DE2754086A1 - Spezifisches bindungsverfahren zum nachweis und zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium - Google Patents

Spezifisches bindungsverfahren zum nachweis und zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium

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DE2754086A1 DE19772754086 DE2754086A DE2754086A1 DE 2754086 A1 DE2754086 A1 DE 2754086A1 DE 19772754086 DE19772754086 DE 19772754086 DE 2754086 A DE2754086 A DE 2754086A DE 2754086 A1 DE2754086 A1 DE 2754086A1
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Description

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. 275A08S
1A-50 012
Patentanmeldung
Anmelder: MILES LABORATORI' S, INC.
Elkhart, Indiana 46514, U.S.A.
Titel: Spezifisches Bim !ungsverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium
COPV
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27540«·
1Α-50 012
Anm.: Miles Lab.
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine spezifische Bindungsbestimmung zum Nachweis bzw. zur Bp Stimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, bei der als Markierungssübstanz ein reversibel bindender Enzymmodulator angewandt wird. Das Verfahren selbst wird durchgeführt: wie übliche spezifische Bindungsbestimmungsverfahren, die homogen oder heterogen sein können, bei denen das zu untersuchende flüssige Medium mit Reagentien zusammengebracht v.ird, die ein markiertes Konjugat umfassen, unter Bildung eines Reaktionssystems, in dem eine gebundene und eine freie Form des Konjugats vorhanden ist. Die Menge an Konjugat in der gebundenen oder in der freien Form ist eine Funktion der in dem zu untersuchenden flüssigen Medium vorhandenen Ligatidenmenge. Erfindungsgemäß umfaßt das markierte Konjugat eiron reversibel bindenden Enzymmodulator, der kovalent an eine Bindungskomponente des Bindungsreaktionssystems gebunden ist. Die Verteilung des Konjugats zwischen der gebundenen Form und der freien Form wird bestimmt durch Zugabe eines Enzyms, dessen Aktivität durch den Modulator beeinflußt utmI zwar entweder verringert oder erhöht wird, und Messung der entstehenden Enzymaktivität. Der Modulator kann ein üblicher Enzyminhibitor (Hemmstoff) sein, vorzugsweise ein konkurrieränder oder eine Allosterie bewirkende Substanz (allosterie eCfector).
Die Erfindung betrifft Best.lmmungsverfahren und zwar homogene und heterogene spezifiscUe Bindungsverfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Liganden in einem Medium. Besonders betrifft sie immunologische Konkurrenzbindung sverfahren unter Anwendung nicht isotoper (nicht radio-
aktiver) Markierungen.
Bei einem üblichen Verfahren der spezifischen Bindungsbestimmung wird die zu untersuchende Probe mit Reagentien verschiedener Zusammensetzung - -.anfassend ein Konjugat aus einer Markierungssubstanz, die an eine Bindungskomponente gebunden ist, die mit anderen Bestandteilen (soweit solche vorhanden sind) der Reagensmittel unter Bildung eines Bindungsreaktionssystems reagiert - zusa-nmengebracht, wobei zwei Formen des markierten Konjugats und zwar eine gebundene Form und eine freie Form entsteht. Die relativen Mengen des markierten Konjugats, die in der gebundenen und in der freien Form vorliegen, sind eine Funktion des Vorhandenseins bzw. der Menge des zu bestimmenden Lii-ianden in der zu untersuchenden Probe.
Zur Illustration wird ein übliches Konkurrenz-Bindungsbestimmungsverfahren beschrieben. Bei einem solchen Verfahren umfaßt das Reagensmittel 1.) ein markiertes Konjugat in Form des zu bestimmenden Liganden oder eines entsprechenden Analogen davon, der (das) chemisch an eine Markierungssubstanz gebunden ist, und 2.) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden wie einen Antikörper oder ein anderes Bindungsprotein. Nach Zusammenbringen der zu untersuchenden Probe mit den Reagentien treten der nachzuweisende bzw. zu bestimmende Ligand und das markierte Konjugat in im wesentlichen unterschiedsloser Weise (nondiscriminating) in·Konkurrenz um nicht kovalente Bindung mit dem spezifischen Bindungspartner. Als Folge davon ist die Menge an markiertem Konjugat, die an den Bindungspartner gebunden wird,-d.h. die gebundene Form oder die freibleibende Menge, also die nicht an den Bindungspartner gebundene und daher freie Form-,eine Funktion der vorhandenen Menge des konkurrierenden LigandenJ/wenn das markierte Konjugat in der gebundenen Form und das in der freien Form durch die zur Messung der Markierungssubstanz angewandten Mittel im wesentlichen nicht unterschieden werden können, müssen die gebundene Form und die freie Form physikalisch voneinander getrennt werden,
verfahren wird als "heterogen" bezeichnet. Wenn die gebundene Form und die freie Form des markierten Konjugats unterschieden werden können, kann eine "homogene" Arbeitsweise angewandt und die Trennung vermieden werden.
Die erstentwickelte Form von spezifischen Bindungs-
die
be Stimmungen war radioimmunologj.sche Bestimmung- ., bei der ein radioaktives Isotop als Markierungssubstanz angewandt wird. Bei einer derartigen Bestimmung muß notwendiger Weise eine heterogene Arbeitsweise angewandt werden. Aufgrund der Gefährlichkeit und schwierigen Handhabung von radioaktiven Substanzen sind verschiedene neue Bestimmungssysteme entwickelt worden, bei denen andere Substanzen als (radioaktive) Isotope zur Markierung angewandt werden, wie Enzyme, fluoreszierende Moleküle, Bacteriophagen, Coenzym« und lumineszierende Moleküle.
Verschiedene heterogene Bindungsreaktionssysteme, bei denen ein Enzym als Markierungssubstanz angewandt wird, sind angegeben in den US-PS 3 654 909, 3 791 932, 3 839 153, 3 850 752 und 3 879 262, J. Immunol. Methods Bd. 1, S. 247 (1972) und J. Immunol. Bd. 109, S. 129 (1972). Eine heterogene Bindungsbestimmung unter Anwendung einer nicht aktiven Vorstufe einer spektrophotometrisch nachweisbaren Substanz zur Markierung ist in der US-PS 3 880 934 angegeben. Von weiterem Interesse bezüglich des Hintergrunds heterogener Bestimmungen ist Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Odell und Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972). Eine immunologische Bestimmung der homogenen Art unter Verwendung einer Enzymmarkierung ist in der US-PS 3 817 834 beschrieben, bei der ein Ligand-Enzym-Konjugat angewandt wird. Die Enzymaktivität des Kon^ugats in der gebundenen Form ist weniger gut meßbar als in der freien Form, wodurch eine homogene Arbeitsweise angewandt werden kann. Die Anwendung besonderer einzigartiger Substanzenzur Markierung, wie von Coenzymen, lumineszierenden Molekülen und abspaltbaren fluoreszierenden Substra-
2754Q88
Es ist Hauptaufgabe der voi :.legenden Erfindung, ein spezifisches ßindungsverfahren zu entwickeln, das sowohl für homogene als auch für heterogene Arbeitsweisen geeignet ist, bei dem eine einzigartige I-iarkiei < mgs substanz angewandt wird, die zu einer großen Verbindungskj isse gehört, für die ausgiebige Literatur vorliegt, um di .; Ausv/ahl spezieller Markierungen, die Entwicklung geeigiriter Derivate und die Überwachung von Reaktionen zu erleichtern.
Die Erfindung betrifft eim spezifische Bindungsbestimmung, bei der als Markierungi mbstanz ein reversibel bindender Enzymmodulator angewandt \ i.rd. Die erfindungsgemäße Markierungssubstanz kann sowohl i ;ir homogene als auch für heterogene Arbeitsweisen angewandt werden, wobei das auf einen Liganden zu untersuchende flüssig'.5 Medium mit dem Reaktionsmittel zusammengebracht wird, um."1 issend ein markiertes Konjugat, wobei ein Bindungsreaktionsr/stern entsteht, in dem die gebundene Form und die freie Fon> des Konjugats vorhanden ist. Die Menge an Konjugat, die in gel · indener oder in freier Form vorliegt, ist eine Funktion des Vorhandenseins oder der Menge des Liganden in dem zu untersuche aden flüssigen Medium. Erfindungsgemäß umfaßt das markierte 1 onjugat einen reversibel bindenden Enzymmodulator,der kovaler.t an eine Bindungskomponente des Bindungsreaktionssystems gebunden ist. Die Verteilung des Konjugats zwischen der gebundenem und freien Form wird bestimmt durch Zugabe eines Enzyms, dessen Aktivität beeinflußt wird entweder in Form einer Hemmung O'Mr^Sximulierung durch den Modulator, und Messung der sich ergeb"uden Enzymaktivität unter Anwendung einer homogenen oder heterogenen Arbeitsweise.
Bei den beiliegenden Figur· u ist
Fig. 1 eine Kurve, die die Hemmw.i rkung verschiedener Konzentrationen von Biotin-Modulator-Konjugat auf die Esteraseaktivität von Carbonsäureanhydrase zeigt, 'ie sie durch die Hydrolysegeschwindigkeit gemessen wird, ujii
ORIGINAL COPY
9 2754Q88
Fig. 2 eine Kurve, die die Wirkuiwj verschiedener KonzentrationenAvidin auf die Hemmwirkuni, von Biotin-Modulator-Konjugat auf die Esteraseaktivit«·:; von Carbonsäureanhydrase zeigt, wie sie durch die Hydroly. ^geschwindigkeit gemessen wird.
In dieser Beschreibung habi α die folgenden Ausdrücke die angegebene Bedeutung: "Ligam." ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorbandensein oder Menge in einem flüssigen Medium bestimmt v;rden soll; "spezifischer Bindungspartner für den Liganden" ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die fine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt; "spezifisches Bindui>i$sanaloges des Liganden" ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich im wesentlichen in Beziehung auf lie Bindungsaffinität zu dem spezifischen Bindungspartner für den Liganden wie der Ligand selbst verhält; und "Nachvjisreaktion (monitoring reaction)" ist eine Reaktion, die dm-oh ein Enzym katalysiert wird, dessen Aktivität durch den arfindungsgemäß verwendeten Enzymmodulator beeinflußt, d.h. V3rringert oder erhöht, wird.
