ES2748583T3 - Proteínas de unión al receptor Fc - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-FcRn aislado que comprende una región variable de la cadena ligera (VL) y una región variable de la cadena pesada (VH), en el que el anticuerpo se une a FcRn humano; en el que La VL comprende: (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO:14); (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos GDSQRPS (SEQ ID NO:15); y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13); y La VH comprende: (i) una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos EYAMG (SEQ ID NO:22); (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos SIGSSGGQTKYADSVKG (SEQ ID NO:23); y (iii) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos LAIGDSY (SEQ ID NO:24) Y en el que el anticuerpo anti-FcRn se une a FcRn humano con una constante de disociación (Kd) de menos de nM como se mide por resonancia de plasmón superficial en solución salina con tampón fosfato a pH 7,2 a 30ºC.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión al receptor Fc

Campo de la invención

El campo de la invención se refiere a proteínas que se unen al receptor Fc.

Antecedentes de la invención

El isotipo de anticuerpo más abundante en el suero es IgG y tiene un papel crítico en la mediación de la protección frente a patógenos además de en la mediación de respuestas alérgicas e inflamatorias que aceleran el reclutamiento de los componentes del sistema inmune a los tejidos, mucosas y superficies dérmicas (Junghans, Immunologic Research 16(1 ):29 (1997)). Además, es también un componente clave de una variedad de enfermedades autoinmunes. En condiciones normales, la vida media de IgG en el suero está en el intervalo de 5-7 días en ratones y 22-23 días en humanos, que es un periodo prolongado, respecto a la vida media en suero de otras proteínas en plasma. En parte, esto se da porque el receptor de FcRn neonatal (FcRn) rescata la IgG pinocitosada de los lisosomas degradativos y lo recicla de nuevo al compartimiento extracelular (Junghans y Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5512 (1996), Roopenian et al. J. Immunology 170:3528 (2003)).

FcRn se une a la porción Fc de IgG. La interacción entre la región Fc de IgG y FcRn es dependiente del pH. Tras la entrada en las células por endocitosis en fase fluida, IgG es secuestrado en los endosomas y se une a FcRn con alta afinidad a pH ácido (6~6,5); cuando el complejo IgG-FcRn se cicla a la membrana plasmática, IgG se disocia rápidamente del FcRn en la corriente sanguínea a pH ligeramente básico (~7,4). Mediante este mecanismo de reciclaje mediado por el receptor, el FcRn rescata de forma efectiva a la IgG de la degradación en los lisosomas, prolongando así la vida media de la IgG circulante.

FcRn es un heterodímero no covalente que se encuentra típicamente en los endosomas de células endoteliales y epiteliales. Es un receptor unido a la membrana con una transmembrana de paso único que tiene tres dominios alfa de cadena pesada (a1, a2 y a3) y un único dominio de microglobulina p2 (p2M) de cadena ligera soluble. De forma estructural, pertenece a una familia de moléculas de complejo mayor de histocompatibilidad de clase 1 que tienen p2M como una cadena ligera común. La cadena a de FcRn es una proteína de 46 kD compuesta de un dominio extracelular que contiene los dominios de cadena pesada a1, a2 y a3, una región transmembrana y una cola citoplasmática relativamente corta (Burmeister et al. Nature 372:366 (1994)).

El FcRn se identificó primero en el intestino de rata neonatal, donde funciona para mediar la absorción de anticuerpo IgG procedente de leche materna y facilita su transporte al sistema circulatorio (Leach et al. J Immunol 157:3317 (1996)). El FcRn se ha aislado también de placenta humana, donde también media la absorción y transporte de la IgG materna a la circulación fetal. En adultos, el FcRn se expresa en un número de tejidos, que incluyen tejidos epiteliales del pulmón, intestino, riñón, además de superficies nasales, vaginales y trenza biliar (Patentes de EE.UU. núms. 6.030.613 y 6.086.875; Israel et al. Immunology 92:69 (1997); Kobayashi et al. Am J Physiol (2002); Renal Physiol 282:F358 (2002)).

Para estudiar las contribuciones de FcRn a la homeostasis de IgG, se han diseñado ratones de manera que al menos parte de los genes que codifican las cadenas pesadas de p2M y FcRn se han “desactivado” de manera que estas proteínas no se expresan (publicación internacional WO 02/43658; Junghans y Anderson, Proc Natl Acad Sci US 93:5512 (1996)). En estos ratones, la vida media en suero y las concentraciones de IgG se redujeron dramáticamente, sugiriendo un mecanismo dependiente de FcRn para la homeostasis de IgG.

Se ha sugerido también que pueden generarse anticuerpos de FcRn anti-humanos en estos ratones desactivados en FcRn y que estos anticuerpos pueden evitar la unión de IgG a FcRn. Sin embargo, dichos anticuerpos no se han generado o probado (publicación internacional WO 02/43658).

La inhibición de la unión de IgG a FcRn altera de forma negativa la vida media en suero de IgG evitando el reciclado de IgG. Se ha mostrado que este principio es terapéuticamente efectivo en un modelo de ratón de enfermedades bullosas cutáneas autoinmunes (Li et al. J Clin Invest 115:3440-3450 (2005)). Por consiguiente, los agentes que bloquean o antagonizan la unión de IgG a FcRn pueden usarse en un método para tratar o prevenir enfermedades autoinmunes e inflamatorias o trastornos caracterizados por la presencia de anticuerpos IgG regulados de forma inapropiada. Un anticuerpo monoclonal de FcRn anti-rata antagonista (mAb)1G3 evitó con éxito la Miastenia grave autoinmune experimental (MGAE) en un modelo pasivo de rata a una dosis de 30 mg/kg; que es aproximadamente 100 veces menor que la IgG intravenosa (IGIV) usada en el tratamiento de MG, LES, e ITP. Además, los ratones deficientes en FcRn predispuestos genéticamente a desarrollar un trastorno autoinmune como lupus o artritis tienen una reducción significativa en la gravedad de la enfermedad.

Compendio de la invención

La invención proporciona un anticuerpo anti-FcRn aislado que comprende una región variable de cadena ligera (V^l) y una región variable de cadena pesada (V^h), en el que el anticuerpo se une al FcRn humano; en el que la V^l comprende:

(i) una CDR1 de V^l que comprende la secuencia de aminoácidos TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO:14);

(ii) una CDR2 de V^l que comprende la secuencia de aminoácidos GDSQRPS (SEQ ID NO:15); y

(iii) una CDR3 de V^l que comprende la secuencia de aminoácidos SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13); y

La V^h comprende:

(i) una CDR1 de V^h que comprende la secuencia de aminoácidos EYAMG (SEQ ID NO:22);

(ii) una CDR2 de V^h que comprende la secuencia de aminoácidos SIGSSGGQTKYADSVKG (SEQ ID NO: 23); y (iii) una CDR3 de V^h que comprende la secuencia de aminoácidos LAIGDSY (SEQ ID NO:24) y en la que el anticuerpo anti-FcRn se une al FcRn humano con una constante de disociación (Kd) de menos de 10 nM como se mide por resonancia del plasmón superficial en solución salina de tampón fosfato a pH 7,2 a 30°C.

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones y cualquier realización que no cae dentro de las reivindicaciones se proporciona solo por información.

La presente descripción proporciona anticuerpos aislados que se unen al receptor Fc humano, ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos, y métodos de uso de estos anticuerpos para detectar la presencia de FcRn, modular la actividad del receptor de Fc y tratar trastornos autoinmunes.

Por consiguiente, un aspecto de la presente descripción presenta un anticuerpo aislado que se une a FcRn humano. Este anticuerpo anti-FcRn comprende una región variable de cadena ligera (V^l) que comprende una región CDR1 de V^l, una CDR2 de V^l y una CDR3 de V^l, en la que la región CDR3 de V^l tiene al menos una homología de 85% (p.ej., 90% o 95%) con la región CDR3 de V^l de SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13). Opcionalmente, las CDR1 de V^l y CDR2 de V^l del anticuerpo anti-FcRn tienen una homología de al menos 85% (p.ej., al menos 90% o 95%) con la región CDR1 de V^l TG^t G^s DVGSYNLVS (SEQ ID NO:14) y la región CDR2 de V^l GDSQRPS (SEQ ID NO:15), respectivamente. El anticuerpo anti-FcRn no tiene una cisteína en la primera posición de al menos una región CDR3, p.ej., al menos una de las regiones CDR3 de V^l.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FcRn descrito anteriormente comprende una CDR1 de V^l que tiene al menos homología al 90% con TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO:14), una CDR2 de V^l que tiene al menos homología al 90% con GDSQRPS (SEQ ID NO:15), y/o una CDR3 de V^l que tiene al menos homología al 90% con SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13). En un ejemplo, el anticuerpo anti-FcRn comprende la región CDR1 de V^l TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO:14), la región CDR2 de V^l GDSQRPS (SEQ ID NO:15), y/o la región CDR3 de V^l SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13).

En otras realizaciones, el anticuerpo anti-FcRn aislado descrito en la presente memoria comprende una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos homología al 85% (p.ej., al menos 90%, 95% o 98%) con SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11. En un ejemplo, la V^l del anticuerpo aislado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.10 o SEQ ID NO:11.

Otro aspecto de la presente descripción describe un anticuerpo anti-FcRn aislado que comprende una región variable de cadena ligera (V^l) que comprende una región CDR1 de V^l, una CDR2 de V^l y una CDR3 de V^l, en la que la región CDR3 de V^l tiene hasta 3 sustituciones de aminoácidos en comparación con la siguiente secuencia: SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13), y en la que el anticuerpo aislado no tiene una cisteína en la primera posición de al menos una región CDR3 p.ej., al menos una de las regiones CDR3 de V^l. Opcionalmente, la CDR1 de V^l, CDR2 de V^l y CDR3 de V^l del anticuerpo anti-FcRn, de forma colectiva, contiene hasta 10 sustituciones de aminoácidos en comparación con las siguientes secuencias

(a) CDR1: TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO:14)

(b) CDR2: GDSQRPS (SEQ ID NO:15)

(c) CDR3: SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13).

Cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn descritos anteriormente puede comprender además una región variable de cadena pesada (V^h) que comprende una CDR1 de V^h, una CDR2 de V^h y una CDR3 de V^h, en la que la CDR3 de V^h tiene al menos una homología del 85% (p.ej., al menos 90% o 95%) con LAIGDSY (s Eq ID NO:24). Opcionalmente, la CDR1 de V^h y CDR2 de V^h del anticuerpo anti-FcRn tiene al menos una homología del 85% (p.ej., al menos 90% o 95%) con EYAMG (SEQ ID NO:22) y SIGSSGGQTKYADSVKG (SEQ ID NO:23), respectivamente.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FcRn comprende una CDR1 de V^h que tiene al menos una homología al 90% con EYAMG (SEQ ID NO:22), una CDR2 de V^h tiene al menos homología al 90% con SIGSSGGQTKYADSVKG (SEQ ID NO:23), y/o una CDR3 de VH tiene al menos homología al 90% con LAIGDSY (SEQ ID NO:24). En un ejemplo, el anticuerpo anti-FcRn comprende la región CDR1 de V^h EYAMG (SEQ ID NO:22), la región CDR2 de V^h SIGSSGGQTKYADSVKG (SEQ ID NO:23), y/o la región CDR3 de V^h LAIGDSY (SEQ ID NO:24).

En otras realizaciones, el anticuerpo anti-FcRn descrito en la presente memoria comprende una VH que comparte al menos el 85% (p.ej., al menos el 90%, 95% o 98%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO:9. En un ejemplo, la VH del anticuerpo aislado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un anticuerpo anti-FcRn aislado que comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada (V^h) y una región constante de cadena pesada, en la que la V^h comprende una región CDR3 que tiene al menos una homología del 85% (p.ej., al menos 90% o 95%) con LAIGDSY (SEQ ID NO:24) y la región constante tiene una supresión en la posición que corresponde al residuo de lisina C-terminal de SEQ ID NO:17. En algunos ejemplos, la variable de cadena pesada de este anticuerpo anti-FcRn comprende además una CDR1 de V^h y una CDR2 de V^h, que tienen al menos una homología del 85% (p.ej., al menos 90% o 95%) con EYAMG (SEQ ID NO:22) y SIGSSGGQTKYADSVKG (SEQ ID NO:23), respectivamente. En otros ejemplos, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo anti-FcRn comprende la secuencia de aminoácidos de ^s E^q ID NO:26.

El anticuerpo anti-FcRn descrito anteriormente puede comprender además una región variable de cadena ligera (V^l) que comprende una CDR3 de V^l al menos idéntica al 85% (p.ej., al menos 90% o 95%) a la de DX-2504 (CSYAg Sg IYV; SEQ ID NO:25) y, opcionalmente, una CDR1 de V^l al menos idéntica al 85% (p.ej., al menos 90% o 95%) TGTGSDVGSYNLVS (SeQ ID NO:14) y una CDR2 de V^l al menos idéntica al 85% (p.ej., al menos 90% o 95%) a GDSQRPS (SEQ iD NO:15). En un ejemplo, el anticuerpo anti-FcRn comprende la región CDR1 de V^l TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO:14), la región CDR2 de V^l GDSQRPS (SEQ ID NO:15), y/o la región CDR3 de V^l CSYAGSGIYV (SEQ ID NO:25), SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13). En otro ejemplo, la V^l del anticuerpo anti-FcRn comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.

Cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn descritos anteriormente pueden unirse al FcRn humano con una constante de disociación (KD) de menos de 10 nM. Los anticuerpos anti-FcRn proporcionados en la presente descripción pueden ser anticuerpos humanos o humanizados, o no inmunogénicos en un humano. Por ejemplo, pueden comprender una región estructural de anticuerpos humanos. De forma alternativa, los anticuerpos anti-FcRn pueden ser anticuerpos murinos. En otros ejemplos, pueden ser anticuerpos quiméricos.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FcRn proporcionados en la presente memoria son anticuerpos de longitud completa (que comprenden un dominio Fc). De forma alternativa, pueden ser fragmentos de unión a antígeno tales como Fab, F(ab)’2, Fv o ScFv. Cuando se desee, los anticuerpos anti-FcRn son anticuerpos monoclonales.

También se describen en la presente memoria (i) una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable, (ii) un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, (iii) un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, y (iv) una célula huésped que comprende el vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria.

Cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn descritos en la presente memoria pueden usarse para detectar la presencia de un FcRn o modular la actividad de un FcRn, o in vivo o in vitro.

En un aspecto, se proporciona en la presente memoria un método de detección de un FcRn en una muestra, comprendiendo el método: poner el contacto la muestra con cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, y detectar una interacción entre el anticuerpo y el FcRn si está presente.

En otro aspecto la presente descripción proporciona un método de detección de un FcRn en un sujeto, comprendiendo el método: administrar al sujeto cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, que pueden conjugarse con una molécula detectable tal como una etiqueta de formación de imágenes (fluorescente o radioactiva), y detectar una interacción entre el anticuerpo y el FcRn si está presente.

En aún otro aspecto, la presente descripción proporciona un método de modulación de la actividad de un FcRn, comprendiendo el método: poner en contacto un FcRn con cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria modulando así la actividad del FcRn.

En un aspecto los anticuerpos de la invención pueden usarse en un método de tratamiento de un trastorno autoinmune o modular la vida media/niveles de IgG circulante en un sujeto, comprendiendo el método: administrar al sujeto cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria en una cantidad efectiva para tratar el trastorno autoinmune o modular la vida media/niveles de IgG circulante en el sujeto.

También dentro del alcance de la presente descripción están (a) composiciones farmacéuticas para el uso en la modulación de la actividad de un FcRn, que modulan la vida media/niveles de IgG circulante y/o que tratan un trastorno autoinmune en un sujeto que lo necesita, en el que cada composición farmacéutica comprende uno de más de los anticuerpos anti-FcRn descritos en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable, (b) el uso de cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn descritos en la presente memoria para cualquiera de los propósitos recién anotados, y (c) el uso de cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn para la fabricación de un medicamento para la modulación de la actividad de FcRn, la modulación de la vida media/niveles de IgG circulante, y/o el tratamiento de un trastorno autoinmune en un sujeto (p.ej., un paciente humano).

Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se describen en mayor detalle a continuación.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras son ilustrativas solo y no se necesitan para la capacitación de la invención descrita en la presente memoria.

La Figura 1 muestra un análisis de Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532A-X54-B03;

La Figura 2 muestra un análisis SDS-PAGE de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532A-X54-B03;

La Figura 3 muestra la estabilidad por temperatura de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532A-X54-B03;

La Figura 4 muestra la estabilidad por pH de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532A-X54-B03;

La Figura 5 muestra la estabilidad a pH 8,3 de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532A-X54-B03;

La Figura 6 muestra la estabilidad respecto a la desnaturalización química de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532A-X54-B03;

La Figura 7 muestra el análisis cinético de la interacción de hFcRn a pH 6 con DX-2504, 532A-X53-C02 y 532A-X54-B03 inmovilizados;

La Figura 8 muestra el análisis cinético de la interacción a pH 7,5 de hFcRn con DX-2504, 532A-X53-C02 y 532A-X54-B03 inmovilizados;

La Figura 9 muestra las secuencias de DX2504 (SEQ ID NO:8), 532A-X53-C02 (SEQ ID NO:10) y 532A-X54-B03 (SEQ ID NO:11).

La Figura 10 muestra las distribuciones de longitud de H-CDR3 de anti-hFcRn frente a Fab-310.

La Figura 11 muestra dos gráficos que caracterizan algunas de las propiedades de proteínas de unión a anti-FcRn seleccionadas.

La Figura 12 muestra el efecto de anticuerpos anti-FcRn en el catabolismo de hIgG en ratones TG32B.

La Figura 13 muestra concentraciones en suero de DX-2504 y DX-2507 administradas a monos cinomolgos.

La Figura 14 muestra los niveles de IgG en monos cinomolgos después de la administración de DX-2504 y DX-2507. Descripción detallada de la invención

Se describen en la presente memoria anticuerpos aislados capaces de unirse a FcRn humano y usos de los mismos en la detección de la presencia de FcRn, modulación de la actividad de FcRn, regulación de la vida media/nivel de IgG circulantes, y/o tratamiento de trastornos asociados con la anormalidad de IgG, tal como trastornos autoinmunes (p.ej., esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus, trombocitopenia inmune, espondilitis anquilosante y pénfigo), y trastornos inflamatorios tal como enfermedad inflamatoria del intestino. Preferiblemente, dichos anticuerpos anti-FcRn pueden (a) bloquear la unión de IgG/parte Fc humano no específico al sitio de interacción de FcRn-Fc; (b) unirse a FcRn tanto humano como de rata (soluble y células); (c) unirse a FcRn a pH 6; y/o (d) no unirse exclusivamente a p2M.

En circunstancias normales, FcRn puede ampliar la vida media de la IgG circulante. Los anticuerpos que se unen a FcRn pueden usarse para modular la función de FcRn, por ejemplo, evitando su interacción con IgG. En particular, los anticuerpos que bloquean la interacción de FcRn con IgG pueden usarse para reducir la vida media de las moléculas de IgG.

En un aspecto, la descripción proporciona, entre otros, anticuerpos FcRn anti-humanos antagonistas humanos que están disponibles para el tratamiento de trastornos autoinmunes y la reducción de los niveles circulantes de las IgG. También se describen Fabs (sFab) solubles de alta afinidad con la capacidad de unirse a través del dominio de unión al antígeno y bloquear la interacción entre IgG-Fc y FcRn humano o FcRn de rata.

Definiciones

El término “proteína de unión” se refiere a una proteína que puede interactuar con una molécula diana. Este término se usa de forma intercambiable con “ligando”. Una “proteína de unión a FcRn” o “ligando de unión a FcRn” se refiere a una proteína que puede interactuar con un FcRn, e incluye, en particular, proteínas que interactúan preferentemente con un FcRn, p.ej., IgG.

Como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo” se refiere a una proteína que incluye al menos un dominio variable de inmunoglobulina o secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de cadena pesada (H) (abreviada en la presente memoria como VH) y una región variable de cadena ligera (L) (abreviada en la presente memoria como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligera (L). El término “anticuerpo” incluye fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos (p.ej., anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab y sFab, F(ab’)2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, scFv y fragmentos dAb) además de anticuerpos completos (anticuerpos de longitud completa).

Las regiones V^h y V^l pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de la complementariedad” (“CDR”), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas “regiones estructurales” (“FR”). La extensión de la región estructural y las CDR se ha definido de forma precisa (véase, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de EE.UU. de salud y servicios sociales, Publicación NIH núm. 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, véase también http://www.hgmp.mrc.ac.uk). Las definiciones de Kabat se usan en la presente memoria. Cada VH y VL está compuesto típicamente de tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

El término “fragmento de unión al antígeno” de un anticuerpo de longitud completa (o simplemente “parte de anticuerpo” o “fragmento”), como se usa en la presente memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que retiene la capacidad de unirse específicamente a una diana de interés. Ejemplos de fragmentos de unión incluidos en el término “fragmento de unión al antígeno” de un anticuerpo de longitud completa incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, C^l y C^h1 ; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios V^h y C^h1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios V^l y V^h de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V^h; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada que retiene la funcionalidad. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V^l y V^h, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que los permite constituirse como una única cadena de proteína en que las regiones V^l y V^h se emparejan para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv). Véase p.ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.

Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando cualquier técnica apropiada incluyendo técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. El término “anticuerpo monoespecífico” se refiere a un anticuerpo que presenta una única especificidad de unión y afinidad por una diana particular, p.ej., epítopo. Este término incluye un “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal”, que como se usa en la presente memoria se refiere a un preparado de anticuerpos o fragmentos de los mismos de composición molecular única. Como se usa en la presente memoria, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (p.ej., IgM o IgG 1) que se codifica mediante genes de región constante de cadena pesada.

