FI68324B - Specifik bindningsanalysmetod och reagensmedel foer anvaendning daervid - Google Patents

Description

Γ7-55—1 KU ULUTUSJULKAISU , Q -z 0 A

jST» 8 11 utläggningsskrift 683 2 4 C (45) Patentti myönnetty 12 C8 1905 , . Patent racddolat (51) Kv.lk.*/lnt.CI.4 G Oi N 33/536 SUOMI —FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansökning 76111*8 (22) Hakemispäivä — Ansöknlngsdag 2 6.0 4.76 (Fl) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 26.04.76 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 29.10.76

Patentti-ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. — 30.04.85

Patent- och registerstyrelsen v 1 Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 28.04.75 USA(US) 572008 (71) Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana 46514, USA(US) (72) Robert Charles Bogus 1 aski, Elkhart, Indiana, Robert Joseph Carrico, Bremen. Indiana, James Edward Christner, Ann Arbor, Michigan, USA(US) (74) Berggren Oy Ab (54) Spesifinen sitornisanalyysimenetelmä ja siinä käytettävä reagenssiaine -Specifik bindningsanalysmetod och rsagensmedel för användning därvid

Keksintö koskee spesifistä sitomisanalyysimenetelmää nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrittämiseksi ja siinä käytettävää reagenssiainetta.

Radioaktiivisten aineiden käsittelyn vaikeudesta ja vaarallisuudesta johtuen on tehty useita yrityksiä sopivien spesifisten sitomisanalyysijärjestelmien luomiseksi, jotka olisivat yhtä herkkiä ja nopeita kuin radioimmunoanalyysit, mutta joissa ei käytetä radioaktiviteettia sitoutumisreaktion tarkkailuun. Kuten alla on lähemmin selostettu, käsittävät radioaktiivisten atomien tai molekyylien sijasta merkkiaineena käytetyt aineet monenlaisia aineita kuten entsyymejä, fluoresoivia molekyylejä ja bakterio-faageja. Ensin käsitellään "heterogeenistä" tyyppiä olevia spesifisiä sitomisanalyysimenetelmiä, joissa suoritetaan sidotun ja vapaan faasin erotus. Tällainen erotus on välttämätön spesifisen sitomisanalyysin suorittamiseksi, kun merkkiaine sidotussa faasissa ei ole erotettavissa vapaassa faasissa olevasta merkkiaineesta.

Esimerkkejä heterogeenisistä menetelmistä, joita on kehitetty käyttäen entsyymiä merkkiaineena, on selostettu US-patentissa n:ot 3 654 090, 3 791 932, 3 839 153, 3 850 752 ja 3 879 262 sekä julkaisuissa Journal of Inmunological Methods 1:247 (1972) sekä Journal 68324 of Immunology 109:129 (1972). Kaikissa selostetuissa menetelmissä on entsyymi kemiallisesti sidottu joko etsittyyn ligandiin tai sen sitovaan kumppaniin ja konstruoidaan sopiva heterogeeninen spesifinen sitomisreaktiosuunnitelma näytteen kanssa suoritetun inkuboinnin jälkeen, jolloin joko liukenemattomaan osaan tai nestemäiseen osaan liittyvän entsymaattisen aktiviteetin määrä on näytteessä olevan ligand:'-määrän funktio. Entsyymikonjugaattien synteesiin ja kuvaukseen liittyvät ongelmat ovat vakavia epäkohtia tässä lähestymistavassa.

Brittiläinen patentti n:o 1 392 403 ja ranskalainen patentti n:o 2 201 299 selostavat heterogeenista spesifistä sitomisanalyysiä, jossa merkkiaineena käytetään spektrofotometrisesti aktiivisen aineen ei-aktiivista esimuotoa. Näytteen inkuboimisen jälkeen spesifisellä sitomisreaktiojärjestelmällä erotetaan liukenematon ja nestemäinen osa ja nestemäisessä osassa läsnä olevan merkkiaineen määrä, joka on näytteestä paljastettavan ligandin määrän funktio, määritetään suorittamalla sellaisia reaktiovaiheita, jotka muuttavat inaktiivisen merkkiaineen väriä synnyttäväksi tai fluorometrisesti aktiiviseksi aineeksi, joka sen jälkeen mitataan tavanomaisin välinein.

Muita erityyppisiä merkkiaineita käyttäviä spesifisiä sitomisanalyy-simenetelmiä on selostettu seuraavissa: Yhdysvaltojen Kauppaministe-riön (1973) Kansallisen Teknisen Informaatiopalvelun (NTIS) raportissa n:o PB-224 875 selostetaan epäonnistunutta yristystä hemiiniklo-ridin käyttämiseksi merkkiaineena kemiluminenssireaktiolla osoitetussa heterogeenisessa analyysijärjestelmässä. Julkaisussa Nature 219:186 (1968) selostetaan yksityiskohtaisesti määrättyjä radioimmu-noanalyysimenetelmiä ja siinä on luonteeltaan hyvin yleinen ohimenevä viittaus koentsyymien ja virusten mahdolliseen käyttöön merkkiaineena radioisotooppien sijasta. Se ei kuitenkaan tuo mitään valoa siihen, miten analyysi olisi suoritettava käyttäen tällaisia vaihtoehtoisia merkkiaineita tai olisiko tällainen analyysi itse asiassa mahdollinen. Lisätaustaa varten viitataan julkaisuun Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Odell ja Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972), jossa erilaisia tunnettuja analyysikaavioita selostetaan laajasti kuten myös rritä erilaisia aineita ja piirteitä, joita on käytetty merkkeinä spesi isissä sitomisanalyyseissä.

US-patentissa n:o 3 817 837 selostettu entsyymillä merkitty immuno-analyysi on mielenkiintoinen. Tämä menetelmä on homogeenista tyyppiä, 3 68324 sillä se ei edellytä ositetun (so. liukenematon osa/nestemäi-nen osa) spesifisen sitomisreaktiojärjestelmän käyttöä eikä sen edellyttämää erotusmenettelyä, koska entsyymillä merkitty ligandi on sellainen, että entsymaattinen aktiviteetti on estynyt, kun se on reagoinut ligandin sidosparin kanssa. Näin ollen voidaan sidotun merkkiaineen suhdetta vapaaseen muotoon nähden määrittää seuraamalla muutoksia entsymaattisessa aktiviteetissa. Tästä huolimatta tämä menetelmä kärsii siitä, että on vaikeaa valmistaa hyvin tunnusomaisia entsyymillä merkittyjä konjugaatteja ja löytää sellaisia entsyymejä, jotka sopisivat järjestelmän perussuunnitelmaan.

Vaikka useita uudentyyppisiä spesifisiä sitomisanalyysejä on ehdotettu ja tutkittu jäävät radioiminunoanaiyysi ja erilaiset entsyymillä merkityt imrriunoanalyysit eniten käytetyiksi ja parannetuiksi. Molemmissa järjestelmätyypeissä on kuitenkin ilmeisiä epäkohtia, radioimmunoanaiyysissä sen radioaktiivisen aineen käyttö, joka on vaarallista ja vaatii huolellista käsittelyä, ja entsyymillä merkityissä immunoanalyyseissä käyttökelpoisten entsyymillä merkittyjen konjugaattien valmistus-vaikeus .

Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada hyvin soveltuva, monipuolinen ja herkkä parannettu spesifinen sitomisanalyysi-menetelmä ja reagersslaine, joka perustuu sellaisen aineen käyttöön merkkiaineena, joka osoittaa ennakolta määrätyn tark-kailureaktiojärjestelmän ainesosana reagenssiaktiviteettia, jota ainetta tässä nimitetään reagenssiksi .

Keksintö koskee näin ollen spesifistä sitomisanalyysimenetelmää nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrittämiseksi, joka käsittää seuraavat vaiheet: (a) nestemäinen väliaine saatetaan kosketukseen reagenssi-aineen karissa, joka sisältää merkkiaineen ja spesifisen sitovan aineen konjugaatin, jolloin reagenssiaine ja ligandi muodostavat sitomisreaktiojärjestelmän, joka tuottaa (i) merkityn konjugaatin sidotut faasin, jossa spesifinen sitova aine on sidottu siihen spesifisellä sidosparilla ja (ii) merkityn konjugaatin vapaan faasin, jossa spesifinen sitova aine ei ole sidottu siihen spesi.fisellä sidosparilla, j. 4 68324 (b) määritetään merkkiaine joko sidotussa tai vapaassa faasissa nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin mittana, jolle menetelmälle on tunnusomaista se että, merkkiaine on ko-entsyymi ja että menetelmä on tyypiltään homogeeninen, jolloin koentsyymillä merkityn konjugaatin sidottua faasia ja vapaata faasia ei eroteta fysikaalisesti toisistaan ja jolloin koent-syymin aktiivisuus nestemäisessä kokonaisreaktioseoksessa mitataan ja suhteutetaan testatussa väliaineessa olevan ligandin määrään.

Keksintö koskee myöskin reagenssiainetta nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrittämiseksi, joka reagenssiaine käsittää merkkiaineen ja spesifisen sitovan aineen konjugaatin, ja joka reagenssiaine ja ligandi muodostavat sitomisreaktio-järjestelmän, joka tuottaa merkityn konjugaatin sidotun faasin, jossa spesifinen sitova aine on sidottu siihen spesifisellä sidorparilla ja vapaan faasin, jossa spesifinen sitova aine ei ole sidottu siihen spesifisellä sidosparilla, jolloin merkkiaineen määrä joko sidotussa tai vapaassa faasissa on nestemäisessä väliaineessa olevan ligandinmäärän funktio jolle reagenssiaineelle on tunnusomaista se, että merkkiaine on koentsyymi ja että koentsyymillä merkityllä konjugaatilla on mitattavasi! erilainen koentsyymiaktiivisuus sidotussa faasissa verrattuna vapaaseen faasiin, jolloin määritysmenetelmä on tyypiltään homogeeninen, jolloin ei ole tarpeen fysikaalisesti erottaa konjugaatin sidottua faasia ja vapaata faasia toisistaan.

Keksinnön mukaista merkkiainetta voidaan käyttää uudessa homogeenisessa analyysitekniikassa.

Tarkkailureaktiojärjestelmä on edullisesti entsyymikatalysoitu. Tavallisesti valitaan tarkkailureaktiojärjestelmä, joka on erittäin herkkä konjugaatissa olevalle reagenssille. Lumi-noivat tai fluoresoivat reaktiojärjestelmät ovat hyvin käyttökelpoisia tässä suhteessa. Erityisesti edullisia ovat kierto-reaktiojärjestelmät, erityisesti ne joissa reagenssi on kiertävä aine. Edullisista kiertoreaktiojärjestelmistä ovat entsyymi-katalysoidut erityisen edullisia. Konjugaatissa oleva reagenssi on esillä olevan keksinnön mukaan koentsyymi, jonka molekyyli-paino on edullisesti alle 9000.

68324 Tässä yhteydessä on seuraavilla määreillä seuraava merkitys: ligandi on se aine tai aineiden ryhmä, jonka läsnäolo tai määrä nestemäisessä väliaineessa on määritettävä, ligandin spesifinen sidospari on mikä tahansa aine tai aineiden ryhmä, joilla on spesifinen taipumus sitoutua ligandiin muiden aineiden poissulkemiseksi ja ligandin spesifinen sitova analogi on mikä tahansa aine tai aineiden ryhmä, joka käyttäytyy olennaisesti samalla tavalla kuin ligandi ligandin spesifisen sidosparin sidostaipumuksen suhteen.

