M Semicarbazid-hydrochlorid und die in Lösung enthielt, welche 2 bis 3 Minuten bei 25 °C vorinkubiert

Tabelle 10 angegebenen Mengen bzw. Konzentrationen an 20 worden war. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 10.

Tabelle 10

Reaktion

Konzentration

Konzentration an

Avidin-gebun-

Sepharose maximale

an NAD (nM)

NAD-Biotin-Kon-

dene Sepharose 4B-Suspension

Lichtintensität

jugat (nM)

4B-Suspension (ixl)

00)

(Mittelwert)

1

-

-

_

_

1,2

2

21

-

-

-

159

3

21

-

20

-

147

4

-

10

-

-

45,9

5

-

21

-

-

110

6

-

21

20

-

28,5

7

21

-

-

10

154

8

-

21

-

10

114

0

-

-

20

-

1,6

40

Die Ergebnisse der Vergleichsreaktionen 1 und 9 zeigen, dass in Abwesenheit von NAD und NAD-Biotin-Konjugat sehr wenig Licht erzeugt wird. Die Reaktionen 2 und 3 zeigen, dass die lichterzeugende Reaktion stattfindet, wenn man freies NAD zusetzt, und dass diese Reaktion durch die Anwesenheit Avidin-gebundener Sepharose 4B im wesentlichen unbeein-flusst bleibt. Die Ergebnisse der Reaktionen 4,5 und 6 zeigen, dass das NAD-Biotin-Konjugat in der lichterzeugenden Reaktion aktiv ist, dass die maximale Lichtintensität zunimmt bei zunehmender Menge an NAD-Biotin-Konjugat und dass die Anwesenheit Avidin-gebundener Sepharose 4B die Lichterzeugung inhibiert. Vergleicht man die Ergebnisse der Reaktionen 3 und 5 mit den Ergebnissen der Reaktionen 7 und 8, so zeigt sich, dass die lichterzeugende Reaktion durch die Anwesenheit von einfacher Sepharose 4B nicht beeinflusst wird.

D. Testverfahren

5 weitere Reaktionsgemische wurden hergestellt, von denen jedes ein Volumen von 0,19 ml aufwies und 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlörid-Puffer vom pH 8,0,0,6 M Äthanol, 0,01 M Semicarbozid und die in Tabelle 11 aufgeführten Mengen bzw. Konzentrationen an NAD-Biotin-Konjugat, freiem Biotin und Avidin-gebundener Sepharose 4B-Suspension enthielt. Jedes Reaktionsgemisch wurde in gleicher Weise wie die Vergleichsgemische aus Teil C dieses Beispiels behandelt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 11.

Tabelle!!

Reak-45 tion

,10

11

12

13

14

Konzentration Konzentra- Avidin-gebun- maximale an tion an Biotin dene Lichtinten-

NAD-Biotin- (nM) Sepharose sität

Konjugat (nM) 4B-Suspension (Mittelwert)

(nD

21 21 21 21 21

79 158 158

20 20 20

79,1 17,4 43,1 59,9 79,7

55

Die Ergebnisse der Reaktionen 11,12 und 13 zeigen, dass freies Biotin und NAD-Biotin-Konjugat erfolgreich bezüglich der Bindungsstellen am unlöslich gemachten Avidin konkurrieren, da die erzeugte maximale Lichtintensität von der freien 60 Biotinmenge abhängt. Die Reaktionen 10 und 14 zeigen, dass in Abwesenheit von unlöslich gemachtem Avidin die maximale Lichtintensität bei reichlich verschiedenen Konzentrationen an freiem Biotin konstant ist.

Dieses Beispiel zeigt somit, dass die Menge an NAD-Biotin-65 Konjugat in der flüssigen Phase in umgekehrter Beziehung zur Menge an vorhandenem freiem Biotin steht, so dass die erfindungsgemässe Testmethode brauchbar ist zur Bestimmung eines Liganden in einer unbekannten flüssigen Probe.

23

635 438

Beispiel 13: Heterogener spezifischer Bindungstest auf Avidin und Biotin unter Verwendung eines Enzymsubstrats als markierende Substanz

Das in diesem Beispiel verwendete Testsystem basierte auf folgenden Reaktionen:

-C-(CH2)4~

X

Si N

/

Esterase .

H20, pH 8,0 p

Bi ot in-IJmb e 11 if ermn-Kon jugat

20

+ iß +

Biotin

(max. Fluoreszenz bei 448 nm)

A. Herstellung des unlöslich gemachten Bindungspartners

Avidin wurde unlöslich gemacht durch ko valente Bindung an ein wasserunlösliches Polymer, wobei das Verfahren von Beispiel 12, Teil B angewandt wurde mit der Abweichung, dass nach dem Waschen mit 100 ml 0,1-n-Natriumbicarbonatpuffer vom pH 9,0 die Avidin-gebundene Sepharose 4B in 12 ml 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid-Puffervom pH 8,0 suspendiert und dann im Verhältnis 1:1 mit 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycin-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,0 verdünnt wurde.

Raumtemperatur wurde die in jedem Reaktionsgemisch 30 erzeugte Fluoreszenzintensität bei 448 nm unter Erregung bei 364 nm mit einem Spektrophotofluometer Amico-Bowman gemessen. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 12.

35

Tabelle 12

40

B. Konkurrierender Bindungstest auf Biotin; Einfluss verschiedener Biotinmengen auf die Menge des freigesetzten Umbelli-feron

8 Reaktionsgemische wurden hergestellt, von denen jedes ein Gesamtvolumen von 0,2 ml aufwies und 0,1 m Bis-hydroxy-äthylglycin-hydrochlorid-Puffer vom pH 7,0,0,3 jiM Biotin- 45 Umbelliferon-Konjugat (Herstellung siehe Beispiel 11), 15 |il der Avidin-gebundenen Sepharose 4B-Suspension (Herstellung siehe Teil A) und Biotin in den in Tabelle 12 angegebenen Mengen enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter gelindem Schütteln 20 Minuten inkubiert. Jedes Reak- so tionsgemisch wurde zentrifugiert und 100 (il der überstehenden Flüssigkeit wurden mit 2 ml 0,1 m Bis-hydroxyäthylglycin-hydrochlorid-Puffer vom pH 8,2, der 1,08 Einheiten Schweine-Esterase enthielt, vereinigt. Nach 5minütiger Inkubationszeit bei

Reaktionsgemisch

Konzentration an Biotin

(tiM)

intensität

Fluoreszenz-

1

0,00

0,355

2

0,10

0,495

3

0,20

0,469

4

0,30

0,503

5

0,40

0,547

6

0,50

0,502

7

0,75

0,580

8

1,00

0,688

In diesem Beispiel konnte somit gezeigt werden, dass die Menge an NAD-Biotin in der flüssigen Phase der vorhandenen freien Biotinmenge direkt proportional ist, so dass die Testmethode brauchbar ist zur Bestimmung eines Liganden in einer unbekannten flüssigen Probe.