Como se usa en la presente memoria, “afinidad de unión” se refiere a la constante de asociación aparente o Ka. La Ka es el recíproco de la constante de disociación (Kd). Una proteína de unión puede, por ejemplo, tener una afinidad de unión de al menos 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 y 10-11 M para una molécula diana particular. La unión de afinidad mayor de un ligando de unión a una primera diana respecto a una segunda diana puede estar indicado por una Ka mayor (o un valor numérico menor Kd) para la unión a la primera diana que la Ka (o valor numérico Kd) para unir la segunda diana. En dichos casos, la proteína de unión tiene especificidad por la primera diana (p.ej., una proteína en una primera conformación o imitación de la misma) respecto a la segunda diana (p.ej., la misma proteína en una segunda conformación o imitación de la misma; o una segunda proteína). Las diferencias en la afinidad de unión (p.ej., para especificidad u otras comparaciones) pueden ser al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 70, 80, 100, 500, 1000 o 105 veces.

La afinidad de unión puede determinarse por una variedad de métodos que incluyen diálisis en equilibrio, unión en equilibrio, filtración en gel, ELISA, resonancia del plasmón superficial o espectroscopia (p.ej., usando un ensayo de fluorescencia). Las condiciones ejemplares para evaluar la afinidad de unión están en PBS (solución salina tamponada con fosfato) a pH 7,2 a 302C. Estas técnicas pueden usarse para medir la concentración de proteína de unión libre y unida como una función de concentración de proteína de unión (o diana). La concentración de proteína de unión unida ([Unida]) está relacionada con la concentración de proteína de unión libre ([Libre]) y la concentración de sitios de unión para la proteína de unión en la diana donde (N) es el número de sitios de unión por molécula diana mediante la siguiente ecuación:

[Unida] = N [Libre]/((1/Ka) [Libre]).

No es siempre necesario hacer una determinación exacta de Ka, aunque, ya que a veces es suficiente obtener una medida cuantitativa de afinidad, p.ej., determinada usando un método tal como análisis de ELISA o FACS, es proporcional a Ka, y por consiguiente pueden usarse para comparaciones, tal como determinar si una mayor afinidad es, p.ej., 2 veces mayor, para obtener una medida cualitativa de afinidad, o para obtener una interferencia de afinidad, p.ej., mediante actividad en un ensayo funcional, p.ej., un ensayo in vitro o in vivo.

El término “ligando análogo” se refiere a un ligando que se da de forma natural de un FcRn, que incluye variantes que se dan de forma natural de los mismos (p.ej., variantes de empalme, mutantes que se dan de forma natural e isoformas).

Una “sustitución conservativa de aminoácidos” es una en que el residuo de aminoácido se sustituye con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p.ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p.ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p.ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p.ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones beta (p.ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p.ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Es posible para muchos residuos de aminoácidos estructurales y de CDR incluir una o más sustituciones conservativas.

Las secuencias de consenso para biopolímeros pueden incluir posiciones que pueden variarse entre varios aminoácidos. Por ejemplo, el símbolo “X” en dicho contexto se refiere generalmente a cualquier aminoácido (p.ej., cualquiera de los veinte aminoácidos naturales o cualquiera de los diecinueve aminoácidos que no son cisteína). Otros aminoácidos permitidos pueden también indicarse por ejemplo, usando paréntesis y barras oblicuas. Por ejemplo, “(A/W/F/N/Q)” significa que la alanina, triptófano, fenilalanina, asparagina y glutamina están permitidas en esa posición particular.

Una región variable de inmunoglobulina “efectivamente humana” es una región variable de la inmunoglobulina que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos estructurales humanos de manera que la región variable de la inmunoglobulina no provoca una respuesta inmunogénica en un humano normal. Un anticuerpo “efectivamente humano” es un anticuerpo que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos humanos de manera que el anticuerpo no provoca una respuesta inmunogénica en un humano normal.

Un “epítopo” se refiere al sitio en un compuesto diana que se une mediante una proteína de unión (p.ej., un anticuerpo tal como un Fab o anticuerpo de longitud completa). En el caso donde el compuesto diana es una proteína, el sitio puede estar enteramente compuesto de componentes de aminoácidos, compuesta enteramente de modificaciones químicas de aminoácidos de la proteína (p.ej., restos glucosilo), o compuestos de combinaciones de los mismos. Los epítopos en superposición incluyen al menos un residuo de aminoácido común.

Los cálculos de la “homología” o “identidad de secuencia” entre dos secuencias (los términos se usan de forma intercambiable en la presente memoria) se realizan como sigue. Las secuencias se alinean por propósitos de comparación óptima (p.ej., pueden introducirse huecos en uno o ambos de un primer y un segundo aminoácido o secuencia de ácido nucleico para el alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden ignorarse por propósitos de comparación). El alineamiento óptimo se determina como la mejor puntuación usando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión del hueco de 4, y una penalización del hueco de desplazamiento del marco de lectura de 5. Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en la presente memoria la “identidad” del aminoácido o ácido nucleico es equivalente a la “homología” de aminoácidos o ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.

En una realización, la longitud de una secuencia de referencia alineada por propósitos de comparación es al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia de referencia puede ser la longitud de la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina.

Una región variable de inmunoglobulina “humanizada” es una región variable de inmunoglobulina que se modifica para incluir un número suficiente de posiciones de aminoácidos estructurales de manera que la región variable de inmunoglobulina no provoca una respuesta inmunogénica en un humano normal. Las descripciones de inmunoglobulinas “humanizadas” incluyen, por ejemplo, los documentos US 6.407.213 y US 5.693.762.

Como se usa en la presente memoria, el término “hibrida en condiciones de baja severidad, severidad media, alta severidad o muy alta severidad” describe condiciones para la hibridación y el lavado. La guía para realizar reacciones de hibridación puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y cualquiera puede usarse. Las condiciones de hibridación específicas referidas en la presente memoria son como sigue: (1) condiciones de hibridación de baja severidad en 6X de cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en 0,2X de SSC, SDS al 0,1% al menos a 50°C (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55°C para condiciones de baja severidad); (2) condiciones de hibridación de severidad media en 6X de SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0,2X de SSC, SDS al 0,1% a 60°C; (3) condiciones de hibridación de alta severidad en 6X de SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0,2X de SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y (4) condiciones de hibridación de muy alta severidad son fosfato sódico 0,5M, SDS al 7% a 65°C, seguido por uno o más lavados a 0,2X de SSC, SDS al 1% a 65°C. Las condiciones de severidad muy alta (4) son las condiciones preferidas y la que se usarían a menos que se especifique otra cosa. La descripción incluye ácidos nucleicos que hibridan con severidad baja, media, alta o muy alta a un ácido nucleico descrito en la presente memoria o a un complemento del mismo, p.ej., ácidos nucleicos que codifican una proteína de unión descrita en la presente memoria. Los ácidos nucleicos pueden ser de igual longitud o estar en el 30, 20 o 10% de la longitud del ácido nucleico de referencia. El ácido nucleico puede corresponder a una región que codifica una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina.

Una proteína de unión a FcRn puede tener mutaciones (p.ej., al menos una, dos o cuatro, y/o menos de 15, 10, 5 o 3) respecto a una proteína de unión descrita en la presente memoria (p.ej., unas sustituciones de aminoácidos conservativas o no esenciales), que no tienen un efecto sustancial en las funciones de la proteína. Si se tolerará o no una sustitución particular, es decir, no afectará de forma adversa a las propiedades biológicas, dicha actividad de unión puede predecirse, p.ej., usando el método de Bowie, et al. (1990) Science 247:1306-1310.

Un “dominio de inmunoglobulina” se refiere a un dominio del dominio variable o constante de moléculas de inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina contienen típicamente dos láminas p formadas por aproximadamente siete cadenas p, y un enlace disulfuro conservado (véase, p.ej., A.F. Williams y A.N. Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6:381-405).

Como se usa en la presente memoria, una “secuencia de dominio variable de inmunoglobulina” se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina de manera que una o más regiones CDR se colocan en una conformación adecuada para un sitio de unión al antígeno. Por ejemplo, la secuencia puede incluir toda o parte de la secuencia de aminoácidos de un dominio variable que se da de forma natural. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o más aminoácidos N o C terminales, aminoácidos internos, puede incluir una o más inserciones o aminoácidos terminales adicionales, o pueden incluir otras alteraciones. En una realización, un polipéptido que incluye una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina puede asociarse con otra secuencia de dominio variable de inmunoglobulina para formar una estructura de unión a diana (o “sitio de unión a antígeno”), p.ej., una estructura que interactúa preferentemente con una estructura FcRn.

La cadena V^h o V^l del anticuerpo puede incluir además toda o parte de una región constante de cadena pesada o ligera, para formar así una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una realización, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, en las que las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina están interconectadas mediante, p.ej., enlaces disulfuro. La región constante de cadena pesada incluye tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. La región constante de cadena ligera incluye un dominio CL. La región variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos median típicamente la unión del anticuerpo a tejidos o factores huésped, incluyendo varias células del sistema inmune (p.ej., células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. El término “anticuerpo” incluye inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (además de subtipos de las mismas). Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina puede ser de los tipos: kappa o lambda. En una realización, el anticuerpo se glucosila. Un anticuerpo puede ser funcional para la citotoxicidad dependiente del anticuerpo y/o citotoxicidad mediada por el complemento.

Una o más regiones de un anticuerpo pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las regiones variables pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las CDR pueden ser humanas, p.ej., ^hC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 y ^lC CDR3. Cada uno de los C^d R de cadena ligera puede ser humano. HC CDR3 puede ser humana. Una o más de las regiones estructurales puede ser humana, p.ej., FR1, FR2, FR3 y FR4 de la HC o LC. En una realización, todas las regiones estructurales son humanas, p.ej., derivadas de una célula somática humana, p.ej., una célula hematopoyética que produce inmunoglobulinas o una célula no hematopoyética. En una realización, las secuencias humanas son secuencias de la línea germinal, p.ej., codificadas por un ácido nucleico de línea germinal. Una o más de las regiones constantes pueden ser humanas o efectivamente humanas. En una realización, al menos el 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95 o 98% de, o la totalidad de, el anticuerpo puede ser humano o efectivamente humano.

Todo o parte de un anticuerpo puede codificarse mediante un gen de inmunoglobulina o un segmento del mismo. Los genes de inmunoglobulina humana ejemplares incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, además de la miríada de genes de la región variable de la inmunoglobulina. Las “cadenas ligeras” de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 KDa o 214 aminoácidos) se codifican mediante un gen de la región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las “cadenas pesadas” de la inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KDa o 446 aminoácidos), se codifican de forma similar por un gen de la región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los demás genes de la región constante mencionados anteriormente, p.ej., gamma (que codifican aproximadamente 330 aminoácidos).

Una “composición aislada” se refiere a una composición que se elimina del al menos 90% de al menos un componente de una muestra natural a partir de la cual puede obtenerse la composición aislada. Las composiciones producidas artificialmente o naturalmente pueden ser “composiciones de al menos” un cierto grado de pureza si la especie o población de la especie de interés es al menos pura al 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 o 99% en una base de peso-peso.

El término “imitación”, en el contexto de una imitación de una conformación de un FcRn o parte del mismo, se refiere a un FcRn modificado que tiene una preferencia por al menos una conformación particular respecto a un FcRn que se da de forma natural, o parte del mismo.

Un residuo de aminoácido “no esencial” es un residuo que puede alterarse de la secuencia de tipo salvaje del agente de unión, p.ej., el anticuerpo, sin abolir o sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido “esencial” da por resultado dicho cambio.

Las frases “administración parenteral” y “administrado de forma parenteral” como se usan en la presente memoria significa modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, normalmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

Los términos “polipéptido” o “péptido” (que puede usarse de forma intercambiable) se refieren a un polímero de tres o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico, p.ej., entre 3 y 30, 12 y 60, o 30 y 300, o por encima de 300 aminoácidos de longitud. El polipéptido puede incluir uno o más aminoácidos no naturales. Típicamente, el polipéptido incluye solo aminoácidos naturales. Una “proteína” puede incluir una o más cadenas polipeptídicas. Por consiguiente, el término “proteína” incluye los polipéptidos. Una proteína o polipéptido puede además incluir una o más modificaciones, p.ej., una glucosilación, amidación, fosforilación, nitrosilación etcétera. El término “péptido pequeño” puede usarse para describir un polipéptido que está entre 3 y 30 aminoácidos de longitud, p.ej., entre 8 y 24 aminoácidos de longitud.

Una “cantidad profilácticamente efectiva” se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Típicamente, debido a que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o a una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

Como se usa en la presente memoria, el término “sustancialmente idéntico” (o “sustancialmente homólogo”) se usa en la presente memoria para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos que contiene un número suficiente de residuos de aminoácido o nucleótidos idénticos o equivalentes (p.ej., con una cadena lateral similar, p.ej., sustituciones de aminoácidos conservadas) a una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de manera que la primera y segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico tienen (o codifican proteínas que tienen) actividades similares, p.ej., una actividad de unión, una preferencia de unión, o una actividad biológica. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos 50% de la afinidad relativa al mismo antígeno.

Secuencias similares u homólogas (p.ej., al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia) a las secuencias descritas en la presente memoria son también parte de esta solicitud. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor. Además, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácido nucleico hibridan bajo condiciones de hibridación selectiva (p.ej., condiciones de hibridación altamente severa), al complemento de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisato celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.

La significancia estadística puede determinarse por cualquier método conocido de la técnica. Las pruebas estadísticas ejemplares incluyen: la prueba T de Student, la prueba no paramétrica U de Mann Whitney, y la prueba estadística no paramétrica de Wilcoxon. Algunas relaciones estadísticamente significativas tienen un valor P de menos de 0,05 o 0,02. Las proteínas de unión particulares pueden mostrar una diferencia, p.ej., en la especificidad o unión, que son estadísticamente significativas (p.ej., valor P <0,05 o 0,02). Los términos “inducir”, “inhibir”, “potenciar”, “elevar”, “aumentar”, “disminuir” o similares, p.ej., que indican diferencias cualitativas o cuantitativas distinguibles entre dos estados, y pueden referirse a una diferencia, p.ej., una diferencia estadísticamente significativa, entre los dos estados.

Una “dosis terapéuticamente efectiva” modula un parámetro medible, p.ej., niveles de anticuerpos IgG circulantes mediante un grado estadísticamente significativo o al menos aproximadamente 20%, en al menos aproximadamente 40%, en al menos aproximadamente 60%, o en al menos aproximadamente 80% respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular un parámetro medible, p.ej., autoinmunidad, puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en trastornos autoinmunes humanos. De forma alternativa, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para modular un parámetro in vitro, p.ej., mediante ensayos conocidos para el experto.

Otras características y ventajas de la actual invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones. Las realizaciones de la invención pueden incluir cualquier combinación de características descritas en la presente memoria. En ningún caso el término “realización” excluye una o más características distintas descritas en la presente memoria.

Secuencias de FcRn

El siguiente alineamiento de secuencia es de una secuencia de aminoácidos de cadena alfa de FcRn humano con una secuencia de aminoácidos de cadena alfa de FcRn de rata. Una proteína FcRn ejemplar puede incluir una de estas dos secuencias, o un fragmento de las mismas, p.ej., un fragmento sin la secuencia señal:

S e c u e n c ia s e ñ a l d o m in io a i

□ JHUMANO: MGVPRPQFHAUSUJjFLLPÍ5SIjS AESHLSI.LYHL'TAVSSPAPG'TPAFWVSÍTfc-LGFQQYLE

d _ R A T A l M S M S Q P G V -L L S Iil.V L L F e T W G A E PR LPIA lYH LA A V SD LSTG LPSE'W A TÍiííLG A Q Q YL'r

d o m in io en d o m in io 02

d_H U MAN O: YN SLR G EA EPtG A KVM EN Q VSW Y W EK ETTD LFLIKEK LFLEA FK A LG G K — G P YTLQ GLIvG

a_R A TA : 'i'lfflLEQ EAD PCtH W IW EW O VSW YM EKETTD LKSKEO LFLEAIPLTLEH Q IW GT PTL O G LL G

d o m in io 02

a HUM ANO: CELGFD W TSTYFTAKFA LN GEEFM N FD IJaQ GTW JGDW PEA LA ISQ RiiO Q CD KAAN KELTFL

d_RATA: CELaFD H SSLP X A V FA LM G B EFM R FN FR IG m fSO B W P B TD IV G tTLW H K O PB A A R K ESEri:

d o m in io 02 d o m in io da

d_H U M ANO: L F S C F H R LRE H LERG R G N LEK K E P P 5 MRLKAR PSS F G F S V L T C 5 A F S F Y P P E EQLRFLRN

d RATA: L T S C P E R L IjG ijL E R G R Q N L E K K E PPSM RLKAR PGNSGS S V I iT C A A F S F Y P F E L K FRFLRH

d o m in io da

d_H U MAN O: G UAAGTC-QGDFG PN s DG S F H A S S S L T VK SG DE EH Y C C IV Q H AGLAQP LRV E : .E

d_RATA: G LA SG & G H CSTG FH G D G SFH A H SLLEVKR G D EH H YÜ CQ VEElBG U yQ PLTVD LD

a_HUMANO: DADLKDVNVIPATA (SEQ ID NO:1)

a_RATA: EAEPQGVNAFPATS (SEQ ID NO:2)

El siguiente alineamiento de secuencia siguiente es de una secuencia de aminoácidos de p2 microglobulina humana con una secuencia de aminoácidos de p2 microglobulina de rata. Una proteína FcRn ejemplar puede incluir una de estas dos secuencias, o un fragmento de las mismas, p.ej., un fragmento sin la secuencia señal:

S e c u e n c i a s e ñ a |32 m icrog lobL ilina

f¡2m_hurnano: m s r s v a l a v x a il s l e g l e a iq k t p ;: iq -v y y k h p a e n Gk Sh f in Cy v SGfh PSD r e v d l í

■|32m _rata: m a a s v t v i fe.v e .V3l a w l a iq k t p q iq v y s r h p p b w g k p n f in c w s q f h p p q i&i e l í

Una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica una cadena alfa de proteína FcRn puede incluir las siguientes secuencias:

Secuencia de nucleótidos alfa de FcRn (Homo Sapiens):

GTTCTTCAGGTACGAGGAGGGCATTGTTGTCAGTCTGGACCGAGCCCGCAGAGCCCCTCCTCGGCGTCCT GGTCCCGGCCGTGCCCGCGGTGTCCCGGGAGGAAGGGGCGGGCCGGGGGTCGGGAGGAGTCACGTGCCCC CTCCCGCCCCAGGTCGTCCTCTCAGCATGGGGGTCCCGCGGCCTCAGCCCTGGGCGCTGGGGCTCCTGCT CTTTCTCCTTCCTGGGAGCCTGGGCGCAGAAAGCCACCTCTCCCTCCTGTACCACCTTACCGCGGTGTCC TCGCCTGCCCCGGGGACTCCTGCCTTCTGGGTGTCCGGCTGGCTGGGCCCGCAGCAGTACCTGAGCTACA ATAGCCTGCGGGGCGAGGCGGAGCCCTGTGGAGCTTGGGTCTGGGAAAACCAGGTGTCCTGGTATTGGGA GAAAGAGACCACAGATCTGAGGATCAAGGAGAAGCTCTTTCTGGAAGCTTTCAAAGCTTTGGGGGGAAAA GGTCCCTACACTCTGCAGGGCCTGCTGGGCTGTGAACTGGGCCCTGACAACACCTCGGTGCCCACCGCCA AGTTCGCCCTGAACGGCGAGGAGTTCATGAATTTCGACCTCAAGCAGGGCACCTGGGGTGGGGACTGGCC CGAGGCCCTGGCTATCAGTCAGCGGTGGCAGCAGCAGGACAAGGCGGCCAACAAGGAGCTCACCTTCCTG CTATTCTCCTGCCCGCACCGCCTGCGGGAGCACCTGGAGAGGGGCCGCGGAAACCTGGAGTGGAAGGAGC CCCCCTCCATGCGCCTGAAGGCCCGACCCAGCAGCCCTGGCTTTTCCGTGCTTACCTGCAGCGCCTTCTC CTTCTACCCTCCGGAGCTGCAACTTCGGTTCCTGCGGAATGGGCTGGCCGCTGGCACCGGCCAGGGTGAC TTCGGCCCCAACAGTGACGGATCCTTCCACGCCTCGTCGTCACTAACAGTCAAAAGTGGCGATGAGCACC ACTACTGCTGCATTGTGCAGCACGCGGGGCTGGCGCAGCCCCTCAGGGTGGAGCTGGAATCTCCAGCCAA GTCCTCCGTGCTCGTGGTGGGAATCGTCATCGGTGTCTTGCTACTCACGGCAGCGGCTGTAGGAGGAGCT CTGTTGTGGAGAAGGATGAGGAGTGGGCTGCCAGCCCCTTGGATCTCCCTTCGTGGAGACGACACCGGGG TCCTCCTGCCCACCCCAGGGGAGGCCCAGGATGCTGATTTGAAGGATGTAAATGTGATTCCAGCCACCGC CTGACCATCCGCCATTCCGACTGCTAAAAGCGAATGTAGTCAGGCCCCTTTCATGCTGTGAGACCTCCTG GAACACTGGCATCTCTGAGCCTCCAGAAGGGGTTCTGGGCCTAGTTGTCCTCCCTCTGGAGCCCCGTCCT GTGGTCTGCCTCAGTTTCCCCTCCTAATACATATGGCTGTTTTCCACCTCGATAATATAACACGAGTTTG GGCCCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:5)

La secuencia del ácido nucleico de un FcRn humano ejemplar (dominio extracelular) más las secuencias GPI ADN (negrita minúscula) se presenta a continuación.