Uusi homogeeninen analyysitekniikka perustuu osaksi siihen seikkaan, että reaktio ligandin ja sen spesifisen sidosparin välillä, joista reagenssi on sitoutunut toiseen, muuttaa reagenssin aktiviteettia ennakolta määrätyssä reaktiossa, joka reaktio siten toimii välikappaleena spesifisen sitomisreaktion tarkkailussa. Tämä perusilmiö huomioonottaen voidaan esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää suoritettaessa soveltaa erilaisia manipuloivia suunnitelmia mukaanluettuna erilaiset testikokoomukset ja -laitteet. Suositut peruskä-sittelysuunnitelmat ovat suorasidostekniikka ja kilpaileva sidostek-niikka.

Suorasidostekniikassa saatetaan nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän osoitettavaa ligandia, kosketukseen konjugaatin kanssa, jossa reagenssi on sidottu ligandin spesifiseen sidospariin ja sen jälkeen analysoidaan mahdollinen muutos reagenssin aktiviteetissa. Kilpailevassa sidostekniikassa saatetaan nestemäinen väliaine kosketukseen ligandin spesifisen sidosparin kanssa ja konjugaatin kanssa, jossa reagenssi on sidottu ligandiin tai sen spesifiseen sitovaan analogiin tai molempiin ja sen jälkeen analysoidaan mahdollinen muutos reagenssin aktiviteetissa. Kummassakin menettelytavassa määritetään reagenssin aktiviteetti saattamalla nestemäinen väliaine kosketukseen ainakin yhden sellaisen reagenssin kanssa, joka muodostaa reagenssin kanssa ennakolta määrätyn tarkkailureaktion. Ligandin kvalitatiivinen määritys nestemäisessä väliaineessa käsittää saadun reaktion ominaisuuden, tavallisesti nopeuden vertailemisen tarkkaillun reaktion vastaavan ominaisuuden kanssa ligandittomassa nestemäisessä väliaineessa, mahdollisen eron näiden välissä osoittaessa muutosta reagenssin aktiviteetissa. Ligandin kvantitatiivinen määritys nestemäisessä väliaineessa käsittää saadun reaktion ominaisuuden vertaamista vastaavaan ominaisuuteen tarkkailureaktiossa nestemäisissä väliaineissa, jotka sisältävät tunnettuja määriä ligandia.

6 68324

Yleisesti ottaen, kun seurataan homogeenista analyysikaaviota, voidaan spesifisen sitomisreaktion ainesosat, so. nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän ligandia, konjugaatti ja/tai ligandin spesifinen sidospari, yhdistellä missä tahansa määrässä, tavalla ja järjestyksessä, edellyttäen että konjugaatissa olevan reagenssin aktiviteetti muuttuu mitattavassa määrin, kun nestemäinen väliaine sisältää ligandia sellaisessa määrässä tai pitoisuudessa, joka on merkittävä analyysin tarkoituksiin. Spesifisen sitomisreaktion kaikki ainesosat ovat edullisesti liukoisia nestemäiseen väliaineeseen.

Homogeenista suorasidostekniikkaa käytettäessä spesifisen sitomisreaktion ainesosat ovat nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän ligandin, ja konjugaattia, jossa reagenssi on sitoutunut ligandin spesifiseen sidospariin. Konjugoidun reagenssin aktiviteetti sen ollessa kosketuksissa nestemäisen väliaineen kanssa on kääntäen verrannollinen nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin ja konjugaatissa olevan spesifisen sidosparin väliseen sitoutumisastee- seen. Kun näin ollen ligandin määrä nestemäisessä väliaineessa kohoaa konjugoidun reagenssin aktiviteetti alenee.

Homogeenista kilpailevaa sidostekniikkaa käytettäessä spesifisen sitomisreaktion ainesosat ovat nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän ligandia, konjugaattimäärä, joka sisältää ligandiin tai ligandin spesifiseen sitovaan analogiin sitoutuneen reagenssin, sekä ligandin spesifisen sidosparin määrän. Spesifinen sidospari saatetaan olennaisesti samanaikaisesti kosketukseen seka konjugaatin että nestemäisen väliaineen kanssa. Koska mikä tahansa nestemäisessä väliaineessa oleva ligandi kilpailee konjugaatissa ligandin tai. sen spesifisen sidosanalogin kanssa sitoutuakseen spesifisen sidosparin kanssa on nestemäisen väliaineen kanssa kosketuksessa olevan konjugoidun reagenssin aktiviteetti suoraan verrannollinen nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin ja spesifisen sidosparin väliseen sitou-tumisasteeseen. Konjugoidun reagenssin aktiviteetti kohoaa näin ollen sitä mukaa kun ligandin määrä nestemäisessä väliaineessa kohoaa.

Homogeenisen kilpailevan sidostekniikan muunnos on homogeeninen syrjäy-tyssidostekniikka, jossa konjugaatti < nsln saatetaan kosketukseen ligandin spesifisen sidosparin kanssa ja sen jälkeen nestemäisen väliaineen kanssa. Tällöin esiintyy kilpailua spesifisestä sidosparista. Tällaisessa menetelmässä spesifisen sidosparin kanssa kosketukseen 7 68324 saatetun konjugaatin määrä on tavallisesti se, joka käsittää ligandin tai sen analogin yli sen määrän, joka kykenee sitoutumaan spesifisen sidosparin sen määrän kanssa, joka on läsnä sinä aikana, kun konju-gaatti ja spesifinen sidospari ovat kosketuksessa, ennen kosketusta nestemäisen väliaineen kanssa, jonka epäillään sisältävän ligandia. Tämä kosketusjärjestys voidaan toteuttaa kahdella sopivalla tavalla. Toisessa menetelmässä saatetaan konjugaatti kosketukseen spesifisen sidosparin kanssa nestemäisessä miljöössä ennen kosketusta nestemäisen väliaineen kanssa, jonka epäillään sisältävän ligandia. Toisessa menetelmässä saatetaan nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän ligandia, kosketukseen konjugaattia ja spesifistä sidosparia sisältävän kompleksin kanssa, jolloin konjugaatissa oleva spesifinen sitova aine ja spesifinen sidospari on sidottu toisiinsa palautuvasti. Se määrä konjugaattia, joka sitoutuu spesifiseen aineeseensa, joka on kompleksimuodossa toisessa menetelmässä, on tavallisesti yli sen määrän, jonka ligandi kykenee syrjäyttämään nestemäisessä väliaineessa sinä aikana, jona spesifinen sidospari tai kompleksi ja väliaine ovat kosketuksessa ennen konjugoidun reagenssin aktiviteettimuutoksen analyysin suorittamista loppuun.

Toinen muunnos homogeenisesta kilpailevasta sidostekniikasta on homogeeninen sarjakyllästystekniikka, jossa spesifisen sitomisreaktion ainesosat ovat samoja kuin kilpailevassa sidostekniikassa käytetyt, mutta ainesosien lisäysjärjestys tai yhdistelmä ja niiden käytetyt suhteelliset määrät ovat erilaisia. Sarjakyllästystekniikan mukaan saatetaan ligandän spesifinen sidospari kosketukseen nestemäisen väliaineen kanssa, jonka epäillään sisältävän ligandia, joksikin ajaksi ennen mainitun nestemäisen väliaineen saattamista kosketukseen konjugaatin kanssa. Nestemäisen väliaineen kanssa kosketukseen saatetun spesifisen sidosparin määrä on tavallisesti suurempi kuin se määrä, joka kykenee sitoutumaan koko ligar.dimäärän kanssa, jonka oletetaan olevan läsnä nestemäisessä väliaineessa aikana, jolloin spesifinen sidospari ja nestemäinen väliaine ovat kosketuksessa ennen kuin nestemäinen väliaine joutuu kosketukseen konjugaatin kanssa. Konjugoidussa muodossa olevan ligandin tai ligandianalogin määrä on tavallisesti suurempi kuin se määrä, joka kykenee sitoutumaan spesifisen sidosparin jäljellä olevan sitoutumattoman määrän kanssa sinä aikana kun nestemäinen väliaine ja konjugaatti ovat kosketuksessa ennenkuin konjugoidun reagenssin mahdollisen aktiviteettimuutoksen analysointi saatetaan loppuun.

8 68324

Konjugoidun reagenssin aktiviteetinmuutcksen vahvistaminen ennakolta määrätyn tarkkailureaktion ainesosana aikaansaadaan edullisesti saattamalla spesifinen sitomisreaktioseos kosketukseen vähihtään yhden sellaisen aineen kanssa, joka muodostaa konjugoidun reagenssin kanssa tarkkailureaktion ja määrittämällä spesifisen sitomisreaktion vaikutus tällaisen reaktion ominaisuuteen.

Alla on lyhyt selostus muutamista erilaisista sitomisreaktio-kaavioista.

Joskin merkkiominaisuus merkityssä konjugaatissa, kuten radio-aktiviteetti tai entsymaattinen aktiviteetti tavanomaisissa heterogeenisissa spesifisissä sitomisanalyysimenetelmissä, kuten radioimmunoanalyyseissä, ja heterogeenisissa entsyyni-immunoana-lyyseissa, on olennaisesti sama konjugaatin sidotulle ja vapaalle muodolle vaikuttaa määrätyissä tapauksissa merkityn konjugaatin sitoutuminen esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä reagenssin aktiviteettiin merkkiaineena. Tässä tilanteessa tarkkailureaktiolla on suhteellisen vakio luonne, kun ligandia ei ole läsnä nestemäisessä väliaineessa tai kun sitä on läsnä merkityksettömän pienessä määrässä. Kun ligandia on läsnä nestemäisessä väliaineessa muuttuu tarkkailureaktion ominaisuus tai luonne, kuten yllä on selostettu homogeenisen tekniikan yhteydessä. Alla oleville kaavioille pätevät seuraavat selitykset: 68324 a

Symboli Määritelmä L tutkittava ligandi © ligandi tai sen spesifinen sidosanalogi B ligandin sidospari * merkkiaine, so. reagenssi |- liukenematon faasi -> haudutusajanjakso, jota seuraa sopiva erotus (lim) rajoitettu; läsnä vähemmässä määrässä kuin se, joka kykenee sitoutumaan kaikkiin saatavissa oleviin sidoskohtiin valituissa reaktio-olosuhteissa valitun haudutusajanjakson aikana; so. ainesosa johon sitoutumisesta muut ainesosat kilpailevat (exc) ylimäärä, läsnä määrässä joka on suurempi kuin mitä kykenee sitoutumaan kaikkiin läsnä oleviin sidoskohtiin valituissa reaktio-olosuhteissa valittuna haudutusajanjaksona 1. Kilpailevien sidosten heterogeenisia järjestelyjä a) L +(Γ)* + B(lim) -> + liukenemattomaksi tekevä aine B:tä tai © * varten Tämä on klassinen lähestyrnistäpä kilpailevaan sitomiseen. Esimerkkejä tällaisista liukenemattomaksi tekevistä aineista ovat spesifiset saostavat vasta-aineet, spesifiset liukenemattomaksi tehdyt vasta-aineet ja, kun B tai(L)* on proteiinipitoinen aine, proteiinin saostajat, kuten ammoniumsulfaatti tai kun B tai(L)* on pieni adsorboitava molekyyli, dekstraanilla päällystetty puu-hiili. Selostus samantapaisista järjestelmistä on julkaisussa Biochem. J. 88:137 (1963) ja US-patentissa n:o 3 839 153 (FI-P 54034).

b) L +©* + |-B(lim) -> Tätä lähestymistapaa kutsutaan tavallisesti kiintofaasiteknii-kaksi. Selostuksia samantapaisista radioimmunolanalyysi- ja. entsyymi-immunoanalyysitekniikoista on US-patenteissa n:ot 3 505 019, 3 555 143, 3 646 346 ja 3 654 090.

c) L + B* + |-@(iim) -»

Referenssi: US-patentti n:o 3 65^ 090.

d) L + J"(L) + Bx (lim)-->

Referenssi: US-patentti n:o 3 850 752 (FI-P 54033).