Claims (22)

1. 635438

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Mit einer spezifischen Bindung arbeitendes Testverfah-ren zur Untersuchung eines flüssigen Mediums auf einen Liganden, wobei das Testverfahren die folgenden Schritte umfasst:

   a) das flüssige Medium wird mit einem Reagens, welches ein Konjugat einer markierenden Substanz, die eine vorausbestimmte Charakteristik aufweist, und eine spezifische Bindungssubstanz enthält, in Berührung gebracht, wobei das Reagens und der Ligand ein Bindungsreaktionssystem bilden, welches i) eine gebundene Phase des markierenden Konjugats bildet, worin der spezifische Bindungsanteil durch einen spezifischen Bindungspartner daran gebunden ist, und ii) eine freie Phase des markierenden Konjugats bildet, worin der spezifische Bindungsanteil nicht durch einen spezifischen Bindungspartner daran gebunden ist,

   b) Bestimmung der genannten Charakteristik entweder in der gebundenen Phase oder in der freien Phase als Mass für den genannten Liganden im genannten flüssigen Medium,

   dadurch gekennzeichnet, dass sich die genannte Charakteristik der markierenden Substanz im genannten Konjugat in den nachfolgenden Reaktionssystemen als aktiv erweist:

   1)^ls Substrat in einer Enzym-katalysierten Reaktion,

   2) als Reaktionsteilnehmer in einem cyclischen Reaktionssystem,

   3) als Reaktionsteilnehmer in einem Chemilumineszenz-Reaktionssystem, oder

   4) als Coenzym in einer Enzym-katalysierten Reaktion.
2. 2. Testverfahren nach Anspruch 1 vom homogenen Typ, dadurch gekennzeichnet; dass die genannte markierende Substanz in der gebundenen Phase von derjenigen in der freien Phase messbar verschieden ist und dass die Charakteristik ohne physikalische Trennung der gebundenen Phase von der freien Phase bestimmt wird.
3. 3. Testverfahren nach Anspruch 1 vom heterogenen Typ, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte markierende Substanz in der gebundenen Phase im wesentlichen die gleiche ist als in der freien Phase und dass die gebundene Phase und die freie Phase einer physikalischen Trennung unterworfen werden und dass die genannte Charakteristik in einer der getrennten Phasen bestimmt wird.
4. 4. Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die markierende Substanz einen Reaktionsteilnehmer in einer Enzym-katalysierten Reaktion darstellt, durch welche ein Produkt erhalten wird, welches eine nachweisbare Eigenschaft aufweist, durch welches es sich vom genannten Konjugat unterscheidet.
5. 5. Testverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die nachweisbare Eigenschaft Fluoreszenz ist.
6. 6. Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die markierende Substanz ein cyclischer Reaktionsteilnehmer im genannten cyclischen Reaktionssystem darstellt.
7. 7. Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die markierende Substanz ein Reaktionsteilnehmer in einem Chemilumineszens-Reaktionssystem ist und die genannte Charakteristik durch Messung der gesamten Menge an produziertem Licht oder der Spitzen-Intensität an produziertem Licht bestimmt wird.
8. 8. Testverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte markierende Substanz Luminol oder Iso-luminol oder ein Derivat davon ist.
9. 9. Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die markierende Substanz ein Nucleotid-Coenzym ist.
10. 10. Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte markierende Substanz ein Nikotinamid-Dinucleotid, das in reduzierter Form vorliegen kann, ein Ade-nosin-Triphosphat oder ein Elavinadenin-Dinucleotid ist.
11. 11. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand aus der folgenden

    Gruppe ausgewählt ist: Antigene und entsprechende Antikörper, Haptene und entsprechende Antikörper, Hormone, Vitamine, Metaboliten und pharmakologische Mittel sowie ihre Rezeptoren und ihre Bindungs-Substanzen.
12. 12. Reagens zur Verwendung im Testverfahren gemäss Anspruch 1 bei der Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, enthaltend ein Konjugat einer markierenden Substanz, welches eine vorausbestimmte Charakteristik und eine spezifische Bindungs-Substanz enthält und wobei das Reagens und der Ligand ein Bindungs-Reaktions-System bilden, das eine gebundene Phase des markierten Konjugats erzeugt, worin die darin enthaltene spezifische Bindungs-Substanz an einen spezifischen Bindungs-Partner gebunden ist und eine freie Phase bildet, worin die darin enthaltene spezifische Bindungs-Substanz nicht an einen spezifischen Bindungs-Partner gebunden ist und die genannte Charakteristik entweder in der gebundenen Phase oder in der freien Phase eine Funktion der Menge des Liganden in dem genannten flüssigen Medium ist, dadurch gekennzeichnet, dass sich die genannte Charakteristik der markierenden Substanz im genannten Konjugat in den nachfolgenden Reaktionssystemen als aktiv erweist:

    1) als Substrat in einer Enzym-katalysierten Reaktion,

    2) als Reaktionsteilnehmer in einem cyclischen Reaktionssystem,

    3) als Reaktionsteilnehmer in einem Chemilumineszenz-Reaktionssystem, oder

    4) als Coenzym in einer Enzym-katalysierten Reaktion.
13. 13. Reagens nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es das genannte markierte Konjugat (1), worin die darin enthaltene spezifische Bindungssubstanz der genannte Ligand oder ein spezifisches Bindungs-Analogon des genannten Liganden darstellt und (2) einen spezifischen Bindungs-Partner des genannten Liganden enthält.
14. 14. Reagens nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Träger-Matrix einverleibt enthält.
15. 15. Reagens nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Antigene und entsprechende Antikörper, Haptene und entsprechende Antikörper, Hormone, Vitamine, Metaboliten und pharmakologische Mittel sowie ihre Rezeptoren und ihre Bindungs-Substanzen.

    Die vorliegiende Erfindung bezieht sich auf mit einer spezifischen Bindung arbeitendes mehrstufiges Testverfahren zur Untersuchung eines flüssigen Mediums auf einen Liganden sowie auf ein Reagens, welches zur Durchführung des erfin-dungsgemässen Verfahrens eingesetzt wird.

