FI69214C - Specifik bindningsanalysmetod och reagens foer anvaendning daervid - Google Patents

Description

1 69214

Spesifinen sitomisanalyysimenetelmä ja siinä käytettävä reagenssi

Jakamalla erotettu hakemuksesta 761148

Radioaktiivisten aineiden käsittelyn vaikeudesta ja vaarallisuudesta johtuen on tehty useita yrityksiä sopivien spesifisten sitomisanalyysijärjestelmien luomiseksi, jotka olisivat yhtä herkkiä ja nopeita kuin radioimmunoanalyysit, mutta joissa ei käytetä radioaktiviteettia sitoutumisreaktion tarkkailuun. Kuten alla on lähemmin selostettu, käsittävät radioaktiivisten atomien tai molekyylien sijasta merkkiaineena käytetyt aineet monenlaisia aineita kuten entsyymejä, fluoresoivia molekyylejä ja bakteriofaageja. Ensin käsitellään "heterogeenistä" tyyppiä olevia spesifisiä sitomisanalyysimenetelmiä, joissa suoritetaan sidotun ja vapaan faasin erotus. Tällainen erotus on välttämätön spesifisen sitomisanalyysin suorittamiseksi, kun merkkiaine sidotussa faasissa ei ole erotettavissa vapaassa faasissa olevasta merkkiaineesta.

Esimerkkejä heterogeenisistä menetelmistä, joita on kehitetty käyttäen entsyymiä merkkiaineena, on selostettu US-patenteissa 3 654 090, 3 791 932, 3 839 153, 3 850 752 ja 3 879 262 sekä julkaisuissa Journal of Immunological Methods 1:247 (1972) sekä Journal of Immunology 109:129 (1972). Kaikissa selostetuissa menetelmissä on entsyymi kemiallisesti sidottu joko etsittyyn ligandiin tai sen sitovaan kumppaniin ja konstruoidaan sopiva heterogeeninen spesifinen sitomisreaktiosuunnitelma näytteen kanssa suoritetun inkuboinnin jälkeen, jolloin joko liukenemattomaan osaan tai nestemäiseen osaan liittyvän entsymaattisen aktiviteetin määrä on näytteessä olevan ligandimäärän funktio. Entsyymikonjugaattien synteesiin ja kuvaukseen liittyvät ongelmat ovat vakavia epäkohtia tässä lähestymistavassa.

Brittiläinen patentti 1 392 403 ja ranskalainen patentti 2 201 299 selostavat heterogeenista spesifistä sitomisanalyysiä, 2 69214 jossa merkkiaineena käytetään spektrofotometrisesti aktiivisen aineen ei-aktiivista esimuotoa. Näytteen inkuboimisen jälkeen spesifisellä sitomisreaktiojärjestelmällä erotetaan liukenematon ja nestemäinen osa ja nestemäisessä osassa läsnä olevan merkkiaineen määrä, joka on näytteestä paljastettavan li-gandin määrän funktio, määritetään suorittamalla sellaisia reaktiovaiheita, jotka muuttavat inaktiivisen merkkiaineen väriä synnyttäväksi tai fluorometrisesti aktiiviseksi aineeksi, joka sen jälkeen mitataan tavanomaisin välinein.

Muita erityyppisiä merkkiaineita käyttäviä spesifisiä sitomis-analyysimenetelmiä on selostettu seuraavissa: Yhdysvaltojen kauppaministeriön (1973) Kansallisen Teknisen Informaatiopalvelun (NTIS) raportissa n:o PB-224 875 selostetaan epäonnistunutta yritystä hemiinikloridin käyttämiseksi merkkiaineena kemilumi-nenssireaktiolla osoitetussa heterogeenisessa analyysijärjestelmässä. Julkaisussa Nature 219:186 (1968) selostetaan yksityiskohtaisesti määrättyjä radioimmunoanalyysimenetelmiä ja siinä on luonteeltaan hyvin yleinen ohimenevä viittaus koentsyymien ja virusten mahdolliseen käyttöön merkkiaineena radioisotooppien sijasta. Se ei kuitenkaan tuo mitään valoa siihen, miten analyysi olisi suoritettava käyttäen tällaisia vaihtoehtoisia merkkiaineita tai olisiko tällainen analyysi itse asiassa mahdollinen. Lisätaustaa varten viitataan julkaisuun Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Odell ja Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972), jossa erilaisia tunnettuja analyysikaavioita selostetaan laajasti kuten myös niitä erilaisia aineita ja piirteitä, joita on käytetty merkkeinä spesifisissä sitomisanalyyseissä.

US-patentissa n:o 3 817 837 selostettu entsyymillä merkitty immunoanalyysi on mielenkiintoinen. Tämä menetelmä on homogeenista tyyppiä sillä se ei edellytä ositetun (so. liukenematon osa/nestemäinen osa) I! 6921 4 spesifisen sitomisreaktiojärjestelmän käyttöä eikä sen edellyttämää erotusmenetelmää, koska entsyymillä merkitty ligandi on sellainen, että entsymaattinen aktiviteetti on estynyt, kun se on reagoinut ligandin sidosparin kanssa. Näin ollen voidaan sidotun merkkiaineen suhdetta vapaaseen muotoon nähden määrittää seuraamalla muutoksia entsymaattisessa aktiviteetissa. Tästä huolimatta tämä menetelmä kärsii siitä, että on vaikeaa valmistaa hyvin tunnusomaisia entsyymillä merkittyjä konjugaatteja ja löytää sellaisia entsyymejä, jotka sopisivat järjestelmän perussuunnitelmaan .

Vaikka useita uudentyyppisiä spesifisiä sitomisanalyysejä on ehdotettu ja tutkittu,jäävät radioimmunoanalyysi ja erilaiset entsyymillä merkityt immunoanalyysit eniten käytetyiksi ja parannetuiksi. Molemmissa järjestelmätyypeissä on kuitenkin ilmeisiä epäkohtia, radioimmunoanalyysissa sen radioaktiivisen aineen käyttö, joka on vaarallista ja vaatii huolellista käsittelyä, ja entsyymillä merkityissä immunoanalyyseissä käyttökelpoisten entsyymillä merkittyjen konjugaattien valmistusvaikeus.

Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada hyvin soveltuva, monipuolinen ja herkkä parannettu spesifinen sitomisanalyysi-menetelmä, ja reagenssiaine, jotka perustuvat sellaisen aineen käyttöön merkkiaineena, joka osoittaa ennakolta määrätyn tarkkailu-reaktiojärjestelmän aineosana reagenssiaktiviteettia, jota ainetta tässä nimitetään reagenssiksi. Keksintö koskee näin ollen spesifistä sitomisanalyysimenetelmää nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrittämiseksi, joka käsittää seuraavat vaiheet: (a) nestemäinen väliaine saatetaan kosketukseen reagenssiaineen kanssa, joka sisältää merkkiaineen ja spesifisen sitovan aineen konjugaatin, jolloin reagenssiaine ja ligandi muodostavat sitomisreaktiojärjestelmän, joka tuottaa (i) merkityn konjugaatin sidotun faasin, jossa spesifinen sitova aine on sidottu siihen spesifisellä sidosparilla ja (ii) merkityn konjugaatin vapaan faasin, jossa spesifinen sitova aine ei ole sidottu siihen spesifisellä sidosparilla, ja (b) määritetään merkkiaine joko sidotussa tai vapaassa faasissa nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin mittana, jolle 4 6921 4 menetelmälle on tunnusomaista se, että merkkiaine on kemilumi-nointireaktion reaktiokomponentti, kuten luminointi tai iso-luminointi tai niiden johdannainen.

