DE3587845T2 - Verfahren zur Bestimmung eines Liganden. - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden und insbesondere ein Verfahren, bei welchem eine für den Liganden spezifische Bindungssubstanz, welche mit einem Avidin-Reagens markiert und mit demselben kovalent verknüpft ist, und ein biotinmarkiertes Enzym-Reagens verwendet werden.
- Die US-PS 4 228 237 ist auf ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden gerichtet, bei welchem ein enzymmarkiertes Avidin-Reagens und eine biotinmarkierte, spezifische Bindungssubstanz für den Liganden verwendet werden, wobei dieser letztgenannte dazu verwendet wird, eine Biotinbrücke zu schaffen, um die spezifische Bindungssubstanz an das enzymmarkierte Avidin zu kuppeln.
- In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Komplexe und Konjugate von höherer spezifischer Enzymaktivität zu verwenden, und demzufolge ist ein Verfahren zur Erzielung dieses Ergebnisses erwünscht und wird benötigt.
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden und insbesondere ein Verfahren, bei welchem eine für den Liganden spezifische Bindungssubstanz, welche mit einem Avidin-Reagens markiert und mit demselben kovalent verknüpft ist, und ein biotinmarkiertes Enzym-Reagens verwendet werden.
- Das Verfahren umfaßt das Bereitstellen einer unlöslichen Phase, welche eine für den Liganden spezifische Bindungssubstanz enthält. Die unlösliche Phase wird mit den folgenden Reagentien inkubiert:
- (i) einem Medium, welches den Liganden vermutlich enthält;
- (ii) einem löslichen Reagens, welches aus einer Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: (a') einer für den Liganden spezifischen Bindungssubstanz, welche mit Adivin kovalent verknüpft ist; (b') dem Reagens (a'), welches mit biotinmarkiertem Enzym komplex gebunden ist; oder (c') dem an Avidin gebundenen Liganden; oder (d') einem Reagens (c'), welches mit biotinmarkiertem Enzym komplex gebunden ist; und
- (iii) einem löslichen, biotinmarkiertem Enzym, wenn das Reagens (a') oder (c') ist. Die nicht-umge-setzten Reagentien werden von der unlöslichen Phase nach dem Inkubieren abgetrennt; und die Enzymaktivität von entweder den abgetrennten, nicht-umgesetzten Reagentien oder von der abgetrennten, unlöslichen Phase, wird dann gemessen, um dem Liganden zu bestimmen.
- Obgleich das Biotin-Avidin-System der vorliegenden Erfindung in irgendeinem herkömmlichen Verfahren mit heterogenem Binden angewendet werden kann, so werden doch Verfahren mit nicht kompetitivem und kompetitivem Binden bevorzugt.
- Generell können die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion (die unlösliche Phase, welche eine spezifische Bindungssubstanz für den Liganden enthält, und die entsprechenden Reagentien) zusammen auf eine Art und Weise oder in einer Reihenfolge zugegeben werden, welche dafür sorgt, daß die so entstandene Enzymaktivität in einem späteren System mit einer Nachweisreaktion leicht meßbar ist.
- Liganden, welche gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden können, sind spezifische, organische Materialien, für welche eine spezifische Bindungssubstanz zur Verfügung gestellt werden kann. Eine spezifische Bindungssubstanz ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, welche - unter Ausschluß anderer Substanzen - eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden aufweist. Wird ein nicht-kompetitives Verfahren angewendet, dann können die in der unlöslichen Phase enthaltene, spezifische Bindungssubstanz und die an ein Avidin-Reagens gebundene, spezifische Bindungssubstanz, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden sollen, identisch sein, oder sie können sich voneinander unterscheiden.
- Generische Klassen von Materialien, welche von dem Ausdruck "Ligand" umfaßt werden, schließen z. B. Antigene, Antikörper und Haptene sowie jene Substanzen ein, welche natürlich vorkommende Rezeptoren aufweisen, oder für welche Rezeptoren angefertigt werden können, z. B. DNA-Sonden.
- Ist der Ligand ein Antigen, dann ist die für den Nachweis des Antigens benützte, spezifische Bindungssubstanz normalerweise der entsprechende Antikörper, welcher erzeugt wird, wenn das Antigen in den Blutstrom eines Wirbeltieres eingeführt wird. Beispiele von Antigenen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden können, umfassen z. B. Polypeptid- und Protein-Hormone, Human-IgE und-alpha&sub1;-Fetoprotein, ein fetales Antigen, das auch im Serum von Patienten mit Hepatom und embryonalem Adrenokarzinom vorkommt. Umgekehrt kann dann, wenn der Ligand ein Antikörper ist, das denselben hervorruf ende Antigen als spezifische Bindungssubstanz verwendet werden. Ein Test auf Antikörper-Titer ist besonders nützlich bei der Diagnose auf z. B. Infektionskrankheiten wie z. B. Syphilis, Röteln und von durch haemolytische Streptokokken verursachte Infektionen.
- Ist der Ligand ein Hapten (nämlich eine proteinfreie Substanz, welche von sich aus keine Antikörperbildung hervorruft), dann ist die für den Nachweis des Haptens benützte, spezifische Bindungssubstanz ein Antikörper, welcher erzeugt wird, wenn das an einen antigenen Träger gebundene Hapten in den Blutstrom eines Wirbeltieres eingebracht wird. Beispiele von Haptenen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden können, umfassen Steroide, wie z. B. Östron, Östradiol, Testosteron, Pregnandiol und Progesteron; Vitamine, wie z. B. B&sub1;&sub2; und Folsäure; Triodthyronin, Thyroxin, Histamin, Serotonin, Digoxin, Prostaglandine, Adrenalin, Noradrenalin, Morphin, Pflanzenhormone und Antibiotika, wie z. B. Pencillin.
