DE2660548C2 - Konjugate für ein heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium - Google Patents

Description

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O⁶

Ο^θ

— Ο—Ρ—Ο—Ρ—Ο—Ρ—Ο —Υ—Z

steht, wobei

Y eine Bindung oder eine Brückengruppe bedeutet und

Z für einen Liganden, ein spezifisch bindendes Analoges eines Liganden oder einen spezifisch bindenden Partner eines Liganden steht.

2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Y für eine Brückengruppe, enthaltend 1—50 Kohlenstoffatome und/oder Heteroatome, steht.

3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Nikotinamidadenindinukleotid und Biotin gebildet wird.

4. Verwendung eines Konjugats gemäß Anspruch 1 —3 in einem heterogenen spezifischen Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, wobei man

a) das flüssige Medium mit Reagentien zusammenbringt, umfassend ein markiertes Konjugat mit einem spezifisch bindenden Teil, der an einen markierenden Teil mit einer vorbestimmten Eigenschaft gebunden ist, wobei die Reagentien und der Ligand ein Bindungs-Reaktionssystem bilden unter Entstehung (i) einer gebundenen Phase aus dem markierten Konjugat, in dem der spezifisch bindende Teil an einen spezifisch

b) c)

bindenden Partner dazu gebunden ist, und (ii) einer freien Phase des markierten Koiijugats, in dem der spezifisch bindende Teil nicht an den spezifisch bindenden Partner dazu gebunden ist, wobei die Menge der Markierungssubstanz in einer Phase eine Funktion ist von der Menge des in der zu bestimmenden Probe vorhandenen Liganden,

die gebundene Phase von der freien Phase trennt und

die vorbestimmte Eigenschaft in der gebundenen oder freien Phase bestimmt

5. Reagens für heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß es ein markiertes Konjugat gemäß Anspruch 1 bis 3 enthält.

Die Erfindung betrifft Konjugate für ein heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung derartiger Konjugate in einem heterogenen spezifischen Bindungsverfahren sowie ein Reagens für ein solches Verfahren, enthaltend ein derartiges Konjugat.

Der Bedarf an einem bequemen, zuverlässigen und nicht gefährlichen Mittel zur Bestimmung des Vorhandenseins geringer Konzentrationen von Substanzen in Flüssigkeiten, besteht seit langem. Das ist besonders der Fall auf dem Gebiet der klinischen Chemie, wo Bestandteile von Körperflüssigkeiten, die in so geringen Konzentrationen wie 10- ^M molar pathologische Bedeutung besitzen können. Die Schwierigkeit, derartig geringe Konzentrationen nachzuweisen, tritt besonders auf dem Gebiet der klinischen Chemie auf, wo die Probengröße üblicherweise sehr begrenzt ist.

Klassisch werden Substanzen in Flüssigkeiten nachgewiesen aufgrund eines Reaktionsschemas, bei dem die nachzuweisende Substanz ein notwendiges Reagens ist. Das Vorhandensein der unbekannten Substanz wird angezeigt durch das Auftreten eines Reaktionsproduktes oder das Verschwinden eines bekannten Reagens. In einigen Fällen kann ein solches Bestimmungsverfahren quantitativ sein aufgrund der Messung von entweder der Geschwindigkeit, mit der das Produkt auftritt oder das Reagens verschwindet oder durch Messung der Gesamtmenge an entstandenem Produkt oder verbrauchtem Reagens bei Erreichung des Gleichgewichts. Jedes Bestimmungs-Reaktionssystem ist notwendigerweise entweder auf die Anwendung zum Nachweis nur einer kleinen Gruppe von Substanzen beschränkt oder es ist nicht spezifisch.

Die Suche nach Bestimmungsverfahren, die hochspezifisch aber auf den Nachweis eines weiten Bereiches von Substanzen anwendbar sind, hat zu den radioimmunologischen Bestimmungsverfahren geführt. Bei diesem System läßt man eine bekannte Menge einer radioaktiv markierten Form der nachzuweisenden Substanz mit der unbekannten Substanz bzw. unbekannten Menge der Substanz um eine begrenzte Menge von Antikörper, der zu der nachzuweisenden Substanz spezifisch ist, in Konkurrenz treten. Die Menge an markierter Form, die an den Antikörper gebunden wird, ändert sich umgekehrt mit der Menge an der nachzuweisenden

Substanz. Bei radioimmunologischen Bestimmungsverfahren ist es unumgänglich notwendig, die markierte Form der nachzuweisenden Substanz, die an den Antikörper gebunden ist — die gebunden? Phase — von dem nicht gebundenen Teil — der freien Phase — zu trennen. Während verschiedene Wege entwickelt worden sind, diese erforderliche Trennung zu erreichen (US-PS 35 05 019, 35 55 143, 36 46 346, 37 20 760 und 37 93 445) ist bei allen ein getrennter Schritt, wie Filtrieren. Zentrifugieren, Waschen oder Abziehen des flüssigen Anteils aus einer Säule erforderlich, um eine wirksame Trennung der gebundenen von der freien Phase sicherzustellen. Eine solche Trennung wird häufig erreicht durch Bildung eines Systems, umfassend einen unlöslichen Anteil, enthaltend die gebundene Phase, und einen flüssigen Anteil, enthaltend die freie Phase, so daß die Menge an radioaktiv markierter Substanz in jedem Anteil eine Funktion des Ausmaßes der Bindung der markierten Substanz ist und damit eine Funktion der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Menge an Liganden. Der Ausdruck »heterogen«, wie er allgemein in der wissenschaftlichen Literatur verwendet wird und hier angewandt wird, bezeichnet diejenigen spezifischen Bindungsbestimmungen, bei denen eine Trennung der gebundenen von der freien Phase durchgeführt wird. Eine solche Trennung ist erforderlich, um c^;ne spezifische Bindungsbestimmung durchzuführen, bei der die markierte Substanz in der gebundenen Phase nicht unterscheidbar ist von derjenigen in der freien Phase.

Aufgrund der gefährlichen und schwierigen Handhabung von radioaktiven Substanzen sind zahl; eiche Versuche unternommen worden, bequeme spezifische Bindungs-Bestimmungssysteme zu entwickeln, die ebenso empfindlich und schnell sind wie radioimmunologische Bestimmungen, aber die andere Eigenschaften als die Radioaktivität als Mittel zum Nachweis bzw. zur Überwachung der Bindungsreaktion anwenden. Wie später näher diskutiert wird, umfassen Substanzen, die als Markierungssubstanz anstelle von radioaktiven Atomen oder Molekülen angewandt worden sind, verschiedene Substanzen, wie Enzyme, Fluoreszens-Moleküle und Bacteriophagen.