Keksintö koskee myöskin reacenssiair.etta nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrittämiseksi, joka reagenssiaine käsittää merkkiaineen ja spesifisen sitovan aineen konjugaatin, ja joka reagenssiaine ja ligandi muodostavat sitomisreaktiojärjes-telmän, joka tuottaa merkityn konjugaatin sidotun faasin, jossa spesifinen sitova aine en sidottu siihen spesifisellä sidosparilia ja vapaan faasin, jossa spesifinen sitova aine ei ole sidottu siihen spesifisellä sidosparilia, jolloin merkkiaineen määrä joko sidotussa tai vapaassa faasissa on nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrän funktio, jolle reagenssiaineelle on tunnusomaista se, että merkkiaine on kemiluminointireaktion reaktiokomponentti, kuten luminointi tai isoluminointi tai niiden johdannainen.

Keksinnön mukaista merkkiainetta voidaan käyttää uudessa homogeenisessa analyysitekniikassa tai missä tahansa tavanomaisessa heterogeenisessä analyysitekniikassa.

Tarkkailureaktiojärjestelmä on entsyymikatalysoitu ja valitaan sellainen tarkkailureaktiojärjestelmä, joka on erittäin herkkä konjugaatissa olevalle reagenssille. Fluoresoivat reaktiojär-jestelmät ovat hyvin käyttökelpoisia tässä suhteessa. Konjugaa-tissa oleva reagenssi on esillä olevan keksinnön mukaan kemiluminointireaktion reaktiokomponentti.

Il 5 69214 Tässä yhteydessä en seuraavilla määreillä seuraava merkitys: ligandi on se aine tai aineiden ryhmä, jonka läsnäolo tai määrä nestemäisessä väliaineessa on määritettävä, ligandin spesifinen sidospari on mikä tahansa aine tai aineiden ryhmä, joilla on spesifinen taioumus sitoutua ligandiin muiden aineiden poissulkemiseksi ja ligandin spesifinen sitova analogi on mikä tahansa aine tai aineiden ryhmä, joka käyttäytyy olennaisesti samalla.tavalla kuin ligandi ligandin spesifisen sidosparir sidostaipumuksen suhteen·.

Uusi homogeeninen analyysitekniikka perustuu osaksi siihen seikkaan, että reaktio ligandin ja sen spesifisen sidosparin välillä, joista reagenssi on sitoutunut toiseen, muuttaa reagenssin aktiviteettia ennakolta määrätyssä reaktiossa, joka reaktio siten toimii välikappaleena spesifisen sitomisreaktion tarkkailussa. Tämä perusilmiö huomioonottaen voidaan esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää suoritettaessa soveltaa erilaisia manipuloivia suunnitelmia mukaanluettuna erilaiset testikokoomukset ja -laitteet. Suositut peruskä-sitte ly suunnitelmaa ovat suorasidostekr.iikka ja kilpaileva sidostek-r, iikka.

Suorasidcstekniikassa saatetaan nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän osoitettavaa ligandia, kosketukseen kon.iugaatin kanssa, jossa reagenssi on sieestu ligandin spesifiseen sidospariin ja sen jälkeen analysoidaan mahdollinen muutos reagenssin aktiviteetissa. Kilpailevassa sidostekniikassa saatetaan nestemäinen väliaine kosketukseen ligandin spesifisen sidosparin kanssa ja konju-gaatin kanssa, jossa reagenssi on sidottu ligandiin tai sen spesifiseen sitovaan analogiin tai molempiin ja sen jälkeen analysoidaan mahdollinen muutos reagenssin aktiviteetissa. Kummassakin menettelytavassa määritetään reagenssin aktiviteetti saattamalla nestemäinen väliaine kosketukseen ainakin yhden sellaisen reagenssin kanssa, joka muodostaa reagenssin kanssa ennakolta määrätyn tarkkailureaktion. Ligandin kvalitatiivinen määritys nestemäisessä väliaineessa käsittää saadun reaktion ominaisuuden, tavallisesti nopeuden vertailemisen tarkkaillun reaktion vastaavan ominaisuuden kanssa ligandittomassa nestemäisessä väliaineessa, mahdollisen eron näiden välissä osoittaes sa muutosta reagenssin aktiviteetissa. Ligandi.n kvantitatiivinen määritys nestemäisessä väliaineessa käsittää saadun reaktion ominaisuuden vertaamista vastaavaan ominaisuuteen tarkkailureaktiossa nestemäisissä väliaineissa, jotka sisältävät tunnettuja määriä ligandia.

6921 4

Yleisesti ottaen, kun seurataan homogeenista analyysikaaviota, voidaan spesifisen sitomisreaktion ainesosat, so. nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän ligandia, kcnjugaatti ja/tai ligandin spesifinen sidospari, yhdistellä missä tahansa määrässä, tavalla ja järjestyksessä, edellyttäen että konjugaatissa olevan reagenssin aktiviteetti muuttuu mitattavassa määrin, kun nestemäinen väliaine sisältää ligandia sellaisessa määrässä tai pitoisuudessa, joka on merkittävä analyysin tarkoituksiin. Spesifisen sitomisreaktion kaikki ainesosat ovat edullisesti liukoisia nestemäiseen väliaineeseen.

Homogeenista suoraSidostekniikkaa käytettäessä spesifisen sitcmisreak-tion ainesosat ovat nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän ligandin, ja konjugaattia, jossa reagenssi on sitoutunut ligandin spesifiseen sidospariin.· Konjugoidun reagenssin aktiviteetti sen ollessa kosketuksissa nestemäisen väliaineen kanssa on kääntäen verrannollinen nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin ja konjugaatissa olevan spesifisen sidosparin väliseen sitoutumisa.stee-seen. Kun näin ollen ligandin määrä nestemäisessä väliaineessa kohoaa, konjugoidun reagenssin aktiviteetti alenee.

Homogeenista kilpailevaa sidostekniikkaa käytettäessä spesifisen si-tcmisreakticn ainesosat ovat nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän ligandia, kcnjugaattimäärä, joka sisältää ligandiin tai ligandin spesifiseen sitovaan analogiin sitoutuneen reagenssin, sekä ligandin spesifisen sidosparin määrän. Spesifinen sidospari saatetaan olennaisesti samanaikaisesti kosketukseen sekä konjugaatin että nestemäisen väliaineen kanssa. Koska mikä tahansa nestemäisessä väliaineessa oleva ligandi kilpailee konjugaatissa ligandin tai sen spesifisen sidosanalogin kanssa sit.cutuakseen spesifisen sidosparin kanssa, on nestemäisen väliaineen kanssa kosketuksessa olevan konju-gcidun reagenssin aktiviteetti suoraan verrannollinen nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin ja spesifisen sidosparin väliseen sitou-tumisasteeseen. Konjugoidun reagenssin aktiviteetti kohoaa näin ollen sitä mukaa kun ligandin määrä nestemäisessä väliaineessa kohoaa.

