NO853790L

NO853790L - Fremangsmaate for paavisning av immobiliserte raportoergrupper

Info

Publication number: NO853790L
Application number: NO853790A
Authority: NO
Inventors: Lyle J Arnold Jr
Original assignee: Molecular Biosystems Inc
Priority date: 1984-01-27
Filing date: 1985-09-26
Publication date: 1985-09-26
Also published as: AU582341B2; DK436785A; WO1985003356A1; EP0170652A4; JPS61501047A; AU2577084A; EP0170652A1; DK436785D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører immunologisk

og diagnostisk kjemi, nærmere bestemt en sensitiv og spesifikk luminescens-påvisning av immobiliserte rapportørgrupper som er mindre enn ca. 10.000 dalton i størrelse.

I løpet av det siste tiår er et stort antall analysemetoder med radioaktiv merking og enzymmerking blitt utviklet. Mens hittil utviklede reaksjoner med radioaktiv merking oppviser høy sensitivitet etter dagens standard, er det flere alvorlige begrensninger forbundet med radioaktiv påvisning. Disse omfatter: 1) Den radioaktive markør må inkorporeres som en rapportørgruppe ved hjelp av langsommelig kjemisk syntese eller ved å binde den til passende funksjonelle grupper.

2) Det radioaktivt merkede materiale må renses

under nøye kontrollerte betingelser for å unngå farlig eksponering mot radioaktivitet. 3) Det radioaktivt merkede materiale må også hånd-teres og kasseres ved hjelp av spesielle fremgangsmåter.

4) Halveringstiden for mange radioaktive stoffer

er kort og følgelig er lagringstiden for de tilsvarende radioaktivt merkede reagenser kort. 5) Instrumenteringen for påvisning av radioaktive stoffer er kostbar.

6) Radioaktiviteten dekomponerer analysereagensene

og påvirker derved på en uheldig måte nøyaktigheten i analysen .

I motsetning til begrensningene som er forbundet

med radioaktiv påvisning, byr analysemetoder som utnytter luminescerende reagenser, på liten miljømessig risiko, er stabile i lange tidsperioder og krever billig instrumentering til påvisningen. Reaksjonene med enzymmerking som det er henvist til ovenfor, har den fordel at de ikke benytter seg av radioaktivitet, men de har vanligvis ikke følsomheten til radioaktive analyser. Følgelig foreligger det et tydelig behov for en ikke-radioaktiv påvisningsmetode med en følsom-het som er sammenlignbar med de radioaktive påvisningsmetoders følsomhet.

De tidligere kjente metoder med enzymmerking utnytter vanligvis reaksjoner med konkurrerende binding for å påvise tilstedeværelsen av oppløselige analytter, og de faller innenfor to hovedkategorier: 1) Heterogen. Fremgangsmåter som krever adskillelse av faser som er frie fra faser som er bundet. 2) Homogen. Fremgangsmåter som ikke krever separasjon.

Ifølge US patentskrifter nr. 3 850 752, 3 839 153, 3 654 090, 4 016 043, 4 338 237 og 4 318 980 anvendes fremgangsmåter for påvisning av analytter i oppløsning basert på en konkurranse mellom former som er bundet og som er frie. Noen av disse metoder er blitt utvidet til å omfatte bruken av bioluminescens eller kjemiluminescens. Britisk patentskrift nr. 1 578 275 beskriver en heterogen fremgangsmåte for analyse av insulin i oppløsning hvor det brukes en analyse-metode med konkurrerende binding som utnytter et konjugat av insulin og isoluminol. US patentskrifter nr. 4 230 797 og 4 380 580 beskriver analysemetoder med konkurrerende binding for påvisning av ligander i et væskemedium og utnytter et konjugat av en ligand og en enzymreaktant. US patentskrift nr. 4 383 031 beskriver en homogen analysefremgangsmåte hvor det brukes en lignende konjugattype for å påvise ligander i et væskemedium.

En god oversikt over den publiserte litteratur på dette område er offentliggjort i en gjennomgåelse av KRICKA, L.J. og CARTER, T.J.N. i "Clinical and Biochemical Luminescence", Vol. 12, s. 153-178, redigert av J.J. KRICKA og T.J.N. CARTER, Marcel Dekker, New York, (1982). Etter ut-arbeidelsen av denne oversiktsartikkel er flere andre publi-kasjoner blitt utgitt hvor det angis bruk av kjemiluminescens i påvisning av ligander i oppløsning. Schroeder et al. brukte et antistoff merket med et isoluminolderivat i en kjemilumine-scensmetode for å måle hepatitis B overflateantigen i human-serum [Clin. Chem. 27, 1378-1384 (1981)], Hinkkanen et al. målte mengdene av immunabsorberte proteiner med en luminol-metode [Hoppe-Seyler's Z. Physiol Chem. 306, 407-411 (1983)], og Pronovost og Baumgarten målte forskjellige proteiner i opp-løsning ved å bruke isoluminol [Experimentia 38, 304-306

(1982)]. Alle disse systemer er hovedsakelig utformet for å påvise analytter som er tilstede i et væskemedium, ved hjelp av konkurranse med merkede analytter.

Tidligere har påvisningen av immobiliserte ligander hovedsakelig vært begrenset til cytologiske og histologiske fremgangsmåter med farging hvor det har vært anvendt fluorescerende og kolorimetriske metoder. Som angitt i Virology, 126, 32-50 (1983)påviste f.eks. Brigati et al DNA i vev-snitt innleiret i paraffin ved å bruke et peroxydasekompleks og biotinylerte hybridiseringsprober for DNA beskrevet i EP patent publikasjon nr. 0063879, utgitt 3. november 1982. Disse fremgangsmåter gir vanligvis kvalitative og ikke kvantitative målinger av ligandene som er tilstede og som anvendes for å teste med hensyn på spesifikke seter som allerede er tilstede i vevene eller cellene.

Et nylig publisert sammendrag omtalte påvisningen av immobilisert DNA ved å bruke en mikroperoxydase som var covalent bundet til DNA [Fed. Proe. 42, 1954, abs. 1149,

(1983)]. Ved denne metode ble det anvendt luminol for å påvise mikroperoxydase, men metoden har begrenset anvendbar-het ettersom den er sterkt begrenset på grunn av mangel på følsomhet (påvisningsgrense~10 -3 mol av mål-DNA).

Foreliggende oppfinnelse er ny og adskiller seg klart fra den tidligere kjente teknikk. De bestemte kjennetegn på metoden ifølge oppfinnelsen er:

1) Den påviser immobiliserte rapportørgrupper.

2) Den er en direkte metode for analyse av rapportør-grupper . 3) Den bruker høyspesifikke ligand-ligand-reaksjoner til å visualisere rapportørgruppene. 4) Den har en påvisningsgrense i området fra ca. 10 til ca. 10 mol rapportørgruppe. Dette plasserer den nært opp til påvisningsgrensene for radioaktive markører og er langt høyere enn konvensjonelle ikke-isotopiske påvisnings-systemer. 5) Det brukes ufarlige kjemiluminescerende eller bioluminescerende reagenser.

6) Reagensene som brukes er stabile i lang tid.

7) Det brukes bare svært små mengder reagenser, noe

som gjør enkeltstående analyser billige.

8) Det brukes billig instrumentering.

9) Det trenges bare noen få minutter for å gjøre analysen, i motsetning til analyser med radioaktivt merkede rapportørgrupper som kan ta flere dager. 10) Analysefremgangsmåten. har høy følsomhet ettersom den omfatter påvisning av ett enkelt svakt signal og ikke en liten forskjell mellom to sterke signaler, slik det gjøres konvensjonelt.

Denne oppfinnelse vokste frem ut fra et behov for

å påvise svært små mengder rapportørgrupper bundet til en bærergrunnmasse ved hjelp av ikke-radioaktive midler. Det er i mange tilfeller nødvendig å være i stand til å kvantifisere antallet reaktive steder eller bindingsseter på overflaten av en bærergrunnmasse. Videre er det tvingende nødvendig å være i stand til å kvantifisere effektiviteten ved reaksjoner hvorved stoffer bindes til overflaten av en bærergrunnmasse. Endelig er det i mange tilfeller ønskelig å være i stand

til å kvantifisere reaksjonsgraden mellom et andre molekyl og bærergrunnmassen. Til alle disse anvendelser trenges det en hurtig og følsom, ikke-radioaktiv metode. De ovenfor an-gitte kjennetegn ved oppfinnelsen oppfyller disse behov. Ettersom denne oppfinnelse korrelerer lysemisjon med nærværet av rapportørgrupper med en størrelse som er mindre enn ca. 10.000 dalton, er den svært følsomme påvisning av slike rapportørgrupper nu mulig. Vanlige luminescerende metoder er i stand til å påvise så lite som 100 fotoner/sekund. Dersom kvanteutbyttet i den luminescerende reaksjon er høyt og lysemisjonen oppstår i løpet av noen få sekunder, kan det kanskje påvises så lite som 500 molekyler. Teoretisk gjør dette luminescerende påvisning like følsom eller mer følsom enn radioaktiv påvisning. I tilfeller hvor påvisningen av rapportørgrupper kan forsterkes enzymatisk før eller samtidig med den lysemitterende reaksjon, blir denne metode ennu mer følsom.

Luminescerende påvisningsmetoder er å foretrekke fremfor radioaktive påvisningsmetoder av en rekke grunner i tillegg til de tidligere nevnte. Radioaktive partikler brytes sakte og kontinuerlig ned og sender ut stråling. Til enhver tid er det faktisk bare en svært liten del av de tilstedeværende radioaktive isotoper som brytes ned og sender ut stråling. I tilfellet med et stoff merket med 12 5jod må

12,5 millioner av 12 5jod-atom-markørene være tilstede for å

gi 100 atomspaltinger pr. minutt. På grunn av den sakte ned-brytning av radioaktive partikler og det lille antall som nedbrytes i løpet av et hvilket som helst gitt tidsintervall, krever radioaktive påvisningsmetoder nødvendigvis sakte signalakkumulering.

I motsetning til dette er praktisk talt alle luminescerende molekyler disponible for lysemisjon på ethvert tidspunkt, og de kan fåes til å emittere fotoner hurtig når de induseres til å gjøre det. Følgelig kan praktisk talt alle de tilstedeværende luminescerende molekyler under kon-troll av brukeren fåes til å emittere fotoner samtidig. Dette gir luminescerende metoder en fordel når det gjelder følsom-het og kort analysetid sammenlignet med metoder hvor det anvendes radioaktive markører.

Et annet fordelaktig trekk ved foreliggende oppfinnelse er at den tilveiebringer en metode som direkte påviser rapportørgrupper som er immobilisert på en bærergrunnmasse. Som tidligere angitt, krever vanligvis tidligere kjente enzymatiske metoder hvor det anvendes analyser med konkurrerende binding på analytter i oppløsning, at en liten forskjell mellom to sterke signaler skjeldnes. Den direkte påvisning som frembys ved hjelp av foreliggende oppfinnelse forsterker dens følsomhet sammenlignet med følsomheten til slike tidligere kjente metoder ettersom det er mye lettere å påvise ett enkelt svakt signal enn det er å påvise en liten forskjell mellom to sterke signaler.

Disse tidligere kjente metoder virker dessuten ved analyse av store proteinmolekyler i antistoffer, antigener eller analytter som har en tendens til å være ustabile under visse reaksjonsbetingelser. Rapportørgrupper som er nyttige ved bestemmelse av antallet reaktive grupper på bærermasser, ved bestemmelse av den oppnådde effektivitet av sammenkoblings-reaksjoner eller ved kvantifisering av reaksjonen mellom et andre molekyl og en bærermasse, kan ikke være store proteiner. For å få et følsomt mål på massesammensetning, er bruken av rapportørgrupper av liten størrelse vesentlig for nøyaktige kvantitative bestemmelser ettersom slike bestemmelser ikke kan gjøres like lett ved bruken av store, sterisk voluminøse protein-rapportørgrupper. I motsetning til de ustabile proteinmolekyler som analyseres ifølge tidligere kjente fremgangsmåter, omfatter rapportrørgrupper påvist ved hjelp av metoden ifølge foreliggende oppfinnelse stoffer som er stabile innenfor rimelige grenser når det gjelder pH, temperatur, oppløsningsmiddel og saltkonsentrasjoner.

