DE2952373A1 - Verfahren zur bildung eines isolierten immunologischen lectin-konjugates - Google Patents
Verfahren zur bildung eines isolierten immunologischen lectin-konjugatesInfo
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Description
P;PL.-1NQ. J. RICHTER DIPL.- ING. F. WERDERMANN
ZUOEL. VERTRETER BEIM EPA · PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE EPO ■ MANDATAIRES AGREES PRES L1OCB
NEUER WALL IO
3Γ CO 4 O) 3400 4S/3400Sa
TELEGRAMME: INVENTIUS HAMBURe
22. Dezember 1979
OATU M/DATE
PATENTANMELDUNG
PRIORITÄT: entsprechend US-Anmeldung Serial-No. 972 921 vom 26.12.1978
BEZEICHNUNG: Verfahren zur Bildung eines isolierten immunologischen Lectin-Konjugates
ANMELDER: E-Y LABORATORIES, INC., 127 N. Amphlett Boulevard,
San Mateo, Kalif. 94 401 (V.St.A.)
030028/0824
" 2352373
Die Erfindung behandelt die Bildung und Isolierung eines an eine Komponente eines immunologischen Konjugates (wie
beispielsweise ein Antigen oder ein Antikörper) gebundenes Lectin, insbesondere zum Einsatz in Immunoassays.
Zu den gängigen Immunoassayverfahren gehören das sogenannte "Sandwich"-Verfahren oder das konkurrierende Bindungsverfahren.
Typischerweise bringen solche Verfahren verschiedene immunologische Reaktionen mit markierten Antikörpern
oder Antigenen zum Einsatz. Ein diesen Verfahren gemeinsames Problem liegt in der Trennung des gebundenen, markierten
Antigens oder Antikörpers vom Rest des Reaktionsgemisches, das ungebundene, markierte Stoffe enthält. Die Nachteile
der verschiedenen vorbekannten Verfahren zur Erreichung dieses Ziels sind in einer auf der Priorität der US-Anmeldung
Nr. 972 696 vom 26.12.1978 beruhenden deutschen Patentanmeldung auseinandergesetzt.
Von Lectinen ist bekannt, daß sie Rezeptorstellen oder reaktionsfähige Stellen eines hohen spezifischen Ansprechvermögens
für einen bestimmten Zucker oder bestimmte Zuckerarten, jedoch nicht für andere Zuckerarten aufweisen. Es
ist bekannt, daß die zwischen dem Lectin und Zucker gebildete Bindung umkehrbar ist. Der mögliche Vorteil beim
Einsatz dieser Art von Reaktion zur Trennung in einem Immunoassay ist nach dem vorbekannten Stand der Technik
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noch nicht offenbart worden. Statt dessen wurde die Lectin-Zucker-Reaktion
in begrenzter Weise als ein Werkzeug zum biologischen Assay eingesetzt. So ist beispielsweise mit
einem Enzym gekoppeltes Lectin zur selektiven Markierung von Glycoprotein in einer biologisch abgeleiteten Zelle
verwendet worden, wobei anschließend die Enzymmarkierung als ein Maß für das Glycoprotein bestimmt wurde.
Gemäß der Erfindung werden Lectin und eine Komponente eines immunologischen Konjugats fest aneinander gebunden, vorzugsweise
durch kovalente Bindungen, und das Reaktionsprodukt wird aus seinem Reaktionsgemisch, hier als "Kopplungsreaktionsgemisch"
bezeichnet, zum Gebrauch in einem nachfolgenden Immunoassay isoliert. Zu solchen Konjugaten gehören
Antigene, Antikörper oder Teile davon sowie deren Äquivalente (zur Vereinfachung der Beschreibung wird, soweit
keine andere Bezeichnung verwendet wird, Antigen als die eine Komponente eines immunologischen Konjugats
bezeichnet, das an Lectin gebunden ist, und das Bindungsprodukt wird als das "Lectin/Antikörper-Produkt" bezeichnet.
Ein wesentlicher Vorteil dieses Lectin/Antikörper-Produkts ist seine Fähigkeit zur umkehrbaren Bindung an einen speziell
mit ihm reaktionsfähigen Zucker auf einer festen Oberfläche zur Trennung vom Reaktionsgemisch. Danach
ist es durch Vorbeileiten einer Lösung mit einem gleichartigen Zucker längs der festen Oberfläche lösbar. Dadurch
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werden die Nachteile der Spaltung immunologischer Bindungen beseitigt.
Es können verschiedene Verfahren eingesetzt werden, um das Lectin/Antikörper-Produkt aus der Kopplungsreaktionsmischung
zu isolieren. Bei einem ersten Verfahren zur Isolation wird der freie und gebundene Antikörper in
der Kopplungsreaktionsmischung mit unlöslich gemachten Antigenen zur Reaktion gebracht. Dann wird der Rest des
Reaktionsgemisches, der freies Lectin enthält, entfernt. Darauf wird die Bindung zwischen Antigen und Antikörper
aufgebrochen, und der lösliche Anteil wird mit einem Volumen an unlöslich gemachtem Zucker zur Reaktion gebracht.
Der lösliche Anteil, der nicht an das Lectin gebundene Antikörper enthält, wird entfernt. Dann wird
der unlöslich gemachte Zucker mit löslichem Zucker gewaschen, um eine das isolierte Lectin/Antikörper-Produkt
enthaltende Lösung zu bilden. Bei einem alternativen oder zweiten Verfahren zur Isolierung kann die Reihenfolge
der die Antigen/Antikörper-Reaktion und der die Lectin/Zucker-Reaktion betreffenden Schritte vertauscht
werden.
Nach einem dritten Verfahren zur Isolierung wird die Kopplungsreaktionsmischung durch ein Filtrierbett geleitet,
um das Lectin/Antikörper-Produkt vom freien Lectin und freien Antikörpern in Abhängigkeit von der
Zeit aufgrund des jeweiligen Molekulargewichts der Stoffe
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zu trennen. Dann wird das Lectin/Antikörper-Produkt als eine Fraktion vom Rest des Reaktionsgemisches getrennt.
