FI75677B - Testanordning foer bestaemning av en ligand i ett vaetskeprov medelst homogen immunoanalys, foerfarande foer framstaellning av denna och med anvaendning av anordningen utfoert analytiskt foerfarande. - Google Patents

Description

1 75677

Koelaite ligandin määrittämiseksi nestenäytteestä homogeenisella immunokokeella, menetelmä sen valmistamiseksi ja laitteen avulla suoritettava analyyttinen menetelmä 5 Keksinnön kohteena on koelaite ja menetelmä sen käyttämiseksi ligandin määrittämiseen tai ligandin sitomis-kyvyn määrittämiseen nestenäytteessä, joka menetelmä perustuu spesifisen sitomiskokeen, esim. immunokokeen periaatteeseen. Erityisesti keksintö koskee kiinteässä muo-10 dossa olevia kantaja-aineita, jotka sisältävät homogeenisen spesifisen sitomiskokeen reagensseja.

Eri tyyppisten näytteiden analyyseihin, varsinkin luonnossa olevien biologisten nesteiden, teollisuusnestei-den ym. analyyseihin käytetään usein kiinteiden analyyt-15 tisten yksiköiden muodossa olevia koeliuskoja, koska niiden käyttö on mukavaa ja tulokset saadaan niitä käyttäen nopeasti. Erilaisten kliinisesti merkitsevien aineiden havaitsemiseen biologisissa nesteissä, kuten veriherassa tai virtsassa koeliuskat ovat osoittautuneet sangen edul-20 lisiksi määritettäessä ihmisten ja eläinten tautien laatu ja käsittely.

Tavanomaiset koeliuskojen muodossa olevat koelaitteet käsittävät tavallisesti kantajajäsenen, kuten absorboivan tai huokoisen perusaineen, joka on esim. paperia, 25 johon on sisällytetty reagensseja, jotka reagoivat kokeiltavaan nestenäytteeseen sisältyvän aineosan tai aineosien kanssa, josta reaktiosta on havaittavana tuloksena, tavallisesti sähkömagneettisena säteilynä signaali, kuten värin muutos. Kokeiltava näyte saatetaan kosketuksiin kanta-30 jajäseneen sisällytetyn reagenssin kanssa, esimerkiksi kastamalla laite hetkeksi näytteeseen tai lisäämällä näytettä laitteelle ja havaitsemalla tai mittaamalla tulos määrätyn reaktioajan kuluttua. Tällaisten koelaitteiden etuna on niiden helppo käyttö rutiinimääräyksissä, joissa 35 laborantilta ei kulu aikaa eikä vaaditä taitoa reagenssien lisäämiseen näytteeseen, ja joissa tulokset saadaan helposti havaittavina tai instrumenttilukemina. Lisäksi 2 75677 helposti havaittava tulos tai instrumenttilukema saadaan nopeasti.

Eri tyyppiset koeliuskat ovat olleet tunnettuja ja käytössä useiden vuosien ajan monilla eri aloilla aina ta-5 vallisimmasta pH-paperista in vitro diagnostisiin laitteisiin erilaisten virtsan ja veren aineosien toteamiseen, kuten glukoosin, proteiinin, vieraan veren ym. toteamiseen (näitä on kuvattu esim. US-patenttijulkaisuissa nro 3 164 534, 3 485 587 ja 3 012 976). Näissä tavanomaisissa 10 koeliuskoissa olevat reagenssikoostumukset reagoivat määritettävän aineen tai määritettävien aineiden kanssa suoraan, ja niiden herkkyys on tästä syystä ja muista syistä rajoittunut käyttöön aineiden havaitsemiseksi, joita nes-tenäytteissä on konsentraatioina millimoolista ylöspäin.

15 Toisaalta spesifinen sitomiskoetekniikka on osoit tautunut erittäin käyttökelpoiseksi analyyttisissa menetelmissä määritettäessä erilaisia orgaanisia, diagnostiselta, lääketieteelliseltä, ympäristön ja teollisuuden kannalta tärkeitä, erittäin alhaisina konsentraatioina esiintyviä 20 aineita. Spesifiset sitomiskokeet perustuvat ligandin, so. määritettävän sitoutumiskykyisen analyytin ja sen sitomis-partnerin vuorovaikutukseen. Kun ligandi tai sen sitomis-partneri on vasta-aine ja toinen niistä on hapteeni tai antigeeni, niin koetta nimitetään immunokokeeksi.

25 Tavanomaisessa spesifisessä sitomiskoetekniikassa kokeiltavan nestemäisen aineen näyte yhdistetään reagenssin kanssa, jonka koostumus vaihtelee. Tällaisiin koostumuksiin sisältyy merkitty konjugaatti, joka käsittää sitomiskompo-nentin ja siihen sisältyvän merkintäaineen. Merkityssä kon-30 jugaatissa oleva sitomiskomponentti yhdessä reagenssin mahdollisten muiden aineosien kanssa vaikuttaa kokeiltavassa aineessa olevaan ligandiin ja muodostaa sitovan reaktiosys-teemin ja tuottaa kahta lajia tai muotoa olevat merkityt konjugaatit, sidotun ja vapaan. Merkityn konjugaatin sido- 75677 3 tussa lajissa sitomiskomponentti, esim. hapteeni tai antigeeni on sitoutunut vastaa/aan sitomispartneriin, esim. vasta-aineeseen, kun sensijaan vapaassa lajissa sitomiskomponentti ei ole tällä tavoin sidottu. Tuloksena saadun sido-5 tun lajin sisältämä merkityn konjugaatin suhteellinen määrä verrattuna vapaan lajin määrään riippuu koenäytteestä määritettävän ligandin määrästä.

Kun sidotun lajin merkitty konjugaatti on käytännöllisesti katsoen mahdoton havaita merkintäaineen havaitsemi-10 seen käytetyllä ilmaisimella vapaan lajin sisältämän merkityn konjugaatin läsnäollessa, niin sidottu laji ja vapaa laji on kokeen suorittamiseksi erotettava toisistaan fysikaalisesti. Tämäntyyppistä koetta nimitetään alalla heterogeeniseksi. Kun merkityn konjugaatin sidottu laji ja va-15 paa laji pystytään toistensa läsnäollessa havaitsemaan, ei erottamisvaihetta tarvitse suorittaa, ja koetta kutsutaan homogeeniseksi.

Ensimmäiseksi keksityssä erittäin herkässä spesifisessä sitomiskokeessa, radioimmunokokeessa käytetään mer-20 kintäaineena radioaktiivista isotooppia. Tällaisen kokeen on välttämättä oltava heterogeeninen, koska merkintäaineen ilmaisimella havaittava ominaisuus pysyy kvalitatiivisesti muuttumattomana vapaassa ja sidotussa lajissa. Radioaktiivisten aineiden käsittelyyn liittyvien hankaluuksien ja 25 vaikeuksien johdosta sekä tarvittavan erottamisvaiheen vuoksi on kehitetty homogeenisia koesysteemejä, joissa radio-isotooppien sijasta käytetään muita merkintäaineita, kuten entsyymejä, bakteriofageja, metalleja ja organometallikomp-lekseja, koentsyymejä, entsyymisubstraatteja, entsyymiakti-30 vaattoreita ja -inhibiittoreita, syklisointireagensseja, orgaanisia ja epäorgaanisia katalysaattoreita, prosteetti-sia ryhmiä, kemoluminesenssireagensseja ja fluoresoivia molekyylejä. Tällaisilla homogeenisilla spesifisillä sitomis-koesysteemeillä saadaan havaittavissa oleva vaste esim. säh-35 kömagneettisen säteilyn signaali, kuten kemiluminenssi- tai 4 75677 fluoresenssiemissio, tai värin muutos, joka signaali riippuu kokeiltavan nestenäytteen sisältämän ligandin läsnäolosta tai määrästä.

Kaupallisesti koelaitteet spesifisten sitomiskokei-5 den suorittamiseen ovat tavallisesti koepakkausten muodossa, jotka sisältävät pakattuna yhdistelmänä liuoksia tai veden kanssa liuoksiksi valmistettavia koostumuksia sisältävät reagenssit, jotka tarvitaan kokeen suorittamiseen.

