DE2951678A1

DE2951678A1 - Immunologische bestimmung mit hilfe von lectin

Info

Publication number: DE2951678A1
Application number: DE19792951678
Authority: DE
Inventors: Chu Albert En-Yuen
Original assignee: E-Y Laboratories Inc
Current assignee: E-Y Laboratories Inc
Priority date: 1978-12-26
Filing date: 1979-12-21
Publication date: 1980-07-10
Also published as: US4289747A; JPS5593063A; JPS6343711B2

Description

DIPL.-INQ. J. RICHTER PATENTANWÄLTE

PIPL-ING. F. WERDERMANN

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PATENTANMELDUNG

PRIORITÄT: 26. Dezember 1978

(entspr. U.S.-Anm. Serial No. 972 696)

BEZEICHNUNG: Immunologische Bestimmung mit

Hilfe von Lectin.

ANMELDER: E-Y LABORATORIES, INC.

127 N. Amphlett Boulevard
San Mateo, Kalif. 9^01
V.St.A.

ERFINDER: Albert E. Chu

819 Maple Street

San Mateo, Kalif. 9^02

V.St.A.

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Die Erfindung bezieht sich auf ein immunologisches Verfahren zur Markierungsanalyse einer Komponente eines immunologischen Konjugates, z.B. eines Antigens oder Antikörpers, wobei das markierte Konjugat von dem Rest der Reaktionsmischung durch reversible Aufbringung auf eine feste Oberfläche getrennt und danach von der festen Oberfläche zur Analyse entfernt wird.

Die üblichen immunologischen Assayverfahren sind die sogen. Sandwich- oder konkurrierenden Bindungsverfahren. Bei einem Sandwichverfahren wird die Probe, wie z.B. ein Serum, das eine unbekannte Konzentration eines Antigens enthält, immunologisch mit einem Antikörper zur Reaktion gebracht, der aus dem Rest der Reaktionsmischung abgetrennt wird. Dann wird das gebundene Antigen mit einem markierten Antikörper bebrütet und die Menge des immunologisch gebundenen markierten Antikörpers gemessen. Bei einem konkurrierenden Bindungsverfahren wird die Konzentration des zu bestimmenden Antigens und eine bekannte Menge markierten Antigens immunologisch konkurrierend mit Antikörper zur Reaktion gebracht und von dem Rest der Reaktionsmischung abgetrennt. Das abgetrennte, an den Antikörper gebundene markierte Antigen wird dann quantifiziert, um indirekt die Gesamtmenge des Antigens in der ursprünglichen Probe zu bestimmen.

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Ein allgemeines Problem bei den vorstehend genannten Verfahren ist die genaue Trennung des gebundenen markierten immunologischen Konjugatprodukts von dem Rest der das ungebundene markierte Material enthaltenden Reaktionsmischung. Ein Verfahren für eine solche Trennung besteht darin, das markierte Reaktionsprodukt an eine feste Oberfläche zu binden, die aus der flüssigen Reaktionsmischung entfernt wird. Ein Problem hierbei besteht in der Schwierigkeit, bestimmte Markierungen wie Enzyme auf einer festen Oberfläche zu messen und zwar wegen der langsamen Diffusionsraten zwischen Substrat und Enzym und der begrenzten Enzymbeweglichkeit auf der festen Oberfläche, wodurch die Kollisionsfrequenz zwischen Enzym und Substrat herabgesetzt wird. Die Messung der Enzymaktivität in der flüssigen Phase ist weitaus rascher und genauer. Ein anderer Nachteil der Pestphasentechnik ist der, dass die feste Phase nicht allgemein regenerationsfähig ist.

Ein Verfahren zur Wiederverwendung der festen Oberfläche und zur Messung marktierten Antigens oder Antikörpers in einem flüssigen Substrat ist in der U.S.-Patentschrift 3 896 217 von Johnson beschrieben. Danach wird Antikörper irreversibel gebunden, etwa durch kovalente Bindung an eine feste Oberfläche, worauf anschliessend eine immunologische Reaktion mit dem Antigen der Probe und eine Markierung vorgenommen wird. Nach Trennung der festen Oberfläche von der Reaktionsmischung wird ein Spaltungsreagenz wie Äthylalkohol zugesetzt, um die Antikörper/Antigen-

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Bindung zu brechen. Danach wird das so freigesetzte markierte Antigen in der flüssigen Phase gemessen und die feste Oberfläche regeneriert. Ein anderes Verfahren ist in der U.S.-Patentschrift H 041 146 von Giaever beschrieben, wobei eine Säure als Spaltungsreagenz zwischen einer Antikörper/Antigen-Bindung an eine feste Oberfläche verwendet wird. Diese Verfahren sind jedoch mit Nachteilen verbunden. Zum Beispiel ist eine solche Spaltung nicht für die gesamte Freigabe der markierten Verbindung wirksam. Ausserdem können solche Spaltungsreagenzien eine Denaturierung der Enzyme und eine Ausfällung von Antikörpern oder Antigenen verursachen.

Erfindungsgemäss wird ein Festphasen-Trennungsverfahren zur Bestimmung einer oder mehrerer Komponenten eines immunologischen !Conjugates in einer flüssigen Probe vorgesehen. Zur Vereinfachung der Beschreibung wird das Antigen, sofern es nicht anderweitig spezifiziert wird, als die Probenverbindung und der Antikörper als die entsprechende immunologische Verbindung des Konjugates bezeichnet. Das markierte Konjugat wird umkehrbar auf eine feste Oberfläche aufgebracht und danach davon abgelöst, ohne dass es erforderlich wäre, immunologische Bindungen zu spalten. Nach einer Ausführungsform ist unlöslich gemachter Zucker irreversibel an eine feste Oberfläche gebunden,und ein markiertes immunologisches Reaktionsprodukt, das durch Antikörper an ein Lectin gebunden ist, ist selektiv und umkehrbar reaktionsfähig mit dem unlöslich gemachten Zucker.

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Das markierte Lectin-gebundene Produkt wird mit dem spezifischen Zucker in Berührung gebracht und auf der festen Oberfläche zur Trennung von dem Rest der Reaktionsmischung, die das lösliche, markierte Produkt enthält, zurückgehalten. Danach wird die Menge der markierten Verbindung in dem durch unlöslich gemachten Zucker gebundenen Lectinprodukt als Indikator für die Menge der zu bestimmenden Probenkomponente gemessen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Messung besteht darin, das gewaschene markierte Produkt aus der Säule mit einer Lösung von Zucker der gleichen Art wie das markierte Produkt auszuwaschen, um das markierte Lectinprodukt von der Säule in Lösung freizusetzen und danach das in Lösung befindliche markierte Produkt zu messen.

Das ctlge Verfahren ist anwendbar auf ein System mit raschem Durchfluss, bei dem der unlöslich gemachte Zucker kovalent an ein poröses Teilchenbett oder ein festes Filterglied gebunden ist, das die Reaktionsmischung passiert. Auch können Mehrfachantigene oder -antikörper durch Verwendung verschiedener spezifischer Antikörper oder Antigene mit verschiedenen Markierungen (z.B. Enzymen) analysiert werden, wobei die Reaktionsmischung durch eine einzelne Säule geleitet und daraus zur nachfolgenden Analyse der verschiedenen Enzyme in Lösung freigegeben wird. Gewünschtenfalls können die Rollen des Lectins und des Zuckers durch Unlöslichmachen des Lectins und Binden des Zuckers an ein Glied des immunologischen Konjugates vertauscht werden.

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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Assay zur Quantifizierung einer Komponenten eines immunologischen Konjugates zu schaffen, bei dem das markierte immunologische Reaktionsprodukt von dem Rest der Reaktionsmischung durch umkehrbare Bindung an eine feste Oberfläche getrennt und danach einfach ii eine Lösung zwecks Messung freigegeben wird. Es soll ferner ein immunochemisches System mit einer speziellen festen Oberfläche geschaffen werden, das spezielle Lectin/Zucker-Paare für die umkehrbare Substratbindung aufweist. Es soll ferner ein solches System geschaffen werden, das als Durchflußsystem ausgebildet ist. Weiterhin soll ein Inkubations- oder Brütverfahren mit einer homogenen Lösung geschaffen werden, an das sich das vorher erwähnte Trennverfahren anschliessen kann. Weiter soll ein System geschaffen werden, das zu einer Mehrkomponentenquantifizierung fähig ist.

