DE2754086A1 - Spezifisches bindungsverfahren zum nachweis und zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium - Google Patents
Spezifisches bindungsverfahren zum nachweis und zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen mediumInfo
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Description
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IH. I.V(;. I·. HKIIHKiVS TK. KKoK (oho) o^auei
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1'ATKNTAKWAlZfJ4 L TK..K..HAM
. 275A08S
1A-50 012
Patentanmeldung
Anmelder: MILES LABORATORI' S, INC.
Elkhart, Indiana 46514, U.S.A.
Titel: Spezifisches Bim !ungsverfahren zum Nachweis
und zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium
COPV
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27540«·
1Α-50 012
Anm.: Miles Lab.
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine spezifische Bindungsbestimmung zum Nachweis bzw. zur Bp Stimmung eines Liganden in
einem flüssigen Medium, bei der als Markierungssübstanz ein reversibel bindender Enzymmodulator angewandt wird. Das
Verfahren selbst wird durchgeführt: wie übliche spezifische Bindungsbestimmungsverfahren, die homogen oder heterogen
sein können, bei denen das zu untersuchende flüssige Medium mit Reagentien zusammengebracht v.ird, die ein markiertes
Konjugat umfassen, unter Bildung eines Reaktionssystems, in dem eine gebundene und eine freie Form des Konjugats vorhanden
ist. Die Menge an Konjugat in der gebundenen oder in der freien Form ist eine Funktion der in dem zu untersuchenden
flüssigen Medium vorhandenen Ligatidenmenge. Erfindungsgemäß
umfaßt das markierte Konjugat eiron reversibel bindenden
Enzymmodulator, der kovalent an eine Bindungskomponente des Bindungsreaktionssystems gebunden ist. Die Verteilung des
Konjugats zwischen der gebundenen Form und der freien Form wird bestimmt durch Zugabe eines Enzyms, dessen Aktivität
durch den Modulator beeinflußt utmI zwar entweder verringert
oder erhöht wird, und Messung der entstehenden Enzymaktivität. Der Modulator kann ein üblicher Enzyminhibitor (Hemmstoff)
sein, vorzugsweise ein konkurrieränder oder eine Allosterie
bewirkende Substanz (allosterie eCfector).
Die Erfindung betrifft Best.lmmungsverfahren und zwar homogene und heterogene spezifiscUe Bindungsverfahren zur
qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Liganden in einem Medium. Besonders betrifft sie immunologische Konkurrenzbindung
sverfahren unter Anwendung nicht isotoper (nicht radio-
aktiver) Markierungen.
Bei einem üblichen Verfahren der spezifischen Bindungsbestimmung wird die zu untersuchende Probe mit Reagentien
verschiedener Zusammensetzung - -.anfassend ein Konjugat aus einer Markierungssubstanz, die an eine Bindungskomponente gebunden
ist, die mit anderen Bestandteilen (soweit solche vorhanden sind) der Reagensmittel unter Bildung eines Bindungsreaktionssystems
reagiert - zusa-nmengebracht, wobei zwei Formen des markierten Konjugats und zwar eine gebundene Form
und eine freie Form entsteht. Die relativen Mengen des markierten Konjugats, die in der gebundenen und in der freien
Form vorliegen, sind eine Funktion des Vorhandenseins bzw. der Menge des zu bestimmenden Lii-ianden in der zu untersuchenden
Probe.
Zur Illustration wird ein übliches Konkurrenz-Bindungsbestimmungsverfahren
beschrieben. Bei einem solchen Verfahren umfaßt das Reagensmittel 1.) ein markiertes Konjugat in
Form des zu bestimmenden Liganden oder eines entsprechenden Analogen davon, der (das) chemisch an eine Markierungssubstanz
gebunden ist, und 2.) einen spezifischen Bindungspartner
für den Liganden wie einen Antikörper oder ein anderes Bindungsprotein.
Nach Zusammenbringen der zu untersuchenden Probe mit den Reagentien treten der nachzuweisende bzw. zu bestimmende
Ligand und das markierte Konjugat in im wesentlichen unterschiedsloser Weise (nondiscriminating) in·Konkurrenz um
nicht kovalente Bindung mit dem spezifischen Bindungspartner. Als Folge davon ist die Menge an markiertem Konjugat, die an
den Bindungspartner gebunden wird,-d.h. die gebundene Form oder die freibleibende Menge, also die nicht an den Bindungspartner
gebundene und daher freie Form-,eine Funktion der vorhandenen
Menge des konkurrierenden LigandenJ/wenn das markierte Konjugat
in der gebundenen Form und das in der freien Form durch die zur Messung der Markierungssubstanz angewandten Mittel im wesentlichen
nicht unterschieden werden können, müssen die gebundene Form und die freie Form physikalisch voneinander getrennt werden,
verfahren wird als "heterogen" bezeichnet. Wenn die gebundene
Form und die freie Form des markierten Konjugats unterschieden werden können, kann eine "homogene" Arbeitsweise angewandt
und die Trennung vermieden werden.
Die erstentwickelte Form von spezifischen Bindungs-
die
be Stimmungen war radioimmunologj.sche Bestimmung- ., bei der ein radioaktives Isotop als Markierungssubstanz angewandt wird. Bei einer derartigen Bestimmung muß notwendiger Weise eine heterogene Arbeitsweise angewandt werden. Aufgrund der Gefährlichkeit und schwierigen Handhabung von radioaktiven Substanzen sind verschiedene neue Bestimmungssysteme entwickelt worden, bei denen andere Substanzen als (radioaktive) Isotope zur Markierung angewandt werden, wie Enzyme, fluoreszierende Moleküle, Bacteriophagen, Coenzym« und lumineszierende Moleküle.
be Stimmungen war radioimmunologj.sche Bestimmung- ., bei der ein radioaktives Isotop als Markierungssubstanz angewandt wird. Bei einer derartigen Bestimmung muß notwendiger Weise eine heterogene Arbeitsweise angewandt werden. Aufgrund der Gefährlichkeit und schwierigen Handhabung von radioaktiven Substanzen sind verschiedene neue Bestimmungssysteme entwickelt worden, bei denen andere Substanzen als (radioaktive) Isotope zur Markierung angewandt werden, wie Enzyme, fluoreszierende Moleküle, Bacteriophagen, Coenzym« und lumineszierende Moleküle.
Verschiedene heterogene Bindungsreaktionssysteme, bei
denen ein Enzym als Markierungssubstanz angewandt wird, sind angegeben in den US-PS 3 654 909, 3 791 932, 3 839 153,
3 850 752 und 3 879 262, J. Immunol. Methods Bd. 1, S. 247 (1972) und J. Immunol. Bd. 109, S. 129 (1972). Eine heterogene
Bindungsbestimmung unter Anwendung einer nicht aktiven Vorstufe einer spektrophotometrisch nachweisbaren Substanz zur
Markierung ist in der US-PS 3 880 934 angegeben. Von weiterem
Interesse bezüglich des Hintergrunds heterogener Bestimmungen ist Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Odell
und Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972). Eine immunologische Bestimmung der homogenen Art unter Verwendung
einer Enzymmarkierung ist in der US-PS 3 817 834 beschrieben,
bei der ein Ligand-Enzym-Konjugat angewandt wird. Die Enzymaktivität
des Kon^ugats in der gebundenen Form ist weniger gut meßbar als in der freien Form, wodurch eine homogene Arbeitsweise
angewandt werden kann. Die Anwendung besonderer einzigartiger Substanzenzur Markierung, wie von Coenzymen, lumineszierenden
Molekülen und abspaltbaren fluoreszierenden Substra-
2754Q88
Es ist Hauptaufgabe der voi :.legenden Erfindung, ein
spezifisches ßindungsverfahren zu entwickeln, das sowohl für
homogene als auch für heterogene Arbeitsweisen geeignet ist, bei dem eine einzigartige I-iarkiei <
mgs substanz angewandt wird, die zu einer großen Verbindungskj isse gehört, für die ausgiebige
Literatur vorliegt, um di .; Ausv/ahl spezieller Markierungen,
die Entwicklung geeigiriter Derivate und die Überwachung
von Reaktionen zu erleichtern.
