DE2754086A1

DE2754086A1 - Spezifisches bindungsverfahren zum nachweis und zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium

Info

Publication number: DE2754086A1
Application number: DE19772754086
Authority: DE
Inventors: Robert Charles Boguslaski; Robert Joseph Carrico; James Edward Christner; Ind Elkhart
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-12-06
Filing date: 1977-12-05
Publication date: 1978-06-22
Also published as: DE2754086C3; DE2754086B2; CA1079632A; US4134792A; GB1575425A; FR2373063B1; FR2373063A1; JPS53105291A; JPS6240662B2

Description

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Patentanmeldung

Anmelder: MILES LABORATORI' S, INC.

Elkhart, Indiana 46514, U.S.A.

Titel: Spezifisches Bim !ungsverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium

COPV

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1Α-50 012

Anm.: Miles Lab.

Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine spezifische Bindungsbestimmung zum Nachweis bzw. zur Bp Stimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, bei der als Markierungssübstanz ein reversibel bindender Enzymmodulator angewandt wird. Das Verfahren selbst wird durchgeführt: wie übliche spezifische Bindungsbestimmungsverfahren, die homogen oder heterogen sein können, bei denen das zu untersuchende flüssige Medium mit Reagentien zusammengebracht v.ird, die ein markiertes Konjugat umfassen, unter Bildung eines Reaktionssystems, in dem eine gebundene und eine freie Form des Konjugats vorhanden ist. Die Menge an Konjugat in der gebundenen oder in der freien Form ist eine Funktion der in dem zu untersuchenden flüssigen Medium vorhandenen Ligatidenmenge. Erfindungsgemäß umfaßt das markierte Konjugat eiron reversibel bindenden Enzymmodulator, der kovalent an eine Bindungskomponente des Bindungsreaktionssystems gebunden ist. Die Verteilung des Konjugats zwischen der gebundenen Form und der freien Form wird bestimmt durch Zugabe eines Enzyms, dessen Aktivität durch den Modulator beeinflußt utmI zwar entweder verringert oder erhöht wird, und Messung der entstehenden Enzymaktivität. Der Modulator kann ein üblicher Enzyminhibitor (Hemmstoff) sein, vorzugsweise ein konkurrieränder oder eine Allosterie bewirkende Substanz (allosterie eCfector).

Die Erfindung betrifft Best.lmmungsverfahren und zwar homogene und heterogene spezifiscUe Bindungsverfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Liganden in einem Medium. Besonders betrifft sie immunologische Konkurrenzbindung sverfahren unter Anwendung nicht isotoper (nicht radio-

aktiver) Markierungen.

Bei einem üblichen Verfahren der spezifischen Bindungsbestimmung wird die zu untersuchende Probe mit Reagentien verschiedener Zusammensetzung - -.anfassend ein Konjugat aus einer Markierungssubstanz, die an eine Bindungskomponente gebunden ist, die mit anderen Bestandteilen (soweit solche vorhanden sind) der Reagensmittel unter Bildung eines Bindungsreaktionssystems reagiert - zusa-nmengebracht, wobei zwei Formen des markierten Konjugats und zwar eine gebundene Form und eine freie Form entsteht. Die relativen Mengen des markierten Konjugats, die in der gebundenen und in der freien Form vorliegen, sind eine Funktion des Vorhandenseins bzw. der Menge des zu bestimmenden Lii-ianden in der zu untersuchenden Probe.

Zur Illustration wird ein übliches Konkurrenz-Bindungsbestimmungsverfahren beschrieben. Bei einem solchen Verfahren umfaßt das Reagensmittel 1.) ein markiertes Konjugat in Form des zu bestimmenden Liganden oder eines entsprechenden Analogen davon, der (das) chemisch an eine Markierungssubstanz gebunden ist, und 2.) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden wie einen Antikörper oder ein anderes Bindungsprotein. Nach Zusammenbringen der zu untersuchenden Probe mit den Reagentien treten der nachzuweisende bzw. zu bestimmende Ligand und das markierte Konjugat in im wesentlichen unterschiedsloser Weise (nondiscriminating) in·Konkurrenz um nicht kovalente Bindung mit dem spezifischen Bindungspartner. Als Folge davon ist die Menge an markiertem Konjugat, die an den Bindungspartner gebunden wird,-d.h. die gebundene Form oder die freibleibende Menge, also die nicht an den Bindungspartner gebundene und daher freie Form-,eine Funktion der vorhandenen Menge des konkurrierenden LigandenJ/wenn das markierte Konjugat in der gebundenen Form und das in der freien Form durch die zur Messung der Markierungssubstanz angewandten Mittel im wesentlichen nicht unterschieden werden können, müssen die gebundene Form und die freie Form physikalisch voneinander getrennt werden,

verfahren wird als "heterogen" bezeichnet. Wenn die gebundene Form und die freie Form des markierten Konjugats unterschieden werden können, kann eine "homogene" Arbeitsweise angewandt und die Trennung vermieden werden.

Die erstentwickelte Form von spezifischen Bindungs-

die
be Stimmungen war radioimmunologj.sche Bestimmung- ., bei der ein radioaktives Isotop als Markierungssubstanz angewandt wird. Bei einer derartigen Bestimmung muß notwendiger Weise eine heterogene Arbeitsweise angewandt werden. Aufgrund der Gefährlichkeit und schwierigen Handhabung von radioaktiven Substanzen sind verschiedene neue Bestimmungssysteme entwickelt worden, bei denen andere Substanzen als (radioaktive) Isotope zur Markierung angewandt werden, wie Enzyme, fluoreszierende Moleküle, Bacteriophagen, Coenzym« und lumineszierende Moleküle.

Verschiedene heterogene Bindungsreaktionssysteme, bei denen ein Enzym als Markierungssubstanz angewandt wird, sind angegeben in den US-PS 3 654 909, 3 791 932, 3 839 153, 3 850 752 und 3 879 262, J. Immunol. Methods Bd. 1, S. 247 (1972) und J. Immunol. Bd. 109, S. 129 (1972). Eine heterogene Bindungsbestimmung unter Anwendung einer nicht aktiven Vorstufe einer spektrophotometrisch nachweisbaren Substanz zur Markierung ist in der US-PS 3 880 934 angegeben. Von weiterem Interesse bezüglich des Hintergrunds heterogener Bestimmungen ist Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Odell und Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972). Eine immunologische Bestimmung der homogenen Art unter Verwendung einer Enzymmarkierung ist in der US-PS 3 817 834 beschrieben, bei der ein Ligand-Enzym-Konjugat angewandt wird. Die Enzymaktivität des Kon^ugats in der gebundenen Form ist weniger gut meßbar als in der freien Form, wodurch eine homogene Arbeitsweise angewandt werden kann. Die Anwendung besonderer einzigartiger Substanzenzur Markierung, wie von Coenzymen, lumineszierenden Molekülen und abspaltbaren fluoreszierenden Substra-

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Es ist Hauptaufgabe der voi :.legenden Erfindung, ein spezifisches ßindungsverfahren zu entwickeln, das sowohl für homogene als auch für heterogene Arbeitsweisen geeignet ist, bei dem eine einzigartige I-iarkiei < mgs substanz angewandt wird, die zu einer großen Verbindungskj isse gehört, für die ausgiebige Literatur vorliegt, um di .; Ausv/ahl spezieller Markierungen, die Entwicklung geeigiriter Derivate und die Überwachung von Reaktionen zu erleichtern.