ATGGGGGTCCCGCGGCCTCAGCCCTGGGCGCTGGGGCTCCTGCTCTTTCTCCTTCCTGGGAGCCTGGGCG CAGAAAGCCACCTCTCCCTCCTGTACCACCTTACCGCGGTGTCCTCGCCTGCCCCGGGGACTCCTGCCTT CTGGGTGTCCGGCTGGCTGGGCCCGCAGCAGTACCTGAGCTACAATAGCCTGCGGGGCGAGGCGGAGCCC TGTGGAGCTTGGGTCTGGGAAAACCAGGTGTCCTGGTATTGGGAGAAAGAGACCACAGATCTGAGGATCAA GGAGAAGCTCTTTCTGGAAGCTTTCAAAGCTTTGGGGGGAAAAGGTCCCTACACTCTGCAGGGCCTGCTGG GCTGTGAACTGGGCCCTGACAACACCTCGGTGCCCACCGCCAAGTTCGCCCTGAACGGCGAGGAGTTCATG AATTTCGACCTCAAGCAGGGCACCTGGGGTGGGGACTGGCCCGAGGCCCTGGCTATCAGTCAGCGGTGGCA GCAGCAGGACAAGGCGGCCAACAAGGAGCTCACCTTCCTGCTATTCTCCTGCCCGCACCGCCTGCGGGAGC ACCTGGAGAGGGGCCGCGGAAACCTGGAGTGGAAGGAGCCCCCCTCCATGCGCCTGAAGGCCCGACCCAGC AGCCCTGGCTTTTCCGTGCTTACCTGCAGCGCCTTCTCCTTCTACCCTCCGGAGCTGCAACTTCGGTTCCT GCGGAATGGGCTGGCCGCTGGCACCGGCCAGGGTGACTTCGGCCCCAACAGTGACGGATCCTTCCACGCCT CGTCGTCACTAACAGTCAAAAGTGGCGATGAGCACCACTACTGCTGCATTGTGCAGCACGCGGGGCTGGCG CAGCCCCTCAGGGTGGAGCTGGAATCTCCAGCCAAGTCCTCCcggccgctcgacgggctacgagcatcagt

aacactactaggcgcaggcctactactatcactactaccagcactactacgatttgggccataa (SEQ ID

NO: 6)

Una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica una beta-2-microglobulina (P2M) puede incluir las siguientes secuencias:

Nucleótido de beta-2-microglobulina (B2M) (Homo Sapiens):

AATATAAGTGGAGGCGTCGCGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCT

CCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGAT TCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTT CATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACT TGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGA GTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGTAA GCAGCATCATGGAGGTTTGAAGATGCCGCATTTGGATTGGATGAATTCCAAATTCTGCTTGCTTGCTTTT TAATATTGATATGCTTATACACTTACACTTTATGCACAAAATGTAGGGTTATAATAATGTTAACATGGAC ATGATCTTCTTTATAATTCTACTTTGAGTGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCTGAGCAGGTTGCTCCACA GGTAGCTCTAGGAGGGCTGGCAACTTAGAGGTGGGGAGCAGAGAATTCTCTTATCCAACATCAACATCTT GGTCAGATTTGAACTCTTCAATCTCTTGCACTCAAAGCTTGTTAAGATAGTTAAGCGTGCATAAGTTAAC TTCCAATTTACATACTCTGCTTAGAATTTGGGGGAAAATTTAGAAATATAATTGACAGGATTATTGGAAA TTTGTTATAATGAATGAAACATTTTGTCATATAAGATTCATATTTACTTCTTATACATTTGATAAAGTAA GGCATGGTTGTGGTTAATCTGGTTTATTTTTGTTCCACAAGTTAAATAAATCATAAAACTTGATGTGTTA TCTCTTA (SEQ ID NO:7)

Anticuerpos de unión a FcRn

DX2504 es un anticuerpo de unión a FcRn que se describe en la publicación internacional WO2009/131702 y el documento US-2009-0324614-A1. DX2504 se generó por una combinación de tecnología de anticuerpos monoclonales y experimentos de expresión en fagos usando polipéptidos de FcRn o células que expresan FcRn como la diana. Además, la secuencia de DX2504 era de línea germinal para disminuir la inmunogenicidad. Las secuencias de cadena ligera y cadena pesada de DX2504 se muestran a continuación:

Región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:8):

FRl-L CDR1-L FR2-L CDR2-L

QSALTQPASVSGSPGQSITISC TGTGSDVGSYNLVS WYQQHPGKAPKLMIY GDSQRPS

FR3-L CDR3-L FR4-L

GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC CSYAGSGIYV FGTGTKVTVL

Longitud completa de cadena ligera (SEQ ID NO:16; C^l subrayado):

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSQRPSGVSNRFSGSKSGNTASL TISGLQAEDEADYYCCSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTV AWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:9):

FRl-H CDR1-H FR2-H CDR2-H

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS EYAMG WVRQAPGKGLEWVS SIGSSGGQTKYADSVKG

FR3-H CDR3-H FR4-H

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR LAIGDSY WGQGTMVTVSS

Longitud completa de la cadena pesada (SEQ ID NO:17, C^h subrayado)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGQTKYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Además de la unión a FcRn, DX2504, o anticuerpos precursores, se ha mostrado que bloquean la unión de IgG-Fc a células que expresan FcRn (Ejemplo 21 de la publicación internacional WO2009/131702). Además, administrar DX2504 a ratones Tg32B, un ratón en que el FcRn de ratón se sustituye por el FcRn humano, disminuyó los niveles de un IgG humano que se administró a los ratones anteriormente (Ejemplo 27 de la publicación internacional WO2009/131702). Además, la administración de DX2504 en monos cinomolgos dio por resultado la disminución de niveles séricos de IgG (Ejemplo 27 de la publicación internacional WO2009/131702).

Se encontró inesperadamente en la presente memoria que alterar o la CDR3 de la cadena ligera (p.ej., los mutantes de cisteína descritos en la presente memoria) o la región constante de la cadena pesada (p.ej., los mutantes de supresión descritos en la presente memoria) de DX2504 dieron por resultado anticuerpos de unión a FcRn con propiedades mejoradas cuando se compara con DX2504. Este descubrimiento fue inesperado al menos en parte porque, generalmente, un anticuerpo que ha pasado tantas series de optimización de secuencia, tal como DX2504, no puede optimizarse fácilmente adicionalmente introduciendo mutaciones adicionales.

Mutantes de cisteína

Los mutantes de cisteína de DX2504 descritos en la presente memoria carecen de un residuo de cisteína en la primera posición de al menos una CDR3, por ejemplo, la primera posición de la CDR3 de V^l de DX2504 que está sustituida con otro residuo de aminoácido tal como Ala, Ser o una sustitución conservativa de los mismos. Los mutantes de cisteína ejemplares incluyen, aunque no están limitados a, 532A-X53-C02 (que tiene una V^l descrita como SEQ ID NO:10) y 532A-X53-B03 (que tiene una V^l descrita como SeQ ID NO:11). Dichos mutantes conservan la actividad de unión a FcRn, p.ej., la unión a FcRn humano con una constante de disociación (K^d) de menos de 10 nM, que puede determinarse mediante un método rutinario. En algunos ejemplos, el mutante de cisteína contiene dos cadenas V^l, o una o ambas de las cuales no tienen una cisteína en la primera posición de la región CDR3 de V^l.

El mutante de cisteína descrito en la presente memoria puede comprender una cadena V^l, en que la CDR1, CDR2 y CDR3 comparten al menos el 70% (p.ej., al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95%) de identidad de secuencia con la CDR1 de V^l y CDR2 de V^l de DX2504 (SEQ ID NOs:14 y 15, respectivamente; idénticas a las de 532A-X53-C02 o 532A-X53-B03) y una CDR3 de V^l alterada de DX2504 (SEQ ID NO:12 o 13, la CDR3 de V^l de 532A-X53- C02 o 532A-X53-B03). En algunas realizaciones, una o más de las CDR de V^l comparten al menos 70% de identidad de secuencia a las de las correspondientes CDR(s) de 532A-X53-C02 o 532A-X53-B03. Por ejemplo, el mutante de cisteína tiene al menos 70% de homología (al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95%) en la región CDR3 de V^l con las secuencias SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12), o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13).

En otras realizaciones, las CDR de V^l del mutante de cisteína, en combinación, comparten al menos 70% de identidad de secuencia con las de 532A-X53-C02 o 532A-X53-B03, en combinación. Por ejemplo, un anticuerpo con al menos 90% de homología en la región CDR1, CDR2 y CDR3 con las secuencias CDR de referencia se refiere a un anticuerpo que tiene al menos 9 de cada 10 aminoácidos en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 combinadas idénticas a los aminoácidos encontrados en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 combinadas de 532A-X53-C02.

De forma alternativa, el anticuerpo puede tener hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, o hasta 5 sustituciones de aminoácidos en la región CDR3 de V^l en comparación con las secuencias SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13). En algunas realizaciones, el mutante de cisteína puede contener hasta 3 sustituciones en la región CDR3 de VL en comparación con la región CDR3 de DX2504. La una o más sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas.

Además, los anticuerpos mutantes de cisteína pueden tener hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, hasta 10, o hasta 15 sustituciones de aminoácidos en la región CDR1, CDR2 y CDR3 en comparación con las secuencias de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de 532A-X53-C02 o 532A-X53-B03. En algunas realizaciones, pueden contener hasta 10 sustituciones en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de V^l de forma colectiva. En un ejemplo, la una o más de las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas.

En algunas realizaciones, el mutante de cisteína comprende una cadena V^l que comparte al menos el 70% (p.ej., al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 98%) de identidad de secuencia a la secuencia V^l de 532A-X53-C02 (SEQ ID NO:10) o la de 532A-X53-B03 (SEQ ID NO:11). En un ejemplo, el mutante de cisteína comprende la misma región CDR3 de VL que 532A-X53-C02 o 532A-X53-B03, y opcionalmente, las mismas regiones CDR1 y CDR2 de V^l como los dos mutantes ejemplares.

El “porcentaje de identidad” de dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Las búsquedas de proteína BLAST puede realizarse con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de interés. Donde existen huecos entre dos secuencias, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. Cuando se utiliza los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (p.ej., XBLAST y NBLAST).

En algunas realizaciones, los mutantes de cisteína descritos en la presente memoria pueden contener una o más mutaciones (p.ej., sustituciones de aminoácidos conservativas) en las regiones estructurales (FR) en comparación con los dos mutantes ejemplares descritos anteriormente y en el Ejemplo 1 posterior. Como se sabe en la técnica, las mutaciones en las regiones FR es improbable que afecten a la actividad de unión al antígeno del anticuerpo. En otras realizaciones, los mutantes de cisteína descritos en la presente memoria pueden contener una o más mutaciones (p.ej., 1, 2 o 3 mutaciones tales como sustituciones de aminoácidos conservativas) en una o más de las regiones CDR en comparación con 532A-X53-C02 o las de 532A-X53-B03. Preferiblemente, dichos mutantes retienen las mismas regiones/residuos responsables de la unión al antígeno que el padre, como los mismos residuos que determinan la especificidad dentro de las CDR.

En general, un residuo de cisteína proporciona una proteína con propiedades únicas porque un residuo de cisteína puede formar un enlace covalente con otras cisteínas. La mutación de una cisteína a menudo da por resultado proteínas con propiedades significativamente alteradas. Por lo tanto fue inesperado que los anticuerpos con la cisteína en CDR3 de la cadena ligera mutados a una serina (C54-C02) o una alanina (X54-B03) se encontró que eran más homogéneos que DX-2504, como se mide por cromatografía por exclusión de tamaño (Figura 1) y por análisis SDS-PAGE (Figura 2). También fue inesperado que los mutantes de cisteína fueran más estables, con respecto al porcentaje de la especie IgG monomérica, tras una incubación de 30 días a 37°C de incubación (Figura 3) o después de incubación de 15 días a pH 8,3 (Figura 4). Las mutaciones en las CDR de un anticuerpo a menudo disminuyen la afinidad de la unión al antígeno. Por lo tanto fue más inesperado que mutar una cisteína en la CDR3 de la cadena ligera de DX-2504 no afectara a la afinidad de la unión al antígeno (Figuras 7 y 8).

Cualquiera de los mutantes de cisteína descritos anteriormente puede comprender además una región variable de cadena pesada (V^h), que comprende las regiones CDR1 de V^h, CDR2 de V^h y CDR3 de V^h. La V^h puede ser igual que la de DX2504 (SEQ ID NO:9) o una variante funcional de la misma. En algunas realizaciones, las CDR de V^h en la variante funcional comparten al menos el 70% (p.ej., al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95%) de identidad de secuencia con las de DX2504 (SEQ ID NOs:22, 23 y 24). En un ejemplo, una o más de las CDR de V^h comparten al menos el 70% de identidad de secuencia con las de la(s) correspondiente(s) CDR der V^h de DX2504, por ejemplo, que tienen al menos 70% de homología (al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95%) en la región CDR3 de V^h con las secuencias LAIGDSY (SEQ ID NO:24).

En otro ejemplo, las CDR de V^h de la variante funcional, en combinación, comparten al menos el 70% de identidad de secuencia con las de DX2504, en combinación. Por ejemplo, un anticuerpo con al menos el 90% de homología en la región CDR1, CDR2 y CDR3 con las secuencias de CDR de referencia se refiere a un anticuerpo que tiene al menos 9 de cada 10 aminoácidos en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 combinadas idénticas a los aminoácidos encontrados en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 combinadas de DX2504.

De forma alternativa, el mutante funcional puede contener hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, o hasta 5 sustituciones de aminoácidos en la región CDR3 en comparación con las secuencias CDR3 de DX2504 (LAIGDSY, SEQ ID NO:24). En algunas realizaciones, las variantes funcionales incluyen hasta 3 sustituciones en la región CDR3 de V^h en comparación con la región CDR3 de DX2504. En un ejemplo, la una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas.

Además, la variante funcional puede contener hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, hasta 10, hasta 11, hasta 12, hasta 13, hasta 14, o hasta 15 sustituciones de aminoácidos en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 en comparación con las secuencias de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de DX2504. En algunas realizaciones, contienen hasta 10 sustituciones en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de V^h de forma colectiva. En un ejemplo, la una o más de las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas.

En algunas realizaciones, la variante funcional comprende una cadena V^h que comparte al menos 70% (p.ej., al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 98%) de identidad de secuencia con la secuencia V^h de DX2504 (SEQ ID NO:9). En un ejemplo, la variante funcional comprende la misma región CDR3 de V^h que DX2504, y opcionalmente, las mismas regiones CDR1 y CDR2 de V^h que DX2504.

Cuando se desee, la variante funcional de la cadena pesada de DX2504 como se describe en la presente memoria puede contener una o más mutaciones (p.ej., sustituciones de aminoácidos conservativas) en las regiones estructurales (FR) de DX2504 (véase la descripción anterior). Como se sabe en la técnica, las mutaciones en las regiones FR es improbable que afecten a la actividad de unión al antígeno del anticuerpo. En otras realizaciones, los mutantes de cisteína descritos en la presente memoria pueden contener una o más mutaciones (p.ej., 1, 2 o 3 mutaciones tal como sustituciones de aminoácidos conservativas) en una o más de las regiones CDR en comparación con DX2504. Preferiblemente, dichas variantes retienen las mismas regiones/residuos responsables de la unión al antígeno como el padre, tal como los mismos residuos que determinan la especificidad dentro de las CDR.

En un ejemplo, el mutante de cisteína de DX2504 descrito en la presente memoria comprende una cadena ligera de al menos 70% (p.ej., al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95%) de homología con 532A-X53-C02 o 532A-X53-B03, y una cadena pesada que comprende las mismas CDR como las de DX2504 (p.ej., la misma región variable de cadena pesada que la de DX2504). En otro ejemplo, el mutante comprende la misma V^l que 532A-X53-C02 o 532A-X53-B03, y la misma V^h que DX2504.

Mutantes de supresión

Se ha descubierto también, inesperadamente, que la supresión del residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada de DX2504 dio por resultado un anticuerpo anti-FcRn (DX2507) que tenía retención de anticuerpo aumentada y una mayor reducción de IgG en un modelo animal en comparación con DX2504 (Figuras 13 y 14).

Por consiguiente, también se describen en la presente memoria mutantes de supresión que carecen del residuo de lisina C-terminal en su cadena pesada en comparación con la cadena pesada de DX2504. Más específicamente, la cadena pesada del mutante de supresión descrito en la presente memoria puede ser idéntico de otro modo a la cadena pesada de DX2504 (SEQ Id NO:17) o a la cadena pesada de cualquiera de las variantes funcionales de DX2504 como se describe anteriormente excepto para la supresión del residuo de aminoácidos que corresponde al residuo de lisina C-terminal en la cadena pesada de DX2504 (SEQ ID NO:17). Un ejemplo de dicha cadena pesada es la de DX2507 (SEQ D NO:19) descrita en el Ejemplo 2 posterior.

Los mutantes de supresión descritos anteriormente pueden comprender adicionalmente una cadena ligera, que puede comprender la región V^l de DX2504 o la región V^l de cualquiera de los mutantes de cisteína descritos en la presente memoria.

En algunos ejemplos, el mutante de supresión comprende una cadena ligera que comprende las mismas CDR de V^l como DX2504, 532A-X53-C02, o 532A-X53-B03 (p.ej., la misma V^l que DX2504, 532A-X53-C02 o 532A-X53-B03), una cadena pesada que comprende las mismas CDR de V^h que DX2504 (p.ej., la misma V^h que DX2504) y una región constante de cadena pesada que tiene una supresión en la posición correspondiente al residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada de DX2504.

Cualquiera de los mutantes de cisteína y de supresión descritos en la presente memoria puede unirse al FcRn humano con una constante de disociación (K^d) de menos de 10 nM.

Además de tener las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria, los anticuerpos anti-FcRn descritos en la presente memoria pueden tener cualquier marco estructural. Por consiguiente, por ejemplo las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 descritas anteriormente, pueden integrarse en una estructura de anticuerpo “tradicional”, o pueden integrarse en una estructura scFv o Fab. El anticuerpo anti-FcRn descrito en la presente memoria puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión al antígeno del mismo, p.ej., anticuerpo Fab, F(ab)’2, Fv o ScFv. Puede ser un anticuerpo no humano tal como un anticuerpo murino (p.ej., un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular hibridoma), un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado.

También en el alcance de la presente descripción están los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la V^h y/o la V^l de cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn descritos en la presente memoria (p.ej., cualquiera de los mutantes de cisteína o cualquiera de los mutantes de supresión descritos anteriormente). Dichas secuencias de ácido nucleico pueden insertarse en vectores de expresión, que pueden introducirse en células huésped adecuadas (p.ej., células bacterianas tal como células E. coli, células de levadura, células de insectos, células vegetales o células de mamíferos) para la producción de los anticuerpos anti-FcRn por medio de tecnología recombinante.

Métodos de fabricación de anticuerpos monoclonales de ratón

Los métodos de fabricación de anticuerpos monoclonales se han descrito (Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)). En algunos ejemplos, como una primera etapa, un roedor, p.ej., un ratón se inmuniza con un polipéptido antigénico para generar una respuesta de anticuerpos. Debido a que FcRn se expresa de forma ubicua y muestra alto grado de homología entre especies, la inmunización del polipéptido no ha tenido éxito en la producción de anticuerpos monoclonales específicos de FcRn de alta afinidad o anticuerpos de bloqueo monoclonal de FcRn. Para resolver este problema puede realizarse la vacunación de ADN (Castagliola et al., J. Immunology 160:1458 (1998)). La vacunación de ADN implica inmunizar un roedor, p.ej., un ratón con un constructo de ADNc que codifica FcRn o un fragmento del mismo. La inmunización puede administrarse de forma intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intravenosa, intradérmica o directamente en el nódulo linfático. En una realización las inmunizaciones se administraron de forma intramuscular. La vacunación de ADN puede administrarse con un adyuvante, p.ej., adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund. La vacunación de ADN puede acompañarse por la administración de una cardiotoxina para aumentar el título de anticuerpos. La administración de una cardiotoxina provoca la muerte celular y la regeneración celular que mejora la absorción celular de la vacuna de ADN administrada. La cardiotoxina puede también aumentar la inflamación que da por resultado en una respuesta inmune más fuerte.

Las células que secretan anticuerpo (células B) se aíslan del roedor. Típicamente la célula B puede aislarse del bazo de los roedores y condensarse con una línea celular de mieloma. Las líneas celulares de mieloma son líneas celulares inmortalizadas que no producen anticuerpos. La línea celular de mieloma puede elegirse de, aunque no está limitada a P3-X63Ag8, X63Ag8.653, Sp2/0-Ag14, FO, NSI/1-Ag4-1, NSO/1, FOX-NY, Y3-Ag1.2.3, YB2/0 e IR983F.

Los esplenocitos se condensan con la línea celular de mieloma para formar un hibridoma. La fusión puede mediarse mezclando los dos tipos de células con polietilenglicol durante un periodo apropiado de tiempo (p.ej., cinco minutos). Los hibridomas formados se cultivan en cultivo celular usando un medio de selección apropiado (p.ej., HAT) y se criban por su capacidad para producir un anticuerpo monoclonal contra FcRn. El cribado puede realizarse usando técnicas inmunológicas conocidas, p.ej., un ELISA.

