CN100480397C - 用于检测sars病毒的生物芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测SARS病毒的生物芯片,它包括一个适于在核酸杂交中使用的支持物;该支持物上固定有至少两个不同的寡核苷酸探针,该至少两个不同的寡核苷酸探针是选自下组之一的互补序列:a)一个位于SARS-CoV基因组的保守区的至少10个核苷酸的核苷酸序列,和一个位于SARS-CoV基因组的可变区的至少10个核苷酸的核苷酸序列;或者b)一个位于SARS-CoV基因组的结构蛋白编码基因中的至少10个核苷酸的核苷酸序列,和一个位于SARS-CoV基因组的非结构蛋白编码基因中的至少10个核苷酸的核苷酸序列。本发明还公开了一种用于扩增和检测SARS-CoV核苷酸序列的试剂盒,该试剂盒包括上述芯片和一个用于评估SARS-CoV核苷酸序列和所述芯片上的探针之间形成的杂交复合体的方法的说明书。本发明的芯片具有重要的实际应用价值。
Description
发明背景
从2002年11月开始,在全球22个国家报导了一种称为严重急性呼吸综合症(SARS)的疾病。到2003年5月2日为止,WHO已经报道了感染的病人中累计6054例SARS病例和417例死亡病例。同时,中国报道了3788例累计SARS病例和181例死亡病例。
SARS病人的主要症状包括发热(超过38℃)、头痛和身体疼痛。2-7天的发病后,病人可能会发生伴随着呼吸困难的无痰干咳。
基于来自于香港、加拿大和美国的发现,一种从来不知道的冠状病毒被确认为引起SARS的原因。研究人员发现SARS冠状病毒是一种正链RNA病毒,该病毒不需要DNA的中间步骤就可以进行复制,并且使用标准的密码子(Marra等人,Science2003年5月1日;(在付印之前以电子文档公开);和Rota等人,Science2003年5月1日,(在付印之前以电子文档公开))。
SARS冠状病毒是一种新发现的病毒,以前从来没有在人或者动物中被检测到。SARS冠状病毒的基因组结构非常类似于其它冠状病毒。SARS冠状病毒的基因组长30K碱基对,对于一个病毒来说,这个基因组非常大了。SARS冠状病毒的基因组编码RNA聚合酶(聚合酶1a和1b),S蛋白(刺突蛋白),M蛋白(膜蛋白),和N蛋白(核衣壳蛋白)等等。
当前有三种类型的检测SARS冠状病毒的方法:免疫方法(例如ELISA),反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR),和细胞培养方法。
上述三种检测方法都有显著的缺陷。例如,ELISA可以从SARS病人血清中可靠地检测抗体。但是这些抗体只有在症状发生的21天之后才能被检测到。细胞培养方法具有相对长的检测周期,并且只能在一些有限的条件下才能够使用。而且,细胞培养方法只能检测活病毒的存在。
阻止SARS冠状病毒传播的关键步骤是早期诊断、早期隔离和治疗。RT-PCR是唯一存在的可以检测SARS冠状病毒核酸的方法。然而,RT-PCR不能在SARS病毒表达前排除受感染的病人,而且RT-PCR的检测率是很低的。检测过程需要昂贵的实时PCR设备。因此RT-PCR无法满足早期临床筛选和诊断的需要。
在本技术领域需要开发一种快速、灵敏和准确的严重急性呼吸综合症的诊断技术。本发明解决了本技术领域的这个问题并满足了其它相关的需要。
发明概述
一方面,本发明是一种芯片,用来检测引起严重急性呼吸综合症的冠状病毒(SARS-CoV),该芯片包括一个支持物,适合在核酸杂交中使用,该支持物上固定化有与SARS-CoV基因组的至少两个不同的核苷酸序列互补的至少两个寡核苷酸探针,所述核苷酸序列包括至少10个核苷酸。
另一方面,本发明涉及在样本中检测SARS-CoV的方法,该方法包括:a)提供了一种上述描述的芯片;b)用含有或疑似包含SARS-CoV核苷酸序列的样本在适合核酸杂交的条件下接触所述芯片;并且c)评价由所述SARS-CoV核酸序列,如果在样本中存在的话,和至少两个分别与SARS-CoV基因组的两个不同的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针之间形成的杂交复合体,来决定样本中SARS-CoV的存在与否和数量,从而只要检测到一个或者两个上述杂交复合体就显示在给定样本中存在所述SARS-CoV。
通过使用多个杂交探针,和基于单个杂交探针的试验相比,本发明的方法减少了假阴性结果的发生,这是由于多个杂交目标上同时出现突变的机率比单个杂交目标上出现突变的机率要小得多。当使用其它优选实施方案时,例如采用阴性对照探针和空白点时,假阳性结果的机会也降低了。并且芯片上包括了更多的优选实施方案,例如一个固定化对照探针和一个阳性对照探针,可以提供对于检测结果的进一步验证。使用优选的样本制备流程、RNA提取流程和扩增流程可以进一步增强本发明方法的灵敏度。
仍然在另一个方面,本发明涉及用于扩增SARS-CoV的核苷酸序列的寡核苷酸引物,该寡核苷酸引物包括一个具有以下特征的核苷酸序列:a)和表1中所示的一个SARS-CoV靶核苷酸序列,或者它的互补链在高严谨性下杂交;或者b)和包括表1中所示的核苷酸序列的SARS-CoV靶核苷酸序列或其互补序列具有至少90%的同一性。也同样包括使用这些引物扩增SARS-CoV核苷酸序列的试剂盒和方法。
表1 由博奥生物芯片(Capital Biochip)设计的SARS-CoV引物
仍然在另一个方面,本发明涉及一个可以和一个SARS-CoV核苷酸序列杂交的寡核苷酸探针,该寡核苷酸探针包括一个具有如下特点的核苷酸序列:a)可以和表2中的一个SARS-CoV靶核苷酸序列或其互补链在高严谨性下杂交;或者b)和包括表2中的核苷酸序列的SARS-CoV靶核苷酸序列或其互补链具有至少90%同一性。也同样涉及使用这些探针进行SARS-CoV核苷酸序列的杂交分析的试剂盒和方法。
表2 由博奥生物芯片设计的SARS-CoV探针
附图简述
图1A和1B说明了示例的SARS-CoV基因组结构(参见Marra等人,Science2003年5月1日;[在付印之前以电子文档公开]的图2;和GenBank Accession No.NC_004718)。
图2说明了一个示例的样本制备过程。
图3说明了一个在PCR中使用的例证性探针标记。通用引物的序列和特异引物的共同序列相互补。在扩增步骤开始之前通用引物和特异引物就加到PCR体系中。扩增的特异性由特异引物的特异部分来保证。在一个或者几个热循环后,通用引物可以有效地整合到扩增子当中。然后通用引物可以和特异引物的共同序列的互补序列进行退火结合。PCR进一步可以用掺入到通用引物中的荧光染料进行。1和6描述了一个荧光染料;2描述了一个上游的通用引物;3描述了一个具有共同序列的上游特异引物;4指的是一个模板;5指的是一个具有一个共同序列的下游的特异引物;7指的是一个下游的通用引物。
图4描述了在氨基修饰过的玻璃基片表面固定的探针,例如用聚-L-赖氨酸处理。胺偶联化学:胺底物含有伯胺基团(NH3+),其共价连接到玻璃表面上(矩形)。胺在中性pH的时候带有正电荷,可以通过和带有负电荷的磷酸骨架形成离子键而吸引带有负电荷的DNA(双螺旋)。静电吸附可以通过一个紫外灯照射或者加热来补充。这样使得DNA在伯胺和胸腺嘧啶之间形成共价键(右面的图面)而使得DNA可以共价连接到表面上。静电结合和共价连接组合起来以高度稳定的方式将DNA偶合到底物上。
图5说明了一个SARS-CoV检测芯片的示例阵列格式。
图6A和6B说明了从一个SARS病人的血液样本中进行的SARS-CoV检测(样本编号3)。
图7A和7B说明了从一个SARS病人的血液样品中进行的SARS-CoV检测(样本编号4)。
图8A和8B说明了从一个SARS病人的痰液样本中进行的SARS-CoV检测(样本编号5)。
图9A和9B说明了从一个SARS病人的痰液样本中进行的SARS-CoV检测(样本编号6)。
图10说明了另一个示例性的SARS-CoV检测芯片的阵列格式。
图11说明了在图10中说明的SARS SARS-CoV检测芯片上所有可能的阳性结果。
发明详述
为了便于本发明的说明,而不是为了受到限制,本发明的详细描述划分为如下几节。
A.定义
除非另外定义,此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。此处所提到的所有专利、申请书、已公开的申请书和其它申请书被完整地引入于此作为参考。如果该部分所述的定义与此处引入作为参考的专利、申请书、已公开的申请书和其它申请书中所述的定义相反或者不一致,那么该部分所述的定义超越了被引入此处作为参考的定义。
这里使用的“一个”意味着“至少一个”或者“一个或多个”。
这里提到的“冠状病毒”指的是一个导致呼吸疾病的单链RNA病毒家族。该病毒的外膜上有向外放射状排列的棒状突起,负染色病毒体显示出典型的冠状外表。
这里使用的“聚合酶链式反应(PCR)”指的是一个用于体外DNA扩增的系统。在存在过量的脱氧核苷酸和一个热稳定的DNA聚合酶的情况下,例如,TaqDNA聚合酶,两个合成的寡核苷酸引物,与被扩增的靶DNA(每条链一个)的两个区域互补,被增加到靶DNA上(无需纯化)。在一系列温度循环,例如30个循环之后,靶DNA重复变性(例如,大约90℃),退火到引物上(例如,在50-60℃)和从引物扩增出子代链(例如72℃)。随着子代链本身作为后续循环的模板,和两个引物匹配的DNA片断得到了指数扩增,而不是线性扩增。原始的DNA不必是纯化的或者高丰度的,PCR反应因此得到了越来越广泛的应用,不只是在研究中,而且在临床诊断和法医学研究中都得到了广泛的应用。
这里提到的“嵌套式PCR”指的是这样的一种PCR反应,其中通过顺序使用两套引物使得特异性得到了提高。最初的PCR通过外部的引物对来进行,然后将第一轮PCR产物中的一小份用作第二轮PCR的模板,第二轮PCR使用“内部”引物对进行。
这里提到的“反转录PCR或者RT-PCR”指的是这样一种PCR,其中起始模板是RNA,这意味着需要一个初始的反转录酶步骤来产生DNA模板。一些热稳定的聚合酶具有很好的反转录酶活性,或者更加常见的是进行一个明显的反转录步骤,然后使反转录酶去活性或者纯化产物,最终进行一个单独的传统PCR。
这里指的“引物”指的是一段寡核苷酸,它可以和一个靶序列进行杂交,通常在扩增过程中引发核酸扩增。
这里的“探针”指这样的一段寡核苷酸,其能与靶序列杂交,通常用来辅助对该靶序列的检测。术语“靶序列”指的是探针与其特异性结合的一段核酸序列。和扩增过程中用来引发靶核酸的引物不同,探针不需要使用聚合酶来延长以扩增靶序列。然而,对于本技术领域的普通技术人员显而易见的是,探针和引物在许多情况下在结构上是相似或者相同的。
这里使用的“所述5’和3’通用引物的浓度分别等于或高于所述5’和3’特异性引物的浓度”是指,5’通用引物的浓度等于或高于5’特异性引物的浓度,和3’通用引物的浓度等于或高于3’特异性引物的浓度。