Die Erfindung betrifft eim spezifische Bindungsbestimmung, bei der als Markierungi mbstanz ein reversibel bindender Enzymmodulator angewandt \ i.rd. Die erfindungsgemäße Markierungssubstanz kann sowohl i ^;ir homogene als auch für heterogene Arbeitsweisen angewandt werden, wobei das auf einen Liganden zu untersuchende flüssig'.5 Medium mit dem Reaktionsmittel zusammengebracht wird, um."¹ issend ein markiertes Konjugat, wobei ein Bindungsreaktionsr/stern entsteht, in dem die gebundene Form und die freie Fon> des Konjugats vorhanden ist. Die Menge an Konjugat, die in gel · indener oder in freier Form vorliegt, ist eine Funktion des Vorhandenseins oder der Menge des Liganden in dem zu untersuche aden flüssigen Medium. Erfindungsgemäß umfaßt das markierte 1 onjugat einen reversibel bindenden Enzymmodulator,der kovaler.t an eine Bindungskomponente des Bindungsreaktionssystems gebunden ist. Die Verteilung des Konjugats zwischen der gebundenem und freien Form wird bestimmt durch Zugabe eines Enzyms, dessen Aktivität beeinflußt wird entweder in Form einer Hemmung O'Mr^Sximulierung durch den Modulator, und Messung der sich ergeb"uden Enzymaktivität unter Anwendung einer homogenen oder heterogenen Arbeitsweise.

Bei den beiliegenden Figur· u ist

Fig. 1 eine Kurve, die die Hemmw.i rkung verschiedener Konzentrationen von Biotin-Modulator-Konjugat auf die Esteraseaktivität von Carbonsäureanhydrase zeigt, 'ie sie durch die Hydrolysegeschwindigkeit gemessen wird, ujii

ORIGINAL COPY

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Fig. 2 eine Kurve, die die Wirkuiwj verschiedener KonzentrationenAvidin auf die Hemmwirkuni, von Biotin-Modulator-Konjugat auf die Esteraseaktivit«·:; von Carbonsäureanhydrase zeigt, wie sie durch die Hydroly. ^geschwindigkeit gemessen wird.

In dieser Beschreibung habi α die folgenden Ausdrücke die angegebene Bedeutung: "Ligam." ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorbandensein oder Menge in einem flüssigen Medium bestimmt v;rden soll; "spezifischer Bindungspartner für den Liganden" ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die fine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt; "spezifisches Bindui>i$sanaloges des Liganden" ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich im wesentlichen in Beziehung auf lie Bindungsaffinität zu dem spezifischen Bindungspartner für den Liganden wie der Ligand selbst verhält; und "Nachvjisreaktion (monitoring reaction)" ist eine Reaktion, die dm-oh ein Enzym katalysiert wird, dessen Aktivität durch den arfindungsgemäß verwendeten Enzymmodulator beeinflußt, d.h. V3rringert oder erhöht, wird.

Die erfindungsgemäß angewandte neue Markierungssubstanz kann irgendeine chemische Substanz sein, die sich spezifisch oder nicht spezifisch in reversibler nicht kovalenter Weise mit einem Enzym verbindet und dadurch in meßbarer Weise,entweder durch Hemmung oder Stimulierung, die katalytische Aktivität des Enzyms in einer vorbestimmten Reaktion, d.h. der Nachweisreaktion für das Bindungr- system, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entsteht, beeinflußt. Unter "reversibel bindend" ist gemeint, daß die Bi;<lungskonstante für die Verbindung (Assoziation) des Enzymmodulators mit dem Enzym, das

11 die Nachweisreaktion katalysiert, veniger als ungefähr 10 m

beträgt. Vorzugsweise liegt die >^lindungskonstante zwischen ungefähr 10⁵ und ungefähr 10^ m~¹.

BAD GP'·"

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Eine Gruppe von Substanzen, die erfindungsgemäß anwendbare Enzymmodulatoren umfaßt, isi die Gruppe von reversibel bindenden Enzyminhibitoren (Hemm: hoffen), unabhängig davon, ob sie konkurrierend oder nicht— konkurrieren! (competitive, uncompetitive or noncompetetive) >ind. Konkurrierende Inhibitoren verbinden sich mit dem f re;" an Enzym auf eine solche Weise, daß sie mit dem normalen .'abstrat um die Bindung an den aktiven Stellen des Enzyms in Konkurrenz treten, wobei das Inhibitormolekül jedoch durcl· das Enzym nicht chemisch umgewandelt wird. Im Gegensatz drcu verbinden sich unkompetitive Inhibitoren nicht mit dem frrien Enzym oder beeinflussen dessen Verbindung mit dem normal*· > ι Substrat nicht, sondern sie verbinden sich mit dem entstehend-m Enzym-Substrat-Komplex und ergeben ein inaktives Addukte das nicht imstande ist, das normale Produkt freizusetzen. Nicht*-kompetitive Inhibitoren können sich sowohl mit dem freien Enzym als auch mit dem Enzym-Substrat-Komplex verbinden vond die normale Katalyse stören üblicherweise durch Bindi'ug an eine andere Stelle des Enzyms als die aktive Stelle, wodurch sie die empfindliche Konfiguration des aktiven Enzyms ändern.

Von den üblichen Enzyminhibitoren sind die kompetitiven bevorzugt. Im folgenden ist eine Tabelle von geeigneten kompetitiven Inhibitoren, den Enrymen, deren Aktivität duKh sie gehemmt wird, und ein ungefährer Wert für die Inhibitionskonstanten (K. ) für die Dissoziation der betreffenden Inhibitoren von den Enzymen angegeben.

Inhibitor .;Jnzym K₁ (m)

Acetazolamid ^arbonsäure-anhydrase 6x10

Sulfanilamid Carbonsäure-anhydrase 10

Phenyl—trimethyl-ammoniura-ion Acetylcholin-esterase 10~ Saccharo-1,4-lacton ß-Glucuronidase 10~

4-Amino-IO-methyl-pteroyl- Dihydrofolat-reduktase 10 ^ glutaminsäure

2,6,8-Trichlorpurin Uricase 10~

Es können auch wirksame Analoge, d.h. Derivate, Homologe usw., der oben angegebenen Inhibitoren angewandt werden. Zum Beispiel wird Acetylcholinest'rase auch durch p-Aminophenyl-trimethylamiQoniumion und durch den N-Methyl-N-(paminophenyl)-carbamatester von m-'.Trimethylamino)-phenol gehemmt.

Eine andere Gruppe von Substanzen, aus der geeignete Enzymmodulatoren ausgewählt werden können, sind aie allosterischen Effektoren. Derartige Substanzen wirken bei biologischen Prozessen als Regulatoren ö"S enzymatischen Metabolismus. Ihre Wirkung wird erreicht durch . pezifische Bindung an eine andere Stelle des Enzyms als die '.(Ar das Substrat aktive Stelle, wodurch die Aktivität des Enzyms gehemmt oder stimuliert wird, z.B. durch eine Konfcrmationsänderung. Im folgenden ist eine Tabelle von einigen·allenterischen Effektoren angegeben, die erfindungsgemäß als En/ymmodulatoren angewandt werden können. In der Tabelle sind 3'ihibitor oder negative Effektoren gekennzeichnet durch ( ■) und stimulierende oder positive Effektoren durch (+). Dj .· Quelle für das beeinflußte IJnzym ist ebenfalls in Klammern ar;.;egeben.