Die Erfindung betrifft eim spezifische Bindungsbestimmung,
bei der als Markierungi mbstanz ein reversibel bindender
Enzymmodulator angewandt \ i.rd. Die erfindungsgemäße
Markierungssubstanz kann sowohl i ;ir homogene als auch für
heterogene Arbeitsweisen angewandt werden, wobei das auf einen Liganden zu untersuchende flüssig'.5 Medium mit dem Reaktionsmittel zusammengebracht wird, um."1 issend ein markiertes Konjugat,
wobei ein Bindungsreaktionsr/stern entsteht, in dem die gebundene Form und die freie Fon>
des Konjugats vorhanden ist. Die Menge an Konjugat, die in gel · indener oder in freier Form
vorliegt, ist eine Funktion des Vorhandenseins oder der Menge des Liganden in dem zu untersuche aden flüssigen Medium. Erfindungsgemäß
umfaßt das markierte 1 onjugat einen reversibel bindenden Enzymmodulator,der kovaler.t an eine Bindungskomponente
des Bindungsreaktionssystems gebunden ist. Die Verteilung des
Konjugats zwischen der gebundenem und freien Form wird bestimmt durch Zugabe eines Enzyms, dessen Aktivität beeinflußt wird
entweder in Form einer Hemmung O'Mr^Sximulierung durch den Modulator,
und Messung der sich ergeb"uden Enzymaktivität unter Anwendung
einer homogenen oder heterogenen Arbeitsweise.
Bei den beiliegenden Figur· u ist
Fig. 1 eine Kurve, die die Hemmw.i rkung verschiedener Konzentrationen
von Biotin-Modulator-Konjugat auf die Esteraseaktivität
von Carbonsäureanhydrase zeigt, 'ie sie durch die Hydrolysegeschwindigkeit
gemessen wird, ujii
9 2754Q88
Fig. 2 eine Kurve, die die Wirkuiwj verschiedener KonzentrationenAvidin
auf die Hemmwirkuni, von Biotin-Modulator-Konjugat
auf die Esteraseaktivit«·:; von Carbonsäureanhydrase
zeigt, wie sie durch die Hydroly. ^geschwindigkeit gemessen
wird.
In dieser Beschreibung habi α die folgenden Ausdrücke
die angegebene Bedeutung: "Ligam." ist die Substanz oder
Gruppe von Substanzen, deren Vorbandensein oder Menge in
einem flüssigen Medium bestimmt v;rden soll; "spezifischer
Bindungspartner für den Liganden" ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die fine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen
besitzt; "spezifisches Bindui>i$sanaloges des Liganden"
ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich im wesentlichen in Beziehung auf lie Bindungsaffinität zu
dem spezifischen Bindungspartner für den Liganden wie der Ligand selbst verhält; und "Nachvjisreaktion (monitoring reaction)"
ist eine Reaktion, die dm-oh ein Enzym katalysiert
wird, dessen Aktivität durch den arfindungsgemäß verwendeten
Enzymmodulator beeinflußt, d.h. V3rringert oder erhöht, wird.
Die erfindungsgemäß angewandte neue Markierungssubstanz
kann irgendeine chemische Substanz sein, die sich spezifisch oder nicht spezifisch in reversibler nicht kovalenter Weise
mit einem Enzym verbindet und dadurch in meßbarer Weise,entweder
durch Hemmung oder Stimulierung, die katalytische Aktivität des Enzyms in einer vorbestimmten Reaktion, d.h. der
Nachweisreaktion für das Bindungr- system, das bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren entsteht, beeinflußt. Unter "reversibel bindend" ist gemeint, daß die Bi;<lungskonstante für die Verbindung
(Assoziation) des Enzymmodulators mit dem Enzym, das
11 die Nachweisreaktion katalysiert, veniger als ungefähr 10 m
beträgt. Vorzugsweise liegt die >lindungskonstante zwischen ungefähr
105 und ungefähr 10^ m~1.
BAD GP'·"
275408$
Eine Gruppe von Substanzen, die erfindungsgemäß anwendbare
Enzymmodulatoren umfaßt, isi die Gruppe von reversibel bindenden Enzyminhibitoren (Hemm: hoffen), unabhängig davon,
ob sie konkurrierend oder nicht— konkurrieren! (competitive,
uncompetitive or noncompetetive) >ind. Konkurrierende Inhibitoren
verbinden sich mit dem f re;" an Enzym auf eine solche
Weise, daß sie mit dem normalen .'abstrat um die Bindung an
den aktiven Stellen des Enzyms in Konkurrenz treten, wobei das Inhibitormolekül jedoch durcl· das Enzym nicht chemisch
umgewandelt wird. Im Gegensatz drcu verbinden sich unkompetitive
Inhibitoren nicht mit dem frrien Enzym oder beeinflussen
dessen Verbindung mit dem normal*· > ι Substrat nicht, sondern sie
verbinden sich mit dem entstehend-m Enzym-Substrat-Komplex
und ergeben ein inaktives Addukte das nicht imstande ist, das normale Produkt freizusetzen. Nicht*-kompetitive Inhibitoren
können sich sowohl mit dem freien Enzym als auch mit dem Enzym-Substrat-Komplex verbinden vond die normale Katalyse
stören üblicherweise durch Bindi'ug an eine andere Stelle des
Enzyms als die aktive Stelle, wodurch sie die empfindliche Konfiguration des aktiven Enzyms ändern.
Von den üblichen Enzyminhibitoren sind die kompetitiven
bevorzugt. Im folgenden ist eine Tabelle von geeigneten kompetitiven Inhibitoren, den Enrymen, deren Aktivität duKh
sie gehemmt wird, und ein ungefährer Wert für die Inhibitionskonstanten (K. ) für die Dissoziation der betreffenden Inhibitoren
von den Enzymen angegeben.
Inhibitor .;Jnzym K1 (m)
Acetazolamid ^arbonsäure-anhydrase 6x10
Sulfanilamid Carbonsäure-anhydrase 10
Phenyl—trimethyl-ammoniura-ion Acetylcholin-esterase 10~
Saccharo-1,4-lacton ß-Glucuronidase 10~
4-Amino-IO-methyl-pteroyl- Dihydrofolat-reduktase 10 ^
glutaminsäure
2,6,8-Trichlorpurin Uricase 10~
Es können auch wirksame Analoge, d.h. Derivate, Homologe
usw., der oben angegebenen Inhibitoren angewandt werden. Zum Beispiel wird Acetylcholinest'rase auch durch p-Aminophenyl-trimethylamiQoniumion
und durch den N-Methyl-N-(paminophenyl)-carbamatester
von m-'.Trimethylamino)-phenol gehemmt.
Eine andere Gruppe von Substanzen, aus der geeignete
Enzymmodulatoren ausgewählt werden können, sind aie allosterischen
Effektoren. Derartige Substanzen wirken bei biologischen Prozessen als Regulatoren ö"S enzymatischen Metabolismus.
Ihre Wirkung wird erreicht durch . pezifische Bindung an eine andere Stelle des Enzyms als die '.(Ar das Substrat aktive
Stelle, wodurch die Aktivität des Enzyms gehemmt oder stimuliert wird, z.B. durch eine Konfcrmationsänderung. Im folgenden
ist eine Tabelle von einigen·allenterischen Effektoren angegeben,
die erfindungsgemäß als En/ymmodulatoren angewandt werden
können. In der Tabelle sind 3'ihibitor oder negative
Effektoren gekennzeichnet durch ( ■) und stimulierende oder
positive Effektoren durch (+). Dj .· Quelle für das beeinflußte IJnzym ist ebenfalls in Klammern ar;.;egeben.