Beispiele für Verfahren, bei denen ein Enzym als Markierungssubstanz verwendet wird, sind beschrieben in den US-PS 36 54 090. 37 91 932, 38 39 153, 38 50 752 und 38 79 262 und in Journal of Immunological Methods 1, 247 (1972) und in Journal of Immunology 109, 129 (1972). Bei jedem dieser beschriebenen Verfahren wird ein Enzym chemisch entweder an den nachzuweisenden Liganden oder einen Bindungspartner davon gekuppelt und dadurch ein entsprechendes heterogenes spezifisches Bindungs-Reaktionsschema gebildet, wodurch nach der Inkubation mit einer Probe die Menge an Enzymaktivität, die entweder mit dem unlöslichen Teil oder mit dem flüssigen Teil verbunden ist, eine Funktion ist der Ligandenmenge in der Probe. Die mit der Synthese und Charakterisierung von Enzymkonjugaten verbundenen Probleme sind ernste Nachteile dieser Verfahren.

Interessant ist das in der US-PS 38 17 837 beschriebene immunologische Bestimmungsverfahren, bei dem mit Enzym markierte Substanzen angewandt werden. Bei diesem Verfahren wird kein zweiteiliges (partitioned) (d. h. unlöslicher Teil/flüssiger Teil) spezifisches Bindungsreaktionssystem angewandt und dadurch das Trennungsverfahren vermieden, da der mit Enzym markierte Ligand so ausgewählt ist, daß er nach Umsetzung mit dem bindenden Partner des Liganden die Enzymaktivität hemmt Dadurch kann das Verhältnis von gebundener markierter Substanz zu derjenigen in freier Form bestimmt werden, indem man die Änderungen der Enzymaktivität nachweist Bei diesem Verfahren tritt jedoch trotzdem die Schwierigkeit auf, gut charakterisierte enzymmarkierte Konjugate herzustellen und Enzyme zu finden, die für dieses System geeignet sind.

In den GB-PS 13 92 403 und FR-PS 22 01 299 sind spezifische Bindungsbestimmungen beschrieben, bei denen eine nicht-aktive Vorstufe einer spektrophotometriseh aktiven Substanz als Markierungssubstanz angewandt wird. Nach Inkubation der Probe mit dem spezifischen Bindungsreaktionssystem werden der unlösliche und flüssige Teil voneinander getrennt und die in dem flüssigen Teil vorhandene Menge der Markierungssubstanz, die eine Funktion der nachzuweisenden Ligandenmenge in der Probe ist. bestimmt durch Durchführung von Re. ktionsstufen. die die inaktive Markierungssubstanz .n eine chromogen oder fluorometrisch aktive Substanz umwandeln, die dann auf übliche Weise gemessen wird.

Andere spezifische Bindungs-Bestimmungsverfahren, bei denen unterschiedliche Arten von Markierungssubstanzen angewandt werden, sind in der US-PS 38 50 578 beschrieben, bei der die Elektronen-spin-Resonanz als Markierung angewandt wird. In der US-PS 39 01 654 wird die Anwendung von fluoreszensauslöschenden und verstärkenden Substanzen zur Markierung beschrieben.

In dem Report Nr. PB-224 875 des National Technical Information Service (NTIS) des United States Department of Commerce (1973) ist ein erfolgloser Versuch beschrieben, Häminchlorid als Markierungssubstanz in einem heterogenen Bestimmungssystem anzuwenden, das durch Chemilumineszens überwacht wird. In Nature 219, 186 (1968) sind sehr im Detail bestimmte radioimmunologische Bestimmungsverfahren beschrieben und sehr allgemein die Möglichkeit, Coenzyme und Viren anstelle von Radioisotopen als Markierungssubstanzen zu verwenden, erwähnt. Es ist jedoch nichts darüber ausgesagt, wie die Reagenzien für ein derartiges Verfahren aussehen oder wie sie erhältlich sind. Ferner wird auf Principles of Competitive Protein-Bindung Assays, Herausg. Odell und Daugha-

■»5 day (J. B. Lippincott Co.. Philadelphia, 1972) verwiesen, wo die verschiedenen bekannten Bestimmungsschernata ausführlich diskutiert werden und einige unterschiedliche Substanzen und Eigenschaften, die zur Markierung von spezifischen Bindungsbestimmungen angewandt werden.

Obwohl viele neue Arten von spezifischen Bindungsbestimmungen beschrieben und untersucht worden sind, bleiben die radioimmunologischen Bestimmungen und die verschiedenen immunologischen Bestimmungen mit Hilfe enzymmarkierter Substanzen, die am weitesten angewandten und verbesserten. Beide Systeme besitzen jedoch offensichtliche Nachteile, und zwar die radioimmunologischen Bestimmungen durch die· Anwendung von radioaktiven Substanzen, die gefährlich sind und eine vorsichtige Handhabung erfordern und die mit Enzym markierten immunologischen Bestimmungen durch die Schwierigkeit, geeignete enzymmarkierte Konjugate herzustellen.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, anknüpfend an den oben zitierten Vorschlag in Nature, 219, 186 (1968) Konjugate für ein heterogenes spezifisches Bindungsvei fahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssiger: Medium bereitzustellen, die

aus dem Liganden, einem spezifisch bindenden Analogen des Liganden oder einem spezifisch bindenden Partner des Liganden einerseits und einem Coenzym als Markierungssubstanz andererseits gebildet werden.

Diese Aufgabe wird gemäß dem Kennzeichen des Patentanspruchs 1 gelöst.

Vorteilhafte Ausführungsformen der Konjugate ergeben sich aus den Ansprüchen 2 und 3. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate gemäß Anspruch 4 und das Reagens ι ο gemäß Anspruch 5, das ein solches Konjugat enthält.

Im folgenden wird die Erfindung näher erläutert. Dabei werden die folgenden Ausdrücke entsprechend den angegebenen Definitionen angewandt: Ligand ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren !5 Vorhandensein oder Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; spezifisch bindender Partner zu dem Liganden ist irgend eine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt und spezifisch bindendes Analoges des Liganden ist irgend eine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich in Beziehung auf die Bindungsaktivität zu dem spezifisch bindenden Partner zu dem Liganden im wesentlichen genauso verhält wie der Ligand.

Das spezifisch bindende Reagens kann in verschiedenen Formen vorliegen. Im allgemeinen umfaßt ein solches Mittel drei grundlegende Bestandteile, und zwar:

30

(1) den nachzuweisenden Liganden,

(2) einen spezifisch bindenden Partner des Liganden und

(3) einen markierten Bestandteil, der üblicherweise die markierte Form von

(a) dem Liganden,

(b) einem spezifisch bindenden Analogen des Liganden oder

(c) dem spezifischen Bindungspartner ist.