Die erfindungsgemäß angewandte neue Markierungssubstanz kann irgendeine chemische Substanz sein, die sich spezifisch oder nicht spezifisch in reversibler nicht kovalenter Weise mit einem Enzym verbindet und dadurch in meßbarer Weise,entweder durch Hemmung oder Stimulierung, die katalytische Aktivität des Enzyms in einer vorbestimmten Reaktion, d.h. der Nachweisreaktion für das Bindungr- system, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entsteht, beeinflußt. Unter "reversibel bindend" ist gemeint, daß die Bi;<lungskonstante für die Verbindung (Assoziation) des Enzymmodulators mit dem Enzym, das
11 die Nachweisreaktion katalysiert, veniger als ungefähr 10 m
beträgt. Vorzugsweise liegt die >lindungskonstante zwischen ungefähr 105 und ungefähr 10^ m~1.
BAD GP'·"
275408$
Eine Gruppe von Substanzen, die erfindungsgemäß anwendbare Enzymmodulatoren umfaßt, isi die Gruppe von reversibel bindenden Enzyminhibitoren (Hemm: hoffen), unabhängig davon, ob sie konkurrierend oder nicht— konkurrieren! (competitive, uncompetitive or noncompetetive) >ind. Konkurrierende Inhibitoren verbinden sich mit dem f re;" an Enzym auf eine solche Weise, daß sie mit dem normalen .'abstrat um die Bindung an den aktiven Stellen des Enzyms in Konkurrenz treten, wobei das Inhibitormolekül jedoch durcl· das Enzym nicht chemisch umgewandelt wird. Im Gegensatz drcu verbinden sich unkompetitive Inhibitoren nicht mit dem frrien Enzym oder beeinflussen dessen Verbindung mit dem normal*· > ι Substrat nicht, sondern sie verbinden sich mit dem entstehend-m Enzym-Substrat-Komplex und ergeben ein inaktives Addukte das nicht imstande ist, das normale Produkt freizusetzen. Nicht*-kompetitive Inhibitoren können sich sowohl mit dem freien Enzym als auch mit dem Enzym-Substrat-Komplex verbinden vond die normale Katalyse stören üblicherweise durch Bindi'ug an eine andere Stelle des Enzyms als die aktive Stelle, wodurch sie die empfindliche Konfiguration des aktiven Enzyms ändern.
Von den üblichen Enzyminhibitoren sind die kompetitiven bevorzugt. Im folgenden ist eine Tabelle von geeigneten kompetitiven Inhibitoren, den Enrymen, deren Aktivität duKh sie gehemmt wird, und ein ungefährer Wert für die Inhibitionskonstanten (K. ) für die Dissoziation der betreffenden Inhibitoren von den Enzymen angegeben.
Inhibitor .;Jnzym K1 (m)
Acetazolamid ^arbonsäure-anhydrase 6x10
Sulfanilamid Carbonsäure-anhydrase 10
Phenyl—trimethyl-ammoniura-ion Acetylcholin-esterase 10~ Saccharo-1,4-lacton ß-Glucuronidase 10~
4-Amino-IO-methyl-pteroyl- Dihydrofolat-reduktase 10 ^ glutaminsäure
2,6,8-Trichlorpurin Uricase 10~
Es können auch wirksame Analoge, d.h. Derivate, Homologe usw., der oben angegebenen Inhibitoren angewandt werden. Zum Beispiel wird Acetylcholinest'rase auch durch p-Aminophenyl-trimethylamiQoniumion und durch den N-Methyl-N-(paminophenyl)-carbamatester von m-'.Trimethylamino)-phenol gehemmt.
Eine andere Gruppe von Substanzen, aus der geeignete Enzymmodulatoren ausgewählt werden können, sind aie allosterischen Effektoren. Derartige Substanzen wirken bei biologischen Prozessen als Regulatoren ö"S enzymatischen Metabolismus. Ihre Wirkung wird erreicht durch . pezifische Bindung an eine andere Stelle des Enzyms als die '.(Ar das Substrat aktive Stelle, wodurch die Aktivität des Enzyms gehemmt oder stimuliert wird, z.B. durch eine Konfcrmationsänderung. Im folgenden ist eine Tabelle von einigen·allenterischen Effektoren angegeben, die erfindungsgemäß als En/ymmodulatoren angewandt werden können. In der Tabelle sind 3'ihibitor oder negative Effektoren gekennzeichnet durch ( ■) und stimulierende oder positive Effektoren durch (+). Dj .· Quelle für das beeinflußte IJnzym ist ebenfalls in Klammern ar;.;egeben.
../Tabelle
TABELLE Allosterischer Effektor
L-Isoleucin (-) L-Valin (+)
Cytosin-triphosphat (CTP)
Adenosin-triphosphat (ATP)(+)
Desoxythymidin-triphosphat (dTTP) (-) Desoxycytosin-triphosphat (dCTP) (+)
ATP(-)
3',5 '-Adenosin-monophosphat
(AMP)(+)
dTTP(-) Deoxycytosin-diphosphat (dCDP(+)
ert-Ketoglutarat(-) Citrat (+)
5'-AMP(+)
L-Threonin(-) L-Isoleucin(+)
L-Methionin(+)
Adenosin-diphosphat (ADP)(+)
L-Valin(-) L-Threonin(-)
Uridin-diphosphat (UDP)-N-Acetyl-glucosamin(-)
Glucose-6-phosphat(+)
ATP(-)
Guanosin-triphosphat (GTP)(-) reduziertes NAD(-) Östrogene(-) Thyroxin(-) ADP(+)
Leucin(+) Methionin(+)
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Enzym
biosynthetische L-Threonindesaminase (E. coli K12)und (Hefe)
Desoxycytidylat-aminohydrolase (Esel-Milz)
Phosphofructokinase (Meerschweinchen-Herz)
Desoxythymidinkinase (E.coli)
Nicotinamid-adenin-dinucleotid-(NAD)-Isocitronensäuredehydrogenase (N. crassa)
NAD-Isocitronensäure-dehydrogenase (Hefe)
Homoserin-dehydrogenase (R. rubrum)
L-Threonin-deaminase (C. tetanomorphum)
Acetolactat-synthetase (E. coli) Threonin-aspartokinase (E. coli)
L-Glutamin-D-fructose-6-phosphat· transaminase (Ratten-Leber)
Glycogen-synthetase (Hefe) und (Lamm-Muskel)
Glutamat-dehydrogenase (Rinder-Leber)
Allosterischer Effektor
ATP(-)
5'-AMP(+)
Cytosin-raonophosnhat (CMP)-N-Acetyl-neuraminsäure(-) L-Threonin(-)
Lr-Lysin(-)
5'-AMP(-)
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Enzym
b (Kaninchen-
Phosphorylase
Muskel)
UDP-N-Acetyl-glucosamin-2-epimerase (Ratten-Leber)
Homoserin-dehydrogenase (E. coli)
Lysin-aspartokinase (E. coli)
Fructose-1,6-diphosphatase (Frosch-Muskel und Ratten-Leber)
Weitere Einzelheiten sind i'.\ J. (1965) angegeben.
Mol Biol. Bd. 12 S. 88
Um das markierte Konjugat borzustellen, das an dem Bindungsreaktionssystem teilnimmt, wird der Enzymmodulator kovalent an eine entsprechende Biudungskomponente eines solchen Reaktionssystems gebunden. Eine reiche Bindungskomponente ist der zu bestimmende Ligand, ein spezifisches Bindungsanaloges des Liganden oder ein spezifischer Bindungspartner zu dem Liganden, je nach dem ausgewählten Bindungsreaktionsschema. Einige der verschiedenen üblichen Bindungsreaktionsschemata werden später näher beschrieben. Das angewandte Verfahren,um den Enzymmodulator und die Bindui'^skomponente kovalent miteinander zu verbinden, ist nicht kritisch, solange die entstehende Enzym-Modulator-Gruppiej'img eine meßbare Menge modulierungsaktivität besitzt und ähi.vLich die entsprechende Gruppierung der Bindungskomponente eine geeignete Menge Aktivität in Beziehung auf das Bindungsreaktionssystem behält. Allgemein werden der Enzymmodulator und die Bindungskomponente direkt oder über eine Brücke mit aktiven Kuppelungsgruppen an entgegengesetzten Seiten, um die entsprechenden zu verbindenden Gruppen kovalent miteinander zu verbinden, aneinander gebunden. Die Brücke enthält üblicherweise 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoff atome oder Heteroatome, wie Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphoratoine usw. Beispiele für Brücken, die ein einzelnes Atom enthalten, sind die Methylengruppe (ein
Cohlenstoffatom in der Kette) um' die Aminogruppe (ein Heteroatom in der Kette). Die Brücke b< litzt üblicherweise ein Molekulargewicht von nicht mehr als Ό00 und vorzugsweise weniger ils 200. Die Brücke, soweit eine solche vorhanden ist, umfaßt iine Kette von Kohlenstoffatomen 'and/oder Heteroatomen und .st an den Enzymmodulator bzw. d.i. 1J Bindungskomponente durch rerbindende Gruppen gebunden, di·· üblicherweise ausgewählt ;ind aus Ester, Amid, Äther, Thiosster, Acetal, Methylen und iminogruppen.
Im folgenden sind Struktur^ormeln für einige infrage ;ommende markierte Konjugate angegeben einschließlich den Lompetitiven Inhibitoren, die οI en als Markierungssubstanzen ingegeben sind,und ein allgemeines Verfahren zu ihrer Herstel-•ung.
A. Konjugate aus AcetazolawLd und Bindungskomponente
N N
H2NO2S^^S^^NHCO(CH2)4 ■Bindungskomponente
H2NO2S-" ^S-^"^NHCO(CH2) NH- Bindungskomponente
In Beispiel 1, B und C sin<i Einzelheiten der Herstelung für derartige Konjugate angegeben.
../11
λ-
AS
275408$
B. Kon jugate aus Phenyl-tr j i;iethylammonium-ion und Bindung skomponente
N0CCH
rCr
NHCO(CH2) 5NH-Bindungskompoi:'2nte
Die interessierende Bindung'.-.komponente wird kovalent an die Aminofunktion einer o-Aminoalkylcarbonsäure gebunden durch eine Reaktion wie eine nucleophile Substitution. Das entstehende Produkt wird dann mit Hilfe eines Aktivierungsmittels, wie Carbodiimid, an p-ADiino-N,N-dimethylanilin gebunden. Das entstehende Produkt vird anschließend mit Methyljodid behandelt, um das gev'inschte Konjugat
NH-f CO (CH2) ?CONH (CH2) 3NH (CH2) 2NHJ^-R
n=l,2 und R= Bindungskomponente
zu erhalten.