../Tabelle
L-Isoleucin (-) L-Valin (+)
Cytosin-triphosphat (CTP)
Adenosin-triphosphat (ATP)(+)
Desoxythymidin-triphosphat (dTTP) (-) Desoxycytosin-triphosphat
(dCTP) (+)
ATP(-)
3',5 '-Adenosin-monophosphat
(AMP)(+)
dTTP(-) Deoxycytosin-diphosphat (dCDP(+)
ert-Ketoglutarat(-) Citrat (+)
5'-AMP(+)
L-Threonin(-) L-Isoleucin(+)
L-Methionin(+)
Adenosin-diphosphat (ADP)(+)
L-Valin(-) L-Threonin(-)
Uridin-diphosphat (UDP)-N-Acetyl-glucosamin(-)
Glucose-6-phosphat(+)
ATP(-)
Guanosin-triphosphat (GTP)(-) reduziertes NAD(-) Östrogene(-)
Thyroxin(-) ADP(+)
Leucin(+) Methionin(+)
Leucin(+) Methionin(+)
275A088
Enzym
biosynthetische L-Threonindesaminase (E. coli K12)und
(Hefe)
Desoxycytidylat-aminohydrolase (Esel-Milz)
Phosphofructokinase (Meerschweinchen-Herz)
Desoxythymidinkinase (E.coli)
Nicotinamid-adenin-dinucleotid-(NAD)-Isocitronensäuredehydrogenase
(N. crassa)
NAD-Isocitronensäure-dehydrogenase (Hefe)
Homoserin-dehydrogenase (R. rubrum)
L-Threonin-deaminase (C. tetanomorphum)
Acetolactat-synthetase (E. coli) Threonin-aspartokinase (E. coli)
L-Glutamin-D-fructose-6-phosphat· transaminase (Ratten-Leber)
Glycogen-synthetase (Hefe) und (Lamm-Muskel)
Glutamat-dehydrogenase (Rinder-Leber)
ATP(-)
5'-AMP(+)
5'-AMP(+)
Cytosin-raonophosnhat (CMP)-N-Acetyl-neuraminsäure(-)
L-Threonin(-)
Lr-Lysin(-)
5'-AMP(-)
5'-AMP(-)
275A086
Enzym
b (Kaninchen-
Phosphorylase
Muskel)
Muskel)
UDP-N-Acetyl-glucosamin-2-epimerase
(Ratten-Leber)
Homoserin-dehydrogenase (E. coli)
Lysin-aspartokinase (E. coli)
Fructose-1,6-diphosphatase
(Frosch-Muskel und Ratten-Leber)
Weitere Einzelheiten sind i'.\ J. (1965) angegeben.
Mol Biol. Bd. 12 S. 88
Um das markierte Konjugat borzustellen, das an dem
Bindungsreaktionssystem teilnimmt, wird der Enzymmodulator kovalent an eine entsprechende Biudungskomponente eines solchen
Reaktionssystems gebunden. Eine reiche Bindungskomponente ist
der zu bestimmende Ligand, ein spezifisches Bindungsanaloges
des Liganden oder ein spezifischer Bindungspartner zu dem Liganden, je nach dem ausgewählten Bindungsreaktionsschema.
Einige der verschiedenen üblichen Bindungsreaktionsschemata werden später näher beschrieben. Das angewandte Verfahren,um
den Enzymmodulator und die Bindui'^skomponente kovalent miteinander
zu verbinden, ist nicht kritisch, solange die entstehende
Enzym-Modulator-Gruppiej'img eine meßbare Menge modulierungsaktivität
besitzt und ähi.vLich die entsprechende Gruppierung
der Bindungskomponente eine geeignete Menge Aktivität in Beziehung auf das Bindungsreaktionssystem behält. Allgemein
werden der Enzymmodulator und die Bindungskomponente direkt oder über eine Brücke mit aktiven Kuppelungsgruppen an entgegengesetzten
Seiten, um die entsprechenden zu verbindenden Gruppen kovalent miteinander zu verbinden, aneinander gebunden.
Die Brücke enthält üblicherweise 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoff atome oder Heteroatome, wie Stickstoff,
Sauerstoff, Schwefel, Phosphoratoine usw. Beispiele für Brücken, die ein einzelnes Atom enthalten, sind die Methylengruppe (ein
Cohlenstoffatom in der Kette) um' die Aminogruppe (ein Heteroatom
in der Kette). Die Brücke b< litzt üblicherweise ein Molekulargewicht
von nicht mehr als Ό00 und vorzugsweise weniger ils 200. Die Brücke, soweit eine solche vorhanden ist, umfaßt
iine Kette von Kohlenstoffatomen 'and/oder Heteroatomen und .st an den Enzymmodulator bzw. d.i. 1J Bindungskomponente durch
rerbindende Gruppen gebunden, di·· üblicherweise ausgewählt
;ind aus Ester, Amid, Äther, Thiosster, Acetal, Methylen und
iminogruppen.
Im folgenden sind Struktur^ormeln für einige infrage
;ommende markierte Konjugate angegeben einschließlich den
Lompetitiven Inhibitoren, die οI en als Markierungssubstanzen
ingegeben sind,und ein allgemeines Verfahren zu ihrer Herstel-•ung.
A. Konjugate aus AcetazolawLd und Bindungskomponente
N N
H2NO2S^^S^^NHCO(CH2)4 ■Bindungskomponente
H2NO2S-" ^S-^"^NHCO(CH2) NH- Bindungskomponente
In Beispiel 1, B und C sin<i Einzelheiten der Herstelung
für derartige Konjugate angegeben.
../11
λ-
AS
275408$
B. Kon jugate aus Phenyl-tr j i;iethylammonium-ion und
Bindung skomponente
N0CCH
rCr
NHCO(CH2) 5NH-Bindungskompoi:'2nte
Die interessierende Bindung'.-.komponente wird kovalent
an die Aminofunktion einer o-Aminoalkylcarbonsäure gebunden
durch eine Reaktion wie eine nucleophile Substitution. Das entstehende Produkt wird dann mit Hilfe eines Aktivierungsmittels,
wie Carbodiimid, an p-ADiino-N,N-dimethylanilin gebunden.
Das entstehende Produkt vird anschließend mit Methyljodid behandelt, um das gev'inschte Konjugat
NH-f CO (CH2) ?CONH (CH2) 3NH (CH2) 2NHJ^-R
n=l,2 und R= Bindungskomponente
zu erhalten.
Die interessierende Bindungrkomponente wird durch geeignete
Mittel (Aktivierung der Carboxylgruppe, nucleophile Substitution) an eine Aminogruppf; von 3»3'-Diaminodipropylamin
gebunden. Das entstehende Px->dukt wird dann mit Bern-
und
steinsäureanhydrid behandelt di<> entstehende Substanz an die freie Aminofunktion des N-Methyl-N-(p-aminophenyl)-carbamatesters von m-(Triäthylam.tao)-phenol mit Hilfe eines Carbonsäure-Aktivierungsmittels »sbunden. Wahlweise kann der Inhibitor weiter von dem Liganden angeordnet werden durch Be-
steinsäureanhydrid behandelt di<> entstehende Substanz an die freie Aminofunktion des N-Methyl-N-(p-aminophenyl)-carbamatesters von m-(Triäthylam.tao)-phenol mit Hilfe eines Carbonsäure-Aktivierungsmittels »sbunden. Wahlweise kann der Inhibitor weiter von dem Liganden angeordnet werden durch Be-
- X-
275A086
handlung des oben angegebenen sue inylierten Derivats mit
3,3'-Diaiainodipropylarain und Carb iiimid und anschließend
Bernsteinsäureanhydrid und Kupplung an den Inhibitor
(n=2).
C. Konjugat aus Saccharo-1,'-lacton und Bindungskomponente
C-HCOH I R=KCH2),NH(CH2 )T
I o
-(CH2) .-
C— NH— R—NH- Bindungskompone· ■ te
Saccharo-1,4-lacton wird an ein t ' ,^-Diaminoalkylderivat
über die freie Carboxylgruppe mit Hilfe eines Carbonsäureaktivierenden
Mittels gebunden. C-s entstehende Produkt wird
dann an die Bindungskomponente üb r eine geeignete Reaktion, z.B. eine nucleophile Substitution, Carbonsäureaktivierung
usw., gebunden.