Bei dem immunologischen Verfahren nach der Erfindung wird das hochspezielle umkehrbare Reaktionsprodukt eines Lectin/ Zucker-Paares mit einem Glied des Paares in unlöslich gemachter Form auf einer festen Oberfläche als ein Modus zur Trennung eines markierten immunologischen Reaktionsprodukts aus der immunologischen Reaktionsmischung benutzt. Danach kann die feste Oberfläche von dem Reaktionsprodukt mittels Durchgangs von löslichem Zucker oder Lectin der gleichen Art, wie auf der Säule vorhanden, abgestreift und die Menge der markierten Verbindung in dieser Mischung als Maß des zu analysierenden Materials bestimmt werden.

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Dieses System ist auf die Bestimmung einer Komponente eines immunologischen Konjugates anwendbar. Allgemein gesprochen, enthalten solche !Conjugate irgendein Paar von Substanzen, die immunologisch aneinander bindbar sind. Insbesondere enthalten die Konjugate Antigene und deren Antikörper, biologisch wirksame Haptene und deren Antikörper, Enzyme und deren Substrate, Hormone und deren Rezeptoren sowie Vitamine und deren Rezeptoren. Sie können somit einen ersten Antikörper und einen zweiten Antikörper gegen den ersten umfassen. Der Einfachheit halber soll hier, soweit keine andere Spezifizierung gebraucht wird, das Antigen/Antikörper-Paar als das immunologische Konjugat bezeichnet werden, wobei das Antigen als die Komponente einer flüssigen Probe, insbesondere eines Serums gemessen werden soll. Zu anderen Alternativen gehört die Analyse für Antikörper in einer Probe.

Lectine sind Proteine oder Glykoproteine, welche spezifische Rezeptorstellen oder -platze (receptor sites specificity) für eine bestimmte Zuckerart oder bestimmte Zuckerarten, nicht aber für andere Zuckerarten aufweisen. Zum Beispiel hat Concanvalian A (Con A) eine Spezifizität für Alpha-D-Glukose und Alpha-D-Mannose. Wenn ein Ligand wie Glukose kovalent mit einer festen Matrix verkettet wird, wird Con A auf der Oberfläche zurückgehalten, weil der Glukose-Ligand Avidität mit der Rezeptorstelle oder dem Rezeptorplatz des Con A besitzt. Diese Bindung ist umkehrbar. Somit gibt eine Lösung von Glukose das Con A von der Oberfläche frei.

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Bei dem hier vorliegenden System ist das Lectin irreversibel an einen Antikörper oder ein Antigen gebunden, vorzugsweise durch bekannte kovalente Bindungsverfahren. Eine solche Bindung ist in geeigneter Weise durchführbar durch Verkettung des Lectins mit dem Antigen oder Antikörper durch ein bifunktionelles Verkettungsagenz. Geeignete bifunktionelie Verbindungen sind auffindbar in der Review von Peters, K., und Richards, P.M. (Ann. Rev. Biochim. H6 (1977) 523). Alkylimidate weisen einen hohen Grad von Spezifizität unter den funktionellen Gruppen auf, die ihnen durch ein Protein dargeboten werden. Die Reaktion ist spezifisch für primäre Aminogruppen.

Für die Bestimmung von Antigen in einer flüssigen Probe, wie einem Serum, wird ein Reaktionsprodukt gebildet, das Antigen immunologisch gebunden an einen Antikörper enthält, der wiederum an ein Lectin gebunden ist. In diesem Reaktionsprodukt ist eine Markierungsverbindung enthalten, die entweder an die gleiche Art von Antigen oder die gleiche Art von Antikörper in dem immunologischen Paar enthalten ist. Dann wird das Reaktionsprodukt mit unlöslich gemachtem Zucker in Berührung gebracht, der selektiv und umkehrbar reaktionsfähig mit dem gebundenen Lectin ist, um das Reaktionsprodukt umkehrbar durch Vermittlung des Lectins an den unlöslich gemachten Zucker zu binden. Darauf wird das Reaktionsprodukt des an den unlöslich gemachten Zucker gebundenen Lectins von dem Rest der Reaktionsmischung abgetrennt und die Menge der markierten Verbindung in entweder dem Reaktionsprodukt oder dem Rest als Maß für die Menge des Antigens in der Probe bestimmt. Vorzugsweise wird die Markierungsverbindung in dem

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Reaktionsprodukt bestimmt und vor der Bestimmung der unlöslich gemachte Zucker mit einer Zuckerlösung zur Berührung gebracht, um das Lectinprodukt auszuwaschen und die Messung der Markierungsverbindung in löslicher Form zu ermöglichen.

Noch spezieller ausgedrückt, wird das immunologische Konjugatreaktionsprodukt folgendermassen gebildet: Zunächst wird die das Antigen enthaltende flüssige Probe mit ihrem speziellen, an Lectin gebundenen Antikörper und mit einer markierten Form entweder desselben Antigens oder seiner speziellen Antikörpers in Berührung gebracht, um ein immunologisches Reaktionsprodukt zu bilden. Die übrigen Verfahrensschritte werden dann wie vorstehend auseinandergesetzt ausgeführt.

Die beiden bevorzugten immunologischen Reaktionsarten für den Gebrauch mit dem jeweiligen Trennsystem sind die konkurrierende oder die Sandwichart. Es sollte jedoch verstanden werden, dass andere Arten ebenfalls verwendet werden können, solange die Trennung unter Verwendung der umkehrbaren Lectin/ Zucker-Bindung auf einer festen Oberfläche durchgeführt wird. Das konkurrierende Verfahren wird nachstehend zunächst beschrieben :

Konkurrierendes immunologisches Homogensystem

Gemäss einer Ausführungsweise der Erfindung wird zunächst eine homogene immunologische Reaktion, entweder nacheinander

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oder gleichzeitig, aber in jedem Falle in Lösung durchgeführt. Angenommen, das Antigen in einer flüssigen Probe wie einem Serum sei zu bestimmen, wobei die Probe das Antigen enthält, wird die Probe mit einer bekannten Menge von an eine Markierungsverbindung wie ein Enzym in geeigneter Weise kovalent durch ein bifunktionelles Verkettungsagenz gebundenen Antigens vermischt. Ausserdem wird der für das Antigen spezifische Antikörper, gebunden an ein Lectin, zugesetzt, um eine flüssige Reaktionsmischung zu bilden, die bebrütet wird. Während der Inkubation oder Bebrütung konkurrieren das unbekannte Antigen und das markierte Antigen mit dem Lectin-gebundenen Antikörper in bekannter Weise, um ein immunologisches Reaktionsprodukt zu bilden. Ein solches Produkt wird mit unlöslich gemachtem Zucker, gebunden an eine feste Oberfläche und von einer Art, die selektiv und umkehrbar reaktionsfähig mit dem gebundenen Lectin ist, in Berührung gebracht. Die Bindung des Zuckers an die feste Oberfläche kann auch kovalent durch ein übliches bifunktionelles Verkettungsagenz erfolgen. Das Reaktionsprodukt ist umkehrbar vermittels des Lectins an den unlöslich gemachten Zucker gebunden.

Bei dem nächsten Schritt wird das Reaktionsprodukt des mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenenLeetins von dem Rest der Reaktionsmischung abgetrennt. Angenommen, das Substrat weist eine gepackte Säule von Teilchen auf, so wird dieser Schritt in geeigneter Weise so durchgeführt, dass das Reaktionsprodukt durch die Säule fliessen gelassen wird,

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um den nicht aus Lectin bestehenden Teil der Reaktionsmischung zu entfernen.

Danach wird die Menge der markierten Verbindung in entweder dem mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenen Lectinprodukt oder in dem Rest der Reaktionsmischung als Maß der Menge des Antigens in der Probe bestimmt. Dieser Schritt wird vorzugsweise so ausgeführt, dass das mit unlöslichem Zucker gebundene Lectinprodukt mit markiertem Zucker derselben Art wie der unlösliche Zucker in Berührung gebracht wird, um zu erreichen, dass das gebundene Lectinprodukt mit dem löslichen Zucker zur Umwandlung in eine löslich gemachte Form reagiert. Dann werden die löslichen und unlöslichen Komponenten in verschiedene Fraktionen getrennt. Danach wird die Menge der markierten Verbindung, vorzugsweise in der löslichen Franktion, als Maß für die Menge des Antigens in der Probe bestimmt.

Wie bei einem üblichen konkurrierenden System wird in dem vorhergehenden Enzym-Markierungssystem die Enzymkonzentration in der löslichen Zuckerfraktion aus einer Antigen/ Enzym-Konjugatkonzentration abgeleitet, die in Konkurrenz stand mit dem für Antikörperstellen zu messenden Antigen, und somit ist die Enzymkonzentration invers auf eine solche Antigenkonzentration bezogen. Es kann eine Kurve der Enzymkonzentration, bezogen auf die Inkubations- oder Brützeit (einschliesslich des anschliessenden Durchflusses durch das Bett) bei verschiedenen Normkonzentrationen des Antigens aufgezeichnet werden. Aufgrund davon kann eine zweite Norm-

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kurve der Norm-Antigenkonzentration, bezogen auf die Enzymrate bei konstanter Inkubationszeit, aufgezeichnet werden. Die Enzymrate eines unbekannten Antigens wird unter Verwendung der gleichen Inkubationsdauer gemessen. Dann kann die Menge des unbekannten Antigens aus der Aufzeichnung der Enzymrate, bezogen auf das Antigen, wie vorstehend erörtert, bestimmt werden.