40

Die Bestandteile der Bindungsreaktion werden gleichzeitig oder in einzelnen Stufen zusammengegeben und innerhalb einer geeigneten Inkubationszeit oder -zeiten wird der markierte Bestandteil an seinen entsprechenden konkurrierenden Bindungspartner gebunden, so daß das Ausmaß der Bindung, d. h. das Verhältnis der Menge an markiertem Bestandteil, die an den Bindungspartner gebunden ist, zu der ungebundenen Menge eine Funktion der Menge des vorhandenen Liganden ist. Die unterschiedliche Bindungsreaktionsschemata, die zur Durchführung eines heterogenen spezifischen Bindungsverfahrens angewandt werden können, sind bekannt und brauchen daher nicht näher erläutert zu werden.

Während bei den üblichen heterogenen spezifischen Bindungsbestimmungsverfahren, wie den radioimmunologischen Bestimmungen und heterogenen Enzyme-immunologischen Bestimmungsverfahren die Markierungseigenschaften in dem markierten Konjugat, wie die Radioaktivität oder Enzym-Aktivität im wesentlichen gleich sind für die gebundenen und freien Formen des Konjugats wird erfindungsgemäß die Aktivität des Coenzyms als Markierungssubstanz in bestimmten Fällen beeinflußt durch die Bindung des markierten Konjugats. In einer solchen Situation zeigt die Nachweisreaktion einen verhältnismäßig konstanten Charakter, wenn der Ligand in dem flüssigen Medium nicht vorhanden oder in einer unbedeutend kleinen Menge vorhanden ist. Wenn der Ligand in dem flüssigen Medium vorhanden ist, wird ein Charakteristikum oder eine Eigenschaft der Nachweisreaktion verändert. Allgemein ist die Aktivität des konjugierten Coenzyms das Ausmaß oder die Geschwindigkeit, mit der das Reagens imstande ist, an der Nachweisreaktion teilzunehmen. So wird der Charakter der Nachweisreaktion verändert durch das Vorhandensein des Liganden in dem flüssigen Medium, üblicherweise entweder in Beziehung auf die Gesamtreaktionsgeschwindigkeit oder die Menge an einem oder mehreren Reaktionsprodukten, die im Gleichgewichtszustand vorhanden sind. Üblicherweise wird in einem solchen Falle die Fähigkeit des konjugierten Coenzyms an der Nachweisreaktion teilzunehmen, durch Reaktion zwischen der spezifisch bindenden Substanz, mit der es konjugiert ist, und einem spezifisch bindenden Partner einer solchen spezifisch bindenden Substanz verringert, d. h. das Konjugat ist in freier Form reaktionsfähiger in der Nachweisreaktion als in gebundener Form.

Die Bestimmung der Aktivität des konjugierten Coenzyms als Bestandteil des vorher bestimmten Nachweisreaktionssystems entweder in der gebundenen oder in der freien Phase wird bequem erreicht, indem man diese Phase mit mindestens einer Substanz zusammenbringt, die mit dem konjugierten Coenzym die Nachweisreaktion ergibt und ein Charakteristikum dieser Reaktion mißt. Das Nachweisreaktionssystem kann eine einzelne chemische Umwandlung oder eine Vielzahl oder Reihe von chemischen Umwandlungen umfassen.

Neben dem konjugierten Coenzym umfaßt das Reaktionssystem mindestens ein Enzym und kann auch ein oder mehrere enzymatische Reagentien, wie Substrate und weitere Coenzyme umfassen. Ein derartiges enzymkatalysiertes Reaktionssystem kann eine einzelne einfache enzymatische Reaktion oder eine komplexe Reihe von enzymatischen und nicht-enzymatischen Reaktionen umfassen. Zum Beispiel kann das enzymkatalysierte Reaktionssystem aus einem einzigen enzymkataiysierten Abbau oder einer Dissoziationsreaktion bestehen. In einem solchen System wird das konjugierte Coenzym abgebaut oder dissoziiert und die einzige Komponente des Reaktionssystems, die mit der gebundenen oder freien Phase in Berührung gebracht werden muß, ist ein Enzym, das den Abbau oder die Dissoziationsreaktion katalysiert. Ein komplexeres enzymkatalysiertes Reaktionssystem kann aus einer einzelnen enzymatischen Reaktion bestehen, umfassend zwei oder mehrere Reaktionsteilnehmer, oder es kann aus einer Reihe von Reaktionen bestehen, umfassend verschiedene Reaktionsteilnehmer, von denen mindestens eine Reaktion enzymkatalysiert ist. In einem solchen System wäre das konjugierte Coenzym einer der enzymatischen Reaktionsteilnehmer der enzymkatalysierten Reaktion und die gebundene oder feste Phase würde mit dem entsprechenden Enzym und den anderen Komponenten der Reaktion außer dem Konjugat zusammengebracht, die erforderlich sind, um das gewünschte enzymkatalysierte Reaktionssystem zu ergeben.

Die entsprechenden Reaktionsbestandteile, die zusammen mit dem Coenzym in dem Konjugat das Nachweisreaktionssystem bilden, können mit dem Gemisch der abgetrennten Phase einzeln oder in irgend einer Kombination vorher, gleichzeitig oder anschließend an die Auslösung der spezifischen Bindungsreaktion zusammengebracht werden. Nach Beginn der

ίο

spezifischen Bindungsreakton wird das Reaktionsgemisch, das irgend eine oder alle der erforderlichen Bestandteile für die Nachweisreaktion enthalten kann, üblicherweise eine vorherbestimmte Zeit inkubiert, bevor eine Änderung der Aktivität des Reagenses in dem Konjugat bestimmt wird. Nach der Trennung werden irgendwelche Bestandteile, die für die Nachweisreaktion erforderlich sind und die nicht schon in ausreichenden Mengen in dem Reaktionsgemisch vorhanden sind, zugegeben, und die Coenzym-Aktivität bestimmt als Zeichen für das Vorhandensein oder die Menge des Liganden in dem flüssigen Medium.

Wenn die Reaktionsgeschwindigkeit der Nachweisreaktion das Charakteristikum ist, das angewandt wird, um die Coenzym-Aktivität der gebundenen oder freien Phase zu bestimmen, ν,ίε es bevorzugt ist, wird eine derartige Geschwindigkeit üblicherweise bestimmt durch Messung der Geschwindigkeit, in der ein Reaktionspartner verschwindet oder der Geschwindigkeit, mit der ein Reaktionsprodukt auftritt. Eine derartige Messung kann durch viele verschiedene Verfahren durchgeführt werden, wie die üblichen chromatographischen, gravimetrischen, potentiometrischen, spektrophotometrische, fluorometrische, Trübungsmessungen und volumetrischen Bestimmungen. Da die erfindungsgemäßen Konjugate in erster Linie bestimmt ist zum Nachweis geringer Konzentrationen an Liganden, wurden sehr empfindliche Reaktionssysteme entwickelt zur Anwendung im Zusammenhang mit dem neuen spezifischen Bindungsreaktionssystem.