Otro enfoque para fabricar anticuerpos monoclonales específicos de FcRn es inmunizar un ratón desactivado en FcRn transgénico con FcRn humano soluble, véase, Solicitud PCT WO 02/43658. La publicación internacional WO 02/43658 describe un ratón transgénico cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen de FcRn endógeno, en el que dicha interrupción homocigótica evita la expresión de una proteína FcRn funcional. El anticuerpo monoclonal de la invención no se hace en un ratón transgénico cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen FcRn endógeno, en el que dicha interrupción homocigótica evita la expresión de una proteína FcRn funcional. El anticuerpo monoclonal de la invención no está comprendido por una célula B de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen FcRn endógeno, en el que dicha interrupción homocigótica evita la expresión de una proteína FcRn funcional.

Bibliotecas de expresión en anticuerpos anti-FcRn humanizados

Una biblioteca de expresión puede usarse para identificar anticuerpos que se unen al FcRn. Una biblioteca de expresión es una colección de entidades; cada entidad incluye un componente polipeptídico accesible y un componente recuperable que codifica o identifica el componente polipeptídico. El componente polipeptídico se varía de manera que se representan diferentes secuencias de aminoácidos. El componente polipeptídico puede ser de cualquier longitud, p.ej., de tres aminoácidos a más de 300 aminoácidos. En una selección, el componente polipeptídico de cada miembro de la biblioteca se prueba con el FcRn y si el componente polipeptídico se une al FcRn, el miembro de la biblioteca de expresión se identifica, típicamente por retención en un soporte. Además, una entidad de biblioteca de expresión puede incluir más de un componente polipeptídico, por ejemplo, las dos cadenas polipeptídicas de un sFab.

Los miembros de la biblioteca de expresión retenidos se recuperan del soporte y se analizan. El análisis puede incluir la amplificación y una posterior selección en condiciones similares o distintas. Por ejemplo, pueden alternarse las selecciones positivas y negativas. El análisis puede incluir también determinar la secuencia de aminoácidos del componente polipeptídico y la purificación del componente polipeptídico para la caracterización detallada.

Una variedad de formatos puede usarse para las bibliotecas de expresión. Los ejemplos incluyen lo siguiente.

Expresión en fagos. Un formato utiliza virus, particularmente bacteriófagos. Este formato se denomina “expresión en fagos”. El componente de proteína está unido típicamente de forma covalente a una proteína de recubrimiento del bacteriófago. La unión resulta de la traducción de un ácido nucleico que codifica el componente de proteína condensado con la proteína de recubrimiento. La unión puede incluir un conector peptídico flexible, un sitio de proteasa, o un aminoácido incorporado como resultado de la supresión de un codón de parada. La expresión en fagos se describe, por ejemplo, en el documento U.S. 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; las publicaciones internacionales WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1988) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; y Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137.

Los sistemas de expresión en fagos se han desarrollado para fagos filamentosos (fago f1, fd, y M13) además de otro bacteriófago. Los sistemas de expresión en fagos filamentosos usan típicamente fusiones con una proteína de recubrimiento menor, tal como proteína del gen III, y proteína del gen VIII, una proteína de recubrimiento mayor, aunque pueden usarse también fusiones de otras proteínas de recubrimiento tal como proteína del gen VI, proteína del gen VII, proteína del gen IX, o dominios de los mismos (véase, p.ej., la publicación internacional WO 00/71694). En una realización, la fusión es con un dominio de la proteína del gen III, p.ej., el dominio o “porción” de anclaje (véase, p.ej., la Patente de EE.UU. núm. 5.658.727 para una descripción del dominio de anclaje de proteína del gen III). También es posible asociar físicamente la proteína que se expresa al recubrimiento que usa una unión no peptídica.

El bacteriófago que expresa el componente de proteína puede cultivarse y cosecharse usando métodos preparatorios de fagos estándar, p.ej., precipitación de PEG desde un medio de crecimiento. Después de la selección de fagos de expresión individuales, el ácido nucleico que codifica los componentes de proteína seleccionados puede aislarse de las células infectadas con los fagos seleccionados o desde los fagos en sí mismos, después de la amplificación. Las colonias individuales o placas pueden escogerse, el ácido nucleico aislarse y secuenciarse.

Otros formatos de expresión. Otros formatos de expresión incluyen expresión basada en células (véase, p.ej., la publicación internacional WO 03/029456), fusiones de proteína-ácido nucleico (véase, p.ej., documento US 6.207.446), y expresión de ribosoma (véase, p.ej., Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 y Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; y Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231 (1 -2): 119-35).

Estructuras. Las estructuras para la expresión pueden incluir: anticuerpos (p.ej., fragmentos Fab, moléculas Fv de cadena sencilla (scFV), anticuerpos de dominio único, anticuerpos de camélidos, y anticuerpos camelizados); receptores de células T; proteínas MHC; dominios extracelulares (p.ej., repeticiones de fibronectina Tipo III, repeticiones de EGF); inhibidores de proteasa (p.ej., dominios de Kunitz, ecotina, BPTI, etcétera); repeticiones de TPR; estructuras de trifoilo; dominios de dedo de zinc; proteínas de unión a ADN; particularmente proteínas de unión a ADN monoméricas; proteínas de unión a ARN; enzimas, p.ej., proteasas (particularmente proteasas inactivas), RNasa; chaperonas, p.ej., tioredoxina y proteínas de choque térmico; dominios de señalización intracelular (tal como los dominios SH2 y SH3); péptidos lineales y restringidos; y sustratos peptídicos lineales. Las bibliotecas de expresión pueden incluir diversidad sintética y/o natural. Véase, p.ej., el documento US 2004-0005709.

La tecnología de expresión puede usarse además para obtener anticuerpos que se unen a epítopos particulares de una diana. Esto puede hacerse, por ejemplo, usando moléculas no diana competitivas que carecen del epítopo particular o se mutan en el epítopo, p.ej., con alanina. Dichas moléculas no diana pueden usarse en un procedimiento de selección negativa como se describe a continuación, como moléculas competitivas cuando se unen a una biblioteca de expresión a la diana, o como un agente de pre-elución, p.ej., para capturar en una disolución de lavado que disocia los miembros de la biblioteca de expresión que no son específicos de la diana. Selección iterativa. En una realización, la tecnología de biblioteca de expresión se usa en un modo iterativo. Una primera biblioteca de expresión se usa para identificar uno o más anticuerpos que se unen a una diana. Estos anticuerpos identificados se varían entonces usando un método de mutagénesis para formar una segunda biblioteca de expresión. Los anticuerpos de mayor afinidad se seleccionan entonces de la segunda biblioteca, p.ej., usando condiciones de unión y lavado de mayor severidad o más competitivas.

En algunas implementaciones, la mutagénesis está dirigida a regiones conocidas o que están probablemente en la interfase de unión. En el caso de los anticuerpos, la mutagénesis puede dirigirse a las regiones CDR de las cadenas pesada o ligera como se describe en la presente memoria. Además, la mutagénesis puede estar dirigida a regiones estructurales cerca o adyacentes a las CDR. En el caso de anticuerpos, la mutagénesis puede además estar limitada a una o unas pocas de las CDR, p.ej., para hacer mejoras en pasos precisos. Las técnicas de mutagénesis ejemplares incluyen: PCR propensas al error, recombinación, transposición de ADN, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis del casete.

En un ejemplo de selección iterativa, los métodos descritos en la presente memoria se usan para identificar primero un anticuerpo de una biblioteca de expresión que se une a un FcRn con al menos una especificidad de unión mínima para una diana o una actividad mínima, p.ej. una constante de disociación en equilibrio para la unión de menos de 1 nM, 10 nM o 100 nM. La secuencia de ácido nucleico que codifica los anticuerpos identificados iniciales se usan como una plantilla de ácido nucleico para la introducción de variaciones, p.ej., para identificar un segundo anticuerpo que tiene propiedades mejoradas (p.ej., afinidad de unión, cinéticas o estabilidad) respecto al anticuerpo inicial. Selección de constante de disociación. Como una velocidad de disociación lenta puede ser predictiva de alta afinidad, particularmente con respecto a las interacciones entre anticuerpos y sus dianas, los métodos descritos en la presente memoria pueden usarse para aislar anticuerpos con una velocidad de disociación cinética deseada (p.ej., reducida) para una interacción de unión a una diana.

Para seleccionar anticuerpos de disociación lenta de una biblioteca de expresión, la biblioteca se pone en contacto con una diana inmovilizada. La diana inmovilizada se lava entonces con una primera disolución que elimina biomoléculas unidas de forma no específica o débilmente. Después los anticuerpos unidos se eluyen con una segunda disolución que incluye una cantidad de saturación de diana libre o un anticuerpo monoclonal que compite a alta afinidad específico de la diana, es decir, réplicas de la diana que no están unidas a la partícula. La diana libre se une a biomoléculas que se disocian de la diana. Que se una de nuevo se evita de forma efectiva mediante la cantidad de saturación de diana libre respecto a la concentración mucho más baja de diana inmovilizada.

La segunda disolución puede tener condiciones de disolución que son sustancialmente fisiológicas o que son rigurosas. Típicamente, las condiciones de disolución de la segunda disolución son idénticas a las condiciones de disolución de la primera disolución. Se recogen fracciones de la segunda disolución en orden temporal para distinguir las fracciones tempranas de las tardías. Las fracciones tardías incluyen biomoléculas que se disocian a una velocidad más lenta de la diana que las biomoléculas en las fracciones tempranas.

Adicionalmente, es posible también recuperar los miembros de la biblioteca de expresión que permanecen unidos a la diana incluso después de la incubación extendida. Estos pueden o disociarse usando condiciones caotrópicas o pueden amplificarse mientras se unen a la diana. Por ejemplo, el fago unido a la diana puede ponerse en contacto con células bacterianas.

Selección o cribado para la especificidad. Los métodos de cribado de la biblioteca de expresión descritos en la presente memoria pueden incluir un proceso de selección o cribado que descarta los miembros de biblioteca de expresión que se unen a una molécula no diana. Ejemplos de moléculas no diana incluyen estreptavidina en perlas magnéticas, agentes de bloqueo tal como albúmina de suero bovino, leche bovina que no es grasa, cualquier anticuerpo monoclonal de captura o inmovilización de la diana, o células no transfectadas que no expresan la diana de FcRn humana.

En una implementación, se usa una denominada etapa de “selección negativa” para discriminar entre la diana y molécula no diana relacionada y unas moléculas que no son diana relacionadas pero distintas. La biblioteca de expresión o un grupo de la misma se ponen en contacto con la molécula que no es diana. Los miembros de la muestra que no se unen a la no diana se recogen y se usan en posteriores selecciones para la unión a la molécula diana o incluso para selecciones negativas posteriores. La etapa de selección negativa puede ser previa o posterior a la selección de los miembros de la biblioteca que se unen a la molécula diana.

En otra implementación, se usa una etapa de cribado. Después de aislarse los miembros de la biblioteca de expresión para la unión a la molécula diana, cada miembro de la biblioteca aislado se prueba por su capacidad de unirse a una molécula no diana (p.ej., una no diana enumerada anteriormente). Por ejemplo, una criba ELISA de alto rendimiento puede usarse para obtener este dato. El cribado de ELISA puede usarse también para obtener datos cuantitativos para la unión de cada miembro de la biblioteca a la diana además de para la reactividad de especies cruzadas a dianas relacionadas o subunidades de la diana (p.ej., FcRn de rata; microglobulina p2) y también bajo una condición diferente tal como pH 6 o pH 7,5. Los datos de unión a la no diana y la diana se comparan (p.ej., usando un ordenador y software) para identificar los miembros de la biblioteca que se unen específicamente a la diana.

Otras bibliotecas de expresión

Otros tipos de colecciones de proteínas (p.ej., bibliotecas de expresión) pueden usarse para identificar proteínas con una propiedad particular (p.ej., capacidad para unirse a FcRn y/o capacidad para modular FcRn), incluyendo, p.ej., series de proteínas de anticuerpos (véase, p.ej., De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994), bibliotecas lambda gt11, bibliotecas de dos híbridos, etcétera.

Bibliotecas de anticuerpos

En una realización, la biblioteca presenta un grupo diverso de polipéptidos, cada uno de los cuales incluye un dominio de inmunoglobulina, p.ej., un dominio variable de inmunoglobulina. Las bibliotecas de expresión son particularmente útiles, por ejemplo, para identificar anticuerpos humanos o “humanizados” que reconocen los antígenos humanos. Dichos anticuerpos pueden usarse como agentes terapéuticos para tratar trastornos humanos tales como trastornos autoinmunes. Debido a que las regiones constantes y estructurales del anticuerpo son humanas, estos anticuerpos terapéuticos pueden evitar por sí mismos el ser reconocidos y ser objetivos como antígenos. Las regiones constantes pueden también optimizarse para emplear funciones efectoras del sistema inmune humano. El proceso de selección de expresión in vitro supera la incapacidad de un sistema inmune humano normal para generar anticuerpos contra los autoantígenos.

Una biblioteca de expresión de anticuerpos típica presenta un polipéptido que incluye un domino V^h y un dominio V^l. Un “dominio de inmunoglobulina” se refiere a un dominio procedente del dominio variable o constante de las moléculas de inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina contienen típicamente dos láminas p formadas por aproximadamente siete cadenas p, y un enlace disulfuro conservado (véase, p.ej., A. F. Williams y A. N. Barclay, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6:381-405). La biblioteca de expresión puede presentar al anticuerpo como un fragmento Fab (p.ej., usando dos cadenas polipeptídicas) o una única cadena Fv (p.ej., usando una cadena polipeptídica única). También pueden usarse otros formatos.

Como en el caso del Fab y otros formatos, el anticuerpo presentado puede incluir una o más regiones constantes como parte de una cadena ligera y/o pesada. En una realización, cada cadena incluye una región constante, p.ej., como en el caso de un Fab. En otras realizaciones, se presentan regiones constantes adicionales.

Las bibliotecas de anticuerpos pueden construirse mediante un número de procesos (véase, p.ej., de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30; Hoogenboom et al., 1998, Immunotechnology 4:1-20; y Hoogenboom et al., 2000, Immunol. Today 21:371-378. Además, los elementos de cada proceso pueden combinarse con los de otros procesos. Los procesos pueden usarse de manera que la variación se introduce en un único dominio de inmunoglobulina (p.ej., VH o VL) o en múltiples dominios de inmunoglobulina (p.ej., VH y VL). La variación puede introducirse en un dominio variable de inmunoglobulina, p.ej., en la región de una o más de CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 y FR4, en referencia a dichas regiones de cualquiera o ambos de dominios variables de cadena pesada y ligera. En una realización, se introduce la variación en las tres CDR de un dominio variable dado. En otra realización, la variación se introduce en CDR1 y CDR2, p.ej., de un dominio variable de cadena pesada. Cualquier combinación es factible. En un proceso, las bibliotecas de anticuerpos se construyen insertando diversos oligonucleótidos que codifican CDR en las regiones correspondientes del ácido nucleico. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse usando nucleótidos o trinucleótidos monoméricos. Por ejemplo, Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol.

296:57-86 describe un método para construir oligonucleótidos que codifican CDR usando la síntesis de trinucleótido y una plantilla con sitios de restricción fabricados para aceptar los oligonucleótidos.

En otro proceso, un animal, p.ej., un roedor, se inmuniza con el FcRn. El animal se estimula opcionalmente con el antígeno para estimular más la respuesta. Después las células del bazo se aíslan del animal, y el ácido nucleico que codifica los dominios V^h y/o V^l se amplifica y se clona para la expresión en la biblioteca de expresión.

En aún otro proceso, las bibliotecas de anticuerpos se construyen desde ácido nucleico amplificado a partir de genes de inmunoglobulina de la línea germinal no tratados anteriormente. El ácido nucleico amplificado incluye ácido nucleico que codifica el dominio V^h y/o V^l. Las fuentes de ácidos nucleicos que codifican la inmunoglobulina se describen a continuación. La amplificación puede incluir PCR, p.ej., con cebadores que hibridan con la región constante conservada, u otro método de amplificación.

Los dominios de inmunoglobulina que codifican ácido nucleico pueden obtenerse de las células inmunes de, p.ej., un humano, un primate, ratón, conejo, camello, llama o roedor. En un ejemplo, las células se seleccionan para una propiedad particular. Las células B en diversas etapas de maduración pueden seleccionarse. En otro ejemplo, las células B no se han tratado nunca.

En una realización, se usa una clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para clasificar células B que expresan moléculas de IgM, IgD o IgG unidas a la superficie. Además, las células B que expresan diferentes isotipos de IgG pueden aislarse. En otra realización, la célula B o T se cultiva in vitro. Las células pueden estimularse in vitro, p.ej., cultivando con células alimentadoras o añadiendo mitógenos u otros reactivos moduladores, tal como anticuerpos a CD40, ligando CD40 o CD20, acetato de miristato de forbol, lipopolisacárido bacteriano, concanavalina A, fitohemaglutinina o mitógeno de hierba carmín.

En aún una realización, las células se aíslan de un sujeto que tiene un trastorno autoinmune, p.ej., lupus eritomatoso sistémico (LES), artritis reumatoide, vasculitis, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica o síndrome antifosfolipídico. El sujeto puede ser un humano, o un animal, p.ej., un modelo animal para la enfermedad humana, o un animal que tiene un trastorno análogo. En aún una realización, las células se aíslan de un animal no humano transgénico que incluye un sitio de inmunoglobulina humana.

En una realización, las células tienen activo un programa de hipermutación somática. Las células pueden estimularse para experimentar mutagénesis somática de genes de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante tratamiento con anticuerpos anti-inmunoglobulina, anti-CD40, y anti-CD38 (véase, p.ej., Bergthorsdottir et al., 2001, J. Immunol. 166:2228). En una realización, las células no se han tratado nunca.

El ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina puede aislarse de un repertorio natural mediante el siguiente método ejemplar. Primero, se aísla ARN de la célula inmune. Se separan los ARNm de longitud completa (es decir, protegidos) (p.ej., degradando los ARN no protegidos con fosfatasa intestinal de ternera). La protección se elimina entonces con pirofosfatasa ácida de tabaco y se usa la transcripción inversa para producir ADNc.

La transcripción inversa de la primera hebra (antisentido) puede hacerse de cualquier manera con cualquier cebador adecuado. Véase, p.ej., de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30. La región de unión al cebador puede ser constante entre diferentes inmunoglobulinas, p.ej., para transcribir de forma inversa diferentes isotipos de inmunoglobulina. La región de unión al cebador puede además ser específica para un isotipo particular de inmunoglobulina. Típicamente, el cebador es específico para una región que es 3’ a una secuencia que codifica al menos una CDR. En una realización, pueden usarse cebadores poli-dT (y pueden preferirse para los genes de la cadena pesada).

Una secuencia sintética puede ligarse al extremo 3’ de la hebra transcrita de forma inversa. La secuencia sintética puede usarse como un sitio de unión al cebador para la unión del cebador directo durante la amplificación de PCR después de la transcripción inversa. El uso de la secuencia sintética puede obviar la necesidad de usar un grupo de diferentes cebadores directos para capturar completamente la diversidad disponible.

El gen que codifica el dominio variable se ejemplifica después, p.ej., usando una o más series. Si se usan múltiples series, pueden usarse cebadores anidados para fidelidad aumentada. El ácido nucleico amplificado se clona entonces en un vector de la biblioteca de expresión.

Métodos de cribado secundario

Después de seleccionar los miembros de la biblioteca candidatos que se unen a una diana, cada miembro de la biblioteca candidato puede analizarse más, p.ej., para caracterizar adicionalmente sus propiedades de unión para la diana. Cada miembro de la biblioteca candidato puede someterse a uno o más ensayos de cribado secundarios. El ensayo puede ser para una propiedad de unión, una propiedad catalítica, una propiedad inhibidora, una propiedad fisiológica (p.ej., citotoxicidad, aclaramiento renal, inmunogenicidad), una propiedad estructural (p.ej., estabilidad, conformación, estado de oligomerización) u otra propiedad funcional. El mismo ensayo puede usarse de forma repetida, pero con condiciones variables, p.ej., para determinar las sensibilidades al pH, iónicas o térmicas.

Cuando sea apropiado, los ensayos pueden usar un miembro de la biblioteca de expresión directamente, un polipéptido recombinante producido a partir del ácido nucleico que codifica el polipéptido seleccionado, o un péptido sintético sintetizado en base a la secuencia del polipéptido seleccionado. Los ensayos ejemplares para las propiedades de unión incluyen los siguientes.

ELISA. Los anticuerpos seleccionados a partir de una biblioteca de expresión pueden también cribarse para una propiedad de unión usando un ELISA. Por ejemplo, cada anticuerpo se pone en contacto con una placa de microvaloración cuya superficie del fondo se ha recubierto con la diana, p.ej., una cantidad limitante de la diana. La placa se lava con tampón para eliminar polipéptidos unidos de forma no específica. Después la cantidad del anticuerpo unido a la placa se determina sondando la placa con un anticuerpo que puede reconocer al anticuerpo de prueba, p.ej., una etiqueta o parte constante del anticuerpo. El anticuerpo de detección se une a una enzima tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante (HRP) que produce un producto colorimétrico cuando se proporcionan sustratos apropiados.