Rapportørgruppene påvist ved hjelp av metoden ifølge foreliggende oppfinnelse er mindre enn 10.000 dalton i størrelse. Den lille størrelse på slike rapportørgrupper byr på flere fordeler, deriblant: 1) De kan lett bindes til bærermasser ved hjelp av fremgangsmåter som ikke lett kan tilpasses for binding av store rapportørgrupper eller rapportørgrupper som lett dena-tureres . 2) Slike rapportørgrupper kan bindes til en bestemt bærermasse i mye større antall enn det større rapportørgrupper kan. Denne større tetthet av rapportørgrupper pr.enhet over-flateareal på bærermassen letter påvisningen av rapportør-gruppene innenfor et bestemt lite område ettersom den større tetthet gir et lettere påvist signal fra et slikt overflate-areal. 3) Bruken av små rapportørgrupper gir en høyere grad av allsidighet som ikke er mulig når det brukes store rapportørgrupper. Den kjemiske fremgangsmåte ved binding av små rapportørgrupper er lettere å utføre og påvisningen og kvantifiseringen av slike grupper er også lettere. Ettersom en lang rekke forskjellige stoffer kan bindes kjemisk til slike små rapportørgrupper, kan dertil et felles påvisnings-system anvendes for å overvåke immobiliseringen av små rap-portørgrupper som har slike stoffer bundet til seg. En slik allsidighet er ikke mulig med store rapportørgrupper.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte, komplekser og reagensmidler for den følsomme påvisning av rapportørgrupper bundet til en bærergrunnmasse, noe som muliggjør overvåking av reaksjonen hvorved rapportørgruppen immobiliseres på bærermassen, samt kvantifisering av reaksjonen mellom et andre molekyl og bærermassen. Oppfinnelsen muliggjør også overvåking av beslektede reaksjoner sorn omfatter stoffer som kan endre rapportørgruppekompleksenes mulighet til å bli immobiliserte. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt den luminescerende påvisning av immobiliserte rapportørgrupper ved bruk av et nytt påviserkompleks som lett kan sammenkobles med et lysemitterende system og som er i stand til å gi en reaksjon med høy affinitet raed en bestemt rapportørgruppe som er mindre enn ca. 10.000

dalton i størrelse.

Rapportørgruppene som kan brukes ved utøvelsen av oppfinnelsen, kan være praktisk talt ethvert lite molekyl som det er tilgjengelig spesifikke bindingsstoffer for (dvs. ligander). Slike rapportørgrupper omfatter, men er ikke begrenset til, vitaminer, slik som biotin, iminobiotin, desthiobiotin eller pyridoxalfosfat som reagerer svært spesifikt med visse proteiner, cofaktorer slik som porfyriner som reagerer svært spesifikt med visse proteiner, slik som cyto-chromene og hydroperoxydasene, antigener, som f.eks. dinitrofenol, biotin, iminobiotin, desthiobiotin, fluorescein og fluorescamin eller konjugater derav som antistoffer reagerer svært spesifikt med, og carbohydrater, som f.eks. mannose, galactose og fucose som visse lectiner reagerer svært spesifikt med.

Tilstedeværelsen av den immobiliserte rapportør-grupper bestemmes ved først å inkubere den med et overskudd av fritt påviserkompleks i oppløsning. På grunn av påviserkompleksets sterke affinitet til rapportørgruppene, binder en del av påviserkomplekset seg til de tilstedeværende rapportør grupper. Etter fjerning av ikke-bundet påviserkompleks, påvises det påviserkompleks som er tilbakebundet ved å bringe det i kontakt med et lysemitterende system som er i stand til emittere lys i nærvær av komplekset. Ettersom mengden bundet påviserkompleks er proporsjonal med mengden rapportørgruppe på bærermassen, korreleres lyset som emitteres ved hjelp av det lysemitterende system på bærermassen med antallet rapportør-grupper bundet til bærermassen.

Påviserkomplekset ifølge oppfinnelsen består av en første bestanddel som har en høy spesifikk affinitet til en rapportørgruppe med en størrelse som er mindre ca. 10.000 dalton, og en andre bestanddel som lett kan kobles til et lysemitterende system. Denne andre bestanddel kan bestå av enten et kjemisk stoff som kan delta i lysgenerering når det tilsettes ytterligere bestanddeler, eller den kan bestå av et enzym som spiller en vesentlig rolle i en flertrinns lys-emitterende reaksjon. Uansett den nøyaktige natur av den andre bestanddel i påviserkomplekset, emitteres lys ved hjelp av det lysemitterende system bare når påviserkomplekset er tilstede. Denne lysemisjon kan korreleres direkte med tilstedeværelsen av det immobiliserte påviserkompleks.

Innen den tidligere kjente teknikk er det kastet lys over et stort antall bioluminescerende og kjemiluminescerende, lysemitterende systemer som kan brukes ved utøvelsen av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse (jfr. Maulding, D.R. og Roberts, B.G., J. Org. Chem. 34, 1734 (1969), Tseng, S.S.

et al., J. Org. Chem., 44, 4113-4116 (1979), Gill, S.L., Aldrichimia Acta 16, 59-61 (1983), Clinical and Biochemicak Luminescence, suprar;og Methods in Enzymology, Vol. 57, Aca-demic Press, 1978). Ettersom de fleste av disse krever flere bestanddeler for at hele systemet skal virke, kan den luminescens-tilkoblende andre bestanddel i påviserkomplekset være hvilken som helst av en lang rekke stoffer.

Ettersom det er en lang rekke stoffer som har en

høy spesifikk affinitet til potensielle rapportørgrupper med en størrelse som er mindre enn ca. 10.000 dalton, kan på samme måte rapportørgruppen som binder den første bestanddel i påviserkomplekset, være en lang rekke forskjellige stoffer.

For å lette forståelsen av foreliggende oppfinnelse, gis det følgende definisjoner for visse uttrykk som er brukt:

1) Bærergrunnmasse. En hvilken som helst fast

bærer sammensatt av en uoppløselig polymer, som f.eks. nitrocellulose, agarose, etc, som kan, men ikke behøver, ha et

organisk belegg som omfatter et protein, et carbohydrat, en nucleinsyre eller en analog derav.

2) Rapportørgruppe. Enhver kjemisk rest som kan

brukt for å merke bestemte kjemiske grupper på en bærergrunnmasse, og som er rimelig stabil overfor pH-, temperatur-, oppløsningsmiddel- og saltbetingelser. Slike grupper har en størrelse som er mindre enn ca. 10.000 dalton, og er vanligvis substituenter som ikke er poteiner. Rapportørgrupper omfatter også kjemiske rester som vanligvis ikke er tilstede på molekyloverflåtene, men som kan innføres som rapportørgrupper gjennom kjemiske fremgangsmåter. 3) Påviserkompleks. Et kompleks en første bestanddel bestående av et rapportørgruppebindende stoff og en andre bestanddel bestående av et sammenbindende stoff. 4) Lysemitterende system. Én eller flere reaksjoner som, når de kobles til et påviserkompleks, kuliminerer i emisjonen av lys. Det lysemitterende system kan bestå av en lysemitterende reaksjon, en overgangsreaksjon og et stoff eller en annen reaktant som, når den omsettes med påviserkomplekset, gir et produkt som er en bestanddel i overgangsreaksjonen eller i den lysemitterende reaksjon.

Den grunnleggende fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse gjør bruk av følgende trinn: 1) Binding av et påviserkompleks til en rapportør-gruppe som er bundet til en bærergrunnmasse, samt kompleksdannelsen mellom rapportørgruppen og påviserkomplekset. 2) Fjerning av påviserkompleks som ikke har dannet kompleks med rapportørgruppen. 3) Sammenkobling av et lysemitterende system med detektorkomplekset som er bundet og som forblir immobilisert på bærermassen, noe som forårsaker at lys emitteres. 4) Bruk av lysfølende midler som f.eks. et luminometer, lysfølsom film eller en lysfølsom ladningskoblet anordning (CCD) og sammenligning med standardkurver for å bestemme ut fra mengde emittert lys antallet tilstedeværende rapportørgrupper på bærermassen.

I den lysemitterende reaksjon kan ytterligere trinn og reagenser være påkrevet og vil variere avhengig av arten av påviserkompleks. Den andre bestanddel i påviserkomplekset er fortrinnsvis av to hovedtyper som omfatter henholdsvis: a) Et stoff, som f.eks. en luminescerende forbindelse, som i seg selv er en vesentlig bestanddel i en lysemitterende reaksjon, eller b) Et enzym, coenzym, fluorescerende forbindelser, en annen faktor eller stoff som tilveiebringer et vesentlig

eller begrensende stoff i en overgangsreaksjon eller i en lysemitterende reaksjon.

Det kan brukes en lang rekke forskjellige luminescerende reaksjoner for å utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Omtale av lysemitterende systemer som kan brukes ved utøvelsen av oppfinnelsen, finnes i: Clinical and Biochemical Luminescence, supra, og Methods in Enzymology, supra. Disse litteraturhenvisninger er represen-tative, men omfatter ikke alle lysemitterende reaksjoner som kan brukes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Anvendbarheten av disse lysemitterende reaksjoner kan utvides ved bruken av en lang rekke forskjellige over-gangsreaks joner som kan tilveiebringe en av begrensende stoffer i den luminescerende reaksjon. Det bør understrekes at selv om oxygen er et begrensende stoff, er det i mange lysemitterende systemer vanligvis allestedsnærværende, og derfor er overgangsreaksjoner som produserer oxygen generelt upraktiske.

Det er mulig å anvende et stort antall påviserkomplekser. Sammenbindingsstoffet som utgjør den andre bestanddel i påviserkomplekset, kan utgjøre en av de nødvendige bestanddeler i den luminescerende reaksjon, eller det kan utgjøre en bestanddel i et overgangssystem, idet dette tilveiebringer en bestanddel som er nødvendig for at den luminescerende reaksjon skal virke. For å demonstrere forskjellig-artetheten av mulige påviserkomplekser, skal det nedenunder omtales reaksjoner av forskjellige former med et bioluminescerende system avledet fra bakterier.

Den andre bestanddel kan bestå av en bakterie-luciferase, og når det er tilfelle, og FMNH, et langkjedet alde hyd og oxygen bringes i kontakt med påviserkomplekset, emitteres lys. Den andre bestanddel kan også bestå av stoff som er en vesentlig bestanddel i en overgangsreaksjon som gir et mellomprodukt som er vesentlig eller begrensende i en luminescerende reaksjon, som f.eks. en bakteriell biolumine-scensreaksjon. Typiske stoffer som kan brukes som en slik andre bestanddel, er illustrert i de lysemitterende systemer nedenunder som er gruppert etter type anvendt overgangsreak-s jon.