    Wegen des Sicherheitsrisikos und der Schwierigkeiten bei der Handhabung radioaktiver Stoffe wurden zahlreiche Versuche unternommen, mit spezifischen Bindungen arbeitende Testsysteme zu entwickeln, die ebenso empfindlich und schnell wie Radioimmuntests sind, jedoch zum Nachweis der Bindungsreaktion andere Eigenschaften als die Radioaktivität verwenden. Wie nachstehend noch näher ausgeführt wird, gehören zu den bereits als markierende Substanzen anstelle radioaktiver Atome oder Moleküle verwendeten Stoffen zum Beispiel Enzyme, fluoreszierende Moleküle und Bakteriophagen. Die zunächst diskutierten, auf einer spezifischen Bindung beruhenden Testmethoden gehören zum «heterogenen» Typ, bei denen eine Trennung gebundener und freier Phasen erfolgt. Diese Trennung ist dann notwendig, wenn das markierte Material in der gebundenen Phase vom markierten Material in der freien Phase nicht unterscheidbar ist.

    Beispiele für heterogene Methoden mit Enzymen als mar-

    2

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60

    65

    3 635 438

    kierender Substanz sind in den US-PSS 3 654 090,3 791 932, der Schwierigkeit der Darstellung brauchbarer enzymgebunde-

    3 839153,3 850 752 und 3 879 262 in Journal of Immunological ner Konjugate.

    Methods 1:247 (1972) und in Journal of Immunology 109:129 Die vorliegende Erfindung stellt eine sehr bequeme, anpas-

    (1972) beschrieben. Bei sämtlichen dieser Methoden wird ein sungsfähige und empfindliche verbesserte Testmethode bereit,

    Enzym chemisch entweder an den aufzufindenden Liganden 5 die darauf basiert, dass man als markierende Substanz eine Sub-

    oder seinen Bindungspartner gekoppelt und ein geeignetes stanz verwendet, die als Bestandteil eines vorbestimmten heterogenes spezifisches Bindungs-Reaktionsschema wird auf- Monitorsystems Reaktionsfähigkeit zeigt und nachstehend als gestellt, wobei nach der Inkubation mit der Probe die Menge an «das Reagens» bezeichnet wird. Die erfindungsgemässe mar-

    enzymatischer Aktivität, die entweder an den unlöslichen oder kierende Substanz kann entweder mit einer neuen homogenen den löslichen Anteil gebunden ist, eine Funktion der Menge des io Testtechnik oder in den konventionellen heterogenen Test-Liganden in der Probe darstellt. Die Probleme bei der Synthese Schemata eingesetzt werden.

    und Charakterisierung der Enzym-Konjugate stellen schwer- Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auf ein mit wiegende Nachteile der obigen Verfahren dar. einer spezifischen Bindung arbeitendes Testverfahren zur

    Die GB-PS 1 392 403 und FR-PS 2 201299 beschreiben Untersuchung eines flüssigen Mediums auf einen Liganden,

    einen heterogenen spezifischen Bindungstest, der einen inakti- is wobei das Testverfahren die folgenden Schritte umfasst:

    ven Vorläufer einer spektrophotometrisch aktiven Substanz als a) das flüssige Medium wird mit einem Reagens, welches

    Markierende Substanz verwendet. Nach Inkubation der Probe ein Konjugat einer markierenden Substanz, die eine vorausbe-

    mit dem spezifischen Bindungsreaktionssystem werden unlös- stimmte Charakteristik aufweist, und eine spezifische Bindungs-

    liche und flüssige Anteile voneinander getrennt und die Menge Substanz enthält, in Berührung gebracht, wobei das Reagens an markierender Substanz im flüssigen Anteil, die eine Funk- 20 und der Ligand ein Bindungsreaktionssystem bilden, welches tion der Menge des Liganden in der Probe darstellt, wird ermit- i) eine gebundene Phase des markierenden Konjugats bil-

    telt, indem man Reaktionsstufen ausführt, die die inaktive mar- det, worin der spezifische Bindungsanteil durch einen spezifi-

    kierende Substanz in ein Chromogen oder fluorometrisch akti- sehe Bindungspartner daran gebunden ist, und ves Material überführen, das dann in konventioneller Weise ii) eine freie Phase des markierenden Konjugats bildet,

    quantitativ ermittelt wird. 25 worin der spezifische Bindungsanteil nicht durch einen spezifi-

    Weitere heterogene spezifische Bindungstests, die ver- sehe Bindungspartner daran gebunden ist,

    schiedene Arten von markierenden Substanzen verwenden, b) Bestimmung der genannten Charakteristik entweder in sind in folgender Literatur beschrieben: Report Nr. PB-224,875 der gebundenen Phase oder in der freien Phase als Mass für den des National Technical Information Service (NTIS) des US- genannten Liganden im genannten flüssigen Medium, Handelsministeriums (1973) beschreibt einen erfolglosen Ver- 30 und das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekenn-such zur Verwendung von Häminchlorid als markierende Sub- zeichnet, dass sich die genannte Charakteristik der markierenstanz in einem heterogenen Testsystem, welches durch eine den Substanz im genannten Konjugat in den nachfolgenden Chemilumineszenzreaktion verfolgt wird. In Nature 219:186 Reaktionssystemen als aktiv erweist:

    (1968) werden ausführlich bestimmte Radioimmuntestverfah- 1) als Substrat in einer Enzym-katalysierten Reaktion, ren beschrieben, wobei gleichzeitig ein allgemeiner Hinweis 35 2) als Reaktionsteilnehmer in einem cyclischen Reaktionsauf die mögliche Verwendung von Coenzymen und Viren system,

    anstelle von Radioisotopen als markierende Substanzen 3) als Reaktionsteilnehmer in einem Chemilumineszenz-

    gemacht wird. Der Autor entwickelt jedoch keine Vorstellung Reaktionssystem, oder