../Tabelle

TABELLE Allosterischer Effektor

L-Isoleucin (-) L-Valin (+)

Cytosin-triphosphat (CTP)

Adenosin-triphosphat (ATP)(+)

Desoxythymidin-triphosphat (dTTP) (-) Desoxycytosin-triphosphat (dCTP) (+)

ATP(-)

3',5 '-Adenosin-monophosphat

(AMP)(+)

dTTP(-) Deoxycytosin-diphosphat (dCDP(+)

ert-Ketoglutarat(-) Citrat (+)

5'-AMP(+)

L-Threonin(-) L-Isoleucin(+)

L-Methionin(+)

Adenosin-diphosphat (ADP)(+)

L-Valin(-) L-Threonin(-)

Uridin-diphosphat (UDP)-N-Acetyl-glucosamin(-)

Glucose-6-phosphat(+)

ATP(-)

Guanosin-triphosphat (GTP)(-) reduziertes NAD(-) Östrogene(-) Thyroxin(-) ADP(+)
Leucin(+) Methionin(+)

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Enzym

biosynthetische L-Threonindesaminase (E. coli K12)und (Hefe)

Desoxycytidylat-aminohydrolase (Esel-Milz)

Phosphofructokinase (Meerschweinchen-Herz)

Desoxythymidinkinase (E.coli)

Nicotinamid-adenin-dinucleotid-(NAD)-Isocitronensäuredehydrogenase (N. crassa)

NAD-Isocitronensäure-dehydrogenase (Hefe)

Homoserin-dehydrogenase (R. rubrum)

L-Threonin-deaminase (C. tetanomorphum)

Acetolactat-synthetase (E. coli) Threonin-aspartokinase (E. coli)

L-Glutamin-D-fructose-6-phosphat· transaminase (Ratten-Leber)

Glycogen-synthetase (Hefe) und (Lamm-Muskel)

Glutamat-dehydrogenase (Rinder-Leber)

Allosterischer Effektor

ATP(-)
5'-AMP(+)

Cytosin-raonophosnhat (CMP)-N-Acetyl-neuraminsäure(-) L-Threonin(-)

Lr-Lysin(-)
5'-AMP(-)

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Enzym

b (Kaninchen-

Phosphorylase
Muskel)

UDP-N-Acetyl-glucosamin-2-epimerase (Ratten-Leber)

Homoserin-dehydrogenase (E. coli)

Lysin-aspartokinase (E. coli)

Fructose-1,6-diphosphatase (Frosch-Muskel und Ratten-Leber)

Weitere Einzelheiten sind i'.\ J. (1965) angegeben.

Mol Biol. Bd. 12 S. 88

Um das markierte Konjugat borzustellen, das an dem Bindungsreaktionssystem teilnimmt, wird der Enzymmodulator kovalent an eine entsprechende Biudungskomponente eines solchen Reaktionssystems gebunden. Eine reiche Bindungskomponente ist der zu bestimmende Ligand, ein spezifisches Bindungsanaloges des Liganden oder ein spezifischer Bindungspartner zu dem Liganden, je nach dem ausgewählten Bindungsreaktionsschema. Einige der verschiedenen üblichen Bindungsreaktionsschemata werden später näher beschrieben. Das angewandte Verfahren,um den Enzymmodulator und die Bindui'^skomponente kovalent miteinander zu verbinden, ist nicht kritisch, solange die entstehende Enzym-Modulator-Gruppiej'img eine meßbare Menge modulierungsaktivität besitzt und ähi.vLich die entsprechende Gruppierung der Bindungskomponente eine geeignete Menge Aktivität in Beziehung auf das Bindungsreaktionssystem behält. Allgemein werden der Enzymmodulator und die Bindungskomponente direkt oder über eine Brücke mit aktiven Kuppelungsgruppen an entgegengesetzten Seiten, um die entsprechenden zu verbindenden Gruppen kovalent miteinander zu verbinden, aneinander gebunden. Die Brücke enthält üblicherweise 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoff atome oder Heteroatome, wie Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphoratoine usw. Beispiele für Brücken, die ein einzelnes Atom enthalten, sind die Methylengruppe (ein

Cohlenstoffatom in der Kette) um' die Aminogruppe (ein Heteroatom in der Kette). Die Brücke b< litzt üblicherweise ein Molekulargewicht von nicht mehr als Ό00 und vorzugsweise weniger ils 200. Die Brücke, soweit eine solche vorhanden ist, umfaßt iine Kette von Kohlenstoffatomen 'and/oder Heteroatomen und .st an den Enzymmodulator bzw. d.i. ¹J Bindungskomponente durch rerbindende Gruppen gebunden, di·· üblicherweise ausgewählt ;ind aus Ester, Amid, Äther, Thiosster, Acetal, Methylen und iminogruppen.

Im folgenden sind Struktur^ormeln für einige infrage ;ommende markierte Konjugate angegeben einschließlich den Lompetitiven Inhibitoren, die οI en als Markierungssubstanzen ingegeben sind,und ein allgemeines Verfahren zu ihrer Herstel-•ung.

A. Konjugate aus AcetazolawLd und Bindungskomponente

N N

^H2^NO2S^^S^^NHCO(CH₂)₄ ■Bindungskomponente

H₂NO₂S-" ^S-^"^NHCO(CH₂) NH- Bindungskomponente

In Beispiel 1, B und C sin<i Einzelheiten der Herstelung für derartige Konjugate angegeben.

../11

λ-

AS

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B. Kon jugate aus Phenyl-tr j i;iethylammonium-ion und Bindung skomponente

N⁰CCH

rCr

NHCO(CH₂) ₅NH-Bindungskompoi:'2nte

Die interessierende Bindung'.-.komponente wird kovalent an die Aminofunktion einer o-Aminoalkylcarbonsäure gebunden durch eine Reaktion wie eine nucleophile Substitution. Das entstehende Produkt wird dann mit Hilfe eines Aktivierungsmittels, wie Carbodiimid, an p-ADiino-N,N-dimethylanilin gebunden. Das entstehende Produkt vird anschließend mit Methyljodid behandelt, um das gev'inschte Konjugat

NH-f CO (CH₂) _?CONH (CH₂) ₃NH (CH₂) 2NHJ^-R

n=l,2 und R= Bindungskomponente

zu erhalten.

Die interessierende Bindungrkomponente wird durch geeignete Mittel (Aktivierung der Carboxylgruppe, nucleophile Substitution) an eine Aminogruppf; von 3»3'-Diaminodipropylamin gebunden. Das entstehende Px->dukt wird dann mit Bern-

und
steinsäureanhydrid behandelt di<> entstehende Substanz an die freie Aminofunktion des N-Methyl-N-(p-aminophenyl)-carbamatesters von m-(Triäthylam.tao)-phenol mit Hilfe eines Carbonsäure-Aktivierungsmittels »sbunden. Wahlweise kann der Inhibitor weiter von dem Liganden angeordnet werden durch Be-

- X-

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handlung des oben angegebenen sue inylierten Derivats mit 3,3'-Diaiainodipropylarain und Carb iiimid und anschließend Bernsteinsäureanhydrid und Kupplung an den Inhibitor (n=2).

C. Konjugat aus Saccharo-1,'-lacton und Bindungskomponente

C-HCOH I R=KCH₂),NH(CH₂ )_T

I o

-(CH₂) .-

C— NH— R—NH- Bindungskompone· ■ te

Saccharo-1,4-lacton wird an ein t ' ,^-Diaminoalkylderivat über die freie Carboxylgruppe mit Hilfe eines Carbonsäureaktivierenden Mittels gebunden. C-s entstehende Produkt wird dann an die Bindungskomponente üb r eine geeignete Reaktion, z.B. eine nucleophile Substitution, Carbonsäureaktivierung usw., gebunden.