68324 10 2. Heterogeenisiä sarjakyllästysjärjestelyjä a) L + B(exc) -> + (D X (exc) -? + liukenemattomaksi tekevä aine B:tä tai (E)* varten

Sarjakyllästystekniikassa merkkiainesosa sitoutuu joihinkin tai kaikkiin niihin sidoskohtiin aineessa B, jotka jäävät jäljelle ensimmäisen haudutusjakson jälkeen.

b) L + J- B(exc)--} + © * (exc) -^

Selostuksia samantapaisista radioimmunoanalyysi- ja entsyymi-immu-noanalyysitekniikoista löytyy US-patentista n:o 3 720 760 (FI-P 48785) ja julkaisusta J. ImmunoL. 209:129 ( 1972 ).

c) L + B* (exc) -> + |-(E)(exc) -> 3. Heterogeeninen kerrostusjärjestely L + |“ B (exc) -^ B* (exc) ->

Kerrostustekniikassa merkkiainesosa sitoutuu joihinkin tai kaikkiin liukenemattomaksi tehtyihin sidospareihin sitoutuneisiin ligandimolekyyleihin.

Referenssi: US-patentti n:o 3 720 760 (FI-P 48785).

4. Heterogeeninen kiintofaasilaimennusjärjestely L + (E) x + |- (ei-spesifinen) —--> + B (lim) -y Tässä tekniikassa ligandi ja merkkiainesosa sidotaan ei-spesifi-fiseen aitojaan ja sen jälkeen siitä dissosioidaan suhteellisia määriä sidosparilia sitomalla, jolla on suurempi affiniteetti ligandiin ja merkkiainesosaan. Tämän tekniikan kaikkein käyttö-kelpoisimmassa muodossa käytetään ei-spesifisen sitojan kolonnia, kuten on selostettu US-patentissa n: o 3 6‘39 104. Tällainen tekniikka on käyttökelpoinen, kun ligandi on sidottu endogeenisiin sitoviin aineisiin näytteessä, jotka häiritsisivät kilpailevaa sitomisreaktiota jollei niitä poistettaisi. Tultua sidotuksi ei-spesifiseen sitojaan voidaan endogeeniset sitovat aineet poistaa sopivilla pesuilla.

Tavanomaisiin heterogeenisiin analyysijärjestelmiin liittyviä parametreja, kuten analyysijärjestelyjä ja vaihtoehtoisia erotusmenetel- 68324 11 miä selostetaan yksityiskohtaisemmin julkaisussa Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Odell ja Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972).

Sopivat reaktioainesosat, jotka muodostavat yhdessä konjugaa-tissa olevan reagenssin kanssa tarkkailureaktion, voidaan saattaa kosketukseen spesifisen sitomisreaktiosecksen kanssa homogeenisen tekniikan mukaisesti. Spesifisen sitomisreaktion käynnistämisen jälkeen reaktioseosta, joka voi sisältää jonkin tarkkailu-reaktiota varten välttämättömän ainesosan tai kaikki, inkuboidaan tavallisesti ennakolta määrätyn ajan ennen kuin konjugaatissa olevan reagenssin mahdollinen aktiviteett-imuutos vahvistetaan (homogeeninen tekniikka). Inkubointijakson jälkeen lisätään reak-tioseokseen kaikkia tarkkailureaktioon tarvittavia ainesosia, joita ei vielä ole läsnä riittävissä määrissä reaktiosecksessa, ja tarkkailureaktio vahvistetaan osoituksena nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin läsnäolosta tai määrästä.

Eräs suosittu muoto tarkkailureaktiosta on luminoiva reaktiojär-jestelmä, edullisesti entsyymikatalysoitu, kuten bioluminenssi-tai kemiluminenssi-ilmiön omaava reaktio. Konjugaatissa oleva reagenssi voi olla reagenssi joko valoa kehittävässä reaktiossa tai reaktiossa, joka edeltää entsymaattista tai ei-entsymaattista luminenssireaktiota. Mikä tahansa spesifisestä sitomisreaktiosta johtuva konjugoidun reagenssin aktiviteetin muutos aiheuttaa muutoksen valon kehittymisnopeudessa tai kehitetyn valon kokonaismäärässä, huippuintensiteetissä tai ominaisuudessa. Esimerkkejä luminoivista reaktiojärjestelmistä on taulukossa A, jossa on käytetty seuraavia lyhenteitä: ATP adenosiinitrifosfaatti AMP adenosiinimonofosfaatti NAD nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi NADH pelkistetty nikotiiniamidiaueniinidinukleotidi PMN flaviinimononukleotidi PMNHj pelkistetty flaviinimononukleotidi hv sähkömagneettinen säteily, tavallisesti infrapuna- alueella, näkyvällä alueella ta'i ultraviolettialueella 68324 12 ’Ρ ·Η ·Η ω ι γη ρ Μ ·Η ο Ο

C Ό β I β I

·Η ·Η Ο ·Η Ο M β H β g β ·Η β >3 β >3 φ ή ι—ι ρ ρ ρ β 2 w ^ Ο ϊ>3 ϊ>3 1¾ Ρ Ή 3 Ρ β , Ρ Ρ ρ ρ ρ ρ

Ρ Φ 'Π Ρ Ρ Ρ p O O

•η ·η ό -ρ α> α> φ φ c c o CO Cti Ρ Ρ Ρ ·Η ρ Ρ ·Η ·Η ·Η 50 -Ρ I cd CO ΜΗ (Π W H g g 3 CM - Cd Ρ ·Η O ·Η ·Η O Ρ 3 •-3 W K ιτ\<β λ; j* ρ χ λ: ρ ρ ρ

β Ρ 2 Q *> CC ι—I ι—trHi—I ι—ji—IOO

O EH S <C -Ο Φ φ cd φ φ cd co co «c p 2 rocp a p 50 ρ p 50 ρ p

•H P

β β Ή

'*“! ·Η i—I

β Ρ ·Η O

p β β β Ρ Ρ φ φ ρ Ή (—j

φ *ρ <Μ Ρ rH cd CM

ρ ·Η ·Η φ Ο 50 2 Ρ co op β co «J β 3 φ Ρ Ρ β + X Η Ρ Q. Ρ g >3 cd ω β ο, -η + ι Ρ χ ρ ρ ρ η Ρ φ β Ρ ρ £ ρ + ρ β ρ cd S CM λ. ·ι I φ cdppcd

<< ffi -H Ρ ;> X Ρ Φ P CM

_ 2; ^ β Ρ X Φ -P cti 2

CP + S Ρ Ρ Φ + Cti . + Ρφ P

P P co β <H χ A φ ρ p + p ? cdo-H-H IK p> p cd o 2 X ·Η Ή + cd χ; CO Ρ + ·Η X cd X β ·Η

Ρ CO β β CO β P CO X ·Η P

2> ^ cd φ Ρ φμ p cti ?cd A + gp < Λ cd χ o < PiP o cd x cd + cd cd

Hi ^ ^ cd fy 2l Ή oj>3 Ρ Ό χ p. cd

β Φ P EC CO · IX Ρ ι I . p -H ;> X 4- ι—I

φρρ a. β p pa3 /vco co χ cd •H β .H + V r—I f—' + Φ CO X cd a ^3 p

to :cd co · p Ρ P O o cd ^ χ P

:cd cd Ρ β p O CO CM O CO CO P £ Ό Λν . H O

g cd β pM Q Cd o ρ p cd co φ p -h co » β ρ β fed P cd ρ χ cd o p co to β ^ ρ φ φ cm (d β + cd ρ β ρ cm χ cdcd -h g ρ Ρ ή o x; φ Χ3ΦΦΙ o cm o cd β co cd cOtHH M ·γΙ Ρ P - O £ βφ β φΟβ+βΟΌβ COLO + C\J Φ φ 50 Cti + n> 3 Ρ Φ β >3 Φ + β I K p 50 >3 Ό β 1 I ' Ρ β Ό X β cd ·Η Ρ Ρ >3 C0 Ρ ρ

;Cd Ό ·Η >3 Φ ·Η ·Η £ Ρ β β + CM ΟΛΙ COX

•>-3 Ή >3ΧΧ Ό β Ρ Ρ ρ ·Η ·Η O XscJ Ο Ο β X T-j Φ Ρ ·<~3 Ρ ·Η Cd ·Η ·Η ·Η CM O O a •η ή φρό cdpcdpcd££p X cm β ' Ρ·Η ΌΦΙ ΦCdPPφφO Οφ .ϋβ Η ,ϋ S β Ä PcdcnP Ρ β + Ο CM Ρ edo cdxdQ φ ccd co cd o ·η ·η ·η ρΟ + ο ΦΡ X < β^£| OPPeO CO g ·ΗΧ Ρ β·Η βρχ ·ΗΡ ΡΡΙβ β 30 Ρ +·Η X.

C0 Φ·γΗ β·Η·Ηβ·-(—ΙΡι—ICMO+ Ρ Cd cd β 3P_—iPT3corP Kp -HO Ρ

Ρ ·Η Ρ Ρ I >3 >3 >1 f—I ·Η I—IP

•Η 3 + Φ+β -HPPp+ctiPOP CM

O >3 "r-j !Χ^ ·Η --H β ρ ρ ρ 500 β cd Ο cm

β-ρ -PIS ad 2 Ρ Ρ ·Η φ φ φ·Η cdP-H 50 cm O

Η ρ Φ2 + ΛΙ2 m ρήρ ρ ρ ρ βρ g ο χχ·η §Φ ΛΙΡ PpOcdcocococoo>3Cd3£ co p-Ρ ‘-Cd 2·Η β cd Ο ·Η Ή ·Η β Ρ 50 ι—I >3 + + cd

Po ^ί+εΡ+ΦΡβ^Ι,^ΛΙ-Η Ο Ρ Cd

•Η Ρ Ρ OP<l)PPPg>jjH>3 ·Η ·Η ι—I

γΜ -Η > +βββχ)ΦΦΦβρ>3Ρ>3 pped ρ ρ χ + Xicocdpppppppp οορ φ CM- φ φ ρ β β cd p+mmm ρρφ-Η-Η^ι 02« cncopgg "^· CM S — Ή *H CO 3 β Ρ IX 2 Ρ ^ ^ χ ρ .-η ρ cd Ρ 2 ΡΡ^ΙΟΟΡ Ε-ι S, ^ ^ ^ φ φ Φ co co <dpPCM ρ ρ ρ ρ Ρ Ρ ικ Ο ΡΡΟΧμρ

Lisäyksityiskohtia ja selostusta koskien luminoivia reaktio- järjestelmiä, joita voidaan käyttää esillä olevassa menetelmässä, on seuraavissa viitejulkaisuissa: 13 68324 J. Biol. Chem. 236:48 (1961).

J. Amer. Chem. Soc. 89:3944 (1967).

Cornier ym., Bioluminescence in Progress, Johnson ym., Princeton University Press (New Jersey, 1966), s. 363-84.

Kries, P. Purification and Properties of Renilla Luciferase, tohtorinväitöskirja University of Georgia (1967).

Am. J. Physiol. 41:454 (1916).

Biol. Bull. 51:89 (1926) .

J. Biol. Chem. 243:4714 (1968).

Reaktiojärjestelmä, joka on erityisen käyttökelpoinen esillä olevan keksinnön mukaisen uuden spesifisen sitomisreaktion tarkkailemiseksi on syklinen tai kiertoreaktiojärjestelmä. Tällainen reaktiojärjestelmä on sellainen, jossa ensimmäisen reaktion tuote on reagenssi toisessa reaktiossa, jonka toisen reaktion jokin tuote on aine, joka myös on reagenssi ensimmäisessä reaktiossa .