- Ist der Ligand eine Substanz, welche einen natürlich vorkommenden Rezeptor aufweist, oder ein angefertiger Rezeptor, dann kann der Rezeptor als spezifische Bindungssubstanz für den Nachweis des Liganden verwendet werden, vorausgesetzt, daß der Rezeptor in einer für den Liganden spezifischen Form isoliert werden kann. Veranschaulichende Liganden, welche natürlich vorkommende Rezeptoren aufweisen, umfassen Thyroxin, viele Steroide, Polypeptide und Neuropolypeptide, wie z. B. Insulin, Gastrin, Angiotensin, Endorphine, verschiedene Opiate und viele andere. Die Rezeptoren für diese Klasse von Liganden sind gewöhnlich Proteine.
- Es wird eine Probe eines flüssigen Mediums ausgewählt, welches den zu bestimmenden Liganden vermutlich enthält. Das flüssige Medium, welches den zu bestimmenden Liganden vermutlich enthält, kann eine natürliche oder synthetische Flüssigkeit sein. In vielen Fällen wird die Flüssigkeit eine biologische Flüssigkeit sein. Biologische Flüssigkeiten, welche gemäß der vorliegenden Erfindung auf Liganden untersucht werden können, umfassen z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Fruchtwasser und Zerebrospinalflüssigkeit.
- Es wird eine geeignete unlösliche Phase hergestellt, welche eine spezifische Bindungssubstanz enthält, deren Einwirkung der Ligand in der Probe ausgesetzt werden soll, und an welche derselbe gebunden werden soll. Eine geeignete unlösliche Phase umfaßt irgendeinen herkömmlichen, unlöslichen Halter oder Träger, der für biochemische Analysen eingesetzt wird. Einige typische, feste Träger- oder Haltersubstanzen, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können unlösliche organische oder teilweise anorganische Polymere, wie z. B. Zellulose, Nitrozellulose, Agarose, Polypropylen, Polystyrol, vernetztes Dextran, Nylon und Glasderivate umfassen. Übliche Konfigurationen für solche Träger umfassen Perlen, Kügelchen, Papierscheiben, Röhrchen, Mikrotiterplatten, Filme, Mischstäbchen und Objektträger.
- Die Herstellung der unlöslichen Phase, welche die für den zu bestimmenden Liganden spezifische Bindungssubstanz enthält, kann nach bekannten Verfahren bewirkt werden. Beispielsweise kann die spezifische Bindungssubstanz an einen festen Träger durch Vernetzen, durch kovalentes Binden oder durch physikalische Adsorption gebunden werden. Beispielsweise kann die Herstellung der unlöslichen Phase dann, wenn der nachzuweisende Ligand ein Antigen ist, einfach durch Überziehen der Röhrchen oder Platten mit dem entsprechenden Antikörper bewirkt werden. Werden Nylonperlen verwendet, dann kann der entsprechende Antikörper nach dem in FEBS Letters, 48, 226, (1974) beschriebenen Verfahren von Faulstich et al. an die Perlen kovalent gekuppelt werden.
- Für die Umsetzung mit dem an die unlösliche Phase gebundenen Liganden bestimmt sind eine spezifische Bindungssubstanz für den Liganden, welche mit einem Avidin-Reagens kovalent verknüpft ist, und ein Enzym-Reagens, welches seinerseits mit Biotin markiert ist. Das Avidin-Reagens, welches kovalent an die spezifische Bindungssubstanz gebunden ist, umfaßt aus Hühnereiklar gewonnenes Avidin oder aus Streptomyces avidinii gewonnenes Streptavidin.
- Das Avidin-Reagens kann an die spezifische Bindungssubstanz oder an den Liganden durch Zugabe von externen, zweiwertigen und polywertigen Kupplungsreagentien oder in einigen Fällen durch direkte Kondensation von vorhandenen, funktionellen Gruppen unter auf dem Fachgebiet wohlbekannten Standardbedingungen kovalent gebunden werden. Solche Kupplungsreagentien umfassen Glutaraldehyd, Carbodiimide, Diisocyanate und heterofunktionelle Vernetzungsmittel, wie z. B. N-gamma-Maleinimidobutyryloxysuccinimid (GMBS), zur Bildung von nicht-aufspaltbaren Bindungen, oder Thio-Verknüpfungsmittel, wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionat (SPDP), welche zur Bildung von Bindungen des aufspaltbaren Typus verwendet werden können.
- Andere Kupplungsreagentien entsprechen der Formel R¹-S-S- A-Z, worin R¹ für 2-Pyridyl, 5-Nitro-2-pyridyl oder 4-Pyridyl steht, A für einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht, und Z für eine Gruppe
- oder für Säureadditionssalze der letztgenannten Gruppe steht, worin n für 2 oder 3 steht, R¹ die gleiche Bedeutung wie das obige R¹ hat und demselben gleich ist, und R² für Methyl oder Ethyl steht. Der Kohlenwasserstoffrest A ist vorzugsweise ein aliphatischer Rest, doch kann er auch ein aromatischer Rest sein. Solche Kupplungsreagentien und deren Herstellung sind in der US-PS 4 149 003 beschrieben.
- Die kovalente Bindung zwischen der spezifischen Bindungssubstanz und dem Avidin-Reagens mit einer aufspaltbaren Brücke kann auf die Art und Weise zustandegebracht werden, welche in der US-PS 4 231 999 beschrieben ist.
- Obgleich für die Herstellung des biotinmarkierten Enzym- Reagens eine umfassende Vielfalt von Enzymen verwendet werden kann, so werden doch gewisse Enzyme bevorzugt. So sollte beispielsweise das Enzym bei der qualitativen Bestimmung eines Liganden vorzugsweise durch eine Farbreaktion nachgewiesen werden.