D. Konjugate aus 4-Amino-1C methylpteroylglutaminsaure und Bindungskoniponente

CONH-CHC'iR

ι ι

NH₂

R = -OH oder-NH (CH₂) — Biri'Iungskomponente

r Λ0

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Die interessierende Bindung komponente wird durch eine entsprechende Reaktionsfolge an d.i e Aminofunktion eines <*,4A-Diaminoalkylderivats gebunden . Das bei dieser Umsetzung entstehende Produkt wird dann an "ine der Carbonsäurefunktionen von 4-Amino-IO-methyl-pteroyl glutaminsäure mit Hilfe eines entsprechenden Carbonsäure-rktivierenden Mittels, z.B. Carbodiimid, gebunden.

E. Konjugat aus 2,6,8-Trichiorpurin und Bindungskoinponente

_NH(CH₂)_nNH Bindvugskomponente

η = 1-6

2,6,8-Trichlorpurin wird mit Dihytiropyran und einer katalytischen Menge Säure behandelt unt r Bildung eines in 9-Stellung substituiei'ten Tetrahydi «pyranyläthers. Dieses Produkt wird dann mit einem ctf, O-Dia'.iinoalkan umgesetzt unter Bildung eines an dem CQ-Atom-subr.tituierten Aminoalkylaminderivats. Die Tetrahydropyran/l-blockierende Gruppe wird dann unter sauren Bedingungen entfernt unter Bildung von 2,6-Dichlor-substituiertem Purin. Die interessierende Bindungskomponente wird dann an die freie Alkylaminogruppe mit Hilfe irgendeiner geeigneten Reaktionsfolge gebunden.

Das erfindungsgemäße Bestiimaungsverfahren kann angewandt werden z.B. zur Bestimmung irgendeines Liganden, für den ein spezifischer Bindung.spartner existiert. Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für das ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen existiert oder synthetisiert werden kann. Der Ligand wird üblicherweise ausgewählt aus der Gruppe von Antigenen und deren Hormonen. Vitaminen. Metaboliten und pharmaKolo-

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gischen Mitteln und deren Rezeptoren und Bindungssubstanzen. Spezifische Beispiele für Liganden, die erfindungsgeniäß nachgewiesen bzw. bestimmt werder können, sind Hormone, wie Insulin, Choriongonadotropin, Thyroxin, Liothyronin und Östriol; Antigene und Haptene, wj-:.· Ferritin, Bradykinin, Prostaglandine und tumorspezifiscUe Antigene; Vitamine, wie Biotin, Vitamin B₁₂, Folsäure, V: kamin E und Ascorbinsäure; Hetaboliten, wie 3',5'-Adenosinmcnophosphat und 3',5'-Guanosinmonophosphat; phamiakologische Mittel, wie Dilantin, Digoxin, Morphin, Digitoxin und barbiturate; Antikörper, wie mikrosome Antikörper und Antikörper gegen Hepatitis und Allergene; und spezifisch bindende Rezeptoren, wie Thyroxin-bindendes Globulin, Avid in, Intrinsikfaktor und Transcobalamin.

Wie oben gesagt, kann das c rf indungsgeinäße Verfahren unter entsprechenden Bedingungen sowohl für eine homogene als auch für eine heterogene Arbeitsweise angewandt werden.

Homogene Arbeitsweise

Eine homogene Arbeitsweise, d.h. eine solche, bei der keine physikalische Trennung der gebundenen von der freien Form erforderlich ist, ist möglich, wenn die Reaktion zwischen der Bindungskomponente des markierten Konjugats und einem entsprechenden Bindung spar bier zu einer meßbaren Änderung, entweder einer positiven ο ι·ϊγ negativen Änderung₄ der Fähigkeit des konjugierten Enzymeodulators die Aktivität des die Nachweisreaktion katalysierenden Enzyms führt. In einem solchen Falle kann die Verteilung des Enzymmodulators zwischen der gebundenen und der frei an Form bestimmt werden durch direkte Zugabe des Enzyms zu dem Gemisch aus beiden Formen und Messung der Enzymaktivität. b;s sind verschiedene Arbeitsweisen zur Durchführung einer homogenen Bestimmung möglich, wobei die direkte Bindung und die Konkurrenzbindung bzw. kompetitive Bindung bevorzugt sind. , "*"*

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Bei der direkten Bindung wird ein Medium, in dem der Ligand vermutet wird, mit einem fc-^njugat zusammengebracht, umfassend den Enzymmodulator, der an einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden i.ebunden ist_}und die Änderung der Aktivität des Enzymmodul·'ι tors bestimmt. Bei der Konkurrenzbindung wird das flüssige Medium mit einem spezifischen Bindungspartner für den IJ.ganden und mit einem Konjugat zusammengebracht, umfassend den Enzymmodulator, der an den Liganden und/oder ein spezifisches Bindungsanaloges davon gebunden istj und anschließend die Änderung der Aktivität des Enzymmodulators, bestimmt. Bei beiden Arbeitsweisen wird die Aktivität der Enzymmodulators bestimmt, indem man das flüssige Medium mit mindestens einem Reagens zusammenbringt, das mit dem Enzyny'Odulator die vorausbestimmte Nachweisreaktion eingeht. Der qualitative Nachweis eines Liganden in dem flüssigen Medium umfaßt einen Vergleich einer Charakteristik üblicherweise der Geschwindigkeit der entstehenden Nachweisreaktion mit derjenigen in einem flüssigen Medium, das keinen Liganden enthält, wobei ein auftretender Unterschied ein Zeichen füv eine Aktivitätsänderung des Enzymmodulators ist. Bei der quantitativen Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium vird eine Eigenschaft der entstehenden Reaktion mit derjenigen einer Nachweisreaktion in flüssigen Medien, die bekannte Mengen des Liganden enthalten, verglichen.

Allgemein können bei einer homogenen Arbeitsv/eise die Komponenten der spezifischen Bincuingsreaktion —d.h. das flüssige Medium, in dem der Ligar.··· vermutet wird, das Konjugat und/oder ein spezifischer Bindung'.partner für den Liganden-in jeder beliebigen Menge, Weise und Reihenfolge zusammengebracht werden, vorausgesetzt, daß die Aktivität des Enzymmodulators in dem Konjugat meßbar verändert vrird, wenn die Flüssigkeit den Liganden in einer Menge oder Konzentration enthält, die für die Bestimmungszwecke von Bedeutung ist. Vorzugsweise sind alle Bestandteile der speziiIschen Bindungsreaktion in dem

Wenn eine Arbeitsweise unte* Ausnutzung einer direkten homogenen Bindung angewandt wird, sind die Komponenten der
Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet v/i rd, und eine Menge eines K-njugats aus dem Enzymmodulator und einem spezifischen .'indungspartner für den
Liganden. Die Aktivität' des konjugierten Modulators ändert
sich bei Berührung mit dem flüssigen Medium, umgekehrt
proportional zu dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner in dem Konjugat. So nimmt mit zur·.ahmender Menge des Liganden in dem flüssigen Medium die Akti\ ^; tat des konjugierten Modulators ab.

Wenn ein Konkurrenzbindungf erfahren angewandt wird,
sind die Komponenten der Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, 'ine Menge eines Konjugats
aus dein Enzynunodulator, der an der Liganden gekuppelt ist
oder einem spezifischen Bindungsanalogen zu dem Ligandenj und eine Menge eines spezifischen Bin■ ungspartners zu dem Liganden. Der spezifische Bindungspartner ν i.rd im wesentlichen gleichzeitig mit dem Konjugat und dem i Lüssigen Medium zusammengebracht. Da etwaiger vorhandener L,i.gand in dem flüssigen Medium mit dem Liganden oder spezifischen Bindungsanalogen davon in dem Konjugat um die Bindung mit Cam spezifischen Bindungspartner in Konkurrenz tritt, ändert sich die Aktivität des
konjugierten Modulators bei Berüi^ung mit dem flüssigen Medium direkt mit dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner. Daher nimmt mit zunehmender Menge des ] i.ganden in dem flüssigen
Medium die Aktivität des konjugif ^i>ten Modulators zu.