Bestimmte Serumproben enthalten Glykoprotein, das mit dem Antikörper-gebundenen Lectin reaktionsfähig ist. Solche Glykoproteine könnten mit dem unlöslich gemachten Zucker um die Reaktionsplätze oder -stellen des an das markierte immunologische Konjugat gebundenen Lectins konkurrieren und veranlassen, dass ein Teil des Lectinprodukts durch die Säule hindurchgeht, ohne an den unlöslich gemachten Zucker gebunden zu werden. Um diese mögliche Fehlerquelle zu vermeiden, kann freies, nicht an den Antikörper gebundenes Lectin von der gleichen Art wie das an den Antikörper gebundene Lectin der Probe im überschuss zu dem mit Lectin reaktionsfähigen Glykoprotein der Probe zugesetzt werden. Auf diese Weise blockiert das ungebundene Lectin die mit Lectin-reaktionsfähigen Stellen des Glykoproteins und beseitigt dadurch diese Störungsquelle.

Ein anderes Verfahren zur Entfernung der Störung durch fremdartiges Glykoprotein besteht darin, dass vor dem Kontakt mit dem unlöslich gemachten Zucker die Probe, vor oder nach der Reaktion, durch ein Bett von unlöslich gemachtem Lectin geleitet wird, das nicht an Antikörper gebunden ist und von

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der gleichen Art ist wie das Lectin, das an das markierte immunologische Reaktionsprodukt gebunden ist. Zweckmässig ist das unlöslich gemachte Lectin kovalent gebunden an die Teilchen des Bettes. Der Durchgang der Probe durch dieses Bett hat zur Folge, dass das Glykoprotein auf der Säule zurückgehalten und dadurch von der Probe entfernt wird.

Konkurrierendes immunologisches Durchflußsystem

Bei dieser Ausführungsform ist keine Inkubation vor dem Kontakt mit dem unlöslich gemachten Zucker erforderlich. Es sei angenommen, dass das Antigen bestimmt werden sollj dann wird der für dieses Antigen spezifische Lectin-gebundene Antikörper durch ein Körpervolumen wie ein poröses Bett von unlöslich gemachtem Zucker hindurchgeleitet, der selektiv reaktionsfähig mit dem gebundenen Lectin ist, um das Lectin umkehrbar an den unlöslich gemachten Zucker zu binden. Die das Antigen enthaltende Probe und eine bekannte Menge von in löslicher Form markiertem Antigen werden durch das Körpervolumen geleitet, um eine konkurrierende immunologische Reaktion zwischen den beiden Formen von Antigen bezüglich der mit Antikörper reaktionsfähigen Stellen auf der Säule zu bewirken. Das Antigen des Musters und das markierte Antigen können gleichzeitig oder nacheinander, ohne Rücksicht auf die Reihenfolge, durch die Säule geleitet werden. Die Verweilzeit in dem Bett wird geregelt, um eine Vervollständigung der immunologischen Reaktion zu ermöglichen.

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Der Rest dieses Assay-Schemas ist der gleiche wie der im Zusammenhang mit der homogenen Reaktion erwähnte. Kurz gesagt, wird der Teil der Reaktionsmischung, der nicht vermittels des Lectins an den unlöslich gemachten Zucker gebunden ist, aus dem Bett entfernt. Gewünschtenfalls kann dieser ungebundene Teil bezüglich seiner Enzymaktivität gemessen werden. Vorzugsweise aber wird die Menge der markierten Verbindung, die an den unlöslich gemachten Zucker gebunden ist, als ein Maß der Menge einer solchen Komponente in der Probe bestimmt. Dies geschieht, wie schon erwähnt, vorzugsweise durch Abstreifen des Lectinprodukts von der Säule mit einer Lösung von löslichem Zucker. Das. gleiche Enzymmessungsschema kann bei Verwendung einer konstanten Inkubationsdauer in dem Bett für die Norm und für das Unbekannte benutzt werden. Ferner können, wie schon erwähnt, falls die Probe Glykoprotein enthält, das mit dem Lectin reaktionsfähig ist, die reaktionsfähigen Plätze oder Stellen des Glykoproteins gesperrt werden oder es kann das Glykoprotein aus der Probe in Übereinstimmung mit den vorstehend genannten Verfahren entfernt werden.

Das konkurrierende Durchflußverfahren ist besonders geeignet zu einem raschen genauen Assay in Lösung, insbesondere von Enzym. Nach einer Ausführungsart der Erfindung wird ein Bett von löslich gemachtem Lectin aufstromseitig von einem Bett des unlöslich gemachten Zuckers angeordnet. Während des Durchflusses wird das Probenglykoprotein in dem ersten Bett entfernt, während das Lectin-immunologische

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Reaktionsprodukt in dem zweiten Bett zurückgehalten wird. Danach wird eine Zuckerlösung durch das zweite Bett geleitet, um das markierte immunologische Reaktionsprodukt aus der Säule zur Analyse zu entfernen.

Sandwichartiges homogenes immunologisches System

Bei einem typischen Sandwichverfahren zur Bestimmung von Antigen wird das Antigen mit einem spezifischen Antikörper bebrütet, der in der Lage ist, Mittel zur Trennung zu schaffen, sowie mit einem anderen Antikörper, der an eine markierte Verbindung gebunden ist, um eine sandwichartige Schichtung zum Verbinden von Peststoffoberfläche/Antikörper/ Antigen/Antikörper/Markierungsverbindung zu bilden. Nach der allgemeinen Terminologie der vorliegenden Erfindung umfasst das Antigen die eine Komponente eines immunologischen Konjugates in der flüssigen Probe; der auf die bindende feste Oberfläche aufgebrachte Antikörper umfasst die entsprechende Komponente des immunologischen Konjugates, währeiti der Anti (d.h. die eine Komponente), der den Antikörper enthält, an eine Markierungsverbindung gebunden ist. Zur Vereinfachung der Beschreibung wird hier auf das spezielle Reaktionssystem von fester Oberfläche/Antikörper/Antigen/Antikörper/Markierung Bezug genommen. Es ist aber zu beachten, dass auch andere analoge immunologische Systeme verwendet werden können, wie z.B. solche zum Peststellen von Antikörper in der Probe durch Rollenvertauschung des Antigens und des Antikörpers.

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Das Antigen in der Probe wird mit Antikörper bebrütet, der an Lectin gebunden ist, um eine immunologische Reaktion zu bewirken. Auch wird solches immunologisch gebundenes Antigen mit markiertem Antikörper bebrütet, um eine zweite immunologische Reaktion zu bewirken. Diese beiden Brutstufen können entweder gleichzeitig oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge stattfinden, solange das gebildete Reaktionsprodukt Leetin/Antikörper/Antigen/Antikörper/Markierungsverbindung ist, hier also das sandwichartige Lectin-Reaktionsprodukt.

Das sandwichartige Lectin-Reaktionsprodukt wird dann mit unlöslich gemachtem Zucker in Berührung gebracht, der selektiv und umkehrbar reaktionsfähig mit dem gebundenen Lectin des Produktes ist, um das Lectin umkehrbar an den unlöslich gemachten Zucker in ähnlicher Weise wie dasjenige zu binden, das oben unter Bezugnahme auf das konkurrierende homogene immunologische System erörtert wurde. Insbesondere wird das mit unlöslich gemachtem Zucker gebundene Lectin-Reaktionsprodukt von dem Rest der Reaktionsmischung abgetrennt und die Menge der Markierungsverbindung in dem mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenen Lectinprodukt wird als Maß für die Menge von Antigen in der Probe bestimmt. Die vorangehende Technik des Abstreifens des Lectinproduktes von der Säule mit einer Lösung von löslichem Zucker kann gleichfalls angewendet werden. Auch kann, wenn die Probe Glykoprotein, das mit dem Lectin reaktionsfähig ist, enthält, diese Fehlerquelle aus dem System, wie oben bereits beschrieben, beseitigt werden.