    über die Durchführung eines derartige alternative markierende 4) als Coenzym in einer Enzym-katalysierten Reaktion. Substanzen verwendenden Tests. In Principles of Competitive 40 Das genannte Reagens zur Durchführung bei der Bestim-Protein-Binding Assays, Herausg. Odell und Daughaday (J.B. mung eines Liganden in einem flüssigen Medium, enthaltend Lippincott Co., Philadelphia, 1972) werden verschiedene ein Konjugat einer markierenden Substanz, welches eine vorbekannte Testschemata und die verschiedenen Materialien ausbestimmte Charakteristik und eine spezifische Bindungssub-breit diskutiert, die bisher zur Markierung in spezifischen Bin- stanz enthält und wobei das Reagens und der Ligand ein Bindungstests verwendet wurden. 45 dungs-Reaktions-System bilden, das eine gebundene Phase des Von Interesse ist der in der US-PS 3 817 837 beschriebene markierten Konjugats erzeugt, worin die darin enthaltene spe-Immuntest, der über ein Enzym verfolgt wird. Die dortige zifische Bindungssubstanz an einen spezifischen Bindungspart-Methode ist vom «homogenen» Typ derart, dass sie nicht die ner gebunden ist und eine freie Phase bildet, worin die darin Verwendung eines aufgeteilten (das heisst unlöslicher Anteil/ enthaltene spezifische Bindungssubstanz nicht an einen spezifi-flüssiger Anteil) spezifischen Bindungsreaktionssystems und 50 sehen Bindungspartner gebunden ist und die genannte das entsprechende Trennverfahren benötigt, da der mittels Charakteristik entweder in der gebundenen Phase oder in der Enzym verfolgte Ligand so ausgestattet ist, dass nach der Reak- freien Phase eine Funktion der Menge des Liganden in dem tion mit dem Bindungspartner des Liganden eine enzymatische genannten flüssigen Medium ist, ist dadurch gekennzeichnet, Aktivität inhibiert wird. Das Verhältnis von gebundenem Mate- dass sich die genannte Charakteristik der markierenden Subrial zu Material in freier Form kann daher bestimmt werden, 55 stanz im genannten Konjugat in den nachfolgenden Reaktions-indem man die Veränderungen der enzymatischen Aktivität systemen als aktiv erweist:

    verfolgt. Diesem Verfahren haftet jedoch die Schwierigkeit an, 1) als Substrat in einer Enzym-katalysierten Reaktion,

    dass man gut charakterisierte, Enzym-gebundene Konjugate 2) als Reaktionsteilnehmer in einem cyclischen Reaktionsherstellen und Enzyme auffinden muss, die in die Grundanord- system,

    nung des Systems passen. 60 3) als Reaktionsteilnehmer in einem Chemilumineszenz-

    Obgleich verschiedene neue Typen spezifischer Bindungs- Reaktionssystem, oder tests vorgeschlagen und untersucht wurden, bleiben die Radio- 4) als Coenzym in einer Enzym-katalysierten Reaktion,

    immuntests und die verschiedenen Enzym-gebundenen Immun- Das Monitorsystem ist vorzugsweise Enzym-katalysiert.

    tests die am breitesten verwendeten und am besten ausgearbei- Gewöhnlich wählt man ein Monitorsystem, das gegenüber dem teten Tests. Beide Systeme besitzen jedoch offenkundige Nach- 65 Reagens im Konjugat hochempfindlich ist. Lumineszierende teile, nämlich der Radioimmuntest in der Verwendung von oder fluoreszierende Reaktionssysteme sind in dieser Hinsicht radioaktivem Material, die risikoreich ist und eine sorgfältige sehr gut brauchbar. Besonders bevorzugt werden cyclische Handhabung erfordert, und der enzymgebundene Immuntest in Reaktionssysteme, besonders solche, bei denen das Reagens

    635438

    das im Kreislauf befindliche Material ist. Unter den bevorzugten cyclischen Reaktionssystemen sind die enzymkatalysierten von besonderem Vorteil. Das Reagens im Konjugat ist gewöhnlich ein enzymatisches Reagens, zum Beispiel ein Enzymsubstrat oder besonders bevorzugt, ein Coenzym, und es weist vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als 9000 auf.

    In der folgenden Beschreibung werden folgende Bezeichnungen verwendet: Der Ligand ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Anwesenheit oder Menge im flüssigen Medium zu bestimmen ist. Spezifischer Bindungspartner des Liganden ist jede Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluss anderer Substanzen aufweist. Spezifische Bindungs-Analogon des Liganden ist jede Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich im wesentlichen wie der Ligand verhält hinsichtlich der Bindungsaffinität des spezifischen Bindungspartners für den Liganden.

    Das neue homogene Testverfahren beruht zum Teil auf der Tatsache, dass die Reaktion zwischen einem Liganden und einem spezifischen Bindungspartner, wobei das Reagens an einen dieser beiden Partner gekoppelt ist, die Aktivität des Rea-genses in der vorgesehenen Reaktion verändert, so dass diese Reaktion als Mittel zur Verfolgung der spezifischen Bindungsreaktion dient. Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens können verschiedene Arbeitsgänge mit verschiedenen Testgemischen und -Vorrichtungen verwendet werden. Bevorzugt werden das direkte Bindungsverfahren und das konkurrierende Bindungsverfahren.

    Beim direkten Bindungsverfahren wird ein flüssiges Medium, in dem der zu bestimmende Ligand vermutet wird, gewöhnlich mit einem Konjugat in Berührung gebracht, welches das Reagens an einen spezifischen Bindungspartner des Liganden gebunden enthält, worauf man jede Veränderung der Wirkung des Reagenses ermittelt. Beim konkurrierenden Bindungsverfahren wird das flüssige Medium in der Regel mit einem spezifischen Bindungspartner des Liganden und mit einem Konjugat in Berührung gebracht, welches das Reagens an den Liganden und/oder ein spezifisches Bindungs-Analogon dafür gekuppelt enthält, worauf man jede Veränderung der Aktivität des Reagenses ermittelt. In beiden Fällen kann die Aktivität des Reagenses festgestellt werden, indem man das flüssige Medium mit mindestens einem Mittel in Berührung bringt, welches mit dem Reagens die vorgesehene, zur Verfolgung geeignete Reaktion eingeht. Bei der qualitativen Bestimmung des Liganden im flüssigen Medium vergleicht man im allgemeinen eine Eigenschaft, gewöhnlich das Ausmass der resultierenden Reaktion gegenüber der zur Verfolgung verwendeten Reaktion in einem flüssigen Medium ohne Liganden, wobei Unterschiede ein Hinweis für eine Veränderung der Aktivität des Reagenses darstellen. Bei der quantitativen Bestimmung vergleicht man vorzugsweise ein Charakteristikum der resultie renden Reaktion mit der zur Bestimmung vorgesehenen Reaktion in flüssigem Medium, das bekannte Mengen des Liganden enthält.