Eine Variation des homogenen Konkurrenzbindungsverfahren ist die homogene Verdrängungsrealt tion, bei der das Konjugat
zunächst mit dem spezifischen Biiiiungspartner für den Liganden und anschließend mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird.

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Dabei tritt dann eine Konkurrenz im den spezifischen Bindungspartner ein. Bei einem derartiger- Verfahren ist die Menge an Konjugat, die mit dem spezifisch« α Bindungspartner zusammengebracht wird, üblicherweise so, 'laß sie den Liganden oder dessen Analoges in einem überschuh gegenüber der Menge enthält, die imstande ist, mit der vorhancinen Menge an spezifischem Bindungspartner während der Zeit. Bindungen einzugehen, die das Konjugat und der spezifische bindungspartner vor der Berührung mit der flüssigen Probe, j.n der der Ligand vermutet wird, in. Berührung ist. Diese Reihenfolge des Kontaktes kann auf zwei bequeme Arten erreicht v-irden. Bei einer Art wird das Konjugat mit dem spezifischen Bindungspartner in einem

<^un^f zwar flüssigen Medium zusanuaengebracm:\ vor dem Kontakt mit dem flüssigen Medium, in dem der Ligcud vermutet wird. Bei der zweiten Art wird das flüssige Mec' Lum, in dem der Ligand vermutet wird, mit einem Komplex zur unmengebracht aus dem Konjugat und dem spezifischen Bindung f. j »artner, wobei die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat und der spezifische Bindungspartner aneinander gebunden ;;ind. Die Menge an Konjugat, die an den spezifischen Bindungspf-rtner bei dem ersten Verfahren gebunden wird oder die bei. dem zweiten Verfahren in Komplexform vorliegt, ist übliche Λ/eise größer als diejenige, die von dem gesamten Liganden in -lern flüssigen Medium in der Zeit verdrängt werden kann, die cir spezifische Bindungspartner oder Komplex und das Medj'im in Berührung stehen, bevor eine etwaigo Änderung der Aktivi^H it des konjugierten Modulators vollständig bestimmt wird.

Eine andere Variation des homogenen Konkurrenzbindungsverfahrens ist ein aufeinanderfolgendes Sättigungsverfahren (sequential saturation homogeneov ; technique), bei dem die Bestandteile der spezifischen Bindnagsreaktion die gleichen sind, wie sie für das Konkurrenz!· Lndungs verfahr en angewandt werden, aber die Reihenfolge der Zugabe oder Kombination der Bestandteile und die relativen Meugen, die angewandt werden, unterschiedlich sind. Bei dem au:· ϊ inande rf olgenden Sättigungs-

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jrfahren wird der spezifische Bii'dungspartnerfür den Ligan-3n mit dem flüssigen Medium, in '.'em der Ligand vermutet Lrd, eine zeitlang zusammengebracht, bevor das flüssige ädium mit dem Konjugat zusammengebracht wird. Die Menge an pezifischem Bindungspartner, die mit dem flüssigen Medium jsammengebracht wird, ist üblicherweise größer als die Menge, ie imstande istjinit dem gesamten Liganden,der in dem flüsigen Medium vermutet wird, in de" Zeit Bindungen einzugehen, ie der spezifische Bindungspartn ;r und das flüssige Medium ti Berührung stehen, bevor das flüssige Medium mit dem onjugat zusammengebracht wird. I -(rner ist die Menge an Ligand

, oder Analogen zu dem Ligander in konjugierter Form übicherweise größer als diejenige Ienge, die imstande ist.mit er verbleibenden nicht—gebundene α Menge an spezifischem Binungspartner während der Zeit Bindungen einzugehen, die das lüssige Medium und das Konjugat .n Berührung stehen, vor der ollständigen Bestimmung einer ßa derung der Aktivität des onjugierten Modulators.

eterogene Arbeitsweise

Ein Enzymmodulator kann audi als Mark ie rungs sub stanz ngewandt werden bei üblichen heterogenen Bestimmungsverfahren, pe! denen die gebundene und frei« Form des markierten Bestandteils getrennt werden und die Men.-je der Markierungssubstanz in ^er einen und/oder anderen Form ι '»stimmt wird. Die Reagentien ;ur Durchführung eines derartige: heterogenen Bestimmungs^rerfahrens können verschiedene Firmen haben. Im allgemeinen unfassen derartige Reagentien dr·! Grundbestandteile und zwar I. den nachzuweisenden Liganden, I. einen spezifischen Binlungspartnerfür den Liganden und 3. einen markierten Bestand- ;eil, der üblicherweise eine markierte Form a) des Liganden, 3) eines spezifischen Bindungsannlogen zu dem Liganden oder ;) des spezifischen Bindungspartners ist. Die Bestandteile der 3indungsreaktion werden gleichzeitig oder nacheinander zu-

und es werden an,- emessene Inkubationszeiten

COPY

S3 275408$

eingehalten, wobei der markierte Y-.istandteil an die entsprechenden konkurrierenden Bindungsp.^tner gebunden wird, sodaß das Ausmaß der Bindung, d.h. das Verhältnis der Menge an markiertem Bestandteil, der an den B.iudungspartner gebunden ist, zu dem nicht gebundenen, eine Fun) eion der vorhandenen Ligandenmenge ist. Im folgenden wird e.i.ie kurze Beschreibung einiger unterschiedlicher heterogener iindungsschemata angegeben, die zur Durchführung des erfindunj.sgemäßen Verfahrens angewandt werden können.

In den folgenden Diagrammen ./erden die folgenden Sympole und Abkürzungen verwendet:

../2O

2 If

1A-50 012

Symbol Definition

L
©

nachzuweisender Ligand

Ligand oder spezifisch bindendes Analoges dazu

Biddungspartner für den Liganden

Markierungssubstanz, d.h. Enzymmodulator

unlösliche Phase

Inkubationszeit

(lim) (exe)

(sep) limitiert; in einer Menge vorhanden, die geringer ist als diejenige, die von den gesamten bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während der angewandten Inkubationszeit gebunden werden kann, d.h. der Bestandteil, um den die anderen Bestandteile in Konkurrenz treten, um mit ihm Bindungen einzugehen

Überschuß; in einer Menge vorhanden, die größer ist als diejenige, die imstande ist, von den gesamt-verfügbaren bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während der angewandten Inkubationszeit gebunden zu werden

Trennung der gebundenen von der freien Phase

- 21 -

1. Schemata für heterogene Bestimmungen durch Konkurrenzbindungsreaktionen

(a) L +© + B(lim) ^ + unlöslich machende

Mittel für B oder

Das ist das klassische Chema einer Konkurrenzbindungsreaktion. Beispiele für die unlöslich machenden Mittel sind spezifische ausfällende Antikörper, spezifische unlöslich gemachte Antikörper und, wenn B oder L ein proteinartiges Material iat, proteinausfällende Substanzen, wie Ammoniumsulfat, oder wenn B oder L ein kleines adsorbierbares Molekül ist, mit Dextran überzogene Aktivkohle. Ähnliche Systeme sind beschrieben in Biochem. J. 88, 137. (1963) und US-PS 3 839 153.

(b) L +© * + I-B(lim) ^ (sep)

Diese Reaktion wird allgemein als Festphasen-Verfahren (solid-phase technique) bezeichnet. Die Beschreibung ähnlicher radioimmunologischer oder anzymatischer immunologischer Bestimmungsverfahren findet sich in US-PS 3 505 019, 3 555 H3, 3 646 346 und 3 654 090.