Die interessierende Bindungrkomponente wird durch geeignete Mittel (Aktivierung der Carboxylgruppe, nucleophile Substitution) an eine Aminogruppf; von 3»3'-Diaminodipropylamin gebunden. Das entstehende Px->dukt wird dann mit Bern-
und
steinsäureanhydrid behandelt di<> entstehende Substanz an die freie Aminofunktion des N-Methyl-N-(p-aminophenyl)-carbamatesters von m-(Triäthylam.tao)-phenol mit Hilfe eines Carbonsäure-Aktivierungsmittels »sbunden. Wahlweise kann der Inhibitor weiter von dem Liganden angeordnet werden durch Be-
- X-
275A086
handlung des oben angegebenen sue inylierten Derivats mit 3,3'-Diaiainodipropylarain und Carb iiimid und anschließend Bernsteinsäureanhydrid und Kupplung an den Inhibitor (n=2).
C. Konjugat aus Saccharo-1,'-lacton und Bindungskomponente
C-HCOH I R=KCH2),NH(CH2 )T
I o
-(CH2) .-
C— NH— R—NH- Bindungskompone· ■ te
Saccharo-1,4-lacton wird an ein t ' ,^-Diaminoalkylderivat über die freie Carboxylgruppe mit Hilfe eines Carbonsäureaktivierenden Mittels gebunden. C-s entstehende Produkt wird dann an die Bindungskomponente üb r eine geeignete Reaktion, z.B. eine nucleophile Substitution, Carbonsäureaktivierung usw., gebunden.
D. Konjugate aus 4-Amino-1C methylpteroylglutaminsaure und Bindungskoniponente
CONH-CHC'iR
ι ι
NH2
R = -OH oder-NH (CH2) — Biri'Iungskomponente
r Λ0
2754088
Die interessierende Bindung komponente wird durch eine entsprechende Reaktionsfolge an d.i e Aminofunktion eines <*,4A-Diaminoalkylderivats gebunden . Das bei dieser Umsetzung entstehende Produkt wird dann an "ine der Carbonsäurefunktionen von 4-Amino-IO-methyl-pteroyl glutaminsäure mit Hilfe eines entsprechenden Carbonsäure-rktivierenden Mittels, z.B. Carbodiimid, gebunden.
E. Konjugat aus 2,6,8-Trichiorpurin und Bindungskoinponente
_NH(CH2)nNH Bindvugskomponente
η = 1-6
2,6,8-Trichlorpurin wird mit Dihytiropyran und einer katalytischen Menge Säure behandelt unt r Bildung eines in 9-Stellung substituiei'ten Tetrahydi «pyranyläthers. Dieses Produkt wird dann mit einem ctf, O-Dia'.iinoalkan umgesetzt unter Bildung eines an dem CQ-Atom-subr.tituierten Aminoalkylaminderivats. Die Tetrahydropyran/l-blockierende Gruppe wird dann unter sauren Bedingungen entfernt unter Bildung von 2,6-Dichlor-substituiertem Purin. Die interessierende Bindungskomponente wird dann an die freie Alkylaminogruppe mit Hilfe irgendeiner geeigneten Reaktionsfolge gebunden.
Das erfindungsgemäße Bestiimaungsverfahren kann angewandt werden z.B. zur Bestimmung irgendeines Liganden, für den ein spezifischer Bindung.spartner existiert. Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für das ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen existiert oder synthetisiert werden kann. Der Ligand wird üblicherweise ausgewählt aus der Gruppe von Antigenen und deren Hormonen. Vitaminen. Metaboliten und pharmaKolo-
BAD ORIGINAL
gischen Mitteln und deren Rezeptoren und Bindungssubstanzen. Spezifische Beispiele für Liganden, die erfindungsgeniäß nachgewiesen bzw. bestimmt werder können, sind Hormone, wie Insulin, Choriongonadotropin, Thyroxin, Liothyronin und Östriol; Antigene und Haptene, wj-:.· Ferritin, Bradykinin, Prostaglandine und tumorspezifiscUe Antigene; Vitamine, wie Biotin, Vitamin B12, Folsäure, V: kamin E und Ascorbinsäure; Hetaboliten, wie 3',5'-Adenosinmcnophosphat und 3',5'-Guanosinmonophosphat; phamiakologische Mittel, wie Dilantin, Digoxin, Morphin, Digitoxin und barbiturate; Antikörper, wie mikrosome Antikörper und Antikörper gegen Hepatitis und Allergene; und spezifisch bindende Rezeptoren, wie Thyroxin-bindendes Globulin, Avid in, Intrinsikfaktor und Transcobalamin.
Wie oben gesagt, kann das c rf indungsgeinäße Verfahren unter entsprechenden Bedingungen sowohl für eine homogene als auch für eine heterogene Arbeitsweise angewandt werden.
Homogene Arbeitsweise
Eine homogene Arbeitsweise, d.h. eine solche, bei der keine physikalische Trennung der gebundenen von der freien Form erforderlich ist, ist möglich, wenn die Reaktion zwischen der Bindungskomponente des markierten Konjugats und einem entsprechenden Bindung spar bier zu einer meßbaren Änderung, entweder einer positiven ο ι·ϊγ negativen Änderung4 der Fähigkeit des konjugierten Enzymeodulators die Aktivität des die Nachweisreaktion katalysierenden Enzyms führt. In einem solchen Falle kann die Verteilung des Enzymmodulators zwischen der gebundenen und der frei an Form bestimmt werden durch direkte Zugabe des Enzyms zu dem Gemisch aus beiden Formen und Messung der Enzymaktivität. b;s sind verschiedene Arbeitsweisen zur Durchführung einer homogenen Bestimmung möglich, wobei die direkte Bindung und die Konkurrenzbindung bzw. kompetitive Bindung bevorzugt sind. , "*"*
/ig 2754088
Bei der direkten Bindung wird ein Medium, in dem der Ligand vermutet wird, mit einem fc-^njugat zusammengebracht, umfassend den Enzymmodulator, der an einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden i.ebunden ist}und die Änderung der Aktivität des Enzymmodul·'ι tors bestimmt. Bei der Konkurrenzbindung wird das flüssige Medium mit einem spezifischen Bindungspartner für den IJ.ganden und mit einem Konjugat zusammengebracht, umfassend den Enzymmodulator, der an den Liganden und/oder ein spezifisches Bindungsanaloges davon gebunden istj und anschließend die Änderung der Aktivität des Enzymmodulators, bestimmt. Bei beiden Arbeitsweisen wird die Aktivität der Enzymmodulators bestimmt, indem man das flüssige Medium mit mindestens einem Reagens zusammenbringt, das mit dem Enzyny'Odulator die vorausbestimmte Nachweisreaktion eingeht. Der qualitative Nachweis eines Liganden in dem flüssigen Medium umfaßt einen Vergleich einer Charakteristik üblicherweise der Geschwindigkeit der entstehenden Nachweisreaktion mit derjenigen in einem flüssigen Medium, das keinen Liganden enthält, wobei ein auftretender Unterschied ein Zeichen füv eine Aktivitätsänderung des Enzymmodulators ist. Bei der quantitativen Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium vird eine Eigenschaft der entstehenden Reaktion mit derjenigen einer Nachweisreaktion in flüssigen Medien, die bekannte Mengen des Liganden enthalten, verglichen.
Allgemein können bei einer homogenen Arbeitsv/eise die Komponenten der spezifischen Bincuingsreaktion —d.h. das flüssige Medium, in dem der Ligar.··· vermutet wird, das Konjugat und/oder ein spezifischer Bindung'.partner für den Liganden-in jeder beliebigen Menge, Weise und Reihenfolge zusammengebracht werden, vorausgesetzt, daß die Aktivität des Enzymmodulators in dem Konjugat meßbar verändert vrird, wenn die Flüssigkeit den Liganden in einer Menge oder Konzentration enthält, die für die Bestimmungszwecke von Bedeutung ist. Vorzugsweise sind alle Bestandteile der speziiIschen Bindungsreaktion in dem
Wenn eine Arbeitsweise unte* Ausnutzung einer direkten homogenen Bindung angewandt wird, sind die Komponenten der
Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet v/i rd, und eine Menge eines K-njugats aus dem Enzymmodulator und einem spezifischen .'indungspartner für den
Liganden. Die Aktivität' des konjugierten Modulators ändert
sich bei Berührung mit dem flüssigen Medium, umgekehrt
proportional zu dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner in dem Konjugat. So nimmt mit zur·.ahmender Menge des Liganden in dem flüssigen Medium die Akti\ ; tat des konjugierten Modulators ab.
Wenn ein Konkurrenzbindungf erfahren angewandt wird,
sind die Komponenten der Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, 'ine Menge eines Konjugats
aus dein Enzynunodulator, der an der Liganden gekuppelt ist
oder einem spezifischen Bindungsanalogen zu dem Ligandenj und eine Menge eines spezifischen Bin■ ungspartners zu dem Liganden. Der spezifische Bindungspartner ν i.rd im wesentlichen gleichzeitig mit dem Konjugat und dem i Lüssigen Medium zusammengebracht. Da etwaiger vorhandener L,i.gand in dem flüssigen Medium mit dem Liganden oder spezifischen Bindungsanalogen davon in dem Konjugat um die Bindung mit Cam spezifischen Bindungspartner in Konkurrenz tritt, ändert sich die Aktivität des
konjugierten Modulators bei Berüi^ung mit dem flüssigen Medium direkt mit dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner. Daher nimmt mit zunehmender Menge des ] i.ganden in dem flüssigen
Medium die Aktivität des konjugif i>ten Modulators zu.
Eine Variation des homogenen Konkurrenzbindungsverfahren ist die homogene Verdrängungsrealt tion, bei der das Konjugat
zunächst mit dem spezifischen Biiiiungspartner für den Liganden und anschließend mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird.