In einem vierten, alternativen Verfahren werden Merkmale des zweiten und dritten Verfahrens eingesetzt. Demnach
wird das Kopplungsreaktionsprodukt mit unlöslich gemachtem Zucker zur Reaktion gebracht, um selektive Lectine
zu binden, und nicht an Lectin gebundene Antikörper werden aus dem unlöslich gemachten Produkt entfernt. Darauf
wird das im Reaktionsprodukt gebundene Lectin durch Herstellung eines Kontaktes mit unlöslich gemachtem Zucker
freigesetzt und durch ein Filtrierbett geleitet, welches das freie Lectin und das Lectin/Antikörper-Produkt
aufgrund des Molekulargewichtes voneinander trennt. Danach ist die Lectin/Antikörper-Fraktion isoliert.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein isoliertes Produkt mit Lectin und einem immunologischen Konzentrat,
insbesondere für ein verbessertes Immunoassay-Verfahren zur Trennung eines markierten immunologischen Reaktiongsproduktes
vom Rest des Reaktionsgemisches durch umkehrbare Bindung an einer Feststoffoberfläche, die Zucker
enthält, und anschließende Freigabe in Lösung zur Messung der Markierung zu schaffen.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich, in der die
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bevorzugten Ausführungsformen im einzelnen als Beispiele
dargelegt sind.
Das Produkt oder die Bindung von Lectin an das immunologische Konjugat nach der Erfindung eignet sich zur Bestimmung
der entsprechenden immunologischen Komponente des Konjugatenpaares. Anders ausgedrückt, schließt der
Begriff "Konjugate" eine Komponente eines jeden Paares
von Substanzen ein, die einander immunologisch binden. Insbesondere schließen die Konjugatpaare Antigene und
ihre Antikörper, biologisch funktionelle Haptene und ihre Antikörper, Enzyme und ihre Substrate, Hormone
und ihre Rezeptoren ein. Die Konjugatkomponenten können
hier im weiteren Sinne als Antigen/Antikörper oder als ihnen gleichwertige Stoffe betrachtet werden. Wie oben
zur Vereinfachung der Beschreibung dargelegt, wird die das immunologische an das Lectin gebundene Konjugat als
Antikörper bezeichnet, sofern nicht anders bestimmt wird. Das isolierte Lectin/Antikörper-Produkt ist besonders
geeignet zur Messung von Antigenen als Bestandteil einer flüssigen Probe, wie insbesondere Blutserum.
Lectine sind Proteine oder Glycoproteine, die eine Spezifizität ihrer Rezeptorstellen für einen bestimmten
Zucker oder bestimmte Zuckerarten, jedoch nicht für andere Zuckerarten aufweisen. So weist Concanvalian A
(Con A) eine Spezifizität oder spezielle Reaktions-
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fähigkeit für oc-D-Glukose und 0(-D-Mannose auf. Wenn
eine Bindungssubstanz wie beispielsweise Glukose kovalent an einem Feststoffgefüge gebunden ist, so wird
Con A auf der Oberfläche gehalten, weil eine Bindungssubstanz aus Glukose eine starke Neigung zur Bindung
mit der Rezeptorstelle von Con A besitzt. Diese Bindung ist umkehrbar. So gibt eine Glukoselösung Con A
von der Oberfläche frei.
Nach der Erfindung ist Lectin nicht umkehrbar an das immunologische Konjugat gebunden, das hier als Antikörper
bezeichnet wird, und zwar durch bekannte Verfahren der kovalenten Bindung. Eine derartige Bindung wird
in geeigneter Weise durch "cross-linking" oder eine Vernetzung oder Verkettung des Lectin mit dem Antigen oder
Antikörper durch ein bifunktionelles Vernetzungsagens ausgeführt. Geeignete bifunktionelle Verbindungen sind
zu finden in Review von K. Peters, F.M. Richards (Ann. Rev. Biochim. 46 (1977) 523). Alkylimidate zeigen ein
hohes Maß an Spezifizität für die ihnen von einem Protein gebotenen Funktionsgruppen. Die Reaktion ist spezifisch
für primäre Aminogrupen. Zu speziellen offenbarten Kopplungsreagentien gehören Amidoester wie beispielsweise
Dimethylmalonimidat, Azide wie Acrylsäure von Tartryldiazid,
das leicht mit Aminogruppen reagiert, um Amid-Bindungen zu erzeugen, ferner Aryldihalogenide (beispielsweise
1,5-Difluoro-2,4,-Dinitrobenzen oder 4,4'-Difluoro-3,3'-Dinitrophenylsulfon),
Anhydrid, gemischtes aromatisches oder aliphatisches Dikarboxyl, N-Hydroxysuccinidester
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und andere bekannte Agentien für das "cross-linking"
oder die Vernetzung. Katalytische Reagentien wie beispielsweise 1-Xthyl-3(3-Dimethylaminopropyl)-Karbodiimidhydrochlorid
kann eingesetzt werden, um kovalente Bindungen zwischen Aminogruppen eines Moleküls und einer Karboxylgruppe
eines anderen zu bilden.
Im wesentlichen sind alle vorstehend genannten Bindungen nicht umkehrbar. Außerdem können bifunktionelle Reagentien
mit funktioneilen Gruppen wie Disulfid oder Glykol verwendet werden. Derartige Bindungen können nach der Vernetzungs-
oder "cross-linking"-Reaktion aufgebrochen werden. Derartige Reagentien schließen Dimethyl-3,3'-Dithiobispropionimidat,
N-(3-Fluoro-4,6-Di(Nitrophenyl)-Zystamin,
Succinimidylpropionimidat, Tartryldiazid, Tartryldi(glycylazid) und Tartryldi(6 -aminocaproylazid)
ein.
Das Lectin/Antikörper-Produkt in isolierter Form eignet sich zu einer Vielzahl von Immunoassay-Verfahren, die
in der erwähnten anderen deutschen Patentanmeldung der Anmelderin ausführlich dargestellt sind. Zu solchen Immunoassay-Verf
ahren gehören homogene oder mit Durchfluß arbeitende konkurrierende Verfahren und homogene oder
mit Durchfluß arbeitende Sandwich-Verfahren; sie sind
besonders geeignet für die Bestimmung multipler Antigene oder Antikörper in einer immunologischen Probe. In der
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erwähnten anderen Anmeldung sind Einzelheiten dieser verschiedenen
Methoden dargestellt, die durch Verweis hier einbezogen sind.
Die umkehrbare Zucker/Lectin-Bindung ergibt den Modus der Trennung des Reaktionsproduktes bei jedem der Immunoassay-Verfahren,
die in dem vorstehenden Absatz angegeben sind. Die ganz besondere Art der Zucker/Lectin-Bindung macht
dieses System besonders vielseitig. Eine Liste von Proben von Lectinen und speziellen Zuckerarten wird nachstehend
als Tabelle I gegeben.
Arachis Hypogaea Agglutinin (PNA) D-GaIjJ (1-*3) -GaINAc
Bauhinia Purpurea Agglutinin (BPA) D-GaINAc, D-GaI
Bendeirea Simplicifolia
Agglutinin (BSA) <X-D-Gal
Canavalia Ensoformis Agglutinin (CON A) ot-D-Man, «-D-Glc.