D. Konjugate aus 4-Amino-1C methylpteroylglutaminsaure
und Bindungskoniponente
CONH-CHC'iR
ι ι
NH2
R = -OH oder-NH (CH2) — Biri'Iungskomponente
r Λ0
2754088
Die interessierende Bindung komponente wird durch eine
entsprechende Reaktionsfolge an d.i e Aminofunktion eines <*,4A-Diaminoalkylderivats gebunden . Das bei dieser Umsetzung
entstehende Produkt wird dann an "ine der Carbonsäurefunktionen von 4-Amino-IO-methyl-pteroyl glutaminsäure mit Hilfe
eines entsprechenden Carbonsäure-rktivierenden Mittels, z.B. Carbodiimid, gebunden.
E. Konjugat aus 2,6,8-Trichiorpurin und Bindungskoinponente
_NH(CH2)nNH
Bindvugskomponente
η = 1-6
2,6,8-Trichlorpurin wird mit Dihytiropyran und einer katalytischen
Menge Säure behandelt unt r Bildung eines in 9-Stellung substituiei'ten Tetrahydi «pyranyläthers. Dieses Produkt
wird dann mit einem ctf, O-Dia'.iinoalkan umgesetzt unter
Bildung eines an dem CQ-Atom-subr.tituierten Aminoalkylaminderivats.
Die Tetrahydropyran/l-blockierende Gruppe wird
dann unter sauren Bedingungen entfernt unter Bildung von 2,6-Dichlor-substituiertem Purin. Die interessierende Bindungskomponente
wird dann an die freie Alkylaminogruppe mit Hilfe irgendeiner geeigneten Reaktionsfolge gebunden.
Das erfindungsgemäße Bestiimaungsverfahren kann angewandt
werden z.B. zur Bestimmung irgendeines Liganden, für den ein spezifischer Bindung.spartner existiert. Der Ligand
ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein,
Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für das ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen
existiert oder synthetisiert werden kann. Der Ligand wird üblicherweise ausgewählt aus der Gruppe von Antigenen und deren
Hormonen. Vitaminen. Metaboliten und pharmaKolo-
gischen Mitteln und deren Rezeptoren und Bindungssubstanzen.
Spezifische Beispiele für Liganden, die erfindungsgeniäß
nachgewiesen bzw. bestimmt werder können, sind Hormone, wie Insulin, Choriongonadotropin, Thyroxin, Liothyronin und
Östriol; Antigene und Haptene, wj-:.· Ferritin, Bradykinin,
Prostaglandine und tumorspezifiscUe Antigene; Vitamine, wie
Biotin, Vitamin B12, Folsäure, V: kamin E und Ascorbinsäure;
Hetaboliten, wie 3',5'-Adenosinmcnophosphat und 3',5'-Guanosinmonophosphat;
phamiakologische Mittel, wie Dilantin,
Digoxin, Morphin, Digitoxin und barbiturate; Antikörper, wie
mikrosome Antikörper und Antikörper gegen Hepatitis und
Allergene; und spezifisch bindende Rezeptoren, wie Thyroxin-bindendes Globulin, Avid in, Intrinsikfaktor und
Transcobalamin.
Wie oben gesagt, kann das c rf indungsgeinäße Verfahren
unter entsprechenden Bedingungen sowohl für eine homogene als auch für eine heterogene Arbeitsweise angewandt werden.
Eine homogene Arbeitsweise, d.h. eine solche, bei der keine physikalische Trennung der gebundenen von der freien
Form erforderlich ist, ist möglich, wenn die Reaktion zwischen der Bindungskomponente des markierten Konjugats und
einem entsprechenden Bindung spar bier zu einer meßbaren Änderung,
entweder einer positiven ο ι·ϊγ negativen Änderung4 der
Fähigkeit des konjugierten Enzymeodulators die Aktivität des
die Nachweisreaktion katalysierenden Enzyms führt. In einem solchen Falle kann die Verteilung des Enzymmodulators zwischen
der gebundenen und der frei an Form bestimmt werden durch
direkte Zugabe des Enzyms zu dem Gemisch aus beiden Formen und Messung der Enzymaktivität. b;s sind verschiedene Arbeitsweisen
zur Durchführung einer homogenen Bestimmung möglich, wobei die direkte Bindung und die Konkurrenzbindung bzw.
kompetitive Bindung bevorzugt sind. , "*"*
/ig 2754088
Bei der direkten Bindung wird ein Medium, in dem der
Ligand vermutet wird, mit einem fc-^njugat zusammengebracht,
umfassend den Enzymmodulator, der an einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden i.ebunden ist}und die Änderung
der Aktivität des Enzymmodul·'ι tors bestimmt. Bei der
Konkurrenzbindung wird das flüssige Medium mit einem spezifischen Bindungspartner für den IJ.ganden und mit einem
Konjugat zusammengebracht, umfassend den Enzymmodulator, der an den Liganden und/oder ein spezifisches Bindungsanaloges
davon gebunden istj und anschließend die Änderung
der Aktivität des Enzymmodulators, bestimmt. Bei beiden Arbeitsweisen
wird die Aktivität der Enzymmodulators bestimmt, indem man das flüssige Medium mit mindestens einem Reagens
zusammenbringt, das mit dem Enzyny'Odulator die vorausbestimmte
Nachweisreaktion eingeht. Der qualitative Nachweis eines Liganden in dem flüssigen Medium umfaßt einen Vergleich
einer Charakteristik üblicherweise der Geschwindigkeit der entstehenden Nachweisreaktion mit derjenigen in einem flüssigen
Medium, das keinen Liganden enthält, wobei ein auftretender Unterschied ein Zeichen füv eine Aktivitätsänderung
des Enzymmodulators ist. Bei der quantitativen Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium vird eine Eigenschaft der
entstehenden Reaktion mit derjenigen einer Nachweisreaktion in flüssigen Medien, die bekannte Mengen des Liganden enthalten,
verglichen.
Allgemein können bei einer homogenen Arbeitsv/eise die Komponenten der spezifischen Bincuingsreaktion —d.h. das
flüssige Medium, in dem der Ligar.··· vermutet wird, das Konjugat
und/oder ein spezifischer Bindung'.partner für den Liganden-in
jeder beliebigen Menge, Weise und Reihenfolge zusammengebracht werden, vorausgesetzt, daß die Aktivität des Enzymmodulators
in dem Konjugat meßbar verändert vrird, wenn die Flüssigkeit den Liganden in einer Menge oder Konzentration enthält, die
für die Bestimmungszwecke von Bedeutung ist. Vorzugsweise sind alle Bestandteile der speziiIschen Bindungsreaktion in dem
Wenn eine Arbeitsweise unte* Ausnutzung einer direkten
homogenen Bindung angewandt wird, sind die Komponenten der
Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet v/i rd, und eine Menge eines K-njugats aus dem Enzymmodulator und einem spezifischen .'indungspartner für den
Liganden. Die Aktivität' des konjugierten Modulators ändert
sich bei Berührung mit dem flüssigen Medium, umgekehrt
proportional zu dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner in dem Konjugat. So nimmt mit zur·.ahmender Menge des Liganden in dem flüssigen Medium die Akti\ ; tat des konjugierten Modulators ab.
Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet v/i rd, und eine Menge eines K-njugats aus dem Enzymmodulator und einem spezifischen .'indungspartner für den
Liganden. Die Aktivität' des konjugierten Modulators ändert
sich bei Berührung mit dem flüssigen Medium, umgekehrt
proportional zu dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner in dem Konjugat. So nimmt mit zur·.ahmender Menge des Liganden in dem flüssigen Medium die Akti\ ; tat des konjugierten Modulators ab.
