DE2754086C3

DE2754086C3 - Spezifisches Bindungsverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium

Info

Publication number: DE2754086C3
Application number: DE2754086A
Authority: DE
Inventors: Robert Charles Boguslaski; Robert Joseph Carrico; James Edward Ann Arbor Mich. Christner; Ind. Elkhart
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-12-06
Filing date: 1977-12-05
Publication date: 1979-10-18
Also published as: US4134792A; DE2754086B2; GB1575425A; FR2373063B1; CA1079632A; FR2373063A1; DE2754086A1; JPS53105291A; JPS6240662B2

Description

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß de:¹ reversibel bindende Enzymmodulator die Aktivität des Enzyms stimuliert bzw. erhöht.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Enzymmodulator als Bestandteil des Konjugais die Aktivität des Enzyms anders beeinflußt, wenn das Konjugat in gebundener Form vorliegt als wenn es in freier Form vorliegt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet daß man eine homogene Arbeitsweise anwendet und das Enzym zu dem Gemisch aus

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gebundener und freier Form zusetzt

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet daß man heterogen arbeitet und die gebundene von der freien Form physikalisch trennt und dann zu einer Form das Enzym zusetzt

H. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet daß der Ligand ein Antigen oder Antikörper dazu, Hapten oder Antikörper dazu, Hormon, Vitamin, Metabolit oder pharmakologisches Mittel oder ein Rezeptor oder eine bindende Substanz dazu ist

Die Erfindung bezieh; sich auf ein spezifisches Bindungsverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Zur Illustration wird ein übliches Konkurrenz-Bindungsbestimmungsverfahren beschrieben. Bei einem solchen Verfahren umfaßt das Reagensmittel 1.) ein markiertes Konjugat in Form des zu bestimmenden Liganden oder eines entsprechenden Analogen davon, der (das) chemisch an eine Markierungssubstanz gebunden ist und 2.) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden wie einen Antikörper oder ein anderes Bindungsprotein. Nach Zusammenbringen der zu untersuchenden Probe mit den Reagentien treten der nachzuweisende bzw. zu bestimmende Ligand und das markierte Konjugat in Konkurrenz um nicht kovalente Bindung mit dem spezifischen Bindungspartner. Als Folge davon ist die Menge an markiertem Konjugat die an den Bindungspartner gebunden wird — d.h. die gebundene Form oder die freibleibende Menge, also die nicht an den Bindungspartner gebundene und daher freie Form —, eine Funktion der vorhandenen Menge des konkurrierenden Liganden.

Wenn das markierte Konjugat in der gebundenen Form und das in der freien Form durch die zur Messung der Markierungssubstanz angewandten Mittel im wesentlichen nicht unterschieden werden können, müssen die gebundene Form und die freie Form physikalisch voneinander getrennt werden, um die Bestimmung durchzuführen. Ein derartiges Bestimmungsverfahren wird als »heterogen« bezeichnet. Wenn die gebundene Form und die freie Form des markierten Konjugats unterschieden werden können, kann eine »homogene« Arbeitsweise angewandt und die Trennung vermieden werden.

Die erstentwickelte Form von spezifischen Bindungsbestimmungen war die radioimmunologische Bestimmung, bei der ein radioaktives Isotop als Markierungssubstanz angewandt wird. Bei einer derartigen Bestimmung muß notwendigerweise eine heterogene Arbeitsweise angewandt werden. Auf Grund der Gefährlichkeit und schwierigen Handhabung von radioaktiven Substanzen sind verschiedene neue Bestimmungssysteme entwickelt worden, bei denen andere Substanzen als radioaktive Isotope zur Markierung angewandt werden, wie Enzyme, fluoreszierende Moleküle, Bacteriophagen, Coenzyme und lumineszierende Moleküle.

Heterogene Bindungsreaktionssysteme, bei denen ein Enzym als Markierungssubstanz angewandt wird, sind z, B. angegeben in den US-PS 36 54 909, 37 91 932, 38 39 153,38 50 752 und 38 79 262, J. Immunol. Methods Bd. 1, S. 247 (1972) und J. Immunol. Bd. 109, S. 129 (1972). Eine heterogene Bindungsbestimmung unter Anwen-

dung einer nicht aktiven Vorstufe einer spektrophotoaietrisch nachweisbaren Substanz zur Markierung ist in der ÜS-PS 3880934 angegeben. Eine immunologische Bestimmung der homogenen Art unter Verwendung einer Enzymmarkierung ist in der US-PS 3817 834 beschrieben, bei der ein Ugand-Enzym-Konjugat angewandt wird. Die Enzymaktivität des Konjugats in der gebundenen Form ist weniger gut meßbar als in der freien Form, wodurch eine homogene Arbeitsweise angewandt werden kann.

Es ist Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein spezifisches Bindungsverfahren zu entwickeln, das sowohl für homogene als auch für heterogene Arbeitsweisen geeignet ist, bei dem eine einzigartige Markierungssubstanz angewandt wird, die zu einer großen Verbindungsklasse gehört, für die ausgiebige Literatur vorliegt, um die Auswahl spezieller Markierungen, die Entwicklung geeigneter Derivate und die Überwachung von Reaktionen zu erleichtern.

Die Lösung dieser Aufgabe ist im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 beschrieben. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Ansprüchen 2 bis 11 dargelegt

In den Figuren ist

F i g. 1 eine Kurve, die die Hemmwirkung verschiedener Konzentrationen von Biotin-Modulator-Konjugat auf die Esteraseaktivität von Carbonsäureanhydrase zeigt, wie sie durch die Hydrolysegeschwindigkeit gemessen wird, und

Fig.2 eine Kurve, die die Wirkung verschiedene.' Konzentrationen von Avidin auf die Hemmwirkung von Biotin-Modulator-Konjugat auf die Esteraseaktivität von Carbonsäurehydrase zeigt, wie sie durch die Hydrolysegeschwindigkeit gemessen wird.

In dieser Beschreibung haben die folgenden Ausdrükke die angegebene Bedeutung: »Ligand« ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorhandensein oder Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; »spezifischer Bindungspartner für den Liganden« ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt; »spezifisches Bindungsanaloges des Liganden« ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich im wesentlichen in Beziehung auf die Bindungsaffinität zu dem spezifischen Bindungspartner für den Liganden wie der Ligand selbst verhält; und »Nachweisreaktion« ist eine Reaktion, die durch ein Enzym katalysiert wird, dessen Aktivität durch den erfindungsgemäß verwendeten Enzymmodulator beeinflußt, d. h. verringert oder erhöht, wird.