Dolichos Biflorus Agglutini (DBA) <X-D-GalNAc
Glycine Max (SBA) D-GaI, <x-D-GalNAc
Lens Culinaris (LcH) oc-D-Man. ot-D-Glc
Limulus Polyhemus (LPA) Sialsäure
Lotus Tetragonolobus (Lotus A) «-L-Fucose
Phaseolus Vulgaris (L-PHA) D-GaINAc
Phaseolus Limensis (LBA I) <X-D-GalNAc
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Phaseolus Vulgaris (H-PHA) Pisum Sativum (PEA)
Phytolacca Americana (Pokeweed) Ricinus Conununis (RCA I)
Ricinus Comunis (RCA II) Sophora Japonica (SJA) Triticum Vulgaris (WGA)
Ulex Europeus (UEA I) Ulex Europaeus (UEA II)
Wisteria Floribunda (WFA)
D-GaINAc
<X-D-Man. Of-D-Glc.
<X-D-Man. Of-D-Glc.
/J-D-GaI
/3-D-Gal, D-GaINAc of-D-GalNAc
(β (1-#4)-D-GIcNAc)
(Sialsäure)
Of-L-Fucose
(D-GlacNAc)2 D-GaINAc
(D-GlacNAc)2 D-GaINAc
Isomere der vorstehend aufgeführten Lectine können gleichfalls im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Die vorstehend
genannten Zuckerarten sind diejenigen mit der höchsten Affinität zu dem Lectin. Jedes Lectin kann sich
mit anderen Zuckerarten mit geringerer Affinität binden.
Die vorgenannten Lectine sind fest mit der geeigneten immunologischen Substanz, beispielsweise einem Antigen,
Antikörper oder äquivalentem bifunktionellem Reagens, wie oben dargestellt, gebunden. So kann jede der Substanzen,
die immunologische Konjugate bilden, bei dem Substanzenpaar aus Lectin und einer immunologischen Substanz verwendet
werden.
Beispiele für Antigene, die zum Test auf den entsprechenden Antikörper in einem System eingesetzt werden, sind
die folgenden:
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Albumin
2 Η-Globulin
Cancinoembryo-Antigen
Choriogonadotropein
Heptoglobulin
Hepatitis B - Oberflächen-Antigen
IgE
IgG
IgM
Insulin
Placentales Lactogen
Der Schwangerschaft zugeordnetes Makroglobulin
Virbio Cholerae-exotoxin Lipopolysaccharide
Beispiele für Haptene sind folgende:
Cortisol
östrogene
2,4-Dinitrophenol
Progesteron
1 Thyrotropin
Amphetamin
Barbituat
Methadon
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Benzoylecogonin (Cocain metabolit)
Diphenylhydantoin
Phenobarbital
Primidon
Digoxin
Morphine und Codein
Thyroxin
Beispielsweise können Antikörper gegen die in der folgenden Tabelle aufgeführten Antigene eingesetzt werden:
Amoeben, strain HK-g
Albumin, Serum
Allergens, verschiedene
Carcinoembryo-Antigen
Choriogonadotropin
DNA
Human-IgG, IgM, IgA
Dextran
2,4-dimtrophenol
Echinococcus granulosus
E. CoIi enterotoxin ο und kl Antigene
o(-Fetoprotein
^-Globulin
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IgG myeloma Proteine Immunologlobulin (leichte Ketten)
Hog Choleravirus Onchocera volualus Plosmodium-Arten
Rubella Virus
Salmonellenarten, 0 Antigene Schistosoma mansoni Streptolysin 0 Toxoplasma Gondiu
Trichinella spiralis Trypanosoma Cruzi
Trypanosoma rhodenscense und Trypanosoma Brucei
Vibrio choterae, Exotoxin und Liposaccharid
Im wesentlichen kann das vorliegende Verfahren als eine erste Stufe (in der das Lectin und die Konjugatkomponente,
insbesondere der Antikörper, kovalent gebunden werden) und eine zweite Stufe (zur Isolierung oder Trennung)
aufgefaßt und bezeichnet werden. Das Reaktionsprodukt der ersten Stufe umfaßt Reaktionsanteile, die nicht miteinander
reagiert haben (Lectin, Antikörper und das verkettete oder "cross-linking"-Agens), das gewünschte Lectin/
Antikörper-Reaktionsprodukt und möglicherweise andere Produkte, die durch das höchst reaktionsfreudige Agens zur
Vernetzung ("cross-linking") gebunden werden, wie beispiels-
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-ϋ
weise Antikörper/Antikörper, Lectin/Lectin oder sogar multiple Lectine, die an einen einzigen Antikörper gebunden
sind, oder multiple Antikörper, die an ein einziges Lectin gebunden sind. Wie oben dargelegt, wird dieses
zusammengesetzte Reaktionsprodukt hier als Kopplungsreaktionsmischung bezeichnet. Der Hauptunterschied zwischen
den verschiedenen in dieser Anmeldung dargestellten Verfahren betrifft die zweite Stufe, d.h. die Trennungsoder Isolierstufe.
Bei diesem Verfahren wird die Kopplungsreaktionsmischung zuerst mit dem Antigen in unlöslich gemachter Form gemischt.
Ein solches Antigen ist selektiv immunologisch reaktionsfähig mit dem Antikörper des zu isolierenden
Lectin/Antikörper-Produkts. Es ist ein großer Überschuß des unlöslich zu machenden Antigens vorhanden,und somit
reagieren alle freien Antikörper und Antikörper/Lectin-Produkte mit dem unlöslich gemachten Antikörper und werden
von diesem festgehalten. Dieser Verfahrensschritt wird hier als der immunologische Reaktionsschritt bezeichnet.
Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform dieses immunologischen
Reaktionsschrittes wird das unlösliche Antigen durch kovalente Bindung an eine Festkörper-Oberfläche durch Verfahrensweisen
gebunden, die denen für die kovalente Bin-
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dung des Lectins und des Antikörpers verwendeten Verfahren
ähneln.
Die immunologische Reaktion kann durch Bebrüten des Antigens
und des Antikörpers in einem Gefäß als Chargenreaktion durchgeführt werden. Da jedoch, wo es möglich ist, zieht
man vor, die Eigengeschwindigkeit durch kontinuierliches Durchleiten der Reaktionsmischung durch ein abgegrenztes
Volumen oder Körpervolumen eines unlöslich gemachten Antigens in einem Vakuumbett oder zum Festhalten des Antikörpers
in dem Bett zu beschleunigen. Für eine solche Anwendung mit Durchfluß ist es vorzuziehen, daß die Feststoff
phase, an die das Antigen kovalent gebunden ist, poröse Beschaffenheit aufweist, was den freien Durchtritt
der Lösungen ermöglicht. So kann beispielsweise das Antigen kovalent an ein Bett aus Zellulosefilterpapier gebunden
sein. Es können auch Teilchen in Form von Perlen "verwendet werden, um dem Durchfluß einen geringeren Widerstand
entgegenzusetzen. Solche Perlen können aus Glas, Polystyrol, Schichten aus Polyacrylamidgel, Nylon-6,
Agarose oder anderen Stoffen geformt sein, die in der Lage sind, eine kovalente Bindung mit dem Antigen einzugehen
.