Homogeenisen kilpailevan sidostekr.iikan muunnos on homogeeninen syrjäy-tyssidostekniikka, jossa konjugaatti ensin saatetaan kosketukseen ligandin spesifisen sidosparin kanssa ja sen jälkeen nestemäisen väliaineen kanssa. Tällöin esiintyy kilpailua spesifisestä sidosparista. Tällaisessa menetelmässä spesifisen sidosparin kanssa kosketukseen 6921 4 saatetun konjugaatin määrä on tavallisesti se, joka käsittää ligandin tai sen analogin yli sen määrän, joka kykenee sitoutumaan spesifisen sidosparin sen määrän kanssa, joka on läsnä sinä aikana, kun konju-gaatti ja spesifinen sidospari ovat kosketuksessa, ennen kosketusta nestemäisen väliaineen kanssa, jonka epäillään sisältävän ligandia. Tämä kosketusjärjestys voidaan toteuttaa kahdella sopivalla tavalla. Toisessa menetelmässä saatetaan konjugaatti kosketukseen spesifisen sidosparin kanssa nestemäisessä miljöössä ennen kosketusta nestemäisen väliaineen kanssa, jonka epäillään sisältävän ligandia. Toisessa menetelmässä saatetaan nestemäinen väliaine, jonka epäillään sisältävän ligandia, kosketukseen konjugaattia ja spesifistä sidosparia sisältävän kompleksin kanssa, jolloin konjugaatissa oleva spesifinen sitova aine ja spesifinen sidospari on sidottu toisiinsa palautuvasta. Se määrä konjugaattia, joka sitoutuu spesifiseen aineeseensa, joka on kompleksimuodossa toisessa menetelmässä, on tavallisesti yli sen määrän, jonka ligandi kykenee syrjäyttämään nestemäisessä väliaineessa sinä aikana, jona spesifinen sidospari tai kompleksi ja väliaine ovat kosketuksessa ennen konjugoidun reagenssin aktiviteettimuutoksen analyysin suorittamista loppuun.

Toinen muunnos homogeenisesta kilpailevasta sidostekniikasta on homogeeninen sarjakyllästystekniikka, jossa spesifisen sitomisreaktion ainesosat ovat samoja kuin kilpailevassa sidostekniikassa käytetyt, mutta ainesosien lisäysjärjestys tai yhdistelmä ja niiden käytetyt suhteelliset määrät ovat erilaisia. Sarjakyllästyetekniikan mukaan saatetaan ligandin spesifinen sidospari kosketukseen nestemäisen väliaineen kanssa, jonka epäillään' sisältävän ligandia, joksikin ajaksi ennen mainitun nestemäisen väliaineen saattamista kosketukseen konjugaatin kanssa. Nestemäisen väliaineen kanssa kosketukseen saatetun spesifisen sidosparin määrä on tavallisesti suurempi kuin se määrä, joka kykenee sitoutumaan koko ligandimäärän kanssa, jonka oletetaan olevan läsnä nestemäisessä väliaineessa aikana, jolloin spesifinen sidospari ja nestemäinen väliaine ovat kosketuksessa ennen kuin nestemäinen väliaine joutuu kosketukseen konjugaatin kanssa. Konjugoidussa muodossa olevan ligandin tai ligandianalogin määrä on tavallisesti suurempi kuin se määrä, joka kykenee sitoutumaan spesifisen sidosparin jäljellä olevan sitoutumattoman määrän kanssa sinä aikana kun nestemäinen väliaine ja konjugaatti ovat kosketuksessa ennenkuin konjugoidun reagenssin mahdollisen aktiviteettimuutoksen analysointi saatetaan loppuun.

8 69214

Konjugoidun reagenssin aktiviteetinmuutoksen vahvistaminen ennakolta määrätyn tarkkailureaktion ainesosana aikaansaadaan edullisesti saattamalla spesifinen sitomisreaktioseos kosketukseen vähintään yhden sellaisen aineen kanssa, joka muodostaa konjugoidun reagenssin kanssn tarkkailureaktion ja määrittämällä spesifisen sitomisreaktion vaikutus tällaisen reaktion ominaisuuteen.

Reagenssin käyttöä merkkiaineena voidaan myös soveltaa tavanomaisiin heterogeenistä tyyppiä oleviin anaiyysikaavicihin, joissa merkkiai-nesosan sidottu ja vapaa faasi erotetaan ja joissa merkkiaineen määrä jommassa Kummassa määritetään. Reagenssi tällaisen heterogeenisen analyysin suorittamiseksi voi olla eri muodoissa. Yleensä tällainen välikappale sisältää kolme perusainesosaa, jotka ovat (1) tutkittava li-gandi, (2) ligandin spesifinen sidcspari ja (3) merkkiainesosa, joka tavallisesti on (a) ligandin, (b) ligandin spesifisen sidosanalogin tai (c) spesifisen sidosparin merkitty muoto. Sitomisreaktion ainesosat yhdistetään samanaikaisesti tai sarjalisäyksinä ja sopivalla inkubointiaialla tai -ajoilla sitoutuu merkkiainesosa vastaaviin kilpa!~ leviin sicospareihinsa, niin että sitoutumisaste, so. sidospariin sitoutuneen merkkiainesosan ja sitoutumattoman määrien suhde, en läsnäolevan ligandimäärän funktio. Alla en lyhyt selostus muutamista erilaisista sitomisreaktiokaavicista, joita voidaan käyttää keksinnön mukaista menetelmää suoritettaessa.

Joskin merkkiominaisuus merkityssä konjugaatissa, kuten radioaktivi-teetti tai entsymaattinen aktiviteetti tavanomaisissa heterogeenisissa spesifisissä sitomisanalyysimenetelmissä, kuten radioimmunoanalyy-seiss£,ja heterogeenisissa entsyymi-immunoanalyyseissa, on olennaisesti sana konjugaatin sidotulle ja vapaalle muodolle vaikuttaa määrätyissä tapauksissa merkityn konjugaatin sitoutuminen esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä reagenssin aktiviteettiin merkkiaineena. Tässä tilanteessa tarkkailureaktiolla on suhteellisen vakio luonne, kun ligandia ei ole läsnä nestemäisessä väliaineessa tai kun sitä on läsnä merkityksettömän pienessä määrässä. Kun ligandia on läsnä nestemäisessä väliaineessa muuttuu tarkkailureaktion ominaisuus tai luonne, kuten yllä on selostettu homogeenisen tekniikan yhteydessä. Alla oleville kaavioille pätevät seuraavat selitykset: 6921 4

Symboli Määritelmä L tutkittava ligandi ligandi tai sen spesifinen sidosanalogi B ligandin sidospari x merkkiaine, so. reagenssi |" liukenematon faasi -> irJcubointia j an jakso, jota seuraa sopiva erotus (Iira) rajoitettu; läsnä vähemmässä näärässä kuin se, joka kykenee sitoutumaan kaikkiin saatavissa oleviin sidoskontiin valituissa reaktio-olosuhteissa valitun inkubointia jän jakson aikana; so. ainesosa johon sitoutumisesta muut ainesosat kilpailevat (exc) ylimäärä, läsnä määrässä joka on suurempi kuin mitä kykenee sitoutumaan kaikkiin läsnä oleviin sidoskohtiin valituissa reaktio-olosuhteissa valittuna inkubointiajänjaksona.