- Enzyme, welche für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen jene, welche gemäß der International Union of Biochemists (I.U.B.) als Oxidoreduktasen, Hydrolasen und Lyasen klassifiziert werden. Von den Oxidoreduktasen werden jene bevorzugt, welche auf die CHOH-Gruppe, die Aldehyd- oder Ketogruppe oder die CHNH&sub2;-Gruppe von Spendern (1.1, 1.2 bzw. 1.4) einwirken, und werden jene bevorzugt, welche auf Wasserstoffperoxid als Akzeptor (1.11) einwirken. Besonders bevorzugte Oxidoreduktasen umfassen z. B. Glucoseoxidase und Meerrettich-Peroxidase. Von den Hydrolasen sind jene von besonderem Interesse, welche auf Esterbindungen (sowohl organischer als auch anorganischer Ester) einwirken, sowie jene, welche auf Glykosylverbindungen einwirken, insbesondere Glykosid- Hydrolasen, nämlich 3.1 bzw. 3.2. Besonders bevorzugte Hydrolysen umfassen z. B. alkalische Phosphatase und β-Galactosidase.
- Die Herstellung des löslichen, biotinmarkierten Enzym-Reagens kann typischerweise durch Verwendung des Biotin-n-hydroxysuccinimidesters (BHNS) welcher mit freien Aminogruppen unter Bildung einer Amidbindung reagiert, oder mit Biotinhydrazid vorgenommen werden, welches mit Aldehydgruppen von periodatoxidierten Glykoproteinen unter Bildung von Hydrazonen reagiert.
- Ein besonders bevorzugtes, nicht-kompetitives Bindungsverfahren ist die "Sandwich"-Technik, wobei die Komponenten der Bindungsreaktion eine unlösliche Phase, welche eine spezifische Bindungssubstanz für den Liganden enthält, und die folgenden Reagentien umfassen:
- (i) eine gemessene Menge eines flüssigen Mediums, in welchem der Ligand vermutlich enthalten ist;
- (ii) eine mit Avidin markierte, spezifische Bindungssubstanz für den Liganden; und
- (iii) ein lösliches, biotinmarkiertes Enzym.
- Gemäß einem alternativen Modus kann ein zuvor gebildeter Komplex aus der mit Avidin markierten, spezifischen Bindungssubstanz und dem biotinmarkierten Enzym anstelle der Reagentien (ii) und (iii) verwendet werden. Ein solches Reagens kann einfach durch Zusammenmischen der Reagentien (ii) und (iii) in den richtigen Mengen vor dem Inkubieren mit dem an die unlösliche Phase gebundenen Liganden hergestellt werden.
- Bei dem nicht-kompetitiven Bindungsverfahren kann die unlösliche Phase unter gewissen Bedingungen mit den Reagentien in deren gegenseitiger Anwesenheit inkubiert werden, oder es kann die unlösliche Phase, alternativ, mit den Reagentien einzeln, in einer genauen Aufeinanderfolge derselben, inkubiert werden. Das letztgenannte Verfahren wird im allgemeinen bevorzugt.
- Wird die unlösliche Phase mit den einzelnen Reagentien in einer genauen Aufeinanderfolge inkubiert, dann kann das Bindungsverfahren in mehreren, nämlich zwei oder drei, Inkubationsperioden durchgeführt werden.
- Bei einem dreistufigen Inkubationsverfahren wird die unlösliche Phase zuerst mit dem Liganden-Reagens, nämlich einer gemessenen Menge des flüssigen Mediums, in welchem der Ligand vermutlich enthalten ist, umgesetzt. Das nicht-umgesetzte Reagens wird dann entfernt, und die Avidin-markierte, spezifische Bindungssubstanz für den Liganden wird zugegeben. Im Anschluß an die Umsetzung mit der Avidin-markierten, spezifischen Bindungssubstanz wird das nicht umgesetzte, Avidin-markierte Reagens entfernt, und das biotinmarkierte Enzym wird zugesetzt. Im Anschluß an die Umsetzung mit dem biotinmarkierten Enzym wird das nicht-umgesetzte Reagens von der unlöslichen Phase abgetrennt, und die Enzymaktivität von entweder der unlöslichen Phase oder dem abgetrennten, nicht-umgesetzten, biotinmarkierten Enzym wird durch eine geeignete Nachweisreaktion bestimmt. Die Enzymaktivität der unlöslichen Phase steht in direkter Beziehung zu der Menge des Liganden in dem flüssigen Medium, wohingegen die Enzymaktivität des abgetrennten, nicht-umgesetzten, biotinmarkierten Enzyms zu der Menge des Liganden in umgekehrter Beziehung steht.
- Wird die Avidin-markierte spezifische Bindungssubstanz zuvor mit dem biotinmarkierten Enzym umgesetzt, dann kann das Bindungsverfahren in zwei Stufen durchgeführt werden, wobei die einzelnen Reagentien, nämlich das Avidin-markierte bzw. das biotinmarkierte Enzym-Reagens durch an das biotinmarkierte Enzym gebundenes, Avidin-markiertes Reagens ersetzt werden.
- Zur Erzielung quantitativer Ergebnisse in dem obigen, nicht-kompetitiven Bindungsverfahren ist die Menge der mit den Reagentien vermischten, unlöslichen Phase generell größer als jene Menge, welche befähigt ist, mit der Gesamtmenge des Liganden, welche vermutlich in dem flüssigen Medium enthalten ist, Bindungen zu bilden. Die Menge wird, in der Praxis, gemäß den oben angeführten Kriterien aufgrund der Annahme ausgewählt, daß der Ligand in der Flüssigkeit in der höchstmöglichen Konzentration vorliegt. Das nicht-kompetitive Verfahren unterscheidet sich von einem herkömmlichen Radioimmunoassay (RIA) dadurch, daß im erstgenannten Fall auf den zu bestimmenden Liganden direkt durch Umsetzen desselben mit überschüssiger, markierter Bindungssubstanz geprüft wird, während sich der zu bestimmende Ligand im zweitgenannten Fall mit dem markierten Liganden in Konkurrenz um eine begrenzte Menge an Bindungssubstanz befindet. Das nicht-kompetitive Binden ist besonders gut geeignet für den Nachweis von Liganden mit einem hohen Molekulargewicht und mit mehreren Bindungsstellen.