Nach der obigen immunologischen Reaktion wird das unlöslich gemachte Antigen/Antikörper-Produkt vom Rest des
flüssigen Reaktionsgemisches getrennt, das andere Reaktionsprodukte einschließlich freien Lectins enthält. Vorzugs-
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weise wird dieser Trennschritt durch Festhalten des Antikörpers und des Antikörper/Lectin-Produktes auf einer
Säule des unlöslich gemachten Antigens ausgeführt, wogegen der Rest des Reaktionsgemisches als Abfall abgeleitet
werden kann.
Nach der obigen Trennung können die immunologischen Bindungen durch Gebrauch einer schwach sauren (beispielsweise
0,1 M Essigsäure) oder basischen (beispielsweise 3 M Harnstoff) Lösung aufgebrochen werden. Geeignete pH-Bereiche
für diesen Zweck liegen in der Größenordnung von 1 bis 3 und 11 bis 13. Nach dem Aufbrechen der Bindungen und der
Trennung von der Säule wird das Produkt neutralisiert, um nachteilige Auswirkungen auf das Reaktionsvermögen
des Antikörpers zu vermeiden.
Nach dem Aufbrechen der immunologischen Bindungen kann das unlöslich gemachte Antigen gewünschtenfalls für eine
nachfolgende Charge mit dem zu isolierenden Lectin/Antikörper-Produkt wiederverwendet werden. Anders ausgedrückt,
es wird bei diesem Schritt das unlöslich gemachte Antigen regeneriert.
Der von der oben erwähnten Säule entfernte lösliche Anteil ist von Lectin gereinigt worden, kann aber noch freie
Antikörper oder Antikörper/Antikörper-Paare enthalten.
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Um diese Verunreinigungen zu entfernen, wird die Lösung aus dem vorigen Schritt mit unlöslich gemachten Zuckeranteilen
, die selektiv und umkehrbar und dem spezifischen Lectin reaktionsfähig sind, in Kontakt gebracht, um zu
ermöglichen, daß der Zucker mit dem Lectin des Lectin/ Antikörper-Produkts reagiert. Derjenige Anteil des Gemisches,
der nicht mit dem unlöslich gemachten Zucker reagiert und nicht an Lectin gebundene Antikörper enthält,
kann als Abfall abgeleitet werden. In dieser Weise ist das Lectin/Antikörper-Produkt isoliert worden.
Die obige Reaktion mit unlöslich gemachtem Zucker wird vorzugsweise mittels Durchleitung durch ein poröses
Bett aus unlöslich gemachtem Zucker ausgeführt. In bezug auf den Antikörper kann dieselbe Art von Bett angewendet
werden. Der Zucker ist vorzugsweise mittels der vorher genannten bekannten Verfahren kovalent an das Substrat
gebunden. Geeignete Substrate für den Zucker umfassen mit Säure behandelte Agaroseperlen, wie beispielsweise
unter der Handelsbezeichnung Sepharose erhältlich, oder mit Galaktosamin gebundene Agaroseperlen.
Wenn auch der vorstehend genannte, nicht löslich gemachte Zucker/Lectin/Antikörper eine gewisse begrenzte Anwendung
beim Immunoassay finden mag, so ist doch eine Isolierung des Lectin/Antikörper-Produkts in löslicher Form vorzuziehen.
Dies wird ohne weiteres erreicht durch die Durch-
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leitung einer Zuckerlösung desselben Typs wie die unlöslich gemachten Zuckeranteile durch ein begrenztes Volumen davon.
Dies bewirkt ein Abwaschen des Lectin/Antikörpers von dem unlöslich gemachten Zucker durch Umwandlung in eine löslich
gemachte Form. Dann wird der lösliche Lectin/Antikörper-Anteil abgetrennt. Zucker und das überschüssige Agens zum
Vernetzen oder "cross-linking" wird ohne weiteres vom Lectin/Antikörper-Produkt durch herkömmliche Isolationsverfahren
getrennt, wie beispielsweise Dialyse oder Durchlauf durch eine Gel-Filtersäule wie sie unter der Bezeichnung
Sephadex 625 im Handel erhältlich ist.
Die bifunktionellen Kopplungsagentien, die dazu benutzt werden, Lectin und Antikörper miteinander zu koppeln, sind
höchst reaktionsfreudig. Infolgedessen ist es in bestimmten Fällen möglich, daß das Kopplungsagens die mit Zucker
reaktionsfähigen Stellen im Lectin blockiert. Diese Blockierwirkung könnte bewirken, daß Lectin/Antikörper die Säule
mit unlöslich gemachtem Zucker durchlaufen, ohne dort festgehalten zu werden, was möglicherweise zu einem bemerkenswerten
Verlust des Produktes führt.
Um diesen potentiellen Verlust des Produktes möglichst gering zu machen, wird vorzugsweise eine Zucker quelle in die
Lectin/Antikörper-Kopplungsreaktion eingeschlossen, wobei diese mit dem Lectin reaktionsfähig ist. Dieser Zucker
blockiert die für Zucker reaktionsfähigen Stellen während der Kopplung. Nach Abschluß der Kopplungsreaktion wird
der Zucker aus den mit Zucker reaktionsfähigen Stellen des
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Lectins in geeigneter Weise durch Dialyse entfernt.Daran
anschließend wird, wie im Zusammenhang mit dem obigen Trennschritt angegeben, das mit Zucker reaktionsfähige Lectin
mit dem unlöslich gemachten Zucker zur Reaktion gebracht.
Es ist möglich, daß multiple oder Vielfach-Lectine an einen einzigen Antikörper gebunden werden, oder daß multiple
Antikörper an ein einziges Lectin bei der Kopplungsreaktion gebunden werden. Wenn es gewünscht wird, ein außergewöhnlich
reines Produkt mit einem an einen Antikörper gebundenen Lectin zu erzeugen, besteht die Möglichkeit, das
Reaktionsgemisch weiter durch Filterung zu isolieren. Das bedeutet, daß das Produkt aus dem vorhergehenden Isolierverfahren
durch ein Filtrierbett geleitet werden kann, das die Komponenten in Abhängigkeit von der Zeit aufgrund
ihrer jeweiligen Molekulargewichte, Größen und/oder Form zu trennen vermag. Somit kann das Lectin beispielsweise
ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 110 000 und ein Antikörper ein Molekulargewicht in der Größenordnung
von 160 000 haben. Durch Trennung einer Fraktion in der Größenordnung von 270 000 oder weniger werden
multiple Antikörper oder Lectine enthaltende Lectin/Antikörper-Produkte von dem Produkt mit einem einzigen Lectin
und Antikörper getrennt. Dies geschieht in geeigneter Weise durch Gelfiltrierung durch ein Molekularsieb oder
dgl. nach bekannten Verfahrensweisen.