Itse kokeen suorituksessa näitä liuoksia on käsin tai inst-10 rumenttien avulla mitattava näytettä sisältävään reaktio-astiaan.. Käsin suoritettaessa kokeen suorittaminen vaatii aikaa ja taitavan laborantin, ja instrumentteja käytettäessä kokeeseen tarvitaan kallis laitteisto ja sen huolto.

Tarvittavan erottamisvaiheen hankaluuden ja epäkoh-15 tien välttämiseksi heterogeenisissa spesifisissä sitomis-kokeissa on käytetty kiinteäfaasikoelaitteita. Yleisesti käytetty tämäntyyppinen kiinteätaasilaite käsittää huoko-settoman pinnan, kuten koeputken tai muun astian sisäpinnan, johon vasta-aine on kiinnitetty adsorboimalla tai ko-20 valenttisidoksin. US-patenttijulkaisut nro 3 826 619, 4 001 583, 4 017 597 ja 4 104 410 koskevat vasta-aineella päällystettyjen koeputkien käyttöä radioimmunokokeissa. Kiinteäfaasikoelaitteita on käytetty myös heterogeenisissa entsyymiimmunokokeissa (US-patenttijulkaisut nro 4 016 043 25 ja 4 147 752) ja heterogeenisissa fluoresenssi-immunokokeis-sa (US-patenttijulkaisut nro 4 025 310 ja 4 056 724 ja GB-patenttijulkaisu nro 1 552 374).

Tällaisen heterogeenisen spesifisen sitomiskoelait-teen käytöstä kuvataan esimerkkinä seuraavassa US-patentti-30 julkaisussa nro 4 135 884 esitetty ns. "gamma-puikko". Koelaite, johon sisältyy vasta-ainereagenssi, saatetaan kosketuksiin nestenäytteen kanssa ja muiden reaktiosysteemiin kuuluvien reagenssien, pääasiassa merkityn konjugaatin kanssa. Tietyn inkubointiajän jälkeen kiinteäfaasilaite poiste-35 taan fysikaalisesti reaktioliuoksesta ja merkintäaine mää- 5 75677 ritetään joko liuoksesta tai koelaitteesta.

Samankaltaisia laitteita, joissa vasta-ainereagens-si sisältyy perusaineeseen, kuten geeliin tai paperilevyyn, on kuvattu US-patenttijulkaisuissa nro 3 925 017, 3 970 429, 5 4 138 474, 3 966 897, 3981 981 ja 3 888 629 ja DE-hakemus- julkaisussa nro 2 241 646. Samoin tunnettuja ovat heterogeenisiin spesifisiin sitomiskokeisiin käytettävät laitteet, joissa vasta-ainereagenssi on kiinnitetty läpivirtauskolon-nissa olevaan perusaineeseen (US-patenttijulkaisut nro 10 4 036 947, 4 039 652, 4 059 684, 4 153 675 ja 4 166 102).

Kuten kaikissa heterogeenisissä spesifisissä sitomiskoelait-teissa, koelaitteeseen on tavallisesti sisällytetty vain osa kokeen suorittamiseen tarvittavista reagensseista ja laite toimii vain keinona suorittaa välttämätön erotusvaihe muka-15 vämmin.

Lisäksi on myös kuvattu heterogeenisia spesifisiä sitomiskoelaitteita, joissa useimmat tai kaikki tarvittavat reagenssit on sisällytetty samaan kantajaosaan, ja joissa reagenssin/näytteen kosketus ja vapaan ja sidotun faasin 20 erottaminen suoritetaan käyttäen hyväksi mikraatiota kanta-jaosan kapillaareihin. (US-patenttijulkaisut nro 3 641 235, 4 094 647 ja 4 168 146). Näissä patenteissa kuvattuja laitteita on yleensä pidetty vaikeina käyttää ja tuloksia huonosti toisiinnettavina johtuen kantajaosassa kokeen suori-25 tuksessa esiintyvistä monista kemiallisista ja fysikaalisista reaktioista ja tapahtumista sekä laitteella määritettävään ligandin tai analyytin alhaisesta konsentraatiosta.

Homogeenisen spesifisen sitomiskoereagenssisystee-min käyttö kiinteätilakoelaitteessa tarjoaisi koesysteemin 30 rutiinikäyttäjälle huomattavia etuja. Erittäin alhaisina konsentraatioina nestenäytteissä olevien ligandien määrittäminen yksinkertaistuisi tällöin vaiheisiin, joissa laite saatetaan kosketuksiin näytteen kanssa ja saatu signaali mitataan joko silmämääräisesti tai instrumentilla. Reagens-35 sit olisivat kiinteinä, eikä tarvittaisi nestemäisten rea-genssien säilyttämistä, jakelua ja sekoittamista, kuten käy- 6 75677 tettäessä tunnettuja koepakkauksia. Kiinteätilalaitteet soveltuisivat myös paljon paremmin automatisointiin kuin tunnetut nestesysteemit.

Tekniikan tasoa edustavissa julkaisuissa ei ole 5 yksityiskohtaisesti kuvattu, miten homogeenista spesifistä sitomiskoereagenssisysteemiä voitaisiin käyttää kiinteätila-koelaitteissa. GB-patenttijulkaisussa 1 552 607 on kuvattu homogeenisia spesifisiä sitomiskoesysteemejä, joissa käytetään erilaisia uusia merkintäaineita, kuten kemiluminens-10 si-, entsyymi- ja koentsyymimerkintäaineita. Tämän patentin sivulla 23, riviltä 12 alkaen on esitetty mahdollisuus sisällyttää koereagenssit erilaisiin kantajiin, kuten nestettä sisältäviin astioihin tai liukenemattomiin, huokoisiin ja edullisesti absorboiviin perusaineisiin, esimerkiksi 15 huokoiseen paperiin, polymeerikalvoihin, -membraaneihin, -huovikkeisiin tai -kappaleisiin, geeleihin ym.

DE-hakemusjulkaisussa nro 2 537 275 on kuvattu homogeeninen spesifinen sitomiskoereagenssisysteemi, jossa ilmoituksen mukaan on mahdollista käyttää kokeen suoritukseen vas-20 ta-ainetta sisältäviä levyjä tai liuskoja. Julkaisussa ehdotetaan, että merkitty konjugaatti sekoitetaan ensin näytteen kanssa ja sitten reaktioseos saatetaan kosketuksiin koelaitteen kanssa, johon on sisällytetty vasta-aine. Sopivan inkubaatioajan kuluttua ehdotetaan koelaite huuhdotta-25 vaksi puskurilla ja kuivattavaksi, jonka jälkeen mitataan signaali (fluoresenssi). Tämän DE-hakemusjulkaisun koelaite ja menetelmä muistuttavat siten paljon jo tunnettuja heterogeenisia spesifisiä sitomiskoelaitteita ja menetelmiä, joissa koelaite upotetaan nestemäiseen reaktioseokseen, inku-30 boidaan, poistetaan nesteestä, pestään, jonka jälkeen tulos lopuksi luetaan. Ehdotettu koelaite ei lisäksi sisällä kan-tajayksikössä kaikkia sitomiskokeen reagensseja. Vain vasta-aine on ehdotettu sisällytettäväksi kantajayksikköön ja merkitty konjugaatti lisätään näytteeseen erikseen ennen 35 näytteen saattamista kosketuksiin ehdotetun koelaitteen kanssa.