1) FMNH-produserende overgangsreaksjoner.

a) Når det brukes et påviserkompleks med en andre bestanddel som består av FMN<+>oxidoreduktase og hvor komplekset som er bundet, bringes i kontakt med NADH, aldehyd, oxygen og bakterieluciferase, genererer NADH FMNH ved hjelp av FMN<+>oxidoreduktasen og, det emitteres lys i nærvær av de øvrige bestanddeler i det bakterielle bioluminescerende system. b) Når det brukes et påviserkompleks med en andre bestanddel som består av en NAD<+->eller NADP<+->avhengig dehydrogenase, og hvor påviserkomplekset som er bundet, bringes i kontakt med NAD(P)<+>slik at det passende reduserte substrat, genereres NAD(P)H. Et eksempel på en slik dehydrogenase er glucose-6-fosfat-dehydrogenase (G6PDH) fra Leuconostoc mesenteroides: som er i stand til å produsere NADH eller NADPH og som er en av over 300 forskjellige NAD- og NADP<+->avhengige dehydrogenaser, hvorav mange kan brukes i påviserkomplekset. Kontakt mellom NAD(P)H-produktet og FMN<+>, FMN<+>oxidoreduktase, aldehyd, oxygen og bakterieluciferase enten i rekkefølge eller samtidig gir dannelse av FMNH og emisjon av lys. c) Når det brukes et påviserkompleks med en andre bestanddel som utgjøres av et NAD<+->syntetiserende enzym som

f.eks. ATP:NMN<+>adenylattransferase og påviserkomplekset som er bundet, bringes i kontakt med ATP og FMN<+>, genereres NAD. Ved å bringe NAD<+->produktet i kontakt med en NAD<+->avhengig dehydrogenase og et passende redusert substrat for dehydro-genasen, enten samtidig eller i rekkefølge, genereres NADH. Kontakt mellom NADH og FMN<+>og FMN<+>oxidoreduktase, aldehyd, oxygen og bakteriluciferase, enten samtidig eller i rekke-

følge, resulterer i lysemisjon.

d) Når det brukes påviserkompleks med en andre bestanddel som består av aktiv NAD<+>som et begrensende middel,

og detektorkomplekset som er bundet bringes i kontakt med et passende redusert substrat og en passende hydrogenase, gene-rereres NADH. Kontakt mellom NADH og FMN<+>, og FMN<+>oxidored-duktase, enten samtidig eller i rekkefølge, genererer FMNH. Kontakt mellom FMNH og aldehyd, oxygen og bakterieluciferase gir lysemisjon. Et slikt system krever at NAD<+>og NADH er katalytisk aktive sammen med både dehydrogenase og FMN<+>oxidoreduktase .

e) Når det brukes et påviserkompleks med en andre bestanddel som består av aktiv FMN<+>og påviserkompleks soia

er bundet bringes i kontakt med NAD(P)H, FMN+ oxidoreduktase, aldehyd, oxygen og bakterieluciferase, fåes dannelse av FMNH og lysemisjon.

2) Aldehydproduserende overgangsreaksjoner.

a) Når det brukes et påviserkompleks med en andre bestanddel bestående av en passende alkoholdehydrogenase, og detektorkomplekset som er bundet bringes i kontakt med NAD(P)<+>og en passende alkohol, produseres et aldehyd. Ved å bringe dette aldehyd i kontakt med FMNH, oxygen og bakterie-lucif erase, enten samtidig eller i rekkefølge, emitteres lys. b) når det brukes et påviserkompleks med en andre bestanddel bestående av aktiv NAD(P)<+>som virker som et

begrensende middel i genereringen av aldehyd ved hjelp av alkoholdehydrogenase, og påviserkomplekset som er bundet bringes i kontakt med en passende alkohol og en passende dehydrogenase, fåes det produksjon av et aldehyd og NAD(P)H. Samtidig eller på hverandre følgende kontakt mellom produkt-aldehydet og oxygen, FMNH og bakterieluciferase gir lys.

En andre dehydrogenase og dens substrater tilsatt dette reak-sjonssystem regenererer NAD(P)<+->produktet fra NAD(P)H.

Ut fra det ovenfor nevnte er det åpenbart at den andre bestanddel i påviserkomplekset ifølge foreliggende oppfinnelsen kan variere i utstrakt grad, og det skal forståes at de som er beskrevet, kun er for illustrerende formål, og ikke er ment å begrense omfanget av oppfinnelsen. Selv om fagfolk innenfor teknikken vil forstå at flere hundre forskjellige påviserkomplekser kan brukes sammen med de for skjellige lysemitterende systemer som er tilgjengelige, er av praktiske grunner de foretrukkede påviserkomplekser mye færre i antall ettersom mange kan omfatte stoffer som er kostbare, ustabile, vanskelige å erholde, tungvinte i bruk eller har liten følsomhet.

De mest foretrukkede former av påviserkomplekset

er de hvor den andre bestanddel, når den føres smmen med et lysemitterende system, forårsaker at dette emitterer et stort antall fotoner. Slike påviserkomplekser omfatter vanligvis i sine andre bestanddeler et enzym med en forholdsvis høy katalytisk omsetning, eller et molelylært stoff som kan gjennomløpe flere sykluser i løpet av en kort tidsperiode,

idet hver syklus har en høy sannsynlighet for å emittere et foton. En andre bestanddel i et slikt kompleks kan kobles direkte til i en av de luminescerende reaksjoner, eller den kan kobles inn direkte til en slik reaksjon og virke som et begrensende eller vesentlig stoff gjennom en overgangsreak-s j on.

De kjemiske stoffer som den andre bestanddel i påviserkomplekset fortrinnsvis er omfattet av, inkluderer slike enzymer som oxidoreduktasen, som f.eks. FMrJ+ oxidoreduktase, glucose-6-fosfatdehydrogenase (G6PDH), malatdehydrogenase, alkoholdehydrogenase, lactatdehydrogenase eller triosefosfatdehydrogenase, alkalisk fosfatase, adenyltransferase, NAD<+>syntetase eller ATP syntetase, pyruvatkinase, creatinkinase eller adenylatkinase, glucoseoxidase, xanthinoxidase eller monoaminoxidase, peroxidase, bakterie- eller ildflueluciferase, pyranosidaser som f.eks. betagalactosidase, neuraminidase eller fucosidase hvis reaksjonsprodukter kan være fluorescerende stoffer, eller enzymer hvis reaksjonsprodukter kan være andre stoffer som kan være koblet direkte eller indirekte til lys-emitterende systemer.

I tillegg kan den andre bestanddel i påviserkomplekset bestå av luciferin eller et hvilket som enzymatisk aktivt coenzym, som f.eks. NAD<+>, NADP<+>, ATP, ADP, AMP, FMN<+>eller FAD+, katalysatorer, som feks. jern-hem og forskjellige metaller, og stoffer som er luminescerende i nærvær av en katalysator og oxygen eller hydrogenperoxyd, som f.eks. luminol, isoluminol, pyrogallol, lucigenin og lofin. Den andre bestanddel kan også med nytte bestå av et fluorescerende stoff som f.eks. 7,10-difenylanthracen, perylen, rubren, bis[fenylethy-nyl]anthracen (PPEA) og umbellifero n-eller dansyl-derivater, eller stoffer som eksiterer til flurescerende forbindelser,

som f.eks. bis(2,4,6-triklorfenyl)oxalat (TCPO) og bis(2-carbopentoxy-3,5,6-triklorfenyl)oxalat (CPPO) og andre oxalat-analoger. For nærmere omtale av fluorescerende midler og eksiterende stoffer, slik som oxalater, vises det til Mauling, D.R. og Roberts, B.G. J. Org. Chem., 34, supra,

Tseng, S.S. et al., J. Org. Chem., 44, supra, og Gill, S.K. Aldrichimia Acta, 16, supra. Ytterligere omtale av kjemiluminescerende og bioluminescerende lysemitterende systemer kan finnes i Clinical and Biochemical Luminescence, 12, supra og Methods in Enzymology, 57, supra.

På samme måte som den andre bestanddel i påviserkomplekset, kan også det rapportørbindende stoff som den første bestanddel i påviserkomplekset består av, velges blant en lang rekke forskjellige stoffer. Rapportørgruppebindende stoffer som ka:n brukes, er de som er i stand til å gi høy-spesifikke affinitetsreaksjoner med rapportørgrupper som har en størrelse mindre enn ca. 10.000 dalton. Det er foretrukket at reaksjonen mellom det rapportørbindende stoff og en rapportør-gruppe oppviser en affinitet som er større enn ca. 10 8. Eksempler på foretrukkede første bestanddeler i påviserkompleks er de som består av proteiner som binder visse vitaminrap-portørgrupper med høy affinitet, som f.eks. avidin eller streptavidin som binder biotinrapportørgrupper, proteiner som binder risikofaktorraportørgrupper med høy affinitet, som e.eks. apomyoglobin som binder porfyrinrapportørgrupper, antistoffer som binder spesifikke antigene rapportørgrupper med høy affinitet, som f.eks. antistoffer for dinitrofenol-, biotin-, iminobiotin-, desthiobiotin-, fluorescein- eller fluorescaminrapportørgrupper, lectiner som binder carbo-^ hydratrapportørgrupper med høy affinitet, som e.sk. concanavalin A som binder mannoserapportørgruppet, og chelateringsmidler

som selektivt"rb±nder metallrapportørgrupper. Som første bestanddel kan også brukes de som består av kjemiske rester som gir

høyspesifikke reaksjoner med bestemte deler av rapportør-grupper. Gjenkjenning av en rapportørgruppe ved hjelp av påviserkomplekset resulterer i slike tilfeller i dannelse av en covalent binding mellom rapportørgruppen og påviserkomplekset som et resultat av at kjemiske rester på rapportrø-gruppen og den første bestanddel i påviserkomplekset danner et produkt som binder sammen de to artene.

Dannelse av en slik covalent binding mellom en rapportørgruppe og første bestanddel i et påviserkompleks

kan gjennomføres en hvilken som helst av en rekke forskjellige reaksjoner, som f.eks. de nedenfor nevnte hvor de reagerende rester og resulterende produkter er angitt: 1) Omsetning av av primære aminer med aktive estere til amider. 2) Omsetning av alkoholer med aktive estere til estere. 3) Omsetning av aminer og alkoholer med epoxyder til henholdsvis substituerte aminer og ethere. 4) Omsetning av aminer med isothiocyanater til thioureaer. 5) Omsetning av organiske kvikksølvsalter

med olefiner til substituerte olefiner. 6) Omsetning av thioler med maleiimider til thioethere. 7) Omsetning av di-azoniumsalter med aromatiske stoffer til diazoforbindelser.

Fagfolk innen teknikken vil innse at det foreligger en rekke ytterligere kjemiske reaksjoner som kan brukes til dannelsen av den covalente binding. I alle tilfeller må imidlertid bindingsreaksjonen som anvendes være begrenset til påviserkomplekset og rapportørgruppen som er involvert.

Når det gjelder syntesen av påviserkomplekset, så kan bindingen av den første bestanddel til den andre bestanddel utføres på flere måter, deriblant: 1) Direkte covalent binding mellom bestanddelene ved den spontane covalente binding mellom kjemiske rester

på overflatene av bestanddelene slik at det dannes et produkt som kobler sammen de to artene, som f.eks. en ether-, ester-, thiourea-, amid-, thioester-, thioether-, substituert olefin-eller diazoforbindelse. Covalent binding kan også frembringes ved aktivering av slike kjemiske rester med et kondensasjonsmiddel, slik som omsetningen av aminer, trioler og alkoholer med syrer i nærvær av et carbodiimid, thionylklorid eller annet carboxylataktiverende middel.

2) Covalent binding mellom bestanddelene gjennom

et bifunksjonelt koblingsmiddel med perifere funksjonelle grupper som bindes covalent til kjemiske rester på de respektive bestanddeler, og som har en indre del som git en binding mellom de to arter. Eksempler på slike bifunksjonelle koblingsmidler er de som binder sammen aminer og/eller thioler og/eller alkoholer. 3) Dannelse av en høyaffinitets, ikke-covalent reaksjon mellom bestanddelene.

Ved den foretrukne syntese av påviserkomplekset anvendes en ikke-covalent reaksjon av den type som det ovenfor er referert til for binding av påviserkomplekset til en rapportørgruppe, dvs. en reaksjon mellom vitamin og protein,

en reaksjon mellom cafaktor og protein, en reaksjon mellom antigen og antistoff, en reaksjon mellom carbohydrat og lectin eller en hvilken som helst annet egnet ikke-covalent spesifikk bindingsreaksjon med høy affinitet.

Et eksempel på et påviserkompleks hvor bestanddelene er bundet sammen ved hjelp av en ikke-covalent reaksjon mellom protein og vitam, f.eks. avidin og biotin, er en hvor den første bestanddel er avidin og den andre bestanddel er bio-tynilert FMN<+>oxidoreduktase. Ettersom avidin har fire bio-tinbindende seter, har påviserkomplekset et overskudd av slike bindingsseter, noe som gjør det spesielt nyttig til påvisningen av tilstedeværelse av biotin som en immobilisert rapportørgruppe. FMN<+>oxidoreduktasebestanddelen kan lett kobles til lysemisjon ved å bruke det bakterielle biolumine-scenssystem og NADH.