(c) L + B* + f-@ (lim) > (sep)

(US-PS 3 fc>54 090)

(d) L + |-(l) + B (lim) ) (sep)

(US-PS 3 850 752).

- 22 -

2754088

ϋ. Heterogene aufeinanderfolgende Sättigunf<sverfahren

(a) L + B(exc) ^ + (l) (exc) >+ unlöslich ma

chendes Mitte^ für B oder^L) (sep)

Bei dem aufeinanderfolgenden Sättigungsverfahren (sequential ·. saturation technique) werden einige oder alle bindenden Stellen von B, die nach der ersten Inkubationszeit noch verbleibeu, durch den markierten Bestandteil gebunden.

(b) L + f- B(exc) >+© * (exc) > (sep)

Beschreibungen ähnlicher radioimmunologischer und enzymatisch immunologischer Bestimmungsverfahren finden sich in US-PS 3 710 760 und J. Immunol. 209, 129 (1972).

3. Heterogene "Sandwich"-Verfahren

W₁

L + f- B(exc) ) B (exc) ) (sep)

Bei dem "Sandwich"-Verfahren werden einige oder alle Ligandenmoleküle an den unlöslich gemachten Bindungspartner von dem markierten Bestandteil gebunden (US-PS 3 720 760).

4. Festphasen-Liganden-Adsprptions-Verfahren

L + (lJ * + !-(nicht-spezifisch) ^+ B(lim) ^ (

Bei diesem Verfahren werden der Ligand und der markierte Bestandteil an eine nicht-spezifische Substanz gebunden und anschließend proportionale Mengen durch Bindung mit einem Bindungspartner mit einer größeren Affinität, als sie Tünrinnranartner für den Liuanden zu dem markierten Bestand—

P 2? 54 ÜÖ6.9 (Yl 1A-50

275408$

Bei der günstigsten Form dieses Verfahrens wird eine Säule uine3 nicht-spezifischen bindenden Mittels angewandt (US-PS 3 659 104). Ein solches Verfahren 1«t geeignet, wenn der Ligand in der Probe an endogene bindende Substanzen gebunden ist, die, wenn sie nicht entfernt werden, bei der Konkurrenz-Bindungsreaktion stören wurden. Nach-.der Bindung an das nicht-spezifische Bindungsmittel können die endogenen bindenden Substanzen durch entsprechendes Auswaschen entfernt werden.

Bezüglich der weiteren Diakussion von Parametern, die bei üblichen heterogenen Bestimmungsverfahren eine Rolle spielen sowie die mehr ins einzelne gehende Beschreibung von Bestimmungsverfahren und alternativen Trennverfahren, wird auf Principles of Competitive Protein-Bindung Assays, Herausg. Odell und Daughaday (J, B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972) verwiesen.

Im Rahmen der Erfindung ist es auch möglich, andere Verfahrensarten anzuwenden, wie andere Reihenfolgen der Zugabe und andere Bindungsreaktionatechniken zur Durchführung von heterogenen und homogenen spezifischen BindunipbeStimmungen.

Die Bestimmung der Aktivität des konjugierten Reagens als Bestandteil des vorher bestimmten Nachweisreaktionssystems entweder in der gebundenen oder in der freien Phase wird bequem erreicht, indem man diese Phase mit mindestens einer Substanz zusammenbringt, die mit dem konjugierten Reagens die Nachweisreaktion bildet und ein Charakteristikum dieser Reaktion mißt. Das Nachweisreaktionssystem kann eine einzelne chemische Umwandlung oder eine Vielzahl oder Reihe von chemischen Umwandlungen

umfassen.

<■ ' -Ji

Das zu untersuchende fluss.: <;e Medium kann eine natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Flüssigkeit sein, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält, und ist üblicherweise eine Körpe? flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die bei der Verdünnung oder sonstigen Behandlung einer biologischen Flüssigkeit entsteht. Biologische Flüssigkeiten, die erfindungsgem^ß untersucht werden können, sind u.a. Serum, Plasma, Urin, ai'viiotische, Cerebral-und Spinalflüssigkeiten. Andere Substanzen, wie Feststoffe, z.B. Gewebejoder Gase können ebenfalls untersucht werden, wenn sie z.B, durch Lösen des FeststoTCs oder Gases in einer Flüssigkeit oder durch Flüssigkei tsextraktion des Feststoffes in eine flüssige Form gebracht wurden können.

Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Herstellung der «iaterialien

A. Carbonsäureanhydrase

Das Enzym wurde aus menschlichen roten Blutkörperchen isoliert, entsprechend dem Verfahren von Armstrong et al, J. Biol. Chem. Bd. 241, S. 5137-:>149 (1966) mit der Ausnahme, daß die Dialyse vor der Ausfällung mit Ammoniumsulfat weggelassen wurde. Der Niederschlag wurde in 0,05m Tris-(hydroxymethyl)-amxnomethan-hydrochlorid (Tris-HCl)-Puffer, pH 8,7, gelöst und über eine 2,5x55 cm S^;iule, die mit DEAIS-Cellulose beschickt und mit dem gleichen Puffer äquilibriert war. chromatographiert. Das Enzym v/urrie in einer Fraktion mit dem Tris-HCl-Puffer eluiert.

COPV

B, 5- (. C is -hexahydro -2- oxo- IH- tJ: i.eno[3,4-d] imidazole)

-N- (5- sulfonamido-1,3,4-thi.'liazo -2- yl) valeriansäureamid

O₂NH₂

Biotin-Modulater- Konjugat

iiine Lösung von 300 mg (1,2 mMol) wasserfreiem Biotin in 19,5 ml trockenem Dimethylformamid wurde bei -10 C unter trockenem Stickstoff gerührt unc 0,17 ml (1,2 mMol) trockenes Triäthylamin zugegeben (Knappe ot al, Biochem. Z. 338, S. 599 (1963) ). Eine Lösung von 0,141 ml frisch destilliertem Athylchlorformiat in 3 ml trockenem Diäthyläther wurde zugetropft, wobei ein weißer Niederschlag entstand. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -10⁰C gerührt und dann unter Stickstoffatmosphäre filtriert. Das Filtrot wurde sofort auf -10⁰C gekühlt und eine Lösung von 438 mg (2,43 mMol) 2-Amino-1,3,4-thisdiazol-5-sulfonamid (Roblin et al, J. Am. Chem. Soc. Bd. 72, S. 4890-4892 (1950) ) ii\ 3 ml trockenem Pyridin zugegeben. Die entstehende Lösung wurde 15 Minuten bei -10 C und anschließend 30 Minuten bei Flau!".temperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden bei 40⁰C ui-ter Vakuum abgedampft, wobei ein öliger Rückstand verblieb. I..'as Öl wurde bei 0°C mit 50 ml 0,3n Salzsäure gerührt. Der entstehende weiße Feststoff (400 mg) wurde abfiltriert und in 10 Gew.-% Natriumbicarbonatlösung gelöst. Diese Lösung wurde im Eisbad gekühlt und mit konz. Salzsäure auf einen pH-Weit von 6,5 gebracht. Der entstehende beige-farbene Niederschlag wurde abfiltriert. Man erhielt 130 mg (Fp 254⁰C Zers.), Beim Umkristallisieren, aus

• atf' -

30 275Λ086

Analyse berechnet für C₁₂H₁₀U₆O^₃: C 35,46; H 4,46; N 20,67 gefunden : C 35,62; H 4,47; N 20,55