•yf-21 275A086
Dabei tritt dann eine Konkurrenz im den spezifischen Bindungspartner ein. Bei einem derartiger- Verfahren ist die Menge an Konjugat, die mit dem spezifisch« α Bindungspartner zusammengebracht wird, üblicherweise so, 'laß sie den Liganden oder dessen Analoges in einem überschuh gegenüber der Menge enthält, die imstande ist, mit der vorhancinen Menge an spezifischem Bindungspartner während der Zeit. Bindungen einzugehen, die das Konjugat und der spezifische bindungspartner vor der Berührung mit der flüssigen Probe, j.n der der Ligand vermutet wird, in. Berührung ist. Diese Reihenfolge des Kontaktes kann auf zwei bequeme Arten erreicht v-irden. Bei einer Art wird das Konjugat mit dem spezifischen Bindungspartner in einem
<^unf zwar flüssigen Medium zusanuaengebracm:\ vor dem Kontakt mit dem flüssigen Medium, in dem der Ligcud vermutet wird. Bei der zweiten Art wird das flüssige Mec' Lum, in dem der Ligand vermutet wird, mit einem Komplex zur unmengebracht aus dem Konjugat und dem spezifischen Bindung f. j »artner, wobei die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat und der spezifische Bindungspartner aneinander gebunden ;;ind. Die Menge an Konjugat, die an den spezifischen Bindungspf-rtner bei dem ersten Verfahren gebunden wird oder die bei. dem zweiten Verfahren in Komplexform vorliegt, ist übliche Λ/eise größer als diejenige, die von dem gesamten Liganden in -lern flüssigen Medium in der Zeit verdrängt werden kann, die cir spezifische Bindungspartner oder Komplex und das Medj'im in Berührung stehen, bevor eine etwaigo Änderung der AktiviH it des konjugierten Modulators vollständig bestimmt wird.
Eine andere Variation des homogenen Konkurrenzbindungsverfahrens ist ein aufeinanderfolgendes Sättigungsverfahren (sequential saturation homogeneov ; technique), bei dem die Bestandteile der spezifischen Bindnagsreaktion die gleichen sind, wie sie für das Konkurrenz!· Lndungs verfahr en angewandt werden, aber die Reihenfolge der Zugabe oder Kombination der Bestandteile und die relativen Meugen, die angewandt werden, unterschiedlich sind. Bei dem au:· ϊ inande rf olgenden Sättigungs-
2754Q86
jrfahren wird der spezifische Bii'dungspartnerfür den Ligan-3n mit dem flüssigen Medium, in '.'em der Ligand vermutet Lrd, eine zeitlang zusammengebracht, bevor das flüssige ädium mit dem Konjugat zusammengebracht wird. Die Menge an pezifischem Bindungspartner, die mit dem flüssigen Medium jsammengebracht wird, ist üblicherweise größer als die Menge, ie imstande istjinit dem gesamten Liganden,der in dem flüsigen Medium vermutet wird, in de" Zeit Bindungen einzugehen, ie der spezifische Bindungspartn ;r und das flüssige Medium ti Berührung stehen, bevor das flüssige Medium mit dem onjugat zusammengebracht wird. I -(rner ist die Menge an Ligand
, oder Analogen zu dem Ligander in konjugierter Form übicherweise größer als diejenige Ienge, die imstande ist.mit er verbleibenden nicht—gebundene α Menge an spezifischem Binungspartner während der Zeit Bindungen einzugehen, die das lüssige Medium und das Konjugat .n Berührung stehen, vor der ollständigen Bestimmung einer ßa derung der Aktivität des onjugierten Modulators.
eterogene Arbeitsweise
Ein Enzymmodulator kann audi als Mark ie rungs sub stanz ngewandt werden bei üblichen heterogenen Bestimmungsverfahren, pe! denen die gebundene und frei« Form des markierten Bestandteils getrennt werden und die Men.-je der Markierungssubstanz in ^er einen und/oder anderen Form ι '»stimmt wird. Die Reagentien ;ur Durchführung eines derartige: heterogenen Bestimmungsrerfahrens können verschiedene Firmen haben. Im allgemeinen unfassen derartige Reagentien dr·! Grundbestandteile und zwar I. den nachzuweisenden Liganden, I. einen spezifischen Binlungspartnerfür den Liganden und 3. einen markierten Bestand- ;eil, der üblicherweise eine markierte Form a) des Liganden, 3) eines spezifischen Bindungsannlogen zu dem Liganden oder ;) des spezifischen Bindungspartners ist. Die Bestandteile der 3indungsreaktion werden gleichzeitig oder nacheinander zu-
und es werden an,- emessene Inkubationszeiten
COPY
S3 275408$
eingehalten, wobei der markierte Y-.istandteil an die entsprechenden konkurrierenden Bindungsp.^tner gebunden wird, sodaß das Ausmaß der Bindung, d.h. das Verhältnis der Menge an markiertem Bestandteil, der an den B.iudungspartner gebunden ist, zu dem nicht gebundenen, eine Fun) eion der vorhandenen Ligandenmenge ist. Im folgenden wird e.i.ie kurze Beschreibung einiger unterschiedlicher heterogener iindungsschemata angegeben, die zur Durchführung des erfindunj.sgemäßen Verfahrens angewandt werden können.
In den folgenden Diagrammen ./erden die folgenden Sympole und Abkürzungen verwendet:
../2O
2 If
1A-50 012
Symbol Definition
L
©
nachzuweisender Ligand
Ligand oder spezifisch bindendes Analoges dazu
Biddungspartner für den Liganden
Markierungssubstanz, d.h. Enzymmodulator
unlösliche Phase
Inkubationszeit
(lim) (exe)
(sep) limitiert; in einer Menge vorhanden, die geringer ist als diejenige, die von den gesamten bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während der angewandten Inkubationszeit gebunden werden kann, d.h. der Bestandteil, um den die anderen Bestandteile in Konkurrenz treten, um mit ihm Bindungen einzugehen
Überschuß; in einer Menge vorhanden, die größer ist als diejenige, die imstande ist, von den gesamt-verfügbaren bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während der angewandten Inkubationszeit gebunden zu werden
Trennung der gebundenen von der freien Phase
- 21 -
1. Schemata für heterogene Bestimmungen durch Konkurrenzbindungsreaktionen
(a) L +© + B(lim) ^ + unlöslich machende
Mittel für B oder
Das ist das klassische Chema einer Konkurrenzbindungsreaktion. Beispiele für die unlöslich machenden Mittel sind spezifische ausfällende Antikörper, spezifische unlöslich gemachte Antikörper und, wenn B oder L ein proteinartiges Material iat, proteinausfällende Substanzen, wie Ammoniumsulfat, oder wenn B oder L ein kleines adsorbierbares Molekül ist, mit Dextran überzogene Aktivkohle. Ähnliche Systeme sind beschrieben in Biochem. J. 88, 137. (1963) und US-PS 3 839 153.
(b) L +© * + I-B(lim) ^ (sep)
Diese Reaktion wird allgemein als Festphasen-Verfahren (solid-phase technique) bezeichnet. Die Beschreibung ähnlicher radioimmunologischer oder anzymatischer immunologischer Bestimmungsverfahren findet sich in US-PS 3 505 019, 3 555 H3, 3 646 346 und 3 654 090.
(c) L + B* + f-@ (lim) > (sep)
(US-PS 3 fc>54 090)
(d) L + |-(l) + B (lim) ) (sep)
(US-PS 3 850 752).
- 22 -
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ϋ. Heterogene aufeinanderfolgende Sättigunf<sverfahren
(a) L + B(exc) ^ + (l) (exc) >+ unlöslich ma
chendes Mitte^ für B oder^L) (sep)
Bei dem aufeinanderfolgenden Sättigungsverfahren (sequential ·. saturation technique) werden einige oder alle bindenden Stellen von B, die nach der ersten Inkubationszeit noch verbleibeu, durch den markierten Bestandteil gebunden.
(b) L + f- B(exc) >+© * (exc) > (sep)
Beschreibungen ähnlicher radioimmunologischer und enzymatisch immunologischer Bestimmungsverfahren finden sich in US-PS 3 710 760 und J. Immunol. 209, 129 (1972).
3. Heterogene "Sandwich"-Verfahren
W1
L + f- B(exc) ) B (exc) ) (sep)
Bei dem "Sandwich"-Verfahren werden einige oder alle Ligandenmoleküle an den unlöslich gemachten Bindungspartner von dem markierten Bestandteil gebunden (US-PS 3 720 760).
4. Festphasen-Liganden-Adsprptions-Verfahren
L + (lJ * + !-(nicht-spezifisch) ^+ B(lim) ^ (
Bei diesem Verfahren werden der Ligand und der markierte Bestandteil an eine nicht-spezifische Substanz gebunden und anschließend proportionale Mengen durch Bindung mit einem Bindungspartner mit einer größeren Affinität, als sie Tünrinnranartner für den Liuanden zu dem markierten Bestand—
P 2? 54 ÜÖ6.9 (Yl 1A-50
275408$
Bei der günstigsten Form dieses Verfahrens wird eine Säule uine3 nicht-spezifischen bindenden Mittels angewandt (US-PS 3 659 104). Ein solches Verfahren 1«t geeignet, wenn der Ligand in der Probe an endogene bindende Substanzen gebunden ist, die, wenn sie nicht entfernt werden, bei der Konkurrenz-Bindungsreaktion stören wurden. Nach-.der Bindung an das nicht-spezifische Bindungsmittel können die endogenen bindenden Substanzen durch entsprechendes Auswaschen entfernt werden.
Bezüglich der weiteren Diakussion von Parametern, die bei üblichen heterogenen Bestimmungsverfahren eine Rolle spielen sowie die mehr ins einzelne gehende Beschreibung von Bestimmungsverfahren und alternativen Trennverfahren, wird auf Principles of Competitive Protein-Bindung Assays, Herausg. Odell und Daughaday (J, B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972) verwiesen.
Im Rahmen der Erfindung ist es auch möglich, andere Verfahrensarten anzuwenden, wie andere Reihenfolgen der Zugabe und andere Bindungsreaktionatechniken zur Durchführung von heterogenen und homogenen spezifischen BindunipbeStimmungen.
Die Bestimmung der Aktivität des konjugierten Reagens als Bestandteil des vorher bestimmten Nachweisreaktionssystems entweder in der gebundenen oder in der freien Phase wird bequem erreicht, indem man diese Phase mit mindestens einer Substanz zusammenbringt, die mit dem konjugierten Reagens die Nachweisreaktion bildet und ein Charakteristikum dieser Reaktion mißt. Das Nachweisreaktionssystem kann eine einzelne chemische Umwandlung oder eine Vielzahl oder Reihe von chemischen Umwandlungen
umfassen.