Eine bevorzugte Form der Nachweisreaktion umfaßt eine Lumineszensreaktionssystem, wie eine Reaktion, die Biolumineszens oder Chemilumineszens ergibt. Das Coenzym in dem Konjugat kann entweder ein Reagens in der lichterzeugenden Reaktion sein oder in einer Reaktion, die einer enzymatischen oder nichtenzymatischen Limineszensreaktion vorausgeht. Die Aktivität des konjugierten Coenzyms kann bestimmt werden durch Messung der Geschwindigkeit der Lichtbildung oder der Gesamtmenge, Spitzenintensität oder dem Charakter des entstehenden Lichtes. Beispiele für Lumineszensreaktionssysteme sind in Tabelle A angegeben, bei der die folgenden Abkürzungen angewandt werden:

ATP Adenosintriphosphat

AMP Adenosinmonophosphat

NAD Nicotinamidadenin-dinucleotid

NADH reduziertes Nicotinamid-adenindinucleotid

FMN Flavinmononucleotid

FMNH2 reduziertes Flavinmononucleotid

hv elektromagnetische Strahlung, üblicher

weise im IR-, sichtbaren oder UV-Bereich.

Tabelle A
Lumineszeps-Reaktionssystem

A. ATP + reduziertes Luciferin

Luciferase „ hv + AMP + oxi-

(Leuchtkäfer) diertes Luciferin

B. 1) NADH + FMN + H^ffl _{NAD +} 2) FMNH₂ + langkettiger Aldehyd + O₂
Luciferase^ _hv

Konjugiertes Coenzym
ATP

NADH

(P. fisheri)

_{langkettige säure}

C. 1) 3',5'-Adenosin-diphosphat + reduziertes Luciferin-sulfat

3\5'-Adenosindiphosphat

> Adenosin-3'-phosphat-5'-phosphosulfat + reduziertes Luciferin

2) reduziertes Luciferin + O₂ > hv + oxidiertes Luciferin

Ein Reaktionssystem, das besonders bevorzugt ist zur 55 zweiten Reaktion umgesetzt, wobei in der zweiten

Bestimmung der Aktivität des konjugierten Coenzyms Reaktion ein Produkt entsteht, das auch ein Reagens für

in der ausgewählten Phase ist ein cyclisches Reaktions- die erste Reaktion ist

system (Ringreaktion). Bei einem derartigen Reaktions- Das folgende Diagramm zeigt ein Modell für ein

system wird ein Produkt einer ersten Reaktion in einer derartiges cyclisches Reaktionssystem:

Produkte A REAKTION A Reagentien A

icyclisiertes Materia] (Form 1)

cyclisiertes Material (Form 2)

Reagentien B

REAKTION B

Produkte B

Bei dem oben angegebenen Modell eines cyclischen Reaktionssystems bildet eine kleine Menge des cyclisierten Materials, wenn ihr ausreichende Mengen der Reaktionspartner A und B zur Verfugung stehen, große Mengen an Produkten A und B. Da die Reaktionsgeschwindigkeit und Menge an Produkten, die durch die Reaktionen entstehen, die das cyclische Reaktionssystem bilden, sehr empfindlich sind gegenüber der vorhandenen Menge an cyclisiertem Material, ist es besonders bevorzugt, dieses cyclisierte Material als Coenzym in dem erfindungsgemäßen Konjugat zu verwenden. Beispiele für cyclische Reaktionssysteme, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen spezifischen Bindungsreaktionssystem angewandt werden können, sind in den folgenden Tabellen B, C und D angegeben.

Tabelle B

Produkt A

Reagens A

Enzym

NAD*)

Enzym NADH**) * \-

Reagens B

Produkt B

Reaktion

Reagens A
oder
Produkt B

Enzym Reagens B
oder
Produkt A

	Lactaldehyd	Alkohol-dehydrogenase	Propandiol
	a-Ketoglutarat	Glutaminsäure-dehydrogenase	Glutamat
I 3	Oxaloacetat	Apfelsäuredehydrogenase	Malat
I 4	Acetaldehyd	Alkoholdehydrogenase	Äthanol
1 5	ff-Ketoglutarat + CO2	Isocitronensäure-	Isocitrat
		dehydrogenase
6	Dihydroxyacetonphosphat	a-Glycerinphosphat-	L-ir-Glycerinphosphat
		dehydrogenase
7	Pyruvat	M ilchsäure-dehydrogenase	Lactat
I 8	1,3-Diphosphoglycerat	Glyceraldehyd-3-phosphat-	Glyceraldehyd-3-phosphat
I		dehydrogenase	+ Phospaht

*) Nicotinamid-adenin-dinucleotid
*) reduziertes NAD

Tabelle C
Produkt A

Reagens A

. . NADP*) ν . Reagens B Enzym Enzym

¹ Produkt B

Reaktion

Reagens A
oder
Produkt B

Enzym Reagens B
oder
Produkt A

1	6-Fhosphogiuconat	liiucose-6-phosphat-	Glucose-6-phosphat
		dehydrogenase
2	oxidiertes Glutathion	Glutathionreductase	reduziertes Glutathion
3	p-Benzochinon	Chinonreductase	Hydrochinon
4	Nitrat	Nitratreductase	Nitrit
5	tf-Ketoglutarat + NH3	Glutaminsäure-dehydrogenase	Glutamat

*)Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
**) reduziertes

Es ist zu bemerken, daß die in den Tabellen B und C angegebenen cyclischen Reaktionssysteme eine Kombination irgend einer der in den jeweiligen Tabellen angegebenen Reaktionen mit einer anderen dort angegebenen Reaktion umfaßt Zum Beispiel kann die Reaktion 1 in Tabelle B mit irgend einer der Reaktionen 2 bis 8 kombiniert werden, um ein geeignetes cyclisches Reaktionssystem zu ergeben. So geben die Tabellen B

und C 56 bzw. 20 mögliche Reaktionssysteme für das erfindungsgemäße Verfahren an.

Neben den in den Tabellen B und C angegebenen cyclischen Reaktionssystemen ist es möglich, daß eine der Reaktionen in dem cyclischen Reaktionssystem die enzymatische oder nicht-enzymatische Umwandlung eines spektrophotometrischen Indikators umfaßt, vorzugsweise kolorimetrisch.