7 75677 Tässä keksinnössä esitetään homogeeninen spesifinen sitomiskoelaite, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö ligandin tai ligandin sitomiskyvyn määrittämiseen nes-tenäytteessä. Koelaite käsittää (1) kiinteän kantajajäse-5 nen, joka on absorbentti nestenäytteelle, ja (2) tähän kantajajäseneen sisällytetyn reagenssikoostumuksen, joka sisältää (i) ligandin vasta-ainetta tai muuta luonnossa esiintyvää ligandin sitomisproteiinia ja (ii) ligandin konjugaattia tai tämän analogia, jota vasta-aine tai muu 10 sitomisproteiini pystyy myös sitomaan, kovalenttisesti liittyneenä merkintäaineeseen, joka on todettavissa sähkömagneettisen signaalin avulla, joka signaali on erilainen silloin, kun merkitty konjugaatti on sitoutunut vasta-aineeseen tai muuhun sitomisproteiiniin, kuin silloin, 15 kun se ei ole siten sitoutunut, jolloin signaali on näytteessä olevan ligandimäärän funktio. Tälle koelaitteelle on tunnusomaista, että kiinteään kantajajäseneen on sisällytetty mainittu vasta-aine tai muu sitomisproteiini ja mainittu merkitty konjugaatti oleellisesti toisiinsa 20 sitoutumattomina ja että laite on tehty sisällyttämällä kantajaan ensimmäisessä nesteessä toinen reagensseista, jotka ovat mainittu konjugaatti ja mainittu vasta-aine tai sitomisproteiini, ja kuivaamalla kantaja, ja sen jälkeen joko (A) sisällyttämällä kantajaan toinen mainituista 25 reagensseista vettä sisältämättömässä nesteessä ja kuivaamalla kantaja tai (B) esijäähdyttämällä kantaja, sisällyttämällä kantajaan toinen reagensseista, jotka ovat mainittu konjugaatti ja vasta-aine tai sitomisproteiini, toisessa nesteessä, saattamalla kantaja lämpötilaan, jossa 30 toinen neste jäätyy, ja lyofilisoimalla kantaja.

Kantajajäsen voi olla luonnonkuiduista tai synteettisistä polymeerikuiduista koostuva huovike, esimerkiksi paperi tai polymeerikalvo tai geeli.

Koelaitetta käytettäessä se saatetaan kosketuksiin 35 nestenäytteen, esimerkiksi biologisen nesteen, kuten ve-riheran tai virtsan kanssa, esimerkiksi upottamalla hetkeksi reagenssia sisältävä kantajajäsen näytteeseen tai 8 75677 lisäämällä näytettä kantajajäsenen pinnalle. Havaittavissa oleva vaste mitataan sitten tavallisesti etukäteen määrätyn inkubointi- tai reaktioajan jälkeen, jolloin tuloksen lukee joko kokeen suorittava laborantti, tai käytetään 5 instrumenttia. Havaittava vaste on tavallisimmin sähkömagneettisen säteilyn signaali, esimerkiksi fluoresenssi-, kemiluminesenssisignaali, värinmuutos tai spektrofotomet-rinen lukema.

Edullisia homogeenisia spesifisiä sitomiskoesystee-10 mejä ovat alalla tunnetut systeemit, joissa merkintäaine ottaa osaa entsymaattiseen reaktioon. Eräs tällainen edullinen systeemi on sellainen, jossa merkintäaineena on entsyymin prosteettinen ryhmä ja jossa se, missä määrin apo-entsyymi pystyy yhdistymään tällaiseen prosteettisen ryh-15 män muodostamaaan merkintäaineeseen ja muodostamaan holo-entsyymin, on riippuvainen ligandin läsnäolosta tai sen sitomiskyvystä. Holoentsyymi voidaan määrittää mittaamalla sen entsymaattinen aktiviteetti, jonka mittaamiseen voidaan käyttää monia erilaisia menetelmiä, kuten kolori-20 metristä menetelmää. Eräässä toisessa edullisessa koesys-teemissä merkintäaineena on entsyymisubstraatti, ja entsyymin kyky vaikuttaa tällaiseen substraattimerkintäai-neeseen ja tuotteen havaittavissa oleva tuote on riippuvainen ligandin läsnäolosta tai sen sitomiskyvystä. Täl-25 laisessa homogeenisessa spesifisessä sitomiskoesysteemis-sä havaittava tuote on edullisesti fluoresoiva, jolloin koelaitteen antama vastaus voidaan mitata fluorometrises-ti. Käyttökelpoinen on myös sellainen homogeeninen spesifinen sitomiskoesysteemi, jossa merkintäaineena on ent-30 syymi, jonka aktiviteetti on riippuvainen ligandin läsnäolosta tai sitomiskyvystä. Tässä tapauksessa entsyymin aktiviteetti voidaan mitata monin eri tavoin.

Kuvioissa 1-15 on graafisesti esitetty jäljempänä olevissa esimerkeissä saatuja koetuloksia.

35 Keksinnön mukainen koelaite sopii käytettäväksi ho mogeenisen, ei-radioisotooppeihin perustuvan, spesifisen 75677 sitorniskokeen suorittamiseen, esimerkiksi immunokokeiden suorittamiseen, ja se sisältää kaikki samankaltaisiin tavanomaisiin analyyttisiin koeliuskoihin ja muihin koeyk-sikköihin sisältyvät piirteet. Kuten tavanomaisissa lait-5 teissä keksinnön mukaisessa laitteessa on kiinteä kantaja, tavallisesti laadultaan vaihteleva perusaine, johon sisältyvät kaikki tietyn kokeen suorittamiseen tarvittavat rea-genssit, jolloin käyttäjän tarvitsee vain saattaa koelaite kosketuksiin kokeiltavan näytteen kanssa ja mitata saa-10 tu tulos. Kun koko prosessi on automatisoitu, voi samat toiminnat suorittava instrumentti olla rakenteeltaan huomattavasti yksinkertaisempi kuin tavanomaiset nestekemi-allisissa systeemeissä homogeeniseen spesifiseen sitomis-kokeeseen nykyisin käytetyt instrumentit.

15 Keksinnön mukainen koelaite sisältää homogeenisen spesifisen sitomiskokeen reagensseja. Homogeeninen, spesifinen sitomiskoetekniikka perustuu yleisesti 1) sitovan komponentin ja merkintäaineen muodostaman konjugaatin ja 20 2) sitomispartnerin väliseen spesifiseen vuorovai kutukseen, jossa konjugaatin sitova komponentti sitoutuu sitomispartneriin, jolloin merkintäaineen ominaisuudet merkityn konjugaatin ollessa sitomispartnerin sitoma ovat erilaiset kuin sitomattoman konjugaatin ominaisuudet. Mer-25 kintäaineen ominaisuudet, joihin vaikutetaan, voivat olla luonteeltaan erilaisia mitattavissa olevia ominaisuuksia, esimerkiksi merkintäaineen kemiallisia tai fysikaalisia ominaisuuksia. Joissakin tapauksissa ominaisuus, johon vaikutetaan, on kemiallinen reaktiivisuus etukäteen mää-30 rätyssä reaktiossa, jossa muodostuu tai katkeaa kemiallisia, kovalenttisia tai ei-kovalenttisia sidoksia. Toisissa tapauksissa ominaisuus, johon vaikutetaan on merkintäaineen fysikaalinen ominaisuus, joka voidaan mitata ilman kemiallista reaktiota.

35 Useimmissa tapauksissa keksinnön mukainen koelaite sisältää sellaisia homogeenisen spesifisen sitomiskokeen reagensseja, jotka vaikuttavat immunokemiallisesti näyt- 10 75677 teen ligandiin tai sen sitomiskykyyn. Toisin sanoen rea-genssin ja näytteen ligandin ja/tai sen sitomiskyvyn välillä on antigeeni-vasta-ainesuhde tai hapteeni-vasta-ai-nesuhde. Tällaisia kokeita nimitetään sen vuoksi immuno-5 kokeiksi ja merkityn konjugaatin ja sitomispartnerin vä linen spesifinen vuorovaikutus on immunokemiallinen sitoutuminen. Tässä tapauksessa merkityn konjugaatin sitova komponentti on siten antigeeni, hapteeni tai vasta-aine (tai tällaisen fragmentti) ja sitomispartneri on vastaava 10 immunokemiallinen sitomispartneri. On kuitenkin alalla hyvin tunnettua, että homogeenisessa spesifisessä sidon-takokeessa voidaan käyttää myös muiden merkittyjen konju-gaattien ja sitomispartnerien vaikutusta toisiinsa, kuten hormonien, vitamiimien, metaboliittien ja farmakologisten 15 aineiden ja vastaavien reseptorien ja sitovien aineiden välistä vaikutusta.