这里提到的“发夹结构”指包括一个双链茎部和一个单链环部的多核苷酸或核酸,其中两个多核苷酸或核酸链以形成双链茎部的方式连接在一起,并且通过形成环部的单个多核苷酸或核酸链分离。“发夹结构”可以进一步包括从双链茎部延伸出去的3’和/或5’单链部分。
这里使用的“核酸”指任何形式的脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA),其中包括单链、双链、三链、线性和环状形式。也包括多核苷酸、寡核苷酸、核酸的嵌合体及其类似物。此处描述的核酸可以由熟知的脱氧核糖核酸和核糖核酸组成,所述脱氧核糖核酸和核糖核酸由碱基腺苷、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷和尿苷组成,或者可以由这些碱基的类似物或衍生物组成。此外,具有非传统磷酸二酯骨架的多个其它的寡核苷酸衍生物也包括在其中,如磷酸三酯、polynucleopeptides(PNA)、甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、多核苷酸引物、封锁核酸(LNA)及其类似物。
这里使用的“互补的或匹配的”指两个核酸序列具有至少50%序列同一性。优选地,两个核酸序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。“互补的或匹配的”也指两个核酸序列可以在低、中和/或高严谨性条件下进行杂交。
这里使用的“基本上互补的或基本上匹配的”指两个核酸序列具有至少90%的序列同一性。优选地,两个核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。可以选择地,“基本上互补的或基本上匹配的”指两个核酸序列可以在高严谨性条件下进行杂交。
这里使用的“两个精确匹配的核苷酸序列”指一个核酸双链体,其中两个核苷酸链根据沃森-克里克碱基配对法则(Watson-Crick basepair principle)进行配对,即DNA:DNA双链体中的A-T和C-G配对,和DNA:RNA或RNA:RNA双链体中的A-U和C-G配对,并且在双链的每条链中都没有删除或插入。
这里使用的确定错配百分比中的“杂交的严谨性”如下:
1)高严谨性:0.1 x SSPE(或0.1 x SSC),0.1% SDS,65℃;
2)中严谨性:0.2 x SSPE(或1.0 x SSC),0.1% SDS,50℃(也称作中等严谨性);和
3)低严谨性:1.0 x SSPE(或5.0 x SSC),0.1% SDS,50℃。
应该理解到可以使用其它的缓冲液、盐和温度来获得同等的严谨性。
这里使用的“基因”指的是在染色体上占据了一个特定座位的遗传单位,基因的存在可以通过不同等位基因形式的出现来获得验证。假如给定了剪接基因的出现,基因也包括需要来产生一个单独多肽的一组DNA序列(外显子)。
这里使用的“溶解温度”(“Tm”)指的是核酸双链进行变性的温度范围的中点,例如DNA:DNA、DNA:RNA、RNA:RNA、PNA:DNA、LNA:RNA和LNA:DNA等。
这里使用的“样本”指的是可能包含通过当前的芯片、引物、探针、试剂和方法进行实验或者扩增的靶SARS-CoV的任何材料。样本可能是一个生物样本,例如生物流体或者一个生物组织。生物流体的例子包括尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、大便、痰液、脑脊液、眼泪、黏液、羊水或者其它。生物组织是细胞群落,通常是特定种类的细胞与它们的胞内物质的聚合体,它们形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构物质之一,包括结缔组织、上皮细胞组织、肌肉组织和神经组织。生物学组织的例子也包括器官、肿瘤、淋巴结、血管和单独的细胞。生物学组织可被处理来获得悬浮细胞的样本。样本也可以是体外准备的细胞混合物。样本也可以是培养细胞的悬浮液。在生物学样本中,样本可以是原始样本或者处理过的样本,是对原始样本进行多次处理或制备后获得的。例如,用各种细胞分离方法(例如磁性活化的细胞分选)从体液样本例如血液中分离或者富集目标细胞。本发明中使用的样本包括这样的靶细胞富集的细胞制备物。
这里使用的“流体样本”指的是自然以液体或者流体方式存在的样本,例如生物流体。“液体样本”也指以非液体状态天然存在的样本,例如固体或气体,但是制备为含有固体或气体样本材料的液体、流体、溶液或悬液。例如,液体样本可以包括含有生物组织的液体、流体、溶液或悬液。
这里使用的“评价PCR产物”指定量和/或定性测定PCR产物,并且也指获得一个指数、比值、百分数、可视的或其它值,来表示PCR产物的水平。评价可以是直接的或间接的,当然实际检测的化学种类不需要是PCR产物本身,但可以是,例如其衍生物,或一些进一步的物质。
B.检测SARS-CoV的芯片
一方面说,本发明指的是一个芯片,可以用来检测引起严重急性呼吸综合症的冠状病毒(SARS-CoV),这个芯片有一个支持物,所述芯片适合在核酸杂交中使用,支持物上固定化有至少两个寡核苷酸探针,它们与SARS-CoV基因组的至少两个不同的核苷酸序列互补,所述两个不同的核苷酸序列中的每一个包括至少10个核苷酸。
该至少两个不同的核苷酸序列可以是任何适当的组合,例如,SARS-CoV基因组的至少两个不同的核苷酸序列可以包括位于SARS-CoV基因组的保守区中的至少10个核苷酸的核苷酸序列,和位于SARS-CoV基因组的可变区中的至少10个核苷酸的核苷酸序列。在另一个实施例中,SARS-CoV基因组的至少两个不同的核苷酸序列可以包括位于SARS-CoV基因组的结构蛋白编码基因中的至少10个核苷酸的核苷酸序列,和位于SARS-CoV基因组的非结构蛋白编码基因中的至少10个核苷酸的核苷酸序列。
如果期望,本发明的芯片可以包括其它类型的探针或其它元素。例如,该芯片可以进一步包括:a)下述三种寡核苷酸探针中的至少一种寡核苷酸探针:一个固定化对照探针,该探针是经过标记的,并且当含有或疑似包含SARS-CoV的样本与芯片接触时,该探针不参与任何杂交反应;一个阳性对照探针,该探针与任何SARS-CoV序列不互补,但是与样本中所包括的非SARS-CoV序列互补;一个阴性对照探针,该探针与样本中含有的任何核苷酸序列不互补;和b)一个空白点。
在特定的实施方案中,本发明的芯片包括至少两个寡核苷酸探针,这两个寡核苷酸探针分别与包括至少10个核苷酸的两个不同的核苷酸序列互补,位于SARS-CoV基因组的一个保守区域中,位于SARS-CoV基因组的一个结构蛋白编码基因中或者位于SARS-CoV基因组的一个非结构蛋白编码基因中。
SARS-CoV基因组的任何保守区域可以用来作为测试靶标。例如,SARS-CoV基因组的保守区域可以是位于SARS-CoV的复制酶1A,1B基因或者N基因中的一个保守区域。
SARS-CoV基因组的任何可变区可以用来作为测试靶标。例如,SARS-CoV基因组的可变区可以是位于SARS-CoV的刺突糖蛋白(S)基因上的一个区域。
SARS-CoV基因组的任何结构蛋白编码基因可以用来作为一个实验靶标。例如,SARS-CoV基因组的结构蛋白编码基因可以是编码刺突糖蛋白(S)、小包膜蛋白(E)或者核衣壳蛋白(N)的基因。
SARS-CoV基因组的任何非结构蛋白编码基因可以用来作为测试靶标。例如,SARS-CoV基因组的非结构蛋白编码基因可以是一个编码复制酶1A或者1B的基因。
在另外一个特定的实施方案中,本发明的芯片可以包括下列四个寡核苷酸探针中的至少两个:两个与位于SARS-CoV的复制酶1A或者1B中的至少10个核苷酸的两个不同的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,一个与位于SARS-CoV的N基因中的至少10个核苷酸的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,和一个与位于SARS-CoV的S基因中的至少10个核苷酸的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针。
优选地,位于SARS-CoV的复制酶1A或1B基因中的一个或两个不同的核苷酸序列可以包括一个具有如下特征的核苷酸序列:a)在高严谨性条件下与表3中的复制酶1A或1B核苷酸序列或其互补链杂交;或b)与包括一个如表3中所示的核苷酸序列的复制酶1A或1B核苷酸序列或其互补链具有至少90%同一性。更优选地,位于SARS-CoV的复制酶1A或1B基因中的一个或两个不同的核苷酸序列包括一个如表3所示的核苷酸序列。
表3:例证性的SARS-CoV探针
而且优选地,位于SARS-CoV的N基因中的核苷酸序列可以包括一个具有如下特征的核苷酸序列:a)在高严谨性条件下与表3所示的N基因的核苷酸序列或其互补链杂交;或b)与包括表3所示核苷酸序列的N基因的核苷酸序列或其互补链具有至少90%同一性。更优选地,位于SARS-CoV的N基因中的核苷酸序列可以包括一个如表3所示的核苷酸序列。
而且优选地,位于SARS-CoV的S基因中的核苷酸序列可以包括一个具有如下特征的核苷酸序列:a)在高严谨性条件下与表3所示的S基因的核苷酸序列或其互补链杂交;或b)与包括表3所示的核苷酸序列的S基因的核苷酸序列或其互补链具有至少90%同一性。更优选地,位于SARS-CoV的S基因中的核苷酸序列可以包括一个如表3所示的核苷酸序列。
在固定化对照探针中可以使用任何适当的标记,例如化学的、酶的、免疫化学的、放射性标记的、荧光的、发光的或者FRET标记。
可以使用任何适当的非SARS-CoV序列。例如非SARS-CoV序列可以是一个样本的内源序列成分。或者在实验样本中掺入非SARS-CoV序列。另外掺入的非SARS-CoV序列可以是拟南芥来源的一段序列。
仍然在另一个特定实施方案中,本发明的芯片可以包括两个与位于SARS-CoV的复制酶1A或1B基因中的两个不同的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针;一个与位于SARS-CoV的N基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针;一个与位于SARS-CoV的S基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针;一个固定化对照探针,该探针是经过标记的,当含有或疑似含有SARS-CoV的样本与芯片接触时,该探针不参与任何杂交反应;一个阳性对照探针,其与任何SARS-CoV序列不互补,但与样品中所包括的非SARS-CoV序列互补;一个阴性对照探针,其与样本中含有的任何核苷酸序列不互补。