En el caso de un anticuerpo de una biblioteca de expresión, el anticuerpo puede purificarse a partir de células o ensayarse en un formato de biblioteca de expresión, p.ej., como una fusión con un recubrimiento de bacteriófago filamentoso. En otra versión del ELISA, cada anticuerpo seleccionado de una biblioteca de expresión se usa para recubrir un pocillo diferente de una placa microvaloración. El ELISA continúa después usando una molécula diana constante para estudiar cada pocillo.

Ensayos de unión homogéneos. La interacción de unión del anticuerpo candidato con una diana puede analizarse usando un ensayo homogéneo, es decir, después de añadirse todos los componentes del ensayo, no se necesitan manipulaciones de fluido adicionales. Por ejemplo, puede usarse transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET por sus siglas en inglés) como un ensayo homogéneo (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., Patente de EE.UU. núm. 5.631.169; Stavrianopoulos, et al., Patente de EE.UU. núm. 4.868.103). Una etiqueta de fluoróforo en la primera molécula (p.ej., la molécula identificada en la fracción) se selecciona de manera que su energía fluorescente emitida puede absorberse por una etiqueta fluorescente en una segunda molécula (p.ej., la diana) si la segunda molécula está en la proximidad de la primera molécula. La etiqueta fluorescente en la segunda molécula fluoresce cuando absorbe la energía transferida. Como la eficiencia de transferencia de energía entre las etiquetas se relaciona a la distancia que separa las moléculas, la relación espacial entre las moléculas puede evaluarse. En una situación en que se da la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente de la etiqueta de la molécula “aceptora” en el ensayo debería ser máxima. Un suceso de unión que se configura para la monitorización por FRET puede medirse convenientemente a través de medios de detección fluorimétrica estándar bien conocidos en la técnica (p.ej., usando un fluorímetro). Valorando la cantidad de la primera o segunda molécula de unión, puede generarse una curva de unión para estimar la constante de unión de equilibrio.

Otro ejemplo de un ensayo homogéneo es ALPHASCREEN™ (Packard Bioscience, Meriden CT). ALPHASCREEN™ usa dos perlas etiquetadas. Una perla genera oxígeno singlete cuando se excita mediante un láser. La otra perla genera una señal de luz cuando el oxígeno singlete difunde desde la primera perla y colisiona con ella. La señal solo se genera cuando las dos perlas están en proximidad. Una perla puede unirse al miembro de la biblioteca de expresión, la otra a la diana. Las señales se miden para determinar el grado de unión.

Los ensayos homogéneos pueden realizarse mientras el polipéptido candidato está unido al vehículo de la biblioteca de expresión, p.ej., un bacteriófago.

Resonancia del plasmón superficial (SPR por sus siglas en inglés). La interacción de unión de una molécula aislada desde una biblioteca de expresión y una diana puede analizarse usando SPR. SPR o Análisis de interacción biomolecular (BIA por sus siglas en inglés) detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar a ninguno de los agentes que interactúan. Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativo de un suceso de unión) del chip de BIA dan por resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia del plasmón superficial (SPR)). Los cambios en la refractividad generan una señal detectable, que se miden como una indicación de reacciones a tiempo real entre moléculas biológicas. Los métodos para usar SPR se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. núm. 5.641.640; Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander y Urbaniczky, 1991, Anal., Chem. 63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 y las fuentes en línea proporcionan por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia).

La información de SPR puede usarse para proporcionar una medida exacta y cuantitativa de la constante de disociación de equilibrio (Kd), y parámetros cinéticos, que incluyen Kon y Koff, para la unión de una biomolécula a una diana. Dichos datos pueden usarse para comparar biomoléculas diferentes. Por ejemplo, las proteínas seleccionadas de una biblioteca de expresión pueden compararse para identificar proteínas que tienen alta afinidad por la diana o que tienen una Koff lenta. Esta información puede usarse también para desarrollar relaciones de estructura-actividad (SAR por sus siglas en inglés). Por ejemplo, los parámetros cinéticos y de unión en equilibrio de versiones maduras de una proteína parental pueden compararse con los parámetros de la proteína parental. Pueden identificarse aminoácidos variantes en posiciones dadas que correlacionan con parámetros de unión particulares, p.ej., alta afinidad y Koff lenta. Esta información puede combinarse con el modelado estructural (p.ej., usando modelado por homología, minimización de la energía, o determinación de la estructura por cristalografía por rayos X o RMN). Como resultado, un entendimiento de la interacción física entre la proteína y su diana puede formularse y usarse para guiar otros procesos de diseño.

Ensayos celulares. Una biblioteca de anticuerpos candidatos (p.ej., identificados anteriormente mediante una biblioteca de expresión o de otra forma) pueden cribarse por la unión con la diana en células que expresan de forma temporal o estable y presentan la diana de interés en la superficie celular. Por ejemplo, la diana puede incluir secuencias de vector de ácido nucleico que incluyen segmentos que codifican solo la parte extracelular de los polipéptidos de manera que los polipéptidos diana quiméricos se producen en la célula, se secretan de la célula, o se unen a la superficie celular a través del ancla, p.ej., en fusión con unas proteínas de anclaje a la membrana tal como Fc. La diana expresada en la superficie celular puede usarse para cribar anticuerpos que se unen a FcRn y bloquean la unión de IgG-Fc. Por ejemplo, la IgG-Fc humana no específica podría etiquetarse de forma fluorescente y su unión a FcRn en presencia o ausencia de anticuerpo antagonista puede detectarse mediante un cambio en la intensidad de fluorescencia usando citometría de flujo p.ej., una máquina FACS.

Otros métodos para obtener anticuerpos de unión a FcRn

Además del uso de las bibliotecas de expresión, otros métodos pueden usarse para obtener un anticuerpo de unión a FcRn. Por ejemplo, la proteína de FcRn o una región de la misma pueden usarse como un antígeno en un animal no humano, p.ej., un roedor.

En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpo de ratón con grandes fragmentos de las posiciones de Ig humana. Usando la tecnología de hibridoma, los anticuerpos monoclonales específicos del antígeno (Mabs) derivados de los genes con la especificidad deseada puede producirse y seleccionarse. Véase, p.ej., XEnOm OUSE™, Green et al., 1994, Nat. Gen. 7:13-21; documento U.S. 2003-0070185, publicación internacional WO 96/34096, publicado el 31 de octubre de 1996, y la Solicitud PCT núm. PCT/US96/05928, presentada el 29 de abril de 1996.

En una realización, un anticuerpo monoclonal se obtiene a partir del animal no humano, y después se modifica, p.ej., se humaniza o desinmuniza. Winter describe un método de injerto en CDR que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados (Solicitud de patente de RU GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Patente de EE.UU. núm. 5.225.539. Todas las CDR de un anticuerpo humano particular pueden sustituirse con al menos una parte de una CDR no humana o solo algunas de las CDR pueden sustituirse con CDR no humanas. Solo es necesario sustituir el número de CDR necesarias para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Los anticuerpos humanizados pueden generarse sustituyendo secuencias de la región variable Fv que no están implicadas directamente en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables de Fv humanas. Los métodos generales para generar anticuerpos humanizados se proporcionan por Morrison, S.L., 1985, Science 229:1202-1207, por Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, y por Queen et al. Patentes de EE.UU. núms. 5.585.089, US 5.693.761 y US 5.693.762. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todas o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Las fuentes de dicho ácido nucleico se conocen bien por los expertos en la técnica y, por ejemplo, pueden obtenerse a partir de un hibridoma que produce un anticuerpo frente a una diana predeterminada, como se describe anteriormente. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o fragmento del mismo, puede entonces clonarse en un vector de expresión apropiado.

Un anticuerpo de unión a FcRn puede también modificarse por supresión específica de epítopos de célula T humana o “desinmunización” por los métodos descritos en las publicaciones internacionales WO 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo pueden analizarse para péptidos que se unen a MHC Clase II; estos péptidos representan epítopos de célula T potenciales (como se define en las publicaciones internacionales WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopos de célula T potenciales, puede aplicarse un enfoque de modelado por ordenador denominado “reconocimiento del plegamiento de péptidos”, y además puede buscarse en una base de datos de péptidos de unión de MHC de clase II humano los diseños presentes en las secuencias V^h y V^l, como se describe en las publicaciones internacionales WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos diseños se unen a cualquiera de los 18 alotipos de MHC humano de clase II DR principales, y constituyen así los epítopos de célula T potenciales. Los epítopos de célula T potenciales detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeños números de residuos de aminoácido en las regiones variables o mediantes sustituciones de aminoácidos individuales. En la medida de lo posible se hacen sustituciones conservativas, a menudo aunque no de forma exclusiva, puede usarse un aminoácido común en esta posición en secuencias de anticuerpo de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana se describen en Tomlinson, I.A. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. et al., 1995, Immunol. Today Vol. 16(5):237-242; Chothia, D. et al., 1992, J. Mol. Bio. 227:799-817. El directorio V BASE proporciona un directorio completo de las secuencias de la región variable de la inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU). Después de identificarse los cambios de la desinmunización, los ácidos nucleicos que codifican V^h y V^l pueden construirse por mutagénesis u otros métodos sintéticos (p.ej., síntesis de novo, sustitución de casete, etcétera). La secuencia variable mutagenizada puede condensarse, opcionalmente, con una región constante humana, p.ej., regiones constantes IgG1 o ^k humanas.

En algunos casos, un epítopo de célula T potencia incluirá residuos que se conocen o se predice que son importantes para la función de anticuerpo. Por ejemplo, los epítopos de células T potenciales están normalmente predispuestos hacia las CDR. Además, los epítopos de células T potenciales pueden darse en residuos estructurales importantes para la estructura y la unión del anticuerpo. Los cambios para eliminar estos epítopos potenciales necesitarán en algunos casos más escrutinio, p.ej., fabricando y probando cadenas con o sin el cambio. Donde fue posible, los epítopos de células T potenciales que solapan las CDR se eliminaron mediante sustituciones fuera de las CDR. En algunos casos, una alteración en una CDR es la única opción, y por consiguiente deberían probarse las variantes con y sin esta sustitución. En otros casos, la sustitución necesaria para eliminar un epítopo de célula T potencial está en una posición de residuo en la estructura que sería crítica para la unión del anticuerpo. En estos casos, las variantes con y sin esta sustitución deberían probarse. Por consiguiente, en algunos casos se diseñaron varias regiones variables de cadena pesada y ligera desinmunizadas variantes y se probaron varias combinaciones de cadena pesada/ligera para identificar el anticuerpo desinmunizado óptimo. La elección del anticuerpo desinmunizado final puede hacerse entonces considerando la afinidad de unión de las diferentes variantes en conjunto con el grado de desinmunización, es decir, el número de epítopos de célula T potenciales que permanece en la región variable. La desinmunización puede usarse para modificar cualquier anticuerpo, p.ej., un anticuerpo que incluye una secuencia no humana, p.ej., un anticuerpo sintético, un anticuerpo murino distinto del anticuerpo monoclonal no humano, o un anticuerpo aislado de una biblioteca de expresión.

Anticuerpos de la línea germinal

Un anticuerpo usado para tratar una enfermedad autoinmune mediada por IgG puede usarse para administraciones múltiples. Las precauciones que disminuirían la inmunogenicidad del anticuerpo terapéutico incluyen volver uno o más aminoácidos de la línea no germinal en las regiones estructurales a los correspondientes aminoácidos de la línea germinal (p.ej., en tanto que las propiedades de unión se retengan de forma sustancial) del anticuerpo (especialmente de Fabs).

Es posible modificar un anticuerpo que se une a FcRn, p.ej., un anticuerpo descrito en la presente memoria, para hacer las regiones variables del anticuerpo más parecidas a una o más secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una, dos, tres o más sustituciones de aminoácidos, p.ej., en una estructura, CDR, o región constante, para hacerla más parecida a una secuencia de línea germinal de referencia. Un método ejemplar para hacer la línea germinal puede incluir identificar una o más secuencias de la línea germinal que son parecidas (p.ej., las más parecidas en una base de datos particular) a la secuencia del anticuerpo aislado. Las mutaciones (al nivel de aminoácidos) pueden hacerse entonces en el anticuerpo aislado, o bien de forma gradual o en combinación con otras mutaciones. Por ejemplo, se fabrica una biblioteca de ácidos nucleicos que incluye secuencias que codifican algunas o todas las mutaciones posibles en la línea germinal. Los anticuerpos mutados se evalúan entonces, p.ej., para identificar un anticuerpo que tiene uno o más residuos de la línea germinal adicionales respecto al anticuerpo aislado y que es aún útil (p.ej., tiene una actividad funcional). En una realización, se introducen tantos residuos de la línea germinal en un anticuerpo aislado como sea posible.

En una realización, se usa la mutagénesis para sustituir o insertar uno o más residuos de la línea germinal en una región estructural y/o constante. Por ejemplo, un residuo de la región estructural y/o constante de la línea germinal puede provenir de una secuencia de línea germinal que es parecida (p.ej., lo más parecida) a la región no variable que se modifica. Después de la mutagénesis, la actividad (p.ej., unión u otra actividad funcional) del anticuerpo puede evaluarse para determinar si el residuo o residuos de la línea germinal se toleran (es decir, no abolen la actividad). Puede realizarse una mutagénesis parecida en las regiones estructurales.

La selección de una secuencia de línea germinal puede realizarse de formas diferentes. Por ejemplo, una secuencia de línea germinal puede seleccionarse si cumple unos criterios predeterminados para la selectividad o semejanza, p.ej., al menos un cierto porcentaje de identidad, p.ej., al menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5% de identidad. La selección puede realizarse usando al menos 2, 3, 5 o 10 secuencias de línea germinal. En el caso de CDR1 y CDR2, identificar una secuencia de línea germinal parecida puede incluir seleccionar una de dichas secuencias. En el caso de CDR3, identificar una secuencia similar de la línea germinal puede incluir la selección de una de dichas secuencias, pero puede incluir el uso de dos secuencias de la línea germinal que contribuyen de forma separada a la parte amino-terminal y la parte carboxi-terminal. En otras implementaciones se usan más de una o dos secuencias de la línea germinal, p.ej., para formar una secuencia de consenso.

En una realización, con respecto a una secuencia de dominio variable de referencia particular, p.ej., una secuencia descrita en la presente memoria, una secuencia de dominio variable relacionada tiene al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100% de las posiciones de aminoácidos de la CDR que no son idénticas a los residuos en las secuencias CDR de referencia, los residuos que son idénticos a los residuos en las posiciones correspondientes en una secuencia de la línea germinal humana (es decir, una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de línea germinal humana).

En una realización, con respecto a una secuencia de domino variable de referencia particular, p.ej., una secuencia descrita en la presente memoria, una secuencia de dominio variable relacionada tiene al menos 30, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% de las regiones FR que son idénticas a la secuencia FR de una secuencia de línea germinal humana, p.ej., una secuencia de línea germinal relacionada con la secuencia de dominio variable de referencia.

Por consiguiente, es posible aislar un anticuerpo que tiene actividad parecida a un anticuerpo de interés dado, pero es más parecido a una o más secuencias de línea germinal, particularmente una o más secuencias de línea germinal humana. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5% idéntico a una secuencia de línea germinal en una región fuera de las CDR (p.ej., regiones estructurales). Además, un anticuerpo puede incluir al menos 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de línea germinal en una región de CDR, siendo el residuo de la línea germinal de una secuencia de línea germinal parecido (p.ej., lo más parecido) a la región variable que se modifica. Las secuencias de la línea germinal de interés principal son secuencias de la línea germinal humana. La actividad del anticuerpo (p.ej., la actividad de unión) puede estar en un factor de 100, 10, 5, 2, 0,5, 0,1 y 0,001 del anticuerpo original.

Las secuencias de referencia de la línea germinal ejemplares para Vkappa incluyen: O12/O2, O18/O8, A20, A30, L14, L1, L15, L4/18a, L5/L19, L8, L23, L9, L24, L11, L12, O11/O1, A17, A1, A18, A2, A19/A3, A23, A27, A11, L2/L16, L6, L20, L25, B3, B2, A26/A10 y A14. Véase, p.ej., Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-3.

Una secuencia de referencia de línea germinal para el dominio variable HC puede basarse en una secuencia que tiene estructuras canónicas particulares, p.ej., estructuras 1-3 en los bucles hipervariables H1 y H2. Las estructuras canónicas de los bucles hipervariables de un dominio variable de inmunoglobulina pueden inferirse de su secuencia, como se describe en Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798); y Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-38. Las secuencias ejemplares con unas 1-3 estructuras incluyen: DP-1, DP-8, DP-12, DP-2, DP-25, DP-15, DP-7, DP-4, DP-31, DP-32, DP-33, DP-35, DP-40, 7-2, hv3005, hv3005f3, DP-46, DP-47, DP-58, DP-49, DP-50, DP-51, DP-53 y DP-54.

Producción de ligando

Pueden usarse métodos de ácido nucleico recombinante estándar para expresar un anticuerpo que se une a FcRn. Generalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión de ácido nucleico. Por supuesto, si el anticuerpo incluye múltiples cadenas polipeptídicas, cada cadena puede clonarse en un vector de expresión, p.ej., los mismos o diferentes vectores, que se expresan en las mismas o diferentes células.

Producción de anticuerpo. Algunos anticuerpos, p.ej., Fabs, pueden producirse en células bacterianas, p.ej., células E. coli. Por ejemplo, si el Fab está codificado por secuencias en un vector de expresión en fagos que incluye un codón de parada suprimible entre la entidad de expresión y una proteína de bacteriófago (o fragmento de la misma), el ácido nucleico vector puede transferirse a una célula bacteriana que no puede suprimir un codón de parada. En este caso, el Fab no se condensa a la proteína de gen III y se secreta en el periplasma y/o el medio.

Los anticuerpos pueden producirse también en células eucariotas. En una realización, los anticuerpos (p.ej., los scFv) se expresan en una célula de levadura tal como Pichia (véase, p.ej., Powers et al., 2001, J. Immunol. Methods 251:123-35), Hanseula o Saccharomyces.

En una realización, los anticuerpos se producen en células de mamífero. Las células huésped de mamífero para expresar los anticuerpos que son clones o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen ovario de hámster chino (células CHO) (que incluyen células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl., Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, p.ej. como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 621), líneas celulares linfocíticas, p.ej., células de mieloma NS0 y células SP2, células COS, y una célula de un animal transgénico, p.ej., un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial mamaria.

Además de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de inmunoglobulina diversificado, los vectores de expresión recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tal como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (p.ej., orígenes de la replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que el vector se ha introducido (véase p.ej., las Patentes de EE.UU. núms. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que el vector se ha introducido. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células huésped dhfr- con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección G418).

En un sistema ejemplar para la expresión recombinante de un anticuerpo, o la parte de unión al antígeno del mismo, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en células CHO dhfr mediante transfección mediada por fosfato de calcio. En el vector de expresión recombinante, los genes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se unen cada uno de forma operativa a elementos reguladores del potenciador/promotor (p.ej., derivado de SV40, CMV, adenovirus y similares, tal como un elemento regulador de potenciador CMV/promotor AdMLP o un elemento regulador de potenciador SV40/promotor AdMLP) para llevar a altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando la selección/amplificación de metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Las técnicas de biología molecular estándar se usan para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar los transformantes, cultivar las células huésped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos pueden aislarse por cromatografía de afinidad con una matriz acoplada a proteína A o Proteína G.

Para los anticuerpos que incluyen un dominio Fc, el sistema de producción de anticuerpos puede producir anticuerpos en que la región Fc está glucosilada. Por ejemplo, el dominio Fc de moléculas IgG se glucosila en la asparagina 297 en el dominio CH2. Esta asparagina es el sitio para la modificación con oligosacáridos tipo biantenario. Se ha demostrado que esta glucosilación se necesita para funciones efectoras mediadas por los receptores Fcg y el complemento C1q (Burton y Woof, 1992, Adv. Immunol. 51:1 -84; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). En una realización, el dominio Fc se produce en un sistema de expresión de mamífero que glucosila de forma apropiada el residuo correspondiente a asparagina 297. El dominio Fc puede incluir también otras modificaciones post-traduccionales eucariotas.

Los anticuerpos pueden producirse también mediante un animal transgénico. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. núm. 5.849.992 describe un método de expresión de un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Se construye un transgén que incluye un promotor específico de leche y ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de interés y una secuencia señal para la secreción. La leche producida por las hembras de dichos mamíferos transgénicos incluye, secretada en ella, el anticuerpo de interés. El anticuerpo puede purificarse de la leche, o para algunas aplicaciones, usarse directamente.

Un método para producir un ratón transgénico es como sigue. Brevemente, un constructo de direccionamiento que codifica el anticuerpo se microinyecta en el pronúcleo macho de oocitos fertilizados. Los oocitos se inyectan en el útero de una madre de acogida pseudoembarazada para el desarrollo en crías viables. Alguna descendencia incorpora el transgén.

Sistemas de ensayo para los anticuerpos candidatos de FcRn

Los anticuerpos candidatos de FcRn pueden caracterizarse adicionalmente en ensayos que miden su actividad moduladora hacia FcRn o fragmentos de los mismos in vitro o in vivo. Por ejemplo, el FcRn puede combinarse con un sustrato tal como IgG no específica o la parte Fc de la IgG o albúmina bajo condiciones de ensayo que permiten la reacción del FcRn con el sustrato. El ensayo se realiza en ausencia del anticuerpo candidato de FcRn, y en presencia de concentraciones crecientes del anticuerpo candidato de FcRn. La concentración de anticuerpo candidato al que el 50% de la actividad de FcRn (p.ej., unión al sustrato) se inhibe mediante el anticuerpo candidato es el valor CI50 (Concentración inhibidora al 50%) o valor CE50 (Concentración efectiva al 50%) para ese anticuerpo. En una serie o grupo de anticuerpos candidatos, los que tienen valores CI50 o CE50 menores se consideran inhibidores más potentes de FcRn que los anticuerpos que tienen valores CI50 o CE50 mayores. En algunas realizaciones, los anticuerpos tienen un valor CI50 de 800 nM, 400 nM, 100 nM, 25 nM, 5 nM, 1 nM, o menos como se mide en un ensayo in vitro para la inhibición de la actividad de FcRn.