<■ ' -Ji
Das zu untersuchende fluss.: <;e Medium kann eine natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Flüssigkeit sein, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält, und ist üblicherweise eine Körpe? flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die bei der Verdünnung oder sonstigen Behandlung einer biologischen Flüssigkeit entsteht. Biologische Flüssigkeiten, die erfindungsgem^ß untersucht werden können, sind u.a. Serum, Plasma, Urin, ai'viiotische, Cerebral-und Spinalflüssigkeiten. Andere Substanzen, wie Feststoffe, z.B. Gewebejoder Gase können ebenfalls untersucht werden, wenn sie z.B, durch Lösen des FeststoTCs oder Gases in einer Flüssigkeit oder durch Flüssigkei tsextraktion des Feststoffes in eine flüssige Form gebracht wurden können.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1 Herstellung der «iaterialien
A. Carbonsäureanhydrase
Das Enzym wurde aus menschlichen roten Blutkörperchen isoliert, entsprechend dem Verfahren von Armstrong et al, J. Biol. Chem. Bd. 241, S. 5137-:>149 (1966) mit der Ausnahme, daß die Dialyse vor der Ausfällung mit Ammoniumsulfat weggelassen wurde. Der Niederschlag wurde in 0,05m Tris-(hydroxymethyl)-amxnomethan-hydrochlorid (Tris-HCl)-Puffer, pH 8,7, gelöst und über eine 2,5x55 cm S;iule, die mit DEAIS-Cellulose beschickt und mit dem gleichen Puffer äquilibriert war. chromatographiert. Das Enzym v/urrie in einer Fraktion mit dem Tris-HCl-Puffer eluiert.
COPV
B, 5- (. C is -hexahydro -2- oxo- IH- tJ: i.eno[3,4-d] imidazole)
-N- (5- sulfonamido-1,3,4-thi.'liazo -2- yl) valeriansäureamid
O2NH2
Biotin-Modulater- Konjugat
iiine Lösung von 300 mg (1,2 mMol) wasserfreiem Biotin in 19,5 ml trockenem Dimethylformamid wurde bei -10 C unter trockenem Stickstoff gerührt unc 0,17 ml (1,2 mMol) trockenes Triäthylamin zugegeben (Knappe ot al, Biochem. Z. 338, S. 599 (1963) ). Eine Lösung von 0,141 ml frisch destilliertem Athylchlorformiat in 3 ml trockenem Diäthyläther wurde zugetropft, wobei ein weißer Niederschlag entstand. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -100C gerührt und dann unter Stickstoffatmosphäre filtriert. Das Filtrot wurde sofort auf -100C gekühlt und eine Lösung von 438 mg (2,43 mMol) 2-Amino-1,3,4-thisdiazol-5-sulfonamid (Roblin et al, J. Am. Chem. Soc. Bd. 72, S. 4890-4892 (1950) ) ii\ 3 ml trockenem Pyridin zugegeben. Die entstehende Lösung wurde 15 Minuten bei -10 C und anschließend 30 Minuten bei Flau!".temperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden bei 400C ui-ter Vakuum abgedampft, wobei ein öliger Rückstand verblieb. I..'as Öl wurde bei 0°C mit 50 ml 0,3n Salzsäure gerührt. Der entstehende weiße Feststoff (400 mg) wurde abfiltriert und in 10 Gew.-% Natriumbicarbonatlösung gelöst. Diese Lösung wurde im Eisbad gekühlt und mit konz. Salzsäure auf einen pH-Weit von 6,5 gebracht. Der entstehende beige-farbene Niederschlag wurde abfiltriert. Man erhielt 130 mg (Fp 2540C Zers.), Beim Umkristallisieren, aus
• atf' -
30 275Λ086
Analyse berechnet für C12H10U6O^3: C 35,46; H 4,46; N 20,67 gefunden : C 35,62; H 4,47; N 20,55
:. 6-(2,4-Dinitroanilino)-N-(5-sulfonamid -1,3,4-thiadiazo -2-yl) capronsäureamid
V ί (! N-N
DNP-Modulator-i.onjugat
Eine Lösung von 357 nig (1,>" mMol) v/as serfrei em 6-(2,4-Dinitroanalino)-capronsaure (Ganmsha et al, Obshchei Khim Bd. 29, S. 1554-1558 (1959) ) wurde in das gemischte Anhydrid umgewandelt nach der stufenweise)' Zugabe von Triäthylamin und Athylchlorfonniat, wie unter B angegeben. Das Filtrat wurde sofort auf -10°C abgekühlt und das Produkt bei -10° mit einer Lösung von 43Ü mg (2,A ; mMol) 2-Amino-1,3,4-thiadiazol-5-sulfonamid (wie unter B beschrieben erhalten) in 3 ml trockenem Pyridin vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei O0C gerührt und dann die Lösungsmittel bei 300C unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde 1 Stunde bei O0C mic 100 ml 1,5n Salzsäure gerührt und der entstehende gelbe Niederschlag abfiltriert iu;d 1 Stunde bei 00C mit 100 ml 10 Gew.-%iger Natriumhydroxidlöiung gerührt. Der gelbe Feststoff wurde abfiltriert und aus .äßrigem Methanol umkristallisiert. Man erhielt 50 mg einet· gelben Feststoffes. Ausbeute 9 %; Fp 229-2330C
Analyse berechnet für C1^H1-NyO^^2: C 36,60; H 3,73
gefunden : C 37,07; H 3,96; N 21,19
D. Reagens-Lösungen ^
(1) Acetazolamid-Reagens: 1,:> mg 2-Acetylamino-1,3»4-thiadiazol-5-sulfonamid vurden in einigen Tropfen Dimethylsulfoxid gelöst und mit Wasser auf 50 ml verdünnt. Weitere Verdünnungen wurden mit Wasser vorgenommen.
(2) Biotin- und DNP-Modulat^r-Reagentien: Das Biotin-Modulator-Konjugat (2,0 mg) und das DNP-Modulator-Konjugat (1,7 mg) wurden jeweils* in 10 ml 0,1m Natriumcarbonatpuffer, pH 10,5, verdünnt. Weitere Verdünnungen wurden mit »/asser vorgenommen.
(3) Avidin-Reagens: LyophilJ.siertes Avidin (Sigma Chemical Co., St. Louis. Mssouri) wurde in 10 mMol Tris-HCl-Puffer, pt· 7,4, in einer Konzentration von 10,5 Aktivität?einheiten/ml (eine Einheit ist die Menge, die imstande ist, ein yug Biotin zu binden) gelöst.
(4) Antikörper· zu Dinitroph?nyl-(DNP)-Reagens: Antisera, die gegen DNP gebildet worden waren, wurden bei 4°C über eine 5 x T) cm Säule mit Sephadex G-200 (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) mit 0,1m Tris-HCl-Puffer, pH 8,2, enthaltend 1m Natriumchlorid chromatographiert. Der zweite eluierte Anteil, der durch die optische Dichte bei 280nm bestimmt wurde, enthielt die Antikörper-Aki.ivität gegen DNP.
(5) p-Nitrophenyl-acetat-Re-'gens: 5 mg p-Nitrophenylacetat in 0,3 ml Aceton wurden mit destilliertem Wasser unter Rühren auf 10 ml gebracht.
Beispiel 2 Esterase-Aktivitviten von Carbonsäure-Anhydrase
als Funktion der Acetazolamid-Konzentration
Carbonsäure-Anhydrase (0,0I3 Internationale Einheiten) wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur in eine Reihe von 0,66 ml wäßrigen Lösungen, enthaltend jtv/eils 100 /Ul 0,1m Diäthylmalonsäure-Puffer, pH 7»4, und die in Tabelle 1 angegebenen
33 275A0S6
ogei' auf 1 ml ündvolumeh). 0,3:
Acetazolamid und Avidin, bezogen au!" 1 ml ündvolumeh). O,33 ml p-Witrophenyl-acetat-Reagens wu! len zu jeder Lösung gegeben, um ein Gesamtvolumen von 1 ml z\- erhalten. Die Hydrolysegeschwindigkeit von p-Nitrophenyl; :etat wurde durch Beobachtung der Absorption bei 348 nm Iistimmt.
Die Ergebnisse, die jewei.l 3 das Mittel von 2 Messungen sind, sind in Tabelle 1
Tabeli. 3 1 Hydrolysegeschwindig
Acetazolamid- Avidin keit (AOD^Q/min/ml)
Konzentration (/UM) (Einhe· ten/ml) 0,136
0,000 0,088
0,144 - 0,047
0,283 - 0,089
0,144 0,1': 5 0,111
0,000 - 0,106
0,000 0,1"
Diese Werte zeigen, daß d .s Acetazolamid das Enzym Cai'bonsäure-Anhydrase hemmte un.! daß das Vorhandensein von Avidin keine deutliche Wirkung -uf die Hemmung ausübte.
Beispiel 3 ^sterase-AktiviIäten von Carbonsäure-
/unhydrase als funktion der Biotin-Hodulator-Konjugat-Konzen !.ration
Carbonsäure-Anhydrase (O,'/27 Internationale Einheiten) wurde 5 Minuten bei Raumte'perat'.ir in eine Reihe von 0,66 ml wäßrigen Lösungen, enthaltend 100 >ul 0,1m Diäthylmalonsäure-Puffer, pH 7,4, und die in Tabe'le 2 angegebenen Mengen an Biotin-Modulator-Konjugat (hergestellt entsprechend Beispiel 1 inkubiert (Konzentration des Kcujugats, bezogen auf 1 ml Endvolumen). Die Esterase-Aktivitä'., wie sie durch die Hydrolysegeschwindigkeit gemessen wurde, wurde für jedes Reaktions-
33 2754088
gemisch wie in Beispiel 2 bestii-'it. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und in graphischer Forci in Fig. 1 angegeben.
Tabelle 2
Biotin-Modulator-Konjugat- Hydrolysegeschwindigkeit
Konzentration ( /UM) (ÄOD34ö/min/ml)
0,00 0,136
0,05 0,120
0,10 0,109
0,20 0,103
0,30 0,071
0,40 0,057
0,50 0,040
Diese Daten zeigen, daß da^ Biotin-Modulator-Konjugat gute Heminwirkungen, bezogen auf 'Jie Carbonsäure-Anhydrase besitzt und etv/as weniger wirksam Ist als der nicht abgeleitete (underivatized) Inhibitor Acetaz'lamid.