Dieses Verfahren stellt eine Alternative zu dem ersten Ver-
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2/
fahren zur Isolierung dar. Insbesondere wird bei einem ersten Schritt das Kopplungsreaktionsprodukt mit selektiv und umkehrbar
mit dem Lectin im Gemisch reaktionsfähigen, unlöslich gemachten Zuckeranteilen in Kontakt gebracht,
um dazwischen eine umkehrbare Bindung zu bewirken. Somit reagiert der unlöslich gemachte Zucker mit dem freien
Lectin und mit dem Lectin/Antikörper-Produkt. Der die nicht an der Reaktion beteiligten Antikörper und das
Kopplungsreagens enthaltende Rest des Reaktionsgemisches wird als Strom eines löslichen Produktes von dem unlöslich
gemachten Zucker getrennt. Die Form des Zuckers und das Trennverfahren (beispielsweise die Durchleitung
des Produktes durch ein Bett aus unlöslich gemachtem Zucker), sind dieselben wie sie bei dem analogen Schritt
beim ersten Verfahren dargestellt wurden.
Wie bei dem ersten Verfahren ist es vorzuziehen, daß die mit Zucker reaktionsfähigen Stellen des Lectins während
der Kopplungsreaktion geschützt oder blockiert werden, um einen übermäßigen Verlust des Lectin/Antikörper-Produktes
zu vermeiden, das andernfalls an dem unlöslich gemachten Zucker vorbeiströmen würde, ohne festgehalten
zu werden. In diesem Verfahren wird der an solchen reaktionsfähigen Stellen vorhandene Zucker dort vor der
Herstellung des Kontaktes mit dem unlöslich gemachten Zucker entfernt. Wie bei dem ersten Verfahren wird dies
vorzugsweise durch Dialyse des Zuckers vollbracht.
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-2/
(ti
Im nächsten Schritt wird das freie Lectin und das an den unlöslich gemachten Zucker gebundene Lectin/Antikörper-Produkt
von der Feststoffoberfläche durch Durchleitung eines löslichen Zuckers desselben Typs wie der unlöslich
gemachte abgewaschen, was bewirkt, daß das Lectin in eine löslich gemachte Form umgewandelt wird.
Dieses lösliche Zuckerprodukt wird sodann mit unlöslichem Antigen in Kontakt gebracht, das spezifisch immunologisch
reaktionsfähig mit dem Antikörper des Lectin/Antikörper-Produktes ist. Dann läßt man eine immunologische Reaktion
eintreten. Dies ist analog zur immunologischen Reaktion des vorhergehenden Verfahrens. Der Rest des Reaktionsgemisches,
der das nicht an Antikörper gebundene Lectin enthält, wird dann von dem Reaktionsprodukt entfernt.
Im nächsten Schritt wird das unlöslich gemachte Antigen/ Antikörper/Lectin-Produkt Bedingungen zum Aufbrechen der
Bindung zwischen dem Antigen und dem Antikörper unterzogen. Geeignete Bedingungen sind oben angegeben. Sodann
wird das Lectin/Antikörper-Produkt entfernt.
Im wesentlichen stimmt das zweite Verfahren mit dem ersten überein, wobei jedoch die Reihenfolge des immunologischen
Reaktionsschrittes und des Schrittes der Bindung des unlöslich gemachten Zuckers an das Lectin umgekehrt ist.
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In diesem Verfahren wird das Reaktionsprodukt aus der Kopplung des Lectins an den Antikörper in einer höchst
vereinfachten Weise, verglichen mit den vorhergehenden Verfahren, isoliert.
Das Reaktionsgemisch aus der Kopplung des Lectins an den Antikörper wird einer Trennungsbehandlung unterzogen,
die allein auf dem Molekulargewicht beruht. Wie oben angegeben, kann ein typisches Lectin ein Molekulargewicht
von 110 000 haben, während ein typischer Antikörper ein Molekulargewicht von 160 000 besitzt. Somit hat das
gewünschte Lectin/Antikörper-Produkt ein Molekulargewicht von 270 OOO, ein Lectin/Lectin-Produkt 22Ο 000,
und ein Antikörper/Antikörper-Produkt ein solches von 320 000, während multiple Kombinationen von Lectin und
Antikörpern ein höheres Molekulargewicht aufweisen. Somit kann das Produkt durch ein Filtrierbett geleitet
werden, in dem die in der Strömung befindlichen Komponenten des Gemisches in Abhängigkeit von der Zeit aufgrund
ihrer Molekulargewichte voneinander getrennt werden. Anschließend wird die Fraktion, die in diesem Fall dem
gewünschten Molekulargewicht von 270 000 entspricht, unter Ausschluß des Restes des Reaktionsgemisches aus der Strömung
gesammelt.
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Zur Durchführung dieses Verfahrens zur Isolation können herkömmliche Filtrierbetten zur Trennung nach dem Molekulargewicht
eingesetzt werden. So kann beispielsweise das Produkt durch ein Gelfilterbett, wie es unter der
Bezeichnung Sephadex 200 im Handel erhältlich ist, geleitet werden. Außerdem können andere Filtrierbetten vom
Typ des Molekularsiebes verwendet werden.
Zur besseren Isolierung kann das obige Filtrierverfahren
durch einen nachfolgenden Isolierschritt wie folgt ergänzt werden: Die Lectin/Antikörper-Fraktion kann mit
einer Säule aus unlöslich gemachtem Zucker, der mit dem Lectin selektiv und umkehrbar reaktionsfähig ist, in
Kontakt gebracht werden. Auf diese Weise werden der unlöslich gemachte Zucker und das Lectin vom Lectin/Antikörper-Produkt
umkehrbar gebunden. Der Rest der Mischung kann die Säule durchlaufen. Notwendigerweise weist das
Lectin des an die Säule gebundenen Lectin/Antikörper-Produktes eine auf Zucker reaktionsfähige Stelle auf.
Somit beseitigt man alle Lectin/Antikörper als lösliche Fraktion, bei der das Lectin eine reaktionsfähige Stelle
enthält. Dies ist wichtig, wenn das Lectin/Antikörper-Produkt bei nachfolgenden Immunoassay-Verfahren eingesetzt
werden soll.