Die erfindungsgemäß angewandte neue Markierungssubstanz kann irgendeine chemische Substanz sein, die sich spezifisch oder nicht spezifisch in reversibler nicht kovalenter Weise mit einem Enzym verbindet und dadurch in meßbarer Weise, entweder durch Hemmung oder Stimulierung, die katalytische Aktivität des Enzyms in einer vorbestimmten Reaktion, d. h. der Nachweisreaktion für das Bindungssystem, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entsteht, beeinflußt. Unter »reversibel bindend« ist gemeint, daß die Bindungskonstante für die Verbindung (Assoziation) des Enzymmodulators mit dem Enzym, das die Nachweisreaktion katalysiert, weniger als ungefähr 10¹¹In-¹ beträgt. Vorzugsweise liegt die Bindungskonstante zwischen ungefähr 10⁵ und ungefähr 10⁹ m -'.

Eine Gruppe von Substanzen, die erfindungsgemäß anwendbare Enzymmodulatoren umfaßt, ist die Gruppe von reversibel bindenden Enzyminhibitoren (Hemmstoffen), unabhängig davon, ob sie konkurrierend oder nichtkonkurrierend sind. Konkurrierende Inhibitoren verbinden sich mit dem freien Enzym auf eine solche Weise, daß sie mit dem normalen Substrat um die Bindung an den aktiven Stellen des Enzyms in Konkurrenz treten, wobei das Inhibitormolekül jedoch durch das Enzym nicht chemisch umgewandelt wird. Im Gegensatz dazu verbinden sich unkompethive Inhibitoren nicht mit dem freien Enzym oder beeinflussen dessen Verbindung mit dem normalen Substrat nicht, sondern sie verbinden sich mit dem entstehenden Enzym-Substrat-Komplex und ergeben ein inaktives Addukt, das nicht imstande ist, das normale Produkt freizusetzen. Nichtkompetitive Inhibitoren können sich sowohl mit dem freien Enzym als auch mit dem Enzym-Substrat-Komplex verbinden und die normale Katalyse stören üblicherweise durch Bindung an eine andere Stelle des Enzyms als die aktive Stelle, wodurch sie die empfindliche Konfiguration des aktiven Enzyms ändern.

Von den üblichen Enzyminhibitoren sind die kompetitiven bevorzugt Im folgenden ist eine Tabelle von geeigneten kompetitiven Inhibitoren, den Enzymen, deren Aktivität durch sie gehemmt wird, und ein ungefährer Wert für die Inhibitionskonstanten (K₁) für die Dissoziation der betreffenden Inhibitoren von den Enzymen angegeben.

Inhibitor

Enzym

Carbonsäure-anhydrase 6X10⁷ Carbonsäure-anhydrase 10 "
Acetylcholin-esterase 10"

Acetazolamid
Sulfanilamid

Phenyl-trimethyl-

ammonium-ion

Saccharo-l,4-lacton jS-Glucuronidase 10 ⁶

4-Amino-lO-methyl- Dihydrofolat-reduktase 10 ⁹
pteroyl-glutaminsäure

2,6,8-Trichlorpurin Uricase 10 "

Es können auch wirksame Analoge, d.h. Derivate, Homologe usw., der oben angegebenen Inhibitoren angewandt werden. Zum Beispiel wird Acetylcholin-

esterase auch durch p-Amino-phenyl-trimethylammonium-ion und durch den N-Methyl-N-(p-aminophenyl)-carbamatester von m-(Trimethylamino)-phenol gehemmt
Eine andere Gruppe von Substanzen, aus der geeignete Enzymmodulatoren ausgewählt werden können, sind die allosterischen Effektoren. Derartige Substanzen wirken bei biologischen Prozessen als Regulatoren des enzymatischen Metabolismus. Ihre Wirkung wird erreicht durch spezifische Bindung an eine andere Stelle des Enzyms als die für das Substrat aktive Stelle, wodurch die Aktivität des Enzyms gehemmt oder stimuliert wird, z. B. durch eine Konfcmiationsänderung. Im folgenden ist eine Tabelle von einigen allosterischen Effektoren angegeben, die erfindungsgemäß als Enzymmodulatoren angewandt werden können. In der Tabelle sind Inhibitor oder negative Effektoren gekennzeichnet durch (-) und stimulierende oder positive Effektoren durch ( + ). Die

Quelle für das beeinflußte Enzym ist ebenfalls in Klammern angegeben.

Tabelle

Allosterischer Effektor

Enzym

Allosterischer Effektor

Enzym

L-Isoleucin (-)	biosynthctische L-Threonin-
L-Valin (+)	desaminase (E. coli K 12)
	und (Hefe)
Cytosin-triphosphat
(CTP) (-)
Adenosin-triphosphat
(ATP) (+)
Desoxythymidin-tri-	Desoxycytidylat-amino-
phosphat (dTTP) (-)	hydrolase (Esel-Milz)
Desoxycytosin-tri-
phosphat (dCTP) (+)
ATP (-)	Phosphofructokinase
3',5'-Adenosin-mono-	(Meerschwei nchen-H erz)
phosphat (AMP) (+)
dTTP(-)	Desoxythymidinkinase
Deoxycytosin-diphosphat	(E. coli)
(dCDP) (+)
ff-Ketoglutarat (-)	Nicotinamid-adenin-
Citrat (+)	dinucleotid-(N AD)-IsO-
	citronensäure-dehydro-
	genase (N. crassa)
5'-AMP (+)	NAD-Isocitronensäure-
	dehydrogenase (Hefe)
L-Threonin (-)	Homoserin-dehydrogenase
L-Isoleucin (+)	(R. rubrum)
L-Methionin (+)
Adenosin-diphosphat	L-Threonin-deaminase
(ADP) (+)	(C. tetanomorphum)
L-Valin (-)	Acetolactat-synthetase
	(E. coli)
L-Threonin (-)	Threonin-aspartokinase
	(E. coli)
Uridin-diphosphat	L-Glutamin-D-fructose-
(UDP)-N-Acety! glucos	6-phosphat-transaminase
amin (-)	(Ratten-Leber)
GIucose-6-phosphat (+)	Glycogen-synthetase (Hefe)
	und (Lamm-Muskel)
ATP (-)	Glutamat-dehydrogenase
Guanosin-triphosphat	(Rinder-Leber)
(GTP) (-)
Reduziertes NAD (-)
Östrogene {-)
Thyroxin (-)
ADP (+)
Leucin (+)
Methionin (+)
ATP (-)	Phosphorylase b
5'-AMP (+)	(Kaninchen-Muskel)

Cytosin-monophosphat
(CMP)-N-Acetyineuraminsäure (-)

L-Threonin (-)
L-Lysin (-)
5'-AMP (-)

UDP-N-Acetyl-glucosamin-2-epimerase (Ratten-Leber)

Homoserin-dehydrogenase (E. coli)

Lysin-aspartokinase
(E. coli)

Fructose-1,6-diphosphatase (Frosch-Muskel und
Ratten-Leber)

Weitere Einzelheiten sind in J. Mol. Biol. Bd. 12, S. 88 (1965) angegeben.