Los anticuerpos candidatos pueden también evaluarse por la selectividad hacia FcRn. Por ejemplo, un anticuerpo candidato de FcRn puede evaluarse por su potencia hacia FcRn y un panel de receptores de superficie celular, tales como receptores que también utilizan el dominio p2M, y un valor CI50 o valor CE50 puede determinarse para cada proteína receptora. En una realización, un compuesto que demuestra un bajo valor CI50 o valor CE50 para el FcRn, y un mayor valor de CI50 o CE50 para otros receptores en el panel de prueba (p.ej., moléculas MHC de clase I) se considera que es selectivo hacia FcRn.

Las células endoteliales o células epiteliales ex vivo que expresan el FcRn endógeno podrían usarse para seguir la endocitosis o transcitosis de los anticuerpos candidatos bajo diferentes condiciones de pH y temperatura. La transcitosis de IgG o reciclado mediante FcRn puede medirse siguiendo un anticuerpo etiquetado en presencia o ausencia de varios compuestos químicos y bajo condiciones diferentes que se sabe que influyen o afectan la ruta de tráfico intracelular.

Un estudio farmacocinético en ratas, ratones o monos podría realizarse con anticuerpos de unión a FcRn dependientes e independientes del pH para determinar su vida media en el suero. Asimismo, el efecto protector del anticuerpo puede evaluarse in vivo para el uso potencial en la terapia de inmunomodulación o como una inmunoterapia de salvamento inyectando el anticuerpo en presencia o ausencia de una IgG etiquetada o la parte Fc etiquetado de la IgG. Una disminución en la vida media de la IgG/Fc etiquetada en presencia del anticuerpo candidato es una indicación de la eficacia terapéutica del anticuerpo.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la descripción proporciona composiciones, p.ej., composiciones farmacéuticamente aceptables o composiciones farmacéuticas, que incluye un anticuerpo de unión a FcRn. El anticuerpo de unión a FcRn puede formularse junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas incluyen composiciones terapéuticas y composiciones diagnósticas, p.ej., composiciones que incluyen anticuerpos de unión a FcRn etiquetados para la formación de imágenes in vivo.

Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p.ej., mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el anticuerpo de unión a FcRn puede estar recubierto en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Una sal farmacéuticamente aceptable es una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto parental y no da ningún efecto toxicológico no deseado (véase p.ej., Berge, S.M., et al., 1977, J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, además de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Sales de adición de base incluyen los derivados de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, además de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N’-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Las composiciones pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tal como disoluciones líquidas (p.ej., disoluciones inyectables e en infusión), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma puede depender del modo previsto de administración y aplicación terapéutica. Muchas composiciones están en forma de disoluciones inyectables o en infusión, tal como composiciones similares a las usadas para la administración de humanos con anticuerpos. Un modo ejemplar de administración es parenteral (p.ej., intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una realización, el anticuerpo de unión a FcRn se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización, el anticuerpo de unión a FcRn se administra por inyección intramuscular o subcutánea.

La composición puede formularse como una disolución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco. Las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, el ligando) en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se necesite, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por congelación que da un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional procedente de una disolución filtrada estéril previamente del mismo. La fluidez apropiada de una disolución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede proporcionarse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Un anticuerpo de unión a FcRn puede administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones, la ruta/modo de administración es inyección o infusión intrevenosa. Por ejemplo, para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo de unión a FcRn puede administrarse por infusión intravenosa a una velocidad de menos de 30, 20, 10, 5 o 1 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2 o 7 a 25 mg/m2. La ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá el compuesto frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluyen implantes, y sistemas de distribución microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tal como etilenvinilacetato, polianhídridos, poli(ácido glucólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen de forma general. Véase, p.ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., 1978, Marcel Dekker, Inc., Nueva York.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo puede administrarse de forma oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) puede además estar encerrados en una cápsula de gelatina de carcasa dura o blanda, comprimido en comprimidos, o incorporado directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos que pueden ingerirse, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto descrito en la presente memoria mediante una administración distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, una composición farmacéutica descrita en la presente memoria puede administrarse con un dispositivo, p.ej., un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, una bomba o un implante.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de unión a FcRn puede formularse para asegurar la distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos descritos en la presente memoria cruzan la BHE (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véase, p.ej., Patentes de EE.UU. núms. 4.522.811; 5.374.548 y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que se transportan de forma selectiva a células u órganos específicos, mejorando por consiguiente la distribución dirigida del fármaco (véase, p.ej., V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685).

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (p.ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, puede administrarse varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación por facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas ajustadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas unitarias de dosificación puede estar dictada por y ser directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos como un compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Un intervalo ejemplar, no limitante, para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria es 0,1-20 mg/kg, o 1-10 mg/kg. Puede administrarse un anticuerpo anti-FcRn, p.ej., por infusión intravenosa, p.ej., a una velocidad de menos de 30, 20, 10, 5 o 1 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2 o aproximadamente 5 a 30 mg/m2. Los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la condición a aliviar. Para un sujeto particular, pueden ajustarse los regímenes de dosificación específicos en el tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden incluir una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva de un anticuerpo de unión a FcRn descrito en la presente memoria. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es además una en que cualquier efecto tóxico o nocivo de la composición se sobrepasa por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Estabilización y retención

En una realización, un anticuerpo de unión a FcRn está asociado físicamente con un resto que mejora su estabilización y/o retención en la circulación, p.ej., en sangre, suero, linfa u otros tejidos, p.ej., en al menos 1,5, 2, 5, 10 o 50 veces. Por ejemplo, un anticuerpo de unión a FcRn puede asociarse con un polímero, p.ej., unos polímeros sustancialmente no antigénicos, tal como poli(óxidos de alquileno) o poli(óxidos de etileno). Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Los polímeros que tienen pesos moleculares promedio en número que oscilan de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 (o aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000 y 2.000 a aproximadamente 12.500) pueden usarse. Por ejemplo, un anticuerpo de unión a FcRn puede conjugarse con un polímero soluble en agua, p.ej., polímeros de polivinilo hidrófilos, p.ej., polivinilalcohol y polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de dichos polímeros incluye homopolímeros de poli(óxido de alquileno) tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros en bloque de los mismos, siempre y cuando la solubilidad en agua de los copolímeros en bloque se mantenga.

Kits

Un anticuerpo de unión a FcRn descrito en la presente memoria pueden proporcionarse en un kit, p.ej., como un componente de un kit. Por ejemplo, el kit incluye (a) un anticuerpo de unión a FcRn, p.ej., una composición que incluye un anticuerpo de unión a FcRn, y, opcionalmente (b) material informativo. El material informativo puede ser descriptivo, instructivo, de marketing u otro material que se refiere a los métodos descritos en la presente memoria y/o al uso de un anticuerpo de unión a FcRn para los métodos descritos en la presente memoria.

El material informativo de los kits no está limitado en su forma. En una realización, el material informativo puede incluir información sobre la producción del compuesto, peso molecular del compuesto, concentración, fecha de caducidad, información del lote o sitio de producción, etcétera. En una realización, el material informativo se refiere al uso del anticuerpo para tratar, prevenir o diagnosticar un trastorno descrito en la presente memoria, p.ej., un trastorno autoinmune.

En una realización, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar un anticuerpo de unión a FcRn de una manera adecuada para realizar los métodos descritos en la presente memoria, p.ej., en una dosis, forma de dosificación, o modo de administración adecuados (p.ej., una dosis, forma de dosificación o modo de administración descrito en la presente memoria). En una realización, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar un anticuerpo de unión a FcRn a un sujeto adecuado, p.ej., un humano, p.ej., un humano que tiene, o está en riesgo de, un trastorno autoinmune (p.ej., artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico). Por ejemplo, el material puede incluir instrucciones para administrar un anticuerpo de unión a FcRn a un paciente con lupus o un paciente con otro trastorno autoinmune.

El material informativo de los kits no está limitado en su forma. En muchos casos, el material informativo, p.ej., instrucciones, se proporciona material impreso, p.ej., un texto, dibujo y/o fotografía impresos, p.ej., una etiqueta u hoja impresa. Sin embargo, el material informativo puede también proporcionarse en otros formatos, tal como material legible por ordenador, grabación de vídeo o grabación de audio. En una realización, el material informativo del kit es la información de contacto, p.ej., una dirección física, dirección electrónica, página web, o número de teléfono, donde un usuario del kit puede obtener información sustantiva sobre un anticuerpo de unión a FcRn y/o se usa en los métodos descritos en la presente memoria. Por supuesto, el material informativo puede proporcionarse así en cualquier combinación de formatos.

Además de un anticuerpo de unión a FcRn, la composición del kit puede incluir otros ingredientes, tal como un disolvente o tampón, un estabilizante, un conservante, un agente saborizante (p.ej., un antagonista amargo o un edulcorante), una fragancia u otro ingrediente cosmético, y/o un segundo agente para tratar un trastorno autoinmune descrito en la presente memoria, p.ej., artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico. De forma alternativa, los demás ingredientes pueden incluirse en el kit, pero en diferentes composiciones o recipientes que un anticuerpo de unión a FcRn. En dichas realizaciones, el kit puede incluir instrucciones para mezclar un anticuerpo de unión a FcRn y los demás ingredientes, o para usar un anticuerpo de unión a FcRn junto con los demás ingredientes.

Un anticuerpo de unión a FcRn puede proporcionarse en cualquier forma, p.ej., forma líquida, seca o liofilizada. Se prefiere que un anticuerpo de unión a FcRn sea sustancialmente puro y/o estéril. Cuando un anticuerpo de unión a FcRn se proporciona como una disolución líquida, la disolución líquida preferiblemente es una disolución acuosa, prefiriéndose una disolución acuosa estéril. Cuando un anticuerpo de unión a FcRn se proporciona como una forma seca, la reconstitución generalmente es mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, p.ej., agua estéril o tampón, puede proporcionarse opcionalmente en el kit.

El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición que contiene un anticuerpo de unión a FcRn. En algunas realizaciones, el kit contiene recipientes separados, divisores o compartimientos para la composición y material informativo. Por ejemplo, la composición puede estar contenida en una botella, vial o jeringa, y el material informativo puede estar contenido en una funda o paquete de plástico. En otras realizaciones, los elementos separados del kit están contenidos en un recipiente sencillo, no dividido. Por ejemplo, la composición está contenida en una botella, vial o jeringa que ha unido a ella el material informativo en forma de una etiqueta. En algunas realizaciones, el kit incluye una pluralidad (p.ej., un paquete) de recipientes individuales, cada uno conteniendo una o más formas de dosificación unitaria (p.ej., una forma de dosificación descrita en la presente memoria) de un anticuerpo de unión a FcRn. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringas, ampollas, paquetes de aluminio o paquetes en blísteres, cada uno conteniendo una única dosis unitaria de un anticuerpo de unión a FcRn. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos, resistentes al agua (p.ej., impermeables a los cambios en humedad o evaporación), y/u opacos.

El kit incluye opcionalmente un dispositivo adecuado para la administración de la composición, p.ej., una jeringa, inhalador, pipeta, fórceps, cuchara medida, gotero (p.ej., gotero ocular), bastoncillo (p.ej., un bastoncillo de algodón o bastoncillo de madera), o cualquier dispositivo de distribución. En una realización, el dispositivo es un dispositivo implantable que dispensa dosis medidas del anticuerpo. La descripción también presenta un método para proporcionar un kit, p.ej., combinando componentes descritos en la presente memoria.

Tratamientos

Los anticuerpos que se unen a FcRn y se identifican por el método descrito en la presente memoria y/o se detalla en la presente memoria tienen utilidades terapéuticas y profilácticas. Estos anticuerpos pueden administrarse a un sujeto para tratar, prevenir y/o diagnosticar una variedad de trastornos, que incluyen trastornos autoinmunes, o incluso a células en el cultivo, p.ej., in vitro o ex vivo.

El término “tratar” se refiere a administrar una terapia en una cantidad, manera y/o modo efectivo para mejorar una condición, síntoma o parámetro asociado con un trastorno o para evitar la progresión de un trastorno, a o un grado estadísticamente significativo o a un grado detectable por un experto en la técnica. Una cantidad, manera o modo efectivo puede variar dependiendo del sujeto y puede ajustarse al sujeto. El sujeto puede ser un humano o un animal no humano, p.ej., un mamífero no humano.

El anticuerpo de unión a FcRn puede administrarse en una cantidad terapéuticamente efectiva, p.ej., de manera que tras la administración de dosis única o múltiple a un sujeto, el sujeto muestre una mejora de los síntomas de un trastorno, p.ej., un trastorno autoinmune (p.ej. artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico) o de un parámetro indicativo de presencia o riesgo del trastorno.

Los trastornos ejemplares que afectan muchos órganos u órganos localizados en el cuerpo incluyen: esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales (EII), lupus y espondilitis anquilosante. Algunos de estos trastornos se tratan a continuación. En un aspecto, los anticuerpos de la invención pueden usarse en métodos para el tratamiento del cáncer. Aún otros trastornos que pueden tratarse usando un anticuerpo de unión a FcRn incluyen: escleroderma, síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, granulomatosis de Wegener, polimialgia reumática, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad del oído interno autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA), púrpura trombocitopénica autoinmune (PTA), enfermedad de Behcet, penfigoide ampulloso, cardiomiopatía, celiaquíadermatitis, síndrome de fatiga crónica y síndrome de deficiencia inmune (SFCDI), polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica, penfigoide cicatricial, enfermedad de aglutinina fría, síndrome CREST, enfermedad de Crohn, enfermedad de Dego, dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, fibromiositis, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía de IgA, diabetes dependiente de la insulina (tipo I), artritis juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad del tejido conectivo mixto, miastenia grave, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo paraneoplásico, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandular, polimialgia reumática, polimiositis, dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, soriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, sarcoidosis, síndrome de la persona rígida, arteritis de Takayasu, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de unión a anti-FcRn se administra para eliminar un anticuerpo terapéutico indeseado de la corriente sanguínea.

En algunas realizaciones, un anticuerpo de unión a anti-FcRn se administra para suprimir el nivel de anticuerpos anti-HLA. En algunas realizaciones el nivel de anticuerpos anti-HLA se suprime en conexión con el trasplante de órganos.

Los métodos de administración de anticuerpos de unión a FcRn se describen en “composiciones farmacéuticas”. Las dosis adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y el fármaco particular usado. Los anticuerpos pueden usarse como agentes competitivos para inhibir o reducir una interacción indeseable, p.ej., entre un agente natural o patológico y el FcRn.

El anticuerpo de unión a FcRn puede usarse para distribuir macro y micromoléculas, p.ej., un gen en la célula para propósitos de terapia génica en el endotelio o epitelio y se dirige solo a los tejidos que expresan el FcRn. Los anticuerpos pueden usarse para distribuir una variedad de fármacos citotóxicos que incluyen fármacos terapéuticos, un compuesto que emite radiación, moléculas de origen vegetal, fúngico o bacteriano, proteínas biológicas y mezclas de los mismos. Los fármacos citotóxicos pueden ser fármacos citotóxicos que actúan de forma intracelular, tal como emisores de radiación de corto intervalo, que incluyen, por ejemplo, a-emisores de alta energía, corto intervalo, como se describe en la presente memoria.

En el caso de toxinas polipeptídicas, pueden usarse técnicas de ácido nucleico recombinante para construir un ácido nucleico que codifica el anticuerpo y la citotoxina (o un componente polipeptídico del mismo) como fusiones traduccionales. El ácido nucleico recombinante se expresa entonces, p.ej., en células y el polipéptido de fusión codificado se aísla.

De forma alternativa, el anticuerpo de unión a FcRn puede acoplarse a emisores de radiación de alta energía, por ejemplo, un radioisótopo, tal como 131I, un Y-emisor, que, cuando se localiza en un sitio, da por resultado una muerte de varios diámetros celulares. Véase, p.ej., S.E. Order, “Analysis, Results and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”, Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al. (eds.), págs. 303316 (Academic Press 1985). Otros radioisótopos adecuados incluyen unos emisores, tales como 212Bi, 213Bi, y 211At, y emisores b, tal como 186Re y 90Y. Además, 177Lu puede usarse también como un agente de formación de imágenes o agente citotóxico.

La radioinmunoterapia (RIT) que usa anticuerpos etiquetados con 131I, 90Y y 177Lu está bajo intensa investigación clínica. Hay diferencias significativas en las características físicas de esto tres nucleidos y como resultado, la elección del radionucleido es muy crítica para distribuir la máxima dosis de radiación a un tejido de interés. Las partículas beta de mayor energía de 90Y pueden ser buenas para tumores voluminosos. Las partículas beta de energía relativamente baja de 131I son ideales, pero la deshalogenación in vivo de moléculas radioyodadas es una desventaja principal para la internalización del anticuerpo. En contraste, 177Lu tiene partículas beta de baja energía con solo 0,2-0,3 mm de intervalo y distribuye una dosis de radiación mucho menor a la médula ósea en comparación con 90Y. Además, debido a una vida media física más larga (en comparación con 90Y), los tiempos de residencia son mayores. Como resultado, mayores actividades (más cantidades de mCi) de agentes etiquetados con 177Lu pueden administrarse con dosis de radiación comparativamente menores a la médula. Ha habido varios estudios clínicos investigando el uso de anticuerpos etiquetados con 177Lu en el tratamiento de varios cánceres. (Mulligan T et al., 1995, Clin. Canc. Res. 1:1447-1454; Meredith RF, et al., 1996, J. Nucl. Med. 37:1491-1496; Álvarez RD, et al., 1997, Gynecol. Oncol. 65:94-101).

El uso de los métodos terapéuticos para tratar autoinmunidad tiene un número de beneficios. Como los anticuerpos reconocen específicamente FcRn, otro tejido se evita y altos niveles del agente se distribuyen directamente al sitio donde se necesite la terapia. El tratamiento puede monitorizarse de forma efectiva con parámetros clínicos. De forma alternativa, estos parámetros pueden usarse para indicar cuando debería emplearse dicho tratamiento.

Un anticuerpo de unión a FcRn puede administrarse en combinación con una o más de las modalidades existentes para tratar trastornos autoinmunes que incluyen, aunque no están limitados a: terapia de Ig intravenosa, fármacos antinflamatorios no esteroideos (AINE), y corticosteroides; y tratamientos antinflamatorios tales como ciclosporinas, rapamicinas o ascomicinas, o sus análogos inmunosupresores, p.ej., ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, etc.; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; brequinar; FTY 720; leflunomida; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato de mofetilo; 15-desoxispergualina; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, p.ej., anticuerpos monoclonales a receptores de leucocitos, p.ej., MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45 o CD58 o sus ligandos; u otros compuestos inmunomoduladores, p.ej., CTLA4Ig, u otros inhibidores de moléculas de adhesión, p.ej., mAbs o inhibidores de bajo peso molecular que incluyen antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4. Estas terapias de combinación pueden ser parte de unos regímenes de inmunomodulación o un régimen para el tratamiento o prevención de rechazo agudo o crónico de alo­ o xenoinjerto, un trastorno inflamatorio, o unos trastornos autoinmunes.

Esclerosis múltiple

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad del sistema nervioso central que se caracteriza por la inflamación y pérdida de las vainas de mielina.

Los pacientes que tienen EM pueden identificarse por criterios que establecen un diagnóstico de EM clínicamente definido como se define por el taller en el diagnóstico de EM (Poser et al., Ann. Neurol. 13:227, 1983). EM puede diagnosticarse también por la evidencia de dos ataques y bandas oligoclonales de IgG en el fluido cerebroespinal o por combinación de un ataque, evidencia clínica de dos lesiones y banda oligoclonal de IgG en el fluido cerebroespinal. Los criterios de McDonald pueden usarse también para diagnosticar EM. McDonald et al. (2001) Recommended diagnostic criteria for múltiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Múltiple Sclerosis, Ann Neurol 50:121-127. Los criterios de McDonald incluyen el uso de evidencia por IRM del deterioro del SNC con el tiempo para usarse en el diagnóstico de EM, en ausencia de múltiples ataques clínicos. El tratamiento efectivo de la esclerosis múltiple puede evaluarse de varias formas diferentes. Los siguientes parámetros pueden usarse para evaluar la efectividad del tratamiento. Dos criterios ejemplares incluyen: EDSS, por sus siglas en inglés (escala expandida del estado de discapacidad), y aparición de exacerbaciones en IRM (formación de imágenes por resonancia magnética). La EDSS es un medio de clasificar el deterioro clínico debido a la EM (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983). Se evalúan ocho sistemas funcionales por el tipo y gravedad del deterioro neurológico. Brevemente, antes del tratamiento, los pacientes se evalúan para el deterioro en los siguientes sistemas: piramidal, cerebelo, bulbo raquídeo, sensorial, intestino y vejiga, visual, cerebral y otros. Los seguimientos se realizan a intervalos definidos. La escala oscila de 0 (normal) a 10 (muerte debido a EM). Una disminución de una etapa completa puede indicar un tratamiento efectivo (Kurtzke, Ann. Neurol. 36:573-79, 1994). Los síntomas ejemplares asociados con esclerosis múltiple, que pueden tratarse con los métodos descritos en la presente memoria, incluyen: neuritis óptica, diplopía, nistagmo, dismetría ocular, oftalmoplegia internuclear, fosfenos de movimiento y sonido, defecto pupilar aferente, paresis, monoparesis, paraparesis, hemiparesis, cuadraparesis, plejia, paraplejia, hemiplejia, tetraplejia, cuadraplejia, espasticidad, disartria, atrofia muscular, espasmos, calambres, hipotonía, clono, mioclono, mioquimia, síndrome de las piernas inquietas, pie pendular, reflejos disfuncionales, parestesia, anestesia, neuralgia, dolor neuropático y neurogénico, signo de l’hermitte, disfunción propioceptiva, neuralgia del trigémino, ataxia, temblor intencional, dismetría, ataxia vestibular, vértigo, ataxia del habla, distonía, disdiadococinesia, micción frecuente, espasticidad de la vejiga, vejiga flácida, disinergia detrusor-esfínter, disfunción eréctil, anorgasmia, frigidez, estreñimiento, urgencia fecal, incontinencia fecal, depresión, disfunción cognitiva, demencia, cambios de humor, labilidad emocional, euforia, síndrome bipolar, ansiedad, afasia, disfasia, fatiga, síntoma de uhthoff, reflujo gastroesofágico y trastornos del sueño.