Wie oben angegeben, ist das Lectin/Antikörper-Produkt vorzugsweise
in löslicher Form vorhanden. Das Lectin/Antikörper-
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-3/- 29523/3
Produkt wird im letztgenannten Schritt von dem unlöslich gemachten Zucker entfernt. Dies geschieht mittels Durchleitung
einer Zuckerlösung durch die Säule und Entfernung des Lectin/Antikörper-Produktes in löslicher Form. Daran
anschließend wird der lösliche Zucker vom Lectin/Antikörper-Produkt beispielsweise durch Dialyse entfernt.
Dieses Verfahren ist eine Variante des zweiten Verfahrens, bei dem das Reaktionsprodukt aus der Kopplung des Lectins
an den Antikörper zuerst, wie oben angegeben, mit dem Schritt der Bindung des unlöslich gemachten Zuckers an
das Lectin behandelt wird. Dann werden das freie Lectin und das an die Säule gebundene Lectin/Antikörper-Produkt
von der Säule mit einer Zuckerlösung abgewaschen, wie oben angegeben.
Der wesentliche Unterschied dieses Verfahrens besteht darin, daß anstelle des immunologischen Reaktionsschrittes eine
Filtrierung dazu verwendet wird, freies"* Lectin und Lectin-Nebenprodukte
zu entfernen. Das bedeutet, daß das von der Säule mit unlöslich gemachtem Zucker abgewaschene Produkt
durch ein Filtrierbett geleitet wird, um das freie Lectin von dem Lectin/Antikörper-Produkt in der Strömung in Abhängigkeit
von der Zeit aufgrund der Differenz der Molekulargewichte beider Produkete zu trennen. Sodann wird das Lectin/
Antikörper-Produkt vom Rest des Reaktionsgemisches getrennt.
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Die vorangehenden herkömmlichen Verfharensweisen zur Ausführung dieser Trennung durch Filtrierung können mit geeigneter
Variation in der Empfindlichkeit des Filtriermediums bezüglich der Unterschiede in den Molekulargewichten eingesetzt
werden.
Das nach dem vorangehenden Verfahren gebildete Produkt ist ein isoliertes lösliches Reaktionsprodukt eines an
eine Komponente eines immunologischen Konjugats gebundenen Lectins. In der vorangehenden Beschreibung ist eine
solche Komponente ein Antikörper. Es können jedoch dafür auch andere immunologische Stoffe wie Antigene, Antikörper,
Teile davon und dazu äquivalente Stoffe eingesetzt werden.
Das vorgenannte Lectinprodukt findet seine besondere Verwendung bei Immunoassay-Verfahren insofern, als es die
einzigartige Fähigkeit der höchst spezifischen und umkehrbaren Bindung an eine oder mehrere Zuckerarten besitzt.
Zur Ausführung dieser Funktion muß das Lectin zumindest eine reaktionsfähige Rezeptorstelle enthalten,
die zuckerspezifisch ist. Daher sind oben Vorkehrungen angegeben, um sicherzustellen, daß derartige reaktionsfähige
Stellen vorhanden sind.
Bei dem Lectin/Antikörper-Produkt nach der Erfindung bedeutet der Begriff "isoliert", daß das Produkt funktionell
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isoliert ist von bedeutsamen Storeinwirkungen von freiem
Lectin oder Antikörpern. So kann es allgemein einen sehr geringen Prozentsatz freien Lectins oder freier Antikör
per einschließen, wie beispielsweise in Höhe von 1 bis 5%, je nach den Anforderungen des Endzweckes des Inununo-
assays. Wenn eine ganz besonders hohe Reinheit gewünscht wird, so können die ausführlichen oben angegebenen Verfahren verwendet werden.
Eine weitere Offenbarung des Wesens der Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele zur Bildung
des isolierten Lectin/Antikörper-Produktes gegeben. Da bei sollen die angegebenen Daten nur als Beispiele dienen
und nicht den Bereich der Erfindung beschränken. Die ge bildeten Produkte können in Immunoassay-Verfahren einge
setzt werden, die in der eingangs erwähnten anderen An meldung der Anmelderin offenbart sind und hier durch
Verweis einbezogen werden.
5 mg gereinigtes PNA (Lectin) wird in 1 ml einer Puffer lösung aufgelöst, die 0,1 M Laktose, 0,1 M Phosphatpuffer
pH 7,2, O,15 M Natriumchlorid und 5 mg von Ziegen/Anti-
hum IgG-Antikörpern enthält, und 10 bis 20 Mikroliter
eines Kopplungsagens (redestilliertes Glutaraldehyd) werden zugefügt. Diese Mischung wird eine Stunde lang
bei Zimmertemperatur bebrütet. Es erfolgt eine Dialyse gegen 1 1 einer mit 0,1 M Phosphat gepufferten Salzlösung.
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r3<r
Dann wird es durch eine Säule mit Agaroseperlen geleitet, die an Galactose-(1-K3)N-Azetylgalactosamin gebunden sind
und eine Spezifizität zum Festhalten von PNA und PNA-Antikörpern in Säulengefüge besitzen. Die Säule wird gewaschen,
2 Dq
bis die OD -Messung 0,050 ergibt. Dann wird der PNA-Komplex aus der Säule ausgespült durch Verwendung eines
bestimmten Zuckers, wie beispielsweise einer Lösung von 0,5 M Laktose, und dann über eine zweite Säule geleitet,
die mit Human-IgG gekoppelte Agaroseperlen enthält. Die PNA-Antikörper werden aus dem Gefüge durch Verwendung
von Essigsäure (mit 0,1 M) oder 3 M Natriumisothiocyanat oder anderen Reagentien gelöst. Der Komplex wird einer
ausgedehnten Dialyse gegen eine Phosphat-Puffersalzlösung unterzogen. Die ausgewaschene Lösung wird konzentriert
und durch eine Gel-Filtriersäule (Typ Sephadex G 200) geleitet, welche die Bestandteile nach dem Molekulargewicht,
der Größe und/oder der Form trennt. (Es wird die Fraktion gesammelt, die einem Molekulargewicht eines
Lectin/Antikörper-Paares in einem Bindungsverhältnis von 1 : 1 entspricht)
Ein Milliliter einer Phosphat-Puffersalzlösung pH 7,2
mit einem Gehalt von 1 mg PNA wird gemischt mit 2 ml Galaktose (1 -»3) N-Azetylgalaktosamin oder einer für
PNA-Bindung spezifischen Matrix aus mit Laktose verkette-
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ten Agaroseperlen. Es wird Glutaraldehyd hinzugefügt und das Gemisch 1 bis 6 Stunden lang bebrütet. Das Gel
wird in einem Filterrohr aus gesintertem Glas mit PBS gewaschen, über Nacht wird dieses Gel in einer Lösung
von 1 mg Ziegen-Antihuman-IgG-Antikörpern suspendiert.