Wenn ein Konkurrenzbindungf erfahren angewandt wird,
sind die Komponenten der Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, 'ine Menge eines Konjugats
aus dein Enzynunodulator, der an der Liganden gekuppelt ist
oder einem spezifischen Bindungsanalogen zu dem Ligandenj und eine Menge eines spezifischen Bin■ ungspartners zu dem Liganden. Der spezifische Bindungspartner ν i.rd im wesentlichen gleichzeitig mit dem Konjugat und dem i Lüssigen Medium zusammengebracht. Da etwaiger vorhandener L,i.gand in dem flüssigen Medium mit dem Liganden oder spezifischen Bindungsanalogen davon in dem Konjugat um die Bindung mit Cam spezifischen Bindungspartner in Konkurrenz tritt, ändert sich die Aktivität des
konjugierten Modulators bei Berüi^ung mit dem flüssigen Medium direkt mit dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner. Daher nimmt mit zunehmender Menge des ] i.ganden in dem flüssigen
Medium die Aktivität des konjugif i>ten Modulators zu.
sind die Komponenten der Bindungsreaktion das flüssige Medium, in dem der Ligand vermutet wird, 'ine Menge eines Konjugats
aus dein Enzynunodulator, der an der Liganden gekuppelt ist
oder einem spezifischen Bindungsanalogen zu dem Ligandenj und eine Menge eines spezifischen Bin■ ungspartners zu dem Liganden. Der spezifische Bindungspartner ν i.rd im wesentlichen gleichzeitig mit dem Konjugat und dem i Lüssigen Medium zusammengebracht. Da etwaiger vorhandener L,i.gand in dem flüssigen Medium mit dem Liganden oder spezifischen Bindungsanalogen davon in dem Konjugat um die Bindung mit Cam spezifischen Bindungspartner in Konkurrenz tritt, ändert sich die Aktivität des
konjugierten Modulators bei Berüi^ung mit dem flüssigen Medium direkt mit dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner. Daher nimmt mit zunehmender Menge des ] i.ganden in dem flüssigen
Medium die Aktivität des konjugif i>ten Modulators zu.
Eine Variation des homogenen Konkurrenzbindungsverfahren ist die homogene Verdrängungsrealt tion, bei der das Konjugat
zunächst mit dem spezifischen Biiiiungspartner für den Liganden und anschließend mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird.
zunächst mit dem spezifischen Biiiiungspartner für den Liganden und anschließend mit dem flüssigen Medium zusammengebracht wird.
•yf-21 275A086
Dabei tritt dann eine Konkurrenz im den spezifischen Bindungspartner ein. Bei einem derartiger- Verfahren ist die Menge an
Konjugat, die mit dem spezifisch« α Bindungspartner zusammengebracht
wird, üblicherweise so, 'laß sie den Liganden oder dessen Analoges in einem überschuh gegenüber der Menge enthält,
die imstande ist, mit der vorhancinen Menge an spezifischem Bindungspartner während der Zeit. Bindungen einzugehen, die
das Konjugat und der spezifische bindungspartner vor der Berührung
mit der flüssigen Probe, j.n der der Ligand vermutet wird, in. Berührung ist. Diese Reihenfolge des Kontaktes kann
auf zwei bequeme Arten erreicht v-irden. Bei einer Art wird
das Konjugat mit dem spezifischen Bindungspartner in einem
<^unf zwar
flüssigen Medium zusanuaengebracm:\ vor dem Kontakt mit dem
flüssigen Medium, in dem der Ligcud vermutet wird. Bei der
zweiten Art wird das flüssige Mec' Lum, in dem der Ligand vermutet
wird, mit einem Komplex zur unmengebracht aus dem Konjugat
und dem spezifischen Bindung f. j »artner, wobei die spezifisch bindende Substanz in dem Konjugat und der spezifische Bindungspartner
aneinander gebunden ;;ind. Die Menge an Konjugat, die an den spezifischen Bindungspf-rtner bei dem ersten Verfahren
gebunden wird oder die bei. dem zweiten Verfahren in Komplexform vorliegt, ist übliche Λ/eise größer als diejenige,
die von dem gesamten Liganden in -lern flüssigen Medium in der Zeit verdrängt werden kann, die cir spezifische Bindungspartner oder Komplex und das Medj'im in Berührung stehen, bevor
eine etwaigo Änderung der AktiviH it des konjugierten Modulators
vollständig bestimmt wird.
Eine andere Variation des homogenen Konkurrenzbindungsverfahrens ist ein aufeinanderfolgendes Sättigungsverfahren
(sequential saturation homogeneov ; technique), bei dem die Bestandteile
der spezifischen Bindnagsreaktion die gleichen
sind, wie sie für das Konkurrenz!· Lndungs verfahr en angewandt werden, aber die Reihenfolge der Zugabe oder Kombination der
Bestandteile und die relativen Meugen, die angewandt werden,
unterschiedlich sind. Bei dem au:· ϊ inande rf olgenden Sättigungs-
2754Q86
jrfahren wird der spezifische Bii'dungspartnerfür den Ligan-3n
mit dem flüssigen Medium, in '.'em der Ligand vermutet
Lrd, eine zeitlang zusammengebracht, bevor das flüssige
ädium mit dem Konjugat zusammengebracht wird. Die Menge an
pezifischem Bindungspartner, die mit dem flüssigen Medium jsammengebracht wird, ist üblicherweise größer als die Menge,
ie imstande istjinit dem gesamten Liganden,der in dem flüsigen
Medium vermutet wird, in de" Zeit Bindungen einzugehen, ie der spezifische Bindungspartn ;r und das flüssige Medium
ti Berührung stehen, bevor das flüssige Medium mit dem
onjugat zusammengebracht wird. I -(rner ist die Menge an Ligand
, oder Analogen zu dem Ligander in konjugierter Form übicherweise
größer als diejenige Ienge, die imstande ist.mit er verbleibenden nicht—gebundene α Menge an spezifischem Binungspartner
während der Zeit Bindungen einzugehen, die das lüssige Medium und das Konjugat .n Berührung stehen, vor der
ollständigen Bestimmung einer ßa derung der Aktivität des
onjugierten Modulators.
eterogene Arbeitsweise
Ein Enzymmodulator kann audi als Mark ie rungs sub stanz
ngewandt werden bei üblichen heterogenen Bestimmungsverfahren,
pe! denen die gebundene und frei« Form des markierten Bestandteils
getrennt werden und die Men.-je der Markierungssubstanz in
^er einen und/oder anderen Form ι '»stimmt wird. Die Reagentien
;ur Durchführung eines derartige: heterogenen Bestimmungsrerfahrens
können verschiedene Firmen haben. Im allgemeinen
unfassen derartige Reagentien dr·! Grundbestandteile und zwar
I. den nachzuweisenden Liganden, I. einen spezifischen Binlungspartnerfür
den Liganden und 3. einen markierten Bestand- ;eil, der üblicherweise eine markierte Form a) des Liganden,
3) eines spezifischen Bindungsannlogen zu dem Liganden oder
;) des spezifischen Bindungspartners ist. Die Bestandteile der 3indungsreaktion werden gleichzeitig oder nacheinander zu-
und es werden an,- emessene Inkubationszeiten
COPY
S3 275408$
eingehalten, wobei der markierte Y-.istandteil an die entsprechenden
konkurrierenden Bindungsp.^tner gebunden wird, sodaß
das Ausmaß der Bindung, d.h. das Verhältnis der Menge an markiertem
Bestandteil, der an den B.iudungspartner gebunden ist,
zu dem nicht gebundenen, eine Fun) eion der vorhandenen Ligandenmenge
ist. Im folgenden wird e.i.ie kurze Beschreibung einiger
unterschiedlicher heterogener iindungsschemata angegeben, die zur Durchführung des erfindunj.sgemäßen Verfahrens angewandt
werden können.