- Wird ein kompetitives Bindungsverfahren angewendet, dann umfassen die Komponenten der Bindungsreaktion eine eine spezifische Bindungssubstanz für den Liganden enthaltende, unlösliche Phase und die folgenden Reagentien.
- (i) (A) Eine gemessene Menge an flüssigem Medium, in welchem der Ligand vermutlich enthalten ist, und (B) eine bekannte Menge des Avidin-markierten Liganden; und
- (ii) lösliches, biotinmarkiertes Enzym.
- Gemäß einem alternativen Modus kann (B) der Avidin-markierte Ligand sein, der an das biotinmarkierte Enzym gebunden ist, wodurch das Erfordernis nach dem Reagens (ii) eliminiert ist. Dieses Komplex-Reagens wird wie weiter oben beschrieben hergestellt.
- In einem kompetitiven Bindungstest unter Verwendung der Reagentien (i) und (ii) kann die unlösliche Phase mit den Reagentien in deren gegenseitiger Anwesenheit inkubiert werden, oder es kann die unlösliche Phase alternativ mit den Reagentien einzeln, in einer besonderen Reihenfolge, inkubiert werden. Gemäß dem letztgenannten Modus wird die unlösliche Phase zuerst mit einem Reagens inkubiert, welches (A) eine gemessene Menge an flüssigem Medium, in welchem der Ligand vermutlich enthalten ist; und (B) eine bekannte Menge des Avidin-markierten Liganden umfaßt. Es entsteht eine Konkurrenzsituation zwischen dem zu bestimmenden Liganden und dem Avidin-markierten Liganden um die Bindungsstellen der unlöslich gemachten, spezifischen Bindungssubstanz. Nach dem Äquilibrieren wird das nicht-umgesetzte Reagens entfernt, und das biotinmarkierte Enzym-Reagens wird zugesetzt. Nach der Umsetzung des biotinmarkierten Enzym-Reagens wird das nicht-umgesetzte Reagens von der unlöslichen Phase abgetrennt, und die Enzymaktivität von entweder der unlöslichen Phase oder dem abgetrennten, nicht-umgesetzten, biotinmarkierten Enzym wird durch eine geeignete Nachweisreaktion bestimmt. Die Enzymaktivität der unlöslichen Phase steht in umgekehrter Beziehung zu der Menge des Liganden in dem flüssigen Medium, wohingegen die Enzymaktivität des abgetrennten, nichtumgesetzten, biotinmarkierten Enzyms zu der Menge des Liganden in direkter Beziehung steht.
- Wird der Avidin-markierte Ligand zuvor mit dem biotinmarkierten Enzym umgesetzt, dann kann das Bindungsverfahren in einer Inkubationsperiode durchgeführt werden, indem man einfach die unlösliche Phase mit einem Reagens inkubiert, welches (A) eine gemessene Menge an flüssigem Medium, in welchem der Ligand vermutlich enthalten ist; und (B) eine bekannte Menge des Avidin-markierten, an das biotinmarkierte Enzym gebundenen Liganden umfaßt.
- Zur Erzielung quantitativer Ergebnisse in dem kompetitiven Bindungsverfahren ist die Menge der in der unlöslichen Phase vorliegenden, spezifischen Bindungssubstanz pro Probe gewöhnlich kleiner als jene Menge, welche befähigt ist, die Gesamtmenge des Liganden, welche vermutlich in der Flüssigkeit vorliegt, zu binden, und kleiner als die Gesamtmenge des Avidinmarkierten Liganden oder des Avidin-markierten, an das biotinmarkierte Enzym gebundenen Liganden. Bei praktischen Anwendungen wird diese Menge entsprechend den oben angeführten Kriterien aufgrund der Annahme ausgewählt, daß die größte Menge des Liganden, welche in dem flüssigen Medium vorhanden sein kann, tatsächlich dort vorliegt. Im allgemeinen überschreitet die Menge des Avidin-markierten Liganden oder des Avidin-markierten, an das biotinmarkierte Enzym gebundenen Liganden, welche Menge mit dem flüssigen Medium in Berührung gebracht wird, nicht die kleinste Menge des in dem flüssigen Medium zu bestimmenden Liganden. Das kompetitive Bindungsverfahren ist besonders für den Nachweis von Liganden geeignet, welche nur wenige Bindungsstellen aufweisen.
- Liganden, welche gemäß der vorliegenden Erfindung mit Hilfe eines nicht-kompetitiven Bindungsverfahrens (nämlich der "Sandwich"-Technik) bestimmt werden, müssen wenigstens zwei Bindungsstellen aufweisen, damit sie sich sowohl mit der in der unlöslichen Phase enthaltenen, spezifischen Bindungssubstanz als auch mit der Avidin-markierten, spezifischen Bindungssubstanz verbinden. Die obgenannten Kriterien sind nicht erforderlich, wenn ein kompetitives Bindungsverfahren angewendet wird.
- Die Bestimmung der Enzymaktivität wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit einem für das besondere, jeweils verwendete Enzym geeigneten Nachweisreaktionssystem bewirkt. Da es Unterschiede nicht nur zwischen den Tests für verschiedene Enzyme, sondern sogar innerhalb der Vielfalt von Tests für ein besonderes Enzym gibt, kann keine allgemeine Beschreibung der Testtechnik gegeben werden; eine umfassende Mannigfaltigkeit von Medien, Bedingungen und Substraten, welche für die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzyme geeignet sind, findet sich jedoch in Bergmeyer, "Methods of Enzymatic Analysis", Academic Press, New York, 1965.