优选地,该芯片包括所描述探针的多个点,例如如下探针的多个点:两个与位于SARS-CoV的复制酶1A或1B基因中的两个不同的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,与位于SARS-CoV的N基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,与位于SARS-CoV的S基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,固定化对照探针,阳性对照探针和阴性对照探针。
本发明的芯片可以进一步包括与不涉及SARS-CoV的冠状病毒的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针。例如,与SARS不相关的冠状病毒可以是I、II或III组冠状病毒,或是感染如下种类的一种冠状病毒:禽类,例如禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒;马类,例如马冠状病毒;犬类,例如犬冠状病毒;猫类,例如猫冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒;猪类,例如猪流行性腹泻病毒,和猪传染性胃肠炎病毒,猪血凝性脑脊髓炎病毒;小牛类,例如初生小牛痢疾冠状病毒;牛类,牛冠状病毒;小鼠类,例如小鼠肝炎病毒;鸟嘴海雀类,例如鸟嘴海雀病毒;大鼠类,例如大鼠冠状病毒和大鼠涎目腺炎病毒,例如;火鸡类,例如火鸡冠状病毒;或人类,例如人肠道冠状病毒。本发明的芯片可以进一步包括与其它类型的病毒或病原体的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针。如下面的表5中所示为可以使用本发明的芯片检测的病毒和病原体的例证性列表。
表5.例证性的病毒和病原体
序号 | 病毒名称 | 基因组 | 样本核酸 | 结构 |
1 | 冠状病毒科 | 单链,线性RNA | RNA | 有衣壳 |
2 | SARS-CoV | 单链,线性RNA | RNA | 有衣壳 |
3 | 人冠状病毒229E | 单链,线性RNA | RNA | 有衣壳 |
4 | 人冠状病毒OC43 | 单链,线性RNA | RNA | 有衣壳 |
5 | 流感病毒A,B,C | 单链,线性RNA,分组的 | RNA | 有衣壳 |
6 | 副流感病毒 | 单链,线性RNA | RNA | 有衣壳 |
7 | 呼吸道合胞病毒 | 单链,线性RNA | RNA | 有衣壳 |
8 | 人变态肺炎病毒 | 单链,线性RNA | RNA | 有衣壳 |
9 | 鼻病毒 | 单链,线性RNA | RNA | 无衣壳 |
10 | 腺病毒 | 双链,线性DNA | DNA | 无衣壳 |
11 | 肺炎支原体 | 双链,线性DNA | DNA和RNA | 有细胞璧 |
12 | 肺炎衣原体 | 双链,线性DNA | DNA和RNA | 无细胞璧 |
多个探针,例如与位于SARS-CoV基因组的保守区域中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,与位于SARS-CoV基因组的可变区域中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,固定化对照探针,阳性对照探针或阴性对照探针,在其5’端可以包括一个多聚dT区域,以增强其在支持物上的固定化。
在一个特定的实施方案中,这些寡核苷酸探针中的至少一个与SARS-CoV基因组的高度表达的核苷酸序列互补。这样的芯片在检测早期SARS-CoV感染中特别有用。
寡核苷酸探针和靶SARS-CoV核苷酸序列可以是任何合适的长度。优选地,寡核苷酸探针和靶SARS-CoV核苷酸序列的长度是至少7、10、20、30、40、50、60、80、90、100或超过100个核苷酸。
寡核苷酸探针和引物可以通过任何合适的方法制备,例如化学合成,重组方法和/或两种方法都使用(一般地参见,Ausubel等人,(编著),Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(2000))。
任何合适的支持物可以在本发明的芯片中使用。例如,支持物可以包括选自硅、塑料、玻璃、陶瓷、橡胶和聚合物表面的表面。
C.用于检测样本中SARS-CoV的方法
在另一个方面,本发明涉及一种方法,用于检测样本中的SARS-CoV,该方法包括:a)提供上述芯片;b)用含有或可能含有SARS-CoV核苷酸序列的样本在适合核酸杂交的条件下接触所述芯片;和c)如果在所述样本中存在所述SARS-CoV核苷酸序列,评价所述SARS-CoV核苷酸序列,和与SARS-CoV基因组的两个不同的核苷酸序列分别互补的至少两个寡核苷酸探针之间形成的杂交复合体,以确定样本中所述SARS-CoV的存在与否或其数量,从而只要检测到一个或两个所述杂交复合体就表明在所述样本中存在所述SARS-CoV。
在一个特定的实施方案中,本发明的方法包括:a)提供芯片,该芯片包括一个位于SARS-CoV基因组的保守区域中的至少10个核苷酸的核苷酸序列和一个位于SARS-CoV基因组的可变区域中的至少10个核苷酸的核苷酸序列,或一个位于SARS-CoV基因组的结构蛋白编码基因中的至少10个核苷酸的核苷酸序列和一个位于SARS-CoV基因组的非结构蛋白编码基因中的至少10个核苷酸的核苷酸序列;b)用含有或可能含有SARS-CoV核苷酸序列的样本在适合核酸杂交的条件下接触所述芯片;和c)评价所述SARS-CoV核苷酸序列(如果在所述样本中存在),和i)分别与位于SARS-CoV基因组的保守区域中的一个核苷酸序列互补的所述寡核苷酸探针,和与位于SARS-CoV基因组的可变区域中的一个核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,或ii)与位于SARS-CoV基因组的结构蛋白编码基因中的一个核苷酸序列互补的所述寡核苷酸探针,和与位于SARS-CoV基因组的非结构蛋白编码基因中的一个核苷酸序列互补的寡核苷酸探针之间形成的杂交复合体,以确定在所述样本中SARS-CoV的存在与否或其数量,从而只要检测到一个或两个所述杂交复合体就表明在所述样本中存在所述SARS-CoV。
在另一个特定的实施方案中,本发明的方法包括:a)提供一个芯片,该芯片包括一个与位于SARS-CoV基因组的保守区域中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,一个与位于SARS-CoV基因组的可变区域中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,下述三个寡核苷酸探针中的至少一个寡核苷酸探针:一个固定化对照探针,该探针是经过标记的,当含有或可能含有SARS-CoV的样本与芯片接触时,该探针不参与任何杂交反应,一个阳性对照探针,其与任何SARS-CoV序列不互补,但是与样本中含有的非SARS-CoV序列互补,一个阴性对照探针,其与样本中含有的任何核苷酸序列不互补,和一个空白点;b)用含有或可能含有SARS-CoV核苷酸序列的样本在适合核酸杂交的条件下接触所述芯片;和c)评价:i)在所述SARS-CoV核苷酸序列(如果在样本中存在),和分别与SARS-CoV基因组的保守区域中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针以及与SARS-CoV基因组的可变区域中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针之间形成的杂交复合体;ii)包括在固定化对照探针中的标记物,或涉及阳性对照探针和/或阴性对照探针的杂交复合体;和iii)在所述空白点上的信号,以确定在所述样本中SARS-CoV的存在与否或其数量。
优选地,本发明的芯片包括两个与位于SARS-CoV的复制酶1A或1B基因中的两个不同的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,一个与位于SARS-CoV的N基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,一个与位于SARS-CoV的S基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,一个固定化对照探针,一个阳性对照探针和一个阴性对照探针,当存在如下情况时可确定存在SARS-CoV:a)使用位于SARS-CoV的复制酶1A或1B基因中的两个不同的核苷酸序列中的至少一个核苷酸探针,与位于SARS-CoV的N基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针和与位于SARS-CoV的S基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针进行检测,检测到阳性杂交信号;b)使用固定化对照探针进行检测,检测到阳性信号;c)使用阳性对照探针进行检测,检测到阳性杂交信号;d)使用阴性对照探针进行检测,检测不到阳性杂交信号;和e)在空白点处,没有检测到阳性杂交信号。
包括一个在SARS-CoV的可变区域中的靶序列能评价SARS-CoV的可能突变。例如,使用位于SARS-CoV的复制酶1A或1B中的两个不同的核苷酸序列中的至少一个,或与位于SARS-CoV的N基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,检测到阳性杂交信号;而使用与位于SARS-CoV的S基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,检测不到阳性杂交信号,这表明了SARS-CoV的突变。
本发明的方法可以被用于任何合适的预后和诊断目的。在一个实施例中,本发明的方法被用于从具有SARS样症状的病人群体中证实性检测感染了SARS-CoV的病人,所述SARS样症状例如发烧或高热、无痰咳嗽、肌痛、呼吸困难、高乳酸脱氢酶、低血钙和淋巴球减少(Booth等人,JAMA,2003年5月6日;[在付印之前以电子文档公开])。本发明的芯片、方法和试剂盒可以进一步包括检测高乳酸脱氢酶、低血钙症和淋巴球减少症等等。