In den folgenden Diagrammen ./erden die folgenden Sympole
und Abkürzungen verwendet:
../2O
2 If
1A-50 012
Symbol Definition
L
©
©
nachzuweisender Ligand
Ligand oder spezifisch bindendes Analoges dazu
Biddungspartner für den Liganden
Markierungssubstanz, d.h. Enzymmodulator
unlösliche Phase
Inkubationszeit
(lim) (exe)
(sep) limitiert; in einer Menge vorhanden, die geringer ist als diejenige, die von den
gesamten bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während der angewandten
Inkubationszeit gebunden werden kann, d.h. der Bestandteil, um den die anderen Bestandteile in Konkurrenz treten,
um mit ihm Bindungen einzugehen
Überschuß; in einer Menge vorhanden, die größer ist als diejenige, die imstande
ist, von den gesamt-verfügbaren bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während
der angewandten Inkubationszeit gebunden zu werden
Trennung der gebundenen von der freien Phase
- 21 -
1. Schemata für heterogene Bestimmungen durch Konkurrenzbindungsreaktionen
(a) L +© + B(lim) ^ + unlöslich machende
Mittel für B oder
Das ist das klassische Chema einer Konkurrenzbindungsreaktion. Beispiele für die unlöslich machenden
Mittel sind spezifische ausfällende Antikörper, spezifische unlöslich gemachte Antikörper und, wenn B oder L
ein proteinartiges Material iat, proteinausfällende Substanzen, wie Ammoniumsulfat, oder wenn B oder L ein
kleines adsorbierbares Molekül ist, mit Dextran überzogene Aktivkohle. Ähnliche Systeme sind beschrieben in Biochem.
J. 88, 137. (1963) und US-PS 3 839 153.
(b) L +© * + I-B(lim) ^ (sep)
Diese Reaktion wird allgemein als Festphasen-Verfahren (solid-phase technique) bezeichnet. Die Beschreibung
ähnlicher radioimmunologischer oder anzymatischer immunologischer Bestimmungsverfahren findet sich in US-PS
3 505 019, 3 555 H3, 3 646 346 und 3 654 090.
(c) L + B* + f-@ (lim) >
(sep)
(US-PS 3 fc>54 090)
(d) L + |-(l) + B (lim) ) (sep)
(US-PS 3 850 752).
- 22 -
2754088
ϋ. Heterogene aufeinanderfolgende Sättigunf<sverfahren
(a) L + B(exc) ^ + (l) (exc) >+ unlöslich ma
chendes Mitte^ für B oder^L)
(sep)
Bei dem aufeinanderfolgenden Sättigungsverfahren (sequential
·. saturation technique) werden einige oder alle bindenden Stellen von B, die nach der ersten Inkubationszeit
noch verbleibeu, durch den markierten Bestandteil gebunden.
(b) L + f- B(exc) >+© * (exc) >
(sep)
Beschreibungen ähnlicher radioimmunologischer und enzymatisch immunologischer Bestimmungsverfahren finden sich in
US-PS 3 710 760 und J. Immunol. 209, 129 (1972).
3. Heterogene "Sandwich"-Verfahren
W1
L + f- B(exc) ) B (exc) ) (sep)
Bei dem "Sandwich"-Verfahren werden einige oder alle Ligandenmoleküle an den unlöslich gemachten Bindungspartner
von dem markierten Bestandteil gebunden (US-PS 3 720 760).
4. Festphasen-Liganden-Adsprptions-Verfahren
L + (lJ * + !-(nicht-spezifisch) ^+ B(lim) ^ (
Bei diesem Verfahren werden der Ligand und der markierte Bestandteil an eine nicht-spezifische Substanz gebunden
und anschließend proportionale Mengen durch Bindung mit einem Bindungspartner mit einer größeren Affinität, als sie
Tünrinnranartner für den Liuanden zu dem markierten Bestand—
P 2? 54 ÜÖ6.9
(Yl 1A-50
275408$
Bei der günstigsten Form dieses Verfahrens wird eine
Säule uine3 nicht-spezifischen bindenden Mittels angewandt
(US-PS 3 659 104). Ein solches Verfahren 1«t geeignet,
wenn der Ligand in der Probe an endogene bindende Substanzen gebunden ist, die, wenn sie nicht entfernt
werden, bei der Konkurrenz-Bindungsreaktion stören wurden. Nach-.der Bindung an das nicht-spezifische Bindungsmittel
können die endogenen bindenden Substanzen durch
entsprechendes Auswaschen entfernt werden.
Bezüglich der weiteren Diakussion von Parametern, die bei
üblichen heterogenen Bestimmungsverfahren eine Rolle spielen sowie die mehr ins einzelne gehende Beschreibung von
Bestimmungsverfahren und alternativen Trennverfahren, wird auf Principles of Competitive Protein-Bindung Assays,
Herausg. Odell und Daughaday (J, B. Lippincott Co.,
Philadelphia, 1972) verwiesen.
Im Rahmen der Erfindung ist es auch möglich, andere Verfahrensarten anzuwenden, wie andere Reihenfolgen
der Zugabe und andere Bindungsreaktionatechniken zur Durchführung von heterogenen und homogenen spezifischen BindunipbeStimmungen.
Die Bestimmung der Aktivität des konjugierten Reagens als Bestandteil des vorher bestimmten Nachweisreaktionssystems
entweder in der gebundenen oder in der freien Phase wird bequem erreicht, indem man diese Phase mit
mindestens einer Substanz zusammenbringt, die mit dem konjugierten Reagens die Nachweisreaktion bildet und
ein Charakteristikum dieser Reaktion mißt. Das Nachweisreaktionssystem
kann eine einzelne chemische Umwandlung oder eine Vielzahl oder Reihe von chemischen Umwandlungen
umfassen.
<■ ' -Ji
Das zu untersuchende fluss.: <;e Medium kann eine natürlich
vorkommende oder künstlich hergestellte Flüssigkeit sein, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält,
und ist üblicherweise eine Körpe? flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die bei der Verdünnung oder sonstigen Behandlung
einer biologischen Flüssigkeit entsteht. Biologische Flüssigkeiten, die erfindungsgem^ß untersucht werden können,
sind u.a. Serum, Plasma, Urin, ai'viiotische, Cerebral-und
Spinalflüssigkeiten. Andere Substanzen, wie Feststoffe, z.B.
Gewebejoder Gase können ebenfalls untersucht werden, wenn
sie z.B, durch Lösen des FeststoTCs oder Gases in einer
Flüssigkeit oder durch Flüssigkei tsextraktion des Feststoffes
in eine flüssige Form gebracht wurden können.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1 Herstellung der «iaterialien
A. Carbonsäureanhydrase
Das Enzym wurde aus menschlichen roten Blutkörperchen
isoliert, entsprechend dem Verfahren von Armstrong et al, J. Biol. Chem. Bd. 241, S. 5137-:>149 (1966) mit der Ausnahme,
daß die Dialyse vor der Ausfällung mit Ammoniumsulfat weggelassen wurde. Der Niederschlag wurde in 0,05m Tris-(hydroxymethyl)-amxnomethan-hydrochlorid
(Tris-HCl)-Puffer, pH 8,7, gelöst und über eine 2,5x55 cm S;iule, die mit DEAIS-Cellulose
beschickt und mit dem gleichen Puffer äquilibriert war. chromatographiert. Das Enzym v/urrie in einer Fraktion mit dem
Tris-HCl-Puffer eluiert.
COPV
B, 5- (. C is -hexahydro -2- oxo- IH- tJ: i.eno[3,4-d] imidazole)
-N- (5- sulfonamido-1,3,4-thi.'liazo -2- yl) valeriansäureamid
O2NH2
Biotin-Modulater- Konjugat
iiine Lösung von 300 mg (1,2 mMol) wasserfreiem Biotin
in 19,5 ml trockenem Dimethylformamid wurde bei -10 C unter
trockenem Stickstoff gerührt unc 0,17 ml (1,2 mMol) trockenes
Triäthylamin zugegeben (Knappe ot al, Biochem. Z. 338,
S. 599 (1963) ). Eine Lösung von 0,141 ml frisch destilliertem
Athylchlorformiat in 3 ml trockenem Diäthyläther wurde zugetropft,
wobei ein weißer Niederschlag entstand. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -100C gerührt und dann unter Stickstoffatmosphäre
filtriert. Das Filtrot wurde sofort auf -100C gekühlt
und eine Lösung von 438 mg (2,43 mMol) 2-Amino-1,3,4-thisdiazol-5-sulfonamid
(Roblin et al, J. Am. Chem. Soc. Bd. 72, S. 4890-4892 (1950) ) ii\ 3 ml trockenem Pyridin zugegeben.