Om ønsket kan syntesen av påviserkomplekset utføres ved en reaksjon som binder den andre bestanddel til den første bestanddel etter at den sistnevnte er bundet til en rapportør-gruppe som er festet på en bærermasse, slik som i eksemplene 1, 4 og 5 nedenunder. Det skal derfor forståes at når det henvises til at en rapportørgruppe bringes i kontakt med et påviserkompleks, omfatter slik kontakt sekvenskontakten mellom bestanddelene i påviserkomplekset og rapportørgruppen som hører med i slik syntese, såvel som kontakt mellom en rapportør-gruppe og et påviserkompleks syntetisert før kontakten med rapportørgruppen. Uansett hvilken syntetisk fremgangsmåte som brukes, er kravet til bevarelse av den kjemiske og/eller biokjemiske aktivitet hos de respektive bestanddeler som bindes sammen, underforstått. Dersom det viser seg at en ønsket aktivitet går tapt under kompleksdannelsen, bør det anvendes en alternativ kjemisk fremgangsmåte hvor den ønskede aktivitet bevares.

Ved valg av bestanddeler for bruk i et påviserkompleks og av det lysemitterende system som skal kobles sammen med komplekset, bør det tas i betraktning flere fak-torer, deriblant:

1) De enkelte bestanddeler i et påviserkompleks

bør virke på rett måte under betingelser med hensyn til pH, temperatur, saltkonsentrasjon, etc. som har en akseptabel likhet.

2) Den andre bestanddel bør, når den er koblet til et enzym, coenzym eller fluorescerende forbindelse i et produkt som kan påvises ved hjelp av et passende lysemitterende system. 3) Produktet henvist til under 2) bør dannes i en tilstrekkelig stor mengde til å gi den ønskede følsomhet med det bestemte lysemitterende system. I dette henseende bør det forventes at den katalytisie aktivitet til et påviserkompleks, når det er immobilisert ved binding til en immobilisert rapportørgruppe, er lavere enn hos den katalytiske bestanddel når den ikke inngår i et kompleks. 4) Dersom følsom påvisning krever akkumulering av et reaksjonsprodukt over en viss tid, er det nødvendig at et slikt produkt er stabilt i den påkrevde tid. Det ville f.eks. være et dårlig råd å bruke et lysemitterende system som krever akkumulering av FMNH i lang tid ettersom FMNH

er svært ustabilt og har en halveringstid i nærvær av oxygen som er mindre enn 1 sekund.

Når fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse utøves under bruk av et lysemitterende system som gjennomgår en første reaksjon hvor produksjonen av mellomprodukt kata-lyseres og en andre reaksjon hvor lys emitteres, kan de optimale betingelser for katalysering av produksjonen av mellom produktet være forskjellig fra de optimale betingelser for lysemisjonen. Når dette er tilfelle, kan den katalytiske aktivitet til den andre bestanddel i påviserkomplekset bringes til maksimum på flere forskjellige måter, slik som: 1) Ved å utføre den første reaksjon, som involverer den katalytiske aktivitet hos påviserkomplekset, under betingelser som er generelt optimale for dannelsen av mellomproduktet, og deretter utføre den andre reaksjon under betingelser som er generelt optimale for lysemisjon. 2) Ved å oppløseliggjøre minst den katalytiske bestanddel i påviserkomplekset før den brukes i den første reaksjon til generere mellomproduktet. Dette gjøres ettersom oppløselige katalytiske bestanddeler, f.eks. enzymer, vanligvis har større aktivitet enn immobiliserte bestanddeler. Opp-løseliggjøring kan utføres på flere forskjellige måter, avhengig av arten av påviserkompleks. Disse omfatter: a) Dissosiering av påviserkomplekset fra rapportør-gruppen som er bundet til, under anvendelse en endring i pH,

temperatur, saltkonsentrasjon, etc. Varmeseparasjon kan ut-føres ved bruk av påviserkompleks hvor den første bestanddel består av et varmeustabilt antistoff og hvor den andre bestanddel består av et varmestabilt stoff. Adskillelse av et påviserkompleks fra en rapportørgruppe som følge av en endring i pH lettes ved valg av en rapportørgruppe og en første bestanddel i påviserkomplekset som danner en høyaffini-tetbinding som dissosierer under svakt sure eller svakt basiske betingelser. F.eks. er bindingen mellom avidin som rapportørgruppe og iminibiotin som første bestanddel i påviserkomplekset en som har høy affinitet ved nøytral pH,

men som dissosierer ved den svakt sure pH på 4,5.

b) Bruken av et påviserkompleks hvor bestanddelen er bundet sammen ved hjelp av en binding som kan spaltes

under milde betingelser. Eksempler på slike bindinger er di-sulfider som spaltes ved hjelp av thioler, vicinale dioler, som spaltes ved hjelp perjodater, og svakt aktive estere eller carbamater som hydrolyseres ved hjelp av svake baser.

c) Bruken av en enzymatisk nedbrytbar bærermasse som rapportørgruppen er bundet til. Et eksempel på en slik bærermasse er en som er dannet av amylopectin som er nedbrytbar ved amylase. d) Bruken av en enzymatisk spaltbar kjemisk binding til immobiliseringen av rapportørgruppen.

Som tidligere nevnt, er påviserkompleksene som er mest foretrukket for bruk ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, de hvor den andre bestanddel, når den kobles til et lysemitterende system, forårsaker at dette gir flere fotoner for hvert påviserkompleksmolekyl. Slik emittering av flere fotoner er mulig når den andre bestanddel i påviserkomplekset består av eller kan kobles til et enzym, et coenzym eller en fluorescerende forbindelse. Fordelene ved å bruke enzymer består i det faktum av hvert enzymmolemyl i løpet av 1 minutt kan omdanne et stort antall molekyler av et passende substrat til et produkt. En effektiv katalytisk hastighet hos et enzym henvises til som et høyt omsetningstall, og det er fordelaktig minst 10/minutter og foretrukket

2 5

i området fra 10 til 10 /minutter eller høyere. Slike foretrukkede omsetningstall kan i prinsippet gi en økning på 2

til 5 størrelsesordener når det gjelder følsomet, men det er vanligvis i det minste en viss reduksjon i aktivitet forbundet med kompleksdannelse (Se Sundaram, P.V. et al., Ca. J. Chem. 48, 1498-1504, (1970) og Carlsson, J, og Svenson, A., FEBS. Lett., 42, 183-186 (1974). Enzymer beholder imidlertid vanligvis en rimelig aktivitet både når de har dannet kompleks og når de immobilisert.

Det kan også oppnås forbedret følsomhet dersom den andre bestanddel består av et coenzym eller en cofaktor.

Denne fordel oppstår ikke som et resultat av at det genereres flere produkter, men heller som et resultat av den katalytiske virkning til coenzymet eller cofaktoren når det gjelder å aktivere den enzymatiske reaksjon. En slik virkning av coenzymet NAD<+>er illustrert i den periodiske reaksjon nedenunder :

I den illustrerte reaksjon regenererer enzym 1

NADHog enzym 2 benytter NADHtil en overgangsreaksjon som fører til lysemittering. Dette krever at enzymene 1 og 2

er i stand til å bruke conezymet NAD<+>som er kompleksdannet eller konjugert, eller at et aktivt coenzym eller en aktiv cifaktor kan frigjøres fra komplekset før analysen. Enzym 1 kan være et hvilket som helst av en lang rekke dehydrogenaser. Enzym 2 kan f.eks. være FMN+ oxidoreduktase, og den bakterielle luminescerende reaksjon kan brukes for å gi lysemisjon.

Det er blitt syntetisert konjugerte og immobiliserte former av coenzymene NAD<+>og NADP<+>som beholder katalytisk aktivitet. (Se f.eks. Weibel, M.K. et al., i Enxyme Engi-neering (E.K. Pye og L.B. Wingard, eds.) Vol. 2, s. 203 - Plenum, New York, 1974, Larsson, P.O. og Mosback, K., FEBS. Lett. 46, 119, (1974, Mosback et ak., Methods in enzymology, 44, 859-887 (1976).

Den andre bestanddel i påviserkomplekset kan også bestå av ATP som kan virke som et katalytisk reagens. Bruken av ATP krever imidlertid sannsynligvis dets frigivelse fra påviserkomplekset. Så lenge den frigjorte form av ATP er en analog med et langkjedet alifatisk derivat i N6- eller N8-stilling i purinringen, er det en god chanse for at dets katalytiske aktivitet sammen med enzymer vil bli beholdt (Mosbach, K. et al., Methods in Enzymology, 44, supra. En slik anvendelse av ATP er illustrert i reaksjonen nedenunder.

Hvor ATP-m er ATP-modifisert og AMP-m er AMP-modifisert, og PRPP er fosforibosyl-pyrofosfat.

Et påviserkompleks kan også være et som kan kata-lysere dannelsen av et produkt som er en katalysator for en separat reaksjon. Systemer hvor et slikt kompleks er anvend-bare omfatter det følgende:

Når den andre bestanddel i påviserkomplekset består av et katalytisk stoff, slik som et enzym, som kan forårsake den hurtige dannelse av et katalysatorprodukt fra en prokata-lysator, kan det forventes svært følsom påvisning på grunn av de forsterkende virkninger av de to reaksjoner. Den enzymatiske dannelse av NAD<+>, den enzymatiske produksjon av fluorescerende molekyler og den enzymatiske aktivering av et andre enzym faller innenfor denne kategori. Vanlige reaksjoner for generering av henholdsvis NAD<+>og fluorescerende forbindelse, samt henholdsvis bioluminescerende og kjemiluminescerende reaksjoner som kan brukes sammen med disse, kan illustreres på følgende måte:

A. Fremstillingsreaksjoner for NAD<+>

1. MNM<+>+ ATP adenyltransferase>^

2. NADP<+>alkalisk fosfatase^NAQ<+>

B. Lys-emitterende reaksjon (bioluminescerende)

a = en passende dehydrogenase

b = FMN<+>oxidoreduktase

c = bakterieluciferase

:. Omdannelsesreaksjon for forløperforbindelse til fluorescerende forbindelse

3rofluorescerende forbindelse enzYm Fluorescerende forbindelse Et eksempel på denne reaksjon er omdannelsen av den profluore-scerende forbindelse 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-beta-D-glucosamin til den fluorescerende forbindelse 4-methylumbelli-feron i nærvær av enzymet beta-galactosidase.

D. Lys-emitterende reaksjon (kjemiluminescens)

I denne lysemitterende reaksjon omdannes et oxa-latderivat, som f.eks. bis(2,4,6-triklorfenyl)oxalat (TCPO) eller bis(2-carbopentoxy-3,5,6-triklorfenyl)oxalat (CPPO) til et cyclodioxethan, og energien som frigjøres ved sammenbruddet av cyclodioxethanet til CC>2absorberes av den fluorescerende forbindelse, noe som forårsaker eksitasjon av den fluorescerende forbindelse.Derpå følgende relaksasjon av den fluorescerende forbindelse til grunntilstanden resulterer i lys-emusjon.

Som tidligere nevnt har foreliggende oppfinnelse

et sentralt formål, dvs. påvisning av rapportørgrupper som er bundet til en bærermasse. Ettersom tilstedeværelsen av immobiliserte rapportørgrupper er avhengig av reaksjonen som binder dem til bærermassen, kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også brukes til å kvantifisere reaksjoner som påvirker rapportørgruppens evne til å bli immobilisert. Den gjensidige påvirkning hvorved en rapportørgruppe bindes til en bærermasse kan være en kjemisk reaksjon, en binding mellom antistoff og antigen, en binding mellom carbohydrat og lectin, en binding mellom vitamin og protein, en binding mellom cofaktor og protein, en binding mellom nucleinsyrer, slik som en DNA-DNA, RNA-DNA eller RNA-RNA hybridiserings-binding, en metallchelaterende binding, eller en hvilken som helst egnet, spesifikk binding mellom ligand og ligand eller kjemisk reaksjon.