    Beim homogenen Testschema können die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion, das heisst das flüssige Medium, in dem man den Liganden erwartet, das Konjugat und/oder ein spezifischer Bindungspartner des Liganden im allgemeinen in beliebiger Menge, beliebiger Weise und Reihenfolge miteinander vereinigt werden, vorausgesetzt, dass die Aktivität des Reagenses im Konjugat messbar verändert wird, falls das flüssige Medium den Liganden in einer für die Zwecke des Tests signifikanten Menge oder Konzentration enthält. Vorzugsweise sind sämtliche Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion im flüssigen Medium löslich.

    Arbeitet man z.B. mit homogener Technik unter direkter Bindung, so sind die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, und eine Menge Konjugat, welches das Reagens an einen spezifischen Bindungspartner des Liganden gekuppelt enthält. Die Aktivität von Konjugat/Reagens beim Kontakt mit flüssigem Medium verändert sich umgekehrt zum Ausmass der Bindung zwischen Ligand im flüssigen Medium und spezifischem Bindungspartner im Konjugat. Mit zunehmender Menge des Liganden im flüssigen Medium nimmt somit die Aktivität des im Konjugat gebundenen Reagenses ab.

    Bei konkurrierender Bindung im homogenen Verfahren bestehen die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion aus dem flüssigen Medium, in dem der Ligand vermutet wird, einer Menge eines Konjugats, welches das Reagens an den Liganden oder ein spezifisches Bindungs-Analogon des Liganden gekuppelt enthält, und einer Menge eines spezifischen Bindungspartners für den Liganden. Der spezifische Bindungspartner wird im wesentlichen gleichzeitig mit dem Konjugat und dem flüssigen Medium in Berührung gebracht. Da jeder Ligand im flüssigen Medium mit dem Liganden oder dessen spezifischen Bindungs-Analogon im Konjugat hinsichtlich der Bindung mit dem spezifischen Bindungspartner konkurriert, verändert sich die Aktivität des konjugierten Reagenses beim Kontakt mit dem flüssigen Medium in direkter Weise entsprechend dem Ausmass der Bindung zwischen Liganden im flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner. Mit zunehmender Menge des Liganden im flüssigen Medium nimmt somit auch die Aktivität des konjugierten Reagenses zu.

    Eine bevorzugte Abwandlung des homogenen Verfahrens mit konkurrierender Bindung ist das homogene Verfahren mit Verdrängungsbindung, bei welchem das Konjugat zunächst mit dem spezifischen Bindungspartner des Liganden und dann mit dem flüssigen Medium in Berührung gebracht wird. Es tritt dann Wettbewerb hinsichtlich des spezifischen Bindungspartners ein. Bei diesem Verfahren ist die Menge an Konjugat, die mit dem spezifischen Bindungspartner in Berührung gebracht wird, gewöhnlich eine solche, dass sie den Liganden oder dessen Analogon im Überschuss über die Menge enthält, die zur Bindung mit derjenigen Menge des spezifischen Bindungspartners befähigt ist, welche während der Zeit vorliegt, in der Konjugat und spezifischer Bindungspartner vor dem Kontakt mit dem flüssigen Medium miteinander in Berührung stehen. Diese Reihenfolge kann auf zwei Arten eingehalten werden. Im einen Fall wird z.B. das Konjugat vor dem Kontakt mit dem flüssigen Medium, in dem man den Liganden erwartet, mit dem spezifischen Bindungspartner in flüssigem Milieu in Berührung gebracht. Im zweiten Fall kann das flüssige Medium, in dem man den Liganden erwartet, mit einem Komplex in Berührung gebracht werden, welcher das Konjugat und den spezifischen Bindungspartner enthält, wobei die spezifische Bindungssubstanz im Konjugat und der spezifische Bindungspartner reversibel aneinander gebunden sind. Die Menge an Konjugat, die an den spezifischen Partner gebunden wird, der im zweiten Fall in komplexer Form vorliegt, ist gewöhnlich ein Überschuss gegenüber der Menge, die durch alle Liganden im flüssigen Medium in dem Zeitraum verdrängt werden kann, in dem der spezifische Bindungspartner oder Komplex und das Medium vor Beendigung der Bestimmung jeglicher Aktivitätsveränderung des konjugierten Reagenses miteinander in Berührung sind.

    Eine weitere bevorzugte Abwandlung des homogenen Verfahrens mit konkurrierender Bindung ist die homogene Technik mit aufeinander folgender Sättigung, bei welcher die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion die gleichen sind wie bei der konkurrierenden Bindung, jedoch die Reihenfolge der Zugabe oder Kombination der Komponenten und deren relative Mengen davon verschieden sind. Bei der aufeinanderfolgenden Sättigung kann der spezifische Bindungspartner des Liganden mit dem flüssigen Medium, in dem man den Liganden

    4

    5

    10

    15

    20

    25

    30

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    45

    50

    55

    60

    6?

    635 438

    vermutet, eine gewisse Zeit lang in Berührung gebracht werden, ehe das flüssige Medium mit dem Konjugat in Berührung kommt. Die Menge an spezifischem Bindungspartner, die mit dem flüssigen Medium in Kontakt gebracht wird, liegt gewöhnlich im Überschuss zu der Menge vor, die zur Bindung des gesamten Liganden im flüssigen Medium befähigt ist während der Zeit, in der spezifischer Bindungspartner und flüssiges Medium miteinander in Berührung stehen, ehe das flüssige Medium mit dem Konjugat in Berührung kommt. Die Menge an Ligand-oder Ligand-Analogon in konjugierter Form ist gewöhnlich ein Überschuss über die Menge, die zur Bindung der restlichen ungebundenen Menge des spezifischen Bindungspartners während der Zeit befähigt ist, die das flüssige Medium und Konjugat vor Beendigung der Bestimmung einer Veränderung der Aktivität des konjugierten Reagenses miteinander in Berührung stehen.

    Die Bestimmung von Aktivitätsveränderungen des konjugierten Reagenses als Bestandteil der vorbestimmten Monitor-Reaktion wird zweckmässig durchgeführt, indem man das Reaktionsgemisch mit mindestens einer Substanz in Berührung bringt, die mit dem konjugierten Reagens die Monitor-Reaktion eingeht, wobei man den Effekt der spezifischen Bindungsreaktion an einem Charakteristikum dieser Reaktion ermittelt.