Kun näytteestä on tarkoitus määrittää siinä oleva tietty ligandi tai sen määrä, niin homogeenisen spesifisen sitomiskoetekniikan reagenssit käsittävät tavallises-20 ti 1) ligandista tai sen sitovasta analogista ja siihen kemiallisesti liitetystä merkintäaineesta muodostuvan merkityn konjugaatin, 2) ligandin sitomispartnerin, esim. vasta-aineen 25 tai sen fragmentin, luonnonreseptoriproteiinin tms. ja 3) merkityssä konfugaatissa olevan merkintäaineen mittaamiseen tarvittavan apureagenssin. Sitovaa ainetta käytetään rajoitettu määrä, jolloin näytteen sisältämä ligandi kilpailee merkityn konjugaatin kanssa sitomispart- 30 nerin sitomisessa. Merkintäaineen jakautuminen sidotun ja vapaan lajin kesken määrää siten merkintäaineen antaman havaittavan vasteen, joka puolestaan on riippuvainen läsnäolevan ligandin määrästä. Kun kokeen tarkoituksena on mitata näytteestä ligandin sitomiskyky, niin merkitty 35 konjugaatti koostuu ligandista tai sen sitovasta analogista, joka on kemiallisesti kytketty merkintäaineeseen, joi- 11 75 67? loin näytteen kyky sitoa merkitty konjugaatti, mikä riippuu esimerkiksi näytteessä olevan ligandin sitomispartne-rin läsnäolosta, määrää vaikutuksen, joka havaitaan mer-kintäaineen signaalina.

5 Alalla tunnetaan monia erilaisia homogeenisia spe sifisiä sitomiskoesysteemejä, joista seuraavassa esitetään keksintöä rajoittamattomia esimerkkejä, joista joitakin voidaan mahdollisesti käyttää keksinnön mukaiseen laitteeseen. Systeemit on esitetty käytetyn merkintäaineen 10 luonteen mukaisesti.

1. Entsyymin prosteettinen ryhmä merkintäaineena Tässä systeemissä merkintäaineena on entsyymin prosteettinen ryhmä, jolloin katalyyttisesti inaktiivisen apoentsyymin kykyyn yhtyä prosteettiseen merkitsemisaine-15 ryhmään muodostaen aktiivisen entsyymin (holoentsyymi) vaikuttaa merkityn konjugaatin sitoutuminen sitomispartne-riinsa. Tuloksena saadun holoentsyymin aktiviteetti on mitattavissa tavanomaisilla mittaussysteemeillä, joilla saadaan lopullinen havaittava signaali. Tämän tyyppisiä 20 koesysteemejä on kuvattu US-patenttihakemuksessa sarja nro 45 423, haettu 1979-06-04 (vastaa GB-patenttijulkaisua nro 2 023 607). Erityisen edullisessa koejärjestelyssä, jossa on prosteettinen merkitsemisryhmä, käytetään merkintäaineena flaviiniadeniinidinukleotidia (FAD) ja 25 apoglukoosioksidaasia apoentsyyminä. Tuloksena oleva glu- koosiaoksidaasiaktiviteetti voidaan mitata kolorimetri-sesti käyttäen systeemiä, jossa on glukoosia, peroksidaa-sia ja indikaattorisysteemi, jonka värinmuutos vastaa ve-typeroksidipitoisuutta.

30 Tällaisessa edullisessa koejärjestelyssä FAD-mer- kityllä konjugaatilla on edullisesti kaava 75677 12

NH—R-L

L

( II J

5

Riboflaviini-(- Phos -)-^-Riboosi jossa Riboflaviini-(Phos)2_Riboosi tarkoittaa FAD:ssa olevaa riboflaviini-pyrofosfaatti-riboosi-tähdettä, R on 10 liitettävä ryhmä, ja L on sitova komponentti, esim. ligan-di tai sen analogi.

2. Entsyymisubstraattimerkintäaineet Tässä systeemissä merkintäaine valitaan siten, että merkitty konjugaatti on entsyymin substraattina, ja 15 entsyymin kykyyn vaikuttaa substraatti-merkitty-konjugaat-tiyhdistelmään vaikutetaan joko positiivisesti tai negatiivisesti sitomalla merkitty konjugaatti sitomispartne-rinsa kanssa. Entsyymin vaikuttaessa substraatti-merkitty-konjugaatti-yhdistelmään saadaan tuote, jonka jokin omi-20 naisuus tavallisesti kemiallinen tai fysikaalinen ominai suus, voidaan käyttää indikaattorireaktiota tai fotometri-sesti mitattavaa reaktiota, esim. fluoresenssin tai valon absorption (värin) mittaamista. Tämän tyyppisiä koesystee-mejä on kuvattu US-patenttihakemuksissa nro 894 836, jä-25 tetty 1978-04-10 (vastaa DE-hakemusjulkaisua nro 2 618 511) ja 87 819, jätetty 1979-10-23, sekä julkaisuissa Anal.

Chem. 48:1933 (1976), Anal.Biochem., 75:55 (1977) ja Clin. Chem. 23:1402 (1977). Erityisen edullisessa substraatti-merkityssä kokeessa käytetään merkittyä konjugaattia, jol-30 la on kaava 13 75677

CH OH

jossa R on liittävä ryhmä ja L on sitova komponentti, esim. ligandi tai sen analogi, jolloin /&-galaktosidaasientsyymin 10 kyky pilkkoa konjugaatti,josta tuloksena saadaan fluoresens sin avulla todettava tuote, estyy konjugaatin sitoutuessa sitomispartneriinsa.

3. Koentsyymimerkintäaineet Tässä systeemissä merkityn konjugaatin merkintäaine-15 osalla on koentsyymiaktiivinen funktionaalisuus, ja sen kykyyn ottaa osaa entsymaattiseen reaktioon vaikuttaa merkityn konjugaatin sitoutuminen sitomispartneriin. Tuloksena olevan entsymaattisen reaktion määrä voidaan mitata tavanomaisin havaittavan signaalin antavin havaitsemiskeinoin.

20 Tämän tyyppisiä systeemejä on kuvattu US-patenttihakemuk-sessa sarja nro 894 836, jätetty 1978-04-10 (vastaa DE-ha-kemusjulkaisua nro 2 618 511) ja julkaisuissa Anal.Biochem. 72:271 (1976), Anal.Biochem. 72:283 (1976) ja Anal. Biochem. 76:95 (1976).

25 4. Entsyymimodulaattorimerkintäaineet Tässä systeemissä merkityn konjugaatin merkintäaine-osalla on entsyymiä moduloiva vaikutus, kuten entsyymiä inhiboiva tai stimuloiva vaikutus, ja modulaattorimerkintä-aineen kykyyn vaikuttaa entsyymin aktiivisuuteen vaikuttaa 30 merkityn konjugaatin sitoutuminen sitomispartneriinsa. Tuloksena saadun entsymaattisen reaktion määrä on mitattavissa tavanomaisilla havaitsemissysteemeillä, joissa mitataan lopullinen havaittava signaali. Tämän tyypin koesysteemejä on kuvattu US-patenttijulkaisussa nro 4 134 792.

75677 14 5. Entsyymixnerklntäaineet Tässä systeemissä merkintäaineena on entsyymi, ja entsyymin aktiviteettiin vaikuttaa merkityn konjugaatin sitoutuminen sitomispartneriinsa. Tuloksena saatu entsymaat-5 tinen aktiviteetti voidaan mitata tavanomaisilla havaitse- missysteemeillä, joissa mitataan lopullinen havaittava signaali. Tämän tyypin koesysteemejä on kuvattu US-patentti-julkaisuissa nro 3 817 837 ja 4 043 872.