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Andere, dem Sandwichsystem analoge Systeme können ebenfalls benutzt werden. Zum Beispiel kann ein Paar, bestehend aus einem Lectin und einem ersten Antikörper, bebrütet werden mit (a) dem zu messenden Antigen, das damit immunologisch zur Reaktion gebracht wird, wie z.B. in einem Serum, und (b) mit einer zweiten Antikörpermarkierung, worin der erste Antikörper dem zweiten Antikörper gegenübersteht. Das Antigen, das mit dem ersten Antikörper reagiert, blockiert die reaktionsfähigen Stellen des ersten Antikörpers, die zur Reaktion mit dem zweiten zur Verfügung stehen. Somit ist die zweite Antikörpermarkierung, die dem ersten Antikörper-Lectin anhaftet, umgekehrt oder invers bezogen auf die Menge von Antigen und stellt daher ein Maß dieser dar. Ein analoges System dieser Art ohne Lectin ist das Biotin-Avidin· System.

Sandwichartiges immunologisches Durchflußsystem

Wie bei dem konkurrierenden immunologischen Durchflußsystem ist vor dem Kontakt mit dem unlöslich gemachten Zucker in diesem Verfahren keine Inkubation erforderlich. Hier wird der an Lectin gebundene Antikörper mit einem Körpervolumen von unlöslich gemachtem Zucker in Berührung gebracht, der selektiv und umkehrbar reaktionsfähig mit ihm ist, um das Antikörper-Lectin an den unlöslich gemachten Zucker umkehrbar zu binden. Dann wird die das Antigen enthaltende Probe durch das Körpervolumen unter solchen Bedingungen geleitet, dass eine immunologische Reaktion mit dem Antikörper auf der Säule bewirkt wird. Danach wird der an die Markierungs-

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verbindung gebundene Antikörper durch diese Säule geleitet, um eine immunologische Reaktion zwischen dem Antigen auf der Säule und einem solchen markierten Antikörper zu bewirken.

Der Rest der Verfahrensschritte sind dieselben wie oben im Zusammenhang mit dem homogenen sandwichartigen immunologischen System beschrieben. Somit wird das mit unlöslich gemachtem Zucker gebundene Lectinprodukt von dem Rest der Reaktionsmischung getrennt und die Menge der Markierungsverbindung als Maß der Menge der Probenkomponente bestimmt.

Feststellung von Mehrfachantigen oder -antikörper

Entweder die homogenen oder die auf Durchfluss beruhenden konkurrierenden bzw. Sandwichsysteme sind leicht an die Feststellung von zwei oder mehreren Antigenen oder Antikörpern in einer flüssigen Probe wie einem Serum anpassbar.

Bei dem konkurrierenden homogenen System können zwei oder mehr Antigene oder Antikörper analysiert werden. Eine das erste und zweite Antigen enthaltende Probe wird gemischt und bebrütet mit einer bekannten Menge des gleichen ersten bzw. zweiten Antigens, gebunden an verschiedene erste und zweite Markierungsverbindungen in löslicher Form sowie mit ersten und zweiten Antikörpern, die spezifisch sind für das erste bzw. zweite Antigen der Probe, jeweils an Lectin gebunden. Das bebrütete konkurrierende immunologische Reaktionsprodukt wird dann mit unlöslich gemachtem Zucker in Berührung gebracht, der selektiv und umkehrbar reaktions-

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fähig mit dem Lectin dieses Produktes ist, um das Lectin umkehrbar an den unlöslich gemachten Zucker zu binden.

Danach werden die mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenen Lectinprodukte aus dem Rest der Reaktionsmischung abgetrennt und die Menge der ersten und zweiten Markierungsverbindung in den mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenen Lectinprodukten als Maß des ersten und zweiten Antigens bestimmt. Eine solche Bestimmung wird vorzugsweise durchgeführt durch Freigeben des mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenen Lectinprodukts mit löslichem Zucker der gleichen Art wie der unlöslich gemachte Zucker und Trennen der Lösung und Messen der Menge der ersten und zweiten Markierungsverbindung in der löslichen Fraktion. Nach einer Ausführungs- form, die insbesondere auf Enzymmarkierungen anwendbar ist, werden die löslichen Produkte zur unabhängigen Messung der Mengen der verschiedenen ersten und zweiten Enzyme in verschiedene Fraktionen getrennt.

Bei dem sandwichartigen homogenen System können zwei oder mehr Antigene oder Antikörper in einer flüssigen Probe analysiert werden. Der Einfachheit halber wird hier auf eine Probe Bezug genommen, die ein erstes und zweites Antigen enthält. Diese Probe wird gemischt und bebrütet mit einer bekannten Menge eines ersten bzw. zweiten Antigens, gebunden an verschiedene erste und zweite Markierungsverbindungen in löslicher Form. Die markierten Antigene sind von der gleichen Art wie die ersten und zweiten Antigene der Probe. Ausserdem werden der Reaktionsmischung

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erste und zweite Antikörper zugesetzt, die spezifisch sind für das erste bzw. zweite Antigen der Probe, jeweils gebunden an Lectin. Während der Inkubation oder Bebrütung werden die jeweiligen Antigen/Antikörper-Paare gebildet. Diese Reaktionsmischung wird dann mit unlöslich gemachtem Zucker in Berührung gebracht, der selektiv und umkehrbar reaktionsfähig mit dem Lectin ist wie schon oben erwähnt, um das Lectin-Reaktionsprodukt umkehrbar an den unlöslich gemachten Zucker zu binden. Der Rest des Verfahrens ist der gleiche wie bei dem sandwichartigen homogenen System.

Das konkurrierende Durchflußsystem ist auch anwendbar auf die Bestimmung von Mehrfachantigenen und -antikörpern in der Probe. In einer besonderen Ausführungsform werden die ersten und zweiten Antikörper, die speziell reaktionsfähig mit dem ersten und zweiten Antigen und an ein Lectin gebunden sind, durch ein Körpervolumen aus unlöslich gemachtem Zucke· geleitet, der selektiv und umkehrbar mit dem gebundenen Lectin reaktionsfähig ist. Auf diese Art wird der Lectin-Antikörper spezifisch an den löslich gemachten Zucker gebunden. Dann wird die das erste und zweite Antigen enthaltende Probe zusammen mit einer bekannten Menge von markiertem ersten und zweiten Antigen in löslicher Form durch das Körpervolumen geleitet, um die konkurrierende immunologische Reaktion zwischen den markierten und unmarkierten Antigenen für die mit Zucker gebundenen Antikörper zu bewirken.

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Der Rest des konkurrierenden DurchflussVerfahrens zur Analyse von Mehrfachantigenen wurde oben erörtert. Kurz gesagt wird die Reaktionsmischung, die sich nicht an das unlöslich gemachte Zuckersubstrat bindet, aus dem Körpervolumen von unlöslich gemachtem Zucker entfernt. Dann wird die Menge der ersten und zweiten markierten Verbindung in dem mit unlöslich gemachten Zucker gebundenen Lectinprodukt auf der festen Oberfläche als Maß des ersten und zweiten Antigens in der Probe bestimmt. Vorzugsweise werden die Lectinprodukte von dem unlöslich gemachten Zuckersubstrat mittels einer Zuckerlösung abgestreift und der lösliche Teil zur Analyse der markierten Verbindungen abgetrennt.

Das sandwichartige Durchflußsystem kann gleichfalls zur Analyse von Mehrfachantigenen oder -antikörpern verwendet werden. Die folgende Beschreibung bezieht sich auf die Analyse erster und zweiter Antigene in einer Probe. Erste und zweite Antikörper, die spezifisch sind für die ersten bzw. zweiten Antigene in der Probe und an Lectin gebunden sind, laufen durch ein Körpervolumen von unlöslich gemachtem Zucker, das den Lectin-Antikörper umkehrbar an den unlöslich gemachten Zucker bindet. Dann wird die das erste und zweite Antigen enthaltende Probe durch das Körpervolumen geleitet, um zu bewirken, dass eine immunologische Reaktion mit den mit Zucker gebundenen Antikörpern eintritt. Danach werden dritte und virte Antikörper zu den Antigenen der Probe, an erste bzw. zweite markierte Verbindungen gebunden, durch das Körpervolumen

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von Zucler geleitet, um eine immunologische Reaktion mit den ersten und zweiten Antigenen der Probe zu bewirken. Danach wird die Reaktionsmischung, die nicht durch das Lectin an den unlöslich gemachten Zucker gebunden ist, abgetrennt und die Menge der ersten und zweiten markierten Verbindungen auf dem mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenen Lectinprodukt als Maß der Menge der ersten und zweiten Antigene in der Probe bestimmt.