在另一个实施例中,使用了这样的一个芯片,该芯片进一步包括与不涉及SARS-CoV的冠状病毒的核苷酸序列互补的一个寡核苷酸探针,该方法被用于从已经感染了与SARS不相关的冠状病毒的病人中证实性检测感染了SARS-CoV的病人,所述冠状病毒例如感染如下种类的一种冠状病毒:禽类,例如禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒;马类,例如马冠状病毒;犬类,例如犬冠状病毒;猫类,例如猫冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒;猪类,例如猪流行性腹泻病毒,猪传染性胃肠炎病毒和猪血凝性脑脊髓炎病毒;小牛类,例如新生小牛痢疾冠状病毒;牛类,例如牛冠状病毒;小鼠类,例如小鼠肝炎病毒;鸟嘴海雀类,例如鸟嘴海雀病毒;大鼠类,例如大鼠冠状病毒和大鼠涎目腺炎病毒;例如火鸡类,例如火鸡冠状病毒;或人类,例如人肠道冠状病毒。
仍然在另一个实施例中,使用了这样的一个芯片,该芯片包括与SARS-CoV基因组的高度表达的核苷酸序列互补的一个寡核苷酸探针,该方法被用于诊断早期SARS病人,例如已经感染了大约不到一天至大约三天的SARS-CoV的SARS病人。
仍然在另一个实施例中,本发明的方法被用于SARS的监控治疗,例如用抑制多种RNA病毒例如三氮唑核苷的复制的干扰素或试剂进行的治疗。本发明的方法也被用于在药物筛选实验中评价潜在的抗SARS-CoV试剂。
任何合适的SARS-CoV核苷酸序列可以被检测。例如,被检测的SARS-CoV核苷酸序列可以是SARS-CoV RNA基因组序列或从提取的SARS-CoV RNA基因组序列扩增的DNA序列。
SARS-CoV RNA基因组序列可以通过任何合适的方法制备。例如,SARS-CoVRNA基因组序列可以使用QIAamp病毒RNA试剂盒、Chomczynski-Sacchi技术或TRIzol(De Paula等人,J.Virol.Methods,98(2):119-25(2001))从感染了SARS-CoV的细胞或其它材料提取。优选地,SARS-CoV RNA基因组序列是使用QIAamp病毒RNA试剂盒从感染了SARS-CoV的细胞或其它材料提取。SARS-CoV RNA基因组序列可以从任何合适的来源提取。例如,SARS-CoV RNA基因组序列可以从痰液或唾液样本提取。在另一个实施例中,SARS-CoV RNA基因组序列可以从血液样本的淋巴细胞中提取。
SARS-CoVRNA基因组序列可以用任何合适的方法扩增,例如PCR。优选地,标记物在PCR过程中被整合到扩增的DNA序列中。任何合适的PCR可以被使用,例如传统的PCR、多重PCR、嵌套式PCR或RT-PCR。在一个实施例中,PCR可以包括一个两步嵌套式PCR,第一个步骤是RT-PCR,第二个步骤是传统PCR。在另一个实施例中,PCR可以包括一个一步、多重RT-PCR,其使用了多个5’和3’特异性引物,其中每一个特异性引物包括一个与其被扩增的靶序列互补的特异性序列和一个共同序列,和一个5’和3’通用引物,其中5’通用引物与5’特异性引物的共同序列互补并且3’通用引物与3’特异性引物的共同序列互补,其中在PCR中,5’和3’通用引物的浓度分别等于或高于5’和3’特异性引物的浓度。优选地,3’通用引物和/或5’通用引物是经过标记的,例如荧光标记物。仍然在另一个实施例中,PCR包括一个多步嵌套式PCR或RT-PCR。仍然在另一个实施例中,PCR使用表4中所示的下述引物对中的至少一个引物对进行。
表4.例证性SARS-CoV引物
D.SARS-CoV引物、探针、试剂盒及其使用
仍然在另一个方面,本发明涉及寡核苷酸引物,用于扩增SARS-CoV核苷酸序列,该寡核苷酸引物包括一个具有如下探针的核苷酸序列:a)在高严谨性条件下与表1所示的靶SARS-CoV核苷酸序列或其互补链杂交;或b)与包括表1所示的核苷酸序列的靶SARS-CoV核苷酸序列或其互补链具有至少90%同一性。
本发明的引物可以包括任何合适类型的核酸,例如DNA、RNA、PNA或其衍生物。优选地,这些引物包括表1所示的核苷酸序列,或其互补链。
在一个特定的实施方案中,本发明涉及一种试剂盒,用于扩增SARS-CoV核苷酸序列,该试剂盒包括:a)一个如上面所述的引物;和b)可以使用探针扩增SARS-CoV核苷酸序列的核酸聚合酶。优选地,核酸聚合酶是反转录酶。
仍然在另一个方面,本发明涉及寡核苷酸探针,用于与SARS-CoV核苷酸序列杂交,该寡核苷酸探针包括一个具有如下探针的核苷酸序列:a)在高严谨性条件下与表2所示的靶SARS-CoV核苷酸序列或其互补链杂交;或b)与包括表2所示的核苷酸序列的靶SARS-CoV核苷酸序列或其互补链具有至少90%同一性。
本发明的探针可以包括任何合适类型的核酸,例如DNA、RNA、PNA或其衍生物。优选地,这些引物包括表2所示的核苷酸序列,或其互补链。而且优选地,这些探针是经过标记的,例如化学的、酶的、免疫化学的、放射性的、荧光的。发光的和FRET标记物。
在一个特定的实施方案中,本发明涉及一种试剂盒,用于SARS-CoV核苷酸序列的杂交分析,该试剂盒包括:a)一个如上面所述的探针;和b)一种方法,用于评价SARS-CoV核苷酸序列和所述探针之间形成的杂交复合体。
寡核苷酸引物和探针可以通过任何合适的方法产生。例如,这些探针可以是化学合成的(一般地参见,Ausubel(编著)Current Protocols in Molecular Biology,2.11.Synthesis and purification of oligonucleotides,John Wiley & Sons,Inc.(2000)),从天然来源分离的,通过重组方法产生的,或其组合。合成的寡核苷酸也可以通过使用Matteucci等人,J.Am.Chem.Soc.,3:3185-3191(1981)的三酯方法制备。可以选择地,自动化合成是优选的,例如,在使用氰乙基亚磷酰胺化学的AppliedBiosynthesis DNA合成仪上。优选地,探针和引物是化学合成的。
用于制备本发明的寡核苷酸探针和引物的合适的碱基可以选自天然发生的核苷酸碱基,如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶。也可以选自非天然发生的或“合成的”核苷酸碱基,如8-氧代-鸟嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟乙基)尿苷、2'-O-甲基胞苷、5-羧基甲氨基-甲基-2-thioridine、5-羧基甲氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖基queosine、2'-O甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、β-D-甘露糖基queosine、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基氨甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、queosine、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、wybutosine和3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。
同样地,也可以使用寡核苷酸的化学类似物(例如其中磷酸二酯键已经被修饰的寡核苷酸,例如修饰为甲基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或氨基磷酸酯(phosphoramidate))。可通过使用“3’端帽”策略实现保护,不受降解,通过该策略抗核酸酶键在寡核苷酸的3’末端上取代磷酸二酯键(Shaw等人,Nucleic Acids Res.,19:747(1991))。氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基磷酸酯键都以这种方式充分地发挥作用。磷酸二酯骨架的更广泛的修饰已经显示出能够赋予稳定性,并且可以允许寡核苷酸的增强的亲和性和增加的细胞渗透(Milligan等人,J.Med.Chem.,36:1923(1993))。已经使用了许多不同的化学策略来取代具有新颖键的完整的磷酸二酯骨架。骨架类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、boranophosphate、磷酸三酯、formacetal、3’-thioformacetal、5'-thioformacetal、5'-硫醚、碳酸酯、5'-N-氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、氨磺酰、砜、亚硫酸酯、亚砜、硫化物、羟胺、亚甲基(甲基亚氨基)(MMI)或亚甲氧基(甲基亚氨基)(MOMI)键。硫代磷酸酯和甲基膦酸酯修饰的寡核苷酸是特别优选的,这是由于它们可通过自动化寡核苷酸合成得到。寡核苷酸可以是“肽核酸”,如由(Milligan等人,J.Med.Chem.,36:1923(1993))描述的。唯一的要求是寡核苷酸探针应该具有这样的一个序列,即该序列的至少一部分能与靶SARS-CoV序列的一部分序列结合。
杂交探针或扩增引物可以是任何合适的长度。对探针或引物的长度没有下限或上限,只要探针与SARS-CoV靶核酸杂交,并且能作为探针或引物有效地发挥作用(例如有助于删除或扩增)。本发明的探针和引物可以短至50、40、30、20、15或10个核苷酸或更短。同样地,探针或引物可以长至20、40、50、60、75、100或200个核苷酸或更长,例如,长至SARS-CoV靶序列的全长。一般地,探针将具有互补的靶核酸链中任一个链的至少14个核苷酸,优选地至少18个核苷酸,更优选地至少20到30个核苷酸,并且不包括任何发夹二级结构。在特定的实施方案中,探针的长度为至少30个核苷酸或至少50个核苷酸。如果具有完全的互补性,即如果该链具有一个与探针的序列相同的序列,那么双链体在即使严谨条件下也将是相对稳定的,并且探针可以是短的,即范围在大约10-30个碱基对。如果在探针中预期到一些程度的错配,即如果预期到探针将与可变区域杂交,或与一组序列如特异性种类中的所有种类杂交,那么探针可以更长(即15-40碱基),以平衡错配的影响。
探针不需要跨越整个SARS-CoV靶基因。可以使用有潜力来特异地检测SARS-CoV靶物质或等位基因的靶区域的任何子集合。因此,核酸探针可以与靶区域的少至8个核苷酸杂交。进一步,可以使用探针的片段,只要这些片段是充分表征被分类的SARS-CoV靶基因的。
探针或引物应该能与长度为至少8个核苷酸的SARS-CoV靶核苷酸序列在低严谨性下杂交。优选地,探针或引物与SARS-CoV靶核苷酸序列在中严谨性或高严谨性下杂交。