Um das markierte Konjugat herzustellen, das an dem Bindungsreaktionssystem teilnimmt wird der Enzymmodulator kovalent an eine entsprechende Bindungskomponente eines solchen Reaktionssystems gebunden. Eine solche Bindungskomponente ist der zu bestimmende Ligand, ein spezifisches Bindungsanaloges des Liganden oder ein spezifischer Bindungspartner zu dem Liganden, je nach dem ausgewählten Bindungsreaktionsschema. Einige der verschiedenen üblichen Bindungsreaktionsschemata werden später näher beschrieben. Das angewandte Verfahren, um den Enzymmodulator und die Bindungskomponente kovalent miteinander

in zu verbinden, ist nicht kritisch, solange die entstehende Enzym-Modulator-Gruppierung eine meßbare Menge Modulierungsaktivität besitzt und ähnlich die entsprechende Gruppierung der Bindungskomponente eine geeignete Menge Aktivität in Beziehung auf das Bindungsreaktionssystem behält Allgemein werden der Enzymmodulator und die Bindungskomponente direkt oder über eine Brücke mit aktiven Kupplungsgruppen an entgegengesetzten Seiten, um die entsprechenden zu verbindenden Gruppen kovalent miteinander zu verbinden, aneinander gebunden. Die Brücke enthält üblicherweise 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatome oder Heteroatome, wie Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphoratome usw. Beispiele für Brücken, die ein einzelnes Atom enthalten, sind die Methylengruppe (ein Kohlenstoffatom in der Kette) und die Aminogruppe (ein Heteroatom in der Kette). Die Brücke besitzt üblicherweise ein Molekulargewicht von nicht mehr als 1000 und vorzugsweise weniger als 200. Die Brücke, soweit eine solche vorhanden ist umfaßt eine Kette von

■jo Kohlenstoffatomen und/oder Heteroatome«, und ist an den Enzymmodulator bzw. die Bindungskomponente durch verbindende Gruppen gebunden^die üblicherweise ausgewählt sind aus Ester, Amid, Äther, Thioester, Acetal, Methylen und Aminogruppen.

Im folgenden sind Strukturformeln für einige infrage kommende markierte Konjugate angegeben einschließlich den kompetitiven Inhibitoren, die oben als Markierungssubstanzen angegeben sind, und ein allgemeines Verfahren zu ihrer Herstellung.

A. Konjugate aus Acetazolamid und Bindungskomponente

N N

ΛΛ

H₂Ni)₂S S NHCOfCHA-Bindungskomponentc

N N

H₂NO₂S S NHCO(CH₂)₅NH-Bindungskomponcntc

Im Beispiel I. B und C sind Einzelheiten der Herstellung für derartige Konjugalc angegeben. B. K.onjiigatc aus Phcnyl-triniclhylamnioniiim-ion und Bindungskompoiicnlc

N'(

N HCO(CH₂ isNH-Bindungskomponcnle

Die interessierende Bindungskomponente wird kova- dann mit Hilfe eines Aktivierungsmittels, wie Carbodi-

lent an die Aminofunktion einer o-Aminoalkylcarbon- 2» imid, an p-Amino-N,N-dimethylanilin gebunden. Das

säure gebunden durch eine Reaktion wie eine entstehende Produkt wird anschließend mit Methyljo-

nucleophile Substitution. Das entstehende Produkt wird did behandelt, um das gewünschte Konjugat

N (CH,).,

OCON

/)= 1,2 und R = Bindungskomponentc

zu erhalten.

Die interessierende Bindungskomponente wird durch geeignete Mittel (Aktivierung der Carboxylgruppe, nucleophile Substitution) an eine Aminogruppe von 3,3'-DiaminodipropyIamin gebunden. Das entstehende Produkt wird wird dann mit Bernsteinsäureanhydrid behandelt und die entstehende Substanz an die freie Aminofunktion des N-Methyl-N-(p-aminophenyl)-carb-

amatesters von m-(Triäthylamino)-phenol mit Hilfe eines Carbonsäure-Aktivierungsmittels gebunden. Wahlweise kann der Inhibitor weiter von dem Liganden angeordnet werden durch Behandlung des oben angegebenen succinylierten Derivats mit 3,3'-Diaminodipropylamin und Carbodiimid und anschließend Bernsteinsäureanhydrid und Kupplung an den Inhibitor (n = 2).

C. Konjugat aus Saccharo-l^-Iacton und Bindungskomponcnte O

HCOH

HOCH

HC

HCOH

C — NH — R — NH-Bindungskomponente O
—(CH₂).,NH(CH,)₃— oder — (CH₂I₂-

Saccharo-l/l-lactoii wird an ein fltfo-Diaminoalkylderivat über die freie Carboxylgruppe mit Hilfe eines Caibonsäure-aktivierenden Mittels gebunden. Das ent-

stehende Produkt wird dann an die Bindungskomponente über eine geeignete Reaktion, z. B. eine nucleophile Substitution, Carbonsäureaktivierung usw., gebunden.

9 10

I). («Conjugate mis ^Aniino-IO-melhylptcroylglutaminsiuirc und Bindungskomponentc

CONII-CHCOR

H, N

R = —OH oder —NHICH^-Bindungskomponcnte ;i = 6 oder 12

Die interessierende Bindungskomponente wird durch eine der Carbonsäurefunktionen von 4-Amino-10-me-

eine entsprechende Reaktionsfolge an die Aminofunk- thyl-pteroyl-glutaminsäure mit Hilfe eines entsprechen-

tion eines α,ω-Diaminoalkylderivats gebunden. Das bei den Carbonsäure-aktivierenden Mittels, z. B. Carbodi-

dieser Umsetzung entstehende Produkt wird dann an >n imid, gebunden.

E. Konjugat aus 2,6.8-Triclilorpurin und Bindungskomponente
Cl

NH(CH;j)„NH-Bindiingskomponente

CI

= 1 bis 6

2,6,8-Trichlorpurin wird mit Dihydropyran und J5 einer katalytischen Menge Säure behandelt unter Bildung eines in 9-Stellung substituierten Tetrahydropyranyläthers. Dieses Produkt wird dann mit einem α,ω-Diaminoalkan umgesetzt unter Bildung eines an dem Cg-Atom-substituierten Aminoalkylaminderivats. Die Tetrahydropyranyl-blockierende Gruppe wird dann unter sauren Bedingungen entfernt unter Bildung von 2,6-Dichlor-substituiertem Purin. Die interessierende Bindungskomponente wird dann an die freie Alkylaminogruppe mit Hilfe irgendeiner geeigneten Reaktionsfolge gebunden.

Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann angewandt werden z. B. zur Bestimmung irgendeines Liganden, für den ein spezifischer Bindungspartner existiert Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für das ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen existiert oder synthetisiert werden kann. Der Ligand wird üblicherweise ausgewählt aus der Gruppe von Antigenen und deren Antikörpern, Hormonen, Vitaminen, Metaboliten und pharmakologischen Mitteln und deren Rezeptoren und Bindungssubstanzen. Spezifische Beispiele für Liganden, die erfindungsgemäß nachgewiesen bzw. bestimmt werden können, sind Hormone, wie bo Insulin, Choriongonadotropin, Thyroxin, Liothyronin und Östriol; Antigene und Haptene, wie Ferritin, Bradykinin, Prostaglandine und tumorspezifische Antigene; Vitamine, wie Biotin, Vitamin Bi₂, Folsäure, Vitamin E und Ascorbinsäure; Metaboliten, wie 3',5'-Adenosinmonophosphat und 3',5'-Guanosinmonophosphat; pharmakologische Mittel wie Dflatin, Digoxin. Morphin, Digitoxin und Barbiturate; Antikörper, wie mikrosome Antikörper und Antikörper gegen Hepatitis und Allergene; und spezifisch bindende Rezeptoren, wie Thyroxin-bindendes Globulin, Avidin, lntrinsikfaktor und Transcobalamin.

Wie oben gesagt kann das erfindungsgemäße Verfahren unter entsprechenden Bedingungen sowohl für eine homogene als auch für eine heterogene Arbeitsweise angewandt werden.

Homogene Arbeitsweise

Eine homogene Arbeitsweise, d. h. eine solche, bei der keine physikalische Trennung der gebundenen von der freien Form erforderlich ist, ist möglich, wenn die Reaktion zwischen der Bindungskomponente des markierten Konjugats und einem entsprechenden Bindungspartner zu einer meßbaren Änderung, entweder einer positiven oder negativen Änderung, der Fähigkeit des konjugierten Enzymmodulators die Aktivität des die Nschvsreisreakiäon katalysierenden Enzyms führt In einem solchen Falle kann die Verteilung des Enzymmodulators zwischen der gebundenen und der freien Form bestimmt werden durch direkte Zugabe des Enzyms zu dem Gemisch aus beiden Formen und Messung der Enzymaktivität Es sind verschiedene Arbeitsweisen zur Durchführung einer homogenen Bestimmung möglich, wobei die direkte Bindung und die Konkurrenzbindung bzw. kompetitive Bindung bevorzugt sind.

Bei der direkten Bindung wird ein Medium, in dem der Ligand vermutet wird, mit einem Konjugat zusammengebracht, umfassend den Enzymmodulator, der an einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden gebunden ist und die Änderung der Aktivität des Enzymmodulators bestimmt Bei der Konkurrenzbindung wird das

flüssige Medium mit einem spezifischen Bindungspartner für den Liganden und mit einem Konjugat zusammengebracht umfassend den Enzymmodulator, der an den Liganden und/oder ein spezifisches Bindungsanaloges davon gebunden ist, und anschlie- -ßend die Änderung der Aktivität des Enzymmodulators bestimmt. Bei beiden Arbeitsweisen wird die Aktivität des Enzymmodulators bestimmt indem man das flüssige Medium mit mindestens einem Reagens zusammenbringt, das mit dem Enzymmodulator die vorausbe- ι ο stimmte Nachweisreaktion eingeht Der qualitative Nachweis eines Liganden in dem flüssigen Medium umfaßt einen Vergleich einer Charakteristik üblicherweise der Geschwindigkeit der entstehenden Nachweisreaktion mit derjenigen in einem flüssigen Medium, das ι? keinen Liganden enthält wobei ein auftretender Unterschied ein Zeichen für eine Aktivitätsänderung des Enzymmodulators ist. Bei der quantitativen Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium wird eine Eigenschaft der entstehenden Reaktion mit derjenigen einer Nachweisreaktion in flüssigen Medien, die bekannte Mengen des Liganden enthalten, verglichen.

Allgemein können bei einer homogenen Arbeitsweise die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion — 2 > d. h. das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, das Konjugat und/oder ein spezifischer Bindungspartner für den Liganden — in jeder beliebigen Menge, Weise und Reihenfolge zusammengebracht werden, vorausgesetzt daß die Aktivität des Enzymmodulators in dem Konjugat meßbar verändert wird, wenn die Flüssigkeit den Liganden in einer Menge oder Konzentration enthält die für die Bestimmungszwecke von Bedeutung ist Vorzugsweise sind alle Bestandteile der spezifischen Bindungsreaktion in dem flüssigen Medium löslich.

Wenn eine Arbeitsweise unter Ausnutzung einer direkten homogenen Bindung angewandt wird, sind die Komponenten der Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, und eine Menge eines Konjugats aus dem Enzymmodulator und einem spezifischen Bindungspartner für den Liganden. Die Aktivität des konjugierten Modulators ändert sich bei Berührung mit dem flüssigen Medium umgekehrt proportional zu dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner in dem Konjugat So nimmt mit zunehmender Menge des Liganden in dem flüssigen Medium die Aktivität des konjugierten Modulators ab.

Wenn ein Konkurrenzbindungsverfahren angewandt wird, sind die Komponenten der Bindungsreaktion das flüssige Mediuni, in dem der Ligand vermutet wird, eine Menge eines Konjugats aus dem Enzymmodulator, der an den Liganden gekuppelt ist oder einem spezifischen Bindungsanalogen zu dem Liganden, und eine Menge eines spezifischen Bindungspartners zu dem Liganden. Der spezifische Bindungspartner wird im wesentlichen gleichzeitig mit dem Konjugat und dem flüssigen Medium zusammengebracht Da etwaiger vorhandener ω Ligand in dem flüssigen Medium mit dem Liganden oder spezifischen Bindungsanalogen davon in dem Konjugat um die Bindung mit dem spezifischen Bindungspartner in Konkurrenz tritt, ändert sich die Aktivität des konjugierten Modulators bei Berührung mit dem b5 flüssigen Medium direkt mit dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner. Daher nimmt mit zunehmender Menge des Liganden in dem flüssigen Medium die Aktivität des konjugierten Modulators zu.

Eine Variation des homogenen Konkurrenzbindungsverfahrens ist die homogene Verdrängungsreaktion, bei der das Konjugat zunächst mit dem spezifischen Bindungspartner für den Liganden und anschließend mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird.