Obgleich das bevorzugte System für den unlöslich zu machenden Zucker auf einer festen Oberfläche und die Benutzung zur Trennung während der Integrierung des Lectins in das immunologische Reaktionsprodukt gilt, ist zu beachten, dass gewünschtenfalls auch die Rollen des Lectins und des Zuckers vertauscht werden können, wenn dies für ein spezielles Verfahren zweckdienlich erscheint. In diesem Falle wird das Lectin vorzugsweise durch bekannte Verfahren wie kovalente Bindung durch das kombinierte funktioneile Kopplungsreagenz unlöslich gemacht. Das gleiche Kopplungsverfahren kann auch zur Bindung des Zuckers an das Antigen oder den Antikörper verwendet werden.

Lectin/Zucker-Paare

Wie oben auseinandergesetzt schafft die umkehrbare Zucker/ Lectin-Bindung den Modus der Trennung des immunologischen Reaktionsprodukts bei allen vorhergehenden Verfahren. Die hochspezielle Natur der Lectin/Zucker-Bindung macht das System besonders vorteilhaft. Nachstehend wird eine Probenliste von Lectinarten und sDeziel^ja^Zuckerarten angeführt:

Tabelle I

Lectin

Arachis Hypogaea Agglutinin (PNA) Bauhinia Purpurea Agglutinin (BPA')

Bendeirea Simplicifolia Agglutinin (BSA)

Canavalia Ensoformis Agglutinin (CON A)

Dolichos Biflorus Agglutini (DBA) Glycine Max (SBA) Lens Culinaris (LcH) Limulus Polyhemus (LPA) Lotus Tetragonolobus (Lotus A) Phaseolus Vulgaris (L-PHA) Phaseolus Limensis (LBA I) Phaseolus Vulgaris (H-PHA) Pisum Sativum (PEA) Phytolacca Americana (Pokeweed) Ricinus Communis (RCA I) Ricinus Comunis (RCA II) Sophora Japonica (SJA) Triticum Vulgaris (WGA)

Ulex Europeus (UEA I) Ulex Europaeus (UEA II) Wisteria Floribunda (WFA) Zucker

D-Gal/l(l*3)-GalNAc D-GaINAc, D-GaI

Ct-D-GaI 4rD-Man, A-D-GIc.

Hr-D-GaINAc D-GaI, Ct-D-GaINAc Ct-D-Man, Cl-D-GIc Sialsäure A-L-Fucose D-GaINAc Ct-D-GaINAc D-GaINAc d-D-Man, d-D-Glc.

D-GaINAc «t-D-GalNAc

(ft(l-*1)-D-GlcNAc)2 (Sialsäure)

4-L-Fucose (D-GlacNAc)2 D-GaINAc

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Die Verwendung von Isomeren de-r vorstehend genannten Lectinarten liegt gleichfalls im Rahmen der Erfindung.

Die vorstehenden Lectine sind durch ein bifunktionelles Reagenz fest gebunden an die entsprechenden immunologischen Substanzen (z.B. Antikörper, Antigene oder Haptene). Beliebige dieser Substanzen, welche immunologische !Conjugate bilden, können gemäss der Erfindung verwendet werden. Exemplarische Antigene sind folgende:

Tabelle II

Albumin

2 H-Globulin

Cancinoembryonisches Antigen

Choriogonadotropein

Heptoglobulin

Hepatitis B Oberflächenantigen

IgE

IgG

IgM

Insulin

Placental Lactogen

Pregnancy-assoziiertes Macroglobulin

Virbio Cholerae-exotoxin lipopolysaccharid

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Exemplarische Haptene sind folgende:

Tabelle III

Cortisol

Estrogens

2,4-Dinitrophenol

Progesteron

1 Thyrotropin

Morphin und andere Opiate

Amphetamin

Barbituate

Methadon

Benzoyl ecogonin (metabolisches Cocain)

Diphenylhydantoin

Phenobarbital

Primidon

Digoxin

Morphin und Codein

Thyroxin

Beispielsweise können Antikörper gegen die Antigene gemäss der nachstehenden Tabelle IV verwendet werden.

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Tabelle IV

Amoeba, strain HK-g Albumin, Serum Allergens, verschieden Carcinoembryonisches Antigen Choriogonadotropin DNA

Human IgG, IgM, IgA Dextran

2 ,Jj-Dimtrophenol Echinococcus (körnig)

E. CoIi enterotoxin ο und kl Antigene

flt-Fetoprotein y-Globulin

IgG Myeloma Proteine Immunologlobulin (Leichtketten) Hog Cholera Virus Onchocera Volualus Plosmodium Spezies Rubella Virus Salmonella Spezies, O Antigene Schistosoma Mansoni Streptolysin O Toxoplasma Gondiu Trichinella Spiralis Trypanosoma Cruzi

Trypanosoma Rhodescense und Trypanosoma Brucei 030028/0775

Vibrio Choterae, Exotoxin und Liposaccharid

295167g

Bei dem vorliegenden System sind bei den nachstehend aufgeführten Paaren und Substanzen starke Bindungen erforderlich :

(a) Lectin mit der einen Komponente des immunologischen Konjugates (z.B. Antigen, Antikörper oder Hapten),

(b) Markierungsverbindung mit dieser einen Komponente und

(c) Zucker mit dem unlöslich gemachten Substrat.

Es können auch ähnliche bifunktionelle Reagenzien verwendet werden, um diese Verbindungen, wie in der oben erwähnten Literaturstelle Review von Peters und Richards beschrieben, miteinander zu koppeln. Zu solchen Kopplungsreagenzien gehören Amidoester wie Dimethyl Malonimidat, Säuren wie die Acrylsäure von Tartryl Dkzid, welche leicht mit Immunogruppen reagiert, um Amidverkettungen hervorzurufen, ferner Aryl Dihalide (z.B. l,5-Difluoro-2,iJ ,-Dinitrobenzol, oder i*,i»^l-Difluoro-3,3'-Dinitrophenyl Sulfon, Glutaraldehyd, l-Äthyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimid Hydrochlorid, Dimaleinid, gemischtes Anhydrid, m-Maleamido-Benzylboyl N-Hydroxysucciinimidester, und andere bekannte Verkettungsagenzien).

Alle vorstehend genannten Binder sind im wesentlichen irreversibel. Zusätzlich können bifunktionelle Reagenzien mit funktioneilen Gruppen wie Disulfid oder Glykol benutzt werden. Solche Binder können nach der Verkettungsreaktion

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gebrochen werden. Zu solchen Reagenzien gehören Dimethyl 3,3'-Dithiobispropionimidat, Sussinimidyl Propionimidat, N-(3-Fluoro-¹l,6-Dinitrophenyl)-Cystamin, Tartryl Diazid, Tartryl Di (Glycylazid) und Tartryl Di (£-Amino Caproylazid).

In manchen Fällen können die Bindungen direkt zwischen den Reagenzien selbst geformt werden. Zum Beispiel können Antikörper und Enzyme durch funktionelle Gruppen an den entsprechenden Materialien verkettet werden. Um ein spezifisches Beispiel anzuführen: Meerrettich (horseradish) Peroxidase mit einem Gehalt an Carbohydrat kann mit Periodat behandelt und mit Antikörper reagiert werden, um eine Schiff-Grundformation zu ergeben, ohne seine Enzymaktivität zu hemmen oder die immunologische Aktivität des Antikörpers zu blockieren.

Zu den bekannten Verfahren, welche bifunktionelle Verkettungsagenzien in Enzym-Immunoassays üblicher Art verwenden, gehören die folgenden:

(a) Eine einstufige Glutaraldehyd-Verkettung (Avrameas, S. Immuno ehe mis try (5 (1969) ^3)»

(b) zweistufige Glutaraldehyd-Verkettung (Avrameas, S. Immunochemistry (1971) 1175),

(c) Oxidation von Saccharidrückständen und Schiff-Grundformation (Nakane, P.K., J. Hisothem. Cytochem. 2j? (1974) 1084), und

(d) Dimaleimid-Verkettung (Kato, K., et al, Euro. J. Biochem. 6£, (I966) 285).

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Die Festphasenoberfläche zum Unlösmachen des Zuckers oder Lectins bei dem Verfahren gemäss der Erfindung hat vorzugsweise einen porösen Charakter, der es ermögUcht, Lösungen hindurchgehen zu lassen. So können z.B. die Feststoffe eines Zellulosefilterpapierbetts verwendet werden. Noch mehr sind perlenartige Teilchen zu bevorzugen, die einen noch geringeren Strömungswiderstand ergeben. Solche Teilchen können aus Glas, Polystyrol, Tafelpolyacrylamidgel, Nylon-6, Agarose, oder einem anderen Material geformt werden, das in der Lage ist, mit dem Zucker oder Lectin eine kovalente Bildung bei der Trennstufe des Verfahrens nach der Erfindung einzugehen.