仍然在另一个方面,本发明涉及一种固定在支持物上的寡核苷酸探针的阵列,用于测定SARS-CoV靶基因的类型,该阵列包括一个支持物,适合在核酸杂交中使用,该支持物上可以固定多个寡核苷酸探针,至少一个包括具有如下特征的核苷酸序列的所述探针:a)在高严谨性下与表3所示的靶SARS-CoV核苷酸序列或其互补链杂交;或b)与包括表3所示的核苷酸序列的靶SARS-CoV核苷酸序列或其互补链具有至少90%同一性。
各种各样的探针可以包括DNA、RNA、PNA或其衍生物。至少一个或一些探针可以包括表1所示的核苷酸序列或其互补链。优选地,探针阵列包括表3所示的所有核苷酸序列,或其互补链。至少一个、一些或所有探针可以是经过标记的。例证性的标记物包括化学的、酶的、免疫化学的、放射性的、荧光的、发光的和FRET标记物。任何合适的支持物可以在本发明的芯片中使用,例如硅、塑料、玻璃、陶瓷、橡胶和聚合物表面。
E.检测格式
探针的固定化
本发明的方法、探针和探针阵列可以在溶液中使用。优选地,以芯片格式进行,例如通过使用固定在固体支持物上的探针。
探针可以被固定在任何合适的表面上,优选地是固体支持物上,如硅、塑料、玻璃、陶瓷、橡胶或聚合物表面。探针也可以被固定在三维多孔凝胶底物中,例如Packard HydroGel芯片(Broude等人,Nucleic Acids Res.,29(19):E92(2001))。
对于基于阵列的检测,探针被优选地固定在固体支持物如“生物芯片”上。固体支持物可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或任意这些的组合,以颗粒、链、沉淀物、凝胶、板、管道、球体、容器、毛细管、衬垫、切片、膜、盘子、载玻片等形式存在。
包括探针文库的微阵列生物芯片可以通过多个熟知的方法准备,例如这些方法包括光控法(light-directed methods)方法,如美国专利5,143,854、5,384,261或5,561,071中描述的VLSIPSTM;珠式法(bead based methods),如美国专利5,541,061中所描述的;和针式法(pin based methods),如美国专利5,288,514中详细描述的。美国专利5,556,752也适合用于在微阵列中制备发夹探针文库,该专利详细描述了使用VLSIPSTM来制备作为微阵列的不同双链探针文库。
液流通路方法(Flow channel methods),如美国专利5,677,195和5,384,261中所描述的,可以被用于制备具有多个不同探针的微阵列生物芯片。在这种情况下,当探针通过液流通路传递到支持物时,底物的某几个活化区域从其它区域被机械地分离。液流通路方法的详细描述可以在美国专利5,556,752中找到,包括使用保护性涂覆润湿设备(protective coating wetting facilitators),通过指定的液流途径,来增强液体的指导通路。
斑点方法也可以被用于制备微阵列生物芯片,其上固定了多个探针。在这种情况下,反应物通过在支持物的选择区域中直接沉积相对少量而被传递。在一些步骤中,当然,整个支持物表面可以用特定溶液喷洒,或另外地用特定溶液涂覆。分配器以特定格式在区域之间移动,仅仅沉积与每一次停止所必须的同样多的探针或其它试剂。典型的分配器包括微量移液管、纳米移液管、喷墨式合式盒子和针,以便将含有溶液或其它液体的探针传递到支持物,任选地,包括一个机器人系统来控制这些传递设备关于支持物的位置。以其它格式,分配器包括一系列管子或多孔盘子,管道和一系列传递设备,以便多种反应物可以被同时传递到反应区。斑点方法在本技术领域是熟知的,例如包括那些在美国专利5,288,514、5,312,233和6,024,138中描述的方法。在一些情况下,液流通道和“斑点”在支持物的预先确定的区域上的组合也可以被用于制备具有固定探针的微阵列生物芯片。
用于固定探针的固体支持物优选地是扁平的,但可以具有可选择的表面构型。例如,固体支持物可以含有凸起或凹陷的区域,探针合成在这些区域上发生,或探针在这些区域上结合。在一些实施方案中,可以选择固体支持物来提供适当的光吸附特征。例如,支持物可以是聚合的Langmuir Blodgett膜、玻璃或功能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅、或多种凝胶或聚合物如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯((poly)vinylidendifluoride)、聚苯乙烯、聚碳酸酯中的任一种,或其组合。其它合适的固体支持物材料对于本技术领域的普通技术人员将是显而易见的。
固体支持物的表面可以含有反应基团,这些反应基团包括羧基、氨基、羟基、硫羟基或类似基团,适合与寡核苷酸或核酸相关的反应基团偶联。优选地,表面是透光的,并且将具有表面Si--OH官能度,如在硅表面上发现的那些官能度。
探针可以通过化学或物理方式如通过离子、共价或本技术领域熟知的其它力附着到支持物上。核酸和寡核苷酸的固定化可以通过本技术领域熟知的任何方法实现(例如参加,Dattagupta等人,AnalyticalBiochemistry,177:85-89(1989);Saiki等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6230-6234(1989);和Gravitt等人,J.Clin.Micro.,36:3020-3027(1998))。
探针可以通过间隔分子的方式结合到支持物上,例如Lockhart等人的美国专利5,556,752中所描述的,以便在探针的双链部分之间提供间隔,这可能在杂交实验中有用。间隔分子通常包括长度在6-50之间的原子,包括附着到支持物上的表面附着部分。到支持物上的附着可以通过碳碳键实现,例如使用具有(聚)三氟氯乙烯表面的支持物,或优选地通过硅氧烷键实现(例如使用玻璃或二氧化硅作为固体支持物)。硅氧烷键可以通过支持物与间隔基的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基基团之间的反应形成。氨烷基硅烷和羟烷基硅烷、双(2-羟乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷、2-羟乙基氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷或羟丙基三乙氧基硅烷是有用的表面附着基团。
间隔基也包括附着到探针的表面附着部分上的延伸部分或更长的链部分。例如,氨基、羟基、硫羟基和羧基适合于将间隔基的延伸部分附着到表面附着部分上。间隔基的延伸部分可以是多种分子中的任一种,这些分子对任何随后的聚合物合成的条件是没有活性的。这些更长的链部分典型地是芳基乙炔、含有2-14个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸、肽或者其组合。
在一些实施方案中,间隔基的延伸部分是多核苷酸,或整个间隔基可以是多核苷酸。间隔基的延伸部分也可以由聚乙二醇、多核苷酸、亚烷基、多元醇、聚酯、聚胺、聚磷酸二酯及其组合构成。另外,为了在探针的合成中使用,间隔基可以在间隔基(与固体支持物是对应的)的远端或末端具有一个附着到功能基团(例如羟基、氨基或羧酸)上的保护基团。在去保护和偶合后,远端可以共价结合到低聚物或探针上。
本发明的方法可以被用于分析每次具有一个单个探针的单份样本。优选地,该方法以高生产量格式进行。例如,可以用单个探针同时分析多份样本,或使用多个探针同时分析单份样本。更优选地,可以使用多个探针同时分析多份样本。
杂交条件
杂交可以在本技术领域已知的任何合适的技术条件下进行。对本技术领域的普通技术人员显而易见的是,杂交条件可以被改变,以便增加或降低杂交程度、杂交特异性水平、非特异性结合的背景水平(即通过改变杂交或洗涤盐浓度或温度)。探针和靶核苷酸序列之间的杂交可以在任何合适的严谨性下进行,包括高、中或低严谨性。通常,杂交将在高严谨性的条件下进行。
探针和靶核酸之间的杂交可以是同源的,例如在分子信标(Tyagi S.等人,Nature Biotechnology,14:303-308(1996);和美国专利6,150,097)中和杂交保护实验(Gen-Probe,Inc)(美国专利6,004,745)中使用的典型条件,或者是异源的(在不同类型的硝基纤维素基杂交中使用的典型条件和在磁珠基杂交中使用的那些条件)。
靶多核苷酸序列可以通过在高到低严谨性杂交和洗涤条件下,通过与寡核苷酸探针进行杂交而检测,寡核苷酸探针与靶序列的序列形成稳定的杂交复合体。通过杂交进行检测的一个优点是,依赖于所用的探针,进一步的特异性是可能的。如果能预期到探针与靶序列是完全互补的(即大约99%或更高),那么将使用高严谨性条件。如果预期到一些错配,例如,如果变体体菌株期望有这样的结果,即探针不是完全互补的,那么可以减少杂交严谨性。然而,要对条件进行选择,以便最小化或忽略非特异性杂交。
影响杂交的条件和针对非特异性杂交选择的那些条件在本技术领域是已知的(Molecular Cloning A Laboratory Manual,second edition,J.Sambrook,E.Fritsch,T.Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。通常,较低盐浓度和较高温度增加了杂交的严谨性。例如,一般而言,严谨的杂交条件包括在含有大约0.1XSSC,0.1% SDS的溶液中,在大约65℃温育/洗涤温度下温育。中严谨性条件是在含有大约1-2XSSC,0.1% SDS的溶液中,在大约50℃-65℃温育/洗涤温度下温育。低严谨性条件是2XSSC和大约30℃-50℃。
一个可选的杂交和洗涤方法首先是进行低严谨性杂交(5XSSPE,0.5% SDS),随后在存在3M四甲基-氯化铵(TMAC)的情况下进行高严谨性洗涤。TMAC的作用是补偿A-T和G-C碱基对的相对结合,以便使给定温度下的杂交效率与多核苷酸的长度更加密切地对应。使用TMAC,可以改变洗涤温度以实现期望的严谨性水平(Wood等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:1585-1588(1985))。
杂交溶液可以含有25%甲酰胺,5XSSC、5XD enhardt's溶液,100μg/ml的单链DNA,5%葡聚糖硫酸盐或已知对探针杂交有用的其它试剂。
杂交的检测
在探针和SARS-CoV靶核酸序列之间的杂交的检测可以用本技术领域已知的任何方法进行,例如标记探针,标记第二个探针,标记靶核酸或者其一些组合,都适用于本发明的目的。另外,在没有可检测的标记物的时候,杂交可以通过质谱的方法进行检测(例如美国专利6,300,076)。