Die Perlen werden mit PBS gewaschen, und dann mit 0,1 M spezifischer Zuckerlösung gewaschen, um Lectin/Antikörper-Komplexe
aus dem Gefüge freizusetzen. Die Auswaschung wird gesammelt und über eine Säule geleitet, die an Human-IgG gekoppelte
Agaroseperlen enthält. Der Rest des Verfahrens ist wie beim Ausführungsbeispiel 1.
5 mg lyophilisiertes oder gefriergetrocknetes PNA-Pulver#
5 mg einer Immunoglobulinfr.aktion von Kaninchen-Antidigoxin-Antiserum
und 5 mg gereinigte D-Galaktose oder Laktose werden in 0,1 M Phosphat-Puffersalzlösung, pH
7,2, aufgelöst. Diesem Gemisch werden 1 bis 5 Mikroliter von 50%-igem Glutaraldehyd beigefügt. Dieses Gemisch wird
eine Stunde lang bei Raumtemperatur bebrütet und auf eine Säule gegeben, die mit Säure behandelte Agaroseperlen oder
kovalent an 2-Amino-2-deoxy-Galaktopyranoxid gebundene Agaroseperlen enthält (Nahezu der gesamte PNA und PNA-Antikörper
werden im Feststoffgefüge in der Säule festgehalten) . Dieser Säule wird eine 0,2 M-Galaktose- oder
Laktoselösung zugefügt. Die einzelne, PNA und die Konjugate
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enthaltende Spitze erscheint aus der Auswaschung. Diese Fraktion wird auf 0,5 ml konzentriert und durch eine Säule
mit 0,1 χ 1OO cm geleitet, die Sephadex G 200 enthält. Da das Molekulargewicht der Kombination PNA-Antikörper
über 2OO 0OO liegt, wird das nicht an der Reaktion beteiligte PNA von den PNA/Antikörper-Konjugaten getrennt.
Die Bedingung für diese Reinigung kann proportional erweitert werden, wenn eine große Zubereitung erforderlich
ist.
Ein Lectin wird kovalent an ein immunologisches Konjugat,
wie z.B. ein Antikörper/Antigen oder seine Äquivalente,
gebunden. Danach wird das Lectin-Konjugat von der Reaktionsproduktmischung
durch eines von einer Anzahl alternativer Verfahren, zu dem ein oder mehrere der folgenden Reaktionsarten gehören, isoliert: (1) Umkehrbare Reaktion des Lectins
mit einem unlöslich gemachten Zucker zwecks Isolierung des Lectins aus dem Rest der Mischung; (2) Reaktion einer
immunologischen Komponente (beispielsweise Antikörper), die an das Lectin gebunden ist, mit einer unlöslich gemachten
entsprechenden Komponente (beispielsweise Antigen) zwecks Trennung der Antikörperkomponenten von dem Rest des
Reaktionsgemischs; und (3) Filtration der Reaktionskomponenten zwecks Trennung aufgrund des Molekulargewichts,
der Größe und/oder des Form der Produktkomponenten.
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Claims (9)
- DIP L.-IN G. J. RICHTER PATENTANWÄLTEDIPL-ING. F. WERDERMANNZUSEt-. VCRTRCTCB BEIM EPA · PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE EPO · MANDATAIRES AGREES PRES L1OEBD-2OOO HAM BURG 36NEUER WALL IO® (O 4 O) 34 OO 43/34 OO Οβ TELEGRAMME: INVENTIUS HAMBURSIHR ZEICHEN/VOUR FiLEUNSER ZEICHEN/OUR FILE E . 1 862-I~796O4DATU M/DATEPatentansprüche1· Verfahren zur Bildung eines isolierten Reaktionsproduktes eines an eine Komponente eines immunologischen Konjugates gebundenen Lectins, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:(a) Herbeiführung einer Reaktion des Lectins und einer Konjugatkomponente zur Bildung einer Bindung zwischen dem Lectin und der einen Konjugatkomponente, gemischt mit der nicht in Reaktion gegangenen freien einen Konjugatkomponente und freiem Lectin in einem flüssigen Reaktionsgemisch;(b) Herbeiführung einer immunologischen Reaktion der freien und gebundenen einen Konjugatkomponente im Reaktionsgemisch mit seiner entsprechenden Konjugatkomponente in unlöslich gemachter Form;030028/0824ORIGINAL INSPECTED(c) Trennung des unlöslich gemachten, beim Schritt (b) gebildeten immunologischen Reaktionsproduktes vom Rest des freies Lectin enthaltenden flüssigen Reaktionsgemisches;(d) Aufbrechen der immunologischen Bindungen in dem immunologischen Reaktionsprodukt zur Bildung einer die eine Konjugatkomponente frei und löslich sowie gebunden enthaltenden Lösung;(e) Trennung der löslichen und unlöslichen Anteile aus dem Schritt (e) ;(f) Herstellung eines Kontakts zwischen dem getrennten löslichen Anteil aus (e) mit unlöslich gemachten Zuckeranteilen (sugar moieties), die selektiv und reversibel mit dem Lectin reaktionsfähig sind, um zu ermöglichen, daß der Zucker und das Lectin in der Bindung aus Lectin und der einen Konjugatkomponente miteinander reagieren ; und(g) Trennung des unlöslich gemachten Reaktionsproduktes aus Zucker, Lectin und der einen Konjugatkomponente vom Rest der die eine Konjugatkomponente frei und löslich enthaltenden Lösung.
- 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem die Schritte der Herstellung des Kontaktes des unlöslich gemachten Reaktionsproduktes aus030023/0824Zucker, Lectin und der einen Konjugatkomponente mit einem löslichen Zucker desselben Typs wie die unlöslich gemachten Zuckeranteile (sugar moieties) umfaßt, um zu bewirken, daß die Bindung aus Lectin und der einen Konjugatkomponente mit dem löslichen Zucker reagieren zur Umwandlung in eine lösliche Form, und daß danach die löslichen und unlöslichen Reaktionsprodukte in verschiedene Fraktionen getrennt werden.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor oder während des Schrittes (a) das Lectin mit löslichen, selektiv und reversibel mit diesem Lectin reaktionsfähigem Zucker zur Blockierung einer mit Zucker reaktionsfähigen Stelle beim Schritt (a) zur Reaktion gebracht wird, und daß vor dem Schritt (f) der Zucker aus dem löslichen Anteil entfernt wird.