En slik gjensidig påvirkning som kan overvåkes

ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er en binding mellom carbonhydrat og lectin hvorved en rapportørgruppe immobiliseres på en bærermasse. F.eks. kan et lectin adsorberes på en bærermasse og en rapportørgruppe kan bindes covalent til et carbohydrat i et område på det sistnevnte som ikke vil påvirke lectinets gjenkjenning av carbohydratet. Når komplekset mellom rapportørgruppe og carbohydrat er bragt i kontakt med lectinet adsorbert på bærermassen, forårsaker den resulterende binding mellom lectin og carbohydrat at rapportørgruppen immobiliseres på bærermassen. Påviserkomplekset kan så benyttes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til å påvise tilstedeværelsen av det bestemte, immobiliserte lectin som er involvert i bindingen.

Ved en annen anvendelse av dette konsept, kan immobiliseringen av en: rapportørgruppe på en bærermasse gjennom en binding mellom DNA og DNA overvåkes. F.eks. kan en organisk polymer i form av en DNA-kjede adsorberes på en bærermasse, og en rapportørgruppe kan bindes covalent til en andre DNA-kjede, som f.eks. et énkjedet oligonucleotid, som er komplementært til den immobiliserte del av DNA-kjede. Hybridisering av DNA-kjeden binder rapportørgruppen til bærermassen. I et slit tilfelle kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen brukes til å overvåke hybridiseringsreaksjonen. Ved å påvise den immobiliserte rapportørgruppe påviser fremgangsmåten også tilstedeværelsen av den bestemte DNA-kjede som er adsorbert på bærermassen.

Ved utøvelsen av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan forskjellige midler brukes til å registrere lyset som emitteres ved en lysemitterende reaksjon, hvorav noen er benyttet i eksemplene nedenunder. Blant slike lys-følsomme midler er et luminometer, en lysfølsom film og en lysfølsom ladningskoblet anordning eller andre egnede og ønskede lysfølsomme midler.

I hvert av eksemplene nedenunder er påvisning av immobiliserte rapportørgrupper ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen demonstrert, det samme er forskjellige bestemte tilpasninger av fremgangsmåten.

Eksempel 1

Påvisning av agarosebundet biotin-rapportørgrupper ved å bruke et påviserkompleks av avidin og et biotinrikt aggregat av biotinylert G6PHD og avidin (BAC)

I dette eksempel er biotin rapportørgruppen og påviserkomplekset har avidin som sin første bestanddel og har som sin andre bestanddel et ikke-covalent biotinrikt aggregat som består av flere molekyler av biotinylert glucose-6-fosfat-dehydrogenase som er holdt sammen med avidin. Påviserkomplekset kobles til fremstillingen av NADH fra oxydasjonen av glucose-6-fosfat med en enzymet i nærvær av NAD<+.>NADH fremstilt ved virkningen av enzymet bringes i kontakt med reagenset Bactilight I (Beneckea harveyi bakterie-luciferase og FMN<+>oxidoreduktase, som leveres av Analytical Luminescence Laboratory, San Diego, Ca. 92121, hvilket gir lysemisjon. I lysemisjonsreaksjonen brukes NADH til å redusere FMN<+>til FMNH som igjen oxyderes i nærvær av et aldehyd for

å gjendanne FMN<+>med den ledsagende emisjon av et foton.

Syntesen av biotinylert glucose-6-fosfat-dehydrogenase (G6PDH: E.C. 1.1.1.49) fra Leuconostoc mesenteroider utføres på følgende måte. En halv ml G6PDH (2 mg pr. ml) ble dialysert mot 1 liter 0,1M natriumbicarbonat over natten. Dialysen ble gjentatt i 2 timer og dialysatet fjernet fra dialyseposen. NADH og glucose-6-fosfat ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på henholdsvis 5 mM og 10 mM i et volum på 1,4 ml. Til denne oppløsning ble det tilsatt 50 um N-hydroxysuccinimidbiotin (2 mg pr. ml DMSO) og oppløsningen ble inkubert ved værelsetemperatur. G6PDH-aktivitet ble fulgt ved å fjerne små aliquoter av reaksjonsblandingen og analysere enzymatisk aktivitet ved å overvåke produksjonen av NADH spektrofotometrisk i 1 ml 55 mM Tris (pH 7,8) som inneholdt 3,3 mM magnesiumklorid, 1,7 mM NAD<+>og 2,8 mM glucose-6-fosfat. Når enzymaktiviteten hadde avtatt til 50% av den opprinnelige aktivitet, ble 50 mg ammoniumsulfat tilsatt for å stanse reaksjonen. Det biotinylerte enzym ble så dialysert mot 0,IM natriumbicarbonat i 20 timer og den resulterende oppløsning ble lagret ved 4°C. Biotinylering av enzymet ble bekreftet ved å vise at mer enn 90% av enzymet var absorbert på en avidin-agarose-kolonne (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) i nærvær av 0,2 M NaCl. Kontrollkolonner som var forbe-handlet med et overskudd biotin bandt ikke det biotinylerte enzym.

BAC-bestanddelen i påviserkomplekset fremstilles ved å danne et aggregat med et overskudd biotinylert hydrogenase over avidin (dvs. at BAC-bestanddelen er biotinrik). BAC-aggregatet dannes ved å tilsette 4 ul av en oppløsning

av Avidin-D (0,5 mg/ml PBS-Tween 20) til 1 ml PBS-Tween 20. Avidin-D leveres av Vector Laboratories, Burlingame, CA, og PBS-Tween 20 er fosfatbufret saltoppløsning (0,9% NaCl,

10 mM natriumfosfat, pH 7) som inneholder 0,1% Tween 20.

Til denne fortynnede oppløsning tilsettes 12 ul biotinylert enzym (0,4 mg enzym/ml 0,1 m NaHC03) under omrøring. Aggregatet får dannes i minst 15 minutter og lagres deretter ved 4°C inntil det brukes. Umiddelbart før bruk sentrifugeres BAC-aggregatet i 5 minutter i en bord-sentrifuge (ca. 3000 rpm) for å fjerne overliggende store aggregater som bidrar til ikke-spesifikk binding.

10^1 av en oppslemning av biotin-agarose-kuler

(Pierce Chemical Co., 1,5 x IO<-11>avidinbindende kapasitet)

fortynnes il ml PBS-Tween 20. Denne oppslemning dispergeres

så i 100 jul aliquoter i 1,5 ml Eppendorf-rør. Innholdet i hvert rør vaskes to ganger med 1 ml PBS-Tween 20, inkuberes deretter i 30 minutter med 40 ul avidin D (0,5 mg pr. ml,

0,3 nmol) for å danne kompleks med biotinet. Agarose-biotin: avidin-aggregatet vaskes fritt for ikke-bundet avidin med 1 ml PBS-Tween 20 og resuspenderes i 100 ul av den samme.

10 pl store porsjoner av suspensjonen deles deretter -pp i aliquoter i 1,5 ml Eppendorf-rør. Til hvert rør tilsettes 200 p. 1 av BAC-komplekset (12 pmol med hensyn på biotinylert G6PDH) og blandingen får reagere i 15 minutter for å danne

et kompleks av agarose-biotin og avidin-BAC. Kontrollkuler ble fremstilt ved å inkubere agarose-biotin-avidin-kuler med overskudd avidin (40 nM) før inkuberingen med BAC. Ikke-bundet BAC ble så fjernet ved 6 vaskinger med 2 ganger standard natriumcitratbuffer (SSC) bestående av 0,15 M NaCl og 0,015 M natriumcitrat. Utvalgte enkeltkuler av agarose ble så fjernet fra hvert rør under et mikroskop og analysert med hensyn på bioluminescens i et Monolight 4 01 luminometer (Analytical Luminescence Laboratories, San Diego, CA). En reagensoppløsning ble fremstilt av dodecylaldehyd (0,0005%), FMN<+>(3 x 10~<6>M), NAD<+>(3 mM), glucose-6-fosfat (5 mM), magnesiumklorid (3 mM) og trisbuffer (30 mM, pH 7,8) i et sluttvolum på 4 0 ul. Etter tilsetningen av en enkelt agarose-kule til reagensoppløsningen, ble den lysemitterende reaksjon startet opp ved tilsetning av 10 jul Bactilight I reagens (fremstilt etter produsentens instruksjoner) og reaksjonens forløp ble overvåket i luminometeret Monolight 4 01 ved en følsomhetsinnstilling på 10x. I tabell I nedenunder er typiske resultater angitt sammen med kontroller.

Tabell I

Bioluminescerende påvisning av biotinrapportør-grupper bundet til enkle agarosekuler under anvendelse av et avidin-BAC-påviserkompleks

Grad av lysutsendelse Prøve ( vilkårlige enheter) Ingen prøve (tomt apparat) 0,01

Tomt prøverør 0,02

FMN + aldehyd + buffer 0,03

FMN + aldehyd + buffer + Bactilight I

reagens (Fullstendig reagens-system) 0,15 Fullstendig reagens-system + agarose-

biotin:avidin-BAC 2,43 Fullstendig reagens-system + agarose-biotin:avidin-biotin-kontroll 0,15

Den avidinbindende kapasitet til biotin-agarosen ble uavhengig bestemt til å være 1,5 picomol pr.^il av den opprinnelige oppslemning. En kule med 70 um i diameter svarer

-15

følgelig til ca 10 mol biotin. Ut fra disse data kan det beregnes at ved å bruke fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er påvisningsgrensen for agarosebundet avidin ca. i 10 biotin.

Eksempel 2

Påvisning av agarosebundet biotin-rapportørgrupper ved å bruke et avidinbiotinylert G6PDH påviserkompleks.

Dette eksempel er på alle måter det samme som eksempel 1 med det unntak at påviserkomplekset har avidin som sin første bestanddel og har som sin andre bestanddel biotinylert glucose-6-fosfat-dehydrogenase (biotin-G6PDH). I dette tilfellet ble 200 jul av en biotin-G6PDH-oppløsning (tilnærmet lik 12 pmol) tilsatt til hver prøve ved å bruke den samme fremgangsmåte som i eksempel 1. Det endelige kompleks som her ble dannet, var et agarose-biotin:avidin-biotin-G6PDH-kompleks som ble analysert med hensyn på bioluminescens i luminometeret Monolight 401 slik som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er gjengitt i tabell II.

Basert på disse resultater er det beregnet at påvisningsgrensen for biotin bundet til agarose ved å bruke dette påviserkomplekset er ca. 10 mol biotin.

Eksempel 3

Påvisning av agarose-bundet biotin-rapportørgrupper ved å bruke et avidin-biotinylert G6PDH-påviserkompleks.

I dette eksempel ble påviserkomplekset dannet ved

å tilsette et overskudd av avidin til biotinylert glucose-6-fosfat-dehydrogenase. Dette påviserkompleks har den fordel at ingen mellomliggende behandling med avidin og derpå følgende vaskinger er nødvendig for å påvise biotin bundet til agarosekulene, slik tilfellet er i eksemplene 1 og 2.

Som i eksemplene 1 og 2 er rapportørgruppen biotin og det brukes et luminometer Monolight 4 01 for luminescenspåvisning.

Komplekset av biotinylert glucose-6-fosfat-dehydrogenase og avidin ble dannet ved hurtig å blande 12 ^ul streptavidin (0,5 mg pr. ml, Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) med 3 jul biotinylert glycose-6-fosfat-dehydrogenase

(0,42 mg pr. ml) i 125 yul PBS-Tween 20.

300 p. 1 biotin-agarose-suspensjon (Sigma Chemical. Company, St. Louis, MO) ble vasket to ganger med 1 ml PBS-Tween 20 og suspendert i 1 ml av den sistnevnte. Små.

aliquoter av biotin-agarose-suspensjonen ble deretter omsatt med 10 ^ul aliquoter av ctgregatet, etterfulgt av rysting på

en mansjettrister i 1 time ved værelsetemperatur. Prøvene ble deretter vasket 3 ganger med 1 ml PBS-Tween 20 som inneholdt 0,5 M NaCl. Analyse av prøvene under anvendelse av et luminometer Monolight 4 01 etter fremgangsmåtene ifølge eksemplene 1 og 2 ga resultater som svarte til de som ble oppnådd i disse eksempler.