- Da das Verhältnis zwischen dem Avidin und den kovalent daran gebundenen, spezifischen Bindungssubstanzen nicht auf ein Verhältnis von l:l beschränkt sein muß, und da jedes Avidin befähigt ist, vier Moleküle Biotin zu binden, ist es nunmehr möglich, ein größeres Verhältnis zwischen dem Enzym und der spezifischen Bindungssubstanz zu erhalten als dies bisher unter Verwendung der Komplexe zwischen dem biotinmarkierten Enzym und den Avidin-markierten, spezifischen Bindungssubstanzen realisiert worden ist. Demgemäß ist der so entstandene Test auf den Liganden aufgrund der Tatsache empfindlicher und genauer, daß die entstandenen Komplexe oder Konjugate eine höhere spezifische Enzymaktivität aufweisen.
- Die nachstehende spezifische Beschreibung wird gegeben, um den Fachmann in die Lage zu versetzen, die vorliegende Erfindung klarer zu verstehen und in der Praxis auszuführen. Diese Beschreibung ist nicht als Einschränkung des Schutzumfanges der Erfindung sondern bloß als dieselbe veranschaulichend und repräsentierend aufzufassen.
- Es wurde ein Verfahren zur Bestimmung von Human-Antikörpern (IgG) gegen doppelsträngige DNA unter Anwendung der "Sandwich"- Technik ausgeführt.
- Gereinigter Ziegen-Antikörper (IgG) gegen Human-Antikörper (IgG), der mit Hilfe von N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionat (SPDP) kovalent an Avidin gebunden ist, wurde in der folgenden Weise hergestellt.
- 3,7 mg Hühnereiklar-Avidin, gelöst in 1,0 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,4), und 100 ml 0,256 M SPDP in Ethanol, wurden miteinander vereinigt. Das so entstandene Gemisch wurde während 1 h bei 20ºC gerührt, und das nicht-umgesetzte SPDP wurde daraus durch Gelfiltration an einer Sephadex®-G-25-Säule entfernt.
- Weiterhin wurden 2,1 mg (durch Affinitätschromatographie gereinigtes) und in 1,0 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,4) gelöstes Ziegen-Anti-Human-IgG und 100 ml 0,256 M SPDP in Ethanol miteinander vereinigt. Das so entstandene Gemisch wurde während 1 h bei 20ºC gerührt, und nicht-umgesetztes SPDP wurde daraus durch Gelfiltration an einer Sephadex® G-100-Säule entfernt.
- 125 ml 0,1 M Natriumacetat (pH 4,5) wurden zu 1,25 mg SPDP-Ziegen-Anti-Human-IgG in einem 400 ml-Volumen (pH 5,0) zugegeben. Dazu wurden 50 ml 0,1 M Dithiothreit (DTT) zugesetzt. Das so entstandene Gemisch wurde umgerührt und dann während 15 min bei 20ºC inkubiert. Das nicht umgesetzte DTT wurde durch Gelfiltration an einer Sephadex® G-25-Säule entfernt.
- Zu 0,73 mg (reduziertem) SPDP-Ziegen-Anti-Human-IgG wurden 1,24 mg SPDP-Avidin zugegeben. Das so entstandene Gemisch wurde während 1,5 h bei 20ºC leicht gerührt. Das so entstandene Konjugat wurde dann bei 40 C gelagert.
- Zu mit doppelsträngiger Human-DNA überzogenen Vertiefungen einer Polystyrol -Mikrotiterplatte (eines Fassungsvermögens von 250 ul) wurden jeweils 100 ul einer Human-Serumprobe mit einem Gehalt an Antikörper (IgG) gegen doppelsträngige DNA zugegeben. Die Vertiefungen und die Probe wurden dann bei 20ºC während 2 bis 4 h inkubiert und dann zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurden 100 ul von verdünntem, aus dem Ziegen-Antikörper (IgG) gegen Human-IgG und Avidin bestehenden Konjugat-Reagens aus der obigen Stufe (a) zugegeben, und jede Vertiefung wurde während 1 h bei 20ºC inkubiert. Überschüssiges Reagens wurde durch Absaugen entfernt, und jede Vertiefung wurde zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurden dann 100 ul eines aus biotinmarkierter alkalischer Phosphatase bestehenden Reagens zugegeben, welches im Handel erhältlich ist. Jede Vertiefung wurde dann mit dem aus der biotinmarkierten alkalischen Phosphatase bestehenden Reagens während 30 min bei 20ºC inkubiert, wonach überschüssiges Biotin- Reagens durch Absaugen entfernt wurde und jede Vertiefung zweimal mit Waschpuffer gewaschen wurde.
- Zu jeder Vertiefung wurden 100 ul eines aus p-Nitrophenylphosphat bestehenden Substrat-Reagens zugesetzt, wonach während 30 min bei 20ºC inkubiert wurde; worauf 100 ul 2N H&sub2;SO&sub4; zugegeben wurden. Die optische Dichte (O.D.) bei 410 nm wurde abgelesen, um die Enzymkonzentrationen festzustellen.
- Ein Verfahren zur Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin (HCG) kann in der folgenden Weise ausgeführt werden.
- 10,0 mg (0,166 uMol) Streptavidin werden in 1,0 ml 0,05 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH 7,2 aufgelöst. Hierzu werden tropfenweise 33 ul einer 5 mM-Lösung von N-gamma-Maleinimidobutyryloxysuccinimid (GMBS) in Tetrahydrofuran (THF) zugegeben, und es wird während 1,5 h bei 20ºC leicht gerührt.