- 4. Verfahren zur Bildung eines isolierten Reaktionsproduktes eines an eine Komponente eines immunologischen Konjugats gebundenen Lectins, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:(a) Herbeiführung einer Reaktion des Lectins und einer Konjugatkomponente zur Bildung einer Bindung zwischen dem Lectin und der einen Konjugatkomponente, gemischt mit der nicht in Reaktion gegangenen freien einen Konjugatkompo-030028/0824nente und freiem Lectin in einem flüssigen Reaktionsgemisch;(b) Herstellung des Kontakts des Reaktionsgemisches aus (a) mit unlöslich gemachten Zuckeranteilen, die selektiv und umkehrbar reaktionsfähig mit dem Lectin im Reaktionsgemisch sind zwecks Schaffung einer umkehrbaren Bindung zwischen diesen unter Bildung von Bindungen aus dem Zuckeranteil und freiem Lectin und zwischen dem Zuckeranteil, dem Lectin und der einen Konjugatkomponente;(c) Trennung des unlöslich gemachten, beim Schritt (b) gebildeten Anteils und der Bindung aus dem Zuckeranteil und Lectin vom Rest des Reaktionsgemisches;(d) Herstellung eines Kontaktes zwischen dem unlöslich gemachten Anteil mit der Bindung aus dem Zuckeranteil aus (c) mit einem löslichen Zucker desselben Typs wie der - unlöslich gemachte Zucker, um eine Umwandlung des Lectinprodukts in eine löslich gemachte Form zu bewirken;(e) Trennung des löslichen und des unlöslichen Produktes aus (d) in verschiedene Fraktionen;(f) Herstellung des Kontaktes der löslichen Fraktion aus (e) mit einer unlöslichen Konjugatkomponente, die der genannten einen Konjugatkomponente entspricht, zur Herbeiführung einer immunologischen Reaktion zwischen der einen und der entsprechenden Konjugatkomponente;030028/0824(g) Trennung des unlöslich gemachten Reaktionsproduktes vom Rest des freies Lectin enthaltenden flüssigen Reaktionsgemisches;(h) Aufbrechen der immunologischen Bindungen in dem immunologischen Reaktionsprodukt; und(i) Rückgewinnung der isolierten Bindung von Lectin und der einen Konjugatkomponente.
- 5. Verfahren zur Bildung eines isolierten Reaktionsproduktes eines an eine Komponente eines immunologischen Konjugats, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:(a) Herbeiführung einer Reaktion des Lectins und einer Konjugatkomponente zur Bildung einer Bindung zwischen dem Lectin und der einen Konjugatkomponente, gemischt mit der nicht in Reaktion gegangenen freien einen Konjugatkomponente und freiem Lectin in einem flüssigen Reaktionsgemisch;(b) Durchleitung des flüssigen Reaktionsgemisches als Strömung durch ein Filterbett zur Trennung der Bindung des Lectins mit der einen Konjugatkomponente von dem freien Lectin und der einen Konjugatkomponente in der Strömung in Abhängigkeit von der Zeit aufgrund ihrer jeweiligen Molekulargewichte, Größen und/oder Formen; und030028/0824(c) Trennung der Bindung aus Lectin und der einen Konjugatkomponente als Fraktion vom Rest des Reaktionsgemisches.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit der Bindung aus Lectin und der einen Konjugatkomponente mit unlöslich gemachtem, selektiv und umkehrbar mit dem Lectin reaktionsfähigen Zucker in Berührung gebracht wird, um zu ermöglichen, daß der Zucker und das Lectin aus der Bindung von Lectin mit der einen Konjugatkomponente miteinander reagieren, und die unlöslich gemachte Bindung aus Zucker, Lectin und der einen Konjugatkomponente vom Rest der Fraktion getrennt wird.
- 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem die Schritte der Herstellung des Kontaktes des unlöslich gemachten Produkts aus Zucker, Lectin und der einen Konjugatkomponente und einem löslichen Zucker desselben Typs wie der genannte unlöslich gemachte Zucker umfaßt, um zu bewirken, daß die Bindung aus Lectin und der einen Konjugatkomponente mit dem löslichen Zucker zur Umwandlung in eine lösliche Form reagiert, und daß die löslichen und unlöslichen Produkte in verschiedene Fraktionen getrennt werden.
- 8. Verfahren zur Bildung eines isolierten Reaktionsproduktes eines an eine Komponente eines immunologischen030028/0824Konjugats gebundenen Lectins, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:(a) Herbeiführung einer Reaktion des Lectins und einer Konjugatkomponente zur Bildung einer Bindung zwischen dem Lectin und der einen Konjugatkomponente, gemischt mit der nicht in Reaktion gegangenen freien einen Konjugatkomponente und freiem Lectin in einem flüssigen Reaktionsgemisch;(b) Herstellung des Kontaktes des Gemisches aus der Reaktion von (a) mit unlöslich gemachten Zuckeranteilen, die selektiv und umkehrbar reaktionsfähig mit dem Lectin in dem Gemisch sind, um eine umkehrbare Bindung zwischen diesen herbeizuführen, unter der Bildung von Bindungen zwischen dem Zuckeranteil und freiem Lectin und zwischen dem Zuckeranteil, Lectin und der einen Konjugatkomponente;(c) Trennung des Anteils mit der unlöslich gemachten, beim Schritt (b) gebildeten Bindung aus dem Zuckeranteil und Lectin vom Rest des Reaktionsgemische s;(d) Herstellung des Kontaktes zwischen dem Anteil mit der unlöslich gemachten Bindung aus dem Zuckeranteil und Lectin aus (c) mit einem löslichen Zucker desselben Typs wie der genannte030028/0824unlöslich gemachte Zucker zur Umwandlung des Lectinproduktes in eine löslich gemachte Form;(e) Trennung des löslichen und des Unlöslichen Produktes aus (d) in verschiedene Fraktionen;(f) Durchleitung der löslichen Fraktion aus (e) durch ein Filterbett zur Trennung des freien Lectins und der Bindung aus Lectin und der einen Konjugatkomponente in der Strömung in Abhängigkeit von der Zeit aufgrund der jeweiligen Molekulargewichte, Größen und Formen; und(g) Trennung der Bindung aus Lectin und der einen Konjugatkomponente vom Rest des Reaktionsgemisches.
- 9. Isoliertes lösliches Reaktionsprodukt mit einem kovalent an eine Komponente eines immunologischen Konjugats gebundenen Lectin, dadurch gekennzeichnet, daß das Lectin zumindest eine reaktionsfähige Stelle mit spezifischer Ansprechbarkeit (specificity) für zumindest einen Zucker einschließt, und daß die eine Komponente aus der aus Antigen, Antikörpern und Teilen oder Äquivalenten davon ausgewählt ist.030028/0824
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