可检测的标记物是杂交后可以直接或者间接检测的部分。换句话说,一个可检测的标记物具有一个可测量的物理属性(例如荧光或者吸收)或者参与到酶反应过程中。使用直接标记方法的话,靶核苷酸序列或者探针被标记,杂交体的形成通过检测杂交体中的标记物来进行。使用间接标记方法的话,第二个探针被标记,杂交复合物的形成通过检测在第二个探针和最初的杂交体之间形成的第二个杂交体进行。
标记探针或者核酸的方法在本技术领域是熟知的。合适的标记物包括荧光团、发色团、发光团、放射性同位素、电子密试剂、FRET(荧光共振能量转移)、酶和具有特定结合物的配体。特别有用的标记物是具有酶学活性的基团,例如酶(Wisdom,Clin.Chem.,22:1243(1976));酶的底物(British Pat.No.1,548,741);共酶(美国专利4,230,797和4,238,565)和酶抑制物(美国专利4,134,792);荧光团(Soini and Hemmila,Clin.Chem.,25:353(1979));包括藻胆蛋白的发光团,荧光团,如发光荧光团和生物发光团(Gorus and Schram,Clin.Chem.,25:512(1979)and ibid,1531);可特异性结合的配体,例如蛋白结合配体;抗原和包括放射性同位素(例如3H,35S,32P,125I,和14C)的残基。这样的标记物在基于它们本身的物理特性的基础上被检测(例如荧光、发光和放射性)或者它们的活性或者结合特性(例如抗体、酶、底物、共酶和抑制物)。配体标记物对于固相捕获寡核苷酸探针来说也是有用的(例如捕获探针)。例证性的标记物包括生物素(通过和抗生物素蛋白或者链霉抗生物素蛋白结合而可检测)和酶,例如辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶(通过加入酶底物后产生有色的反应产物而可检测)。
例如,一个放射性同位素标记的探针或者靶核酸可以通过自显影被检测。或者通过荧光基团标记的探针或者靶核酸可以通过荧光计来检测。一个半抗原或者配体(例如生物素)标记的核酸,可以通过增加一个抗体或者一个抗体色素到半抗原上,或者通过加入与标记的配体(例如生物素)结合的蛋白进行检测。
进一步来说,探针或者核酸可以用一个结构进行标记,该结构要求用其它的试剂来检测杂交。如果标记物是一个酶,那么被标记的核酸,例如DNA,被最终放在一个合适的介质上来确定催化的程度。例如,一个辅因子标记的核酸可以通过把这个催化剂和底物加到一起而进行检测,用于该酶的标记物是辅因子。这样,如果该酶是磷酸酶,那么介质可以包含硝基苯基磷酸盐,并且可以通过观察颜色监控所生成的硝基酚的数量。如果酶是β半乳糖苷酶,那么媒介可以包含o-硝基-苯基-D-半乳糖-吡喃糖苷,其也可以释放硝基酚。后者的例子包括,但不限于β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、木瓜蛋白酶和过氧化物酶。对于原位杂交研究,底物的最终产物优选地是水不溶性的。其它标记物,例如染料对于本技术领域具有普通技术的人来说是显而易见的。
标记物可以直接连接到DNA结合配体上,例如吖啶染料、菲啶、吩嗪、呋喃香豆素、吩噻嗪和喹啉,通过直接化学键如涉及共价键的直接化学键,或通过间接键如通过将标记物整合到微胶囊或脂质体中,其反过来与结合配体相连接。标记物被连接到DNA结合配体如嵌入化合物上的方法在本技术领域是熟知的,任何便利的方法可以被使用。代表性的嵌入剂包括单或双叠氮氨烷基甲锭或乙锭化合物、单叠氮乙锭二叠氮乙锭、二聚物叠氮乙锭(Mitchell等人,J.Am.Chem.Soc.,104:4265(1982)),4-叠氮-7-氯喹啉、2-叠氮芴、4'-氨甲基4,5'-二甲基当归根素、4'-氨甲基-trioxsalen(4'氨甲基-4,5',8-三甲基-补骨脂素)、3-羧基-5-或-8-氨基-或-羟基-补骨脂素。特异的核酸结合叠氮化合物已经由Forster等人在Nucleic Acid Res.,13:745(1985)中描述。其它有用的光活性嵌入剂是与嘧啶残基形成(2+2)环加合物的呋喃香豆素。烷化剂也可以被用作DNA结合配体,包括例如双-氯乙基胺和环氧化物或氮丙啶,例如黄曲霉毒素、多环烃环氧化物、丝裂霉素和norphillinA。特别有用的光活性形式的嵌入剂是叠氮嵌入剂。它们的反应性氮宾在长波长紫外光或可见光下易于产生,芳基叠氮化物的氮宾优先进行插入反应,而不是形成它们的重排产物(White等人,Meth.Enzymol.,46:644(1977))。
探针也可以被修饰以便以特异性格式使用,例如对于反向斑点添加10-100 T残基,或与牛血清白蛋白结合或固定化到磁性珠子上。
当通过间接检测方法检测杂交时,在探针和靶标之间的初始杂交之后,或在探针和靶标的杂交过程中,可加入可检测标记过的第二个探针。任选地,杂交条件可以在加入第二个探针后被修饰。杂交后,未杂交的第二个探针可以从初始探针分离出来,例如,如果初始探针被固定在固体支持物上可通过洗涤来分离。在固体支持物的情况下,检测结合到支持物上位置上的标记物表明了样本中靶核苷酸序列与探针的杂交。
可检测标记过的第二个探针可以是特异性探针。可以选择地,可检测标记的探针可以是简并探针,例如序列的混合物,如基本上如美国专利5,348,855中描述的全基因组DNA。在后一种情况下,如果第二个探针含有双链DNA,标记可通过嵌入剂实现。优选的DNA结合配体是嵌入化合物,如上面所描述的那些化合物。
第二个探针可以是随机核苷酸探针序列的文库。第二个探针的长度应该根据固体支持物上的第一个探针或靶核苷酸序列的长度和组成来决定,其将通过第二个探针检测。这样的探针文库优选地由用光活化剂标记的3’或5’末端,以及负载有检测试剂如荧光团、酶、染料、发光团或其它可检测得知的部分的其它末端提供。
在制备标记核酸中使用的特定序列是可以被改变的。因此,例如氨基取代的补骨脂素(psoralen)可以首先与核酸发生光化学偶合,通过具有氨基侧基的产物,它可以被偶合到标记物上,即标记是通过DNA结合配体与实验样本中的核酸发生光化学反应来进行的。另外,补骨脂素可以被首先偶合到标记物如酶上,然后偶合到核酸上。
有利地,DNA结合配体首先与标记物发生化学结合,然后与核酸探针结合。例如,由于生物素携带有羧基,所以它可以与呋喃香豆素通过酰胺或酯形成的方式结合,而不影响呋喃香豆素的光化学反应,或生物素的生物活性。氨甲基当归根素、补骨脂素和phenanthridium衍生物可以类似地与标记物连接,正如卤化phenanthridium及其衍生物如氨丙基氯化甲锭(Hertzberg et al,J.Amer.Chem.Soc.,104:313(1982))那样。另外,双功能试剂如二硫代双琥珀酰亚胺基丙酸酯或1,4-丁二醇二环氧甘油醚可以被直接用于将DNA结合配体偶合到标记物上,其中反应物具有烷基氨基残基,关于溶剂、比例和反应条件也是以已知方式进行。某些双功能试剂,可能是戊二醛,则可能是不适合的,这是由于当这些试剂偶合时,它们可以修饰核酸并且因此影响实验。可以采取常规的预防措施以预防这样的难题。
同样有利地,DNA结合配体可以通过间隔基连接到标记物上,该间隔基包括一个高达大约40个原子的链,优选地大约2-20个原子,包括但不限于碳、氧、氮和硫。这样的间隔基可以是包括但不限于如下化合物的成员的多功能基团:肽、烃、多元醇、聚醚、聚胺、聚亚胺和碳水化合物,例如-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-或其它寡肽、碳酰二肽和ω-氨基-烷基-羰基基团或类似物。糖、聚环氧乙烷基团、甘油基、季戊四醇和类似基团也可以用作间隔基。间隔基可以被直接连接到核酸结合配体和/或标记物上,或者该键可以包括一个二价连接基团,如二硫代双琥珀酰亚胺基丙酸酯、1,4-丁二醇二环氧甘油醚、二异氰酸酯、碳二亚胺、乙二醛、戊二醛或类似物。
用于间接检测杂交的第二个探针也可以通过能量转移来检测,如在Tyagi和Kramer的Nature Biotech.,14:303-309(1996)或Lizardi等人的美国专利5,119,801和5,312,728中描述的“信标探针”方法中。本技术领域已知的任何FRET检测系统可以在本发明的方法中使用。例如,可以使用Alpha ScreenTM系统。AlphaScreen技术是一种“扩增发光邻近同形测试(Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay)”方法。一旦用激光在680nm处发光,供体珠子中的光敏剂会将周围的氧气转化为单线态氧。被激发的单线态氧分子在快速衰减之前扩散大约250nm(一个珠子直径)。如果受体珠子与供体珠子密切临近,那么由于生物交互作用,单线态氧分子与化学发光基团在受体珠子上反应,该受体珠子立即将能量转移到同一珠子中的荧光受体。这些荧光受体将发射波长变换为520-620nm。整个反应具有0.3秒的半衰期,因此测定可以以时间分辩模式发生。其它例证性FRET供体/受体对包括荧光素(供体)和四甲基若丹明(受体),有效距离为IAEDANS(供体)和荧光素(受体),有效距离为和荧光素(供体)和QSY-7染料(受体),有效距离为(分子探针)。
核酸检测的定量测定也可以根据本发明进行。与微阵列斑点结合的第二个探针的数量可以被测定,并且可能与样品中的核酸靶标的数量有关。稀释的样本可以与含有已知数量的靶核苷酸一起使用。进行这些步骤的精确条件对本技术领域的普通技术人员是显而易见的。在微阵列分析中,可检测标记物是可视觉观察的(visualized),或通过将探针阵列置于与x射线膜或磷酸图像仪邻近的位置来评价,以识别结合探针的位点。荧光可以通过电荷偶合设备(CCD)或激光扫描的方式检测。
测试样本
任何合适的样本,包括人、动物、或环境(例如土壤或水)来源的样本,可以使用本发明的方法进行分析。测试样本可以包括体液,如尿液、血液、精液、脑脊髓液、脓液、羊水、眼泪或半固体或液体排出物,如痰液、唾液、肺吸气、阴道或尿道分泌物、大便或固体组织样本,如活组织检查或绒毛膜样本。测试样本也包括从皮肤、生殖器或咽喉拭子收集的样本。
测试样本可以通过本技术领域熟知的多种方法进行处理以分离核酸(一般地参见,Ausubel(编著)Current Protocols in Molecular Biology,2.Preparation andAnalysis of DNA和4.Preparation and Analysis of RNA,John Wiley & Sons,Inc.(2000))。对本技术领域的普通技术人员显而易见的是,靶核酸可以是RNA或DNA,它们可以是直接样本或纯化核酸或扩增子的形式。