Dabei tritt dann eine Konkurrenz um den spezifischen Bindungspartner ein. Bei einem derartigen Verfahren ist die Menge an Konjugat, die mit dem spezifischen Bindungspartner zusammengebracht wird, üblicherweise so, daß sie den Liganden oder dessen Analoges in einem Überschuß gegenüber der Menge enthält die imstande ist mit der vorhandenen Menge an spezifischem Bindungspartner während der Zeit Bindungen einzugehen, die das Konjugat und der spezifische Bindungspartner vor der Berührung mit der flüssigen Probe, in der der Ligand vermutet wird, in Berührung ist Diese Reihenfolge des Kontaktes kann auf zwei bequeme Arten erreicht werden. Bei einer Art wird das Konjugat mit dem spezifischen Bindungspartner in einem flüssigen Medium zusammengebracht und zwar vor dem Kontakt mit dem flüssigen Medium, in dem der Ligand vermutet wird. Bei der zweiten Art wird das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, mit einem Komplex zusammengebracht aus dem Konjugat und dem spezifischen Bindungspartner, wobei die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat und der spezifische Bindungspartner aneinander gebunden sind Die Menge an Konjugat die an den spezifischen Bindungspartner bei dem ersten Verfahren gebunden wird oder die bei dem zweiten Verfahren in Komplexform vorliegt ist üblicherweise größer als diejenige, die von dem gesamten Liganden in dem flüssigen Medium in der Zeit verdrängt werden kann, die der spezifische Bindungspartner oder Komplex und das Medium in Berührung stehen, bevor eine etwaige Änderung der Aktivität des konjugierten Modulators vollständig bestimmt wird.

Eine andere Variation des homogenen Konkurrenzbindungsverfahrens ist ein aufeinanderfolgendes Sättigungsverfahren, bei dem die Bestandteile der spezifischen Bindungsreaktion die gleichen sind, wie sie für das Konkurrenzbindungsverfahren angewandt werden, aber die Reihenfolge der Zugabe oder Kombination der Bestandteile und die relativen Mengen, die angewandt werden, unterschiedlich sind. Bei dem aufeinanderfolgenden Sättigungsverfahren wird der spezifische Bindungspartner für den Liganden mit dem flüssigen Medium, in dem der Ligand vermutet wird, eine zeitlang zusammengebracht bevor das flüssige Medium mit dem Konjugat zusammengebracht wird. Die Menge an spezifischem Bindungspartner, die mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird, ist üblicherweise größer als die Menge, die imstande ist mit dem gesamten Liganden, der in dem flüssigen Medium vermutet wird, in der Zeit Bindungen einzugehen, die der spezifische Bindungspartner und das flüssige Medium in Berührung stehen, bevor das flüssige Medium mit dem Konjugat zusammengebracht wird. Ferner ist die Menge an Ligand oder Analogen zu dem Liganden in konjugierter Form üblicherweise größer als diejenige Menge, die imstande ist, mit der verbleibenden nichtgebundenen Menge an spezifischem Bindungspart ner während der Zeit Bindungen einzugehen, die das flüssige Medium und das Konjugat in Berührung stehen, vor der vollständigen Bestimmung einer Änderung der Aktivität des konjugierten Modulators.

Heterogene Arbeitsweise

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Ein Enzymmodulator kann auch als Markierungssubstanz angewandt werden bei üblichen heterogenen Bestimmungsverfahren, bei denen die gebundene und freie Form des markierten Bestandteils getrennt werden und die Menge der Markierungssubstanz in der einen und/oder anderen Form bestimmt wird. Die Reagentier, zur Durchführung eines derartigen heterogenen Bestimmungsverfahi-ens können verschiedene Formen haben. Im allgemeinen umfassen derartige Reagentien drei Grundbestandteile und zwar 1. den nachzuweisenden Liganden, 2. einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und 3. einen markierten Bestandteil, der üblicherweise eine markierte Form a) des Liganden, b) eines spezifischen Bindungsanalogen zu dem Liganden oder c) des spezifischen Bindungspartners ist Die Bestandteile der Bindungsreaktion werden gleichzeitig oder nacheinander zusammengebracht und es werden angemessene Inkubationszeiten eingehalten, wobei der markierte Bestandteil an die entsprechenden konkurrierenden Bindungspartner gebunden wird, so daß das Ausmaß der Bindung, d. h. das Verhältnis der Menge an markiertem Bestandteil, der an den Bindungspartner gebunden ist, zu dem nichtgebundenen, eine Funktion der vorhandenen Ligandenmenge ist Im folgenden wird eine kurze Beschreibung einiger unterschiedlicher heterogener Bindungsschemata angegeben, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandt werden können.

In den folgenden Diagrammen werden die folgenden Symbole und Abkürzungen verwendet:

Symbol Definition

L nachzuweisender Ligand

(L, Ligand oder spezifisch bindendes Analoges dazu

B Bindungspartner für den Liganden

* Markierungssubstanz, d. h. Enzymmodulator

J- unlösliche Phase

— Inkubationszeit

(lim) limitiert; in einer Menge vorhanden, die geringer ist als diejenige, die von den gesamten bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während der angewandten Inkubationszeit gebunden werden kann, d. h. der Bestandteil, um den die anderen Bestandteile in Konkurrenz treten, um mit ihm Bindungen einzugehen

(exe) Überschuß; in einer Menge vorhanden, die größer ist als diejenige, die imstande ist, von den gesamt-verfügbaren bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während der angewandten Inkubationszeit gebunden zu werden

(sep) Trennung der gebundenen von der freien Phase

1. Schemata für heterogene Bestimmungen durch
Konkurrenzbindungsreaktionen

(a) L+ (L)' + B(Hm)-

L * ein kleines adsorbierendes Molekül ist, mit Dextran überzogene Aktivkohle. Ähnliche Systeme sind beschrieben in Biochem. J. 88, 137 (1963) und US-PS 38 39 153.

(b) L + £>* +HB(Km)- (sep)

Diese Reaktion wird allgemein als Festphasen-Verfahren (solid-phase technique) bezeichnet Die Beschreibung ähnlicher radioimmunologischer oder enzymatischer immunologischer Bestimmungsverfahren findet sich in US-PS 3505 019, 3555143, 36 46 346 und 36 54 090.

(sep)

+ unlöslich machendes
Mittel für B oder (E) * (sep)

Das ist das klassische Schema einer Konkurrenzbindungsreaktion. Beispiele für die unlöslich machenden Mittel sind spezifische ausfällende Antikörper, spezifische unlöslich gemachte Antikörper und, wenn B oder L * ein proteinartiges Material ist, proteinausfällende Substanzen, wie Ammoniumsulfat, oder wenn B oder

(c) L+ B· D()
(US-PS 36 54 090)

(d) L + h C + B * (lim)
(US-PS 38 50 752).