Ein Beispiel für ein cyclisches Reaktionssystem, umfassend eine Änderung eines Indikators, ist das System, das gebildet wird durch Kombination der Reagens B-Produkt B Reaktion in Tabelle B mit einer Reaktion, umfassend einen Oxidations-Rcduktions-lndikator und ein elektronenübertragendes Mittel. Als elektronenübertragendes Mittel kann Phenazinmethosulfat angewandt werden. Geeignete Indikatoren umfassen die oxidierten Formen von Nitrotetrazolium. Thiazoylblau und Dichlorphenolindophenol.

Es kann auch ein exponentiales cyclisches Reaktionssystem bei der Nachweisreaktion angewandt werden. Ein Beispiel für ein exponentiales cyclisches Reaktionssystem ist das folgende:

AMP + ATP

ADP + PEP

Myckinase

Pyruvat-kinase

2ADP

ATP + Pyruvat

NADP

Tabelle D

reduziertes
Cytochrom-C ν , FMN^a) ^ ^NADPH

Cytochrom- Cytochrom-C-reductase C-reductase

oxidiertes ^ \ FMNH₂") ^ ^- Cytochrom-C

^a) Flavin-mononucleotid

^b) reduziertes FMN

Phosphat *. * ADF)

Pyruvatkinase

Adenosintriphosphatase

ATP¹)

^c) Adenosin-diphosphat
^f) Adenosin-triphosphat

ADP

V	GTP	ν s Oxaloacetst
Nucleosid-		Phosphoenol-
diphosphat-		pyruvat-
kinase		kinase
A	GDP	^ ^1 Phosphoenol-
		pyruvat

ATP

Bei Bildung irgend eines der in den Tabellen B, C und D angegebenen cyclischen Reaktionssysteme kann eine der Komponenten des Reaktionssystems natürlich in Form des Salzes oder der Säure vorliegen, wenn diese bei Berührung mit dem flüssigen Medium ionisieren. Ein wasserlösliches Salz oder eine Säure ist bevorzugt Eine solche cyclische Reaktion ist autokatalytisch in dem Sinne, daß während jedes Cyclus die Menge an zurückgeführtem (cyclisiertem) Material verdoppelt wird. Die Cyclisierungsgeschwindigkeit nimmt daher exponential mit der Zeit zu und ergibt eine sehr hohe Empfindlichkeit.

Wenn ein cyclisches Reaktionssystem angewandt wird als Mittel zur Bestimmung der Aktivitätsänderung des konjugierten Coenzyms kann die Geschwindigkeit, mit der ein Reagens verschwindet oder ein Reaktionsprodukt auftritt, durch übliche Verfahren bestimmt werden oder mit Hilfe eines oder mehrerer cyclischer Systeme und anschließende übliche Bestimmung der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit. _ Die Anwendung eines cyclischen Reaktionssystems in Verbindung mit dem heterogenen System der spezifischen Bindungsreaktion ergibt eine breite Anwendbarkeit sowie hohe Empfindlichkeit. Ein einziges Konjugat aus Coenzym und spezifisch bindender Substanz kann für eine Vielzahl von Reaktionen angewandt werden, um cyclische Systeme zu bilden mit Empfindlichkeiten, die über einen weiten Bereich variieren und zu einer Vielzahl von Umwandlungen die mit Hilfe der Sinne oder künstlicher Mittel nachgewiesen werden können.

Eine derartige vielseitige Anwendbarkeit besitzen bekannte Bestimmungssysteme nicht.

Die erfindungsgemäßen !Conjugate können ange-

Phosphoenol- wandt werden auf den Nachweis irgend eines Liganden,

pyruvat zu dem es einen spezifisch bindenden Partner gibt. Der

Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein. Steroid oder ein anderes organisches Molekül, so daß es einen spezifisch bindenden Partner in biologischen Systemen gibt oder ein solcher synthetisiert werden kann. Der Ligand wird — allgemein gesprochen — ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen und Antikörpern dazu, Haptenen und Antikörpern dazu, Hormonen, Vitaminen. Metaboliten (Stoffwechselprodukten) und pharmakologischen Mitteln und ihren Rezeptoren und bindenden Substanzen. Spezifische Beispiele für Liganden, die erfindungsgemäß nachgewiesen werden können, sind Hormone, wie Insulin. Choriongonadotropin, Thyroxin, Liothyronin und Östriol, Antigene und Haptene, wie Ferritin, Bradykinnin, Prostaglandine und tumorspezifisehe Antigene, Vitamine, wie Biotin, Vitamin B12, Folsäure, Vitamin E und Ascorbinsäure, Metaboliten, wie 3',5'-Adenosinmonophosphat und 3',5'-Guanosinmonophosphat, pharmakologische Mittel, wie Dilantin, Digoxin, Morphin, Digitoxin und Barbiturate, Antikörper, wie mikroseme Antikörper und Antikörper gegen Heptatis und Allergene und spezifisch bindende Rezeptoren, wie thyroxinbindendes Globulin, Avidin, Intrinsicfaktor und Transcobalamin. Bei dem erfindungsgemäßen Konjugat ist das Coenzym an eine spezifisch bindende Substanz gekuppelt oder gebunden, die der Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner des Liganden ist, je nach dem

Pyruvat

ausgewählten Bestimmungsverfahren, so daß eine meßbare Menge an Aktivität des Coenzyms erhalten bleibt. Die Bindung "wischen dem Coenzym und der spezifisch bindenden Substanz ist üblicherweise im wesentlichen unter den Bestimmungsbedingungen irreversibel, wobei die Nachweisreaktion, in der das Coenzym Aktivität besitzt, nicht so gestaltet ist, um eine solche Bindung chemisch zu zerstören, wie bei dem oben erwähnten Lumineszens- und cyclischen Reaktionssystem.

Das Coenzym kann direkt an die spezifisch bindende Substanz gekuppelt sein, so daß das Molekulargewicht des !Conjugates geringer ist als oder gleich so groß ist wie das Gesamtmolekulargewicht des Coenzyms der spezifisch bindenden Substanz. Üblicherweise sind jedoch das Coenzym und die spezifisch bindende Substanz über eine Brückengruppe, enthaltend 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatom oder Heteroatome, wie Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Phosphoratome usw. miteinander verbunden. Beispiele für eine Brückengruppe, umfassend ein einziges Atom, ist die Methylengruppe (ein Kohlenstoffatom) und die Amiinogruppe (ein Heteroatom). Die Brückengruppe besitzt üblicherweise ein Molekulargewicht von nicht mehr als 1000 und vorzugsweise weniger als 200. Die Brückengruppe umfaßt eine Kette von Kohlenstoffatomen oder Heteroatomen oder eine Kombination von beiden und ist mit dem Coenzym und der spezifisch bindenden Substanz oder einem aktiven Derivat davon über eine verbindende Gruppe gebunden, üblicherweise in Form einer Ester-, Amido-, Äther, Thioester-, Thioäther-, Acetal-, Methylen- oder Aminogruppe.