Eksempel 4

Påvisning av biotin-rapportørgrupper på en nitrocellulosebundet DNA ved å bruke et avidin-BAC-aggregat-påviserkompleks

I dette eksempel er rapportørgruppene bundet til bærermassen gjennom en immobilisert ligand og påviserkomplekset har avidin som sin første bestanddel, og har det biotinrike BAC-aggregat beskrevet i eksempel 1 som sin andre bestanddel. DNA fra lambda-fag ble biotinylert ved å bruke nick-translasjon i nærvær av biotinylert dUTP hvor biotinet var covalent bundet til C-5-stillingen i deoxyuridin via en kjede med 11 atomer. Reagens--systemet som ble brukt til å biotinylere SNA fra fagen var reagens-systemet med nick-translasjon markedsført av Enxo Biochemicals, New Yoek, NY. Omsetningen ga lambda-DNA hvor 31% av thymidinrestene var erstattet med biotinylert deoxyuridin, bedømt ved hjelp av den ledsagende inkorporering av tritium-merket dCTP med kjent spesifikk aktivitet. DNA ble renset bort fra forurensende ikke-inkor-porert dUTP ved å bruke ethanolutfelling og Sephadex^ G-2 0 kromatograf i.

Biotinylert lambda-DNA ble denaturert ved å varme opp til 100°C i 5 minutter i destillert vann etterfulgt av avkjøling på is for å forhindre at enkeltkjeden på nytt bandt seg til hverandre. Forskjellige mengder av den denaturerte DNA ble så bundet til nitrocellulosefiltere (Schleicher and Schuell, Catalog nr. BA 85) ved direkte påsetting av DNA på filtrene i nærvær av 6 x SSC. Filtrene fikk lufttørke over natten og ble deretter varmet opp i 1 time ved 60°c under vakuum for å feste den biotinylerte DNA til filtrene. Mengde biotinylert DNA bundet til hvert filter ble kvantifisert ved hjelp av væske-scintillasjonstelling. Den gjennomsnittlige bindingseffektivitet til filtrene var 56% av påsatt DNA. Kontrollfiltere ble fremstilt ved å bruke ikke-modifisert kalvethymus-DNA (1 ug DNA pr. filter). BAC-aggregatet ga biotinylert G6PDH og avidin ble fremstilt som i eksempel 1.

Fremgangsmåten som ble brukt til å analysere filteret med hensyn på nærvær av immobilisert biotinylert DNA, var den følgende. De ikke-reagerte steder på filtrene ble "tildekket" ved inkubering i 30 minutter ved 37°C med 2% bovint serumalbumin i PBS-Tween 20. De tildekkede filtere ble deretter vasket to ganger i 5 minutter ved værelsetemperatur med 5 ml PBS-Tween 20. På dette punkt kan de reaktive grupper i den biotinylerte DNA som er filterbundet, skjematiseres som filter-DNA-biotin. Filtrene ble deretter behandlet i 30 minutter ved værelsetemperatur med 20 ul streptavidin-oppløsning (fremstilt ved å fortynne 15 ul streptavidin til 1,5 ml med PBS-Tween 20), hvorved det ble dannet et filter-DNA-biotin :avidin-kompleks. Ikke-bundet streptavidin ble

så fjernet ved to vaskinger av 5 minutters varighet med 5 ml PBS-Tween 20 og filtrene ble tørket for å fjerne overskudd

av oppløsning.

Filter-DNA-biotin:avidin-komplekset ble deretter omsatt med 15 ul BAC-aggregat i PBS-Tween 20 i 30 minutter ved værelsetemperatur hvorved det ble dannet et filter-DNA-biotin:avidin-BAC-kompleks. Det påviserkompleks som ikke var bundet, ble fjernet ved vasking av filtrene 6 ganger i 5 minutter med 5 ml 6 x SSC og en gang i 5 minutter med 5 ml Tris-buffer. Sentrumsdelen av hvert område på filteret som bar filter-DNA-biotin-avidin-BAC-komplekset ble deretter stanset ut ved å bruke et korkbord. Den utstansede del ble plassert i en mikrotiterbrønn som inneholdt 50 ul av en NADH-genererende oppløsning sammensatt av 55 mM Tris-buffer, pH 7,8, 3,3 mM magnesiumklorid, 2 mM NAD<+>og 3,3 mM glucose-6-fosfat. Etter 1 time med inkubering ved værelsetemperatur, ble supernatantoppløsningen som inneholdt enzymgenerert NADH overført til en 5 ml plastkuvette som inneholdt 4 00 pl0,0005%dodecylaldehyd i 0,1 M kaliumfosfatbuffer, pH 7.

Disse prøver ble så plassert i et luminometer Monolight 4 01 og analysert med hensyn på NADH-innhold ved å tilsette 100 yl

Bactilight I reagens og måle toppen av lysutsendelsen over

et 10 sekunders intervall ifølge produsentens instruksjoner. Mengden av bunden biotinylert DNA hadde en lineær sammenheng med mengden emittert lys.

Eksempel 5

Bioluminescenspåvisning av en nitrocellulosebundet hepatitis B virus DNA ved å bruke et biotin-rapportørgruppe-merket oligonucleotid og et avidin-BAC-påviserkompleks

En anvendelse av oppfinnelsen er den ikke-radioaktive påvisning av DNA-DNA-hybrider dannet mellom et oligonucleotid merket med en rapportørgruppe som f.eks. biotin, og immobilisert komplentær DNA bundet til en grunnmasse. Slike prober har nylig funnet anvendelse i påvisning av spesifikke syk-domsorganismer slik som hepatitis B virus (HBV) og herpes simplex virus (HSV) typer 1 og 2. Ifølge dette eksempel ble et biotinylert oligonucleotid med 21 nucleotider og som var komplentært med genet for HBV overflateantigenet, syntetisert ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i US patentsøknad nr. 06/4 68 4 98 som er overdratt til søkeren i foreliggende søknad. I dette oli'gonucleotidet ble to av thymidinrestene substituert med biotinylert deoxyuridin. Biotinet ble covalent bundet til 5-stillingen i deoxyoruridin ved hjelp av en kjede med 12 atomer. Den HBV-immobiliserte ligand var et rekombinant DNA-plasmid kalt pAM6 som bærer hele genomet for HBV klonet inn i pBR322 (Moriarty et al., PNAS, 78, sider 2606-2610 (1981)).

HBV-DNA inneholdt i plasmidet pAM6 ble adsorbert på nitrocellulosefiltere i det alt vesentlige som beskrevet i eksempel 4 for lambda-DNA. Kontrollfiltere fremstilt samtidig inneholdt bare kalvethymus- eller sildesperm-DNA. Filtrene ble deretter behandlet i 30 minutter i 6 x SSC (0,9M NaCl og 0,09M natriumcitrat) som inneholdt 10 x Den-hardfs oppløsning (0,02% bovint serumalbumin, 0,2% poly-vinylpyrrolidon og 0,2% Ficoll) for å tildekke de ikke-om-satte steder på nitrocellulosen og forhindre ikke-spesifikk binding av proben til filtermaterialet. Ficoll er en sucrose- polymer solgt av Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J. Filtrene ble deretter behandlet med den biotinylerte DNA-probe (2 mg/ml) over natten ved 4 6°C i 6 x SSC som inneholdt 1 x Denhardt<1>s oppløsning for å danne et kompleks som kan skjematiseres som f ilter-HBV: oligonucleotid-biotin . Ikke-bundet oligonucleotid ble vasket bort fra filteret ved hjelp av tre vaskinger av 15 minutter med 6 x SSC på is etterfulgt av 1 minutt vasking i 6 x SSC ved 46°C. Filtrene ble deretter tildekket på nytt for å forhindre at den ikke-spesifikke binding av avidin-BAC-påviserkomplekset. Dette ble gjort ved å inkubere filtrene i 30 minutter på is i 3%

bovint serumalbumin oppløst i Buffer A (0,5 M NaCl, 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 8, og 0,05% Tween 20). Tildekkingsopp-løsningen ble fjernet ved tre vaskinger av 3 minutter med Buffer A på is. Filtrene ble deretter behandlet med streptavidin (20 ug pr. ml i Buffer A) i 30 minutter på is for å danne et filter-HBV:oligonucleotid-biotin-streptavidin-kompleks. Ikke-bundet streptavidin ble fjernet ved tre vaskinger a 3 minutter i Buffer A på is. Filtrene ble deretter behandlet i 30 minutter med BAC-aggregatet i det vesentlige slik som beskrevet i eksempel 4 og ikke-bundet BAC-aggregat ble fjernet ved tre vaskinger a 3 minutter med iskald Buffer A.

På dette punkt besto hele komplekset som var bundet av filter-HBV:oligonucleotid-biotin:streptavidin-BAC.

For å påvise en mengde immobilisert biotinrapportør-gruppe og derved mengde immobilisert HBV-DNA, såvel som mengde kompleks dannet mellom oligonucleotidet og den immobiliserte DNA, ble filtrene inkubert i 10 minutter ved værelsetemperatur i 50 ul av den NADH-genererende oppløsning beskrevet i eksempel 4. Det fremstilte NADH ble påvist i luminometer Monolight 4 01 ved å bruke Bactilight I reagenset på følgende måte. En 25 ul aliquot av hver analyseblanding ble tilsatt til en 5 ml reaksjonskuvette av plast som inneholdt 400 ul 0,005% dodecylaldehyd i 0,1 M kaliumfosfatbuffer (KPB), pH 7. Denne blanding ble plassert i luminometeret og bakgrunns-emisjonen av lys ble målt. Luminescensreaksjonen ble startet opp ved injeksjon av 100 [ il Bactilight I reagens som inneholdt

<+><+>+

FMN , NAD :FMN oxidoreduktase og bakterieluciferase. Lys- pulsen generert i løpet av 10 sekunder var omtrent lineær i forhold til mengde bundet biotinrapportørgruppe og mengde bundet hepatitis B virus-DNA på nitrocellulosefiltrene.

Eksempel 6

Bioluminescenspåvisning av cellulosebundet anti-herpes antistoff ved å bruke et biotinrapportørgruppe-merket herpes overflateantigen og et avidin-biotinylert G6PDH påviserkompleks .

Anti-herpes simplex virus (HSV) antistoffer (erholdt fra Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) ble bundet til celluloseplater ved å bruke metaperjodatfremgangsmåten ifølge Kricke, et al., (J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 20:91-94, (9182). HSV-type 1 celleoverflate-antigen (levert av Flow Laboratories, McLean, VA) ble biotinylert ved å tilsette 50 ul N-hydroxysuccinimidobiotin (2 mg/ml i dimethylsulfoxyd) til 1 mg av antigenet oppløst i 1 ml 0,1 M natriumbicarbonat, etterfulgt av inkubasjon ved værelsetemperatur i 1 time. Reaksjonen stanses deretter brått ved å tilsette 50 mg ammoniumsulfat og produktet dialyseres to ganger mot 0,1 M natriumbicarbonat. Alternativt kan overflateantigenene sendes til et kommersielt laboratorium for bestillingsbiotinylering.

For å påvise tilstedeværelsen av anti-riSV-antistoffer bundet til celluloseflåtene, ble de inkubert i 30 minutter ved 37°C med en 1 ng/ml oppløsning av det biotinylerte HSV-antigen i PBS-Tween 20 som inneholdt 0,1% bovint serumalbumin.Antigenene som ikke var bundet ble deretter fjernet ved vasking av platene med 3 vaskinger a 5 ml i PBS-Tween 20-BSA. Det anvendte påviserkompleks var det samme som det som ble brukt i eksempel 3,.og platene ble deretter behandlet i 30 minutter med påviserkomplekset i det vesentlige slik som beskrevet i eksempel 4. Påviserkomplekset som ikke var bundet, ble deretter fjernet ved tre vaskinger a 3 minutter med Buffer

A.