Die entstehende Lösung wurde 15 Minuten bei -10 C und anschließend 30 Minuten bei Flau!".temperatur gerührt. Die
Lösungsmittel wurden bei 400C ui-ter Vakuum abgedampft, wobei
ein öliger Rückstand verblieb. I..'as Öl wurde bei 0°C mit 50 ml
0,3n Salzsäure gerührt. Der entstehende weiße Feststoff (400 mg) wurde abfiltriert und in 10 Gew.-% Natriumbicarbonatlösung
gelöst. Diese Lösung wurde im Eisbad gekühlt und mit konz. Salzsäure auf einen pH-Weit von 6,5 gebracht. Der entstehende
beige-farbene Niederschlag wurde abfiltriert. Man erhielt 130 mg (Fp 2540C Zers.), Beim Umkristallisieren, aus
• atf' -
30 275Λ086
Analyse berechnet für C12H10U6O^3: C 35,46; H 4,46; N 20,67
gefunden : C 35,62; H 4,47; N 20,55
:. 6-(2,4-Dinitroanilino)-N-(5-sulfonamid -1,3,4-thiadiazo
-2-yl) capronsäureamid
V ί (! N-N
DNP-Modulator-i.onjugat
Eine Lösung von 357 nig (1,>" mMol) v/as serfrei em 6-(2,4-Dinitroanalino)-capronsaure
(Ganmsha et al, Obshchei Khim Bd. 29, S. 1554-1558 (1959) ) wurde in das gemischte Anhydrid
umgewandelt nach der stufenweise)' Zugabe von Triäthylamin und Athylchlorfonniat, wie unter B angegeben. Das Filtrat
wurde sofort auf -10°C abgekühlt und das Produkt bei -10°
mit einer Lösung von 43Ü mg (2,A ; mMol) 2-Amino-1,3,4-thiadiazol-5-sulfonamid
(wie unter B beschrieben erhalten) in 3 ml trockenem Pyridin vermischt. Das Reaktionsgemisch
wurde 20 Stunden bei O0C gerührt und dann die Lösungsmittel
bei 300C unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde 1 Stunde
bei O0C mic 100 ml 1,5n Salzsäure gerührt und der entstehende
gelbe Niederschlag abfiltriert iu;d 1 Stunde bei 00C mit 100 ml
10 Gew.-%iger Natriumhydroxidlöiung gerührt. Der gelbe Feststoff
wurde abfiltriert und aus .äßrigem Methanol umkristallisiert.
Man erhielt 50 mg einet· gelben Feststoffes. Ausbeute 9 %; Fp 229-2330C
Analyse berechnet für C1^H1-NyO^^2: C 36,60; H 3,73
Analyse berechnet für C1^H1-NyO^^2: C 36,60; H 3,73
gefunden : C 37,07; H 3,96; N 21,19
D. Reagens-Lösungen ^
(1) Acetazolamid-Reagens: 1,:>
mg 2-Acetylamino-1,3»4-thiadiazol-5-sulfonamid
vurden in einigen Tropfen Dimethylsulfoxid gelöst und mit Wasser auf 50 ml verdünnt. Weitere Verdünnungen wurden mit Wasser
vorgenommen.
(2) Biotin- und DNP-Modulat^r-Reagentien: Das Biotin-Modulator-Konjugat
(2,0 mg) und das DNP-Modulator-Konjugat
(1,7 mg) wurden jeweils* in 10 ml 0,1m Natriumcarbonatpuffer, pH 10,5, verdünnt. Weitere
Verdünnungen wurden mit »/asser vorgenommen.
(3) Avidin-Reagens: LyophilJ.siertes Avidin (Sigma
Chemical Co., St. Louis. Mssouri) wurde in 10 mMol Tris-HCl-Puffer, pt· 7,4, in einer Konzentration
von 10,5 Aktivität?einheiten/ml (eine Einheit
ist die Menge, die imstande ist, ein yug Biotin zu
binden) gelöst.
(4) Antikörper· zu Dinitroph?nyl-(DNP)-Reagens: Antisera,
die gegen DNP gebildet worden waren, wurden bei 4°C über eine 5 x T) cm Säule mit Sephadex G-200
(Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) mit 0,1m Tris-HCl-Puffer, pH 8,2, enthaltend 1m Natriumchlorid chromatographiert.
Der zweite eluierte Anteil, der durch die optische Dichte bei 280nm bestimmt wurde, enthielt
die Antikörper-Aki.ivität gegen DNP.
(5) p-Nitrophenyl-acetat-Re-'gens: 5 mg p-Nitrophenylacetat
in 0,3 ml Aceton wurden mit destilliertem Wasser unter Rühren auf 10 ml gebracht.
Beispiel 2 Esterase-Aktivitviten von Carbonsäure-Anhydrase
als Funktion der Acetazolamid-Konzentration
Carbonsäure-Anhydrase (0,0I3 Internationale Einheiten)
wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur in eine Reihe von 0,66 ml wäßrigen Lösungen, enthaltend jtv/eils 100 /Ul 0,1m Diäthylmalonsäure-Puffer,
pH 7»4, und die in Tabelle 1 angegebenen
33 275A0S6
ogei' auf 1 ml ündvolumeh). 0,3:
Acetazolamid und Avidin, bezogen au!" 1 ml ündvolumeh). O,33 ml
p-Witrophenyl-acetat-Reagens wu! len zu jeder Lösung gegeben,
um ein Gesamtvolumen von 1 ml z\- erhalten. Die Hydrolysegeschwindigkeit
von p-Nitrophenyl; :etat wurde durch Beobachtung
der Absorption bei 348 nm Iistimmt.
Die Ergebnisse, die jewei.l 3 das Mittel von 2 Messungen
sind, sind in Tabelle 1
Tabeli. | 3 1 | Hydrolysegeschwindig | |
Acetazolamid- | Avidin | keit (AOD^Q/min/ml) | |
Konzentration (/UM) | (Einhe· | ten/ml) | 0,136 |
0,000 | 0,088 | ||
0,144 | - | 0,047 | |
0,283 | - | 0,089 | |
0,144 | 0,1': | 5 | 0,111 |
0,000 | - | 0,106 | |
0,000 | 0,1" | ||
Diese Werte zeigen, daß d .s Acetazolamid das Enzym Cai'bonsäure-Anhydrase hemmte un.! daß das Vorhandensein von
Avidin keine deutliche Wirkung -uf die Hemmung ausübte.
Beispiel 3 ^sterase-AktiviIäten von Carbonsäure-
/unhydrase als funktion der Biotin-Hodulator-Konjugat-Konzen
!.ration
Carbonsäure-Anhydrase (O,'/27 Internationale Einheiten)
wurde 5 Minuten bei Raumte'perat'.ir in eine Reihe von 0,66 ml
wäßrigen Lösungen, enthaltend 100 >ul 0,1m Diäthylmalonsäure-Puffer,
pH 7,4, und die in Tabe'le 2 angegebenen Mengen an Biotin-Modulator-Konjugat (hergestellt entsprechend Beispiel 1
inkubiert (Konzentration des Kcujugats, bezogen auf 1 ml Endvolumen).
Die Esterase-Aktivitä'., wie sie durch die Hydrolysegeschwindigkeit
gemessen wurde, wurde für jedes Reaktions-
33 2754088
gemisch wie in Beispiel 2 bestii-'it. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 2 und in graphischer Forci in Fig. 1 angegeben.
Biotin-Modulator-Konjugat- | Hydrolysegeschwindigkeit |
Konzentration ( /UM) | (ÄOD34ö/min/ml) |
0,00 | 0,136 |
0,05 | 0,120 |
0,10 | 0,109 |
0,20 | 0,103 |
0,30 | 0,071 |
0,40 | 0,057 |
0,50 | 0,040 |
Diese Daten zeigen, daß da^ Biotin-Modulator-Konjugat
gute Heminwirkungen, bezogen auf 'Jie Carbonsäure-Anhydrase besitzt
und etv/as weniger wirksam Ist als der nicht abgeleitete
(underivatized) Inhibitor Acetaz'lamid.