Beispiel 4 Direkte Bindungsl estimmung für Avidin;
Konkurrenz-Bindu':gsbestimmung für Biotin; Anwendung von deiivatisiertem Acetazolamid als Markierungssübstanz
Jis wurde eine Reihe von Biiidungsreaktionsgemischen hergestellt, jeweils in einem Volumen von 0,66 ml, enthaltend 100 /Ul 0,1m Diäthylmalonsäure-luffer, pH 7,4, und die in Tabelle 3 angegebenen Konzentrat·onen an Biotin-Modulator-Konjugat (hergestellt entsprechend Beispiel 1, B), Biotin und Avidin (Konzentrationen bezogen auf 1 ml Endvolumen). Nach 5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,027 Carbonsäure-Anhydrase zu jedem Koaktionsgemisch gegeben und anschließend weitere 5 Minuten Mikubiert. Dann wurden 0,33 ml p-Nitrophenyl-acetat-Reagens zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und die Hydrolysegeschwind Lgkeit durch Beobachtung der Absorption bei348 nm gemessen.
Die Ergebnisse, die jeweil ■ das Mittel aus zwei Messungen darstellen, sind in Tabelle 3 angegeben. Die Ergebnisse der Reaktionsgemische 2 bi 9 sind in graphischer Form in Fig. 2 angegeben.
Die Werte für die Reaktion'gemisch 2 bis 9 zeigen die Y/irkung verschiedener Gehalt;: an Avidin auf die Hemmwirkung des Biotin-Modulator-Konjugats auf die Esterase-Aktivitäten von Carbonsäure-Anhyirase. Für einen konstanten Gehalt an Biotin-Modulator-K'»ijugat ist die enzymatische Kydrolysegeschwindigkeit direkt proportional der vorhandenen Avidinmenge. Die Ergebnisse der Gemische 8, 10 und 11 zeigen, daß, wenn BAotin vorhanden ist, die Hydrolysegeschwindigkeit der vorhandenen Menge umgekehrt proportional ist.
../Tabelle
Tabelle
lisch Biotin-Modulator-fcenjuBat (μΜ)
Biotin CuM)
Avidin (E /ml) Hydrolysegeschvindigkeii
0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0f 50
2r* Absorption / min bei 348 nm
0,10 0,60
0,011
0,026
0,040
0,053
0,065
0,079
0,105
0,126
0,105
0,105
0,128 0,049 0,056 0,066 0,075 0,079 0,090 0,129 . 0,136 0,104 0,080
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ω UO
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CD
•Η •Ρ
J-, φ d
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CO
CnI
Beispiel 5 Konkurrenz-Bindun ι sbestimmung von Dinitro-
phenyl (DN$-Deriv ten
Anv/endung von der>vatisiertem Acetazolamid als Harkierungssubst8!>z
Es wurde eine Reihe von BirHungsreaktionsgemischen hergestellt, jeweils in einem Volume.» von 0,66 ml und enthaltend 100 /Ul 0,1m Diäthylmalonsäure-Pu'.'fer, pH 7,4, und die in Tabelle 4 angegebenen Mengen an / etazolamid, DNP-Modulator (entsprechend Beispiel 1, C hei*ge 'teilt), N-DNP-6-aminocaproat (Biochem. J. Bd. 42, S. £t«7 (1948) ) und Antikörper zu DNP (die Konzentrationen sind .Jeweils auf 1 ml Endvolumen bezogen). Nach 5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,03 I.E. Carbonsäure-Anhy-Arase zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und anschließend ·> Minuten inkubiert. Dann wurden 0,33 ml p-Nitrophenyl-acet it-Reagens zugegeben und die Hydrolysegeschwindigkeit gemessen durch Beobachtung der Absorption bei 34ö nm.
Die Ergebnisse, die das Mil eel aus zwei Messungen darstellen, sind in Tabelle 4 angeg^oen. Ein Vergleich der Ergebnisse bei den Heaktionsgemischen 1, 3 und 5 zeigt, daß Acetazolamid die Carbonsäure-Anh;· li'ase-Reaktion hemmte und im wesentlichen nicht beeinflußt wurde durch das Vorhandensein von Antikörper zu DNP. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionsgemische 1, 2 und 4 zeigt, Onß das DNP-Modulator-Konjugat auch die Carbonsäure-Anhydrase-R'Uiktion hemmte, wobei der Grad der Hemmung bei Vorhandensein vor· Antikörper zu DNP abnahm. Die Ergebnisse des Reaktionsgemische-: G zeigen, daß das Vorhandenseins eines DWP-Derivats keinen ■..' iutlichen Einfluß auf die Carbonsäure-Anhydrase-Reaktion ausübt. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionsgemische 2 und 7 zeigt, daß das Vorhandenseins des DNP-Derivats bestimmt .erden konnte durch Beobachtung der verstärkten Hemmung der Carbonsäure-Anhydrase-Reaktion durch das DNP-itodulator-Konjugat.
BAD ORIGINAL
nopY ■■'AL
ι Le
erseife

Claims (1)

  1. UK. is*:, i". v\ i icsTiK ·ί·τ' .,ιιιιιι μΓ.μίι ι·:.\ no
    DICK. .·. I'WilMA.NX ν«·ι· \ri-:i«i kksthassi: ^
    -ι-1:ι rroN (»im» > ι;
    υ1.:, ι \»;. :ι. ΐ:ι·'.ϋΐΐ ι·:λν
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    27 5/,088
    Ι'λϊκντλλ u Λ».ti:
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    ΓΙΜΙ'Ι'ΚϋΤΙΆΤΚΝΤ Mt* X* «.'Η KX
    1A-50 012 Anin. : Miles Lab.
    Patentansp? üche
    1.) Spezifisches Bindungsve rf raren zum Nachweis und zur Bestimmung eines läganden in einer flüssigen Medium, bei dem man das flüssige Medium mit «if igentien zusammenbringt, umfassend ein Koajugat aus einer I irkierungssubstanz und einer bindungskomponente unter Bi: iung eines Reaktionssystems, in dem eine gebundene und eine irr :e Form des Korijugats vorliegt, und wobei die Menge an Ligi iden in dem flüssigen Medium bestimmt wird als Funktion rler Menge der Karkierungssubstanz, die in der gebundenen oc :r freien Form vorliegt, dadurch gekennzeichnet , daß man als I-iarkierungssubstanz einen reversibel bii ienden Enzymmodulator verwendet und ein xinzytii zusetzt, des; -m Aktivität durch den Modulator beeinflußt wird, und die i;iei ;e an Enzyrumodulator in der gebundenen oder freien Form als SViktion der Aktivität des mißt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindur'Skonstante für die Assoziation des reversibel bindenen linzyruodulators mit dem L'nzym
    11 —1
    weniger als ungefähr 10 m bet:1 igt.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 >der 2, dadurch g e -
    k e n nz e i c h η e t , daß die 'ündungskonstante für die reversible Binaung zwischen dem Σ] lymmodulator und dem Enzym
    c, 9—1
    ungefähr 10 bis ungefähr 10 m I aträgt.
    4. Verfahi-en nach Anspruch 1 ois 3t dadurch g e kennzeichnet, daß de: reversibel bindende Enzymmodulator die Aktivität des Lnzyin hemmt.
    /■
    ä 275408g
    5. Verfahren nach Anspruch ! bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß 'er reversibel bindende ünzyiiuiiodulator ein kompetitiver nhibitor für das iCnzym ist.
    b. Verfahren nach Anspruch '. bis 'j, dadurch ge
    kennzeichnet , daß -lan als reversibel bindenden kon;petitiven Inhibitor ur I als Enzym
    (a) Acetazolamid oder ein wirksi'ues Analoges davon und Carüonsäure-Anhydrase;
    (b) oulianilaiiiid oder ein v/irks; ies Analoges davon und Carbonsäure-Anhyürase;
    (c) Phenyl-crimethylammonium-ior oder ein wirksames Analoges davon und Acetylcholiner ';erase;
    (d) Saccharo-1,4-lacton oder eil wirksames Analoges davon und ß-Glucuronidase;
    (e) 4-Aiiiirio-IO-methyi-pteroylgl1· caminsäure oder ein wirksames Analoges davon una uii/drofolatreduktase oder
    (f) 2, ο ,8-Trichlorpurin oder ei.11 wirksames Analoges davon und Uricase verwendet.
    7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ier reversibel bindende Enzyim.iodulator die Aktivität ue Enzyms stimuliert bzw. erhöht .
    ü. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, uadurch gekennzeichnet , daß der Enzymmodulator als Bestandteil des Konjugats die Akt vität des Enzyms anders beeinflußt, wenn das Konjugat in ebundener Form vorliegt als wenn es in freier b'orm vorliegt
    9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein homogene Arbeitsweise anwendet und das Enzym zu dem Geu ■ sch aus gebundener und freier Form zusetzt.
    CCvY
    10. Verfahren nach Anspruch I bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß ii in heterogen arbeitet
    und die gebundene von der freien ''orm physikalisch trennt und dann zu einer Form das i&izym zusetzt.
    11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß #:er Ligand ein Antigen oder Antikörper dazu, Hapten oder Antikörper dazu, Hormon,
    Vitamin, Wetabolit oder'pharmako'ogisches Mittel oder ein Rezeptor oder eine bindende Subs-anz dazu ist.