Es kann irgendeine übliche Markierung verwendet werden, die an einer immunologischen Substanz (z.B. Antigen, Antikörper oder Hapten) fest angebracht werden kann. Zu solchen Markierungen gehören eine luminiszierende Substanz wie Phosphor oder ein Fluorogen, eine Bioluminiszenzsubstanz, eine radioaktive Substanz, ein Enzym, Drallmarkierungen (spin labels), oder ein die Substanz enthaltendes Metall. Vorzugsweise wird ein Enzym als Markierung verwendet.

Zu den geeigneten Fluoreszenzmarkierungen gehören Lissanim Rhodamin B, D.A.N.S. (l-Dimethylamino-Naphthalen-5-sulfidische Säure), Ortho-Phthaldehyd, Fluoreszin Isothiocyanat und Fluorescamin, wie sie häufig bei der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden. Es kann auch irgendeines von einer Anzahl bekannter Enyzmmarkierungssysteme verwendet werden. Ein solches System ist beschrieben in einem Artikel

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von Pesce et al "Use of Enzyme-Linkes Antibodies to Measure Serum Anti-DNA Antibody in Systemic Lupus Erthyematosus", Clin. Chem. 20/3, 353-359 (1974). Ein anderes ist beschrieben in Wisdom, G.B., Clin. Chem. 2_2, (1976) 1243. Eine Liste geeigneter Enzyme ist zu finden bei Hawk, et al, Practical Physiological Chemistry, McGraw-Hill Book Company, New York (1954), Seiten 306 bis 397. In der nachstehenden Tabelle V ist eine Liste geeigneter Klassen von Enzymen neben spezifischen Enzymbeispielen angeführt:

Tabelle V

Klasse

Hydrolase Carbohydroase Nuclease Amidase

Purine Deaminase Peptidase Proteinase Esterase Eisen-Enzyme Kupfer-Enzyme Enzyme mit Gehalt an Coenzymen Enzyme reduzierend Cytochrom Gelbe Enzyme Mutase

Demolase Andre Enzyme

Enzymbeispiel

Amylase Polynuceotidase Arginase Adenase Aminopolypeptidase Pepsin Lipase Catalase Tyrosinase Alkohol Dehydrogenase Succinic Dehydrogenase Diaphorase Glyoxalase Aldolase

Phosphorylase Hexokinase

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Die Konzentration des Enzyms wird bestimmt durch Vergleich mit einer Normkurve, geradeso wie andere Markierungen wie Fluoreszenzmarkierungen und radioaktive Markierungen. Nachstehend werden einige Beispiele zur Erläuterung des Wesens der Erfinding angeführt. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass sich die Möglichkeiten zur Ausführung der Erfindung darin nicht erschöpfen.

Beispiel 1 Darstellung eines Lectin/Antikörper-Paares (einstufig)

5 mg von gereinigtem PNA (Lectin) werden gelöst in 1 ml Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,1 M Lactose, 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2, 0,15 M Natriumchlorid und 5 mg Ziegen (goat)-Anti-Human IgG Antikörper, und 10 bis 20 Microliter eines Kopplungsagens (Lambda redestilliertes Glutaraldehyd) werden zugesetzt. Diese Mischung wird für die Dauer einer Stunde bei Raumtemperatur bebrütet. Dann erfolgt eine Dialyse gegen ein Liter 0,1 M Phosphatpuffersalz. Anschliessend erfolgt ein Durchlauf durch eine Säule von Perlen aus Galactose (1 bis 3) Galactosamin verketteter Agarose, die eine Spezifität zum Zurückhalten von PNA und PNA-Antikörpern auf der Säulenmatrix aufweist. Die Säule wird gewaschen, bis die OD -Messung 0,050 beträgt. Dann wird der PNA-Komplex aus der Säule elutiert durch Verwendung eines speziellen Zuckers, wie z.B. 0,5 M Lactoselösung und darauf durch eine zweite Säule geleitet, welche Perlen aus mit Human IgG gekoppelter Agarose enthält. Die PNA-Antikörper werden von der Matrix disoziiert, und zwar durch

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Verwendung entweder von 0,1 M Azetylsäure oder 3 M Natrium-Isothiocyanat oder anderen Reagenzien. Der Komplex wird extensiv gegen Phosphatpuffersalz dialysiert. Die elutierte Lösunc wird konzentriert und durch eine Gelfiltersäule Geleitet, welche die Bestandteile nach Molekulargewicht trennt. Es wird die Fraktion gesammelt, welche einem Molekulargewicht von einem Lectin/Antikörper-Paar in einem Konjugat mit dem Verhältnis 1:1 entspricht.

Beispiel 2

Zweistufiges Verfahren zur Darstellung eines Lectin/ Antikörper-Paares

Zu einem ml Phosphatpuffersalz mit pH 7>2 mit einem Gehalt von einem mg PNA werden zwei ml Galactose (I bis 3) Galactosamin verkettete Agaroseperlen als Matrix beigemischt, die spezifisch für eine PNA-Bindung ist. Es wird Glutaraldehyd zugesetzt und die Mischung für eine bis sechs Stunden bebrütet. Das Gel wird auf einem gesinterten Glasfiltertrichter mit PBS gewaschen. Dieses Gel wird in einer Lösung von 1 mg von Ziegen-Antihuman IgG Antikörpern über Nacht suspendiert. Die Perlen werden mit PBS gewaschen und dann mit 0,1 M spezifischer Zuckerlösung gewaschen, um die Lectin/Antikörper-Komplexe von der Matrix freizusetzen. Der Eluant wird gesammelt und durch eine Säule geleitet, welche Perlen aus mit Human IgG gekoppelter Agarose enthält. Der Rest des Verfahrens ist der gleiche wie beim Beispiel 1.

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Beispiel 3 Direkte Anwendung von Enzym/Lectin zur Messung;

von Glykoprotein oder Polysaecharid oder Glykolipid

Zu einem mit Antikörper überzogenen Polystyrolrohr werden eine Reihe bekannter Konzentration von Human IgG aus 0,001 ng zu 1/Ug in einem ml von 0,1 M Phosphatpuffersalz mit pH 7,2 und einem Gehalt an Human Albuminserum zugesetzt. Diese Mischung wird bei ¹IO⁰C für die Dauer einer Stunde bebrütet _s dekantiert und mit Phosphatpuffersalz gewaschen. Zu jedem Rohr wird ein ml Lectin/Enzym (lO.ug/ml) wie z.B. WGA-Meerrettich Peroxidase oder Con A-Mikroperoxidase oder andere Lectin/Enzym-Konjugate hinzugefügt. Dies wird dann zwei Stunden lang bebrütet, dekantiert und mit Phosphatpuffersalz mit 0,01 % Tween 20 gewaschen. Zu dem leeren Rohr werden 0,01 % Wasserstoffperoxid und O-Dianisdin hinzugefügt und für die Dauer von 15 Minuten bebrütet. Der O.D. wird bei 465 mu aufgezeichnet. Dieselbe Prozedur wird für das Unbekannte benutzt.

Beispiel h Mehrfachversuche

Es wird eine Reihe bekannter Konzentrationen von Human IgG und IgM im Bereich von 100 ng bis 20,ug präpariert. Zu jedem Rohr (Reagenzrohr), welches das Bekannte enthält, werden 30,ug von PNA-Anti IgG und PNA-Anti IgM sowie 10 ng Human IgG-alkalische Phosphatase und 10 ng Human IgM-Meerrettich-Peroxidase hinzugefügt.

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Die Inkubation dauert eine Stunde. Diese Mischung wird auf eine Säule übertragen, die eine Filterscheibe oder Matrix enthält, welche mit für PNA spezifischem Zucker überzogen ist. Dann wird die Säule mit 2 χ Ί ml Phosphatpuffersalz gewaschen, das 0,01 % Tween 20 enthält und der Eluant wird gesammelt. Ein ml des Eluant wird getestet, um die Aktivität der Meerrettich-Peroxidase nach der Inkubation mit 0,01 % Wasserstoff-Peroxid und 0-Dianisidin zu bestimmen. Ein weiteres ml wird getestet, um die Aktivität der alkalischen Phosphatase durch Bebrüten mit 0,001 K p-Nitrophenylphosphat in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer mit pH 10,0 zu bestimmen. Auf diese Weise wird eine Norm- oder Standardkurve der Konzentration, bezogen auf die optische Dichte, erhalten. Wenn aber eine IgG oder IgM-Konzentration eines menschlischen Serums bestimmt werden soll, würden die gleichen Enzyme in dem Human-Serum eine Störung verursachen. Deshalb wird ein alternativer Weg vorgesehen. Die PNA-Antikörper-IgG-Enzymkomplexe werden aus der Säulenscheibe mit einer Lösung von 0,1 M spezifischer Zuckerlösung herausgespült. Die Aktivität der Enzyme wird bestimmt, um eine Normkurve festzulegen. Die gleiche Prozedur wird anschliessend für die Unbekannten durchgeführt, und deren Konzentration kann aus der Kurve für das IgG und das IgM entnommen werden.