Die eingangs angegebene Formel zeigt die ionisierten Formen der coenzymaktiven Konjugate, die protonisierten oder Säureformen sind jedoch gleichermaßen geeignet. Das Ausmaß der Protonisierung hängt von dem pH-Wert der Umgebung ab. Auch die Salze derartiger Konjugate können angewandt werden. Y ist vorzugsweise eine Brückengruppe mit einem Molekulargewicht von <2000, besonders <200 und enthält bevorzugt 1 bis 10 Kohlenstoffatome und/oder Heteroatome.

Die Synthese derartiger Verbindungen kann auf eine Vielzahl von bekannten Arten erreicht werden, die nicht näher erläutert zu werden brauchen.

Das zu untersuchende flüssige Medium kann eine natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Flüssigkeit sein, von der angenommen wird oder bekannt ist, daß sie den Liganden enthält und ist üblicherweise eine biologische Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die durch Verdünnung oder andere Behandlung einer solchen biologischen Flüssigkeit entsteht. Biologische Flüssigkeiten, die mit den erfindungsgemäßen Konjugaten untersucht werden können, umfassen Serum, Plasma, Urin und amniotische Flüssigkeit, Cerebralflüssigkeit und Spinalflüssigkeit. Andere Substanzen, wie Feststoffe, z. B. Gewebe oder Gase, können untersucht werden, indem man sie in flüssige Form überführt, z. B. durch Lösen des Feststoffs oder Gases in einer Flüssigkeit oder durch die Flüssigkeitsextraktion des Feststoffes.

Im Gegensatz zu dem bekannten Bestimmungssystem können biologische Flüssigkeiten, die Substanzen enthalten, die eine ähnliche oder identische Coenzym-Aktivität besitzen wie diejenige des erfindungsgemäßen Konjugats, auf dem Liganden untersucht werden, ohne Störung durch Hintergrundreaktionen. Endogene Hintergrund-Coenzym-Aktivität kann leicht auf verschiedene Weise eliminiert werden. Die biologische Flüssigkeit kann behandelt werden, um die endogene Coenzym-Aktivität selektiv zu zerstören. Eine solche Behandlung kann den Einsatz eines Klärmittels umfassen, das chemisch die endogene Aktivität zerstört und anschließende Behandlung, um die zerstörende Wirkung eines solchen Klärmittels zu inaktivieren.

Zum Beispiel kommen Coenzym-abbauende Enzyme häufig natürlich in biologischen Flüssigkeiten vor,

ίο besonders wenn das Coenzym, NAD, NADP oder ATP ist

Es gibt viele Hemmstoffe für solche coenzymabbauenden Enzyme, z. B. Chelatierungsmittel, die so wirken, daß sie wesentliche Metallionen-Aktivatoren aus den Enzymen entfernen. Als spezielles Beispiel finden sich NAD-abbaubare Enzyme im normalen Serum und besitzen ausreichend Enzymaktivität, um im wesentlichen alle endogene NAD-Aktivität von isoliertem Serum innerhalb weniger Stunden zu entfernen. Die Abbauaktivität solcher Enzyme kann wirksam gehemmt werden durch Zugabe eines Chelatierungsmittel, wie Äthylendiamintetraessigsäure. Die Eliminierung der abbauenden Aktivität kann auch erreicht werden durch Zugabe eines spezifischen Enzymhemmstoffes. Zum Beispiel können ATP-abbauende Enzyme gehemmt werden durch Zugabe von J3y-Methylen-ATP oder Λ,ρ-Methylen-ATP.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Beispiel 1

Herstellung von Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)-purin-dinucleotid

2 g Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) wurden in 10 ml Wasser gelöst und 0,6 ml Äthylenimin zugetropft und der pH-Wert durch Zugabe von 1 m Perchlorsäure <7 gehalten. Nach vollständiger Zugabe des Äthylenimins wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt und die Reaktion bei 20 bis 25°C inkubiert. In Intervallen von 24 h wurden 0,6 ml Äthylenimin zugegeben und der pH-Wert erneut auf 4,5 eingestellt. Nach 96 h wurde die Lösung in 10 Volumina Aceton von -10^cC gegossen. Das entstehende öl wurde gesammelt, mit Äther gewaschen und in ungefähr 50 ml Wasser in einem Kolben gelöst.

Die entstehende Lösung wurde mit 1 η Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 gebracht und 1 g Natriumbicarbonat zugegeben. Dann wurde 4 bis 5 min lang Stickstoff durch die Lösung geleitet und 1 g Natriumhydrosulfit zugegeben. Der Kolben wurde dicht verschlossen und 45 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde dann 15 min mit Sauerstoff behandelt und mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 11,3 gebracht. Die Lösung wurde 1 h auf 75°C erhitzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, 0,6 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan zugegeben und anschließend 5 η Salzsäure, um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen. Zu der entstehenden Lösung wurden 1000 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase und 1 ml Acetaldehyd gegeben. Die Abnahme der optischen Dichte des Reaktionsgemisches wurde bei 340 nm überwacht und als keine weitere Abnahme beobachtet wurde, wurde der pH-Wert auf 3,5 eingestellt. Die Lösung wurde in 10 Volumina Aceton von - 1O⁰C gegossen. Das entstehende öl wurde abgetrennt und mit Äther gewaschen und anschließend in 10 bis 15 ml Wasser gelöst.