1. Kilpailevien sidosten hetercreenisia järjestelyjä a) L +(Τ' " + B(lim) -> + liukenemattomaksi tekevä aine 3:tä tai © * varten Tämä on klassinen lähestymistapa kilpailevaan sitomiseen. Esimerkkejä tällaisista liukenemattomaksi tekevistä aineista ovat spesifiset saostavat vasta-aineet, spesifiset liukenemattomaksi tehdyt vasta-aineet ja, kun E tai (E)* on proteiinipitoinen aine, proteiinin saostajat, kuten ammcniunsulfaatti tai kun B tai(L)x on pieni adsorboitava molekyyli, dekstraani11a päällystetty puu-hiili. Selostus samantapaisista järjestelmistä en julkaisussa Biochem. J. 88:137 (1963) ja US-oatentissa n:o 3 839 153 (FI-P 54 034).

b) L + (E) * + J-E(lim) -^ *··έ·\*<ί lähestymistapaa kutsutaan tavallisesti kiintofaasiteknii— kaksi. Selostuksia samantapaisista radioimmunoanalyysi- ja e.n-syymi-inmunoanalyysitekniikoista on US-patenteissa n:ot 3 505 019, 3 555 143, 3 646 346 ja 3 654 090.

c) L + BÄ + J-(T^(lim) -^

Referenssi: US-patentti n:o 3 654 090.

d) L + |-(Γ) + B* (lim).-^

Referenssi: US-patentti n:o 3 850 752 (Fi-p 54 033).

10 6921 4 2. Heterogeeni si £ sar.i aky 1 las t y,° '· i?·1 -s a a) L + B(exc) _-> + © * (exc) ---? + liukenemattomaksi tekevä aine B:tä tai © varten

Sarjakyllästystekniikassa merih-ttinescsa sitoutuu joihinkin tai kaikkiin niihin sidoskohtiin aineessa z, jotka jaavat jäljelle ensimmäisen inkubointijaksan j‘uineen· b) L + J- E(exc) —+ ©“ (ex n) -?

Selostuksia samantapaisista racicinmunoanalyysi- Öa entsyymi-immu-noanalyysitekniikoista löytyy -S-patentista n:o 3 720 760 (FI-P 48 785) ja julkaisusta J· Itimunol. 209:129 (1 972).

c) L + B* (exc) -^ + [-© (exc) * 3· Heterogeeninen' kerrostua j ä re s t e - y L + |~ 3 (exc) -- E* (exc) *--- ve«v,cstustekn-· -5 kassa rne^^ikiamesosd sit^u^uu ^ cin — n x i n tai x aix— «·:ιm liukenemattomaKsi teqtyi:— w-c^y^.------- o---.u„un._n ligancimolekyyleihin.

Referenssi: US-patentti n: o 3 ?60 .(FI-P 48 725).

. neterogeemnen kiintofaasilair^.—u~·’ -.- L + © x + j- (ei-spesifinen) —" * + ^ Π-ΐΠϊ) ^ Tässä tekniikassa ligandi ja m.erxkiainesosa sidotaan ei-spesifi-fiseen sitojaan ja sen jälkeen siitä dissosioidaan suhteellisia määriä sidosparilla sitomalla» jclla on suurempi affiniteetti ligandiin ja merkkiainesosaan. ^.-.nilkan kaikkein käyttö- kelpoisimmassa muodossa käytetään ei-spes^.isen sitojan kolonnia, kuten on selostettu US-patentis3£· n:o 3 c59 10U. Tällainen tekniikka on käyttökelpoinen, kun l-S-ndi on sidottu endogeenisiin sitoviin aineisiin näytteessä, 0cu·"·a häiritsisivät kilpailevaa sitomisreaktiota jollei niitä poistettaisi. Tultua sidotuksi ei-spesifiseer. sitojaan voidaan endogeeniset sitovat aineet poistaa sopivilla pesuilla.

Tavanomaisiin heterogeenisiin analyysijärjestelmiin liittyviä parametreja, kuten analyysijärjstelyjä ja vaihtoehtoisia erotusmenetel-

H

11 6921 4 miä selostetaan yksityiskohtaisemmin julkaisussa Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Odell ja Daughaday (J. B. Lippin-cott Co., Philadelphia, 1972).

Sopivat reaktioaineosat, jotka muodostavat yhdessä konjugaatissa olevan reagenssin kanssa tarkkailureaktion, voidaan saattaa kosketukseen (i) spesifisen sitomisreaktioseoksen kanssa homogeenisen tekniikan mukaisesti tai (ii) erotetun sidotun tai vapaan faasin kanssa heterogeenisen tekniikan mukaisesti, yksinään tai minä tahansa yhdistelmänä joko ennen, samanaikaisesti tai spesifisen sitomisreaktion käynnistymisen jälkeen. Spesifisen sitomisreaktion käynnistämisen jälkeen reaktioseosta, joka voi sisältää jonkin tark-kailureaktiota varten välttämättömän aineosan tai kaikki, inkuboidaan tavallisesti ennakolta määrätyn ajan ennen kuin konjugaatissa olevan reagenssin mahdollinen aktiviteettimuutos vahvistetaan (homogeeninen tekniikka) tai erotetuissa faaseissa olevan reagenssin aktiviteetti vahvistetaan (heterogeeninen tekniikka). Inkubointijakson jälkeen lisätään reaktioseokseen kaikkia tarkkailureaktioon tarvittavia aineosia, joita ei vielä ole läsnä riittävissä määrissä reaktio-seoksessa, ja tarkkailureaktio vahvistetaan osoituksena nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin läsnäolosta tai määrästä.

Eräs edullinen herkkä tarkkailureaktio käsittää fluoresenssi-ilmiön ja on entsyymikatalysoitu. Tällaisessa reaktiojärjestel-mässä konjugaatissa oleva reagenssi on substraatti entsymaattisessa reaktiossa, joka tuottaa tuotteen, jolla on fluoresoivia ominaisuuksia, jotka eroavat konjugoidun substraatin ominaisuuksista. Mikä tahansa spesifisestä sitomisreaktiosta johtuva konjugoidun entsy-maattisen reagenssin aktiviteetin muutos aiheuttaa muutoksen reak-tioseoksen fluoresoivissa ominaisuuksissa. Yleinen reaktiokaavio tällaiselle entsyymikatalysoidulle reaktiojärjestelmälle on seuraa-va: entsyymisubstraatti - X-Z yym^),) tuote jossa X on entsyymillä lohkaistava sidos tai sidosryhmä, kuten esteri- tai amidoryhmä, ja Z on spesifinen sitova substraatti, joka riippuen käytetystä spesifisestä sitomisreaktiosta, on ligandi, ligandin spesifinen sitova analogi tai ligandin spesifinen sidospari. Tämäntyyppisessä reaktiojärjestelmässä käytettäviä spesifisiä 12 6921 4 konjugaatteja ovat erilaiset entsyymilohkaistavat fluoreseiinin, umbelliferonin, 3-indolin, β-naftolin, 3-pyridolin, resorufiinin johdannaiset ja sen tapaiset. Esimerkkeinä tällaisten johdannaisten mahdollisista rakennekaavoista mainittakoon:

Johdannainen Kaava R1 ___ o ^ R2 fluoreseiini

Cf\

Uy 0 R2 . /x 0 umbellif eroni γΓ \ I, p 3 _^R2 3-indoli J | I *

A

a. .R2 R2 ' r^V" 3-pyridoli o^vVy"2

resorufiini I

joissa Hl on -OH tai -X-z (kuten yllä on määritelty tässä kappalees-sa), F.2 on -X-Z ja F3 on -H tai -CH-.