    Die Verwendung eines Reagenses als markierende Substanz kann auch auf die konventionellen heterogenen Testschemata angewandt werden, bei denen man gebundene und freie Phasen des markierten Bestandteils voneinander trennt und die Menge an markierender Substanz in der einen oder anderen Phase bestimmt. Die Mittel zur Durchführung eines derartigen heterogenen Tests können verschiedene Formen annehmen. Im allgemeinen umfassen sie 3 grundlegende Bestandteile, nämlich (1) den zu ermittelnden Liganden, (2) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden und (3) einen markierten Bestandteil, der gewöhnlich eine markierte Form (a) des Liganden, (b) eines spezifischen Bindungs-Analogon des Liganden oder (c) des spezifischen Bindungspartners ist. Die Bestandteile der Bindungsreaktion werden gleichzeitig oder nacheinander miteinander vereinigt, und bei geeigneter Inkubationszeit oder -zeiten wird der markierte Bestandteil an die entsprechenden konkurrierenden Bindungspartner derart gebunden, dass das Ausmass der Bindung, das heisst das Verhältnis zwischen Menge des markierten Bestandteils, die an einen Bindungspartner gebunden ist, zur ungebundenen Menge, eine Funktion der vorhandenen Ligandenmenge darstellt. Es folgt eine kurze Beschreibung einiger Bindungsreaktionsschemata, die zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens angewandt werden können.

    Bei den konventionellen heterogenen Testverfahren mit spezifischer Bindung wie zum Beispiel Radioimmuntests und heterogenen Enzymimmuntests ist die markierende Eigenschaft im markierten Konjugat, zum Beispiel die Radioaktivität oder enzymatische Aktivität, in gebundener und freier Form des Konjugats im wesentlichen gleich. Erfindungsgemäss hingegen ist die Aktivität des Reagenses, als markierende Substanz, in bestimmten Fällen durch die Bindung des markierten Konjugats beeinflusst. In diesen Fällen zeigt die Monitor-Reaktion einen relativ konstanten Charakter, wenn der Ligand im flüssigen Medium fehlt oder in unsignifikant kleiner Menge vorliegt. Ist der Ligand im flüssigen Medium vorhanden, so wird ebenso wie beim homogenen Verfahren eine Eigenschaft der Monitor-Reaktion verändert.

    In den folgenden Diagrammen gelten folgende Symbole:

    Symbol

    Definition

    L zu bestimmender Ligand

    5 (l) Ligand oder spezifisches Bindungs-Analogon

    B Bindungspartner für den Liganden

    * markierende Substanz, d.h. Reagens t- unlösliche Phase

    — Inkubationszeit, der eine geeignete Abtrennung io folgt

    (lim) begrenzt; liegt in geringerer Menge vor als die

    Menge, die an sämtliche verfügbaren Bindungsstellen unter den gewählten Reaktionsbedingungen bei der gewählten 15 Inkubationszeit gebunden werden könnte; d.h. der

    Bestandteil, mit dem die anderen Bestandteile bezüglich der Bindung konkurrieren, (exc) Überschuss, liegt in grösserer Menge vor als durch sämtliche verfügbaren Bindungsstellen 20 unter den gewählten Reaktionsbedingungen während der gewählten Inkubationszeit gebunden werden können.

    1. Konkurrierende Bindung in heterogenem System 25 a) L + ©* + B(lim) —■ + für B oder ©* unlöslich machendes Mittel

    Dies ist das klassische konkurrierende Bindungsverfahren. Beispiele für unlöslich machende Mittel sind spezielle ausfällende Antikörper, spezielle unlöslich gemachte Antikörper und, falls 3o B oder (t)+ ein proteinartiges Material ist, Protein-Ausfäller wie Ammoniumsulfat, oder falls B oder (l)+ aus einem kleinen adsorbierbaren Molekül bestehen, mit Dextran beschichtete Kohle. Die Beschreibung paralleler Systeme findet sich in Bio-chem. J. 88:137 (1963) und US-PS 3 839 153.

    35 b)L + ©* + l-B(lim)-»

    Dieses Verfahren wird gewöhnlich als Festphasen-Technik bezeichnet. Die Beschreibung paralleler Radioimmuntestverfahren und Enzymimmuntestverfahren findet sich in den US-PSS 3 505 019,3 555 143,3 646 346 und 3 654 090. 40 c) L + B* + I— (JXlim)

    Verweis: US-PS 3 654 090

    d) L + l- (l) + B* (lim) —

    Verweis: US-PS 3 850 752.

    45 2. Aufeinanderfolgende Sättigung im heterogenen System a) L + B(exc) —+ (l)* (exc) -* + unlöslich machendes Mittel für B oder(Ç)+

    Bei der Sättigungstechnik werden einige oder sämtliche Bindungsstellen an B, die nach der ersten Inkubationszeit verblei-50 ben, durch den markierten Bestandteil gebunden.

    b) L + l- B(exc) -* + (l)* (exc) -*

    Beschreibungen paralleler Radioimmuntest- und Enzymimmuntestverfahren finden sich in der US-PS 3 720 760 und in J. Immunol. 209:129 (1972).

    55 c) L + B* (exc) — + H(ÇXexc) —
16. 3. Heterogene «Sandwich»-Verfahren

    L + i- B(exc) — B* (exc) -*■

    Beim Sandwichverfahren werden einige oder sämtliche der an 60 den unlöslichen Bindungspartner gebundenen Ligandenmole-küle durch den markierten Bestandteil gebunden. Verweis: US-PS 3 720 760.
17. 4. Festphasen-Verdünnungs-Verfahren mit heterogenem 65 System

    L + (l)* + l- (nicht spezifisch) -» + B(lim) —

    Bei diesem Verfahren werden Ligand und markierter Bestandteil an einen nicht-spezifischen Binder gebunden und dann pro-

    10

    15

    20

    635438

    portionale Mengen daraus dissoziiert, indem man die Bindung mit einem Bindungspartner herstellt, der grössere Affinität für den Liganden und den markierten Bestandteil besitzt. Die zweckmässigste Form dieses Verfahrens verwendet eine Säule aus dem nicht spezifischen Binder gemäss US-PS 3 659 104. Dieses Verfahren ist dort brauchbar, wo der Ligand an endogene Bindungssubstanzen in der Probe gebunden ist, die, falls sie nicht entfernt werden, die konkurrierende Bindungsreaktion stören würden. Nach der Bindung an den nicht-spezifischen Binder können die endogenen Bindungssubstanzen durch geeignete Wäschen entfernt werden.