Alla oleva kaavio esittää mallia syklisestä reaktiojärjestelmästä:

Tuotteet A Kierrätetty aine Reagenssit B

X (muoto 1)

I REAKTIO B

Reagenssit A Kierrätetty aine Tuotteet B

(muoto 2)

Yllä olevassa syklisessä mallireaktiojärjestelmässä synnyttää pieni määrä kierrätettyä ainetta, jos sille annetaan riittäviä määriä reagensseja A ja B, suuria määriä tuotteita A ja B. Koska kiertoreaktiojärjestelmän muodostavien reaktioiden tuottamien tuotteen osuus ja määrä on erittäin herkkä läsnä olevan kierrätetyn aineen määrälle, on edullisinta käyttää kierrätettyä ainetta reagenssina esillä olevan keksinnön konjugaatissa. Taulukoissa B ja C on annettu esimerkkejä esi?lä olevan keksinnön uuden spesifisen sitomisreaktiojärjestelmän yhteydessä käytettäväksi tarkoitetuista syklisistä reaktiojärjestelmistä.

68324 14

TAULUKKO B

tuote A „ - reagenssi B

entsyymi entsyymi reagenssi A tuote B

reagenssi A reagenssi B

tai t ai reaktio tuote B entsyymi tuote A__ 1 laktaldehydi alkoholide-^ propaanidioli hydrogenaasi 2 α-ketoglutaraat- glutaamidehyd- glutamaatti ti + NH-j rogenaasi 3 oksaloasetaatti maieiinidehyd- malaatti rogenaasi ^ asetaldehydi alkoholidehyd- etanoli rogenaasi 5 α-ketoglutaraat- isositruunahappo- isositraatti ti + CO2 dehydrogenaasi 6 dihydroksiaseto- a-glyserolifos- L-a-glyseroli- nifosfaatti faattidehydro- fosfaatti genaasi 7 pyruvaatti maitohappode- laktaatti hydrogenaasi 8 1,3-difosfogly- glyseraldehydi- glyseraldehydi-3- seraatti 3-fosfaattide- fosfaatti + hydrogenaasi fosfaatti

x nikot iiniamidiadeniinidinukleotidi Kx pelkistetty NAD

15 taulukko c 68324

tuote A ^^>NADFx reagenssi E

entsyymi entsyymi

reagenssi A NADPH tuote B

reagenssi A reagenssi B

tai tai

reaktio tuote B entsyymi tuote A

1 6-fosfoglu- glukoosi-6-fosfaatti- glukoosi-6- konaatti dehydrogenaasi fosfaatti 2 hapetettu glu- glutationireduktaasi pelkistynyt tationi glutationi 3 p-bentsokinoni kinonireduktaasi hydrokinoni 4 nitraatti nitraattireduktaasi nitriitti 3 α-ketogluta- glutamiinidehydro- glutamaatti raatti + NH·* genaasi

* nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatti xx pelkistetty NADP

On huomattava, että taulukoissa B ja C esitetyt sykliset reaktiojär-jestelmät käsittävät minkä tahansa kyseisissä taulukoissa lueteltujen reaktoiden yhdistelmän minkä tahansa muun siinä luetellun reaktion kanssa. Taulukossa B oleva reaktio 1 voidaan esimerkiksi yhdistää minkä tahansa reaktion 2-8' kanssa käyttökelpoisen syklisen reak-tiojärjestelmän muodostamiseksi. Siten taulukot B ja C edustavat 56 ja 20 mahdollista esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoista syklistä reaktiojärjestelmää.

Taulukoissa B ja C esitettyjen syklisten reaktiojärjestelmien lisäksi on ajateltavissa, että jokin syklisen reaktiojärjestelmän reaktioista voi käsittää spektrofotometrisen indikaattorin, edullisesti kolori-metrisen, entsymaattisen tai ei-enrsymaattisen konversion. Tällaisessa järjestelmässä mikä tahansa muutos reaktionopeudessa tai kiertonopeudessa kuvastuisi indikaattorin spektrofotometristen ominaisuuksien muutoksessa. Suosittuja kolorimetrisiä indikaattoreita käytettäessä tällainen muutos olisi värinmuutos. Esimerkkinä syklisestä reaktio-järjestelmästä, joka käsittää indikaattorin konversion, on järjestel 16 68324 mä, joka saadaan yhdistämällä jokin reagenssi B- tuote B-reaktioista taulukosta B hapetus-pelkistysindikaattorin ja elektronin siirtoai-neen sisältävän reaktion kanssa. Eleketronin siirtoaineena voidaan käyttää fenatsiinimetosulfaattia. Käyttökelpoisia indikaattoreita ovat nitrotetratsoliumin, tiatsoyylisinisen ja dikloorifenoli-indofenolin hapettuneet muodot.

On myös ajateltavissa, että tarkkailureaktiojärjestelmään sisällytetään syklinen eksponentiaalireaktiojärjestelmä. Esimerkki eksponentiaalisesta kiertoreaktiojärjestelmästä on seuraava:

AMP * ATP rcyyjLina.as.i 2 ADP

ADP ♦ PEP Pyruvaat^ij^asi.. ATP * pyruvaatti Tällainen kiertoreaktio on autokatalyyttinen siinä mielessä, että kierrätetyn aineen määrä kaksinkertaistuu kunkin kierron aikana. Kiertonopeus kohoaa sen vuoksi eksponentiaalisesti ajan kanssa ja mahdollistaa suuren herkkyysasteen. Lisää yksityiskohtia ja tällaisiin syklisiin reaktioihin liittyvää selostusta löytyy julkaisusta J. Biol. Chem. 247; 3558-70 (1972).

Esillä olevaa keksintöä voidaan soveltaa minkä tahansa sellaisen ligandin havaitsemiseen, jolle on spesifinen sidospari. Ligandi on tavallisesti peptidi, proteiini, hiilihydraatti, glykoproteiini, steroidi tai muu orgaaninen molekyyli, jolle on spesifinen sidospari biologisissa järjestelmissä tai joka on syntetisoitavissa. Toiminnallisessa mielessä ligandiksi valitaan tavallisesti antigeeni tai sen vasta-aine, hapteeni tai sen vasta-aine, tai hormooni, vitamiini, metaboliitti tai farmakologinen aine, tai näiden reseptori tai sitova aine. Erityisesimerkkejä keksinnön mukaisesti havaittavista ligan-deista ovat hormoonit, kuten insuliini, korioniini-gonadotropiini, tyroksiini, liotyroniini ja estrioli, antigeenit ja hapteenit kuten ferritiini, bradykinniini, prostaglandiinit ja syövälle spesifiset vasta-aineet, vitamiinit kuten biotiini, vitamiini-B-^, foliinihappo, vitamiini-E, ja askorbiinihappo, metaboliitit kuten 3',5'-adenosiini-monofosfaatti ja 3',5'-guanosiinimonofosfaatti, farmakologiset aineet kuten dilantiini, digoksiini, morfiini, digitoksiini ja barbituraatit, vasta-aineet kuten mikrosomaali-vasta-aine ja hepatitiksen ja allergeenien vasta-aineet, sekä spesifiset sidosreseptorit kuten tyroksiini ja sitova globuliini, avidiini, sisäinen tekijä ja transko-balamiini.

O

* ' VJL

17 68324

Keksinnön mukaisessa konjugaatissa reagenssi on sidottu tai kytketty spesifiseen sitovaan aineeseen, joka on ligandi, ligandin spesifinen sitova analogi tai ligandin spesifinen sidospari riippuen valitusta analyysikaaviosta, niin että reagenssin aktiviteetista säilyy mitattava määrä. Reagenssin ja spesifisen sitovan aineen välinen sidos on tavallisesti olennaisesti irreversiibeli analyy-siolosuhteissa, esim. kun tarkkailureaktio, jossa reagenssilla on aktiviteettia, ei ole suunniteltu kemiallisesti tuhoamaan tällaista sidosta, kuten yllä mainituissa luminoivissa ja syklisissä reaktiojärjestelmissä. Määrätyissä tapauksissa tällainen sidos on kuitenkin tahallisesti tuhottu tai siihen vaikutetaan muulla tavoin valitulla tarkkailureaktiolla reagenssin aktivi-teettimuutoksen analysoimiseksi. Tällainen tapaus on aikaisemmin mainituissa entsymaattisissä fluoresoivissa substraattireak-tiojärj estelmissä.

Reagenssi voidaan suoraan sitoa spesifiseen sitovaan aineeseen, niin että konjugaatin molekyylipaino on pienempi tai sama kuin reagenssin ja spesifisen sitovan aineen ryhmämolekyylipaino.

Reagenssi ja spesifinen sitova aine sidotaan kuitenkin tavallisesti väliryhmällä, jossa on 1-50 ja edullisesti 1-10 hiiliatomia tai heteroatomia, kuten typpeä, happea, rikkiä, fosforia, jne. Esimerkkejä yhden atomin sisältävästä väliryhmästä on metyleeni-ryhmä (yksi hiiliatomi) ja aminoryhmä (yksi heteroatoml). Väli-ryhmän molekyylipaino on tavallisesti korkeintaan 1000 ja edullisesti alle 200. Väliryhmä sisältää hiiliatomien tai hetero-atomien tai näiden yhdistelmäketjun ja on yhdistetty reagenssiin ja spesifiseen sitovaan aineeseen tai näiden aktiiviseen johdannaiseen yhdysryhmällä, joka tavallisesti on esteri-, amido-, eetteri-, tioesteri-, tioeetteri-, asetaali-, metyleeni- tai aminoryhmän muodossa.

Konjugaatissa käytetään monikäyttöisyyden ja soveltuvuuden takia reagenssina koentsyymejä. Koentsyymi on ei-proteiinimolekyyli, joka siirtyy yhdestä entsyymiproteiinista toiseen edesauttaen entsyymin tehokasta katalyyttistä toimintaa. Kaikilla tunnetuilla koentsyymeillä on molekyylipaino, joka on alle 9000, edullisesti alle noin 5000. Käyttökelpoisia koentsyymejä ovat nukleotidiko-entsyymit, erityisesti ne, jotka sisältävät adeniinirybmiä, 68324 18 kuten adenosiinifosfaatit (so. mono-, di- ja trifosfaatti-muodot), nikotiiniamidiadeniinidinukleotidit ja sen pelkistetyt muodot, nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatit ja sen pelkistetyt muodot. Muita käyttökelpoisia koentsyymejä ovat guanosiinifosfaatit, flaviinimonomukleotidi ja sen pelkistetyt muodot, flaviiniadeniinidinukleotidi ja sen pelkistetyt muodot, koentsyymi A ja sen tioesterit sukkinyylikoent-syymi A, mukaanluettuna, 3', 5 ’ -adenosiinidifosfaatt.i ja adenosiino-3'-fosfaatti-5'-fosfosulfaatti mukaanluettuna.

Käyttökelpoisia koentsyymiaktiivisia konjugaatteja ovat nuk-leotidikoentsyymit, joissa on adeniiniryhmä, johon spesifinen sitova aine, so. ligandi, ligandin spesifinen sitova analogi tai ligandin spesifinen sidospari on sitoutunut suoralla sidoksella tai väliryhmällä, kuten yllä on selostettu. Sellaisilla koentsyymiaktiivisilla konjugaateilla, jotka sisältävät adenosiinifosfaattia, nikotiiniamidiadeniinidinukleotidia tai sen pelkistettyä muotoa, nikotiiniadeniinidinukleotidifos-faattia tai sen pelkistettyä muotoa, on seuraava yleinen kaava: 19 68324 nifosfaatit, flaviinimononukleotidi ja sen pelkistetyt muodot, fla-viiniadeniinidinukleotidi ja sen pelkistetyt muodot, koentsyymi A ja sen tioesterit sukkinyylikoentsyymi A, mukaanluettuna, 3' t5'-3ideno-siinidifosfaatti ja adenosiini-3'-fosfaatti-5'-fosfosulfaatti mukaanluettuna.