6. Sammutettavat fluoresoivat merkintäaineet 10 Tässä systeemissä merkitty konjugaatti sisältää mer- kintäaineosassa fluoresoivaan ainetta, jonka fluoresenssi voidaan mitattavissa määrin sammuttaa merkityn konjugaatin ja sen sitomispartnerin välisellä reaktiolla, sitomispart-nerin ollessa tavallisesti proteiini, kuten vasta-aine. Fluo-15 resoiva merkintäaine voidaan mitata suoraan fluoresenssin ollessa havaittavana signaalina. Tätä tyyppiä olevia koe-systeemejä on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 160 016 ja julkaisussa J. Clin. Path. 3Q:526 (1977).

7. Fluoresoivat polarisaatiomerkintäaineet 20 Tässä systeemissä merkintäaine on myös fluoresoiva aine, jonka mitattava ominaisuus, johon merkityn konjugaatin ja sen sitomispartnerin reaktio vaikuttaa, on fluoresenssin polarisaatio. Sitomispartnerina on tavallisesti proteiini, kuten vasta-aine. Tämän tyypin koesysteemejä on ku-25 vattu julkaisussa J.Exp.Med. 122:1029 (1965).

8. Kemiallisesti herätetyt fluoresoivat merkintäaineet Tässä systeemissä merkintäaine on jälleen fluoresoiva aine, jonka kykyyn kemiallisesti saavuttaa energia-30 taso, jossa se fluoresoi, vaikuttaa merkityn konjugaatin sitoutuminen sitomispartneriinsa. Merkintäaineen kemiallinen herättäminen suoritetaan tavallisesti saattamalla fluoresoiva merkintäaine in situ muodostetun korkeaenergisen yhdisteen vaikutukselle alttiiksi. Tämän tyypin koesysteemejä 35 on kuvattu US-patenttihakemuksessa sarja-nro 4 580, jätet ty 1979-01-18.

15 75677 9. Kaksolsvasta-ainemerkintäaineet, jotka ovat stee-risesti estettyjä

Vielä eräässä systeemissä käytetään kaksoisvasta-aine-immunokoesysteemiä (US-patenttijulkaisut nro 3 935 074 5 ja 3 998 943). Merkittyyn konjugaattiin sisältyy kaksi epi- tooppia, joista toinen ottaa osaa immunologiseen reaktioon ligandin ja antiligandin vasta-aineen kanssa, ja toinen sitoutuu toiseen vasta-aineeseen, jolloin rajoituksena on, etteivät molemmat vasta-aineet pysty samanaikaisesti si-10 toutumaan merkittyyn konjugaattiin. Toinen epitooppi voi olla fluoresoiva aine, jonka fluoresointiin vaikuttaa heikentävästi toisen vasta-aineen sitoutuminen, tai toinen epitooppi voi joutua kilpailevaan sitoutumisreaktioon toisen epitoopin merkityn muodon ja toisen vasta-aineen väli-15 sen reaktion kanssa. Voidaan käyttää erilaisia havaitsemis- systeemejä, joita on kuvattu edellä mainituissa patenttijulkaisuissa. Samantyyppisiä systeemejä on kuvattu US-patentti julkaisuissa nro 4 130 462 ja 4 161 515 ja GB-pa-tenttijulkaisussa 1 560 852.

20 Tässä systeemissä merkintäaine on energiansiirto- antaja-vastaanottajaparin toinen jäsen ja sitomisaine on konjugoitu tämän parin toisen jäsenen kanssa. Kun merkitty konjugaatti sitoutuu sitomispartneriinsa antajakomponentin energian ilmaisu muuttuu siirtymisen johdosta vastaan-25 ottajakomponenttiin. Antaja on yleensä fluoresoiva aine ja vastaanottaja sen sammuttaja, joka myös itse saattaa olla fluoresoiva aine. Tällaisessa toteutusmuodossa fluoresointi on havaittava signaali, mutta myös muita havaitsemissystee-mejä voidaan käyttää. Tällaisia koesysteemejä on kuvattu 30 US-patenttijulkaisuissa nro 3 996 345, 4 174 384 ja 4 199 559 ja GB-patenttijulkaisussa nro 2 018 424.

ie 75677 11. Muita merkintäainelta

Esillä olevassa keksinnössä voidaan käyttää muitakin alalla kuvattuja homogeenisia spesifisiä sidontakoesys-teemejä, esimerkiksi sellaisia, joiden merkintäaineina on 5 a) ei-entsyymikatalysaattoreita, kuten elektronin- siirtoaineita (US-patenttijulkaisu nro 4 160 645); b) ei-entsyymikemiluminesenssiaineita (edellä mainittu US-patenttihakemus sarja nro 894 836) ; c) "kanavoitumis"-merkintäaineita (GB-patenttijul- 10 kaisu nro 2 018 986); d) "hiukkas"-merkintäaineita (GB-patenttijulkaisu nro 2 019 562); e) merkittyjä liposomihiukkasia (US-patenttijulkaisu nro 4 193 983).

15 Ligandi

Keksinnön mukaista koetta voidaan käyttää sellaisen ligandin havaitsemiseen, jolle on olemassa vastaava spesifinen sitomispartneri, ja päinvastoin koetta voidaan käyttää ligandin sitomiseen kykenevän nesteväliaineen havaitse-20 miseen (tavallisesti johtuen sitomispartnerin läsnäolosta nesteväliaineessa). Ligandi on tavallisesti peptidi, poly-peptidi, proteiini, hiilihydraatti, glykoproteiini, steroidi tai muu orgaaninen molekyyli, jota vastaava spesifinen sitomispartneri on olemassa biologisessa systeemissä tai 25 voidaan syntetisoida. Funktionaalisesti ilmaistuna ligandi käsittää tavallisesti antigeenit ja niiden vasta-aineet, hapteenit ja niiden vasta-aineet ja hormonit, vitamiinit, metaboliitit ja farmakologiset aineet sekä niiden reseptorit ja sitomisaineet. Ligandi on tavallisesti immunologi-30 sesti aktiivinen polypeptidi tai proteiini, jonka mole— kyylipaino on 1000-10 000 000, kuten vasta-aine- tai anti-geenipolypeptidi tai -proteiini, tai hapteeni, jonka mole-kyylipaino on 100-1500.

75677 17

Polypeptidiligandeista voidaan mainita esimerkkeinä angiotensiini I ja II, C-peptidi, oksitosiini, vasopressii-ni, neurofysiini, gastriini, sekretiini, bradykiniini ja glu-kagoni.

5 Proteiiniligandeista voidaan erikseen mainita seuraa- vat luokat: protamiinit, mukoproteiinit, glykoproteiinit, glo-buliinit, albumiinit, skleroproteiinit, fosfoproteiinit, his-tonit, lipoproteiinit, kromoproteiinit ja nukleoproteiinit. Erikseen voidaan mainita seuraavat proteiinit prealbumiini, 10 ^^-lipoproteiini, ihmisen seerumialbumiini, o^-glykopro- teiini, transkortiini, tyroksiinia sitova globuliini, hap-toglobiini, hemoglobiini, rnyoglobiini , seruloplasmiini, °(2~ lipoproteiini, o<2-makroglobuliini, &-lipoproteiini, eryt-ropoietiini, transferriini, homopeksiini, fibrinogeeni, im-15 munoglobuliinit, kuten IgG, IgM, IgA, IgD ja IgE ja niiden fragmentit, esim. Fc ja F komplementtitekijät, prolaktiini, veren hyytymistekijät, kuten fibrinogeeni, trombiini jne., insuliini, melanotropiini, somatropiini, tyrotropiini, follikkelia stimuloiva hormoni, keltarauhashormoni, gonado-20 tropiini, kilpirauhasta stimuloiva hormoni, plasentalakto- geeni, intrinsic tekijä, transkobalamiini, veriheran entsyymit, kuten alkalinen fosfataasi, maitohappodehydrogenaasi, amylaasi, lipaasi, fosfataasit, kolinesteraasi, glutamiini-oksaloetikkahappotransaminaasi, glutamiinipalorypälehappo-25 transaminaasi ja uropepsiini, endorfiinit, enkefaliinit, protamiini, kudosantigeenit, bakteeriantigeenit ja virus-antigeenit, kuten maksatulehdukseen liittyvät antigeenit (esim. HB Ag, HB Ag ja HB Ag).