- Man löst 50 mg gereinigten monoklonalen Mäuse-Antikörper gegen alpha-HCG in 2,5 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 4,5) auf. Hierzu werden 100 ul einer 10 mg/ml-Lösung von Pepsin in Acetatpuffer zugegeben, man vermischt leicht und läßt über Nacht (während etwa 16 h) bei 37ºC verdauen. Das Gemisch wird mit 300 ul 2M Tromethamin (Tris) neutralisiert. Man gibt das verdaute Gemisch auf eine G-200-Säule (1,5 · 30 cm) auf und eluiert mit mit 0,01 Tris gepufferter Kochsalzlösung (vom pH 7,3). Man sammelt 2,5 ml-Fraktionen und überwacht bei 280 nm. Der erste Hauptpeak ist F(ab')&sub2;. Die Peak-Fraktionen werden vereinigt und auf 5 ml (etwa 6 mg/ml) konzentriert. Hierzu gibt man 0,5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 50 ul 0,2 M Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA)-Dinatriumsalz und 50 ul 0,1 M Dithiothreit in 1 M Tris-HCl (pH 7,5) zu. Man vermischt leicht und inkubiert während 1 h bei 20ºC.
- Man gibt das Gemisch auf eine G-200-Säule auf und eluiert in gleicher Weise wie bei dem pepsinverdauten Gemisch. Man vereinigt die ersten, Fab'-Fragmente enthaltenden Hauptpeak-Fraktionen. Unmittelbar danach vermischt man die Lösung der vereinigten Mäuse-Anti-alpha-HCG-Fab'-Fragmente mit dem GMBS-behandelten Streptavidin und vermischt leicht während 3 h bei 20ºC. Man löscht das überschüssige Maleinimid mit 50 ul 10 mM Mercaptoethanol ab. Man trennt das Konjugat von den nicht-umgesetzten Komponenten durch Gelfiltration durch eine Sephadex® G-200-Säule ab. Man eluiert mit PBS und überwacht bei 280 nm.
- Der erste Hauptpeak enthält das Mäuse-Anti-α-HCG-Fab'- Streptavidin-Konjugat.
- In die Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte, welche mit durch Affinitätschromatographie gereinigtem, gegen die beta-Untereinheit des HCG spezifischem, monoklonalem Mäuse- Antikörper (IgG) überzogen sind, werden 100 ul einer Patientenserumprobe oder ein HCG-Standard eingebracht. Man inkubiert die Vertiefungen während 3 h bei 20ºC, wonach die in Beispiel I beschriebene Verfahrensweise des Absaugens und Waschens angewendet wird. Zu jeder Vertiefung werden 100 ul des Konjugates mit der Arbeitskonzentration zugegeben, wonach man während 1 h bei 20ºC inkubiert. Nach dem Absaugen und Waschen werden 100 ul eines Konjugates aus Biotin und alkalischer Phosphatase zugegeben. Man inkubiert wie im Beispiel I beschrieben, und man führt die im Beispiel I beschriebene Enzym-Substrat-Reaktion durch. Man verwendet eine Standard-Kurve zur Bestimmung der HCG-Werte der Probe.
- Ein Verfahren für den Nachweis von Auto-Antikörpern gegen die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse kann in folgender Weise ausgeführt werden.
- Avidin aus Streptomyces avidinii wird mit durch Affinitätschromatographie gereinigtem Ziegen-Antikörper gegen Human- IgG nach der folgenden Verfahrensweise konjugiert.
- 3,4 mg (0,023 uMol) von durch Affinitätschromatographie gereinigtem Ziegen-Antikörper gegen Human-IgG werden in 0,5 ml von 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgelöst. Unter Rühren werden 3,0 ul (0,30 uMol) N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) in N,N-Dimethylformamid (DMF) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird während 20 min bei 20ºC inkubiert. Man chromatographiert das Reaktionsgemisch an einer 15 ml-Sephadex® G-25-Säule mit 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 1 mM EDTA. Man stellt den pH-Wert der 0,9 mg Ziegen-Anti- Human-IgG-SATA enthaltenden Fraktion auf einen pH-Wert von 7,5 ein und gibt 100 ul 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) mit 0,4 M NH&sub2;OH·HCl und 0,02 M EDTA zu. Man rührt das Gemisch während 1,5 h bei Zimmertemperatur und lagert dasselbe bei 4ºC.
- Man löst 1 mg (0,016 uMol) Streptavidin in 1,0 ml 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) auf und fügt 27 ul (0,065 uMol) 2,4 mM N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP) in Dimethylsulfoxid hinzu. Man rührt das Reaktionsgemisch während 1 h bei 20ºC und chromatographiert an einer 15 ml-Sephadex® G- 25-Säule mit 0,05 M einbasischem Natriumphosphat (PH 4,3).
- Zu 0,4 mg Ziegen-Anti-Human-IgG-SATA (0,8 mg/ml) gibt man 0,48 mg Streptavidin-SPDP (0,53 mg/ml) zu und rührt während 1,5 h bei Zimmertemperatur. Man lagert das Konjugat bei 20ºC.
- 25 ul von Patientenserumproben, welche jeweils in 0,05 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) verdünnt worden sind, [1 : 2, 1 : 8], werden auf Gewebesektionen auf Objektträgern aufgebracht, welche jeweils mit 4 um dicken Schnitten von Affen-Pankreasgewebe beschichtet sind. Man inkubiert die Objektträger während 1 h in einer Feuchten Kammer. Die Objektträger werden dann zweimal in PBS gewaschen und bei 20ºC während 1 h mit Streptavidin-Konjugat inkubiert, welches in PBS verdünnt und auf die Gewebesektion aufgebracht worden ist. Nach der Inkubation wäscht man die Objektträger zweimal in PBS, fügt 1 ml von in PBS verdünnter (im Handel erhältlicher), biotinmarkierter Glucoseoxidase hinzu und inkubiert während einer weiteren Stunde bei 20ºC. Man wäscht die Objektträger zweimal in PBS, löscht mit Löschpapier ab, und fügt 1,0 ml 0,0005% Nitroblau-Tetrazolium, 0,0075% Glukose und 0,0002% Phenazinmethosulfat in 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;-Puffer (pH 6,9) hinzu. Man inkubiert während 30 min bei 20ºC, wäscht zweimal mit PBS und montiert permanent mit geeigneten Montierungsmedien. Die Pankreassektionen werden unter Verwendung eines Lichtmikroskops bewertet. Ein positives Anfärben wird durch Beobachtung eines Anfärbens des Zytoplasmas der Zellen in den Langerhans-Inseln bestimmt. Jede Sektion wird in Abhängigkeit von der Intensität des Anfärbens mit 0, 1+, 2+, 3+, 4+ usw. bewertet. Die Ergebnisse werden als Titer angegeben.