Käyttökelpoisia koentsyymiaktiivisia konjugaatteja ovat nukleotidi-koentsyymit, joissa on adeniiniryhmä, johon spesifinen sitova aine, so. ligandi, ligandin spesifinen sitova analogi tai ligandin spesifinen sidospari on sitoutunut suoralla sidoksella tai väliryhmällä, kuten yllä on selostettu. Sellaisilla koentsyymiaktiivisilla konju-gaateilla, jotka sisältävät adenosiinifosfaattia, nikotiiniamidiade-niinidinukleotidia tai sen pelkistettyä muotoa, nikotiiniamidiadenii-nidinukleotidifosfaattia tai sen pelkistettyä muotoa, on seuraava yleinen kaava: , v f*; 3 'l.

68324 20 κ1'Ί\Γ°^15 OH l2 jossa R1 on 0° f f _ -O-P-O0 , , -O-P-O-Ij-O®

0 CO

οΘ οΘ 00 o0 f 4 -O-P-O-i-O-P-O® , tai -O-P-O-P-O-CH- 0 R ; 6 J i 4 ft \

OH OH

00 jossa R2 on -OH tai -O-P-O0; Ä j ossa r3 on

NH2 R5 NH2 NHRS

hY; <Vj« <-"rS

χνΛν^ T2 R5 NH2 YH2

</ΝΊΐ ni® 1N /Y^N

I I * I |0

Dii n5

jossa R on K

-®Q> - Q

. * * conh2 conh.

V L

21 68324 jossa R5 on -Y-Z, jossa Y on sidos tai väliryhmä, ja jossa Z on li-gandi, ligandin spesifinen sitova analogi tai ligandin spesifinen sidospari. Yllä mainittu kaava edustaa koentsyymiaktivoidun konjugaa-tin ionoituja muotoja, protonoidut tai happamat muodot ovat kuitenkin yhtä käyttökelpoisia. Protonisoitumisen laajuus riippuu miljöön pH:sta. Tällaisten konjugaattien suoloja voidaan myös käyttää silloin kun se on sopivaa.

Yllä mainittujen yhdisteiden lisäksi ovat käyttökelpoisia koentsyymi-aktiivisia konjugaatteja adenosiinifosfaatit, joihin spesifinen sitova aine on sidottu fosfaattiryhmän välityksellä. Tällaisilla yhdisteillä on seuraava yleinen kaava: nh2 /Y^n

R1-ch2 0 \ -KkJ

o

OH OH

β β β • 1 I p | I 9 jossa Fr on -O-P-O-Fr , -O-P-O-P-O-Fr tai 0 0 8 β β β -O-^-O-^-O-P-O-R2 8 8 8 jossa R2 on -Y-Z; Y on sidos tai väliryhmä ja Z on ligandi, ligandin spesifinen sitova analogi tai ligandin spesifinen sidospari. Sopivissa tapauksissa voidaan myös käyttää protonoituja tai happamia muotoja kuten myös suolamuotoja.

Keksinnön eräässä muodossa ovat spesifisen sitomisreaktion ainesosat, jotka on yhdistettävä nestemäisen väliaineen kanssa, jonka epäillään sisältävän ligandia, nestemäisessä tai kiinteässä muodossa. Suositussa homogeenisessa analyysijärjestelmässä ainesosat ovat tavallisesti liuosmuodossa tai kiinteässä muodossa, joka helposti liukenee nestemäiseen väliaineeseen. Koska testattava nestemäinen väliaine tavallisesti on luonteeltaan vesipitoinen ovat ainesosat tavallisesti vesiliukoisessa muodossa, so. joko vesiliuoksessa tai vesiliukoisessa 22 68324 kiinteässä muodossa, kuten jauheena tai hartsina. Analyysimenetelmä voidaan suorittaa tavallisessa laboiatorioastiassa kuten koeputkessa, jolloin spesifisen sitomisreaktion ainesosat ja reaktiojärjestelmän ainesosat lisätään siilien kiinteässä tai nestemäisessä muodossa.

On myös ajateltavissa, että yksi tai useampi spesifisen sitomisreaktion ainesosista ja/tai yhtä tai useampaa tarkkai1ureaktion ainesosista lisätään kantajan kanssa. Eräässä suoritusmuodossa kantaja voi olla nestettä sisältävä astia kuten koeputki tai kapseli, joka sisältää tällaisen ainesosan tai ainesosia sisäosassaan, esim. nestemäisessä tai irtonaisessa kiinteässä muodossa tai kerroksen muodossa astian sisäpinnalla. Eräässä toisessa suoritusmuodossa kantaja voi olla matriisin muodossa, joka on liukenematon ja huokoinen sekä edullisesti absorboi testattavaa nestemäistä väliainetta. Tällainen matriisi voi olla imupaperi, polymeerifilmejä, -kalvoja, -nukkaa tai -paloja, geelejä jne. Tavallisessa muodossa laite muodostaisi sopivan välikappaleen testattavan nestemäisen väliaineen saattamiseksi kosketukseen, spesifisen sitovan reaktion ja/tai tarkkailureaktion suorittamiseksi sekä saadun tuloksen havaitsemiseksi.

Nestemäinen testattava väliaine voi olla luonnossa esiintyvä tai keinotekoisesti muodostettu neste, jonka epäillään sisältävän ligandia ja se on tavallisesti biologinen juokseva aine tai tämän laimennuksen tai muun käsittelyn tuloksena, saatu neste. Keksinnön mukaisella menetelmällä analysoitavia biologisia nesteitä ovat seerumi, plasma, virtsa ja sikiövedet sekä aivo- ja selkäydinnesteet. Muita aineita kuten kiinteää ainetta, esim. kudosta, tai kaasuja voidaan analysoida saattamalla ne nestemuotoon kuten liuottamalla kiintoaine tai kaasu nesteeseen tai nesteuuttamalla kiintoainetta.

Päin vastoin kuin ennestään tunnetussa homogeenisessa analyysijärjes-telmässä voidaan biologisia nesteitä, jotka sisältävät aineita, joilla on reagenssiaktiviteetti, joka on samanlainen tai identtinen konju-goidun merkkiaineen kanssa, analysoida ligandin suhteen ilman tausta-häiriötä. Endogeenista taustareaktioaktiviteettia voidaan helosti eliminoida usealla tavalla. Biologinen neste voidaan käsitellä endo-geenisen reagenssiaktiviteetin tuhoamiseksi selektiivisesti. Tällainen käsittely voi sisältää selvitysaineen käytön, joka kemiallisesti tuhoaa endogeenisen aktiviteetin, minkä jälkeen seuraa käsittely tällaisen selvitysaineen tuhoamisvaikutuksen inaktivoiiniseksi .

23 68324

Reagenssia turmelevia entsyymejä, esim. esiintyy usein luonnostaan biologisissa nesteissä, etenkin jos reagenssi on koentsyymi kuten NAD, NADP tai ATP. Tällaisille koentsyymiä huonontaville entsyymeille on useita inhibiittoreita, esim. kelatoivia aineita, jotka ryöstävät olennaisia metalli-ioniaktivaattoreita entsyymeiltä. NAD-huonontavia entsyymejä löytyy tavallisesta seerumista ja niillä on riittävä ent-symaattinen aktiviteetti olennaisesti kaiken endogeenisen NAD-aktivi-teetin hävittämiseksi eristetystä seerumista muutaman tunnin sisällä. Tällaisten entsyymien huonontava vaikutus voidaan tehokkaasti ehkäistä lisäämällä kelatoivaa ainetta kuten etyleenidiamiinitetraetikka-happoa. Huonontava vaikutus voidaan myös eliminoida lisäämällä spesifistä entsyymi-inhibiittoria. ATP-huonontavia entsyymejä esim. voidaan inhiboida lisäämällä βγ-metyleeni ATP:tä tai αβ-metyleeni ATP:tä.

Keksintöä selostetaan alla lähemmin esimerkkien avulla.

Esimerkki 1

Nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi-biotiinikonjugaatin valmistus.

A. Nikotiiniamidi-6-(2-aminoetyyliamino)puriinin dinukleotidi.

Kaksi grammaa nikotiiniamidiadeniinidinukleotidia (NAD) liuotettiin 10 ml:an vettä ja 0,6 ml etyleeni-imiiniä lisättiin tipottain, jolloin pH pidettiin arvossa alle 7 lisäämällä 1 M perkloorihappoa. Kun ety-leeni-imiinilisäys oli saatettu loppuun säädettiin pH arvoon '4,5 ja reaktio inkuboitiin 20-25°C:ssa. 24 tunnin välein lisättiin 0,6 ml etyleeni-imiiniä ja pH säädettiin uudestaan arvoon 4,5. 96 tunnin jälkeen kaadettiin liuos 10 tilavuuteen asetonia -10°C:ssa. Muodostunut öljy otettiin talteen, pestiin eetterillä ja liuotettiin suurin piirtein 50 ml:an vettä pullossa.

Saatu liuos säädettiin pH-arvoon 7,0-7,5 1 N natriumhydroksidilla ja 1 g natriumbikarbonaattia lisättiin. Typpeä kuplitettiin liuoksen läpi 4-5 min ja 1 g natriumhydrosulfiittia lisättiin. Pullo suljettiin tiiviisti ja sen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 45 min. Liuos hapetettiin sen jälkeen lp min ja säädettiin pH-arvoon 11,3 natrium-hydroksidilla. Liuosta kuumennettiin 75°C:ssa tunnin ajan. Sen jälkeen reaktioseos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja 0,6 g tris-(hydroksimetyyli)-aminometaania lisättiin, minkä jälkeen lisättiin 5 N suolahappoa pH-arvon säätämiseksi 7,5:een. Saatuun liuokseen lisättiin 1000 Kansainvälistä yksikköä alkoholidehydrogenaasia ja 1 ml 24 68324 asetaldehydiä. Reaktioseoksen laskevaa optista tiheyttä tarkkailtiin 340 nm:ssä ja kun vähenemistä ei enää havaittu säädettiin pH arvoon 3,5- Liuos kaadettiin 10 tilavuuteen asetonia -10°C:ssa. Muodostunut öljy erotettiin ja pestiin eetterillä, minkä jälkeen se liuotettiin 10-15 ml:an vettä.

Saatu liuos lisättiin vedellä tasapainotettuun 2,5 x 90 cm:seen Sephadex G-10 kolonniin (Pharmacia AB, Uppsala, Ruotsi). Tilavuudeltaan 12 ml:n jakeita otettiin talteen. Suurimman optisen absorption aallonpituus ultraviolettialueella ja optinen tiheys tällä aallonpituudella määritettiin kullekin jakeelle. Määritettiin myös kunkin ja-keen optinen tiheys 340 nm:ssä alkoholidehydrogeenaasilla suoritetun pelkistyksen jälkeen. Jakeet joilla oli optinen absorptiomaksimi 264 nm:ssä ja joiden optisten tiheyksien suhde 3^0 nm:ssä ja 264 nm: ssä oli suurempi kuin 0,05 koottiin. Koottu aine väkevöitiin 15-20 ml:an pyörivällä haihduttimella ja johdettiin vedellä tasapainoon saatetun 2,5 x 28 cm:sen Dowex 1-X8 kolonnin läpi (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia). Vettä lisättiin vielä, kootun aineen pesemiseksi kolonnin läpi ja 10 ml:n suuruisia jakeita otettiin talteen. Otettiin talteen jakeet, joilla oli optinen absorptiohuippu 264 nm:ssä ja joiden optisten tiheyksien suhde 340 ja 264 nm:ssä oli suurempi kuin 0,1.