    Bezüglich einer Diskussion der Parameter, die in konventionellen heterogenen Testsystemen vorkommen, Testformen und Trennverfahren sei auf Principles of Competitive Protein-Bin-ding Assays, Herausg. Odell und Daughaday (J.B. Lippincott Co, Philadelphia, 1972) verwiesen.

    Selbstverständlich kann man ohne Abweichung vom Erfindungsgedanken andere Reihenfolgen der Zugabe und andere Bindungsreaktionen sowohl bei homogenen wie heterogenen Tests anwenden.

    Die geeigneten Reaktionsteilnehmer, die zusammen mit dem Reagens im Konjugat die Monitor-Reaktion bewirken, können (1) im homogenen Verfahren mit dem spezifischen Bin-dungsreaktionsgemisch in Berührung gebracht werden, oder (2) im heterogenen Verfahren entweder mit der abgesonderten 25 gebundenen oder freien Phase, einzeln oder in jeder beliebigen Kombination vor, gleichzeitig mit oder nach dem Einsetzen der spezifischen Bindungsreaktion. Nach dem Einsetzen der spezifischen Bindungsreaktion wird das Reaktionsgemisch, das einige oder sämtliche der für die Monitor-Reaktion erforderlichen Komponenten enthält, gewöhnlich während eines vorbestimmten Zeitraums inkubiert, ehe Veränderungen der Aktivität des Reagenses im Konjugat (homogene Technik) oder der Aktivitätsmenge in den voneinander getrennten Phasen (heterogene Technik) bestimmt werden. Nach der Inkubationszeit werden allfällige Komponenten, die für die Monitor-Reaktion erforderlich und nicht bereits in ausreichender Menge vorhanden sind, dem Reaktionsgemisch zugesetzt, und die Reaktion wird als Hinweis auf die Anwesenheit bzw. die Menge des Liganden im flüssigen Medium betrachtet.

    Eine bevorzugte Form der Monitor-Reaktion ist ein lumi-neszierendes Reaktionssystem, das vorzugsweise Enzym-kata-lysiert ist, zum Beispiel eine Reaktion, die Biolumineszenz oder Chemilumineszenz erzeugt. Das Reagens im Konjugat kann ein Reaktionsteilnehmer der lichtproduzierenden Reaktion oder einer Reaktion sein, die der Vorläufer einer enzymatischen oder nicht-enzymatischen lumineszierenden Reaktion ist. Jede Veränderung der Aktivität des konjugierten Reagenses, die aus der spezifischen Bindungsreaktion resultiert, verursacht eine Veränderung der Lichtproduktion oder der Gesamtmenge, Peak-Intensität oder des Charakters des erzeugten Lichts. Beispiele für lumineszierende Reaktionssysteme zeigt Tabelle A, die folgende Abkürzungen verwendet:

    ATP AMP NAD NADH FMN FMNH2 hu

    30

    35

    40

    <D H r-| <D £> CO

    Adenosintriphosphat Adenosinmonophosphat Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid Flavinmono-nucleotid reduziertes Flavinmono-nucleotid elektromagnetische Strahlung, gewöhnlich im IR-, sichtbaren oder UV-Bereich

    50

    55

    60

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    Sulfat-

    D.1 )3f, Ç'-Adenosindipliospliat + reduziertes Lucif erinsulf a t ^ran5fe?a.P.?> 3' ,5 '-Adenosindiphosphat oder reduziertes Luciferin

    Ädenosin-S'-phosphat-V-phosphosulfat + reduziertes Luciferin 2) reduziertes Luciferin + 02 hv + oxidiertes Luciferin reduziertes Luminol + H202 feroxidase ^ hv+ oxidiertes Luminol + H20

    reduziertes Pyrogallol + Hp02 ^e^°xi^ase ) hV + oxidiertes

    Pyrogallol + H20

    reduziertes Luminol + 02 > *V + oxidiertes Luminol reduziertes Pyrogallol + 02 Qxyg?nase > hV + oxidiertes Pyrogallol

    Isoluminol + H202 I-aci;operoxida3e > hv + ^inoplitlialat + N2
18. E. P.
19. G.
20. H.
21. I.

    reduziertes Luminol reduziertes Pyrogal= loi reduziertes Luminol reduziertes Pyrogallol

    Isoluminol
22. J. Isoluminol + KO,

    -> hV + Aminophthalat + N,

    Isoluminol oder Katalase p\ CA

    6

    00

    635 438

    8

    Umbellifero!!

    3-Indol

    Weitere Einzelheiten über lumineszierende Reaktionssysteme, die erfindungsgemäss angewandt werden können, finden sich in folgender Literatur: J. Biol. Chem. 236:48 (1961); J.

    Amer. Chem. Soc. 89:3944 (1967); Cornier et al. Bioluminescence in Progress, Herausg. Johnson et al, Princeton Univer- s sity Press (New Jersey, 1966) S. 363-384; Kries, P. Purification and Properties of Renilla Luciferase, Doktorarbeit an der Universität v. Georgia (1967); Am. J. Physiol. 41:454 (1916); Biol.

    Bull. 51:89 (1926); J. Biol. Chem. 243:4714 (1968).

    Eine weitere bevorzugte, empfindliche Monitor-Reaktion io arbeitet mit Fluoreszenz und ist Enzym-katalysiert. In diesem Reaktionssystem ist das Reagens im Konjugat ein Substrat in einer enzymatischen Reaktion, die ein Produkt mit fluoreszierenden Eigenschaften erzeugt, die sich von denen des konjugierten Substrats unterscheiden. Jede Veränderung der Aktivi- is tat des konjugierten enzymatischen Reagenses, die aus der spezifischen Bindungsreaktion resultiert, verursacht eine Veränderung der fluoreszierenden Eigenschaften des Reaktionsge-mischs. Ein allgemeines Reaktionsschema für derartige Enzymkatalysierte Reaktionssysteme lautet wie folgt: 20

    enzymatisches

    Reagens -X-Z (Enzym^ Produkt

    (Substrat)

    25

    In obiger Gleichung bedeutet X eine durch Enzyme spaltbare Bindung oder bindende Gruppe wie zum Beispiel eine Ester- oder Amidgruppe, während Z eine spezifische bindende Substanz ist, die in Abhängigkeit von der verwendeten Technik aus dem Liganden, einem spezifischen Bindungs-Analogon des 30 Liganden oder einem spezifischen Bindungspartner des Ligan- 3—Pyridol den besteht. Spezifische Konjugate, die in diesen Reaktionssystemen eingesetzt werden können, sind verschiedene durch Enzym spaltbare Derivate von Fluorescein, Umbelliferon,

    3-Indol, ß-Naphthol, 3-Pyridol, Resorufin und dergleichen. Bei- 35 spiele möglicher Formeln dieser Derivate zeigt folgende

    ß-Naphthol

    Zusammenstellung:

    Derivate

    Resorufin

    Wormeln

    40

    Fluorescein

    In den obigen Formeln bedeutet R1 -OH oder -X-Z, R2 X-Z und R3-H oder-CHs.