Die entstehende Lösung wurde in eine 2,5 χ 90 cm-Säule von Sephadex G-IO der Pharmacia AB, Uppsala, Schweden, die mit Wasser äquilibriert war, gegeben. Fraktionen von 12 ml wurden gesammelt Die Wellenlänge der maximalen optischen Absorption im UV-Bereich und die optische Dichte bei einer derartigen Wellenlänge wurden für jede Fraktion bestimmt Außerdem wurde die optische Dichte bei 340 nm für jede Fraktion nach Reduktion mit Alkoholdehydrogenase bestimmt Die Fraktionen, die ein optisches Absorptionsmaximum bei 275 nm besaßen und ein Verhältnis der optischen Dichte bei 340 nm zu derjenigen bei 265 nm von mehr als 0,05 wurden zusammengegeben. Die zusammengegebenen Substanzen wurden auf 15 bis 20 ml auf einem Rotationsverdampfer eingedampft und durch eine 2,5 χ 28 cm-Säule mit Dowex 1-X8 der Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, die mit Wasser äquilibriert war, gegeben. Es wurde weiteres Wasser zugegeben, um die zusammengegebenen Substanzen durch die Säule zu waschen und Fraktionen von 10 ml gesammelt. Die Fraktionen, die ein Verhältnis von optischer Dichte bei 340 nm zu optischer Dichte bei 264 nm von mehr als 0,1 besaßen, wurden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Substanzen wurden durch eine 5 χ 45 cm-Säule mit Dowex 50-X2 der Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, die mit Wasser äquilibriert war, geleitet. Es wurde weiteres Wasser zugegeben und die zusammengegebenen Substanzen durch die Säule gewaschen und 20 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen mit einem Maximum der optischen Absorption bei 264 nm und einem Verhältnis der optischen Dichte bei 340 nm zu derjenigen bei 265 nm von mehr als 0,18 wurden zusammengegeben. Die zusammengegebenen Substanzen wurden auf 4 bis 5 ml eingeengt und folgendermaßen durch Elektrophorese gereinigt:

Die konzentrierten Substanzen wurden auf ein Blatt Whatman 3MM-Papier der Reeve Angel, Clifton, New Jersey in 1 bis 2 cm breiten Streifen senkrecht zu der Richtung des Stromes aufgebracht. Das Papier wurde dann mit 0,02 m Natriumphosphat bei einem pH-Wert von 6,0 behandelt. Die Elektrophorese wurde nach dem Verfahren von Durrum mit hängendem Papier (Science 121, 829 [1955]) 4 bis 7 h mit einem Potentialgradienten

(a) NAD-Ligand + Äthanol

Alkohol-

von ungefähr 8,5 V/cm durchgeführt Die Lage des gewünschten Pyridinnucleotidderivats wurde bestimmt durch die Fluoreszens, die sich nach Besprühen eines Teststreifens des Papiers mit 03 m Natriumcyanid entwickelten. BioLChem. 191,447[1951]). Der Bereich, der das gewünschte Derivat enthielt, wurde aus dem Papier ausgeschnitten und mit 3 χ 50 ml Wasser extrahiert Die entstehenden Auszüge, enthaltend

Nicotinamid-6-(2-aminoäthyIamino)purindinucleotid
ι ο wurden zusammengegeben, auf 3 bis 4 ml eingeengt und bei -20⁰C gelagert

Beispiel 2

Herstellung von Nicotinamidadenindinucleotid-Biotin-Konjugat

16 mg Biotin wurden in 1 ml Wasser, enthaltend 22 mg Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)purindinucleotid, entsprechend Beispiel 1, suspendiert. Zur Erleichterung der Lösung des Biotins wurden einige Tropfen 0,1 η Natriumhydroxid zugegeben. Dann wurden 240 mg 1 -Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat zu der entstehenden Lösung zugegeben und durch Zutropfen von 0,1 η Salzsäure in Lösung gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann in 10 ml Aceton von — 10⁰C gegossen. Das entstehende öl wurde abgetrennt, 2 χ mit 5 bis 10 ml Äther gewaschen und in 1 bis 2 ml Wasser gelöst. Die entstehende

jo Substanz wurde durch Elektrophorese auf Papier, entsprechend Beispiel 1, gereinigt. Es erschienen zwei Fluoreszensbänder nach Besprühen mit Natriumcyanid. Das eine wanderte gegen die Kathode und das andere gegen die Anode. Das zuletzt genannte enthielt das NAD-Biotin-Konjugat und wurde mit Wasser eluiert und bei — 20^r C gelagert.

Beispiel 3

Konkurrenz-Bindungs-Biolumineszens-Bestimmungsverfahren für Biotin; Wirkung verschiedener Gehalte an

Biotin auf die Spitzenlichtintensität.

Das Biolumineszens-Reaktionssystem dieses
spiels beruhte auf folgende Gleichungen:

(b) NADH-Ligand + FMN*) + H®

dehydrogenase

NADH-

dehydrogenase

Luciferase

(c) FMNH₂ + langkettiger Aldehyd + O₂

*) Flavinmononucleotid

A. Herstellung einer Licht erzeugenden Lösung

Eine Licht erzeugende Lösung zur Durchführung der Reaktionen (b) und (c) wurde folgendermaßen hergestellt. Ein Reagensgemisch wurde hergestellt, enthaltend 0,13 m Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,67 Gew.-% Rinderserumalbumin, 15,7 μιτι Flavinmononucleotid (FMN), enthaltend 13,3 mm Natriumacetat und dieses Gemisch in der Dunkelheit bei - 20⁰C aufbewahrt. Eine Emulsion von 5 μΙ Dodecanal in 5 μΙ Wasser wurde an dem Tag hergestellt, an dem die lichtentwickelnde NADH-Ligand + Acetaldehyd
> NAD-Ligand + FMNH₂

FMN + langkettige Säure + H₂O + hv

Lösung angewandt werden sollte. Lyophilisierte Luciferase, extrahiert aus Photobacterium fisheri (Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey) wurde zu 0,013 m Phosphatpuffer, pH 7,3, bis zu einer Konzentration von 20 mg/ml zugegeben. Nach 30 min wurde die entstehende Suspension mit 1500 g 10 min zentrifugiert und die Perle verworfen. Die lichtentwickelnde Lösung wurde dann 5 min vor Anwendung hergestellt durch Zusammengeben von 75 μΐ des Reagensgemisches, 5 μΐ Dodecanaleniulsion und 20 μΙ Luciferaselösung.

B. Herstellung von unlöslich gemachtem
Bindungspartner

Avidin, das eine Bindungsaffinität gegenüber Biotin besitzt, wurde unlöslich gemacht, indem es folgendermaßen kovalent an wasserunlösliche Polymerperlen gebunden wurde. Eine Menge Sepharose 4B (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) wurde aktiviert zur Bindung mit Avidin nach dem Verfahren von March et al. Analytical Biochemistry 60, 149 (1974). Ungefähr 4 ml der aktivierten Sepharose 4B wurden in 8 ml 0,1 m Citratpuffer, pH 7,0, suspendiert. Zu der Suspension wurden 6 mg Avidin mit einer Aktivität von 93 Einheiten pro mg in 3 ml Wasser zugegeben. Eine Einheit Avidinaktivität ist die Menge an Avidin, die imstande ist, 1 jig Biotin zu binden. Das entsteigende Reaktioiisgemisch wurde 6 h bei 7°C gerührt. Die Sepharose 4B, an die das Avidin gebunden war, wurde filtriert, mit 100 ml 0,1 m Natriumbicarbonat-Puffer, pH 9,0, gewaschen und erneut in 240 ml 0,1 m Tris-(hydroxymethy!)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, suspendiert.