For å påvise den immobiliserte biotinrapportør-gruppe og derved mengden av bundet anti-HSV-antistoff tilstede på platene, ble platene suspendert i Bactilight I reagens slik som beskrevet i eksempel 1, og graden av signalgene-rerering ble målt som funksjon av tiden. Disse verdier kan sammenlignes med en standardkurve fremstilt ved å følge den samme fremgangsmåte og bruke forskjellige kjente mengder av anti-HSV-antistoff for å bestemme mengde anti-HSV-antistoff som er tilstede. Ved å bruke en lignende fremgangsmåte kan anti-HSV-antistoffer kvantifiseres ut fra human serum.

Eksempel 7

Bioluminescenspåvisning av nitrocellulosebundet HSV-DNA

ved å bruke et dinitrofenol-rapportørgruppe-merket oligonucleotid og et anti-dinitrofenylantistoff-G6PDH-påviserkompleks

Herpes simplex virus DNA (HSV-DNA) som var blitt klonet inn i et plasmid (pHSVlOl levert av Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD), ble bundet til nitrocellulose etter fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4. Et herpes DNA-oligonucleotid som hadde dinitrofenylrapportørgrupper bundet til C-5-stillingen i deoxyuridin via en kjede med 11 atomer, ble syntetisert ved hjelp av fremgangsmåten ifølge US patent-søknad nr. 06/468 498, som er overdratt til søkeren i foreliggende søknad.

Dinitrofenylert herpes-oligonucleotid som er komplementært med den immobiliserte HSV-DNA, ble kompleksdannet med den sistnevnte ved en oligonucleotidkonsentrasjon på 10 ng/ml i 6 x SSC som inneholdt 10 x Denhardt's oppløsning, over natten ved 37°C i varmeforseglede plastposer. Ved slutten av inkubasjonen ble ikke-bundet overskudd av oligonucleotid vasket bort med 10 vaskinger a 5 ml under anvendelse av 6 x SSC på is.

Deretter ble filtere som bar DNA-komplekset inkubert med 2% BSA i PBS-Tween 20 ved 37°C i 30 minutter for å tildekke eventuelle gjenværende proteinbindende steder på filteret. Etter tre vaskinger å 5 minutter med PBS-Tween 20, ble filtrene inkubert med antidinitrofenylantistoff-G6PDH-påviserkompleks 1 p mol) i 30 minutter ved værelsetemperatur i 40 ul PBS-Tween 20.

Påviserkomplekset med antiDNP-Ab-G6PDH ble fremstilt i et forhold på 1:3 etter fremgangsmåten til Carlsson et al., (Biochem. J. 173: 723-737, 1978) ved å bruke-N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat. Etter vasking av komplekset bundet til filter 6 ganger med 6 x SSC/0,1% Tween 20, kvantifiseres det emitterte lys på følgende måte. Hvert enkelt filter tørkes for å fjerne overskudd av fuktighet og over-føres til en individuell brønn på en mikrotiterplate. Til hver brønn tilsettes 100 ul Bactilight I reagens og reaksjonen får nå en likevekt som oppnåes etter omtrent 1 time med inkubering ved værelsetemperatur. Mikrotiterplaten settes deretter på toppen av et 8 x 10 ark Kodak ® "Xomat XAR-5 røntgenfilm i mørke og eksponeringen får fortsette i en passende lang tid (vanligvis fra ca. 1 til ca. 15 timer).

Ved slutten av eksponeringstiden ble filmen fremkalt i en automatisk fremkaller og mengde lys som var emittert ble kvantifisert ved å bruke et densitometer. Emittert lysmengde var proporsjonal med mengde immobilisert DNP-rapportørgruppe og mengde opprinnelig immobilisert HSV-DNA, samt mengden av kompleks som var dannet mellom oligonucleotidet og den immobiliserte DNA.

Eksempel 8

Luminescenspåvisning av agarosebundet antiHSV-antistoff ved

å bruke et biotin-rapportørgruppe-merket HSV-overflateantigen og et avidin-dansyl-påviserkompleks

Prøver som inneholdt antiHSV-antistoff (erholdt fra Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) ble bundet til CnBr-aktivert agarosekuler ved hjelp av standard fremgangsmåter. Kulene ble passende tildekket med ikke-spesifikt geit-IgG eller bovint serumalbumin (BSA). HSV-typer 1 eller. 2 celleoverflateantigen av den type som ble brukt i eksempel 6, kan biotinyleres ved hjelp av en hvilken som helst fremgangsmåte eller ved kommersiell bestillingsbiotinylering.

Det ble fremstilt et streptavidin-dansyl-påviserkompleks ved dansylering av streptavidin under anvendelse av dansylklorid ifølge standard fremgangsmåter (jfr. Biochemical Journal 181: 251, 1979).

For å påvise tilstedeværelsen av anti-HSV-antistoffer bundet til agarosebærermaterialet, ble de tildekkede kuler inkubert i 30 minutter ved 37°C med en oppløsning av 1 mg pr. ml av de biotinylerte HSV-antigener i PBS-Tween 20. Antigenene som ikke var bundet ble deretter fjernet ved vasking av kulene med tre vaskinger a 5 ml PBS-Tween 20. Filtrene ble deretter behandlet i 30 minutter med påviserkomplekset i det vesentlige som beskrevet i eksempel 4, og det påviserkompleks som ikke var bundet, ble fjernet ved hjelp av tre vaskinger a 3 minutter med Buffer A. På dette punkt besto hele komplekset som var bundet av kule-antistoff: antigen-biotin:streptavidin-dansyl.

For å påvise biotinrapportørgruppene og derved mengde bundet antiHSV-antistoff tilstede på agarosekulene, ble kulene suspendert i 10 ul 0,1 M Tris, pH 7,5 og overført til en glasskuvette hvor eksitasjonsmidlet, 250 ul bis(2,4,6-triklorfenyl)oxalat (TCPO) i ethylacetat, og 100 pl hydrogenperoxyd i aceton (fortynnet fra 30% vandig hydrogenperoxyd), ble tilsatt, noe som forårsaket at dansylgruppene emitterte lys. Sluttkonsentrasjonene av TCPO og hydrogenperoxyd var henholdsvis 1,7 mM og 0,7 mM, og graden av lysemisjon pr. tids-enhet ble målt i en lysfølsom CCD. De oppnådde verdier ble sammenlignet med en standard kurve fremstilt ved å følge den samme fremgangsmåte og bruke forskjellige kjente mengder av antiHSV-antistoff for å bestemme mengden av bundet antiHSV-antistof f tilstede på kulene.

Eksempel 9

Bioluminescenspåvisning av nitrocellulosebundet HSV-DNA

ved å bruke et dinitrofenol-rapportørgruppe-merket oligonucleotid og et anti-DNP-antistoff-pyruvatkinasepåviser-kompleks

Dette eksempel svarer til eksempel 7 med unntak

av at pyruvatkinase ble brukt som den andre bestanddel i på viserkomplekset i stedet for G6PDH. Pyruvatkinasen ble brukt til å fremastille ATP som forårsaker at ildflue-bio-luminescensreaksjonen emitterer lys.

Det ble fremstilt et herpes oligonucleotid som var komplementært med den immobiliserte HSV-DNA og som var merket med dinitrofenol, og det ble dannet et kompleks mellom dette og HSV-DNA slik som i eksempel 7. Etter vasking ble DNA-dupleksen inkubert med et overskudd av påviserkomplekset anti-DNP-antistoff-pyruvatkinase som ble fremstilt i et 1:3 forhold ved å følge fremgangsmåten til Yoshitake et al.,

(Eur. J. Biochem. 101: 395-399, 1979) . Inkubasjonen ble gjennomført i 30 minutter ved værelsetemperatur i PBS-Tween 20. Etter seks gangers vasking i PBS/0,5 M NaCl/0/1% Tween 20, ble filtrene som inneholdt det detektorkompleks som var bundet, inkubert i 0,5 ml 0,05 M imidazolbuffer, pH 7,6, som inneholdt 1,5 mM ATP, 1,5 mM fosfoenolpyruvat og ildflueluce-ferin og -luciferase (Firelight, levert av Analytical Luminescence Laboratories, San Diego, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Mengde immobilisert HSV-DNA samt mengde kompleks dannet mellom oligonucelotidet og DNA, ble bestemt ved hjelp av mengde emittert lys med tiden ved å bruke en lysfølsom ladningskoblet anordning.

Claims

1. Fremgangsmåte for luminescerende påvisning av en spesifikk rapportørgruppe som er mindre enn ca. 10.000 dalton i størrelse og som er bundet til en bærermasse, karakterisert ved trinnene å bringe rapportør-gruppen i kontakt med et påviserkompleks som har, som en første bestanddel, et bindingsstoff som oppviser høy spesifikk affinitet for rapportørgruppen, og som har, som en andre bestanddel, et stoff som er i stand til lett å bli koblet til et lysemitterende system, for derved etter slik kontakt å gi høy affinitetsbinding mellom påviserkomplekset og rapportørgruppen, og deretter bringe i det minstepåviser-kompleksets andre bestanddel i kontakt med et lysemitterende system som er i stand til å emittere lys i nærvær av den andre bestanddel i påviserkomplekset.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kontakt mellom den bundne rapportørgruppe og påviserkomplekset fåes ved først å binde rapportørgruppen og den første bestanddel i påviserkomplekset til hverandre, og deretter binde den andre bestanddel i påviserkomplekset og den bundne første bestanddel til hverandre.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at høyaffinitetsbindingen av påviserkomplekset til rapportørgruppen omfatter dannelse av en covalent binding, eller en reaksjon av type ligand-ligand.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at rapportørgruppen er et vitamin, en cofaktor, et antigen eller et carbohydrat.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at vitaminet er biotin, iminobiotin, desthiobiotin eller pyridoxalfosfat.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at cofaktoren er et por-fyr in .

7. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at antigenet er dinitrofenol, biotin, iminobiotin, desthiobiotin, fluorescein eller fluorescamin.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at carbohydratet er mannose, galactose eller fucose.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at rapportørgruppen er bundet til bærermassen gjennom et organisk polymerbelegg bestående av et protein, et carbohydrat, en nucleinsyre eller en analog derav.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at høyaffinitetsbindingen av påviserkomplekset til rapportørgruppen omfatter en reaksjon mellom vitamin og protein, en reaksjon mellom cofaktor og protein, en reaksjon, mellom antigen og antistoff, en reaksjon mellom carbohydrat og lectin, eller en covalent binding.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at rapportørgruppen er et vitamin og at den første bestanddel i påviserkomplekset består av et vitaminbindende protein.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at vitaminet er biotin, iminobiotin eller desthiobiotin, og at proteinet er avidin, streptavidin eller et kompleks av avidin eller streptavidin.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at rapportørgruppen er en cofaktor, og at den første bestanddel i påviserkomplekset består av et cofaktorbindeprotein.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at cofaktoren er et porfyrin, og at proteinet er apomyoglobin.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at rapportørgruppen er et antigen, og at den første bestanddel i påviserkomplekset består av et antistoff for antigenet.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at antigenet er dinitrofenol, biotin, iminobiotin, desthiobiotin, fluorescein eller fluorescamin.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at rapportørgruppen er et carbohydrat, og at den første bestanddel i påviserkomplekset består av et lectin.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at carbohydratet er mannose, galactose eller fucose.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at carbohydratet er mannose, og at lectinet er concanavalin A.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den første bestanddel i påviserkomplekset er konjugert med avidin eller streptavidin .

21. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den første bestanddel i påviserkomplekset er konjugert med biotin, iminobiotin eller desthiobiotin.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 15 eller 16, karakterisert ved at antigenet er dinitrofenol, fluorescein eller fluorescamin, og at antistoffet er konjugert med avidin eller streptavidin.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 15 eller 16, karakterisert ved at antigenet er dinitrofenol, fluorescein eller fluorescamin, og at antistoffet er konjugert med biotin, iminobiotin eller desthiobiotin.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den første og den andre bestanddel i påviserkomplekset bindes til hverandre ved hjelp av en reaksjon mellom vitamin og protein, en reaksjon mellom cofaktor og protein, en reaksjon mellom antigen og antistoff, en reaksjon mellom carbohydrat og lectin eller en covalent binding.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at vitaminet er biotin, iminobiotin, desthiobiotin eller et konjugat derav, og at proteinet i reaksjonen mellom vitamin og protein er avidin, streptavidin eller et konjugat derav.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at en av påviserkompleksets første og andre bestanddel er et avidin eller er konjugert med et avidin, og at den andre bestanddel er konjugert med et biotin.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av et enzym, et enzymatisk aktivt coenzym, katalysator, fluorescerende forbindelse, eksiterende forbindelse for fluorescerende forbindelse, luciferin eller et stoff som er luminescerende i nærvær av en katalysator og oxygen eller hydrogenperoxyd.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av en dehydrogenase.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av glucose-6-fosfat-dehydrogenase.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av biotinylert glucose-6-fosfat-dehydrogenase .

31. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av FMN <+> oxidoreduktase, glucose-6-fosfat-dehydrogenase, malatdehydrogenase, alkoholdehydrogenase, lactatdehydrogenase, triosefosfatdehydrogenase, alkalisk fosfatase, adenyltransferase, NAD <+> syntetase, ATP syntetase, pyruvatkinase, creatinkinase, adenylatkinase, glucoseoxidase, xanthinoxidase, monoaminoxidase, peroxidase, bakterieluciferase, ildflueluciferase, beta-galactosidase, neuraminidase, fucosidase eller et annet enzym hvis reaksjon-produkt kan være et stoff som kan kobles direkte eller indirekte til et lysemitterende system.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av enzymatisk aktivt NAD <+> , NADP <+> , ATP, ADP, AMP, FMN+ eller FAD <+> .

33. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av jern-hem eller et metall.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av 9,10-difenylanthracen, perylen, rubren, BPEA eller et umbelliferonderivat.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av TCPO ellerC PPO.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av luminol, isoluminol, pyrogallol, lucigenin eller lofin.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset består av et enzym som i nærvær av et substrat for enzymet, har et omsetningstall som er minst 10/minutt.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at påviserkompleksets andre bestanddel består av et molekylært stoff, som når det kobles til det lysemitterende system, gjennomgår flere reaksjons-trinn som resulterer i produksjon av lys.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det lysemitterende system består av bestanddeler i en lysemitterende reaksjon og bestanddeler i en overgangsreaksjon for denne, og at den andre bestanddel i påviserkomplekset, når den er koblet til systemet, gir en vesentlig eller begrensende bestanddel i overgangsreaksjonen.

40. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at kontakt mellom det lys-emitterende system og påviserkomplekset forårsaker en første reaksjon hvor et mellomprodukt fremstilles, og en andre reaksjon hvor lyset emitteres, idet den første reaksjon ut-føres under betingelser som generelt er optimale for pro-dusjonen av mellomproduktet, og den andre reaksjon utføres under betingelser som generelt er optimale for lysemisjon.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det lysemitterende system er bioluminescerende.

42. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det lysemitterende system er kjemiluminescerende.

43. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at, før kontakten med det lysemitterende system, oppløseliggjøres minst den andre bestanddel i påviserkomplekset.

44. Fremgangsmåte ifølge krav 43, karakterisert ved at den andre bestanddel i påviserkomplekset oppløseliggjøres ved kjemisk separasjon derav fra den bundne første bestanddel i komplekset.

45. Fremgangsmåte ifølge krav 43, karakterisert ved at påviserkomplekset opp-løseliggjøres ved kjemisk separasjon derav fra rapportørgruppe]

46. Fremgangsmåte ifølge krav 43, karakterisert ved at rapportørgruppen og påviserkomplekset som er bundet til denne, oppløseliggjøres ved oppløsning av bærermassen.

47. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene ovenfor, karakterisert ved at den omfatter det ytterligere trinn å kvantifisere lyset som emitteres ved hjelp av det lysemitterende system som et mål for rapportørgruppen som er bundet til bærermassen etter kontakt med denne.

48. Fremgangsmåte ifølge krav 47, karakterisert ved at lyset som emitteres av det lysemitterende system kvantifiseres ved bruk av midler omfattende et luminometer eller en lysfølsom ladningskoblet anordning.

49. Fremgangsmåte ifølge krav 47, karakterisert ved at lyset som emitteres ved hjelp av det lysemitterende system kvantifiseres ved bruk av midler som omfatter lysfølsom film.

50. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene ovenfor, karakterisert ved at rapportørgruppen bringes i kontakt med et overskudd av påviserkomplekset, og at det påviserkompleks som ikke er bundet, fraskilles det påviserkompleks som er bundet før den andre bestanddel i komplekset bringes i kontakt med det lysemitterende system.

51. Påviserkompleks for anvendelse ved påvisning av små mengder av en immobilisert rapportørgruppe som er mindre enn ca. 10.000 dalton i størrelse, karakterisert ved en første bestanddel som oppviser en høy affinitet til en spesifikk rapportørgruppe som er mindre enn ca. 10.000 dalton i størrelse, og en andre bestanddel som er i stand til lett å bli koblet til-et lysemitterende system.

52. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første og den andre bestanddel derav har høy affinitet ved binding til hverandre som omfatter covalent binding av bestanddelene over en bi-funksjonell koblingsforbindelse, en covalent binding dannet mellom kjemiske rester på bestanddelene som et resultat av aktivering av restene ved hjelp av et kondensasjonsmiddel, en ikke-covalent binding av type ligand-ligand eller en covalent binding som dannes spontant mellom kjemiske rester på bestanddelene.

53. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at bestanddelene er ikke-covalent bundet til hverandre ved en binding mellom vitamin og protein, en binding mellom cofaktor og protein, en binding mellom carbohydrat og lectin eller en binding mellom antigen og antistoff.

54. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første og den andre bestanddel derav er bundet til hverandre ved hjelp av en binding av type biotin-avidin, idet den første bestanddel består av et avidin, et kompleks av et avidin eller et kompleks av et biotin, og den andre bestanddel består av et kompleks av et avidin eller et kompleks av et biotin.

55. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel består av et vitaminbindende protein og den andre bestanddel består av et vitamin.

56. Påviserkompleks ifølge krav 55, karakterisert ved at proteinet er avidin eller streptavidin og at vitaminet er biotin, iminobiotin eller -, desthiobiotin.

57. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av et antigen og den første bestanddel består av et antistoff for antigenet.

58. Påviserkompleks ifølge krav 57, karakterisert ved at antigenet er dinitrofenol, biotin, iminobiotin, desthiobiotin, fluorescein eller fluorescamin.

59. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at bestanddelene er bundet til hverandre ved hjelp av bifunksjonelt koblingsmiddel som er sammenbindende amin-, thiol- eller alkoholrester på bestanddelene.

60. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at bestanddelene er covalent bundet til hverandre som et resultat av reaksjonen mellom amin-, thiol- eller alkoholrestene på bestanddelene og et carboxylat som er blitt aktivert ved hjelp av et kon-densasjon smidde 1 .

61. Påviserkompleks ifølge krav 60, karakterisert ved at kondensasjonsmidlet er et carbodiimid eller thionylklorid.

62. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel, når den er koblet til et lysemitterende system, direkte eller indirekte tilveiebringer en nødvendig bestanddel i en lumine-scensreaksjon.

63. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av et enzym, enzymatisk aktivt coenzym, katalysator, fluorescerende forbindelse, eksitasjonsforbindelse for fluorescerende forbindelser, luciferin eller et stoff som er luminescerende i nærvær av en katalysator av oxygen eller hydrogenperoxyd.

64. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av et stoff som er i stand til å omdanne en prokata-lysator til en katalysator.

65. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av et stoff som er i stand til å omdanne en forløper-forbindelse for en fluorescerende forbindelse til en fluorescerende forbindelse.

66. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av dehydrogenase.

67. Påviserkompleks ifølge krav 52, karakterisert ved at den andre bestanddel består av glucose-6-fosfat-dehydrogenase.

68. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av biotinylert glucose-6-fosfat-dehydrogenase.

69. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av FMN <+> oxidoreduktase, glucose-6-fosfat -dehydrogenase, malatdehydrogenase, alkoholdehydrogenase, lactatdehydrogenase, triosefosfatdehydrogenase, alkalisk fosfatase, adenyltransferase, NAD <+> syntetase, ATP syntetase, pyruvatkinase, creatinkinase, adenylatkinase, glucoseoxidase, xanthinoxidase, monoaminoxidase, peroxidase, bakterieluciferase, ildflueluciferase, beta-galactoxidase, neuraminidase, glucosidase eller fucosidase eller danner et enzym hvis reaksjonsprodukt kan være et stoff som kan kobles direkte eller indirekte til et lysemitterende system.

70. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av enzymatisk aktivt NAD <+> , NADP <+> , ATP, ADP, AMP, FMN <+> 'eller FAD <+.>

71. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av jern-hem eller et metall.

72. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av 9,10-difenylanthracen, perylen, rubren, BPEA eller et umbelliferon- eller dansylderivat.

73. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av TCPO eller CPPO.

74. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av luminol, isoluminol, pyrogallol, lucigenin eller lofin.

75. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av et enzym som, i nærvær av et substrat for enzymet, har et omsetningstall som er minst 10/minutt.

76. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den andre bestanddel består av et molekylært stoff som, når det kobles til det lysemitterende system, gjennomgår flere reaksjonssykluser som resulterer i produksjon av lys.

77. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel består av en kjemisk rest som er i stand til å danne en covalent binding med en rapportørgruppe, eller en ligand som er i stand til å danne en ikke-covalent ligand-ligand-binding med en rapportørgruppe.

78. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel består av et protein som er i stand til å danne en vitamin-protein-binding med en vitamin-rapportørgruppe, et protein som er i stand til å danne en cofaktor-protein-binding med en cofaktor-rapportørgruppe, et antistoff som er i stand til å danne en antigen-antistoff-binding med en antigen-rapportørgruppe, eller et lectin som er i stand til å danne en carbohydrat-lectin-binding med en carbohydrat-rapportør-gruppe.

79. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel består av avidin eller streptavidin.

80. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel består av apomyoglobin.

81. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel består av et antistoff for dinitrofenol, biotin, iminobiotin, desthiobiotin, fluorescein eller fluorescamin.

82. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel består av et lectin.

83. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel består av concanavalin A.

84. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel er konjugert med avidin eller streptavidin.

85. Påviserkompleks ifølge krav 51, karakterisert ved at den første bestanddel er konjugert med biotin, iminobition eller desthiobiotin.

86. Reagenssett, karakterisert ved at det består av påviserkomplekset ifølge hvilket som helst av kravene 51 til 61 og 77 til 85, og et lysemitterende system hvortil den andre bestanddel i komplekset lett kan kobles, og som er i stand til å emittere lys som en følge av slik kobling.

87. Reagenssett ifølge krav 68, karakterisert ved at det lysemitterende system omfatter bestanddelene i en bioluminescerende reak- s j on.

88. Reagenssett ifølge krav 86, karakterisert ved at det lysemitterende system omfatter bestanddelene i en kjemiluminescerende reaksjon.

89. Reagenssett ifølge krav 86, karakterisert ved at det lysemitterende system omfatter bestanddelene i en lysemitterende reaksjon, samt bestanddelene i en overgangsreaksjon, og hvor den andre bestanddel i påviserkomplekset utgjør en begrensende eller vesentlig bestanddel i overgangsreaksjonen.

90. Reagenssett ifølge krav 89, karakterisert ved at overgangsreaksjonen er en som, når den er i kontakt med den andre bestanddel i påviserkomplekset, er i stand til å frembringe ATP, NADH, NAD PH, FADH, FMNH, aldehyd, hydrogenperoxyd eller en fluorescerende forbindelse.

91. Reagenssett ifølge krav 90, karakterisert ved at den lysemitterende reaksjon er i stand til å emittere lys i nærvær av produktet som frembringes ved overgangsreaksjonen.

92. Reagenssett, karakterisert ved at det omfatter påviserkomplekset ifølge hvilket som helst av kravene 62 til 76 og et lysemitterende system hvortil den andre bestanddel i komplekset lett kan kobles, og som er i stand til å emittere lys som følge av slik kobling.