Beispiel 4 Direkte Bindungsl estimmung für Avidin;
Konkurrenz-Bindu':gsbestimmung für Biotin; Anwendung von deiivatisiertem Acetazolamid
als Markierungssübstanz
Jis wurde eine Reihe von Biiidungsreaktionsgemischen hergestellt,
jeweils in einem Volumen von 0,66 ml, enthaltend 100 /Ul 0,1m Diäthylmalonsäure-luffer, pH 7,4, und die in
Tabelle 3 angegebenen Konzentrat·onen an Biotin-Modulator-Konjugat
(hergestellt entsprechend Beispiel 1, B), Biotin und Avidin (Konzentrationen bezogen auf 1 ml Endvolumen). Nach
5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,027 Carbonsäure-Anhydrase zu jedem Koaktionsgemisch gegeben und
anschließend weitere 5 Minuten Mikubiert. Dann wurden 0,33 ml
p-Nitrophenyl-acetat-Reagens zu jedem Reaktionsgemisch gegeben
und die Hydrolysegeschwind Lgkeit durch Beobachtung der Absorption bei348 nm gemessen.
Die Ergebnisse, die jeweil ■ das Mittel aus zwei Messungen
darstellen, sind in Tabelle 3 angegeben. Die Ergebnisse
der Reaktionsgemische 2 bi 9 sind in graphischer Form in Fig. 2 angegeben.
Die Werte für die Reaktion'gemisch 2 bis 9 zeigen
die Y/irkung verschiedener Gehalt;: an Avidin auf die Hemmwirkung
des Biotin-Modulator-Konjugats auf die Esterase-Aktivitäten
von Carbonsäure-Anhyirase. Für einen konstanten Gehalt an Biotin-Modulator-K'»ijugat ist die enzymatische
Kydrolysegeschwindigkeit direkt proportional der vorhandenen Avidinmenge. Die Ergebnisse der Gemische
8, 10 und 11 zeigen, daß, wenn BAotin vorhanden ist, die Hydrolysegeschwindigkeit der vorhandenen Menge umgekehrt
proportional ist.
../Tabelle
lisch Biotin-Modulator-fcenjuBat (μΜ)
Biotin CuM)
Avidin (E /ml) Hydrolysegeschvindigkeii
0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
0,50 0f 50
2r* Absorption / min bei 348 nm
0,10 0,60
0,011
0,026
0,040
0,053
0,065
0,079
0,105
0,126
0,105
0,026
0,040
0,053
0,065
0,079
0,105
0,126
0,105
0,105
0,128 0,049 0,056 0,066
0,075 0,079 0,090 0,129 . 0,136 0,104 0,080
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Beispiel 5 Konkurrenz-Bindun ι sbestimmung von Dinitro-
phenyl (DN$-Deriv ten
Anv/endung von der>vatisiertem Acetazolamid als
Harkierungssubst8!>z
Es wurde eine Reihe von BirHungsreaktionsgemischen hergestellt,
jeweils in einem Volume.» von 0,66 ml und enthaltend 100 /Ul 0,1m Diäthylmalonsäure-Pu'.'fer, pH 7,4, und die in
Tabelle 4 angegebenen Mengen an / etazolamid, DNP-Modulator
(entsprechend Beispiel 1, C hei*ge 'teilt), N-DNP-6-aminocaproat
(Biochem. J. Bd. 42, S. £t«7 (1948) ) und Antikörper
zu DNP (die Konzentrationen sind .Jeweils auf 1 ml Endvolumen
bezogen). Nach 5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,03 I.E. Carbonsäure-Anhy-Arase zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und anschließend ·>
Minuten inkubiert. Dann wurden 0,33 ml p-Nitrophenyl-acet it-Reagens zugegeben und die
Hydrolysegeschwindigkeit gemessen durch Beobachtung der Absorption
bei 34ö nm.
Die Ergebnisse, die das Mil eel aus zwei Messungen darstellen,
sind in Tabelle 4 angeg^oen. Ein Vergleich der Ergebnisse
bei den Heaktionsgemischen 1, 3 und 5 zeigt, daß Acetazolamid die Carbonsäure-Anh;· li'ase-Reaktion hemmte und im
wesentlichen nicht beeinflußt wurde durch das Vorhandensein von Antikörper zu DNP. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionsgemische
1, 2 und 4 zeigt, Onß das DNP-Modulator-Konjugat
auch die Carbonsäure-Anhydrase-R'Uiktion hemmte, wobei der Grad
der Hemmung bei Vorhandensein vor· Antikörper zu DNP abnahm. Die Ergebnisse des Reaktionsgemische-: G zeigen, daß das Vorhandenseins
eines DWP-Derivats keinen ■..' iutlichen Einfluß auf die
Carbonsäure-Anhydrase-Reaktion ausübt. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionsgemische 2 und 7 zeigt, daß das Vorhandenseins
des DNP-Derivats bestimmt .erden konnte durch Beobachtung der verstärkten Hemmung der Carbonsäure-Anhydrase-Reaktion
durch das DNP-itodulator-Konjugat.
BAD ORIGINAL
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Claims (1)
- UK. is*:, i". v\ i icsTiK ·ί·τ' .,ιιιιιι μΓ.μίι ι·:.\ noDICK. .·. I'WilMA.NX ν«·ι· \ri-:i«i kksthassi: ^-ι-1:ι rroN (»im» > ι;υ1.:, ι \»;. :ι. ΐ:ι·'.ϋΐΐ ι·:λν
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weniger als ungefähr 10 m bet:1 igt.3. Verfahren nach Anspruch 1 >der 2, dadurch g e -k e n nz e i c h η e t , daß die 'ündungskonstante für die reversible Binaung zwischen dem Σ] lymmodulator und dem Enzymc, 9—1ungefähr 10 bis ungefähr 10 m I aträgt.4. Verfahi-en nach Anspruch 1 ois 3t dadurch g e kennzeichnet, daß de: reversibel bindende Enzymmodulator die Aktivität des Lnzyin hemmt./■ä 275408g5. Verfahren nach Anspruch ! bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß 'er reversibel bindende ünzyiiuiiodulator ein kompetitiver nhibitor für das iCnzym ist.b. Verfahren nach Anspruch '. bis 'j, dadurch gekennzeichnet , daß -lan als reversibel bindenden kon;petitiven Inhibitor ur I als Enzym(a) Acetazolamid oder ein wirksi'ues Analoges davon und Carüonsäure-Anhydrase;(b) oulianilaiiiid oder ein v/irks; ies Analoges davon und Carbonsäure-Anhyürase;(c) Phenyl-crimethylammonium-ior oder ein wirksames Analoges davon und Acetylcholiner ';erase;(d) Saccharo-1,4-lacton oder eil wirksames Analoges davon und ß-Glucuronidase;(e) 4-Aiiiirio-IO-methyi-pteroylgl1· caminsäure oder ein wirksames Analoges davon una uii/drofolatreduktase oder(f) 2, ο ,8-Trichlorpurin oder ei.11 wirksames Analoges davon und Uricase verwendet.7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ier reversibel bindende Enzyim.iodulator die Aktivität ue Enzyms stimuliert bzw. erhöht .ü. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, uadurch gekennzeichnet , daß der Enzymmodulator als Bestandteil des Konjugats die Akt vität des Enzyms anders beeinflußt, wenn das Konjugat in ebundener Form vorliegt als wenn es in freier b'orm vorliegt9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein homogene Arbeitsweise anwendet und das Enzym zu dem Geu ■ sch aus gebundener und freier Form zusetzt.CCvY10. Verfahren nach Anspruch I bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß ii in heterogen arbeitet
und die gebundene von der freien ''orm physikalisch trennt und dann zu einer Form das i&izym zusetzt.11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß #:er Ligand ein Antigen oder Antikörper dazu, Hapten oder Antikörper dazu, Hormon,
Vitamin, Wetabolit oder'pharmako'ogisches Mittel oder ein Rezeptor oder eine bindende Subs-anz dazu ist.
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