(sep)

2. Heterogene aufeinanderfolgende
Sättigungsverfahren

(a) L+ B(e--c)- + (E)* (exe)- +unlöslich

machendes Mittel für B oder (E)* (sep)

Bei dem aufeinanderfolgenden Sättigungsverfahren

(sequential saturation technique) werden einige oder alle bindenden Stellen von B, die nach der ersten Inkubationszeit noch verbleiben, durch den markierten Bestandteil gebunden.

(b) L + H B(exe)- + (D*(exe)- (sep)

Beschreibungen ähnlicher radioimmunologischer und enzymatisch immunologischer Bestimmungsverfahren finden sich in US-PS 37 10 760 und J. Immunol. 209,129 (1972).

3. Heterogene »Sandwich«-Verfahren
L + J- B (exe) - B * (exe) - (sep)

Bei dem »Sandwich«-Verfahren werden einige oder alle Ligandenmoleküle an den unlöslich gemachten Bindungspartner von dem markierten Bestandteil gebunden (US-PS 37 20 760).

4. Festphasen-Liganden-Adsorptions-Verfahren
L + (E)* +H(nichtspezifisch)- + B (lim)-(sep)

Bei diesem Verfahren werden der Ligand und der markierte Bestandteil an eine nicht-spezifische Substanz gebunden und anschließend proportionale Mengen durch Bindung mit einem Bindungspartner mit einer größeren Affinität, als sie der Bindungspartner für den Liganden zu dem markierten Bestandteil hat, abgespalten.

Bei diesem Verfahren kann eine Säule eines nicht-spezifischen bindenden Mittels angewandt werden (US-PS 36 59104). Ein solches Verfahren ist geeignet, wenn der Ligand in der Probe an endogene bindende Substanzen gebunden ist, die, wenn sie nicht entfernt werden, bei der Konkurrenz-Bindungsreaktion stören würden. Nach der Bindung an das nicht-spezifische Bindungsmittel können die endogenen bindenden Substanzen durch entsprechendes Auswaschen entfernt werden.

Das zu untersuchende flüssige Medium kann eine natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte

_l

flüssigkeit sein, von der angenommen wird, daß sie den Ligaaden enthält, und ist üblicherweise eine Körperflüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die bei der Verdünnung oder sonstigen Befaandlurg einer biologischen Flüssigkeit entsteht Biologische Flüssigkeiten, die erfindungsgemäß untersucht werden können, sind u.a. Serum, Plasma, Urin, amnioüsche. Cerebral- und Spinalflüssigkeiten. Andere Substanzen, wie Feststoffe, z. B. Gewebe, oder Gase können ebenfalls untersucht werden, wenn sie z. B. durch Lösen des Feststoffs oder Gases in einer Flüssigkeit oder durch Flüssigkeitsextraktion des Feststoffes in eine flüssige Form gebracht werden können.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Herstellung der Materialien A. Carbonsäureanbydrase

Das Enzym wurde aus menschlichen roten Blutkörperchen isoliert, entsprechend dem Verfahren von Armstrong et al, J. BioL Chem. Bd. 241, S. 5137-5149 (1966) mit der Ausnahme, daß die Dialyse vor der Ausfällung mit Ammoniumsulfat weggelassen wurde. Der Niederschlag wurde in 0,05 m Tris-(hydroxymethyO-aminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl> Puffer, pH 8,7. gelöst und über eine 2^ χ 55-cm-Säule, die mit DEAE-Cellulose beschickt und mit dem gleichen Puffer äquilfbriert war, chromatographiert Das Enzym wurde in einer Fraktion mit dem Tris-HCl-Puffer eluiert

B. S

valcriansäiircamid

HN NH

O N N

N S SO_:NH,
H

Biotin-Modulator-Konjugal

Eine Lösung von 300 mg (1,2 mMol) wasserfreiem Biotin in 19,5 ml trockenem Dimethylformamid wurde bei -10° C unter trockenem Stickstoff gerührt und 0,17 ml (1,2 mMol) trockenes Triäthylamin zugegeben « (Knappe et aU Biochem. Z. 338, S. 599 [1963]). Eine Lösung von 0,141 ml frisch destilliertem Äthylchlorformiat in 3 ml trockenem Diäthyläther wurde zugetropft, wobei ein weißer Niederschlag entstand. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -1O⁰C gerührt und dann unter 4<i Stickstoffatmosphäre filtriert. Das Filtrat wurde sofort auf -1O⁰C gekühlt und eine Lösung von 438 mg (2,43 mMol) 2-Amino-l,3,4-thisuiazol-5-sulfonamid (R ο b 1 i η et al., ]. Am. Chem. Soc. Bd. 72, S. 4890-4892 [1950]) in 3 ml trockenem Pyridin zugegeben. Die 4i entstehende Lösung wurde 15 Minuten bei -10° C und anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden bei 40⁰C unter Vakuum abgedampft, wobei ein öliger Rückstand verblieb. Das öl wurde bei 0⁰C mit 50 ml 03 η Salzsäure gerührt. Der entstehende weiße Feststoff (400 mg) wurde abfiltriert und in 10Gew.-% Natriumbicarbonatlösung gelöst. Diese Lösung wurde im Eisbad gekühlt und mit konz. Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht. Der entstehende beige-farbene Niederschlag wurde abfiltriert. Man erhielt 130 mg (Fp 254⁰C, Zers.). Beim Umkristallisieren aus Methanol erhielt man 60 mg eines weißen Produktes (Fp 262 - 263⁰C, Zers.). Analyse für Ci₂H₁₈N₆O₄S₃:

Berechnet: C 35,46; H 4,46; N 20,67; gefunden: C 35,62; H 4,47; N 20,55.

C. 6-(2,4-Oinitroanilino)-N-(i»-siilfonamid-I,3.4-thiadiazo-2-yl)capronsäurcamid

O,N

NO

H S S(XNH₂

DNP-Modulalor-Konjugat

Eine Lösung von 357 mg (1,2 mMol) wasserfreiem 6-(2,4-Dinitroanalino)-capronsäure (Garkusha et al., Obshchei Khim Bd. 29, S. 1554-1558 [1959]) wurde in das gemischte Anhydrid umgewandelt nach der stufenweisen Zugabe von Triethylamin und Äthylchlorformiat, wie unter B angegeben. Das Filtrat wurde sofort auf - 10⁰C abgekühlt und das Produkt bei -10° mit einer Lösung von 438 mg (2.43 mMol) 2-Aminol,3,4-thiadiazol-5-sulfonamid (wie unter B beschrieben erhalten) in 3 ml trockenem Pyridin vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei 0⁰C gerührt und dann die Lösungsmittel bei 30°C unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde 1 Stunde bei 0⁰C mit 100 ml 1,5 η Salzsäure gerührt und der entstehende gelbe Niederschlag abfiltriert und 1 Stunde bei 0°C mit 100 ml 10gew.-%iger Natriumhydroxidlösung gerührt.