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Beispiel 5

Prüfung von Thyroxin und Thyroid stimulierendem Hormon (TSH) durch gleichzeitigen Mehrfachenzym-Immuntest

A. Thyroxin-Mearettich-Peroxidase-Konjugate v/erden durch ein Doppelmarkierungsverfahren präpariert. Ein mg Thyroxid Hydrochlorid mit Äthanol-0,1 M Bicarbonat-

125 pufferlösung mit pH 8,0 und mit Radioisotop I markiertem Thyroxin (2x1- cpm) wird gemischt mit 1 mg Meerrettich-Peroxidase (HRP) durch das Nakane-Verfahren (Nakane, P.Q., und Kawavi, A.J., Histochem. Cytochem. 2_2, 1084 (197¹I). Das Konjugat wird nach einer Inkubation bei 4°C über Nacht gebildet. Dann wird die Mischung dreimal gegen 0,1 M Phosphatpuffersalz dialysiert. Die Konjugate werden weiterhin gereinigt, indem sie durch eine Sephadex-Säule G-200 (2 cm χ 75 cm) und eine DEAE Sepharose-Säule geleitet werden. Die Konzentration des HRP wird gemessen und der cpm des gesamten Dialysats bestimmt. Somit kann die Zahl der Thyroxidmoleküle pro Molekül des HRP deduziert werden. Eine Kurvenaufzeichnung der Konzentration des HRP gegen die Rate der Peroxidase wird aufgezeichnet, basierend auf der Zunahme der optischen Dichte oder fluoreszierender Signale bei einer Absorption von 465 mu pro Zeiteinheit und bei verschiedenen Enzymkonzentrationen, wenn Wasserstoff-Peroxid und O-Dianisidin benutzt werden.

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Thyroid stimulierende Hormone (TSH) oder Thyrotropinalkalische Phosphat-Konjugate werden präpariert.

Es werden 500 ,ug TSH mit 2 mg alkalischer Phosphatase bei pH 8,0 bis 1,0 M Bicarbonatpuffer und 20 Mikroliter Glutaraldehyd gemischt. Diese Mischung wird über Nacht bei ¹J⁰C bebrütet und dann gegen 0,1 M Phosphatpuffersalz extensiv dialysiert. Das Dialysat wird durch eine Sephadex G-200-Säule (2 cm χ 75 cm) oder eine Ultragel 3¹J-SaUIe geleitet, um die Konjugate von den ilicht-Konjugaten zu trennen. Die Konjugatkonzentration wird nach der Lowry-Methode bestimmt. Die Konjugatkonzentration gegen die Enzymreaktionsrate wird durch Messung der Absorption bei ^05 rnu-Inkrement pro Zeiteinheit ermittelt und grafisch aufgetragen, und zwar bei verschiedenen Enzymkonzentrationen, wenn p-Nitrophenylphosphat bei 0,001 M Konzentration in einem Carbonatpuffer - 0,1 M pH 10 als Substrat benutzt wird.

B. Standard- oder Normkurve von Thyroxin in menschlichem Serum

Zu einem von Thyroxin und TSH (100 Mikroliter) freien Humanserum wird das folgende hinzugefügt: 300 Mikroliter 0,1 M Phosphatpuffersalz pH 7,2, wobei die Thyroxin-Konzentration von 2 ng bis J.00 ng pro 100 Mikroliter verschieden sein kann, 1 ng Thyroxin-HRP-Konjugat, 100 ng PNA-Anti-T^, 1 ng TSH-alkalische Phosphatase, TSH mit verschiedenartiger bekannter Konzentration

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und 100 ng PNA-Anti-TSH.

Die 500 Mikroliter werden bei 37°C 30 Minuten lang bebrütet. Dann werden sie auf das Galactose-β (1·*3) Galactosamin-Konjugat Agaroseperlenbett (Ausschlussgrenze 1,5 M bis 15 M) mit dem Volumen 1 ml übertragen. Die Säule wird mit U ml PBS gewaschen, und danach gewaschen mit 2 ml 0,5 M-Lactose PBS-Lösung, und dieser Eluant wird gesammelt. Die Enzymaktivität des HRP pro 0,5 ml-Lactose-Eluant wird durch Assay untersucht. Die HRP-Reaktionsrate wird gegen die bekannte Konzentration des hinzugefügten Thyroxin grafisch aufgetragen. Dann wird die Aktivität der alkalischen Phosphatase gegen die bekannte Konzentration des hinzugefügten TSH aufgetragen.

C. Testen der unbekannten Konzentration von Thyroxin und TSH durch gleichzeitigen Mehrfachenzym-Immunotest

Zu je 100 Mikroliter einer unbekannten Probe werden 300 Mikroliter 0,1 M Phosphatpuffersalz pH 7,2, 100 ng PNA-ArItI-T₁₁, 100 ng PIiA-Anti-TSH, 1 ng HRP-T₁₄ und 1 ng TSH-alkalische Phosphatase hinzugefügt. Die Mischung wird bebrütet und behandelt wie vorstehend im Abschnitt B angegeben.

Aufgrund der aus der unbekannten Probe festgestellten Enzymaktivität wird dfe Konzentration von Thyroxin und Thyroid stimmulierendem Hormon aus der aufgezeichneten Normkurve ermittelt.

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Beispiel 6 Alternatives Durchflussverfahren

1. Brüte 1 ml Galactose β (l-#3)-Galactosamin konjugierte Matrixsäule mit 500 ng PNA-konjugiertem T^-Antikörper und TSH-Antikörper.

2. Wasche mit 0,1 M Phosphatpuffersalz.

3. Mische mit 1 ng sowohl die T^-HRP als auch die TSH-alkalische Phosphatase, 300 Mikroliter PBS mit 100
Mikroliter Serum sowie ohne Serum 5 Minuten lang bei
Raumtemperatur.

k. Übertrage dies auf die Säule, sammle den Eluanten und wasche mit 3 ml 0,1 M Phosphatpuffersalz pH 7,2.

5. Wasche die Säule mit 2 ml von 0,5 m Lactose mit einem Gehalt von PBS.

6. Sammle den Eluant.

7. Nimm 0,5 ml Eluant für ein Enzym-Assay unter Benutzung von 0-Dianisidin für T^-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat und Ij-Methyl-Belliferon-Phosphat für alkalisches Phosphat, und zeichne die Reaktionsgeschwindigkeit auf.

8. Entnimm die Konjugat-Konzentration aus einer Normkurve nach Abzug der Bank.

9. Entnimm das Konzentrat von T^ und TSH einer unbekannten von einer bekannten Konzentration des T^ und TSH.

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Beispiel 7 Sandwichartiges homogenes immunologisches System

Zu einem Testrohr werden folgende Bestandteile gemischt:

1. 0,5 ml Humanserum,

2. 0,1 ml Lectinlösung mit einem Gehalt von 20,ug PNA,

3. 0,1 ml mit einem Gehalt von 10,ug gereinigtem zu PNA zu Kaninchen-Antihuman-Insulin-Antikörper-Konjugaten,

¹I. 0,1 ml mit einem Gehalt von 1/Ug alkalischer Phosphotase zu Ziegen-Antihuman-Insulin-Antikörper-Konjugaten, und

5· 0,2 ml 0,1 M Phosphatpuffersalz pH 7,2. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei 37°C bebrütet.

Nach der Inkubation wird die Mischung durch eine Säule geleitet, welche Galactose-/J(l-»3) N-Acetyl-Galactosamin (hier: Gal|J(l-»3) GalNac), mit Agarose verkettet als Perlen oder feste Matrix enthält. Dann wird die feste Matrix mit 5 ml Phosphatpuffersalz gewaschen. 4 ml 0,2 M (GaIjJ (l-»3) GalNac Phosphatpuffersalz wird anschliessend hinzugefügt. Der Eluant wird gesammelt und die Aktivität der alkalischen Phosphatase durch Assay festgestellt. Aus einer Normkurve, basierend auf verschiedenen bekannten Konzentrationen von Insulin gegen Enzymaktivitäten wird das Konzentrat des Insulin aufgrund der ermittelten Enzymaktivität festgestellt, Die Normkurve wird anhand bekannter Konzentrationen von Insulin anstatt von menschlichem Serum erstellt.