纯化的核酸可以从前述样本提取,并且可以通过光谱光电测定法或通过其它用于纯化的设备来测定。对于核酸扩增领域的普通技术人员而言,扩增子可以通过多种扩增方法以最终产物获得,如PCR(聚合酶链式反应,美国专利4,683,195,4,683,202,4,800,159和4,965,188),NASBA(基于核酸序列的扩增,Nucleic AcidSequence Based Amplification,美国专利5,130,238),TMA(转录介导扩增,Transcription Mediated Amplification)(Kwoh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:1173-1177(1989)),SDA(链置换扩增,由Walker等人描述,美国专利5,270,184),tSDA(嗜热链置换扩增(美国专利5,648,211和欧洲专利EP 0 684315),SSSR(自动维持序列复制)(美国专利6,156,508)。
在一个特定的实施方案中,测定了人来源的样本。仍然在另一个特定的实施方案中,测定了痰液、尿液、血液、组织部分、食物、土壤或水样本。
试剂盒
本发明的探针可以以试剂盒的方式包装,优选地带有一个使用探针来检测靶基因的说明书。试剂盒的组成被包装在一个普通容器中,典型地包括进行此处公开方法的选择性特定实施方案的书面说明书。检测方法的组成,正如此处所描述的,可以任选地包括在试剂盒中,例如,第二个探针,和/或用于完成标记检测的试剂和方法(例如放射性标记物、酶底物、抗体等等,以及类似物)。
F.实施例
实施例1:探针设计
SARS-CoV的各种基因组序列都可获得(参见表6)。
表6:目前可得的各种SARS冠状病毒的基因组序列(截至5/2/2003)
编号 | SARS冠状病毒的来源 | 提交的国家(地区) | GenBankAcc | 序列中N的个数 | 基因组长度 | N的比例 |
SARS_BJ01 | 中国北京 | 中国 | AY278488 | 900 | 28920 | 3.11% |
SARS_BJ02 | 中国北京 | 中国 | AY278487 | 300 | 29430 | 1.02% |
SARS_BJO3 | 中国北京 | 中国 | AY278490 | 607 | 29291 | 2.07% |
SARS_GZ01 | 中国广州 | 中国 | AY278489 | 1007 | 29429 | 3.42% |
SARS_BJO4 | 中国北京 | 中国 | AY279354 | 2502 | 24774 | 10.10% |
SARSCUHK-W1 | 中国香港 | 中国香港 | AY278554 | 0 | 29736 | 0.00% |
SARS_HKU-39849 | 中国香港 | 中国香港 | AY278491 | 0 | 29742 | 0.00% |
SARS_Urbani | 越南 | 美国 | AY278741 | 0 | 29727 | 0.00% |
SARS_TOR2 | 加拿大的多伦多 | 加拿大 | AY274119 | 0 | 29736 | 0.00% |
表6中显示的9个基因组的大小是非常相近的,中国提交的5个基因组包含了各种不同水平的未确定的核苷酸(N)。
表7显示了这9个SARS冠状病毒基因组的相似性或者同源性。
表7.9个SARS冠状病毒基因组的相似性比较
上表比较了SARS冠状病毒的9个基因组之间的相似性。在表7中显示的数字表示了两个基因组之间的相似性百分比。表7中显示的数字代表了两个基因组之间的相似性百分比。表7中的每个数字等于两个基因组中相同的碱基数量除以碱基总数(大约30000个碱基),然后乘以100。
表7显示除了BJ04外,SARS冠状病毒的不同基因组彼此之间是高度相似的。低于99%的相似性是由于核酸序列中存在的N而导致的。如果BJ01-BJ04和GZ01中的N考虑为和其它基因组一样的话(基于对基因组的其它部分进行的比较,可认为这个假设是合理的),这9个基因组彼此之间有99%是相似的。
因为SARS冠状病毒如表6和表7所示是保守的,因此基于核酸的检测方法就是合理的。图1B显示同时检测SARS冠状病毒基因组的不同部分可以同时提高检测方法的灵敏度和特异性。
我们有两个总体设计,一个设计是进行对SARS冠状病毒基因组的不同部分进行一个多重PCR,并且使用PCR产物作为探针进行检测。第二个设计是对于SARS冠状病毒基因组的不同部分进行一个多重PCR,并且使用一个70mer的寡核苷酸作为探针进行检测。
靶基因选择
基于对于SARS冠状病毒基因组的分析,我们选择了3个基因作为靶基因。这3个基因是1A和1B聚合酶蛋白,刺突蛋白和核衣壳蛋白。我们选择了人管家基因GAPD(甘油醛3-磷酸脱氢酶)(GenBank Acc:NM_002046)作为RNA提取的阳性对照,我们选择拟南芥基因(GenBank Acc:AJ441252)作为掺入的阳性对照,该基因与人类或者常见病原体的核苷酸序列没有同源性。
引物和探针的设计
首先分析了SARS冠状病毒的3个蛋白,并且比较了它们的保守序列。根据多重PCR的要求,基于不同基因组之间的保守序列,设计了多对PCR引物,它们具有类似的Tm值,在距离上相距1.5Kb,并且扩增产物在200bp到900bp之间。另外,基于每对引物的扩增产物,设计了多个不重叠的寡核苷酸(70mer)。使用BLASTN将这些引物和探针与最新的NCBI核酸非冗余核苷酸库进行了比较,确保了引物和探针的特异性。
实施例2:血样本的前处理
血样本的前处理涉及到了相对复杂的过程。然而,考虑到血清中报道的相对低的SARS病毒浓度。这里描述的前处理可以有效地从大约2ml全血中富集淋巴细胞来提高检测的机会。
1.样本收集和传输
1)从医院中的病人处将样本收集起来后放入第一个传输窗,然后关上并且锁好该传输窗的门。
2)然后将样本转移到第二个传输窗。在笔记本上记录样本,并且打印3个条形码标签。然后对样本进行常规检测,并且转移到前处理传输窗。
2.使用生物安全柜
1)执行前处理过程的医院工作人员进入到前处理工作室,然后关上门。打开生物安全柜。生物安全柜的风扇和灯自动打开。
2)检测电源开关、空气速度开关和工作灯开关的指示灯是否处于正常工作状态。检查空气选择开关的指示灯是否处于关闭状态。异常或者不正常的操作需要报告。
3)警报开关的指示灯将发出一声警报,这意味着生物安全柜通过了自检而进入了正常状态。15分钟后,警报开关指示灯发出的警报声停止,接着就可以开始在生物安全柜中进行的过程。
4)如果警报声持续响起,生物安全柜中的处理不能开始;如果在运行中生物安全柜的警报声再次响起,必须停止生物安全柜中的处理。这个事故必须马上进行报告。
5)生物安全柜正常操作后,从第二传输窗拿过样本,放入到安全柜中。传输窗的顶部使用75%酒精擦拭并且使用0.5%过乙酸喷雾来清洗。然后关上并锁好传输窗的门。
6)然后在生物安全柜中进行样本预处理的全过程。
3.血清分离
1)在3500rpm将加入了抗凝剂的全血(1.8ml)离心10分钟。使用标记笔标记上层。
2)然后收集上层血清(大约1ml),放入一个1.5ml的无菌Eppendorf离心管中。
3)用条形码标记Eppendorf离心管(标记为“P”),并且标记上一个序列号。
4)然后在笔记本中记录样本。
5)将包含血清样本的离心管放到一个特制的样本盒中,并且在-80℃保存。样本盒的外面标记上SARS、血清和样本号码范围。
4.血细胞的分离
1)将淋巴细胞分离溶液(3.6ml)加入到一个10ml的离心管中。
2)将无菌的生理盐水(体积等于从上述的离心管中取出的血清量)加入到包含血细胞的离心管中。然后使用巴斯德吸液管在盐水中重悬血细胞。
3)将重悬的血细胞缓慢地加到淋巴细胞分离溶液的上层,然后在1500rpm下离心20分钟。
4)收集层之间的细胞,放到一个1.5ml的无菌Eppendorf离心管中,然后将该离心管在10000rmp下离心5分钟,把细胞旋转下来。去除上清液。
5)然后使用条形码标记包含了血细胞的管子,并且标记上一个序列号(标记为“C”)。
6)在笔记本中记录样本。
7)将包含了血细胞样本的离心管放在一个特制的样本盒中,并储存在-80℃。样本盒的外面使用SARS、血细胞和样本数量的范围予以标记。
8)打开生物安全柜的玻璃面板。生物安全柜的台面和其它表面使用70%乙醇擦拭和0.5%过乙酸喷雾进行消毒。
9)清洗之后关上玻璃窗。将紫外灯放在安全柜中,并且打开15分钟。
10)在离开样本预处理工作室之前关上生物安全柜的电源开关。
5.需要注意的事情
1)淋巴细胞分离溶液从冰箱中拿出后不应该立即使用。该溶液应该在其温度达到室温的时候再使用,并且该溶液应该混匀。
2)整个分离过程应该在18-28℃下进行,太高或者太低的温度可能会影响到分离过程的质量。
3)枪头、Eppendorf离心管、手套和丢弃的试剂或者液体应该放在一个废物筒中(包含了0.5%过乙酸)。废物筒中的每样东西都应该在实验后用高压处理,然后丢弃。
4)通过将32ml的16%的过乙酸的水溶液稀释至最终体积为1000ml,制备0.5%的过乙酸。
实施例3.使用QIAamp Viral RNA试剂盒提取RNA的过程
在RNA制备过程中使用了下述步骤:
1.用移液管在一个1.5ml的微离心管中加入含有Carrier RNA的560μl准备好的缓冲液AVL。如果样本容积大于140μl,同比例地增加缓冲液AVL/Carrier RNA的量(例如280μl样本将需要1120μl缓冲液AVL/Carrier RNA)。
2.在微量离心管中的缓冲液AVL/Carrier RNA中加入140μl血浆、血清、尿、细胞培养上清或者无细胞的体液。用脉冲涡旋振荡器混合15秒。为确保有效裂解,重要的是将样本彻底地与缓冲液AVL混合来获得均一的溶液。只解冻过一次的冰冻样本也可以使用。
3.在室温(15-25℃)孵育10分钟。病毒颗粒在室温裂解10分钟后可以裂解完全。更长的孵育时间对于纯化的RNA产量或者纯度没有影响。潜在的感染性物质和RNA酶在缓冲液AVL中失活了。
4.短暂地离心1.5ml的微离心管来除去管盖内部的液滴。
5.在样本中加入560μl乙醇(96-100%),并且用脉冲涡旋振荡器混合15秒。混合之后,短暂地将1.5ml微离心管离心来除去管盖内部的液滴。只有乙醇是优选的,这是因为其它醇会导致RNA产量和纯度降低。如果样本容积大于140μl,同比例地增加纯乙醇的量(例如280μl样本将需要1120μl乙醇)。为了确保有效的结合作用,重要的是将样本与乙醇彻底地混合以得到均一的溶液。
6.将从第5步得到的630μl溶液加入到QIAamp自转柱(在一个2ml的收集管中),柱子无需预湿。将盖子盖上,在6000 x g(8000rpm)下离心1分钟。将QIAamp自转柱放在一个干净的2ml收集管中,并且丢弃包含了滤出液的试管。将每个自转柱盖上以避免离心过程中的交叉污染。在6000 x g(8000rpm)下离心来限制微量离心的噪声。全速离心不会影响病毒RNA的产量或者纯度。如果溶液没有完全通过膜的话,再次在一个更高的速度下离心直到全部溶液通过为止。