Hapteeneista voidaan esimerkkeinä mainita yleiset 30 lääkeaineluokat, metaboliitit, vitamiinit ym. orgaaniset yhdisteet. Hapteenihormoneja ovat mm tyroksiini ja trijodi- 75677 18 tyroniini. Vitamiineja ovat esim. A, B, E ja K vitamiinit, foolihappo ja tiamiini. Lääkeaineista voidaan mainita antibiootit, kuten aminoglykosidit, esim. gentamisiini, tobra-mysiini, amikasiini, sisomisiini, kanamysiini ja netilmi-5 siini, penisilliini, tetrasykliini, terramysiini, kloromy-setiini ja aktinomysetiini, nukleosidit ja nukleotidit, kuten adenosiinidifosfaatti (ADP), adenosiinitrifosfaatti (ATP), flaviinimononukleotidi (FMN), nikotinamidiadeniinidinukleo-tidi (NAD) ja sen fosfaattijohdannainen (NADP), tymidiini, 10 guanosiini ja adenosiini; prostaglandiinit; steroidit, kuten estrogeenit, esim. estrioli ja estradioli, sterogeenit, androgeenit, digoksiini ja digitoksiini ja adrenokortikos-teroidit; sekä muut, kuten fenobarbitaali, fenytoiini, eto-suksimidi, karbamatsepiini, valproaatti, teofylliini, kofe-15 iini, propranololi, prokainamidi, kinidiini, amitryptiliini, kortisoli, desipramiini, disopyramidi, doksepiini, dokso-rubisiini, nortryptiliini, metotreksaatti, imipramiini, lido-kaiini, prokainamidi, N-asetyyliprokainamidi, amfetamiinit, katekolamiinit ja antihistamiinit.

20 Analysoitava nesteväliaine voi olla luonnossa esiin tyvä tai keinotekoisesti valmistettu neste, jonka epäillään sisältävän ligandia. Se on tavallisesti biologinen neste tai sen laimennus. Biologisia nesteitä, joita voidaan analysoida ovat esimerkiksi verihera, plasma, virtsa, sylki ja 25 lapsivesi ja selkäydinneste.

Kantajajäsen

Keksinnössä käytettävän kantajajäsenen tulee olla absorbentti tutkittavalle nestenäytteelle. Se voi vaihdella muodoltaan, ja se käsitetään tässä yhteydessä 30 laajasti. Se voi olla yksi- tai useampifaasinen ja voi koostua yhdestä tai useammasta sopivasta materiaalista, joilla materiaaleilla voi olla samanlaiset tai erilaiset absorptio- tai muut fysikaaliset ominaisuudet. Se voi olla hydrofobinen tai hydrofiilinen, huokoinen tai huokose-35 ton. Tehokkaimmillaan kantajajäsen on huolella suunniteltu sopimaan ominaisuuksiltaan juuri siihen homogeeniseen spesifiseen sitomiskoesysteemiin, jossa sitä käytetään.

19 75677 Tässä käytettynä ilmaisulla "kantajajäsen" tarkoitetaan siten mitä tahansa ainetta, perusainetta tai pintaa, johon voidaan liittää spesifisen sitomiskokeen reagensseja. Se voi olla muodoltaan monenlainen, esimer-5 kiksi sellainen reagenssiliuska, jota käytetään liuosten kemiallisessa ja entsymaattisessa analyysissä. Esimerkiksi US-patenttijulkaisussa nro 3 846 247 on esitetty käytettäväksi huopaa, huokoisia keraamisia liuskoja ja kudottuja tai huopautettuja lasikuituja. Paperin korvikkeena US-10 patenttijulkaisussa nro 3 552 928 esitetään käytettäväksi puutikkuja, kangas-, sieni- tai savimateriaaleja. Paperin sijasta käytettäväksi on ehdotettu synteettisestä hartsista valmistettuja tai lasikuituhuopia GB-patenttijulkaisussa nro 1 369 139. Toisessa GB-patenttijulkaisussa nro 15 1 349 623 on ehdotettu käytettäväksi paperikantajayksikön päällysteeksi liitettyä lievästi permeaabilia ohuista säkeistä muodostettua verkkorakennetta. Tässä julkaisussa ehdotetaan myös paperin impregnoimista reagenssisysteemin osalla ja verkkorakenteen impregnoimista toisella reagens-20 sisysteemin kemiallisella tai entsymaattisella reagenssil-la, joka on mahdollisesti yhteensopimaton ensimmäisen osan kanssa. FR-patenttijulkaisussa 2 170 397 on käytetty kan-tajajäseniä, joissa on yli 50 % polyamidikuituja. US-patentti julkaisussa nro 4 046 513 on ehdotettu, että rea-25 genssit painetaan sopivalle kantajajäsenelle. US-patentti-julkaisussa nro 4 046 514 reagoivaan systeemiin on liitetty kutomalla tai neulomalla reagensseja sisältäviä säikeitä. Kaikkia tällaisia ja muita kantajajäseniä voidaan käyttää esillä olevassa keksinnössä. Kantajajäsen koostuu edul-30 lisesti huokoisesta aineesta, kuten suodatinpaperista, joka on impregnoitu spesifisen sitomiskoesysteemin reagenssien liuoksella tai suspensiolla. Se voi myös koostua systeemistä, joka sulkee fysikaalisesti sisäänsä nämä aineosat, kuten polymeerimikrokapseleita, jotka särkyvät koenäytteen 35 yhteyteen joutuessaan. Se voi käsittää systeemin, jossa 20 7 5 6 7 7 aineosat ovat homogeenisesti yhdistettyinä kantajajäsenen kanssa nestemäisessä tai puolijuoksevassa muodossa, joka myöhemmin kovettuu, jolloin aineosat jäävät siihen sulkeutuneina.

Joka tapauksessa reagenssisysteemin tuleva käyttö määrää valitun kantajajäsenen koostumuksen tai muodon ja materiaalin, joka voi olla huokoinen, jolloin aineosat saadaan siihen imeyttämällä niitä sisältävä liuos, tai huokoseton, jolloin reagenssit voidaan painaa sille tai muodostaa jatkuvaksi päällysteeksi, tai se voi olla kudottu tai neulottu. Reagenssit liitetään kantajajäseneen monivaiheisesti. Tällöin valmistetaan kaksi tai useampia reagenssiliuoksia tai -suspensioita, joihin kantajajäsen kastetaan peräkkäin kuivaamalla aina kastamiskertojen välillä. Tällaisessa tapauksessa käytetään edullisimmin huokoista materiaalia, kuten paperia. Toisena vaihtoehtona on käyttää monifaasikantajajäsentä, joka koostuu kahdesta tai useammasta huokoisen materiaalin kerroksesta, jotka on kiinnitetty toistensa päälle. Vielä eräänä mahdollisuutena on päällystää jatkuva polymeeri peräkkäin erilaisia immunokoesysteemin reagensseja sisältävillä päällysteillä. Kantajajäseneen voi sisältyä suodatuskerroksia, joiden tarkoituksena on estää mahdollisten häiritsevien aineiden pääseminen koesysteemiin, jolloin ne kuitenkin päästävät näytteen sisältävät analysoitavat aineet lävitseen .

Voidaan siten todeta, että kantajajäsenen sopiva valinta riippuu vain kahdesta tekijästä: spesifisen si-tomissysteemin käyttötarkoituksesta ja luonteesta. Edellä esitettyjen tietojen perusteella sopivan kantajajäsenen valinta on rutiinikokein ratkaistavissa.

Koelaitteen valmistus

Keksinnön kohteena on myös menetelmä koelaitteen valmistamiseksi, mikä käsittää koesysteemin komponenttien sisällyttämisen kantajajäseneen. Kun tämä sisällyttäminen suoritetaan impregnoimalla yhdellä tai useammalla keksinnön mukaisen koesysteemin reagenssilla, niin impregoinnin jäi- 75677 21 keen kantaja kuivataan. Impregnoinnin lisäksi keksinnön mukaisten laitteiden valmistuksessa voidaan käyttää muita sopivia menetelmiä, kuten koostumuksen painamista tai suihkuttamista kerrokseksi kantajamateriaalille tai liuosten 5 sisällyttämistä kalvon muodostavaan nesteeseen, jonka annetaan sitten kovettua.