Koottu aine johdettiin vedellä tasapainoon saatetun 5 x 45 cm:sen Dowex 50-X2 kolonnin läpi (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia). Vettä lisättiin vielä kootun aineen pesemiseksi kolonnin läpi ja 20 ml:n suuruisia jakeita otettiin talteen. Otettiin talteen jakeet, joilla oli optinen absorptiohuippu 264 nm:ssä ja joiden optisten tiheyksien suhde 340 ja 264 nm: ssä oli suurempi kuir. 0,1.8. Koottu aine väkevöitiin 4:stä 5 reen ml:aan ja puhdistettiin elektroforeesilla seuraavasti.

Väkevöityä ainetta levitettiin Whatman 3MM paperiarkille (Reeve Angel, Clifton, New Jersey) 1-2 cm:n levyisenä nauhana sähkövirtaan nähden poikittaisessa suunnassa. Sen jälkeen paperi kostutettiin 0,02 M nat-riumfosfaatilla pH-arvossa 6,0. Elektroforeesi suoritettiin Durrum'in riippuvan paperin menetelmällä, kuten on selostettu julkaisussa Science 121:829 (1955) 4-7 tunnin ajan noin 8,5 voltti/cm:n poten-tiaaligradienti11a. Halutun pyridiininukleotidijohdannaisen sijainti määritettiin fluoresenssilla, joka kehitty- sen jälkeen kun paperista 25 68324 otettu testiliuska oli suihkutettu 0,5~m natriumsyanidilla julkaisussa J. Biol. Chem. 191:447 (1951)·selostetulla menetelmällä. Haluttua johdannaista sisältävä alue leikattiin paperista ja uutettiin kolmella 50 ml:n suuruisella tilavuudella vettä. Saadut nikotiiniamidi-6-(2-aminoetyyliamino)puriinidinukleotidia sisältävät uutteet koottiin, väkevöitiin 3~4 ml:an ja varastoitiin -20°C:ssa.

B. Nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi-biotiinikonj ugaatti.

16 mg biotiinia suspendoitiin 1 ml:an vettä, jossa oli 22 mg nikotii-niamidi-6-(2-aminoetyyliamino)puriinidinukleotidia, joka oli valmistettu kuten osassa A yllä. Muutamia tippoja 0,1 N natriumhydroksidia lisättiin biotiinin liuottamisen helpottamiseksi. Saatuun liuokseen lisättiin 240 mg l-sykloheksyyli-3-(2-morfolinoetyyli)-karbodi-imidi-meto-p-toluleenisulfonaattia ja saatettiin liuokseen lisäämällä ti-pottain 0,1-n suolahappoa. Reaktioseoksen annettiin hautua huoneen lämpötilassa 5 tuntia ja kaadettiin sen jälkeen 10 ml:an asetonia -10°C:ssa. Muodostunut öljy erotettiin, pestiin kahdesti 5-10 ml:lla eetteriä ja liuotettiin 1-2 ml:an vettä. Saatu aine puhdistettiin pa-perielektroforeesilla kuten esimerkissä 1. Fluoresoivat nauhat ilmestyivät natriumsyanidisuihkutuksen jälkeen, joista toinen oli siirtynyt katodia ja toinen anodia kohti. Jälkimmäinen nauha, joka sisälsi NAD-biotiinikonjugaatin, eluoitiin vedellä ja varastoitiin -20°C:ssa.

Esimerkki 2

Homogeeninen spesifinen sitomisanalyysi> avidiinin ja biotiinin vaikutus NAD:in ja NAD-biotiinin konjugaattien entsymaattiseen kiertonopeuteen .

Tässä esimerkissä käytetty kiertoreaktiojärjestelmä perustui seuraa-viin reaktioihin: (a) NAD-ligandi + laktaatti —Mj-iL9j?aPP,° ψ dehydrogenaasi NADH-ligandi + pyruvaatti (b) NADH-ligandi + tiatsolyylisininen (hapetettu) —SA_» NAD-ligandi + tiatsolyylisininen (pelkistetty)

Valmistettiin kahdeksan spesifistä sitomisreaktioseosta, joista kullakin oli 0,5 ml:n kokonaistilavuus ja sisältönä 0,12 M N,N-bis-2-hydroksietyyliglysiinihydrokloridi-puskuria pH-arvossa 7,8 ja jotka 68324 26 vastaavasti sisälsivät taulukossa 1 mainitut pitoisuudet ja aktiviteetit NADria, esimerkissä 1 valmistettua NAD-biotiinikonjugaattia, biotiinia ja avidiinia, jolla on taipumus sitoitua biotiinin kanssa. Yksi avidiiniaktiviteettiyksikkö on se määrä avidiinia, joka kykenee sitomaan yhden mikrogramman biotiinia. Reaktioseosta haudutettiin huoneen lämpötilassa 2-3 tuntia. Kukin reaktioseos saatettiin kosketukseen vesipitoisen entsyymi/substraattiseoksen kanssa lisäämällä 0,1 ml 1 M litiumlaktaattia, 0,05 ml 10 mM tiatsolyylisinistä sen hapetetussa muodossa ja riittävästi 0,12 M N,N-bis-2-hydroksietyyliglysii-ni-hydrokloridipuskuria pH-arvossa 7,8, jossa oli 0,38 Kansainvälistä yksikköä naudan sydämen maitohappodehydrogenaasia ja 1,5 Kansainvälistä yksikköä sian sydämen diaforaasia 1 ml:n kokonaisreaktiotila-vuuteen. Tiatsolyylisinisen pelkistyneen muodon suhteellinen muodos-tumisnopeus määritettiin sen jälkeen kussakin reaktioseoksessa mittaamalla optisen tiheyden kokonaismuutos kussakin 570 nm:ssä 2*1 minuutin aikana ensimmäisen tunnin sisällä entsyymi/substraattiseoksen lisäyksen jälkeen. Koko suoritustapa suoritettiin kaksinkertaisena ja keskimääräiset tulokset on esitetty taulukossa 1.

68324 27

H

C rH

φ ό e >j ω ^ φ c Ξ (—» ej_j ^

•H :cö CM Γ^Λ CJ\ ΚΛ rft LP\ CTi i—I

p ^ o ooc--oocm'Po :c0 f- οΗοοΉοοο £ :tÖ LPi ·* ·> n n n n n n

Φ H —’ OOOOOOOO

co -h •h ft co -P M >3 ft Φ :<0 o ft ra

•H

-P

X

CO :c0 i i—i i—ii—ii—i

•H ·Ρ :θ 1—I rH i—li—I

CP ϋ I I I I ·> *> ·» «

•ri P ft O O O O

•H <11 Ή O Φ ffl Ή P X ί> ·Η cO > —

•H

O

rH P

H

O ft M C ^ o o

ft -H S I I I VO I I VO I

ft G C ^ ft -H '-r ft Ή ft p w 0 es •H 3 p co

,r~) CO

G 3 o zs

ft CO Ή *H

c o

•H P

•H ·Η ^ O O O

P ft S I I MD I I VO VO | 0 C K'* ΙΌ ΙΌ •H C —

ft -H

1 p O cti < cO S bO

•H

O

P ^

•H S O O

ftp I CV I I CM I I I

-- CM C\J

G

·· CO

O 3 < 3 S to

O

•H

^ HOjr^ftTLTNVOC^-CO

cd

<D

in 68324

Reaktiot 1, 4 ja 8 olivat vertailureaktioita ja osoittavat että ilman NAD:ia ja NAD-biotiinikonjugaattia ei mitään olennaista kiertoa esiintynyt·. Reaktioiden 2 ja 3 tulokset osoittavat, että NAD-bio-tiinikonjugaatilla oli merkittävä määrä koentsyymiaktiviteettia puhtaaseen NAD:iin verrattuna. Reaktioiden 3 ja 6 tuloksista nähdään, että avidiinin läsnäolo reaktioseoksessa inhiboi tioatsolyylisinisen (pelkistynyt muoto) muodostumisen kun läsnä oleva NAD on konjugoitu-nut biotiinin kanssa. Vertaamalla reaktioiden 6 ja 7 tuloksia nähdään, että vapaan biotiinin läsnäolo vähentää tiatsclyylisinisen (pelkistynyt muoto) muodostumisen inhibointia suhteessa reaktioseoksessa olevan biotiinin pitoisuuteen.

Siten havainnollistettiin tässä esimerkissä, että NAD:in aktiviteetti NAD-biotiinikonjugaatissa kiertoreaktiojärjestelmän suhteen aleni avidiinin läsnä ollessa ja että tällaisen aktiviteettilaskun suuruus väheni, jos läsnä oli lisäksi biotiinia.

Esimerkki 3

Homogeeninen kilpaileva sitomis-bioluminenssianalyyäi; biotiinin eri määrien vaikutus synnytettyyn huippuvalointensiteettiin.

Tässä esimerkissä käytetty bioluminenssireaktiojärjestelmä perustui seuraaviin reaktioihin: (c) NAD-ligandi + etanoli -*-> & dehydrogenaasi NADH-ligandi + asetaldehydi (d) NADH-ligandi + FMN* + F. ® -r-> ° dehydrogenaasi NAD-ligandi + FMNH2 (e) FMNH2 + pitkäketjuinen aldehydi + 02 —u---— -> FMN + pitkäketjuinen happo + H2O + hv *flaviinimononulkeotidi

Reaktioiden (d) ja (e) suorittamiseksi käytetty valoa kehittävä liuos valmistettiin seuraavasti. Valmistettiin reagenssiseos, jossa oli 0,13 M fosfaattipuskuria pH-arvossa 7>0, 0,67 paino-$ boviiniseerumi-albumiinia, 15,7 /tM flaviinimononukleotidia (FMN) ja 13j3 mM natrium-asetaattia ja tätä seosta varastoitiin pimeässä -20°C:ssa. Sinä päivä- 29 68324 nä, jona valoa kehittävää liuosta oli tarkoitus käyttää, valmistettiin emulsio, jossa oli 5 ^ul dodekanaalia 5 ml:ssa vettä. Photobacterium fi.sheri:stä (Worthington Biochemical Corp.:in, Freehold, New Jersey, valmistama entsyymi ) uutettua lyofilisoitua lusiferaasia lisättiin 0,013 M fosfaattipuskuriin pH-arvossa 7,3 pitoisuuteen 20 mg/ml. 30 minuutin jälkeen saatu suspensio sentrifugoitiin 1500 g:ssa 10 min ja pelletti hylättiin. Sen jälkeen valmistettiin valoa kehittävä liuos 5 minuutin sisällä käytöstä yhdistämällä 75 /Ui reagenssiseosta, 5 /ui dodekanaaliemulsiota ja 20 ^ul lusiferaasiliuosta.

Reaktion (e) kehittämän valon havaitsemiseksi rakennettiin valomitta-ri, jossa oli valodetektori ja 6 x 50 mm:n kyvetti sovitettuna valoa integroivaan piiriin, siten että kyvetissä syntynyt valo heijastui valodetektroilie. Valodetektorin tuottama sähköinen signaali johdettiin laskukojeeseen. Kuippu-valointensiteetti, joksi sitä tässä yhteydessä kutsutaan, mitattiin kojeen merkistä ja sille annettiin mielivaltaisia yksikköjä riippuen diagrammaliuskajaoksista.