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GB (1) GB1575425A (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2447966A1 (fr) * 1979-02-05 1980-08-29 Abbott Lab Conjugues analogue de ligand-inhibiteur enzymatique irreversible et procedes pour la determination des ligands les utilisant
EP0034775A2 (de) * 1980-02-22 1981-09-02 Hans A. Dr. Thoma Homogenes Verfahren zur kompetitiven Bestimmung von Liganden
EP0055868A2 (de) * 1981-01-02 1982-07-14 Hans A. Dr. Thoma Verfahren zur Bestimmung von Liganden oder Rezeptoren mittels Kompetitionsreaktion, sowie Test-Kit zur Durchführung desselben und Verwendung
EP0055869A2 (de) * 1981-01-02 1982-07-14 Hans A. Dr. Thoma Verfahren zur Bestimmung von Liganden, Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens und seine Verwendung
US4550075A (en) * 1983-06-22 1985-10-29 Kallestad Laboratories, Inc. Method for ligand determination utilizing an immunoassay monitorable by biotin-containing enzymes, and compositions therefor

Families Citing this family (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL51668A (en) * 1977-03-16 1981-12-31 Israel State Analytical method for the quantitative determination of immunogens and antibodies and a kit therefor
USRE34394E (en) * 1978-01-23 1993-09-28 Baxter Diagnostics Inc. Method and composition for double receptor, specific binding assays
US4279992A (en) * 1978-03-13 1981-07-21 Miles Laboratories, Inc. Specific binding assay employing an enzyme-cleavable substrate as label
US4275149A (en) * 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
AU531777B2 (en) * 1978-04-05 1983-09-08 Syva Co. Label/solid conjugate immunoassay system
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US5605800A (en) * 1978-04-13 1997-02-25 Institut Pasteur Method of detecting and characterizing a nucleic acid or a sequence of the latter, and enzymatic reactant for the application of this method
JPS5510590A (en) * 1978-05-04 1980-01-25 Wellcome Found Enzyme immunity quantity analysis
US4238565A (en) * 1978-06-22 1980-12-09 Miles Laboratories, Inc. Specific binding assay with a prosthetic group as a label component
US4376165A (en) * 1978-06-22 1983-03-08 Miles Laboratories, Inc. Method of preparing an enzyme-labeled ligand for use in specific binding assays and the labeled conjugate produced thereby
US4600690A (en) * 1978-08-07 1986-07-15 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University Immunoassay
US4430263A (en) 1978-09-18 1984-02-07 Abbott Laboratories Hapten-inhibitor immunoassay
US4228237A (en) * 1978-09-21 1980-10-14 Calbiochem-Behring Corp. Methods for the detection and determination of ligands
US4307190A (en) * 1978-10-30 1981-12-22 Technicon Instruments Corporation Immunoassay using ascitic fluid
FR2440555A1 (fr) * 1978-10-31 1980-05-30 Maes Roland Perfectionnements aux procedes de determination de substances montrant entre elles des affinites de liaison specifiques, par des tests faisant intervenir une phase solide
US4374925A (en) * 1978-11-24 1983-02-22 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318707A (en) * 1978-11-24 1982-03-09 Syva Company Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays
US4256834A (en) * 1979-04-09 1981-03-17 Syva Company Fluorescent scavenger particle immunoassay
US4340668A (en) * 1979-06-04 1982-07-20 Miles Laboratories, Inc. Heme-labeled specific binding assay
US4318983A (en) * 1979-06-04 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Fad-labeled specific binding assay monitored with apoglutathione reductase or apolipoamide dehydrogenase
US4318982A (en) * 1979-06-04 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. FMN-Labeled specific binding assay
US4446231A (en) * 1979-10-03 1984-05-01 Self Colin H Immunoassay using an amplified cyclic detection system
GB2059421A (en) * 1979-10-03 1981-04-23 Self C H Assay method and reagents therefor
US4478914B1 (en) * 1980-01-24 1997-06-17 Roger W Giese Process for applying multiple layers of a protein and a ligand extender to a surface and to the multiple layer system
US4282287A (en) * 1980-01-24 1981-08-04 Giese Roger W Biochemical avidin-biotin multiple-layer system
USRE31712E (en) * 1980-01-24 1984-10-23 Biochemical avidin-biotin multiple-layer system
US4318981A (en) * 1980-04-24 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Homogeneous specific binding assay employing an intramolecularly modulated photogenic enzyme substrate label
FR2486657A1 (fr) * 1980-07-09 1982-01-15 Pasteur Institut Procede de detection et de dosage d'une substance biologique par erythroadsorption
US4341865A (en) * 1980-07-21 1982-07-27 Abbott Laboratories Determination of thyroxine binding globulin
US4849353A (en) * 1980-09-30 1989-07-18 Cornell Research Foundation, Inc. Immunocapture of enzyme inhibitor, enzyme complexes and uses thereof
US4323647A (en) * 1980-10-15 1982-04-06 University Of Miami Steric hindrance enzyme immunoassay
US4404278A (en) * 1980-11-24 1983-09-13 Syva Company Methods and compositions for assaying for the production of 1,4-dihydropyridyl
US4378428A (en) * 1981-03-30 1983-03-29 Baker Instruments Corporation Method for carrying out non-isotopic immunoassays, labeled analytes and kits for use in such assays
US4785080A (en) * 1981-03-30 1988-11-15 Baker Instruments Corporation Labeled analytes
US4711955A (en) * 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
DE3265794D1 (en) * 1981-07-16 1985-10-03 Hoffmann La Roche Method for the detection of human occult blood in human stool samples
US4433051A (en) * 1981-10-14 1984-02-21 Yeda Research And Development Co., Ltd. Derivatives of α-difluoromethylornithine useful in analysis
JPS58129998A (ja) * 1981-11-02 1983-08-03 ジエ−ムス・ウオルタ−・リヤン 標識蛋白質性阻害剤を用いるプロテア−ゼの分析法
EP0079489A1 (de) * 1981-11-04 1983-05-25 Miles Laboratories, Inc. Methotrexat markierte Jodthyronin-Konjugate und Verfahren, Reagenz und Testeinrichtung zum Nachweis von Jodthyronin oder der Jodthyronin-Aufnahme einer Flüssigkeit
JPS58122459A (ja) * 1982-01-14 1983-07-21 Yatoron:Kk 酵素の会合を利用した測定方法
US4506009A (en) * 1982-03-30 1985-03-19 University Of California Heterogeneous immunoassay method
JPS58209994A (ja) * 1982-05-10 1983-12-07 Fujirebio Inc 活性蛋白等固定化物を用いた抗原の測定方法
US4472301A (en) * 1982-05-27 1984-09-18 Miles Laboratories, Inc. Propranolol immunogen and antibodies
AU574646B2 (en) * 1982-07-19 1988-07-14 Cooperbiomedical Inc. Enzyme assay method
US4530900A (en) * 1982-09-13 1985-07-23 Seragen Diagnostics Inc. Soluble insoluble polymers in enzymeimmunoassay
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
GB2135773B (en) * 1983-01-31 1985-12-04 Boots Celltech Diagnostics Enzyme inhibitor labelled immunoassay
AU559576B2 (en) * 1983-01-31 1987-03-12 Boots-Celltech Diagnostics Limited Immunoassay
EP0119767B1 (de) * 1983-03-11 1990-11-22 FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. Verfahren zur Bestimmung von Liganden
US4650751A (en) * 1983-04-29 1987-03-17 Technicon Instruments Corporation Protected binding assay avoiding non-specific protein interference
JPS607362A (ja) * 1983-06-27 1985-01-16 Fujirebio Inc 酵素を用いた抗原決定基具有物質の測定法
US4629694A (en) * 1983-07-12 1986-12-16 Cornell Research Foundation, Inc. Detecting and distinguishing between plasminogen activators
US4713324A (en) * 1983-09-01 1987-12-15 Technicon Instruments Corporation Inverted latency specific binding assay
GB8334499D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Derivatives
GB8400653D0 (en) * 1984-01-11 1984-02-15 Beecham Group Plc Conjugates
US4708929A (en) * 1984-10-29 1987-11-24 Microgenics Corporation Methods for protein binding enzyme complementation assays
US4727022A (en) * 1984-03-14 1988-02-23 Syntex (U.S.A.) Inc. Methods for modulating ligand-receptor interactions and their application
DE3417638A1 (de) * 1984-05-10 1985-11-14 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Verfahren zur bestimmung geringer stoffmengen von arzneimitteln, von koerpereigenen oder anderen chemischen substanzen in biologischem material
US4737453A (en) * 1984-12-12 1988-04-12 Immunomedics, Inc. Sandwich immunoassay utilizing a separation specific binding substance
US4833251A (en) * 1985-06-25 1989-05-23 Siska Diagnostics, Inc. Compounds for tagging nucleic acid probes
US4780405A (en) * 1985-06-25 1988-10-25 Siska Diagnostics, Inc. Carbonic anhydrase inhibitor-tagged nucleic acid probes
ATE98376T1 (de) * 1986-03-24 1993-12-15 Ortho Pharma Corp Synthetische htlv-iii-peptid-zusammensetzungen und ihre verwendung.