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Claims

Patentansprüche

c 1.) Verfahren zur Bestimmung einer Komponente eines immunologischen Konjugates in einer flüssigen Probe, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

(a) Es wird ein immunologisches Konjugatreaktionsprodukt gebildet, das diese eine Komponente, immunologisch an ihre entsprechende Komponente gebunden, eine gebundene Markierungsverbindung und ein gebundenes Lectin enthält, welches an die erwähnte entsprechende Komponente gebunden ist;

(b) dieses Reaktionsprodukt wird mit unlöslich gemachtem Zucker in Berührung gebracht, der selektiv und umkehrbar mit dem gebundenen Lectin reaktionsfähig ist, um das Reaktionsprodukt durch das Lectin an den unlöslich gemachten Zucker zu binden;

(c) das durch den unlöslich gemachten Zucker ge-

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ORIGINAL INSPECTED

bundene Lectinprodukt wird von dem Rest der Reaktionsmischung getrennt] und

(d) die Menge der Markierungsverbindung wird entweder in dem durch unlöslich gemachten Zucker gebundenen Lectinprodukt oder in dem Rest als Maß der einen Komponente in der Probe bestimmt.
2. Verfahren zur Bestimmung einer Komponente eines immunologischen Konjugates in einer flüssigen Probe, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

(a) Die eine Komponente, welche die Probe enthält, wird mit einer bekannten Menge der einen Komponente, die in löslicher Form an eine Markierungsverbindung gebunden ist, und mit der entsprechenden Komponente des immunologischen Konjugates, die an ein Lectin gebunden ist, gemischt, so dass eine flüssige Reaktionsmischung entsteht;

(b) die unter (a) genannte Reaktionsmischung wird bebrütet, um eine konkurrierende immunologische Reaktion zu verursachen;

(c) die bebrütete Reaktionsmischung wird mit unlöslich gemachtem Zucker in Berührung gebracht, der selektiv und umkehrbar mit dem gebundenen Lectin reagiert und das Lectin umkehrbar an den unlöslich gemachten Zucker bindet;

(d) das Reaktionsprodukt des mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenen Lectins wird von dem Rest der

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Reaktionsmischung getrennt; und

(e) die Menge der Markierungsverbindung in entweder dem mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenen Lectinprodukt oder dem Rest als Maß für die Menge der einen Komponente in der Probe bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die eine Komponente des immunologischen Konjugates ausgewählt ist aus der aus Antigen, Antikörper oder Teilen oder Äquivalenten davon bestehenden Gruppe.
Ί. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (e) durch in Berührung bringen des mit unlöslich gemachtem Zucker gebundenen Lectinprodukts mit löslichem Zucker von der gleichen Art wie der unlöslich gemachte Zucker ausgeführt wird, um das gebundene Lectinprodukt mit dem löslichen Zucker zwecks Umwandlung in eine löslich gemachte Form zur Reaktion zu bringen, worauf die löslichen und die unlöslichen Komponenten in verschiedene Fraktionen getrennt und danach die Menge der Markierungsverbindung in der löslichen Fraktion gemessen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der unlöslich gemachte Zucker kovalent an eine feste Oberfläche gebundenen Zucker enthält.

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-H-
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Glykoprotein enthält, das mit dem Lectin reaktionsfähig ist, und dass vor dem Schritt (c) das ungebundene Lectin der Probe von der gleichen Art wie das gebundene Lectin zugesezt wird, wobei das ungebundene Lectin in einem Überschuss gegenüber dem damit reaktionsfähigen Glykoprotein in der Probe vorhanden ist, so dass das ungebundene Lectin die Lectin-reaktionsfähigen Plätze des Glykoproteins sperrt.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit Lectin-reaktionsfähiges Glykoprotein enthält und vor dem Schritt (c) die Probe durch ein Bett von unlöslich gemachtem Lectin mit Glykoprotein-reaktionsfähigen Plätzen und von der gleichen Art wie das gebundene Lectin gebildet wird, so dass das Glykoprotein auf der Säule zurückgehalten und dadurch aus der Probe entfernt wird.
8. Verfahren zur Bestimmung mindestens eines ersten und eines zweiten Antigens oder Antikörpers in einer flüssigen Probe, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte

(a) Die Probe, welche die ersten und zweiten Antigene oder Antikörper enthält, wird mit einer bekannten Menge dieser ersten und zweiten Antigene bzw. Antikörper, in löslicher Form gebunden an verschiedene erste und zweite Markierungsverbindungen, und mit

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ersten und zweiten Antikörpern oder Antigenen, die für die ersten und zweiten Antigene bzw. Antikörper der Probe spezifisch sind, vermischt und bebrütet und an Lectin gebunden, um die entsprechenden Antigen/Antikörper-Paare zu bilden;

(b) die Brutreaktionsmischung wird mit löslich gemachtem Zucker, der selektiv und umkehrbar reaktionsfähig mit dem Lectin ist, in Berührung gebracht, um das Lectin an den unlöslich gemachten Zucker zu binden;

(c) die Produkte aus unlöslich gemachtem Zucker und Lectin werden von dem Rest der Reaktionsmischung getrennt; und

(d) die Menge der ersten und zweiten Markierungsverbindung in entweder den Produkten aus unlöslich gemachtem Zucker und Lectin oder dem Rest als Maß der Menge der ersten und zweiten Antigene bestimmt.
9· Verfahren zur Bestimmung einer Komponente eines immunologischen Konjugates in einer flüssigen Probe, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

(a) Die entsprechende Komponente des immunologischen Konjugates, gebunden an Zucker, wird durch ein Körpervolumen von unlöslich gemachtem Lectin geleitet, das selektiv und umkehrbar mit dem gebundenen Zucker reaktionsfähig ist, um den Zucker umkehrbar an den unlöslich gemachten Zucker zu binden;

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(b) die die eine Komponente enthaltende Probe und eine bekannte Menge der einen Komponente, gebunden an eine Markierungsverbindung in löslicher Form, wird durch das erwähnte Körpervolumen geleitet, um eine immunologische Reaktion zwischen den Komponenten des immunologischen Konjugates zu bewirken;

(c) das unlöslich gemachte, Lectin-gebundene Reaktionsprodukt wird von dem Rest der Reaktionsmischung getrennt; und

(d) die Menge der Markierungsverbindung in dem unlöslich gemachten Zucker-gebundenen Lectinprodukt wird als Maß der Menge der einen Komponente in der Probe bestimmt.
10. Verfahren zur Bestimmung mindestens eines ersten und zweiten Antigens oder Antikörpers in einer flüssigen Probe, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

(a) Durch ein Körpervolumen von unlöslich gemachtem Zucker werden erste und zweite Antikörper oder Antigene geleitet, welche spezifisch sind für die ersten und zweiten Antigene bzw. Antikörper in der Probe, wobei jeder spezifische Antikörper bzw. jedes spezifische Antigen an ein Lectin gebunden und der Zucker selektiv und umkehrbar mit dem gebundenen Lectin reaktionsfähig ist, um das Lectin umkehrbar an den unlöslich gemachten Zucker zu binden;

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(b) die Probe, welche die ersten und zweiten Antigene oder Antikörper enthält, und eine bekannte Menge der an erste bzw. zweite Markierungsverbindungen in löslicher Form gebundenen Antigene oder Antikörper werden durch das Körpervolumen hindurch geleitet, um eine immunologische Reaktion zwischen den ersten und zweiten Antigenen oder Antikörpern und den ersten und zweiten Zucker-gebundenen Antikörpern bzw. Antigenen zu bewirken;

(c) die mit unlöslichem Zucker gebundenen Lectinreaktionsprodukte aus dem Rest der Reaktionsmischung werden abgetrennt;

(d) die Menge der ersten und zweiten Markierungsverbindungen in den mit unlöslichem Zucker gebundenen Lectinprodukten werden als Maß der ersten und zweiten Antigene oder Antikörper in der Probe gemessen.
11. Reaktionsprodukt zur Verwendung in einem immunologischen Assay, gekennzeichnet durch ein markiertes immunologisches Reaktionsprodukt, in welchem ein Glied des Produktes irreversibel an ein Lectin und ein anderes Glied des Reaktionsproduktes an eine Markierungsverbindung irreversibel gebunden ist.
12. Reaktionsprodukt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungsverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Enzym, radioaktiven Molekülen und fluoreszierenden Molekülen besteht.

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13. Reaktionsprodukt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es umkehrbar durch das Lectin an einen unlöslich gemachten Zucker auf einer festen Oberfläche gebunden ist, wobei der Zucker selektiv reaktionsfähig mit dem Lectin ist.
14. Reaktionsprodukt zur Verwendung in einem immunologischen Assay, der ein markiertes immunologisches Reaktionsprodukt enthält, in welchem ein Glied des Reaktionsproduktes irreversibel an Zucker und ein anderes Glied des Reaktionsproduktes irreversibel an eine Markierungsverbindung gebunden ist.

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