:. 6-(2,4-Dinitroanilino)-N-(5-sulfonamid -1,3,4-thiadiazo -2-yl) capronsäureamid

V ί (! N-N

DNP-Modulator-i.onjugat

Eine Lösung von 357 nig (1,>" mMol) v/as serfrei em 6-(2,4-Dinitroanalino)-capronsaure (Ganmsha et al, Obshchei Khim Bd. 29, S. 1554-1558 (1959) ) wurde in das gemischte Anhydrid umgewandelt nach der stufenweise)' Zugabe von Triäthylamin und Athylchlorfonniat, wie unter B angegeben. Das Filtrat wurde sofort auf -10°C abgekühlt und das Produkt bei -10° mit einer Lösung von 43Ü mg (2,A ; mMol) 2-Amino-1,3,4-thiadiazol-5-sulfonamid (wie unter B beschrieben erhalten) in 3 ml trockenem Pyridin vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei O⁰C gerührt und dann die Lösungsmittel bei 30⁰C unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde 1 Stunde bei O⁰C mic 100 ml 1,5n Salzsäure gerührt und der entstehende gelbe Niederschlag abfiltriert iu;d 1 Stunde bei 0⁰C mit 100 ml 10 Gew.-%iger Natriumhydroxidlöiung gerührt. Der gelbe Feststoff wurde abfiltriert und aus .äßrigem Methanol umkristallisiert. Man erhielt 50 mg einet· gelben Feststoffes. Ausbeute 9 %; Fp 229-233⁰C
Analyse berechnet für C₁^H₁-NyO^^₂: C 36,60; H 3,73

gefunden : C 37,07; H 3,96; N 21,19

D. Reagens-Lösungen ^

(1) Acetazolamid-Reagens: 1,:> mg 2-Acetylamino-1,3»4-thiadiazol-5-sulfonamid vurden in einigen Tropfen Dimethylsulfoxid gelöst und mit Wasser auf 50 ml verdünnt. Weitere Verdünnungen wurden mit Wasser vorgenommen.

(2) Biotin- und DNP-Modulat^r-Reagentien: Das Biotin-Modulator-Konjugat (2,0 mg) und das DNP-Modulator-Konjugat (1,7 mg) wurden jeweils* in 10 ml 0,1m Natriumcarbonatpuffer, pH 10,5, verdünnt. Weitere Verdünnungen wurden mit »/asser vorgenommen.

(3) Avidin-Reagens: LyophilJ.siertes Avidin (Sigma Chemical Co., St. Louis. Mssouri) wurde in 10 mMol Tris-HCl-Puffer, pt· 7,4, in einer Konzentration von 10,5 Aktivität?einheiten/ml (eine Einheit ist die Menge, die imstande ist, ein yug Biotin zu binden) gelöst.

(4) Antikörper· zu Dinitroph?nyl-(DNP)-Reagens: Antisera, die gegen DNP gebildet worden waren, wurden bei 4°C über eine 5 x T) cm Säule mit Sephadex G-200 (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) mit 0,1m Tris-HCl-Puffer, pH 8,2, enthaltend 1m Natriumchlorid chromatographiert. Der zweite eluierte Anteil, der durch die optische Dichte bei 280nm bestimmt wurde, enthielt die Antikörper-Aki.ivität gegen DNP.

(5) p-Nitrophenyl-acetat-Re-'gens: 5 mg p-Nitrophenylacetat in 0,3 ml Aceton wurden mit destilliertem Wasser unter Rühren auf 10 ml gebracht.

Beispiel 2 Esterase-Aktivitviten von Carbonsäure-Anhydrase

als Funktion der Acetazolamid-Konzentration

Carbonsäure-Anhydrase (0,0I3 Internationale Einheiten) wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur in eine Reihe von 0,66 ml wäßrigen Lösungen, enthaltend jtv/eils 100 /Ul 0,1m Diäthylmalonsäure-Puffer, pH 7»4, und die in Tabelle 1 angegebenen

³³ 275A0S6

ogei' auf 1 ml ündvolumeh). 0,3:

Acetazolamid und Avidin, bezogen au!" 1 ml ündvolumeh). O,33 ml p-Witrophenyl-acetat-Reagens wu! len zu jeder Lösung gegeben, um ein Gesamtvolumen von 1 ml z\- erhalten. Die Hydrolysegeschwindigkeit von p-Nitrophenyl; :etat wurde durch Beobachtung der Absorption bei 348 nm Iistimmt.

Die Ergebnisse, die jewei.l 3 das Mittel von 2 Messungen sind, sind in Tabelle 1

	Tabeli.	3 1	Hydrolysegeschwindig
Acetazolamid-	Avidin		keit (AOD^Q/min/ml)
Konzentration (/UM)	(Einhe·	ten/ml)	0,136
0,000			0,088
0,144	-		0,047
0,283	-		0,089
0,144	0,1':	5	0,111
0,000	-		0,106
0,000	0,1"

Diese Werte zeigen, daß d .s Acetazolamid das Enzym Cai'bonsäure-Anhydrase hemmte un.! daß das Vorhandensein von Avidin keine deutliche Wirkung -uf die Hemmung ausübte.

Beispiel 3 ^sterase-AktiviIäten von Carbonsäure-

/unhydrase als funktion der Biotin-Hodulator-Konjugat-Konzen !.ration

Carbonsäure-Anhydrase (O,'/27 Internationale Einheiten) wurde 5 Minuten bei Raumte'perat'.ir in eine Reihe von 0,66 ml wäßrigen Lösungen, enthaltend 100 >ul 0,1m Diäthylmalonsäure-Puffer, pH 7,4, und die in Tabe'le 2 angegebenen Mengen an Biotin-Modulator-Konjugat (hergestellt entsprechend Beispiel 1 inkubiert (Konzentration des Kcujugats, bezogen auf 1 ml Endvolumen). Die Esterase-Aktivitä'., wie sie durch die Hydrolysegeschwindigkeit gemessen wurde, wurde für jedes Reaktions-

33 2754088

gemisch wie in Beispiel 2 bestii-'it. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und in graphischer Forci in Fig. 1 angegeben.

Tabelle 2

Biotin-Modulator-Konjugat-	Hydrolysegeschwindigkeit
Konzentration ( /UM)	(ÄOD_34ö/min/ml)
0,00	0,136
0,05	0,120
0,10	0,109
0,20	0,103
0,30	0,071
0,40	0,057
0,50	0,040

Diese Daten zeigen, daß da^ Biotin-Modulator-Konjugat gute Heminwirkungen, bezogen auf 'Jie Carbonsäure-Anhydrase besitzt und etv/as weniger wirksam Ist als der nicht abgeleitete (underivatized) Inhibitor Acetaz'lamid.

Beispiel 4 Direkte Bindungsl estimmung für Avidin;

Konkurrenz-Bindu':gsbestimmung für Biotin; Anwendung von deiivatisiertem Acetazolamid als Markierungssübstanz

Jis wurde eine Reihe von Biiidungsreaktionsgemischen hergestellt, jeweils in einem Volumen von 0,66 ml, enthaltend 100 /Ul 0,1m Diäthylmalonsäure-luffer, pH 7,4, und die in Tabelle 3 angegebenen Konzentrat·onen an Biotin-Modulator-Konjugat (hergestellt entsprechend Beispiel 1, B), Biotin und Avidin (Konzentrationen bezogen auf 1 ml Endvolumen). Nach 5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,027 Carbonsäure-Anhydrase zu jedem Koaktionsgemisch gegeben und anschließend weitere 5 Minuten Mikubiert. Dann wurden 0,33 ml p-Nitrophenyl-acetat-Reagens zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und die Hydrolysegeschwind Lgkeit durch Beobachtung der Absorption bei348 nm gemessen.