Además de o antes de estudios humanos, puede usarse un modelo animal para evaluar la eficacia del uso de los dos agentes. Un modelo animal ejemplar para la esclerosis múltiple es el modelo de ratón de encefalitis autoinmune experimental (EAE), p.ej., como se describe en (Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141:1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132:2393-2401), y Traugott (Cell Immunol. (1989) 119:114-129). Puede administrarse a los ratones un primer y segundo agente descrito en la presente memoria antes de la inducción de EAE. Después los ratones se evalúan por los criterios característicos para determinar la eficacia de usar los dos agentes en el modelo.

Enfermedad inflamatoria intestinal

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) incluyen generalmente inflamación intestinal crónica, reincidente. EII se refiere a dos trastornos distintos, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (CU). Los síntomas clínicos de EII incluyen sangrado rectal intermitente, dolor abdominal con calambres, pérdida de peso y diarrea. Puede usarse también un índice clínico para monitorizar la EII tal como el Índice de actividad clínica para la colitis ulcerosa. Véase además, Walmsley et al., Gut. Julio de 1998; 43(1):29-32 y Jowett et al. (2003) Scand J Gastroenterol. 38(2):164-71. Un anticuerpo de unión a FcRn puede usarse para mejorar al menos un síntoma de EII o para mejorar un índice clínico de EII.

Artritis reumatoide

La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria autoinmune que provoca dolor, hinchazón, rigidez y pérdida de función de las articulaciones. La artritis reumatoide a menudo se presenta en un patrón simétrico. La enfermedad puede afectar a las articulaciones de la muñeca y las articulaciones de los dedos más cercanas a la mano. Puede afectar también a otras partes del cuerpo además de las articulaciones. Además, la gente con artritis reumatoide puede tener fatiga, fiebres ocasionales y un malestar general. Los factores positivos para el diagnóstico de artritis reumatoide incluyen el anticuerpo sanguíneo de “factor reumatoide” y anticuerpo de citrulina. Un anticuerpo de unión a FcRn puede ser útil en el tratamiento, prevención o alivio de la artritis reumatoide o uno o más síntomas de artritis reumatoide.

Lupus

El lupus eritematoso sistémico (LES) es un trastorno autoinmune que lleva a la inflamación y daño a varios tejidos corporales. LES puede estar mediado por auto-anticuerpos dirigidos contra su propio ADN. El lupus puede afectar a muchas partes del cuerpo, incluyendo las articulaciones, piel, riñones, corazón, pulmones, vasos sanguíneos y cerebro. Aunque varios síntomas pueden estar presentes, algunos de los más comunes incluyen fatiga extrema, articulaciones doloridas o hinchadas (artritis), fiebre inexplicable, erupciones cutáneas y problemas renales. Los síntomas ejemplares del lupus incluyen articulaciones doloridas o hinchadas, fiebre inexplicada y fatiga extrema. Una erupción cutánea roja característica puede aparecer a través de la nariz y las mejillas. Las erupciones pueden darse también en la cara y orejas, brazos superiores, hombros, pecho y manos. Otros síntomas del lupus incluyen dolor del pecho, pérdida de pelo, anemia, úlceras en la boca, y dedos de las manos y los pies pálidos o púrpuras por el frío y la tensión. Algunas personas también experimentan dolores de cabeza, mareos, depresión, confusión o convulsiones. Los factores positivos para el diagnóstico de LES incluyen anticuerpos anti-nucleares circulantes, anticuerpos de anti-ADN y anticuerpos anti-Sm. Un anticuerpo de unión a FcRn puede ser útil en el tratamiento, prevención o alivio de LES o uno o más síntomas de LES. El lupus, como se usa en la presente memoria incluye lupus cutáneo y lupus nefrítico.

Trombocitopenia inmune (ITP)

ITP es una enfermedad de destrucción aumentada de plaquetas periféricas, donde los pacientes desarrollan anticuerpos que se unen a proteínas específicas de la membrana de las plaquetas. Los anticuerpos anti-plaquetas opsonizan las plaquetas, llevando a la destrucción por macrófagos. Los intentos para tratar ITP han implicado generalmente la supresión del sistema inmune, lo que provoca un aumento en los niveles de plaquetas. Un anticuerpo de unión a FcRn puede ser útil en el tratamiento, prevención o alivio de la ITP, o uno o más sistemas de la misma.

Espondilitis anquilosante

La espondilitis anquilosante es un trastorno autoinmune que no solo afecta a la columna vertebral, sino que puede afectar también a las caderas, hombros y rodillas ya que los tendones y ligamentos alrededor de los huesos y articulaciones de inflaman, dando por resultado dolor y rigidez. La espondilitis anquilosante tiende a afectar a la gente en la adolescencia tardía o la adultez temprana. Un anticuerpo de unión a FcRn puede ser útil en el tratamiento, prevención o alivio de la espondilitis anquilosante, o uno o más síntomas de la misma.

Pénfigo

El pénfigo es un trastorno autoinmune que afecta a las membranas mucosas y la piel. El trastorno se caracteriza por la generación de auto-anticuerpos contra la desmogleína. La desmogleína es una proteína en la familia de cadherinas y está implicada con la formación de desmosomas, que unen a las células entre ellas. El pénfigo puede clasificarse como uno de tres tipos: pénfigo vulgar, la forma más común del trastorno, en el que los auto-anticuerpos se dirigen a la desmogleína 3. En el pénfigo foliáceo se generan auto-anticuerpos contra la desmogleína 1. El tercer tipo, y el trastorno menos común es el pénfigo paraneoplásico, en el que los auto-anticuerpos se dirigen a la desmoplaquinas y que se asocia con cánceres tales como linfoma. Los trastornos se diagnostican normalmente por un dermatólogo por el aspecto de la piel y se conforma por la detección de auto-anticuerpos contra la desmogleína. Los métodos de tratamiento incluyen la administración de esteroides y/o la administración de un anticuerpo CD20 tal como rituximab (Rituxan).

Cáncer

“Cáncer” como se usa en la presente memoria se refiere a un crecimiento incontrolado de células que interfiere con el funcionamiento normal de los órganos y sistemas corporales. Los cánceres que migran desde su posición original y órganos vitales de origen pueden llevar eventualmente a la muerte del sujeto a través del deterioro funcional de los órganos afectados. Los carcinomas son cánceres malignos que surgen de las células epiteliales e incluyen adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas. Los sarcomas son cánceres del tejido conectivo o de soporte e incluyen osteosarcoma, condrosarcoma y tumor del estroma gastrointestinal. Los cánceres hematopoyéticos, tal como leucemia, son capaces de superar los compartimientos hematopoyéticos normales en un sujeto, llevando por consiguiente al fallo hematopoyético (en forma de anemia, trombocitopenia y neutropenia) que en última instancia provoca la muerte. Una persona experta en la técnica puede clasificar un cáncer como un sarcoma, carcinoma o cáncer hematopoyético.

El cáncer, como se usa en la presente memoria, incluye los siguientes tipos de cáncer, cáncer de mama, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, cáncer cerebral que incluye glioblastomas y meduloblastomas; cáncer del cuello del útero, coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer de esófago; cáncer gástrico; neoplasmas hematológicos que incluyen leucemia linfocítica y mielógena agudas: leucemia/linfoma linfoblástica aguda de células T; tricoleucemia; leucemia mielógena crónica; mieloma múltiple; leucemias asociadas con SIDA y linfoma leucemia de células T del adulto; neoplasmas intraepiteliales que incluyen enfermedad de Bowen y enfermedad de Paget; cáncer hepático; cáncer de pulmón; linfomas que incluyen enfermedad de Hodgkin y linfomas linfocíticos; neuroblastomas; cáncer de boca que incluyen carcinoma de células escamosas; cáncer de ovario que incluye los que surgen de células epiteliales, células del estroma, células germinales y células mesenquimales; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas que incluyen leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma y osteosarcoma; cáncer de piel que incluye melanoma, sarcoma de Kaposi, cáncer basocelular y cáncer de células escamosas; cáncer de testículo que incluye tumores germinales tales como seminoma, no seminoma (teratomas, coriocarcinomas), tumores del estroma, y tumores de células germinales; cáncer de tiroides que incluye adenocarcinoma tiroideo y carcinoma medular; y cáncer renal que incluye adenocarcinoma y tumor de Wilms. Otros cánceres se conocerán por un experto en la técnica.

Tratamiento de fetos

El FcRn media el transporte de la IgG materna a través de las barreras de células epiteliales al feto. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden usarse para distribuir fármacos macromoleculares, p.ej., antibióticos, y/o pequeñas moléculas a los fetos en el útero. Los fetos pueden experimentar una condición o trastorno (p.ej., una infección entérica o trastorno metabólico) que necesita tratamiento. El fármaco o molécula para tratar la condición o trastorno puede conjugarse con un anticuerpo de unión a FcRn y administrarse a una mujer embarazada que tiene un feto en el útero que necesita tratamiento. El anticuerpo de unión a FcRn conjugado se une a FcRn y se transporta así al feto por medio de la placenta. El feto recibe el tratamiento de fármaco o molécula.

Inmunoadsorción

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden usarse en métodos para la eliminación de un anticuerpo terapéutico no deseado de un individuo. En algunas realizaciones, el anticuerpo terapéutico no deseado es un anticuerpo IgG. En algunas realizaciones el anticuerpo terapéutico no deseado es un anticuerpo anti-VLA4 tal como Natalizumab (Tysabri, Biogen Idec/Elan), efalizumab (Raptiva, Genentech), bevacizumab (Avastina, Genentech) y proteínas de fusión Fc tal como etanercept (Enbrel, Amgen/Wyeth). La terapia de anticuerpo monoclonal natalizumab se ha asociado con Leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML). La disminución del anticuerpo terapéutico de la corriente sanguínea y/o el resto del cuerpo pueden alterar la progresión de PML.

En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento presentados en la presente memoria pueden combinarse con métodos para eliminar o eliminar parcialmente anticuerpos terapéuticos de la corriente sanguínea de un sujeto. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FcRn presentados en la presente memoria pueden combinarse con una proteína de captura que puede unirse a un anticuerpo terapéutico, dando las combinaciones por resultado un aclaramiento aumentado del anticuerpo terapéutico de la corriente sanguínea. En algunas realizaciones, el método de eliminación o eliminación parcial del anticuerpo terapéutico de la corriente sanguínea de un sujeto es intercambio de plasma (PLEX). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FcRn pueden administrarse a un sujeto que experimenta intercambio de plasma. En alguna realizaciones, los anticuerpos anti-FcRn pueden usarse como un inmunoadsorbente para FcRn en el proceso de intercambio de plasma.

En el intercambio de plasma (también denominado aféresis o plasmaféresis) la sangre se saca del cuerpo y el plasma que contiene un agente indeseado, tal como colesterol o un anticuerpo terapéutico, se elimina de la sangre mediante un separador celular. La sangre puede sacarse del cuerpo en lotes o puede sacarse en un modo de flujo continuo, con el último permitiendo la reintroducción de la sangre procesada en el cuerpo. El plasma quitado que comprende el agente indeseado puede descartarse y el paciente puede recibir plasma donante o solución salina con proteínas añadidas a cambio. En algunas realizaciones, pueden necesitarse múltiples series de intercambio de plasma para quitar el agente indeseado de la sangre o para disminuir el nivel del agente indeseado en la sangre a un nivel aceptable. En algunas realizaciones la sangre se “filtra” y el agente indeseado se elimina, antes de devolver la sangre al paciente. Se conocen métodos de intercambio de plasma en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento US 6.960.178.

Se ha mostrado que el intercambio de plasma reduce los niveles de anticuerpo terapéutico en la sangre de un sujeto y la restauración de la homeostasis (véase, p.ej., Khatri et al; 2009; Neurology 72:402-409).

Un anticuerpo terapéutico basado en IgG (tal como natalizumab) puede quitarse de la sangre, plasma o suero poniendo en contacto la sangre con la proteína de captura proteína A de estafilococo, que se unirá a la región Fc de la IgG y eliminará el anticuerpo IgG de la corriente sanguínea. Otras proteínas de captura pueden usarse para anticuerpos de isotipo diferente. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FcRn pueden usarse como una proteína de captura en el proceso de intercambio de plasma, dando por resultado la eliminación de FcRn de la corriente sanguínea, aumentando así la cantidad de anticuerpo terapéutico “libre”. El anticuerpo terapéutico “libre” resultante tendrá una vida media más corta que el anticuerpo presente antes del tratamiento y/o puede eliminarse de la sangre más fácilmente con una proteína de captura diferente (tal como proteína A). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FcRn se administran a un paciente durante o antes del intercambio de plasma. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FcRn pueden inmovilizarse y usarse en una columna, dando por resultado la unión de FcRn. En algunas realizaciones, la sangre de un paciente que contiene un anticuerpo terapéutico se pone en contacto tanto con anticuerpo anti-FcRn inmovilizado como con proteína A inmovilizada.

En algunas realizaciones los anticuerpos anti-FcRn presentados en la presente memoria pueden usarse en la terapia de “rescate” para anticuerpos terapéuticos que se han administrado y han mostrado un efecto adverso. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FcRn puede usarse como una alternativa para el intercambio de plasma. La administración de un anti-FcRn puede conseguir la disminución de anticuerpo terapéutico sin los riesgos asociados con la plasmaféresis y el intercambio de plasma tal como acceso vascular, terapia de citrato y obtención de plasma donante.

Antígenos leucocitarios humanos

Los antígenos leucocitarios humanos (HLA, por sus siglas en inglés) presentan péptidos y antígenos en el exterior de la célula, que son reconocidos posteriormente por las células T, que a su vez pueden activar las células B. El panel de genes HLA disponibles es único para cada persona. Cualquier célula que presente un HLA que “no es propio” dará por resultado la inducción de una respuesta inmune. En general, cuanto más diferente sea e1HLA “no propio” del HLA propio, mayor será la respuesta inmune. Por ejemplo, en el caso de trasplantes de órganos, los sujetos con genes HLA similares se prefieren para minimizar la respuesta inmune. Se ha encontrado que los anticuerpos de HLA específicos del donante están asociados con fallo de injerto en el trasplante de riñón, corazón, pulmón e hígado.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden usarse en métodos para la disminución del nivel de anticuerpos de HLA “no propios” en un individuo. Disminuir el nivel de anticuerpos de HLA “no propios” puede dar por resultado la supresión de una respuesta inmune, p.ej., durante el trasplante de órganos. En algunas realizaciones a una persona que estará experimentando el trasplante de órganos se administra un anticuerpo anti-FcRn. En algunas realizaciones a una persona que está experimentando trasplante de órganos se administra un anticuerpo anti-FcRn. En algunas realizaciones a una persona que ha recibido un trasplante de órgano se administra un anticuerpo anti-FcRn. Los ensayos para medir los niveles de anticuerpos de HLA se conocen bien en la técnica. Usos diagnósticos

Los anticuerpos que se unen a FcRn y se identifican por el método descrito en la presente memoria y/o detallado en la presente memoria tienen utilidades diagnósticas in vitro e in vivo.

En un aspecto, la descripción proporciona un método diagnósti

vivo (p.ej., formación de imágenes in vivo en un sujeto). El método puede incluir localizar FcRn en una posición subcelular, p.ej., el endosoma. El método puede incluir: (i) poner en contacto una muestra con anticuerpo de unión a FcRn; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo de unión a FcRn y la muestra. El método puede además incluir poner en contacto una muestra de referencia (p.ej., una muestra de control) con el anticuerpo, y determinar el grado de formación del complejo entre el anticuerpo y la muestra respecto al mismo para la muestra de referencia. Un cambio, p.ej., un cambio estadísticamente significativo, en la formación del complejo en la muestra o sujeto respecto a la muestra de control o sujeto puede ser indicativo de la presencia de FcRn en la muestra.

Otro método ejemplar incluye: (i) administrar el anticuerpo de unión a FcRn a un sujeto; y (iii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo de unión a FcRn y el sujeto. La detección puede incluir determinar la posición o tiempo de formación del complejo.

El anticuerpo de unión a FcRn puede etiquetarse directamente o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varios enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos.

La formación del complejo entre el anticuerpo de unión a FcRn y el FcRn puede detectarse midiendo o visualizando o el anticuerpo unido al FcRn o el anticuerpo no unido. Pueden usarse ensayos de detección convencionales, p.ej., unos ensayos inmunosorbentes unidos a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica tisular. Además de etiquetar al anticuerpo de unión a FcRn, la presencia de FcRn puede probarse en una muestra mediante un inmunoensayo de competición utilizando patrones etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo de unión a FcRn no etiquetado. En un ejemplo de este ensayo, la muestra biológica, los patrones etiquetados y el anticuerpo de unión a FcRn se combinan y la cantidad de patrón etiquetado unido al anticuerpo no etiquetado se determina. La cantidad de FcRn en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de patrón etiquetado unido al anticuerpo de unión a FcRn.

Pueden prepararse anticuerpos etiquetados con fluoróforos y cromóforos. Debido a que los anticuerpos y otras proteínas absorben luz que tienen longitudes de onda hasta aproximadamente 310 nm, los restos fluorescentes deberían seleccionarse para tener una absorción sustancial a longitudes de onda por encima de 310 nm y preferiblemente por encima de 400 nm. Una variedad de agentes fluorescentes y cromóforos adecuados se describen por Stryer, 1968, Science 162:526 y Brand, L. et al., 1972, Annu. Rev. Biochem. 41:843 868. Los anticuerpos pueden etiquetarse con grupos cromóforos fluorescentes mediante procedimientos convencionales tales como los descritos en las Patentes de EE.UU. núms. 3.940.475, 4.289.747 y 4.376.110. Un grupo de agentes fluorescentes que tienen un número de las propiedades deseables descritas anteriormente es el de los tintes de xanteno, que incluyen las fluoresceínas y rodaminas. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas. Una vez etiquetado con un fluoróforo o cromóforo, el anticuerpo puede usarse para detectar la presencia o localización del FcRn en una muestra, p.ej., usando microscopio fluorescente (tal como microscopio confocal o de deconvolución).

Análisis histológico. La inmunohistoquímica puede realizarse usando los anticuerpos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el anticuerpo puede sintetizarse con una etiqueta (tal como una marca de purificación o de epítopo), o pueden etiquetarse de forma detectable, p.ej., conjugando una etiqueta o grupo de unión a etiqueta. Por ejemplo, un agente quelante puede unirse al anticuerpo. El anticuerpo se pone entonces en contacto con un preparado histológico, p.ej., una sección fija de tejido que está en un portaobjetos de microscopio. Después de una incubación para la unión, el preparado se lava para eliminar el anticuerpo no unido. El preparado se analiza entonces, p.ej., usando un microscopio, para identificar si el anticuerpo está unido al preparado.

Por supuesto, el anticuerpo puede no estar etiquetado en el momento de la unión. Después de la unión y el lavado, el anticuerpo se etiqueta para volverlo detectable.

Matrices de proteínas. El anticuerpo de unión a FcRn puede también inmovilizarse en una matriz de proteína. La matriz de proteína puede usarse como una herramienta diagnóstica, p.ej., para cribar las muestras médicas (tal como células aisladas, sangre, sueros, biopsias y similares). Por supuesto, la matriz de proteína puede también incluir otros ligandos, p.ej., que se unen a FcRn o a otras moléculas diana.

Los métodos de producción de matrices de polipéptido se describen, p.ej., en De Wildt et al., 2000, Nat. Biotechnol.

18:989-994; Lueking et al., 1999, Anal. Biochem. 270:103-111; Ge, 2000, Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath y Schreiber, 2000, Science 289:1760-1763; publicaciones internacionales WO 01/40803 y WO 99/51773A1. Los polipéptidos para la matriz pueden detectarse a alta velocidad, p.ej., usando aparatos robóticos disponibles comercialmente, p.ej., de Genetic MicroSystems o BioRobotics. El sustrato de matriz puede ser, por ejemplo, nitrocelulosa, plástico, vidrio, p.ej., vidrio modificado en la superficie. La matriz puede incluir además una matriz porosa, p.ej., acrilamida, agarosa u otro polímero.