909 642/38b

Der gelbe Feststoff wurde abfiltriert und aus wäßrigem Methanol umkristallisiert Man erhielt 50 mg eines selben Feststoffes. Ausbeute 9%: Fp. 229-233°C Analyse für Ci₄Hi₇N₇Oa:

Berechnet: C 36,60: H 3.73;

gefunden: C 37,07; H 3^6; N 21,19.

D. Reagens-Lösungen

(1) Acetazolamin-Reagens: 1,6 mg 2-AcetylamimolA4-thiadiazol-5-suIfonamid wurden in einigen Tropfen Dimethylsulfoxid gelöst und mit Wasser auf 50 ml verdünnt Weitere Verdünnungen wurden mit Wasser vorgenommen.

(2) Biotin- und DNP-Modulator-Reagentien: Das Biotin-Modulator-Konjugat (2,0 mg) und das DlWP- r> Modulator-Konjugat (1,7 mg) vnirden jeweils in 10 ml 0,1 m Natriumcarbonatpuffer, pH 3'9,5, verdünnt Weitere Verdünnungen wurden imit Wasser vorgenommen.

(3) Avidin-Reagens: Lyophilisiertes Avidin (Sigma Chemical Co, St Louis, Missouri) wurde in 10 mMol Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, in einer Konzentration von 10,5 Aktivitätseinheiten/ml (eine Einheit ist die Menge, die imstande ist ein μg Biotin zu binden) gelöst

(4) Antikörper zu Dinitrophenyl-(DNP)-Reagens: Antisera, die gegen DNP gebildet worden waren, wurden bei 4° C über eine 5 χ 70-cm-Säule mit Sephadex G-200 (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) mit 0,1 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,2, enthaltend 1 m Natriumchlorid chromatographiert Der zweite eluierte Anteil, der durch die optische Dichte bei 280 nm bestimmt wurde, enthielt die Antikörper-Aktivität gegen DNP.

(5) p-Nitrophenyl-acetat-Reagens: 5 mg p-Nitrophenyl-acetat in 0,3 ml Aceton wurden mit destilliertem Wasser unter Rühren auf 10 ml gebracht.

Beispiel 2

Esterase-Aktivitäten von Carbonsäure-Anhydrase als Funktion der Acetazolamid-Konzentration

Carbonsäure-Anhydrase (0,013 Internationale Einheiten) wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur in eine Reihe von 0,66 ml wäßrigen Lösungen, enthaltend jeweils μΙ 0,1 m Diäthylmalonsäure-Puffer, pH 7,4, und die in Tabelle 1 angegebenen Mengen Acetazolamid und Avidin inkubiert (Konzentrationen an Acetazolamid und Avidin, bezogen auf 1 ml Endvolumen). 0,3 i ml p-Nitrophenyl-acetat-Reagens wurden zu jeder Lösung gegeben, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erhalsten. Die Hydrolysegeschwindigkeit von p-Nitrophenylacetat wurde durch Beobachtung der Absorption bei nm bestimmt.

Die Ergebnisse, die jeweils das Mittel von 2 Messungen sind, sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Acetazolamid-	Avidin	Hydrolysegeschwin
Konzentration		digkeit
(μΜ)	(Einheiten/ml)	(JOD₃₄₈/min/ml)
0,000	_	0,136
0,144	-	0,088
0,288	-	0,047
0,144	0,105	0,089
0,000	-	0,111
0,000	0,105	0,106

Diese Werte zeigen, daß das Acetazolamid das Enzym Carbonsäure-Anhydrase hemmte und daß das Vorhandensein von Avidin keine deutliche Wirkung auf die Hemmung ausübte.

Beispiel 3 Esterase-Aktivitäten von Carbonsäure-Anhydrase

als Funktion der Biotin-Modulator-Konjugat-Konzentration

Carbonsäure-Anhydrase (0,027 Internationale Einheiten) wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur in eine Reihe von 0,66 ml wäßrigen Lösungen, enthaltend 100 μΐ 0,1 m Diäthylmalonsäure-Puffer, pH 7,4, und die in Tabelle 2 angegebenen Mengen an Biotin-Modulator-Konjugat (hergestellt entsprechend Beispiel IB) inkubiert (Konzentration des Konjugats, bezogen auf 1 ml Endvolumen). Die Esterase-Aktivität, wie sie durch die Hydrolysegeschwindigkeit gemessen wurde, wurde für jedes Reaktionsgemisch wie in Beispiel 2 bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und in graphischer Form in F i g. 1 angegeben.

Tabelle 2

Biotin-Modulator-	Hydrolyse
Konjugat-Konzentration	geschwindigkeit
(μΜ)	(Λ OD34g/min/ml)
0,00	0,136
0,05	0,120
0,10	0,109
0,20	0,103
0,J0	0,071
0,40	0,057
0,50	0,040

Diese Daten zeigen, daß das Biotin-Modulator-Konjugat gute Hemmwirkungen, bezogen auf die Carbonsäure-Anhydrase, besitzt und etwas weniger wirksam ist als der nicht abgeleitete (underivatized) Inhibitor Acetazolamid.

Beispiel 4 Direkte Bindungsbestimmung für Avidin; Konkurrenz-Bindungsbestimmung für Biotin; Anwendung von derivatisiertem Acetazolamid

als Markierungssubstanz

Es wurde eine Reihe von Bindungsreaktionsgemisehen hergestellt, jeweils in einem Volumen von 0,66 ml, enthaltend 100 μΐ 0,1 m Diäthylmalonsäure-Puffer, pH 7,4, und die in Tabelle 3 angegebenen Konzentrationen an Biotin-Modulator-Konjugat (hergestellt entsprechend Beispiel I₁ B), Biotin und Avidin (Konzentrationen bezogen auf 1 ml Endvolumen). Nach 5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,0271. E. Carbonsäure-Anhydrase zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und anschließend weitere 5 Minuten inkubiert.

Dann wurden 0,33 ml p-Nitrophenyl-acetat-Reagens zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und die Hydrolysegeschwindigkeit durch Beobachtung der Absorption bei 348 mn gemessen.