Die Ergebnisse, die jeweil ■ das Mittel aus zwei Messungen darstellen, sind in Tabelle 3 angegeben. Die Ergebnisse der Reaktionsgemische 2 bi 9 sind in graphischer Form in Fig. 2 angegeben.

Die Werte für die Reaktion'gemisch 2 bis 9 zeigen die Y/irkung verschiedener Gehalt;^: an Avidin auf die Hemmwirkung des Biotin-Modulator-Konjugats auf die Esterase-Aktivitäten von Carbonsäure-Anhyirase. Für einen konstanten Gehalt an Biotin-Modulator-K'»ijugat ist die enzymatische Kydrolysegeschwindigkeit direkt proportional der vorhandenen Avidinmenge. Die Ergebnisse der Gemische 8, 10 und 11 zeigen, daß, wenn BAotin vorhanden ist, die Hydrolysegeschwindigkeit der vorhandenen Menge umgekehrt proportional ist.

../Tabelle

Tabelle

lisch Biotin-Modulator-fcenjuBat (μΜ)

Biotin CuM)

Avidin (E /ml) Hydrolysegeschvindigkeii

0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0_f 50

2r* Absorption / min bei 348 nm

0,10 0,60

0,011
0,026
0,040
0,053
0,065
0,079
0,105
0,126
0,105

0,105

0,128 0,049 0,056 0,066 0,075 0,079 0,090 0,129 . 0,136 0,104 0,080

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Beispiel 5 Konkurrenz-Bindun ι sbestimmung von Dinitro-

phenyl (DN$-Deriv ten

Anv/endung von der>vatisiertem Acetazolamid als Harkierungssubst8!>z

Es wurde eine Reihe von BirHungsreaktionsgemischen hergestellt, jeweils in einem Volume.» von 0,66 ml und enthaltend 100 /Ul 0,1m Diäthylmalonsäure-Pu'.'fer, pH 7,4, und die in Tabelle 4 angegebenen Mengen an / etazolamid, DNP-Modulator (entsprechend Beispiel 1, C hei*ge 'teilt), N-DNP-6-aminocaproat (Biochem. J. Bd. 42, S. £t«7 (1948) ) und Antikörper zu DNP (die Konzentrationen sind .Jeweils auf 1 ml Endvolumen bezogen). Nach 5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,03 I.E. Carbonsäure-Anhy-Arase zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und anschließend ·> Minuten inkubiert. Dann wurden 0,33 ml p-Nitrophenyl-acet it-Reagens zugegeben und die Hydrolysegeschwindigkeit gemessen durch Beobachtung der Absorption bei 34ö nm.

Die Ergebnisse, die das Mil eel aus zwei Messungen darstellen, sind in Tabelle 4 angeg^oen. Ein Vergleich der Ergebnisse bei den Heaktionsgemischen 1, 3 und 5 zeigt, daß Acetazolamid die Carbonsäure-Anh;· li'ase-Reaktion hemmte und im wesentlichen nicht beeinflußt wurde durch das Vorhandensein von Antikörper zu DNP. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionsgemische 1, 2 und 4 zeigt, Onß das DNP-Modulator-Konjugat auch die Carbonsäure-Anhydrase-R'Uiktion hemmte, wobei der Grad der Hemmung bei Vorhandensein vor· Antikörper zu DNP abnahm. Die Ergebnisse des Reaktionsgemische-^: G zeigen, daß das Vorhandenseins eines DWP-Derivats keinen ■..' iutlichen Einfluß auf die Carbonsäure-Anhydrase-Reaktion ausübt. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionsgemische 2 und 7 zeigt, daß das Vorhandenseins des DNP-Derivats bestimmt .erden konnte durch Beobachtung der verstärkten Hemmung der Carbonsäure-Anhydrase-Reaktion durch das DNP-itodulator-Konjugat.

BAD ORIGINAL

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1A-50 012 Anin. : Miles Lab.

Patentansp? üche

1.) Spezifisches Bindungsve rf raren zum Nachweis und zur Bestimmung eines läganden in einer flüssigen Medium, bei dem man das flüssige Medium mit «if igentien zusammenbringt, umfassend ein Koajugat aus einer I irkierungssubstanz und einer bindungskomponente unter Bi: iung eines Reaktionssystems, in dem eine gebundene und eine irr :e Form des Korijugats vorliegt, und wobei die Menge an Ligi iden in dem flüssigen Medium bestimmt wird als Funktion ^rler Menge der Karkierungssubstanz, die in der gebundenen oc :r freien Form vorliegt, dadurch gekennzeichnet , daß man als I-iarkierungssubstanz einen reversibel bii ienden Enzymmodulator verwendet und ein xinzytii zusetzt, des; -m Aktivität durch den Modulator beeinflußt wird, und die i^;iei ;e an Enzyrumodulator in der gebundenen oder freien Form als SViktion der Aktivität des mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindur'Skonstante für die Assoziation des reversibel bindenen linzyruodulators mit dem L'nzym

11 —1
weniger als ungefähr 10 m bet:¹ igt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 >der 2, dadurch g e -

k e n nz e i c h η e t , daß die 'ündungskonstante für die reversible Binaung zwischen dem Σ] lymmodulator und dem Enzym

c, 9—1

ungefähr 10 bis ungefähr 10 m I aträgt.

4. Verfahi-en nach Anspruch 1 ois 3_t dadurch g e kennzeichnet, daß de: reversibel bindende Enzymmodulator die Aktivität des Lnzyin hemmt.

/■

ä 275408g

5. Verfahren nach Anspruch ^! bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß 'er reversibel bindende ünzyiiuiiodulator ein kompetitiver nhibitor für das iCnzym ist.

b. Verfahren nach Anspruch '. bis 'j, dadurch ge

kennzeichnet , daß -lan als reversibel bindenden kon;petitiven Inhibitor ur I als Enzym

(a) Acetazolamid oder ein wirksi'ues Analoges davon und Carüonsäure-Anhydrase;

(b) oulianilaiiiid oder ein v/irks; ies Analoges davon und Carbonsäure-Anhyürase;

(c) Phenyl-crimethylammonium-ior oder ein wirksames Analoges davon und Acetylcholiner ';erase;

(d) Saccharo-1,4-lacton oder eil wirksames Analoges davon und ß-Glucuronidase;

(e) 4-Aiiiirio-IO-methyi-pteroylgl¹· caminsäure oder ein wirksames Analoges davon una uii/drofolatreduktase oder

(f) 2, ο ,8-Trichlorpurin oder ei.¹¹ wirksames Analoges davon und Uricase verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ier reversibel bindende Enzyim.iodulator die Aktivität ue Enzyms stimuliert bzw. erhöht .

ü. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, uadurch gekennzeichnet , daß der Enzymmodulator als Bestandteil des Konjugats die Akt vität des Enzyms anders beeinflußt, wenn das Konjugat in ebundener Form vorliegt als wenn es in freier b'orm vorliegt

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein homogene Arbeitsweise anwendet und das Enzym zu dem Geu ■ sch aus gebundener und freier Form zusetzt.

CCvY

10. Verfahren nach Anspruch I bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß ii in heterogen arbeitet
und die gebundene von der freien ''orm physikalisch trennt und dann zu einer Form das i&izym zusetzt.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß ^#:er Ligand ein Antigen oder Antikörper dazu, Hapten oder Antikörper dazu, Hormon,
Vitamin, Wetabolit oder'pharmako'ogisches Mittel oder ein Rezeptor oder eine bindende Subs-anz dazu ist.