13 6921 4

Esillä olevaa keksintöä voidaan soveltaa minkä tahansa sellaisen ligandin havaitsemiseen, jolle on spesifinen sidospari. Ligandi on tavallisesti peptidi, proteiini, hiilihydraatti, glykoproteiini, steroidi tai muu orgaaninen molekyyli, jolle on spesifinen sidos-pari biologisissa järjestelmissä tai joka on syntetisoitavissa. Toiminnallisessa mielessä ligandiksi valitaan tavallisesti antigeeni tai sen vasta-aine, hapteeni tai sen vasta-aine, tai hormoni, vitamiini, metaboliitti tai farmakologinen aine, tai näiden reseptori tai sitova aine. Erityisesimerkkejä keksinnön mukaisesti havaittavista ligandeista ovat hormoni, kuten insuliini, korio-niini-gonadotropiini , tyroksiini, liotyroniini ja estrioli, antigeenit ja hapteenit kuten ferritiini, bradykinniini, prostaglandiinit ja syövälle spesifiset vasta-aineet, vitamiinit kuten biotiini, vitamiiini-B12> foliinihappo, vitamiini-E, ja askorbiinihappo, metaboliitit kuten 31,5'-adenosiiniraonofosfaatti ja 3’,5’-guano-siinimonofosfaatti, farmakologiset aineet kuten dilantiini, digoksiini, morfiini, digitoksiini ja barbituraatit, vasta-aineet kuten mikrosomaali-vasta-aine ja hepatitiksen ja allergeenien vasta-aineet, sekä spesifiset sidosreseptorit kuten tyroksiini ja sitova globuliini, avidiini, sisäinen tekijä ja transkobalamiini.

Keksinnön mukaisessa konjugaatissa reagenssi on sidottu tai kytketty spesifiseen sitovaan aineeseen, joka on ligandi, ligandin spesifinen sitova analogi tai ligandin spesifinen sidospari riippuen valitusta analyysikaaviosta, niin että reagenssin aktiviteetistä säilyy mitattava määrä. Reagenssin ja spesifisen sitovan aineen välinen sidos on tavallisesti olennaisesti irreversiibeli analyysiolosuhteissa, esim. kun tarkkailureaktio, jossa reagenssilla on aktiviteettia, ei ole suunniteltu kemiallisesti tuhoamaan tällaista sidosta, kuten yllä mainituissa luminoivissa ja syklisissä reaktiojärjestelmissä. Määrätyissä tapauksissa tällainen sidos on kuitenkin tahallisesti tuhottu tai siihen vaikutetaan muulla tavoin valitulla tarkkailureaktiolla reagenssin aktiviteettimuutoksen analysoimiseksi. Tällainen tapaus on aikaisemmin mainituissa entsymaattisissa fluoresoivissa subst-raattireaktiojärjestelmissä.

Reagenssi voidaan suoraan sitoa spesifiseen sitovaan aineeseen, niin että konjugaatin molekyylipaino on pienempi tai sama kuin 14 6921 4 reagenssin ja spesifisen sitovan aineen ryhmämolekyjrlipaino. Reagenssi ja spesifinen sitova aine sidotaan kuitenkin tavallisesti väliryhmillä, jossa on 1-50 ja edullisesti 1-10 hiiliatomia tai heteroatomia, kuten typpeä, happea, rikkiä, fosforia, jne. Esimerkkejä yhden atomin sisältävästä väliryhmästä on metyleeni-ryhmä (yksi hiiliatomi) ja aminoryhmä (yksi heteroatomi).

Väliryhmän molekyylipaino on tavallisesti korkeintaan 1000 ja edullisesti alle 200. Väliryhmä sisältää hiiliatomien tai hete-roatomien tai näiden yhdistelmäketjun ja on yhdistetty reagenssiin ja spesifiseen sitovaan aineeseen tai näiden aktiiviseen johdannaiseen yhdysryhmällä, joka tavallisesti on esteri-, amido-, eetteri-, tioesteri-, tioeetteri-, asetaali-, metyleeni- tai aminoryhmän muodossa.

Reagenssina oleva enstyymisUbstraatti on yhdiste tai ryhmä, joka entsyymillä katalysoiden on kemiallisesti muutettavissa. Kun substraattia käytetään konjugoituina reagensseinä on sen molekyylipaino edullisesti alle 9000 ja edullisimmin alle 5000. Tämänkokoiset substraatit ovat, sen johdosta että niiden molekyyli ei ole monimutkainen, erittäin sopivia käytettäviksi konjugaatin valmistuksessa. Tällaisten substraattien aktiviteetti on lisäksi, sidottuna spesifiseen sitovaan aineeseen, helposti muutettavissa saattamalla konjugaatti reagoimaan spesifisen sitovan aineen kanssa. Esimerkkejä esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoisista entsyymisubstraateista ovat yllä mainitut entsyymillä pilkottavat fluoresenssisubstraatit kuten fluoreseiini ja umbelliferonijohdannaiset; pH-indikaattorit; ja spektrofotometriset indikaattori-värit, erityisesti väriainetta synnyttävät tyypit.

Keksinnön eräässä muodossa ovat spesifisen sitomisreaktion aineosat, jotka on yhdistettävä nestemäisen väliaineen kanssa, jonka epäillään sisältävän ligandia, nestemäisessä tai kiinteässä muodossa. Suositussa homogeenisessa analyysijärjestelmässä aineosat ovat tavallisesti liuosmuodossa tai kiinteässä muodossa, joka helposti liukenee nestemäiseen väliaineeseen. Koska testattava nestemäinen väliaine tavallisesti on luonteeltaan vesipitoinen ovat aineosat tavallisesti vesiliukoisessa muodossa, so. joko vesiliuoksessa tai vesiliukoisessa

II

15 6921 4 kiinteässä muodossa, kuten jauheena tai hartsina. Analyysimenetelmä voidaan suorittaa tavallisessa laboratorioastiassa kuten koeputkessa, jolloin spesifisen sitomisreaktion ainesosat ja reaktiojärjestelmän ainesosat lisätään siihen kiinteässä tai nestemäisessä muodossa.

On myös ajateltavissa, että yksi tai useampi spesifisen sitomisreaktion ainesosista ja/tai yhtä tai useampaa tarkkailureaktion ainesosista lisätään kantajan kanssa. Eräässä suoritusmuodossa kantaja voi olla nestettä sisältävä astia kuten koeputki tai kapseli, joka sisältää tällaisen ainesosan tai ainesosia sisäosassaan, esim. nestemäisessä tai irtonaisessa kiinteässä muodossa tai kerroksen muodossa astian sisäpinnalla. Eräässä toisessa suoritusmuodossa kantaja voi olla matriisin muodossa, joka on liukenematon ja huokoinen sekä edullisesti absorboi testattavaa nestemäistä väliainetta. Tällainen matriisi voi olla imupaperi, polymeerifilmejä, -kalvoja, -nukkaa tai -paloja, geelejä jne. Tavallisessa muodossa laite muodostaisi sopivan välikappaleen testattavan nestemäisen väliaineen saattamiseksi kosketukseen, spesifisen sitovan reaktion ja/tai tarkkailureaktion suorittamiseksi sekä saadun tuloksen havaitsemiseksi.

Nestemäinen testattava väliaine voi olla luonnossa esiintyvä tai keinotekoisesti muodostettu neste, jonka epäillään sisältävän ligandia ja se on tavallisesti biologinen juokseva aine tai tämän laimennuksen tai muun käsittelyn tuloksena saatu neste. Keksinnön mukaisella menetelmällä analysoitavia biologisia nesteitä ovat seerumi, plasma, virtsa ja sikiövedet sekä aivo- ja selkäydinnesteet. Muita aineita kuten kiinteää ainetta, esim. kudosta, tai kaasuja voidaan analysoida saattamalla ne nestemuotoon kuten liuottamalla kiintoaine tai kaasu nesteeseen tai nesteuuttamalla kiintoainetta.