Valmistettiin seitsemän spesifistä sitomisreaktioseosta, joista kunkin kokonaistilavuus oli 0,2 ml ja kukin sisälsi 0,1 M tris-(hydroksi-metyyli)-aminometaani-hydrokloridipuskuria pH-arvossa 8,0, 0,6 M etanolia, 0,01 M semikarbatsidihydrokloridia, 3^3 nM esimerkin 1 mukaisesti valmistettua NAD-biotiinikonjugaattia, 0,025 Kansainvälistä yksikköä alkoholidehydrogenaasia ja 0,055 yksikköä avidiinia. Biotiinia lisättiin kuuteen seitsemästä reaktioseoksesta, so. numeroihin 2-7 taulukossa 2, mainitussa taulukossa esitetyissä pitoisuuksissa.

Reaktioseoksia haudutettiin huoneen lämpötilassa noin 30 min. 10 ^ul:n tilavuus kutakin reaktioseosta ruiskutettiin yllä selostettuun valo-mittariin sovitettuun erilliseen kyvetti.in, jossa lisäksi oli 100 yUi yllä selostetulla tavalla valmistettua ja 28°C:ssa 2-3 min esihaudu-tettua valoa kehittävää liuosta. Koko prosessi ajettiin kaksinkertaisena ja keskimääräiset tulokset on esitetty taulukossa 2.

30 68324 TAULUKKO 2

Reaktioseos Biotiinin pitoisuus Keskimääräinen huippu- _ _ (nM)__valointensiteett i__ 10 36

2 25 M

3 50 57 4 100 79 5 150 90 6 200 97 7 300 104 Tällä esimerkillä havainnollistettiin siten., että bioluminenssi-reaktiojärjestelmän kehittämän huippuvalointensiteetin suuruus ja siten NADrin aktiviteetti NAD-biotiinikonjugaatissa oli suoraan verrannollinen spesifisessä sitomisreaktioseoksessa läsnä olevan biotiinin määrään.. Esillä oleva keksintö aikaansaa siten testi-seoksen ja -menetelmän nestemäisessä väliaineessa olevan ligandi-biotiinin läsnäolon määrittämiseksi käyttäen kilpailevaa sitomia-bioluminenssianalyysitekniikkaa.

Esimerkki 4 2,4-dinitrofenyyli-ATP-konjugaatin (6-asemassa sitoutunut johdannainen) valmistus N^-j_2-(2,4-dinitrofenyyli)aminoetyyli7adenosiini-5 ' -trifosfaatt i .

g A. N -(2-aminoetyyli) adenosiini-5 ' -monofosfaatt.i.

Kaksi g (7 mmoolia) 6-klooripuriiniribosidia (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, Missouri) sekoitettiin 17 ml:n kanssa trietyylifosfaattia ja saatettiin reagoimaan fosforyylikloridin kanssa veden läsnäollessa, kuten on selostettu julkaisussa Chem. Scrip. 19:165-70 (1972). Fosfodikloridaatin hydrolyysin jälkeen lisättiin 9,5 ml etyleenidiamiinia (140 mmoolia) ja annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 3-tuntia. Reaktioseos laimennettiin 4 litralla vettä ja pH säädettiin arvoon 12 natriumhydroksidilla. Liuos johdettiin asetaatin muodossa olevan 31 68324 5 χ 30 cm:sen Dowex 1 x 8-kolonniin (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia) läpi. Sen jälkeen kolonni pestiin 3 litralla 0,01 M ammo-niumkloridia ja kromatogrämmi kehitettiin 3 litralla vettä ja 3 litralla 1 M etikkahappoa kehitetyllä lineaarisella gradientilla. Ultraviolettisäteilyä absorboivan aineen eristetty gradientti välillä 1800 ml ja 2050 ml eluoitu huippu väkevöitiin noin 25 ml:an tyhjössä. Tämän liuoksen seistessä 7°C:ssa yön yli muodostui valkoisia kiteitä ja ne otettiin talteen sekä kuivattiin, jolloin saatiin 65 %:ner\ saanto tuotetta. Kuumasta vedestä uudelleenkiteytettiin näyte analyysiä varten.

Laskettu yhdisteelle C-^H 19N5O713 · 2^0: C 33,8, H 5,45, N 19,7 Saatu : C 34,3, H 5,22, N 19,7.

Kahdella liuotinjärjestelmällä, joista ensimmäinen sisälsi neljä osaa 0,5 M ammoniumasetaattia 1 osaa etanolia kohti ja toinen 3 osaa iso-butyyrihappoa 5 osaa kohti 1 M ammoniumhydroksidia, kehitetyistä erillisistä ohutkerroskromatogrammeista oli kummassakin 1 ainesosa, joka sammutti fluoroinnin ja reagoi ninhydriinin kanssa. 0,1 N suolahapossa oivalla yhdisteellä oli absorptiohuippu 264 nmrssä ja millimolaarinen ekstinktiokoeffisientti oli 17,7, jotka kirjo-ominaisuudet ovat luonteenomaisia N^-alkyloiduille adenosiinijohdannaisille.

B. N (2,4-dinitrofenyyli)aminoetyyli7adenosiini-5' -monofosfaatti.

250 mg N^-(2-aminoetyyli)adenosiini-5’-monofosfaattia (0,65 mmoclia) tämän esimerkin osasta A liuotettiin 20 ml:an vettä pH-arvossa 8.

Sen jälkeen lisättiin 168 mg natriumbikarbonaattia, jota seurasi 0,2 ml 1-fluori-2,4-dinitrobenseeniä (1,58 mmoolia liuotettuna 2 ml:an etanolia). Reaktioseosta sekoitettin pimeässä huoneen lämpötilassa 4 tuntia ja sen jälkeen lisättiin vielä 0,1 ml 1-fluori-2,4-dinitro-bentseeniä 1 ml:ssa etanolia. Kun reaktioseosta oli sekoitettu yön yli, säädettiin se pH-arvoon 2,0 suolahapolla ja kaadettiin 200 ml:an etanolia. Muodostunut sakka liuotettiin 200 ml:an vettä ja tämä liuos säädettiin pH-arvoon 8,0 natriumhydroksidilla ja kromatografoitiin bikarbonaattimuodossa olevalla DEAE-selluloosan (Reeve Angel, Clifton, New Jersey) 2,5 x 30 cmrsellä kolonnilla. Kromatogrammi kehitettiin 1,5 litrasta vettä ja 1,5 litrasta 0,7 M anmoniumbikarbonaattia muodostetulla lineaarisella gradient il.1 a. Gradientti välillä 1200 ja 1500 ml eluoitiin ultraviolettivaloa absorboivan keltaisen aineen suurin huippu. Ammoniumbikarbonaatti poistettiin haihduttamalla toistuvasti kuiviin, jolloin saatiin 40 %:neu saanto haluttua tuotetta. Tämä tuote 32 68324 kulki yhtenä keltaisena täplänä ohutkerroskromatogrammeilla, jotka oli kehitetty samoilla tämän esimerkin osassa A mainituilla kahdella kahdella liuottimena ja epikloorihydriinitrietanoliamiini anionin-vaihtopaperilla, joka oli kehitetty 0,25 M natriumasetaatti-etikka-happopuskurilla, pH 5,0. 0,02 N suolahapossa oli tuotteella optinen absorptiohuippu arvossa 264 nm ja 363 nm mi Himo laarisi 11a ekstinktio-koeffisienteilla 21,8 ja 14,2.

C. 2,4-dinitrofenyyli-ATP-konjugaatti.

C _ N -/2-(2,4-dinitrofenyyli)aminoetyyli7adenos iini-5’-monofosfaatti (tämän esimerkin osasta B, 0,3 mmoolia) muutettiin pyridiniumsuolaksi kromatografoimalla pyridiniummuodossa olevalla 1,5 x 20 cm:sella Dowex 50 x 2-kolonnilla (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia). Keltainen poistovirtaus väkevöitiin kuiviin ja 15 ml dimetyyliformami-dia ja 0,3 mmoolia tri-n-butyyliamiinia lisättiin. Tämä seos haihdutettiin kuiviin ja jäännös kuivattiin vielä toistuvasti haihduttamalla. Monofosfaattivälituote saatettiin sen jälkeen reagoimaan trifosfaatti-muotoon käyttäen julkaisussa J. Amer. Chem. Soc. 87:1785-8(1965) selostettua menetelmää. Dimetyyliformamidiin liukoiset reaktiotuotteet lisättiin 250 ml:an vettä, joka sitten säädettiin pH-arvoon 8,0. Tämä liuos johdettiin bikarbonaattimuodossa olevan DEAE-selluloosan 2,5 x 58 cm:seen1kolonniin ja kromatogrammi kehitettiin 3 litrasta vettä ja 3 litrasta 0,5 M ammoniumkarbonaattia valmistetulla lineaarisella gradientilla. Keltaisen aineen ensimmäinen eluoitu huippu identifioitiin difosfaattijohdannaiseksi. Keltaisen aineen toinen huippu, joka eluoitui gradienttivälillä 4,15 ja 4,4 litraa, haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 20 %:sena saantona haluttua konjugaattia, joka analyysissä sisälsi 3,0 fosfaattitähdettä riboositähdettä kohti.

Esimerkki 5 2,4-dinitrofenyyli-ATP-konjugaatin (8-asemassa substituoitu johdannainen) valmistus.

8-/2-(2,4-dinitrofenyyli)aminoetyy1x7aminoadenosiini-5’-trifosfaatti.

A. 8-(2-aminoetyyli)aminoadenosiini-5’-monofosfaatti.

2,2 mmoolia 8-bromiadenosiini-5’-monofosfaattia, joka oli valmistettu julkaisussa Arch. Biochem. Biophys. 163:561-9 (1974) selostetulla me- 68324 33 netelmällä, 66 mmoolia etyleenidiamiinia ja 25 ml vettä sisältävää reaktioseosta kuumennettiin öljyhauteella l40°C:ssa 2 tuntia. Jäähdytetty seos säädettiin pH-arvoon 11,5 natriumhydroksidilla ja se johdettiin 2,5 x 55 cmrseen Dowex 1 x 8-kolonniin (200-400 mesh, bikar-bonaattimuoto). Kolonni pestiin 300 ml:11a vettä ja sen jälkeen 3 litrasta vettä ja 3 litrasta 0,5 M ammoniumbikarbonaattia muodostetulla lineaarisella gradientilla. Poistovirtauksen absorptio arvossa 254 nm tarkkailtiin ja absorboivan aineen suurin huippu eluoitui gradientti-välillä 4,6 ja 5,8 litraa.

Ammoniubikarbonaatti poistettiin toistuvasti haihduttaen (viisi kertaa, 20-30 ml vettä joka kerta) kuiviin tyhjössä ja lopullinen jäännös liuotettiin 20 ml:an vettä lisäämällä ammoniumhydroksidia pH-arvoon 8,0. Liuos suodatettiin, säädettiin pH-arvoon 5,0 muurahaishapolla ja annettiin seistä 5°C:ssa päivän. Muodostuneet kiteet otettiin talteen, liuotettiin pH-arvossa 8,0 ja uudelleenkiteytettiin pH-arvossa 5,0. Halutun välituotteen saanto oli 27 %· Kun sitä tarkkailtiin ohutker-roskromatografoimalla liuottimessa, jossa oli 4 osaa 0,5 M ammonium-asetaattiä 1 osaa kohti etanolia, siirtyi tuote yhtenä ninhydriinipo-sitiivisena täplänä, joka sammutti fluoroinnin. Optinen absorptio-huippu 0,02 N suolahapossa oli 275 nm ja millimolaarinen ekstinktio-koeffisientti oli 17,5, jotka kirjo-ominaisuudet ovat luonteenomaisia alkyloiduille 8-aminoadenosiini-johdannaisille.

Laskettu yhdisteelle C]_2H2oN7°7P·H20: C H 5,33, N 23,2.

Saatu : C 34,1, H 5,28, N 23,9- B. 8-_/2 - (2,4-dinitrofenyyli )aminoetyyli7aminoadenosiini-5 ' -mono-fosfaatti .