- Ein kompetitiver Immunoassay für die Bestimmung von Human- IgE in Patienten-Serumproben kann wie folgt durchgeführt werden.
- Dies geschieht in der gleichen Weise wie dies für das Konjugieren des Human-IgG an das Streptavidin in Beispiel III beschrieben worden ist.
- In Vertiefungen, welche mit einer gesonderten Menge von Kaninchen-Antikörper gegen Human-IgE überzogen sind, bringt man jeweils 100 ul Patienten-Serum oder Standard, jeweils in PBS verdünnt, ein. Man fügt 50 ul IgE-Streptavidin-Konjugat in PBS hinzu und inkubiert das Gemisch über Nacht (während etwa 16 h) bei 20ºC. Man saugt ab und wäscht die Vertiefungen gründlich mit PBS, bevor jeweils 100 ul biotinmarkierte Meerrettich- Peroxidase zugegeben werden. Man inkubiert während 1 h bei 20ºC. Man saugt ab, wäscht wie zuvor und fügt 200 ul Substratpuffer hinzu, welcher 0,3% o-Phenylendiamin·2 HCl und 0,02% Wasserstoffperoxidase in Citrat-Phosphat-Puffer (pH 5,2) enthält. Man inkubiert während 30 min bei 20ºC und beendet die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 N H&sub2;SO&sub4;. Die IgE-Konzentrationen werden zu den Werten für die dekadische Extinktion bei 492 nm umgekehrt proportional sein.
- Der Nachweis von Adenovirus durch DNA-Hybridisierung kann in der folgenden Weise ausgeführt werden.
- Dies ist von Virtanen, M. et. al., Lancet, Bd. I, S. 831 (1983), beschrieben worden.
- 30 mg Streptavidin werden in 1,0 ml 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,3) aufgelöst. Unter Rühren gibt man 10 ul 0,1 M N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA), in N,N-Dimethylformamid (DMF) zu und inkubiert während 20 min bei 20ºC. Man eluiert das Gemisch durch eine Sephadex® G-25- Säule mit 1 M Tris-HCl (pH 8,0) und konzentriert die Protein- Peak-Fraktion auf etwa 1,0 ml.
- Man vermischt mit 1 mg DNA in 100 ul 2M NH&sub2;NH&sub2;/1 M NaHSO&sub3; (pH 6,3) und inkubiert bei 37ºC während 75 min. Man fügt 1,4 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,6) hinzu und dialysiert zweimal gegen diesen Puffer (1,0 Liter) während 24 h. Man setzt die Dialyse während weiterer 12 h gegen 0,05 M NaCl fort. Man fällt die derivatisierte DNA mit überschüssigem Ethanol aus und wäscht dieselbe damit, wonach man sie erneut in 100 ul 1M Tris- HCl (pH 8,0) solubilisiert.
- Man behandelt 12 mg SATA-derivatisiertes Streptavidin in 1,0 ml 1M Tris-HCl (pH 8,0) mit 4,0 mg Brombrenztraubensäure und inkubiert während 15 min. Man vermischt mit 5 mg des präparierten Polynukleotides und läßt während 1 h bei 20ºC stehen. Man eluiert die Streptavidin-markierte Sonde in einer Sephadex® G-100-Säule mit 0,15 M NaCl mit 0,015 M Natriumcitrat (SSC)
- Man denaturiert pBR322-Plasmid-DNA in 0,3 NaOH bei 100ºC während 5 min. Man kühlt auf 0ºC und vermischt mit einem gleichen Volumen von 2 M Ammoniumacetat. Man trägt auf 3 mm-Nitrozellulosefilter auf (150 ng/Filter). Vor der Hybridisierung werden die Filter in 0,15 M NaCl mit 0,015 M Natriumcitrat (SSC), 0,02% Ficoll und 0,25% SDS vorinkubiert. Die Proben- DNA wird durch Kochen in 7 mM NaOH während 5 min denaturiert. Nach dem Kühlen und Neutralisieren verdünnt man sie im Verhältnis von 1 : 4 in SSC mit 0,02% Ficoll und Streptavidin-markierter Sonde. Jede Hybridisierungsreaktion enthält den Filter mit der immobilisierten DNA, sowie 400 ul des Gemisches aus Probe/Sonde. Man inkubiert bei 37ºC während 16 h. Man wäscht den Filter gründlich in SSC mit 0,02% Ficoll und biotinmarkierter Peroxidase bei 20ºC während 2 h. Man wäscht den Filter gründlich in SSC mit 0,02%igem Ficoll und entwickelt in 10 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) mit 10 mM Imidazol, 10 ul an 30 %igem H&sub2;O&sub2; und 3,3'-Dianidisin in 2 ml Ethanol. Man spült und lagert den Filter in Tris-HCl.