Por ejemplo, la matriz puede ser una matriz de anticuerpos, p.ej., como se describe en De Wildt, supra. Las células que producen los anticuerpos pueden cultivarse en un filtro en un formato ordenado. La producción de anticuerpo se induce, y los polipéptidos expresados se inmovilizan en el filtro en la posición de la célula. Una matriz de anticuerpo puede ponerse en contacto con una diana etiquetada para determinar el grado de unión de la diana a cada anticuerpo inmovilizado. La información sobre el grado de unión en cada dirección de la matriz puede almacenarse como un perfil, p.ej., en una base de datos informática. La matriz de anticuerpos puede producirse en réplicas y usarse para comparar perfiles de unión, p.ej., de una diana y una no diana.

FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia). El anticuerpo de unión a FcRn puede usarse para etiquetar células, p.ej., células en una muestra (p.ej., una muestra de paciente). El anticuerpo se une también (o es unible) a un compuesto fluorescente. Las células pueden entonces clasificarse usando un clasificador celular activado por fluorescencia (p.ej., usando un clasificador disponible de Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José, CA; véase también las Patentes de EE.UU. núms. 5.627.037; 5.030.002 y 5.137.809). Mientras las células pasan a través del clasificador, un rayo láser excita el compuesto fluorescente mientras el detector cuenta las células que pasan a su través y determina si un compuesto fluorescente está unido a la célula detectando fluorescencia. La cantidad de etiqueta unida a cada célula puede cuantificarse y analizarse para caracterizar la muestra.

El clasificador puede además reflejar la célula y separar las células unidas mediante el anticuerpo de las células no unidas mediante el anticuerpo. Las células separadas pueden cultivarse y/o caracterizarse.

Formación de imágenes in vivo. También se presenta un método para detectar la presencia de unos tejidos que expresan FcRn in vivo. El método incluye (i) administrar a un sujeto (p.ej., un paciente que tiene un trastorno autoinmune) un anticuerpo anti-FcRn, conjugado con un marcador detectable; (ii) exponer al sujeto a un medio para detectar dicho marcador detectable en los tejidos o células que expresan FcRn. Por ejemplo, el sujeto se genera en imágenes, p.ej., por RMN u otro medio tomográfico.

Ejemplos de etiquetas útiles para la formación de imágenes diagnósticas incluyen radioetiquetas tales como 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 125I, 3H, 14C y 188Rh, etiquetas fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, etiquetas activas a la resonancia magnética nuclear, isótopos emisores de positrones detectables mediante un escáner de tomografía por emisión de positrones (“PET”), agentes quimioluminiscentes tales como luciferina, y marcadores enzimáticos tales como peroxidasa o fosfatasa. También pueden emplearse emisores de radiación de intervalo corto, tales como isótopos detectables mediante sondas de detección de intervalo corto. El anticuerpo puede etiquetarse con dichos reactivos usando técnicas conocidas. Por ejemplo, véase Wensel y Meares, 1983, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, Nueva York para técnicas relacionadas con el radioetiquetado de anticuerpos y D. Colcher et al., 1986, Meth. Enzymol. 121:802816.

Un anticuerpo radioetiquetado puede además usarse para pruebas diagnósticas in vitro. La actividad específica de un anticuerpo etiquetado de forma isotópica depende de la vida media, la pureza isotópica de la etiqueta radioactiva, y como la etiqueta se incorpora en el anticuerpo.

Los procedimientos para etiquetar polipéptidos con los isótopos radiactivos (tales como 14C, 3H, 35S, 125I, 32P, 131I) se conocen generalmente. Por ejemplo, procedimientos de etiquetado con tritio se describen en la Patente de EE.UU. núm. 4.302.438. Procedimientos de yodación, etiquetado con tritio, y etiquetado con 35S, p.ej., como los adaptados para anticuerpos monoclonales murinos, se describen, p.ej., por Goding, J.W. (Monoclonal antibodies: principies and practice: production and application of monoclonal antibodies in cell biology, biochemistry and immunology 2a ed. Londres; Orlando: Academic Press, 1986, págs. 124 126) y las referencias citadas en ellos. Otros procedimientos para yodar polipéptidos, tal como anticuerpos, se describen por Hunter y Greenwood, 1962, Nature 144:945, David et al., 1974, Biochemistry 13:1014 1021 y las Patentes de EE.UU. núms. 3.867.517 y 4.376.110. Los elementos de radioetiquetado que son útiles en la formación de imágenes incluyen 123I, 131I, 111In y 99mTc, por ejemplo. Los procedimientos para yodar anticuerpos se describen por Greenwood, F. et al., 1963, Biochem. J. 89:114 123; Marchalonis, J., 1969, Biochem. J. 113:299 305; y Morrison, M. et al., 1971, Immunochemistry 289 297. Los procedimientos para el etiquetado con 99mTc se describen por Rhodes, B. et al., en Burchiel, S. et al., (eds.), Tumor Imaging: The Radioimmunochemical Detection of Cancer, Nueva York: Masson 111 123 (1982) y las referencias citadas en él. Los procedimientos adecuados para anticuerpos etiquetados con 111In se describen por Hnatowich, D.J. et al., 1983, J. Immunol. Methods, 65:147 157, Hnatowich, D. et al., 1984, J. Applied Radiation, 35:554 557, y Buckley, R.G. et al., 1984, F.E.B.S. 166:202204.

En el caso de un anticuerpo radioetiquetado, el anticuerpo se administra al paciente, se localiza a células que portan el antígeno con el que el anticuerpo reacciona, y se detecta o “se obtiene en imágenes” in vivo usando técnicas conocidas tales como barrido radionuclear usando p.ej., una cámara gamma o tomografía de emisión. Véase, p.ej., A.R. Bradwell et al., “Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (eds.), págs. 65 85 (Academic Press 1985). De forma alternativa, un escáner de tomografía transaxial con emisión de positrones, tal como el denominado Pet VI situado en Brookhaven National Laboratory, puede usarse donde la radioetiqueta emite positrones (p.ej., 11C, 18F, 15O y 13N).

Agentes de contraste de IRM. La formación de imágenes por resonancia magnética (IRM) usa RMN para visualizar las características internas del sujeto vivo, y es útil para el pronóstico, diagnóstico, tratamiento y cirugía. La IRM puede usarse sin compuestos trazadores radioactivos por el obvio beneficio. Algunas técnicas de IRM se resumen en el documento EP-A-0 502 814. Generalmente, las diferencias relacionadas con las constantes del tiempo de relajación T1 y T2 de los protones del agua en diferentes medios se usan para generar una imagen. Sin embargo, estas diferencias pueden ser insuficientes para proporcionar imágenes nítidas de alta resolución.

Las diferencias en estas constantes del tiempo de relajación pueden mejorarse mediante agentes de contraste. Ejemplos de dichos agentes de contraste incluyen un número de agentes magnéticos agentes paramagnéticos (que alteran principalmente T1) y ferromagnéticos o superparamagnéticos (que alteran principalmente la respuesta de T2). Los quelatos (p.ej., quelatos de EDTA, DTPA y NTA) pueden usarse para unirse (y reducir la toxicidad) de algunas sustancias paramagnéticas (p.ej., Fe+3, Mn+2, Gd+3). Otros agentes pueden estar en forma de partículas, p.ej., menos de 10 mm a aproximadamente 10 nM de diámetro). Las partículas pueden tener propiedades ferromagnéticas, antiferromagnéticas o superparamagnéticas. Las partículas pueden incluir, p.ej., magnetita (Fe3O4), Y-Fe2O3, ferritas y otros compuestos minerales magnéticos de elementos de transición. Las partículas magnéticas pueden incluir: uno o más cristales magnéticos con y sin material no magnético. El material no magnético puede incluir polímeros sintéticos o naturales (tales como sefarosa, dextrano, dextrina, almidón y similares.

El anticuerpo de unión a FcRn puede también etiquetarse con un grupo indicador que contiene el átomo 19F activo en RMN, o una pluralidad de dichos átomos en la medida que (i) esencialmente todos los átomos de flúor naturalmente abundantes son el isótopo 19F y, por consiguiente, sustancialmente todos los compuestos que contienen flúor son activos en RMN; (ii) muchos compuestos polifluorados químicamente activos tales como anhídrido trifluoroacético están disponibles comercialmente a coste relativamente bajo; y (iii) muchos compuestos fluorados se han encontrado médicamente aceptables para el uso en humanos tal como los poliéteres perfluorados utilizados para llevar oxígeno como sustitutos de la hemoglobina. Después de permitir dicho tiempo para la incubación, una IRM del cuerpo entero se realiza usando un aparato tal como uno de los descritos por Pykett, 1982, Sci. Am. 246:7888 para situar y formar imágenes de tejidos que expresan FcRn.

La descripción también presenta kits que comprenden un anticuerpo que se une a FcRn e instrucciones para el uso diagnóstico, p.ej., el uso del anticuerpo de unión a FcRn o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para detectar FcRn, in vitro, p.ej., en una muestra, p.ej., una biopsia o células de un paciente que tiene un trastorno autoinmune, o in vivo, p.ej., mediante la formación de imágenes de un sujeto. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, tal como una etiqueta o agente diagnóstico adicional. Para el uso in vivo el anticuerpo puede formularse como una composición farmacéutica.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que de ninguna manera están construidos como adicionalmente limitantes.

Ejemplo 1: DX2504 y mutantes de cisteína del mismo

La cadena ligera del anticuerpo anti-FcRn DX-2504 tiene una cisteína desapareada en la primera posición de CDR3. Esta cisteína es adyacente a la cisteína en la FR3 que se aparea con la cisteína en la FR1 de las cadenas ligeras. Se construyeron dos mutantes que sustituyen la cisteína en la CDR3 con o una serina o una alanina. (Véase a continuación y véase también la Figura 9).

Mutantes

1) 532A-X53-C02: mutante de cys a ser

2) 532A-X54-B03: mutante de cys a ala

Alineamiento de secuencia de las cadenas ligeras de DX-2504 (SEQ ID NO:8), 532A-X53-C02 (SEQ ID NO:10) y 532A-X54-B03 (SEQ ID NO:11)

FRl-L CDR1-L FR2-L CDR2-L

DX-2504: QSALTQPASVSGSPGQSITISC TGTGSDVGSYNLVS WYQQHPGKAPKLMIY GDSQRPS

532A-X53-C02 QSALTQPASVSGSPGQSITISC TGTGSDVGSYNLVS WYQQHPGKAPKLMIY GDSQRPS

532A-X54-B03 QSALTQPASVSGSPGQSITISC TGTGSDVGSYNLVS WYQQHPGKAPKLMIY GDSQRPS

FR3-L CDR3-L FR4-L

DX-2504: GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC CSYAGSGIYV FGTGTKVTVL

532A-X53-C02 GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC SSYAGSGIYV FGTGTKVTVL

532A-X54-B03 GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC ASYAGSGIYV FGTGTKVTVL

Análisis por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03

Se evaluó la pureza del anticuerpo inyectando 50 pg de proteína en una columna G3000 SWXL Tosoh equilibrada en fosfato sódico 0,2M, pH: 6,9 en un sistema HPLC Waters 2695 con detección UV. Las áreas integradas de los picos se expresaron cómo % de monómero (es decir, anticuerpo intacto), % de agregados de alto peso molecular (% de HMW) y % de especies de bajo peso molecular (% de LMW) en la Tabla 1. (Véase también la Figura 1).

Tabla 1. Compendio de resultados SEC

Análisis SDS-PAGE de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03

Los anticuerpos se trataron con N-etilmaleimida 50 mM seguido por tampón de muestra de SDS-PAGE y se calentaron durante 10 minutos a 72°C para bloquear el tiol libre que puede llevar a artefactos de gel. El anticuerpo (4 pg) se cargó en un gel NuPAGE de gradiente 4-12% y se tiñó con Simply Blue Safe Stain, antes del análisis de densitometría usando un sistema UVP (Tabla 2). (Véase también la Figura 2).

Tabla 2. Compendio de los análisis por densitometría

Estabilidad de temperatura de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03

Se incubaron muestras de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03 a 37°C durante 1 mes. Las muestras se tomaron en diferentes puntos temporales para el análisis usando SEC analítico. La estabilidad de temperatura de DX-2504 y los mutantes de cisteína se presenta en base al cambio en el % de monómero. (Véase la Figura 3).

Estabilidad de pH de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03

Se incubaron muestras de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03 en diferentes condiciones de pH a temperatura ambiente durante 1 mes. Las muestras se tomaron en diferentes puntos temporales para el análisis usando SEC analítico. La estabilidad de pH de DX-2504 y mutantes de cisteína se presenta en base al cambio en % de monómero. (Véase la Figura 4).

Estabilidad de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03 a pH 8,3

Se evaluó la estabilidad usando SEC como se describe en el párrafo anterior de la Tabla 1. El análisis SEC de los anticuerpos a pH 8,3 se muestra ya que ilustra la estabilidad mejorada de los mutantes de cisteína sobre DX-2504 a la condición de pH probado. (Véase la Figura 5).

Valoración de tiol con DTNB

La presencia de tioles de cisteína libres en las disoluciones de anticuerpo purificado se evaluó haciendo reaccionar anticuerpo 10 pM con DTNB 10 mM (reactivo de Ellman, o 5,5’-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico)) en presencia o ausencia del reactivo de desnaturalización hidrocloruro de guanidina 6 M durante 0,5 horas a 37°C antes de leer la absorbancia de la reacción a 412 nm (e = 14.100 M-1cm-1). La concentración de tiol se dividió por la concentración de anticuerpo para obtener los moles de tiol/moles de mAb. (Véase la Tabla 3 posterior).

Tabla 3. Compendio de datos de valoración de tiol

Estabilidad de DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03 con respecto a la desnaturalización química.

La estabilidad de proteína de DX-2504 y los mutantes de cisteína se midió monitorizando la fluorescencia intrínseca como una función de la concentración del desnaturalizante químico hidrocloruro de guanidina (GuHCl). 1 mg/ml de cada producto de anticuerpo se preparó con diferente concentración de GuHCl 1 a 8M. La fluorescencia se midió y se representa la relación de intensidad de 360/330 como una función de la concentración de GuHCl. Los mutantes de cisteína muestran una mejor estabilidad para los cambios de conformación estructural frente al reactivo desnaturalizante. (Véase la Figura 6).

Análisis cinético por resonancia del plasmón superficial (SPR o Biacore) de la interacción de hFcRn con DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03 inmovilizados.

Las medidas de SPR se realizaron usando un Biacore 3000. DX-2504, 532A-X53-C02 y 532-X54-B03 se inmovilizaron por acoplamiento de amina en chips sensores CM5 a densidades de inmovilización de ~220 RU. Para medir los parámetros cinéticos de la interacción de DX-2504 con analito FcRn, se inyectaron diluciones en serie doble preparadas a partir de 100 nM de FcRn por duplicado durante 5 min a 50 □l/min con una fase de disociación de 15 minutos. La superficie del chip sensor se regeneró con un pulso de 30 segundos de glicina 10 mM pH 1,5 a un caudal de 75 □l/min seguido por un pulso de 15 segundos de tampón. Las medidas se realizaron a 25°C usando HBS-P como el tampón de migración. La célula de flujo de referencia se activó y se bloqueó en una reacción de acoplamiento de amina simulada. Los datos se ajustaron a un modelo de unión 1:1 usando el software Biaevalution v.4.1. (Véase la Tabla 4, Figura 7 y Figura 8).

Tabla 4. Compendio de los resultados de SPR

Ejemplo 2: Muíante de supresión de DX-2504

La cadena pesada del anticuerpo anti-FcRn de DX-2504 contiene una lisina en la última posición (extremo C) en la cadena pesada. El mutante DX-2507 (cadena ligera SEQ ID NO:18, cadena pesada SEQ ID NO:19) contiene la misma cadena ligera que la de DX-2504 y una cadena pesada mutada, que se construyó suprimiendo el residuo de lisina C-terminal en la cadena pesada de DX-2504. Un alineamiento de secuencia entre el fragmento C-terminal de la cadena pesada de DX-2504 (SEQ ID NO:20) y el de la cadena pesada de DX-2507 (SEQ ID NO:21) se muestra a continuación:

DX-2504: SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

DX-2507: SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Perfil farmacológico y perfil toxicocinético de DX-2504 y DX-2507 en monos cinomolgos

Seis monos cinomolgos hembras no tratadas anteriormente se asignaron a dos grupos de dosis consistiendo cada uno en 3 animales. La Tabla 5 proporciona un resumen del diseño del estudio. Todos los animales se dosificaron con 20 mg/kg del anticuerpo de prueba por medio de inyección subcutánea (SC) una vez en el día de estudio 0 y día de estudio 7. Se administró a los animales del grupo 1 DX-2504 y se administró a los animales del grupo 2 DX-2507. Se recogió sangre de todos los animales en los siguientes puntos temporales: día 0 (antes de la dosificación y 2 y 12 horas después de la dosis), días 1, 2, 3, 4, 5, 6, día 7 (antes de la dosificación y 2 y 12 horas después de la dosis), días 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 21, 24, 28, 31 y 35. Las muestras de suero para las toxicocinéticas de DX-2504 y DX-2507 se analizaron usando un método ELISA cualificado (DRD-910-029). Los niveles de IgG total de los monos cinomolgos se analizaron usando un método ELISA cualificado (DRD_910-033).

Tabla 5: Diseño del estudio

Las concentraciones en suero de DX-2504 se detectaron a partir de las 2 horas después de la dosis en el día 0 hasta el día 11 en 2 animales y el día 13 en un animal. Las concentraciones en suero de DX-2507 se detectaron a partir de las 2 horas después de la dosis en el día 0 hasta el día 11, día 12 y día 17 en los animales individuales. Los resultados así obtenidos muestran que las concentraciones en suero de DX-2507 fueron mucho mayores que las de DX-2504 en los animales de prueba, indicando que DX-2507 fue más estable in vivo que DX-2504. Figura 13.

Los niveles de IgG en monos cinomolgos se redujeron después de la administración tanto de DX-2504 como de DX-2507 (Figura 14). Después de la administración de la dosis del día 0, los niveles medios de IgG total se redujeron a 42% y 33% de los niveles base antes de la dosis en los grupos de dosis de DX-2504 y DX-2507, respectivamente. Antes de la dosis del día 7, los niveles medios de IgG total aumentaron al 45% y 37% de niveles base antes de la dosis en los mismos grupos de tratamiento. Después de la administración de la dosis del día 7, los niveles medios de IgG total se redujeron al 42% de los valores base antes de la dosis en el grupo de DX-2504 y al 30% de los valores base antes de la dosis en el grupo de DX-2507. Los niveles de IgG total volvieron a los valores base antes de la dosis en el día 13 en los animales tratados con DX-2504 y en el día 21 en los animales tratados con DX-2507. Los parámetros toxicocinéticos medios para DX-2504 y DX-2507 se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6: Parámetros toxicocinéticos medios (DE)

*Los perfiles de concentración en suero se corrigieron para concentraciones base antes de la dosis (día 7)

Los parámetros toxicocinéticos tanto para DX-2504 como para DX-2507 fueron sustancialmente coherentes en los días 0 y 7. La exposición total de DX-2507 fue mayor que la observada para DX-2504. Los valores de concentración máxima media (Cmax) y de la curva de concentración en plasma/suero-tiempo (ABCúltima) para DX-2507 en el día 0 o el día 7 estuvieron entre 2 y 3 veces más que los valores correspondientes calculados para DX-2504. Además, los valores correspondientes de aclaramiento aparente medio (CL/F) y volumen de distribución (Vz/F) para DX-2504 estuvieron entre 2 a 12 veces mayores que DX-2507.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-FcRn aislado que comprende una región variable de la cadena ligera (V^l) y una región variable de la cadena pesada (V^h), en el que el anticuerpo se une a FcRn humano; en el que

La V^l comprende:

(i) una CDR1 de V^l que comprende la secuencia de aminoácidos TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO:14);

(ii) una CDR2 de V^l que comprende la secuencia de aminoácidos GDSQRPS (SEQ ID NO:15); y

(iii) una CDR3 de V^l que comprende la secuencia de aminoácidos SSYAGSGIYV (SEQ ID NO:12) o ASYAGSGIYV (SEQ ID NO:13); y

La V^h comprende:

(i) una CDR1 de V^h que comprende la secuencia de aminoácidos EYAMG (SEQ ID NO:22);

(ii) una CDR2 de V^h que comprende la secuencia de aminoácidos SIGSSGGQTKYADSVKG (SEQ ID NO:23); y (iii) una CDR3 de V^h que comprende la secuencia de aminoácidos LAIGDSY (SEQ ID NO:24)

Y en el que el anticuerpo anti-FcRn se une a FcRn humano con una constante de disociación (Kd) de menos de 10 nM como se mide por resonancia de plasmón superficial en solución salina con tampón fosfato a pH 7,2 a 30°C.

2. El anticuerpo anti-FcRn aislado según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 que carece del residuo de lisina C-terminal.

3. El anticuerpo anti-FcRn aislado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la V^l del anticuerpo aislado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.

4. El anticuerpo anti-FcRn aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la V^h del anticuerpo aislado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9.

5. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-FcRn según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo anti-FcRn según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 7.

9. Un método in vitro de detección de un FcRn en una muestra, comprendiendo el método: poner en contacto la muestra con el anticuerpo anti-FcRn según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y detectar una interacción entre el anticuerpo y el FcRn si está presente.

10. El anticuerpo anti-FcRn según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para usar en el diagnóstico in vivo.

11. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para usar en el tratamiento de un trastorno autoinmune o un trastorno inflamatorio en un sujeto.

12. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 10 u 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénico en un humano.

13. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 10 o 12, en el que el anticuerpo es quimérico.

14. El anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab)’2, Fv y scFv.