Die Ergebnisse, die jeweils das Mittel aus zwei Messungen darstellen, sind in Tabelle 3 angegeben. Die Ergebnisse der Reaktionsgemische 2 bis 9 sind in graphischer Form in F i g. 2 angegeben.

Die Werte für die Reaktionsgemische 2 bis 9 zeigen die Wirkung verschiedener Gehalte an Avidin auf die Hemmwirkung des Biotin-Modulator-Konjugats auf die Esterase-Aktivitäten von Carbonsäure-Anhydrase. Für einen konstanten Gehalt an Biotin-Modulator-Konjugat ist die enzymatische Hydrolysegeschwindigkeit direkt proportional der vorhandenen Avidinmenge. Die Ergebnisse der Gemische 8,10 und 11 zeigen, daß, wenn Biotin vorhanden ist, die Hydrolysegeschwindigkeit der vorhandenen Menge umgekehrt proportionr¹ ist

Tabelle 3

	Reaktions	Biotin-Modula	Biotin	Avidin	Hydrolyse
	gemisch	tor-Konjugat			geschwindig
		(μΜ)	(μΜ)	(E/ml)	*keit) 25**
X I	1	_		_	0,128
I	2	0,50	-	0,011	0,049
	3	0,50	-	0,026	0,056 so
i	4	0,50	-	0,040	0,066
i	5	0,50	-	0,053	0,075
	6	0,50	-	0,065	0,079
i	7	0,50	-	0,079	0,090
	8	0,50	-	0,105	0,129 35
	9	0,50	-	0,126	0,136
	10	0,50	0,10	0,105	0,104
	11	0,50	0,60	0,105	0,080

Beispiel 5

*) Zunahme der Absorption/min bei 348 nm.

Konkurrenz-Bindungsbestimmung von Dinitrophenyl (DNP)-Derivaten

Anwendung von derivatisiertem Acetazolamid als Markierungssubstanz

Es wurde eine Reihe von Bindungsreaktionsgemischen hergestellt, jeweils in einem Volumen von 0,66 ml und enthaltend 100 μΐ 0,1 m Diäthylmalonsäure-Puffer,

ίο pH 7,4, und die in Tabelle 4 angegebenen Mengen an Acetazolamid, DNP-Modulator (entsprechend Beispiel 1, C hergestellt), N-DNP-6-aminocaproat (Biochem. J. Bd. 42, S. 287 [1948]) und Antikörper zu DNP (die Konzentrationen sind jeweils auf 1 ml Endvolumen

π bezogen). Nach 5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,03 L E. Carbonsäure-Anhydrase zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und anschließend 5 Minuten inkubiert Dann wurden 0,33 ml p-Nitrophenyl-acetat-Reagens zugegeben und die Hy drolysegeschwjndigkeit gemessen durch Beobachtung der Absorption bei 348 nm.

Die Ergebnisse, die das Mittel aus zwei Messungen darstellen, sind in Tabelle 4 angegeben. Ein Vergleich der Ergebnisse bei den Reaktionsgemischen 1, 3 und 5 zeigt, daß Acetazolamid die Carbonsäure-Anhydrase-Reaktion hemmte und im wesentlichen nicht beeinflußt wurde durch das Vorhandensein von Antikörper zu DNP. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionsgemische 1,2 und 4 zeigt, daß das DNP-Modulator-Konjugat auch die Carbonsäure-Anhydrase-Reaktion hemmte, wobei der Grad der Hemmung bei Vorhandensein von Antikörper zu DNP abnahm. Die Ergebnisse des Reaktionsgemisches 6 zeigen, daß das Vorhandensein eines DNP-Derivats keinen deutlichen Einfluß auf die Carbonsäure-Anhydrase-Reaktion ausübt Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionsgemische 2 und 7 zeigt, daß das Vorhandensein des DNP-Derivats bestimmt werden konnte durch Beobachtung der verstärkten Hemmung der Carbonsäure-Anhydrase-

Reaktion durch das DNP-Modulator-Konjugat. Tabelle 4

Reaktions- Acetazolamid DNP-Modula- N-DNP-6-gemisch tor-Konjugat amino-caproat

(μΜ) (μΜ) (μΜ)

Antikörper zu DNP

(μΐ/ml)

Hydrolysegeschwindigkeit*)

1	—	—	-	100	0,153
2	-	0,278	-	100	0,108
3	0,216	-		100	0,091
4	-	0,278	-	-	0,074
5	0,216	-	-	-	0,088
6	-	-	1,8	-	0,154
7	-	0,278	1,8	100	0,098
*) Zunahme	der Absorption/min bei 348 nm.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Spezifisches Bindungsverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Liganden in einem ■> flüssigen Medium, bei dem man das flüssige Medium mit Reagentien zusammenbringt umfassend ein Konjugat aus einer Markierungssubstanz und einer Bindungskomponente unter Bildung eines Reaktionssystems, in dem eine gebundene und eine freie Form des Konjugats vorliegt, und wobei die Menge an Liganden in dem flüssigen Medium bestimmt wird als Funktion der Menge der Markierungssubstanz, die in der gebundenen oder freien Form vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß man als 1; Markierungssubstanz einen reversibel bindenden Enzymmodulator verwendet und ein Enzym zusetzt, dessen Aktivität durch den Modulator beeinflußt wird, und die Menge an Enzymmodulator in der gebundenen oder freien Form als Funktion der Aktivität des Enzyms mißt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die Bindungskonstante für die Assoziation des reversibel bindenden Enzymmodulators mit dem Enzym weniger als ungefähr 10'' m -' beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß die Bindungskonstante für die reversible Bindung zwischen dem Enzymmodulator und dem Enzym ungefähr 10⁵ bis ungefähr 10⁹ m-' beträgt

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß der reversibel bindende Enzymmodulator die Aktivität des Enzyms hemmt

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß der reversibel bindende Enzymmodulator ein kompetitiver Inhibitor für das Enzym ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5. dadurch gekennzeichnet daß man als reversibel bindendien kompetitiven Inhibitor und als Enzym

(a) Acetazolamid oder ein wirksames Analoges davon und Carbonsäure-Anhydrase;

(b) Sulfanilamid oder ein wirksames Analoges davon und Carbonsäure-Anhydrase;

(c) Phenyl-trimethylammonium-ion oder ein wirksames Analoges davon und Acetylcholinesterase;

(d) Saccharo-l,4-lacton oder ein wirksames Analoges davon und 0-Glucuronidase;

(e) 4-Amino-lO-methyl-pteroylglutaminsäure oder ein wirksames Analoges davon und Dihydrofolatreduktase oder

(f) 2,6,8-Trichlorpurin oder ein wirksames Analoges davon und Uricase verwendet