Päin vastoin kuin ennestään tunnetussa homogeenisessa analyysijärjestelmässä voidaan biologisia nesteitä, jotka sisältävät aineita, joilla on reagenssiaktiviteetti, joka on samanlainen tai identtinen konju-goidun merkkiaineen kanssa, analysoida ligandin suhteen ilman tausta-häiriötä. Endogeenista taustareaktioaktiviteettia voidaan helosti eliminoida usealla tavalla. Biologinen neste voidaan käsitellä endo-geenisen reagenssiaktiviteetin tuhoamiseksi selektiivisesti. Tällainen käsittely voi sisältää selvitysaineen käytön, joka kemiallisesti tuhoaa endogeenisen aktiviteetin, minkä jälkeen seuraa käsittely tällaisen selvitysaineen tuhoamisvaikutuksen inaktivoimiseksi.

16 6921 4

Keksintöä selostetaan alla lähemmin esimerkkien avulla.

Esimerkki 1 2,4-dinitrofenyyli-fluoreseiini-konjugaatin valmistus

Fluoreseiini-3'/£-(2,4-dinitroanilino)heksanoaatti7.

Synteesi käsitti pohjimmiltaan 6-(2,4-dinitroanilino helcsaani-hapon happokloridin reaktion fluoreseiinin dinatriumsuolan kanssa.

6-(2,4-dinitroanilino)heksaanihappo valmistettiin julkaisussa Biochem. J. 1*2-287-94 (1948) selostetulla menetelmällä.

Liuos, jossa oli 1,5 g (5 mmoolia) 6-(2,4-dinitroanilino)heksaani-happoa muutettiin happokloridiksi saattamalla se reagoimaan 10 ml:n kanssa lämmintä tionyylikloridia 15 minuuttia, minkä jälkeen jäähdytettiin ja laimennettiin 20 ml:11a heksaania. Muodostunut kiinteä happokloridi otettiin talteen suodattamalla ja perusteellisen kuivauksen jälkeen siihen lisättiin 600 mg fluoreseiinin dinatriumsuolaa 10 ml:ssa kuivaa asetonia. 5 tunnin palautus-jäähdytyskeiton jälkeen tukahdutettiin reaktio lisäämällä 2 ml vettä ja 5 ml asetonia. 30 minuutin jälkeen 25°C:ssa väkevöitiin seos kuiviin ja jäännös jaettiin i.etyyliasetaatin ja natriumkarbonaatin vesiliuoksen välillä. Orgaaninen faasi erotettiin ja pestiin 1 %:sella rikkihapon vesiliuoksella, kuivattiin

II

6921 4 17 vedettömällä magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin. Punainen öljy kromatografoitiin 60 g:11a piigeeliä 50 (E. Merck, Darmstadt, Saksa) käyttäen eluoimisaineena 20 % (t/t) asetonia hiilitetrakloridissa.

1,2 g epäpuhdasta fcis-esteriä uucelleenkrcmategrafoltiin 60 g:11a tii-geeliä käyttäen 10 p:sta (t/t) asetonia hiilitetrakloridissa. Sopivat jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 180 mg keitaitta lasimaista kiintoainetta.

Laskettu yhdisteelle C^H^gMgO^: C 55,33, H 4,30, n 9,43 Saatu : C 60,92, H 4,35, N 5,65.

Infranpunakirjossa oli odotettu esteri-k&rbonyyliadsorptio arvossa 1765 cm-1.

Esimerkki 2

Homogeenisia spesifisiä sitonisanalyysejä 2 ,a-dinitrofenyyIin johdannaisille ja näiden vasta-aineille käyttäen entsyymisubstraattia (modifioitu flucreseiini) merkkiaineena.

Tässä esimerkissä käytetyt spesifiset sitomisanalyysijärjestelmät perustuvat kaaviossa 1 esitettyyn reaktioon.

A. Homogeeninen suora sitcmis-fluoresciva. analyysi 2,4-dinitrofenyy-lin vasta-aineena; vasta-aineen eri määrien vaikutus reaktionopeuteen.

Valmistettiin ja analysoitiin seitsemän spesifistä sitomisreaktioseos-ta. Kussakin reaktioseoksessa 20 ^ul 1 ^uJi 2, 4-dinitrofenyylif luore-seiinikonjugaattia (valmistettu esimerkin 1 mukaisesti) dimetyylisulf-oksidissa oli yhdistetty 2,4-dinitrofenyylin antiseerumin taulukossa 5 annetun tilavuuden kanssa ja jossa lisäksi oli riittävästi 0,1 M bishydroksietyyliglysiini-hydrokloridipuskuria pH-arvossa 7,0 kokonaistilavuuden 2,0 ml:ssaaikaansaamiseksi. Kullekin reaktioseokselle määritettiin konjugaatissa olevan esterisidcksen tausta-hydrolyysinopeus 3 minuutin aikana määrittämällä fluoresointi-intensiteetin lisäys 510 nmrssä fluorimetrilaitteiston herätystilar. ollessa 470 nm:ssä.

18 6921 4 KAAVIO 1 8 o p.-c-o n CJ - 1, ,, a^r;r_?si_^ n ^ e , pH I > 0 2,4-dinitrofenyyli-fluoreseiinikonj ugaatti ©O C'vV^V\ ^

CuO'

Ci, / s (suurin fluoriloisre 51C nr.:ssä) R = - (CK2 )5 K02 o2n 10 ^ul:n tilavuus 0,1 M bis-hydroksietyylislysilnl'hydrokloridipusku-ria pH-arvossa 7,0, jossa oli 0,5^ yksikköä tyypin I esteraasia (Ξ.C. lio. 3.1.1.1» Signa Chemical Co., St. Louis, Missouri) lisättiin sen jälkeen kuhunkin reaktioseokseen. Saatu kokonaisreaktionopeus mitattiin samalla tavein kuin taustanydrolyysir.opeus. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

11 19 taulukko 1 6921 4 antiseerumin taustahydro- Kokonais reaktio- määrä lyysi- reaktio- seos___ ( , ui 1_ nopeus__noceus . 1 0 0,02 2,58 . 2 5 0,07 2,48 3 10 0,11 1,91 4 20 G,17 1,08 5 30 0,21 0,63 6 40 C,22 0,4ρ 7 6.0 0,26 · C ,30

Esimerkin tässä osassa havainnollistettiin, että hydrolyysireaktior. nettoreaktioncpeus oli kääntäen verrannollinen spesifisessä sitomis-reaktioseoksessa läsnä olevan ligandir., 2,1-äinitrofenyylin vasta-aineen määrään. Samein havainnollistui, estä taustahyoroiyysireaktion reaktionopeus oli suoraan verrannollinen spesifisessä s it omis re aktio-seoksessa läsnä olevan vasta-aineen määrään. Esillä oleva keksintö· aikaansaa näin ollen testiseoksen ja -menetelmän ligandivasta-aineen läsnäolon määrittämiseksi 2,t-äinitrofenyylillä nestemäisessä väliaineessa käyttäen suoraa sitemis-flucroivaa analyysitekniikkaa.

B. 2,4-dinitrofenyyIin johdannaisten homogeeninen kilpaileva sitemis-fluoroiva analyysi; 2, ^-dir.itrofenyyli-£-alaniinin eri määrien vaikutus reaktionopeuteen.