7.小心地打开QIAamp自转柱,然后重复第6步,如果样品容积大于140μl,重复此步直到所有的裂解液都加到自转柱中。
8.小心地打开QIAamp自转柱,并且加入500μl缓冲液AW1。盖上盖子,然后在6000 x g(8000rpm)下离心1分钟。将QIAamp自转柱放在一个干净的2ml收集管(已提供)中,然后丢弃包含了滤出液的试管。如果最初的样本容量大于140μl,那么无需增加缓冲液AW1的容量。
9.小心地打开QIAamp自转柱,加入500μl缓冲液AW2。盖上盖子,然后在全速下离心(20000g;14000rpm)3分钟。直接进行步骤10,或者除掉任何可能带入的缓冲液AW2,执行步骤9a,然后执行步骤10。注意:洗出液中残存的缓冲液AW2可能引起下游应用中的问题。一些离心机转子在减速时可能震动,导致液体的流动,使得缓冲液AW2接触到QIAamp自转柱。从离心机上拿下QIAamp自转柱和收集管也可能导致液体流到QIAamp自转柱上。在这些情况下,应该进行可选的步骤9a。
9a.(可选):将QIAamp自转柱放在一个新的2ml收集管中(未提供),并且丢弃旧的含有滤出液的收集管。全速离心1分钟。
10.将QIAamp自转柱放在一个干净的1.5ml微离心管中(未提供)。丢弃包含滤出液的旧收集管。小心打开QIAamp离心柱,然后加入60μl缓冲液AVE,平衡到室温。盖上盖子,在室温下孵育1分钟。在6000 x g(8000rpm)下离心1分钟。使用60μl缓冲液AVE洗提一次就可以从QIAamp自转柱上洗下至少90%的病毒RNA。使用2 x 40μl的缓冲液AVE进行二次洗提可以使产率增加高达10%。使用体积小于30μl的缓冲液洗提将导致产率有所降低,并且不会提高洗提液中RNA的浓度。当存储在-20℃或-70℃时,病毒RNA可以稳定保存长达1年。
下面为与上述步骤有关的进一步的信息:
● 平衡样本至室温(15-25℃)。
● 在第10步平衡缓冲液AVE至室温用于洗提。
● 按照说明书第14-15页检查缓冲液AW1、缓冲液AW2以及载体RNA是否已经准备好了。
● 如果必要的话通过加热在溶缓冲液AVL/载体RNA中重新溶解沉淀物,并且在使用前冷却到室温。
● 所有的离心步骤都在室温下进行。
实施例4.SARS-CoV检测芯片的一个示例性阵列格式
图5说明了SARS-CoV检测芯片的一个示例性阵列格式。
固定化对照是寡核苷酸探针,它是使用荧光染料HEX在末端标记的,当包含或者疑似包含SARS-CoV的样本和芯片接触的时候,该探针不参与任何杂交反应。
阳性对照(拟南芥)是寡核苷酸探针,它是按照拟南芥(一种模式生物)基因进行设计的,当包含或者疑似包含SARS-CoV的样本和芯片接触的时候,该探针不参与任何杂交反应。在杂交反应的过程中,可以和该阳性对照很好地进行杂交的靶探针被加入到杂交溶液中。阳性对照的信号可以用来监控杂交反应。
阴性对照是寡核苷酸探针,当包含或者疑似包含SARS-CoV的样本和芯片接触的时候,该探针不参与任何杂交反应。
空白对照是DMSO溶液的点,它用来监控点样质量。
SARS探针是011、024、040和044探针。
实施例5.从一个SARS病人血细胞进行的SARS-CoV检测(样本编号3)
图6A和6B显示了从一个SARS病人血液样本进行的SARS-CoV检测(样本编号3)。从3#SARS病人血液样本中分离淋巴细胞。使用QIAamp试剂盒从淋巴细胞样本中提取RNA。使用上述得到的RNA作为模板进行RT-嵌套式PCR。044RT-嵌套式PCR的结果和杂交效果都很好。040RT-嵌套式PCR的结果不好,但杂交结果很好。这表明芯片杂交方法是敏感和特异的。
实施例6.从一个SARS病人血液样本中进行的SARS-CoV检测(样本编号4)
图7A和7B显示了从一个SARS病人血液样本中进行的SARS-CoV检测(样本编号4)。从4#SARS病人血液样本中分离淋巴细胞。从淋巴细胞样本中使用QIAamp试剂盒提取RNA。使用上述得到的RNA作为模板进行RT-嵌套式PCR。024、040和044RT-嵌套式PCR的结果和杂交结果都很好。
实施例7.从一个SARS病人的痰液样本中进行的SARS-CoV检测(样本编
号5)
图8显示了从一个SARS病人的痰液样本中进行的SARS-CoV检测(样本编号5)。使用QIAamp试剂盒从5#SARS病人痰液样本中提取RNA。使用上述得到的RNA作为模板进行RT-嵌套式PCR。040RT-嵌套式PCR的结果和杂交结果都很好。
实施例8.从一个SARS病人的痰液样本中讲行的SARS-CoV检测(样本编
号6)
图9说明了从一个SARS病人的痰液样本中进行的SARS-CoV检测(样本编号6)。使用QIAamp试剂从6#SARS病人痰液样本中提取RNA。使用上述得到的RNA作为模板进行RT-嵌套式PCR。所有探针的RT-嵌套式PCR的结果很好,杂交结果也很好。
实施例9.SARS-CoV检测芯片的另外一个例证性的阵列格式
图10说明了SARS-CoV检测芯片的另外一个例子。
固定化对照是寡核苷酸探针,它是使用荧光染料HEX在末端标记的,当包含或者疑似包含SARS-CoV的样本和芯片接触的时候,该探针不参与任何杂交反应。
阳性对照(拟南芥)是寡核苷酸探针,它是按照拟南芥(一种模式生物)基因进行设计的,当包含或者疑似包含SARS-CoV的样本和芯片接触的时候,该探针不参与任何杂交反应。在杂交反应的过程中,可以和该阳性对照很好地进行杂交的靶探针被加入到杂交溶液中。阳性对照的信号可以用来监控杂交反应。
阴性对照是寡核苷酸探针,当包含或者疑似包含SARS-CoV的样本和芯片接触的时候,该探针不参与任何杂交反应。
空白对照是DMSO溶液的点,它用来监控点样质量。
SARS探针是011、024、040和044探针。
实施例10:图10中示意性说明的SARS-CoV检测芯片的所有可能的阳性结
果
图11说明了图10中示意性说明的SARS-CoV检测芯片的所有可能的阳性结果。
在芯片上有4组探针可以检测SARS病毒:探针011,探针024,探针040和探针044。
第一行显示了所有四组探针(011+024+040+044)出现的信号可以给出的的阳性结果(1)。
第二行显示了三组探针(011+024+044,024+040+044,011+040+044,011+024+040)出现的信号可以给出的所有可能的阳性结果(4)。
第三行显示了两组探针(011+040,024+044,011+044,040+044,011+024,024+040)出现的信号可以给出的所有可能的阳性结果(6)。
第四行显示了只是一组探针(011,024,040,044)出现的信号可以给出的所有可能的阳性结果(4)。
上面的例子只是用来作为示意性说明的目的,而不是限制了本发明的范围。上述描述的例子的很多变化是可能的。由于上述例子的很多修饰和改变对于本技术领域的普通技术人员来说是很显见的,所以本发明仅仅由后述的权利要求进行限定。
Claims (13)
1、用于检测引起严重急性呼吸综合症冠状病毒的芯片,它包括一个适于在核酸杂交中使用的支持物;该支持物上固定有至少两个不同的寡核苷酸探针,该至少两个不同的寡核苷酸探针选自如表3所示的探针序列。
2、如权利要求1所述的芯片,其特征在于:所述支持物上进一步固定有:
a)如下3个寡核苷酸探针中的至少之一:一个固定化对照探针,该探针是经过标记的,当包含或者疑似包含SARS-CoV的样本和芯片接触的时候,该探针不参与任何杂交反应;一个阳性对照探针,其和任何SARS-CoV序列都不互补,但是和一个包含在样本中的非SARS-CoV序列互补;一个阴性对照探针,它和包含在样本中的任何核苷酸序列都不互补;
b)一个空白点。
3、如权利要求1所述的芯片,其特征在于:所述芯片由表3所示的寡核苷酸探针组成。
4、如权利要求2所述的芯片,其特征在于:所述固定化对照探针的标记物选自化学的、酶的、免疫化学的、放射性标记的、荧光的、发光的和FRET标记物。
5、如权利要求2所述的芯片,其特征在于:所述非SARS-CoV序列是在实验的时候被掺入到样本中的。
6、如权利要求5所述的芯片,其特征在于:掺入的非SARS-CoV序列来源于拟南芥。
7、如权利要求2所述的芯片,其特征在于:所述芯片固定有两个与SARS-CoV的复制酶1A或者1B基因中的两个不同的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针;一个与SARS-CoV的N基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针;一个与SARS-CoV的S基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针;一个固定化对照探针,该探针是经过标记的,当包含或者疑似包含SARS-CoV的样本使用芯片接触的时候,该探针不参与任何杂交反应;一个阳性对照探针,其与任何SARS-CoV序列都不互补,但是与包含在样本中的非SARS-CoV序列互补;一个阴性对照探针,其与包含在样本中的任何核苷酸序列都不互补。
8、如权利要求7所述的芯片,其特征在于:所述芯片包括下述探针的多个点:两个与SARS-CoV的复制酶1B基因中的两个不同的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,与SARS-CoV的N基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,与SARS-CoV的S基因中的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针,固定化对照探针,阳性对照探针和阴性对照探针。
9、如权利要求1所述的芯片,其特征在于:所述芯片进一步包括一个与SARS-CoV无关的冠状病毒的核苷酸序列互补的寡核苷酸探针。
10、如权利要求9所述的芯片,其特征在于:所述和SARS病毒无关的冠状病毒是I、II或者III组冠状病毒,或者是感染禽类、马、犬、猫、猪、小牛、牛、小鼠、鸟嘴海雀、大鼠、火鸡或者人类的冠状病毒。
11、如权利要求1所述的芯片,其特征在于:所述至少一个寡核苷酸探针的5’端包含了一个多聚-dT区域,用来增强其在支持物上的固定化。
12、如权利要求1—11任意一项所述的芯片,其特征在于:所述支持物的表面选自硅、塑料、玻璃、陶瓷、橡胶或聚合物。
13、一个试剂盒,用于SARS-CoV核苷酸序列的杂交分析,所述试剂盒包括:
a)一个权利要求1—10中任意一项所述的芯片;和
b)一个用于评估一个SARS-CoV核苷酸序列和所述芯片上的探针之间形成的杂交复合体的方法的说明书。
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