C. Vergleichsversuche

Es wurden neun spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,19 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxyme-

10

15

20

25 thylJ-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, 0,6 m Äthanol, 0,01 m Semicarbazidhydrochlorid und jeweils die in Tabelle I angegebenen Mengen bzw. Konzentrationen an NAD, NAD-Biotin-Konjugat, Suspension von an Sepharose 4B gebundenem Avidin (entsprechend Teil B dieses Beispiels) und Sepharose-48-Suspension (hergestellt durch Suspendieren von 1 ml (packed) Sepharose 4B in 60 ml 0,1 m Tris-(hydroxyäthyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH S,0). Die Reaktionsgemische wurden 15 min bei Raumtemperatur leicht geschüttelt Dann wurden 0,22 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase zu jedem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktionsreduktion einzuleiten. Das Semicarbazid verband sich mit dem in Reaktion (a) gebildeten Acetaldehyd unter Bildung eines Semicarbazone, wodurch die Reaktion (a) in die gewünschte Richtung geführt wurde.

Die Reaktionsgemische wurden erneut 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. 10μ1 der überstehenden Flüssigkeit jedes Reaktionsgemisches wurden dann in eine getrennte Küvette injiziert, die in einem DuPont Modell 760 Bioluminescence Photometer (E.I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware) befestigt war und 100 μΐ der vorher hergestellten lichterzeugenden Lösung enthielt, die vorher 2 bis 3 min bei 25° C inkubiert worden war. Man erhielt die in Tabelle I angegebenen Ergebnisse.

Tabelle I

Reaktions gemisch	NAD-Konzen- tration	NAD-Biotin- Konj ugat-Konzen- tration	Suspension von an Sepharose 4B gebundenem Avidin	Sepharose-4B- Suspension	Spitzenlicht- intensität
	(nm)	(nm)	(μΙ)	(ül)
1		_	-	-	1,2
2	21	-	-	-	159
3	21	-	20	-	147
4	-	10	-	-	45,9
5	-	21	-	-	110
6	-	21	20	-	28,5
7	21	-	-	10	154
8	_	21	-	10	114
9	_	-	20	-	1,6

Die Ergebnisse der Vergleichsreaktionen 1 und 9 zeigen, daß in Abwesenheit von NAD und dem NAD-Biotin-Konjugat nur sehr wenig Licht erzeugt wurde. Die Reaktionen 2 und 3 führten zu Ergebnissen, die zeigen, daß die lichterzeugende Reaktion eintrat, wenn freies NAD zugegeben wurde und daß eine derartige Reaktion im wesentlichen nicht beeinflußt wurde durch das Vorhandensein von an Sepharose 4B gebundenem Avidin. Die Ergebnisse der Reaktionen 4.5 und 6 zeigen, daß das NAD-Biotin-Konjugat in der lichterzeugenden Reaktion aktiv war, daß die Spitzenlichtintensität zunahm, je mehr NAD-Biotin-Konjugat vorhanden war und daß das Vorhandensein von an *>^Γ> Sepharose 4B gebundenem Avidin die Lichterzeugung hemmte. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 3 und 5 mit denjenigen der Reaktionen 7 und 8 zeigt, daß die lichterzeugende Reaktion durch das Vorhandensein von purer Sepharose 4B nicht beeinflußt wurde.

D. Bestimmungsverfahren

Es wurden fünf weitere spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt jeweils mit einem Volumen von 0,19 ml und jeweils enthaltend 0,1 m Tris-(hydroxyrnethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0,0,6 m Äthanol, 0,01 m Semicarbazid und jeweils die in Tabelle Il angegebenen Mengen bzw. Konzentrationen an NAD-Biotin-Konjugat, freiem Biotin und an Sepharose 4B gebundenem Avidin in Suspension, jedes Reaktionsgemisch wurde auf die gleiche Weise behandeli wie die Vergleichsreaktionsgemische in Teil C dieses Beispiels. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angegeben.

	21	26 60 548	22	I	Spitzenlicht
					intensität
	NAD-Biotin-Konjugat-		Suspension von an
Tabelle II	Konzentration	Biotin-Konzentration	Sepharose 4B gebundenem
Reaktions			Avidin	79,1
gemisch	(nm)		(μΐ)	17,4
	21	(nm)	_	43,1
	21	_	20	59,9
10	21	-	20	79,7
11	21	79	20
12	21	158	—
13		158
14

Die Ergebnisse der Reaktionen 11, 12 und 13 zeigen, daß freies Biotin und das NAD-Biotin-Konjugat wirksam um die bindenden Stellen des unlöslich gemachten Avidins in Konkurrenz treten, da die Spitzenlichtintensität abhängt von der Menge an freiem vorhandenen Biotin. Die Reaktionen 10 und 14 führten zu Ergebnissen, die zeigen, daß in Abwesenheit von unlöslich gemachtem Avidin die Spitzenlichiintensität für stark unterschiedliche Konzentrationen an freiem Biotin konstant ist.

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die in der flüssigen Phase vorhandene Menge an NAD-Biotin-Konjugat umgekehrt proportional ist der Menge an vorhandenem freien Biotin und das erfindungsgemäße Verfahren und Mittel daher geeignet sind zur Bestimmung eines Liganden in einer unbekannten Flüssigkeitsprobe.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Konjugate für ein heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, dadurch gekenn- 5 zeichnet, daß sie der allgemeinen Formel

NH·,

N ^w Y-Z

R³—H₂C O R¹

HOR²

R⁵—H₂C O N

NH,

HOOH

entsprechen,
in welcher

R¹ für eine der Gruppen

—Ζ—Υ

NH₂

NH₂

NH-Υ—Ζ

NH₂

Y-Z

oder

(Π)

15

20

25

30

NH₂

Y-Z

steht,

R² eine der Gruppen

— OH oder —Ο—Ρ—Ο^Θ

Ii ο

bedeutet und
R³ für eine der Gruppen

O^e

— Ο—Ρ—0^θ

Il ο

o^e ο^θ

— Ο— Ρ— Ο—Ρ— Ο^θ

Il Il ο ο

_Οθ _Οθ _Οθ

— Ο—Ρ—Ο—Ρ—Ο—Ρ—Ο^θ

Il Il Il

0 0

oder

Ο^θ Ο^θ

I I

— Ο —Ρ—Ο—Ρ—Ο —H₂C O R⁴

!I Il ο ο

HO OH

steht, wobei

40

60

R⁴ die Bedeutung von

-ν y

CONH₂

—N

CONH₂

hat und

R⁵ für eine der Gruppen

Ο^θ