Kun kantajajäsen sisältää useampia kerroksia, esimerkiksi paperista tai muusta huokoisesta materiaalista koostuvia kerroksia, niin nämä voidaan liittää samansuun-10 täisinä toisiinsa liiman avulla, joka sallii nesteen kulun kerrosten välillä. Integraalisten analyysiyksikköjen valmistamiseksi kalvonmuodostajakerrokset voidaan valmistaa erikseen etukäteen ja laminoida sitten kokonaisuudeksi. Kalvokerrosten materiaali voi koostua pehmittimestä ja poly-15 meerista, josta valmistettu kalvo on muotonsa pitävä. Kerrosten valmistus tapahtuu tyypillisesti päällystämällä liuoksella tai dispersiolla pinta, josta kuivattu kerros voidaan irroittaa fysikaalisesti. Sopivassa menetelmässä, jossa vältetään useat irroitus- ja laminointivaiheet, valmis-20 tetaan aluksi kerros pinnalle, josta valmistettu kerros voidaan irroittaa, tai haluttaessa alusta-aineella, ja sen-jälkeen seuraavat kerrokset valmistetaan suoraan peräkkäin edelliselle päällystekerroksella. Tällainen päällystys voidaan suorittaa käsin käyttäen päällystysterää tai koneella 25 käyttäen kastamis- tai helmipäällystystekniikka. Koneellista päällystystekniikkaa käytettäessä on usein mahdollista päällystää samanaikaisesti viereiset kerrokset käyttäen va-lonherkkien valokuvafiImien ja -paperien valmistuksessa käytettyä syöttösuppilopäällystystekniikkaa.

30 Kalvokerroksen materiaalina voidaan käyttää samen- tumapolymeerikerroksia. Kalvo muodostetaan alusta-aineelle liuottamalla polymeeri kahden nesteen seokseen, joista toisella on alempi kiehumispiste kuin toisella ja hyvä polymeerin liuotuskyky, ja toisella on korkeampi kiehumispiste ja 35 polymeeri on siihen liukenematon tai niukkaliukoinen. Alus- 75677 22 ta-aine päällystetään sitten tällaisella polymeeriliuoksella ja kuivataan säädetyissä olosuhteissa. Alemmalla kiehuva liuotin haihtuu helpommin, ja päällysteessä kasvaa liuottimen osuus, johon polymeeri on liukenematon tai 5 niukkaliukoinen. Haihtumisen jatkuessa sopivissa olosuhteissa polymeeri muodostaa huokoisen kerroksen. Keksinnön tarkoituksiin voidaan käyttää monia erilaisia polymeerejä yksin tai yhdistelminä huokoisen samentumapolymeerikerrok-sen valmistamiseksi. Tyypillisiä esimerkkejä ovat polykar-10 bonaatit, polyamidit, polyuretaanit ja selluloosaesterit, kuten selluloosa-asetaatti. Valmistettaessa kerroksia, jotka sisältävät merkittyä konjugaattia tai muuta reagenssia, voidaan valmistaa päällystysliuos tai -suspensio, joka sisältää perusaineen ja siinä aktiiviset materiaalit ja pääl-15 lystää tällä liuoksella tai suspensiolla edellä kuvatulla tavalla alusta-aine ja kuivata se dimensioiltaan pysyväksi kerrokseksi.

Kerrosten paksuudet ja niiden läpäisykyvyt vaihtele-vat suuresti riippuen aiotusta käytöstä. Sopivia paksuuksia 20 ovat noin 5 ^um - 100 qM, vaikkakin joissakin tapauksiss myös laajemmat paksuusvaihtelut voivat tulla kyseeseen.

Jos tarvitaan esimerkiksi suhteellisen suuri määrä vaikuttavaa materiaalia, kuten polymeerimateriaalia, esim. entsyymejä, voi olla edullista valmistaa jonkin verran paksum-25 pi kerros.

Saattaa myös olla edullista sisällyttää kantajajä-seneeseen yksi tai useampia heijastavia kerroksia, jotka ovat mahdollisesti havaittavaa säteilyä absorboivaa ainetta ja helpottavat signaalin havaitsemista heijastusradiometrillä, 30 esim. heijastusffotometrillä tai vastaavalla. Tällainen hei-jastusaine voidaan sisällyttää yhteen tai useampaan edellä kuvatuista kerroksista tai se voidaan muodostaa omaksi ker-roksekseen, jolla ei ole muuta merkitystä laitteessa. Heijastavassa kerroksessa voidaan käyttää edullisesti heijas-35 tavia pigmenttejä, kuten titaanioksidia ja bariumsulfaattia.

75677 23

Samentumapolymeeri voi sisältää myös sopivaa heijastavaa ainetta. Eräässä edullisessa toteutusmuodossa samen-tumapolymeeri voi sisältää pigmenttiä heijastuskyvyn tai muun funktion parantamiseksi. Kerrokseen yhdessä polymee-5 rin kanssa sisällytettävä pigmenttimäärä voi suuresti vaih-tella, edullisia pitoisuuksia ovat noin 1-10 paino-osaa pigmenttiä yhtä samentumapolymeerin paino-osaa kohti, jolloin edullisin määrä on noin 3-6 osaa pigmenttiä yhtä samentumapolymeerin paino-osaa kohti.

10 Kantajajäsenen kerroksiin voi olla edullista sisäl lyttää yhtä tai useampaa pinta-aktiivista ainetta, kuten anionista tai ionitonta pinta-aktiivista ainetta. Se saattaa esimerkiksi parantaa kerroskoostumusten päällystettä-vyyttä ja sellaisten kerrosten kostutettavuutta, joita nes-15 tenäytteet eivät helposti kostuta ilman pinta-aktiivisen aineen apua. Kantaja-aineen kerroksiin voi olla edullista sisällyttää aineita, jotka voivat muuttaa valitulle analyysille haitalliset aineet haitattomiksi kemiallisella reaktiolla tai muuten.

20 Kuten edellä mainittiin koko analyyttinen elementti voi olla itsekantava tai se voi olla päällysteenä kantavalla aineella. Kantava aine voi olla himmeä tai valoa tai muuta energiaa läpäisevä. Kannattajajäsenen kantavaksi aineeksi tulee valita aine, joka sopii aiottuun signaalin havait-25 semismenetelmään. Edullisia kannattaja-aineita ovat läpinäkyvät aineet, joiden lävitse sähkömagneettinen säteily aaltopituudeltaan noin 200-900 nm pääsee. Kannattajan ei tietenkään tarvitse läpäistä koko alueen 200-900 nm säteilyä, vaikkakin fluorometrisen analyysituloksen havaitsemi-30 sessa kannattaja-aineen lävitse on edullista, että se läpäisee leveällä aaltoalueella säteilyä tai vaihtoehtoisesti läpäisee käytetyn fluoresoivan aineen havaitsemiseen käytetyn absorptio- tai emissiospektrin. Saattaa olla myös edullista että kannattaja-aine päästää lävitseen yhden tai 35 useamman kapean aaltopituusalueen ja on läpäisemätön viereisille aaltopituusalueille. Tämä voidaan aikaansaada imp- 24 75677 regnoimalla tai päällystämällä kannattaja-aine yhdellä tai useammalla väriaineella, jolla on halutut absorptio-ominaisuudet.