Claims (16)
1. Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem Medium, in
welchem der Ligand vermutlich enthalten ist, welches Verfahren
umfaßt:
(a) Bereitstellen einer unlöslichen Phase, welche eine für den
Liganden spezifische Bindungssubstanz enthält;
(b) Inkubieren dieser unlöslichen Phase mit den folgenden
Reagentien:
(i) dem Medium, welches den Liganden vermutlich enthält;
(ii) einem löslichen Reagens, welches aus einer Gruppe
ausgewählt ist, welche besteht aus:
(a') einer für den Liganden spezifischen Bindungssubstanz,
welche mit einem Avidin-Reagens kovalent verknüpft ist;
(b') dem genannten Reagens (a'), welches mit
biotinmarkiertem Enzym komplex gebunden ist;
(c') dem an Avidin gebundenen Liganden; oder
(d') einem Reagens (c'), welches mit biotinmarkiertem Enzym
komplex gebunden ist; und
(iii) einem löslichen, biotinmarkiertem Enzym, wenn das
genannte Reagens (a') oder (c') ist;
(c) Abtrennen der nicht-umgesetzten Reagentien von der
unlöslichen Phase nach dem Inkubieren; und
(d) Bestimmung der Enzymaktivität von entweder den abgetrennten,
nicht-umgesetzten Reagentien oder von der abgetrennten,
unlöslichen Phase, um den Liganden zu bestimmen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Stufe (b) die unlösliche
Phase mit der spezifischen Bindungssubstanz inkubiert wird,
welche kovalent mit dem Avidin-Reagens verknüpft ist, welches
seinerseits an das biotinmarkierte Enzym gebunden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Stufe (b) die unlösliche
Phase mit dem Liganden inkubiert wird, welcher mit Avidin
verknüpft ist, das seinerseits an biotinmarkiertes Enzym
gebunden ist.
4. verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, wobei die Stufe
(b) das Inkubieren der unlöslichen Phase mit den Reagentien (i),
(ii) und - sofern zutreffend - (iii) in Gegenwart aller dieser
Reagentien umfaßt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, wobei die Stufe
(b) das Inkubieren der unlöslichen Phase mit den Reagentien (i)
(ii) und - sofern zutreffend - (iii) in der angegebenen
Reihenfolge umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, welches weiterhin in der Stufe (c)
das Abtrennen des nicht-umgesetzten Reagens von der unlöslichen
Phase nach jeder Inkubation umfaßt, und welches in der Stufe (d)
die Bestimmung der Enzymaktivität von entweder der unlöslichen
Phase oder von dem abgetrennten, nicht-umgesetzten,
biotinmarkierten Enzym umfaßt.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, wobei der Ligand
ein Antigen, ein Antikörper, ein Hapten oder eine andere, einen
Rezeptor aufweisende Substanz in einem lebenden Organismus ist.
8. Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem Medium, in
welchem der Ligand vermutlich enthalten ist, welches Verfahren
umfaßt:
(a) Bereitstellen einer unlöslichen Phase, welche eine für den
Liganden spezifische Bindungssubstanz enthält;
(b) Inkubieren dieser unlöslichen Phase mit den folgenden
Reagentien:
(i) (A) einem flüssigen Medium, in welchem der Ligand
vermutlich enthalten ist, und (B) mit einer bekannten Menge
eines löslichen Reagens, welches aus einer Gruppe ausgewählt
ist, welche besteht aus:
(a') einer für den Liganden spezifischen Bindungssubstanz,
welche mit einem Avidin-Reagens kovalent verknüpft ist;
(b') dem genannten Reagens (a'), welches mit
biotinmarkiertem Enzym komplex gebunden ist;
(c') dem an Avidin gebundenen Liganden; oder
(d') einem Reagens (c'), welches mit biotinmarkiertem Enzym
komplex gebunden ist; und
(ii) einem löslichen, biotinmarkiertem Enzym, wenn das
genannte Reagens (a') oder (c') ist;
(c) Abtrennen der nicht-umgesetzten Reagentien von der
unlöslichen Phase nach dem Inkubieren; und
(d) Bestimmung der Enzymaktivität von entweder der unlöslichen
Phase oder von dem abgetrennten, nicht-umgesetzten Reagens,
wobei diese Aktivität mit der Menge des Liganden in dem
flüssigen Medium in Beziehung steht.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei in der Stufe (b) die
bekannte Menge von (B) das Reagens (b') umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei in der Stufe (b) die
bekannte Menge von (B) das Reagens (d') umfaßt.
11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei in der Stufe (b) die
bekannte Menge von (B) das Reagens (d') umfaßt.
12. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Stufe (b) das
Inkubieren der unlöslichen Phase mit den Reagentien (i) und - soferne
zutreffend - (ii) in der angegebenen Reihenfolge umfaßt; und
wobei die Stufe (c) das Abtrennen von nicht-umgesetztem Reagens
von der unlöslichen Phase nach jeder Inkubation umfaßt; und
wobei die Stufe (d) die Bestimmung der Enzymaktivität von
entweder der unlöslichen Phase oder von dem abgetrennten,
nicht-umgesetzten, biotinmarkierten Enzym umfaßt.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 8 und 9, wobei der Ligand aus
einer Gruppe ausgewählt ist, welche aus Antigen, Antikörper,
einem Hapten oder einer anderen, einen Rezeptor aufweisenden
Substanz in einem lebenden Organismus besteht.
14. Reagens zur Bestimmung eines Liganden, welches enthält:
(a) eine für den Liganden spezifische Bindungssubstanz;
(b) eine Avidin-Markierungsgruppe, welche mit Hilfe eines damit
umgesetzten Kupplungs-Reagens an diese spezifische
Bindungssubstanz kovalent gebunden ist; und
(c) eine biotinmarkierte Enzymgruppe, welche an die genannte,
kovalent gebundene Avidin-Markierungsgruppe gekuppelt ist.
15. Reagens nach Anspruch 14, wobei das Kupplungs-Reagens eine
Verbindung der Formel R¹-S-S-A-Z ist, worin R¹ für 2-Pyridyl,
5-Nitro-2-pyridyl oder 4-Pyridyl steht, A einen
Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt und Z für
eine aus
oder
ausgewählte Gruppe steht, worin n für 2 oder 3
steht, R¹ die gleiche Bedeutung wie das obige R¹ hat und
demselben gleich ist und R² für Methyl oder Ethyl steht.
16. Reagens nach Anspruch 14, wobei das Kupplungs-Reagens
N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionat ist.
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