    Ein besonders bevorzugtes Reaktionssystem zur Verfolgung der neuen spezifischen Bindungsreaktion gemäss vorliegender Erfindung ist ein zyklisches Reaktionssystem. In einem solchen Reaktionssystem ist ein Produkt einer ersten Reaktion 50 ein Reagens einer zweiten Reaktion, in welcher als eines der Produkte eine Substanz gebildet wird, die auch ein Reagens bzw. Ausgangsmaterial der ersten Reaktion dartellt.

    Folgendes Diagramm illustriert ein Modell eines zyklischen Reaktionssystems :

    Produkte A ^ ^im Kreislauf befindl.-\ / Reagentien B

    Material (Form 1)

    REAKTION A l Ä REAKTION B

    Reagentien jJ ^ im Kreislauf befindl.1^ ^Produkte B

    Material (Form 2)

    9 635 438

    Im obigen modellhaften zyklischen Reaktionssystem sind von der Menge an Kreislaufmaterial, verwendet man das erzeugt eine kleine Menge an Kreislaufmaterial bei Zufuhr aus- Kreislaufmaterial gerne als Reagens im Konjugat gemäss vorreichender Mengen der Ausgangsmaterialien A und B grosse liegender Erfindung. Beispiele für zyklische Reaktionssysteme Mengen der Produkte A und B. Da Geschwindigkeit und zur Verwendung mit dem neuen spezifischen Bindungsreak-Menge an Produkt, das durch die das zyklische Reaktionssy- 5 tionssystem gemäss vorliegender Erfindung zeigen die Tabel-stem ausmachenden Reaktionen gebildet wird, stark abhängig len B und C:

    Tabelle B

    Produkt A

    ÌTAD ^5

    Enzym Enzym

    A WA UH +%K

    Reagens k' ^NADH

    Reagens B

    Produkt B

    Reagens A oder

    Reaktion Produkt 3

    1

    3

    4

    5

    7

    8

    Lactaldehyd

    Enzym

    Al ko hol-Dehydrogenase

    Reagens B

    oder Produkt A

    Propandiol o^-Ketoglutar- GELu tarn in säure- Glutamat at + NH-Oxalacetat

    Acetaldehyd

    Dehydrogenase

    Apfelsäure-De- Malat hydrogenase

    Alkohol-De-hydrogenase

    C£~Ketoglutar~ Isocitronen-

    at + CO

    säure-Dehydro= genäse

    Dihydroxyace- ot-Glycerin= tonphosphat phosphat-

    Dehydrogenase

    Pyruvat

    1,3-Diphos= phoglycerat

    Milchsäure-De= hydrogenase

    Ithanol Isocitrat

    I- C£-Glycerin= phosphat

    Lactat

    Glyceraldehyd- Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehy= -3-phosphat + drogenase Phosphat

    Nicotinamid-Adenin-dinucleotid

    ++

    reduziertes NAD

    635 438

    10

    Tabelle C

    Produkt A

    Reagens A

    NADP -y Enzym Enzym

    NADPH++«"^

    Reagens A Reaktion oder

    Produkt B

    1

    6-Phospho= gluconat oxidiertes Glutathion

    Enzym

    Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase

    Glutathion-Reductase o-Benzochinon Chinon-Reduc= tase

    Reagens B

    Produkt B

    Reagens B

    oder Produkt A

    Glucose-6-phosphat reduziertes Glutathion

    Hydrochinon

    4

    Nitrat

    Nitrat-Reductase

    Nitrit o£"-Ketoglu= Glutaminsäure- Glutamat tarat + NH, Dehydrogenase

    Nicotinamid-Adenindinucleotid-phosphat

    45

    50

    ++reduziertes NADP

    Die Reaktionssysteme der Tabellen B und C umfassen auch die Kombination sämtlicher dort aufgeführter Reaktionen untereinander. Beispielsweise kann die Reaktion 1 von Tabelle B mit jeder der Reaktionen 2 bis 8 zu einem nützlichen zyklischen Reaktionssystem gepaart werden. Die Tabellen B und C stellen somit 56 bzw. 20 mögliche zyklische Reaktionssysteme zur Verwendung gemäss vorliegender Erfindung dar.

    Zusätzlich zu den zyklischen Reaktionssystemen der Tabellen B und C ist vorgesehen, dass eine der Reaktionen im zyklischen System die enzymatische oder nicht-enzymatische Umwandlung eines spektrophotometrischen Indukators beinhaltet. In diesem System reflektiert sich jede Veränderung der Reaktions- oder Kreisgeschwindigkeit in einer Veränderung der spektrophotometrischen Eigenschaften des Indikators. Verwendet man die bevorzugten colorimetrischen Indikatoren, so ist diese Veränderung eine Farbveränderung. Ein Beispiel eines zyklischen Reaktionssystems mit Umwandlung eines Indi-55 kators ist das System, das man erhält durch Kombination einer Reaktion Reagens B — Produkt B gemäss Tabelle B mit einer Reaktion zwischen einem Oxidations/Reduktions-Indikator und einem Elektronenüberträger. Als Elektronenüberträger kann man Phenazinmethosulfat verwenden. Brauchbare Indikatoren sind die oxidierten Formen von Nitrotetrazol, Thia-zoylblau und Dichlorphenolindophenol.

    Man kann auch ein exponentiell zyklisches Reaktionssystem in das Monitor-Reaktionssystem aufnehmen. Ein Beispiel für ein exponentiell zyklisches Reaktionssystem ist folgendes:

    60

    65

    AMP + ATP Myokinase^ 2 ADP

    ADP + PEP Pyruvatkinase.. ATP + Pyruvat

    Diese zyklische Reaktion ist autokatalytisch in dem Sinn, dass während jedes Zyklus die Menge an Kreislaufmaterial verdoppelt wird. Die Kreislaufmenge nimmt daher exponentiell mit der Zeit zu und führt zu einer hohen Empfindlichkeit. Weitere Einzelheiten über derartige zyklische Reaktionen gibt J. Biol. Chem. 247:3558-3570 (1972).