AU7238087A (en) * 1986-03-26 1987-10-20 Murex Corp. Anti-enzyme antibody immunoassay
US4883751A (en) * 1986-05-28 1989-11-28 New York University Specific immunoassay for heparin
WO1987007957A1 (en) * 1986-06-20 1987-12-30 The Regents Of The University Of California Low-level detection of human immunodeficiency virus
US4935343A (en) * 1986-08-08 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Monoclonal antibodies for interleukin-1β
US4960691A (en) * 1986-09-29 1990-10-02 Abbott Laboratories Chromatographic test strip for determining ligands or receptors
US4906567A (en) * 1987-01-21 1990-03-06 E. I. Dupont De Nemours And Company Non-immunochemical binding of lipopolysaccharides and sandwich assays therefor
US4788136A (en) * 1987-04-07 1988-11-29 Abbott Laboratories Diagnostic immunoassay by solid phase separation for digoxin
US5003054A (en) * 1987-04-07 1991-03-26 Abbott Laboratories Ouabain triacetate derivative compounds
US5474899A (en) 1987-05-13 1995-12-12 Cistron Biotechnology, Inc. Selective immunoassay for IL-1 β
IL85596A (en) * 1987-05-18 1992-06-21 Technicon Instr Method for a specific binding enzyme immunoassay
US5384241A (en) * 1987-09-11 1995-01-24 Enzo Diagnostics, Inc. Specific binding assay compound with inhibitive self-quenching characteristics
US5132209A (en) * 1987-09-14 1992-07-21 Vanderbeeken Yves E Process for testing for maternal-fetal immunoincompatibility in pregnant women
EP0310361A3 (de) * 1987-09-30 1989-05-24 Beckman Instruments, Inc. Aus drei Verzahnungen bestehendes Konjugat und Verfahren zu seiner Verwendung
US5196351A (en) * 1987-09-30 1993-03-23 Beckman Instruments, Inc. Bidentate conjugate and method of use thereof
US5534620A (en) * 1987-09-30 1996-07-09 Beckman Instruments, Inc. Method of heterogenous purification using a bidentate conjugate
US4962024A (en) * 1988-08-11 1990-10-09 Becton, Dickinson And Company Signal enhancement in assay for an enzyme
CA1335707C (en) * 1989-08-15 1995-05-30 Pyare Khanna Drug screening assay
US5376556A (en) * 1989-10-27 1994-12-27 Abbott Laboratories Surface-enhanced Raman spectroscopy immunoassay
US5792606A (en) * 1990-02-26 1998-08-11 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid hybridization based assay for determining a substance of interest
WO1992002817A1 (en) * 1990-08-02 1992-02-20 Biocarb, Inc. Adhesion receptors for pathogenic or opportunistic microorganisms
US5972625A (en) * 1991-05-06 1999-10-26 The Regents Of The University Of California Assays for inhibitors of leukocyte adhesion
US5877028A (en) * 1991-05-29 1999-03-02 Smithkline Diagnostics, Inc. Immunochromatographic assay device
US6168956B1 (en) 1991-05-29 2001-01-02 Beckman Coulter, Inc. Multiple component chromatographic assay device
US5998220A (en) * 1991-05-29 1999-12-07 Beckman Coulter, Inc. Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them
US6100099A (en) 1994-09-06 2000-08-08 Abbott Laboratories Test strip having a diagonal array of capture spots
US5618675A (en) * 1992-07-16 1997-04-08 Panorama Research, Inc. Methods and compositions for detecting lipopolysaccharides using CAP18 fragments
US6103888A (en) * 1992-07-17 2000-08-15 Panorama Research, Inc. Mammalian cationic proteins having lipopolysaccharide binding and anti-coagulant activity
US5798219A (en) 1993-11-23 1998-08-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Serological identification of cattle, sheep or goats infected with anaplasma species
EP0737863A4 (de) * 1993-12-28 1998-09-30 Ss Pharmaceutical Co Verfahren zum nachweis von blutkomponenten und kit dafür
US6110689A (en) * 1994-01-21 2000-08-29 Osteometer A/S Method of assaying collagen fragments in body fluids, a test kit and means for carrying out the method and use of the method to diagnose the presence of disorders associated with the metabolism of collagen
US5747352A (en) * 1994-05-23 1998-05-05 Beckman Instruments, Inc. Reagents and methods for the rapid and quantitative assay of pharmacological agents
US5962340A (en) * 1994-11-02 1999-10-05 Wako Pure Chemical Industries Ltd. Homogeneous immunoassay method utilizing 5-300 mM magnesium
US5712103A (en) * 1995-02-13 1998-01-27 Regents Of The University Of California Diagnostic assay for the prediction of preeclampsia
NZ507994A (en) * 1998-05-15 2003-01-31 Sekisui Chemical Co Ltd Immunoassay reagent and immunoassay method
US7297554B2 (en) * 1998-11-18 2007-11-20 Microdiagnostics, Inc. Immunoassay system
JP3649319B2 (ja) * 1999-01-25 2005-05-18 東洋紡績株式会社 レセプター結合能の測定方法および測定用試薬
US6524808B1 (en) * 1999-06-25 2003-02-25 Roche Diagnostics Corporation Enzyme inhibition immunoassay
US6811998B2 (en) * 1999-06-25 2004-11-02 Roche Diagnostics Operations, Inc. Conjugates of uncompetitive inhibitors of inosine monophosphate dehydrogenase
US20030228288A1 (en) 1999-10-15 2003-12-11 Scarborough Nelson L. Volume maintaining osteoinductive/osteoconductive compositions
US6380377B1 (en) 2000-07-14 2002-04-30 Applied Gene Technologies, Inc. Nucleic acid hairpin probes and uses thereof
US6596490B2 (en) * 2000-07-14 2003-07-22 Applied Gene Technologies, Inc. Nucleic acid hairpin probes and uses thereof
US9387094B2 (en) 2000-07-19 2016-07-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Osteoimplant and method of making same
EP1207394B1 (de) * 2000-11-14 2009-12-30 Roche Diagnostics GmbH Immunoassay für HIV-Protease-Hemstoffe
US7323193B2 (en) * 2001-12-14 2008-01-29 Osteotech, Inc. Method of making demineralized bone particles
US20020142361A1 (en) * 2001-03-27 2002-10-03 Emmert-Buck Michael R. Biodetection method
US20040265923A1 (en) * 2001-05-03 2004-12-30 James Gilmore Method and apparatus to determine the performance of protein arrays
US6800608B2 (en) 2001-06-22 2004-10-05 Beckman Coulter, Inc. Homogeneous assay of vancomycin using a stable particle-vancomycin conjugate, a novel rate enhancer, and a novel dose response modulator
US7166208B2 (en) * 2004-03-03 2007-01-23 Stephen Eliot Zweig Apoenzyme reactivation electrochemical detection method and assay
US8118991B2 (en) * 2001-09-04 2012-02-21 Stephen Eliot Zweig Apoenzyme reactivation electrochemical detection method and assay
WO2003024923A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-27 Axys Pharmaceuticals, Inc. Sulfonamide compounds as protease inhibitors
EP1434608B1 (de) * 2001-10-12 2018-08-22 Warsaw Orthopedic, Inc. Verbessertes knochenimplantat
US20030219755A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for performing hybridization assays using target enhanced signal amplification (TESA)
US20040009574A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-15 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for detecting streptococcus agalactiae capsular polysaccharide synthesis genes
US20040009482A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-15 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for detecting streptococcus agalactiae surface immunogenic protein genes
US20060073475A1 (en) * 2002-08-09 2006-04-06 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for detecting pathogenic bacteria expressing chaperonin proteins
WO2004038369A2 (en) * 2002-10-21 2004-05-06 Discoverx, Inc. Ip3 protein binding assay
AU2003229474A1 (en) * 2003-05-09 2004-11-26 Capital Biochip Company, Ltd. Methods and compositions for detecting sars virus
AU2004247143B2 (en) * 2003-06-11 2010-09-23 Warsaw Orthopedic, Inc. Osteoimplants and methods for their manufacture
CN100494399C (zh) * 2003-06-30 2009-06-03 清华大学 一种基于dna芯片的基因分型方法及其应用
CN1580283A (zh) * 2003-08-13 2005-02-16 清华大学 一种检测核酸分子的方法
US7341837B2 (en) * 2003-09-02 2008-03-11 Lawton Robert L Soluble analyte detection and amplification
US20050136488A1 (en) * 2003-11-06 2005-06-23 Horecka Joseph L. Cellular membrane protein assay
US7608415B2 (en) * 2004-06-30 2009-10-27 Discoverx Corporation Analysis of intracellular modifications
EP1810030A1 (de) * 2004-07-16 2007-07-25 Gyros Patent Ab Sequentielles verfahren
US20060166236A1 (en) * 2004-12-15 2006-07-27 Chong-Sheng Yuan Allosteric enzyme coupled immunoassay (AECIA)
CA2594733A1 (en) * 2005-01-14 2006-07-20 Osteotech, Inc. Expandable osteoimplant
WO2007056671A1 (en) * 2005-11-02 2007-05-18 Osteotech, Inc. Hemostatic bone graft
US20080026394A1 (en) * 2006-07-11 2008-01-31 Antara Biosciences Inc. Methods of detecting one or more cancer markers
KR20110086045A (ko) * 2008-10-24 2011-07-27 오스테오테크, 인코포레이티드 뼈 형성 촉진용 조성물 및 뼈 형성 촉진방법
US9283272B2 (en) 2012-03-30 2016-03-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Targeting intracellular target-binding determinants with intracellular antibodies
AU2013257715B2 (en) * 2012-05-08 2016-05-05 Cellixbio Private Limited Compositions and methods for suppression of carbonic anhydrase activity
CN102721802B (zh) * 2012-07-06 2014-11-26 深圳市易瑞生物技术有限公司 一种提高竞争免疫分析灵敏性的方法
JP2016507741A (ja) * 2013-01-09 2016-03-10 バンティックス ホールディングス リミテッド Ft4電気化学アッセイ検出システム

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4003792A (en) * 1967-07-01 1977-01-18 Miles Laboratories, Inc. Conjugates of acid polysaccharides and complex organic substances
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3880934A (en) * 1972-02-10 1975-04-29 Syntex Inc Nitrophenyloxy-butanediols
US3975342A (en) * 1972-05-15 1976-08-17 Biological Developments, Inc. Tyrosyl-class antigenic conjugates, their preparation and antibodies raised thereto
US3966556A (en) * 1972-11-06 1976-06-29 Syva Company Compounds for enzyme amplification assay methadone analogs

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2447966A1 (fr) * 1979-02-05 1980-08-29 Abbott Lab Conjugues analogue de ligand-inhibiteur enzymatique irreversible et procedes pour la determination des ligands les utilisant
EP0034775A2 (de) * 1980-02-22 1981-09-02 Hans A. Dr. Thoma Homogenes Verfahren zur kompetitiven Bestimmung von Liganden
EP0034775A3 (de) * 1980-02-22 1981-09-09 Hans A. Dr. Thoma Homogenes Verfahren zur kompetitiven Bestimmung von Liganden
EP0055868A2 (de) * 1981-01-02 1982-07-14 Hans A. Dr. Thoma Verfahren zur Bestimmung von Liganden oder Rezeptoren mittels Kompetitionsreaktion, sowie Test-Kit zur Durchführung desselben und Verwendung
EP0055869A2 (de) * 1981-01-02 1982-07-14 Hans A. Dr. Thoma Verfahren zur Bestimmung von Liganden, Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens und seine Verwendung
EP0055868A3 (de) * 1981-01-02 1982-08-04 Hans A. Dr. Thoma Verfahren zur Bestimmung von Liganden oder Rezeptoren mittels Kompetitionsreaktion, sowie Test-Kit zur Durchführung desselben und Verwendung
EP0055869A3 (en) * 1981-01-02 1982-08-11 Hans A. Dr. Thoma Process for the determination of ligands, test kit for carrying out the process and its application
US4550075A (en) * 1983-06-22 1985-10-29 Kallestad Laboratories, Inc. Method for ligand determination utilizing an immunoassay monitorable by biotin-containing enzymes, and compositions therefor

Also Published As

Publication number Publication date
DE2754086B2 (de) 1979-02-15
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JPS6240662B2 (de) 1987-08-29
DE2754086C3 (de) 1979-10-18
FR2373063B1 (de) 1980-09-19

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