Valmistettiin kymmenen spesifistä sitemisreaktioseosta, joilla kunkin kokonaistilavuus oli 2,0 ml ja kussakin oli 0,1 M bis-hydroksietyyli-glysiinihydrokloridipuskuria pH-arvossa 7,0 ja.2,4-dinitrofenyyli-B-alaniinia, valmistettuna julkaisussa J. Amer. Chem. Soc. 76:1328 (1954) selostetulla menetelmällä taulukossa 2 esitetyissä pitoisuuksissa. Yhdeksään reaktioseokseen, so. numeroihin 2-10 taulukossa 2, lisättiin 2,^-dinitrofenyyIin antiseerumia määrässä, joka riitti inhiboimaan esteraasi-katalysoidun reaktion nopeuden toisessa seoksessa, so. n:ossa 1, oC %: Ha. Sekoituksen jälkeen lisättiin kuhunkin reaktioseokseen 20 ^ul 1 ^uM 2, t-dinitrofenyyli-fluoreseiinikcnjugaattia (valmistettu kuten esimerkissä l) dimetyylisulfoksidissa. Kuhunkin reaktioseokseen lisättiin sen jälkeen 10 /Ul:n tilavuus 0,1 M bis-hydroksietyy liglysiini-hydrokloridipuskuria pH-arvossa 7,0, jossa oli 0,54 yksikköä tyypin I esteraasia (E.C. No. 3·1·1·1» Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Saatu reaktionopeus mitattiin kuten tämän 20 6921 4 esimerkin osassa A. reaktioiden 2-10 nopeuden prosentuaalinen arvo verrattuna reaktion n:o 1 (ilman vasta-ainetta) laskettiin· Tulokset ilmenevät taulukosta 2.

TAULUKKO 2 2 , -dinitrcfenyyli- β-alanimin pitci- reaktion n:o 1 reaktio- suus reaktio- prosentuaalinen seos___(n. i) nopeus nopeus 1 0 2,78 2 0 1,014 37 3 5 1,01 36 ^ ' 12 1,014 ' 37 5 20 1,214 145 6 30 1,51 5¾ 7 50 1,514 56 8 75 1,30 65 9 100 1,85 67

10 150 2,33 SH

Esimerkin tässä osassa havainnollistui, että hycrolyysireaktion reaktionopeus oli suoraan verrannollinen reaktioseoksessa olevan 2,i4-di-nitrofenyyli-S-alaniinin määrään. Esillä oleva keksintö aikaansaa näin ollen testiseoksen ja -menetelmän sellaisten ligandien määrittämiseksi kuin 2,i4-dinitrofenyylin johdannaiset nestemäisessä väliaineessa käyttäen kilpailevaa sitomis-fluoroivaa analyysitekniikkaa.

C. 2,14-dinitrofenyyIin johdannaisten homogeeninen kilpaileva sitomis-spektrofotometrinen analyysi; 2,lJ-dinitrofenyyli-B-alaniinin eri määrien vaikutus reaktionopeuteen.

Valmistettiin kahdeksan spesifistä sitomisreaktioseosta, joilla kullakin oli kokonaistilavuus 1,0 ml ja jossa kussakin oli 0,1 M tris-(hydroksimetyyli)-aminometaanihydrckloridi-puskuria pK-arvossa 7,0 ja 2,i4-cinitrofenyyli-6-alaniinia taulukossa 3 esitetyissä pitoisuuksissa. Seitsemään kahdeksasta reaktioseoksesta, so. numeroihin 2-8 taulukossa 3, lisättiin riittävä määrä 2, *J-dinitrofenyy Iin antiseerumia esteraa-si-katalysoidun reaktion nopeuden inhiboimiseksi 82 5:11a toisessa seoksessa, so. numerossa 1. Sekoituksen jälkeen lisättiin kuhunkin reaktioseokseen 10 ^ul 0,1 mM 2 »JJ-dinitrofenyyli-fluoreseiini-konju-gaattia (valmistettu kuten esimerkissä l)· Kuhunkin reaktioseokseen 21 6921 4 lisättiin sen jälkeen 20 ^ul:n tilavuus 0,1 M tris-(hydroksi-metyyli)-aminometaanihydrokloridi-puskuria pH-arvossa 7,0, jossa oli 2,16 kansainvälistä yksikköä tyypin I esteraasia (E.C. No.

3.1.1.1, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Kunkin reaktioseoksen absorptiomuutos arvossa 489 nm per min mitattiin Gilford 2000-spektrofotometrillä. Tulokset ilmenevät taulukosta 3.

Taulukko 3 reaktio- 2,4-dinitrofenyyli- absorptionopeuden seos 8-alaniinin pitoisuus muutos _ _(/UM)_ _ 1 0 0,0261 2 0 0,0047 3 1,25 0,0118 4 2,5 0,0131 5 5,0 0,0185 6 7,5 0,0202 7 10,0 0,0192 8 12,5 0,0223 Tämä osa esimerkistä havainnollistaa, että reaktionopeus oli suoraan verrannollinen reaktioseoksessa olevan 2,4-dinitrofenyyli-B-alaniinin määrään. Esillä oleva keksintö tarjoaa näin ollen testiseoksen ja -menetelmän sellaisten ligandien läsnäolon määrittämiseksi kuin 2,4-dinitrofenyylijohdannaisten nestemäisessä väliaineessa käytetään kilpailevaa sitomis-spektrofotometristä analyysitekniikkaa.

Esimerkki 3

Biotiini-umbelliferohikonjugaatin valmistus (2-okso-2-H-l-bentsopyraani-7-yyli)-5-/kis-heksahydro-2-okso-lH-tieno-(3,4-d-)-imidatsoli7valeriaanahappoesteri.

Liuosta, jossa oli 300 mg (1,2 mmoolia) vedetöntä biotiinia 20 mltssa kuivaa dimetyyliformamidia sekoitettiin -10°C:ssa kuivassa typpi-kaasukehässä ja 0,17 ml (1,2 mmoolia) kuivaa trietyyliamiinia lisättiin. Lisättiin tipottain liuosta, jossa oli vasta valmistettua 22 6 9 2 1 4 etyyliklooriforraiaattia (0,l4l ml 3 ml:ssa kuivaa eetteriä).

30 minuutin hauduttamisen ja sekoituksen jälkeen suodatettiin saatu sakka kuivassa typpiatmosfäärissä ja jäähdytettiin välittömästi -10°C:een. Suodatettu jäännös lisättiin liuokseen, jossa oli 197 mg (1,2 mmoolia) vedetöntä 7-hydroksikumariinia 3 ml:ssa kuivaa pyridiiniä ja sekoitettiin tunnin aj'an -10°C:ssa ja sen jälkeen 20 tuntia 25°C:ssa. Liuotetut liuottimet haihdutettiin perkityhjössä 40°C:ssa. Jäähdytyksen jälkeen suodatettiin saatu kiintoaine ja uudelleenkiteytettiin metanolista, jolloin saatiin haluttua tuotetta (sp. 2l6-2l8°C).

Laskettu yhdisteelle C^i^Q^P^S: C 48,75, H 4,19, N 7,21.

Saatu : C 58,4 H 5,12, N 6,86.

Esimerkki 4

Heterogeenisiä spesifisiä sitomisanalyysejä amidiinille ja bio-tiinille käyttäen entsyymisubstraattia merkkiaineena.

Tässä esimerkissä käytetyt spesifiset sitomisanalyysijärjestelmät perustuivat seuraavaan reaktioon: 0

II

/ \ o N__! S/ esteraasi ^ ^J\ H20, pH 8,0 biotiini-umbelliferonikonjugaatti 0 n ΠΘ jj ^ + H^ + biotnni (maksimaalinen fluorointi arvossa 448 nm) A. Liukenemattomaksi tehdyn sidosparin valmistus.