8-(2-aminoetyyli)aminoadenosiini-5'-monofosfaattia tämän esimerkin osasta A (0,64 mmoolia) liuotettiin 20 ml:an vettä lisäten natrium-hydroksidia pH-arvoon 8,0. Sen jälkeen lisättiin 168 mg natriumbikarbonaattia, ja sen jälkeen 0,2 ml 1-fluori-4-dinitrobentseeniä (1,58 mmoolia liuotettuna 2 ml:an etanolia). Reaktioseosta sekoitettiin 18 tuntia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen lisättiin 0,1 ml l-fluori-2,4-dinitrobentseeniä 1 ml:ssa etanolia. Vielä 4 tunnin sekoituksen jälkeen säädettiin seoksen pH arvoon 2,0 suolahapolla ja se kaadettiin 200 ml:an kylmää asetonia (-10°C). Muodostunut keltainen sakka otettiin talteen suodattamalla, liuotettiin 200 ml:an vettä ja johdettiin bikarbonaattimuodossa olevan DEAE-selluloosan 2,5 x 45 34 68324 cm:seen kolonniin. Kromatogrammi kehitettiin 2 litrasta vettä ja 2 litrasta 0,7 M ammoniumkarbonaattia kehitetyllä lineaarisella suola-gradientilla. Gradientti-välillä 2 ja 3 litraa eluoitui keltaisen aineen huippu, jonka absorptiomaksimi oli 275 nm. Ammoniumbikarbonaatti poistettiin tästä aineesta haihduttamalla tyhjössä ja halutun välituotteen saanto oli 37 %· 0,02 N suolahapossa mitattu optinen absorp-tiohuippu esiintyi 275 ja 363 nm:ssä ja millimolaarinen ekstinktio-koeffisientti oli 21,8 ja 15,5. Lisäanalyysi osoitti, että riboosi-tähdettä kohti oli 1,07 fosfaattitähdettä.

C. 2,4-dinitrof enyyli-ATP-konj ugaattj.

Monofosfaattivälituote (0,5 mrcoolia) saatettiin reagoimaan tri-n-butyyliammoniumsuolaksi lisäämällä 0,8 mmoolia tri-n-butyyliamiinia. Seos kuivattiin haihduttamalla toistuvasti kuivasta dimetyyliformami-dista (A kertaa, 10-15 ml kulloinkin). Lopullinen jäännös liuotettuna 1 ml:an dimetyyliformamidia sekoitettiin 2,0 mmoolin kanssa karbonyy-lidi-imidatsolia myös 1 ml:ssa dimetyyliformamidia ja annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 4 tuntia. Ylimäärä karbonyylidi-imidatsolia tuhottiin saattamalla se reagoimaan 15 ^ul:n kanssa metanolia 30 min ajan. Lopuksi lisättiin 3 mmoolia tri-n-butyyliammoniumpyrofosfaattia ml:ssa dimetyyliformamidia ja annettiin seistä 20 tuntia. Muodostunut kiinteä jäännös erotettiin sentrifugoimalla ja pestiin kahdesti 5 ml:n suuruisilla annoksilla dimetyyliformamidia.Yhdistetyt päällä olevat nesteet lisättiin 200 ml: an vettä, joki.·, sen jälkeen säädettiin pH-arvoon 8 ja kromatografoitiin bikarbonaattimuodossa olevalla 2,5 x 25 cm:sella DEAE-selluloosan kolonnilla. Kromatogrammi kehitettiin 2 litrasta vettä ja 2 litrasta 0,5 M ammoniumbikarbonaattia muodostetulla lineaarisella gradientilla. Gradienttivälillä 2,0 ja 2,9 litraa eluoitui keltaisen aineen huippu, jonka optinen absorptiomaksimi oli 275 ja 363 nm:ssä. Ammoniumbikarbonaatti poistettiin haihduttamalla, jolloin saatiin haluttua konjugaattia 22 %:sena saantona. Analyysitulokset osoittivat, että tämä tuote sisälsi 3,2 fosfaattitähdettä jokaista riboositähdettä kohti.

Esimerkki 6 2,^-dinitrofenyylin johdannaisten home "eeninen kilpaileva sitomis-bioluminesenssianalyysi; ATP:n käyttö merkkiaineena.

Tässä esimerkissä käytetty bioluminesenssireaktiojärjestelmä perustui seuraavaan reaktioon: 68324 ATP-ligandi + pelkistynyt lusiferiini AMP-ligandi + hapettunut lusiferiini + hv A. Analyysi käyttäen 6-asemassa substituoidun ATP:n johdannaista.

Valmistettiin kolme spesifistä sitomisreaktioseosta, joissa kullakin oli kokonaistilavuus 100 /ul ja kussakin oli 10 mM tris-(hydroksime-tyyli)-aminometaani-hydrokloridipuskuria pH-arvossa 7,4, 10 mM ety-leenidiamiinitetraetikkahappoa, 20 /Ui antiseerumia 2, 4-dinitrofenyy-lille, 512 nM 2,4->dinitrofenyyli-ATP konjugaattia (6-asemassa substi-tuoitu johdannainen, valmistettu esimerkinä mukaisesti) ja 2,4 di-nitrofenyyli-S-alaniinia taulukossa 7 esitetyissä pitoisuuksissa. Lämpötilassa 25°C 2 tuntia suoritetun haudutuksen jälkeen analysoitiin kunkin reaktioseoksen 10 ^ulin suuruisia alikvoottisia kaksoiskappaleita ruiskuttamalla ne 0,1 ml:n suuruiseen tilavuuteen yllä mainittua valoa synnyttävää liuosta, jota sitä ennen oli haudutettu 25°c>ssa vähintään 2 min ja joka oli koeputkessa, joka cl.i sovitettu Dupont Model 760 olevaan Bioluminisenssi-valonittariin (E.I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware). Huippuvalointensiteetti luettiin valomittarista. Keskimääräinen huippuvalointensiteetti kullekin reak-tioseokselle laskettiin, kuten myös suhteellinen intensiteetti (100 % kertaa näytteen keskimääräisen huippuintensiteetin suhde verrattuna siihen, että antiseerumia ei ole läsnä). Tulokset ilmenevät taulukosta 7 · TAULUKKO 7 2,4-dinitrofenyyli-6- reaktio- alaniinin pitoisuus keskimääräinen huipputeos__ _( iuM)___valointensiteetti__ 10 7 2 25 14 3 2500 185 B. Analyysi käyttäen ATP:n 8-asemassa substituoitua johdannaista.

Valmistettiin neljä spesifistä sitomisreaktioseosta, jolloin kunkin kokonaistilavuus oli 100 ^ul ja kukin sisälsi 20 mM tris-(hydroksime-tyyli)-aminometaani-hydrokloridipuskuria pH-arvossa 7,4, 10 mM ety-leenidiamiinitetraetikkahappoa, 20 ^ul antiseerumia, 2,4-dinitrofe-nyylille, 594 nM 2,4-dinitrofenyyli-ATP konjugaattia (8-asemassa subs-tituoitu johdannainen, esimerkin 5 mukaisesti valmistettuna) ja 2,4- 36 68324 dinitro-3-alaniinia taulukossa 8 esitetyissä pitoisuuksissa. 25°C:n lämpötilassa suoritetun 2 tuntisen hauduttamisen jälkeen analysoitiin kunkin reaktioseoksen 10 ^,ul:n suuruisia alikvoot-tisia kaksoiskappaleita kuten osassa A yllä ja keskimääräinen huippuvalointensiteetti laskettiin kullekin. Tulokset ilmenevät taulukosta 8.

TAULUKKO 8

Reaktio- 2,4-dinitrofenyyli-β- Keskimääräinen huippu- seos alaniinin pitoisuus valointensiteetti l nM) 10 18 2 25 51 3 250 191 k 2500 190 Tästä esimerkistä ilmenee, että merkkiainetta, ATPrtä, voidaan substituoida eri asemissa sen rakenteen ympärillä valmistettaessa esillä olevan keksinnön mukaisessa spesifisessä sitomisanalyysi-menetelmässä käyttökelpoista konjugaattia.

Claims (10)

1. 37 68324
2. 1. Spesifinen sitomisanalyysimenetelmä nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrittämiseksi, joka käsittää seuraavat vaiheet: (a) nestemäinen väliaine saatetaan kosketukseen reagenssiaineen kanssa, joka sisältää merkkiaineen ja spesifisen sitovan aineen konjugaatin, jolloin reagenssiaine ja ligandi muodostavat sitomis-reaktiojärjestelmän, joka tuottaa (i) merkityn konjugaatin sidotun faasin, jossa spesifinen sitova aine on sidottu siihen spesifisellä sidosparilla ja (ii) merkityn konjugaatin vapaan faasin, jossa spesifinen sitova aine ei ole sidottu siihen spesifisellä sidosparilla, ja (b) määritetään merkkiaine joko sidotussa tai vapaassa faasissa nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin mittana, tunnettu siitä, että merkkiaine on koentsyymi ja että menetelmä on tyypiltään homogeeninen, jolloin koentsyymillä merkityn konjugaatin sidottua faasia ja vapaata faasia ei eroteta fysikaalisesti toisistaan ja jolloin koentsyymin aktiivisuus nestemäisessä kokonaisreaktioseoksessa mitataan ja suhteutetaan testatussa väliaineessa olevan ligandin määrään.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koentsyymi on nukleotidinen koentsyymi.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koentsyymi on adenosiinifosfaatti, nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi tai tämän pelkistetty muoto, tai nikotiini-amidiadeniini-dinukleotidifosfaatti tai tämän pelkistetty muoto. li. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koentsyymi on adenosiinitrifosfaatti.
5. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koentsyymi on flaviiniadeniini-dinukleotidi.
6. 6. Reagenssiaine nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrittämiseksi, joka reagenssiaine käsittää merkkiaineen ja spesifisen sitovan aineen konjugaatin, ja joka reagenssiaine 68324 38 ja ligandi muodostavat sitomisreaktiojärjestelmän, joka tuottaa merkityn konjugaatin sidotun faasin, jossa spesifinen sitova aine on sidottu siihen spesifisellä sidosparilla ja vapaan faasin, jossa spesifinen sitova aine ei ole sidottu siihen spesifisellä sidosparilla, jolloin merkkiaineen määrä joko sidotussa tai vapaassa faasissa on nestemäisessä väliaineessa olevan ligandinmäärän funktio, tunnettu siitä, että merkkiaine on koentsyymi ja että koentsyymillä merkityllä konjugaatilla on mitattavasti erilainen koentsyymi-aktiivisuus sidotussa faasissa verrattuna vapaaseen faasiin, jolloin määritysmenetelmä on tyypiltään homogeeninen, jolloin ei ole tarpeen fysikaalisesti erottaa konjugaatin sidottua faasia ja vapaata faasia toisistaan.
7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssiaine, tunnettu siitä, että se sisältää (1) merkityn konjugaatin, joka sisältää merkkiaineen sidottuna ligandiin tai sen spesifiseen sitovaan analogiin, ja (2) ligandin sidosparin.
8. 8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssiaine, tunnettu siitä, että koentsyymi on nukleotidinen-'koentsyymi.
9. 9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssiaine, tunnettu siitä, että koentsyymi on adenosiinifosfaatti, nikotiiniamidiadeniini-dinukleotidi tai tämän pelkistetty muoto tai nikotiiniamidiadeniini-dinukleotidifcsfaatti tai sen pelkistetty muoto.
10. 10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssiaine, tunnettu siitä, että koentsyymi on adenosii.nitrifosfaatt i . 1 Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssiaine, tunnet-t u siitä, että koentsyymi on flaviiniadeniini-dinukleotid.i. 39 68324