Avidiini, jolla on taipumus sitoutua biotiiniin, tehtiin liukenemattomaksi sitomalla se kovalenttisesti veteen liukenemattomaan polymeeripalloon seuraavalla tavalla. Määrätty määrä Sepharose'a 4b (Pharmacia AB, Uppsala, Ruotsi) aktivoitiin avidiiniin sitoutumista varten käyttäen March’in ym. julkaisussa Analytical Biochemistry 60:149 (1974) selostamaa menetelmää. Noin 4 ml aktivoitua Sepharose’a 4B suspendoitiin 8 ml:aan 0,1 M sitraattipuskuria pH-arvossa 7,0.

23 6921 4

Suspensioon lisättiin 6 mg avidiinia, jonka aktiviteetti oli 9,9 yksikköä per mg 3 ml:ssa vettä. Yksi yksikkö avidiini-aktiviteettia on sen määrä avidiinia, joka kykenee sitomaan yhden mikrogramman biotiinia. Saatua reaktioseosta sekoitettiin 6 tuntia 7°C:ssa. Avidiiniin sitoutunut Sepharose 4B suodatettiin sen jälkeen, pestiin 100 ml:11a 0,1 M natriumbi-karbonaattipuskuria pH-arvossa 9,0 ja suspendoitiin uudelleen 12 ml:aan 0,1 M tris-(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridi-puskuria pH-arvossa 8,0 ja laimennettiin 1:1 0,1 M bis-hydroksi-etyyliglysiinihydrokloridipuskurilla pH-arvossa 7,0.

B. Kilpaileva sitomisanalyysi biotiinille; biotiinin vaihtelevien määrien vaikutus vapautuneen umbelliferonin määrään.

Valmistettiin kahdeksan spesifistä sitomisreaktioseosta, jolloin kunkin kokonaistilavuus oli 0,2 ml ja kussakin oli 0,1 M bis-hydroksietyyliglysiinihydrokloridi-puskuria pH-arvossa 7,0, 0,3 /UM biotiiniumbelliferonikonjugaattia (valmistettu kuten esimerkissä 3), 15 /Ui avidiiniin sidotun Sepharose 4B:n suspensiota, joka oli valmistettu kuten tämän esimerkin osassa A, ja biotiinia taulukossa 4 esitetyissä pitoisuuksissa. Reaktioseosten annettiin hautua huoneen lämpötilassa ravistaen varovasti 20 min. Kukin reaktioseos sentrifugoitiin ja päällä olevan nefeteen 100 /ul:n suuruinen alikvootti yhdistettiin 2 ml:n kanssa 0,1 M bis-hydrok-sietyyliglysiinihydrokloridi-puskuria pH-arvossa 8,2, jossa oli 1,08 yksikköä sian esteraasia. Viiden minuutin hauduttamisen jälkeen huoneen lämpötilassa mitattiin kussakin reaktioseoksessa kehittynyt fluorointi-intensiteetti 448 nm:ssä 364 nm:n herätteellä käyttäen Amico-Bowman-spektrofotofluometriä. Tulokset ilmenevät taulukosta 4.

24 6921 4

Taulukko 4 reaktioseos biotiinipitoisuus fluorointi- (^,uM) intensiteetti 1 0,00 0,355 2 0,10 0,495 3 0,20 0,469 4 0,30 0,503 5 0,40 0,547 6 0,50 0,502 7 0,75 0,580 8 1,00 0,688 Tästä esimerkistä ilmenee, että NAD-biotiinin määrä nestemäisessä faasissa oli suoraan verrannollinen läsnä olevan vapaan biotiinin määrään ja siten esillä olevan keksinnön mukaista analyysimenetelmää ja reagenssiainetta voidaan käyttää ligandin määrittämiseksi tuntemattomassa nestemäisessä näytteessä.

ti

Claims (2)

25 6921 4

1. Specifik bindningsanalysmetod för bestämning av en ligand i ett flytande medium, vilken metod omfattar följande steg: (a) man bringar det flytande mediet i beröring med ett reagens-medel, som innehAller ett konjugat av ett märkningsmedel och ett specifikt bindande medel, varvid reagensmedlet och liganden bildar ett bindningsreaktionssystem, soti bildar (i) en bunden fas av det märkta konjugatet, väri det specifikä bildande mediet är bundet därvid med ett specifikt bindningspar och (ii) en fri fas av det märkta konjugatet, väri det specifikä bindande mediet ej är bundet därvid med ett specifikt bindningspar, och (b) man bestämmer märkningsmedlet antingen i den bundna eller den fria fasen som ett mätt för liganden i det flytande mediet, kännetecknad av att märkningsmedlet är ett substrat för en enzym, som verkar katalytiskt pA substratet under bildning av en bestämbar produkt, sAsom en fluorescerande produkt.

1. Spesifinen sitomisanalyysimenetelmä nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrittämiseksi, joka käsittää seuraavat vaiheet: (a) nestemäinen väliaine saatetaan kosketukseen reagenssiaineen kanssa, joka sisältää merkkiaineen ja spesifisen sitovan aineen konjugaatin, jolloin reagenssiaine ja ligandi muodostavat sitomisreaktiojärjestelmän, joka tuottaa (i) merkityn konjugaatin sidotun faasin, jossa spesifinen sitova aine on sidottu siihen spesifisellä sidosparilla ja (ii) merkityn konjugaatin vapaan faasin, jossa spesifinen sitova aine ei ole sidottu siihen spesifisellä sidosparilla, ja (b) määritetään merkkiaine joko sidotussa tai vapaassa faasissa nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin mittana, tunnettu siitä, että merkkiaine on entsyymisubstraatti, johon entsyymi vaikuttaa katalyyttisesti muodostaen määritettävän tuotteen, kuten fluoresoivan tuotteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymin kyky toimia katalyyttisesti substraatti-merkkiaineeseen on erilainen sidotussa faasissa kuin vapaassa faasissa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen homogeenista tyyppiä oleva menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymisubstraatin aktiivisuus nestemäisessä reaktioseoksessa mitataan erottamatta merkityn konjugaatin sidottua faasia ja vapaata faasia toisistaan .

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen heterogeenista tyyppiä oleva menetelmä, tunnettu siitä, että saatu merkityn konjugaatin sidottu faasi ja vapaa faasi erotetaan toisistaan ja entsyymisubstraatin aktiivisuus mitataan toisessa niistä.

5. Reagenssiaine nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrittämiseksi, joka reagenssiaine käsittää merkkiaineen ja spesifisen sitovan aineen konjugaatin, ja joka reagenssiaine ja 26 6921 4 ligandi muodostavat sitomisreaktiojärjestelmän, joka tuottaa merkityn konjugaatin sidotun faasin, jossa spesifinen sitova aine on sidottu siihen spesifisellä sidosparilla ja vapaan faasin, jossa spesifinen sitova aine ei ole sidottu siihen spesifisellä sidosparilla, jolloin merkkiaineen määrä joko sidotussa tai vapaassa faasissa on nestemäisessä väliaineessa olevan ligandin määrän funktio, tunnettu siitä, että merkkiaine on entsyymisubstratti, johon entsyymi vaikuttaa katalyyttisesti muodostaen määritettävän tuotteen, kuten fluoresoivan tuotteen.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen reagenssiaine, tunnet-t u siitä, että se sisältää (1) merkityn konjugaatin, joka sisältää merkkiaineen sidottuna liqandiin tai sen spesifiseen sitovaan analogiin, ja (2) ligandin sidospariin.

2. Metod enligt patentkravet 1, kännetecknad av att enzymets förmAga att verka katalytiskt pA substrat-märk-ningsmedlet är annorlunda i den bundna fasen än i den fria fasen. Il