Seuraavassa kuvataan esillä olevan keksinnön mu-5 kaisten koelaitteiden valmistus:

Useampikertainen impregointi

Kantaja-ainekerros impregnoidaan ensimmäisessä liuot-timessa olevalla ensimmäisellä reagenssiliuoksella tai suspensiolla ja kuivataan. Sitten kantaja-aine impregnoidaan 10 toisella jäljellejääneiden reagenssien liuoksella tai suspensiolla toisessa liuottimessa, joka on laadultaan sellainen, että se estää ensimmäisessä liuottimessa olevien reagenssien vaikuttamisen. Tällä tavoin kummankaan liuoksen reagenssit eivät pääse vaikuttamaan toisiinsa koelaitteen 15 valmistuksen aikana eivätkä siten reagoi ennen aikojaan. Edullisessa toteutusmuodossa tietyt ensimmäiset reagenssit liitetään kantaja-ainekerrokseen käyttäen kastamista vesipitoiseen väliaineeseen. Muille reagensseille käytetään sopivaa orgaanista liuotinta, kuten tolueenia, asetonia, 20 kloroformia, metyleenikloridia, n-propanolia tai etyleeni-dikloridia. Tämä kerros kovetetaan antamalla orgaanisen liuottimen haihtua. Yksityiskohtia on lähemmin selvitettu esimerkeissä.

Monikerroselementti 25 Monikerroselementti valmistetaan sisällyttämällä en simmäiseen tai päällä olevaan kerrokseen joitakin, ei kuitenkaan kaikkia, reagensseista, joita käytetään spesifisessä sitomiskoesysteemissä, sisällyttämällä toiseen tai alla olevaan kerrokseen muut reagenssit, kovettamalla erik-30 seen, esimerkiksi kuivaamalla kerrokset ja kiinnittämällä ne toisiinsa laminaarisesti. Kun käytetään absorboivaa kanta jama teriaalia, niin elementit valmistetaan impregnoimalla kerrokset ja kuivaamalla impregnoidut kerrokset.

Ensimmäisellä ja toisella kerroksella on kummallakin 35 pari vastakkaisia pintoja. Toinen ensimmäisen kerroksen pinnoista laminaarisuhteessa toisen kerroksen toisen pinnan 25 7 5 6 7 7 kanssa, ja näyte pannaan näiden kerrosten jommalle kummalle pinnalle. Ilmaisulla laminaarisuhde tarkoitetaan, että neste tai kaasu pystyy kulkemaan tällaisten toistensa päälle asetettujen kerrosten pintojen välissä. Tällai-5 set kerrokset voivat olla jatkuvia tai niitä voi erottaa toisistaan välillä oleva kerros. Välissä oleva kerros ei saisi estää kulkua kaikkien kerrosten välillä.

Kylmäkuivausmenetelmä Tässä valmistusmenetelmässä pyritään sisällytettäes-10 sä yhteensopimattomia reagensseja yhteen ainoaan analyysi-elementin kerrokseen estämään niiden välinen reaktio. Kun käytetään esimerkiksi absorboivaa kantajamateriaalia, niin ensimmäinen reagenssiryhmä sisällytetään kerrosmateriaa-liin korotetussa lämpötilassa (tai vaihtoehtoisesti kylmä-15 kuivaamalla) ja käsitellyn kerroksen annetaan kovettua.

Toinen ryhmä reagensseja, joista ainakin joku reagoi huoneen lämpötilassa ensimmäisen ryhmän kanssa, lisätään ja yksikkö jäädytetään nopeasti. Jäädyttämällä estetään ennenaikainen reaktio ja kylmäkuivaarnalla saadaan sitten vesi 2Q poistettua, mikä estää ennenaikaisen reaktion kerroksen lämmettyä huoneen lämpötilaan.

Edullisessa toteutusmuodossa yksi reagenssiryhmä voidaan lisätä vesiliuoksena kerrokseen ja kuivata. Toisen rea-genssiryhmän lisäys suoritetaan vesiliuoksessa, joka jää-25 dytetään sitten nopeasti ja josta senjälkeen poistetaan vesi kylmäkuivaarnalla. Tällä menetelmällä voidaan yksikköön sisällyttää vain vesiliukoisia reagensseja ja estää näin reagenssien väliset reaktiot. Siten vältetään myös orgaanisten liuottimien käyttö, joista tietyt voivat vai-30 kuttaa haitallisesti joihinkin reagensseihin (esim. entsyymeihin) .

Tällä menetelmällä voidaan valmistaa koostumuksia reagensseista, joita käytetään homogeeniseen spesifiseen kokeeseen, jossa kaikki reagenssit ovat samassa kerrosele-35 mentissä.

75677 26

Palautuva kompleksinmuodostus Näytteen ligandin ja merkityn ligandin kilpailu sitoutumisesta sitomispartneriin (tässä esimerkkinä käytetty vasta-ainetta "Ab") voidaan esittää seuraavalla yh-5 tälöllä: ligandi Ab:ligandi + < » + merkitty ligandi Ab:merkitty ligandi 10 +

Ab

Kuvatussa systeemissä vasta-aine ja merkitty ligandi pidetään erillään toisistaan aina näytteen lisäämiseen asti.

15 Tässä keksinnön mukaisen menetelmän toteutuksessa käytetään hyväksi palautuvaa reaktiota ja uudelleen tasapainottumista ligandin kanssa, kuten nähdään seuraavassa yhtälössä: ligandi Ab:ligandi 20 + * — + AB:merkitty ligandi merkitty ligandi jossa syrjäytetyn merkityn ligandin määrä on suorassa suhteessa näytteen ligandikonsentraatioon. Etuna on, että käik-25 ki reagenssikomponentit voidaan sisällyttää yhteen väliaineeseen ja saatua systeemiä käytettäessä tarvitaan vain kokeiltavan näytteen lisäys.

Analyyttisiä elementtejä valmistetaan ikuboimalla lyhyen aikaa, esim. 15 min. tiettyä konjugaattia vastaavan 30 antiseerumin kanssa. Sitten lisätään mahdollisia lisäreagens-seja, ja inkubointia jatketaan vielä jonkin aikaa, muodostuneella liuoksella impregnoidaan (tai sisällytetään muuten) kantaja-ainekerros, ja liuoksen annetaan kovettua.

Havaittava vaste 35 Kuten edellä mainittiin, monilla viime aikoina suun nitelluilla homogeenisilla spesifisillä sitomiskoesystee- 75677 27 meillä saadaan, mahdollisesti käyttäen sovellutusta, havaittava vaste, kuten värin muutos, kemiluminesenssi- tai fluoresenssivaste, joka vastaa kokeiltavan nestenäytteen ligandia kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti.

5 Ilmaisulla "havaittava laji" ja muilla tässä käy tetyillä samantapaisilla ilmaisuilla tarkoitetaan atomeja, kemiallisia ryhmiä (so. osia molekyylistä) tai kemiallisia yhdisteitä, jotka itsessään ovat suoraan tai epäsuorasti havaittavissa, ja ilmaisulla "havaittava vaste" sekä muil-10 la tässä käytetyillä samankaltaisilla ilmaisuilla tarkoitetaan tällaisen lajin havaittavissa olevaa ilmausta. Esimerkkejä ovat sähkömagneettisen säteilyn signaalit, kuten fluoresenssi, fosforesenssi, kemiluminesenssi, valon absorption tai reflektanssin muutos näkyvällä spektrin osalla, mikä 15 havaitaan näkyvänä värin muutoksena, tai valon absorption tai reflektanssin muutos näkyvän alueen ulkopuolella, kuten ultravioletti- tai infrapuna-alueella. Kuten immunoko-keita perillä olevalle asiantuntijalle on selvää, ilmaisua "havaittava vaste" on tässä käytetty laajimmassa mielessä.

20 Sähkömagneettisten säteilysignaalien lisäksi ilmaisuun "havaittava vaste" käsitetään sisältyvän myös systeemin muiden parametrien havaittavat muutokset, kuten reaktantin havaittavat muutokset, jotka havaitaan näytteen jonkin komponentin saostumisena tai muu muutos joko immunokoesysteemissä tai 25 näytteessä. Tällaisia muita havaittavia vasteita ovat sähkökemialliset ja kolorimetriset vasteet. Havaittava vaste voi lisäksi olla sellainen, joka voidaan suoraan havaita aisteilla tai jollakin havaitsemislaitteella, kuten spektro-fotometrilla, UV-valon havaitsemislaitteella, fluorometrilla, 30 spektrofluorometrilla, pH-mittarilla tai muulla. On toivot tavaa, että havainto voidaan suorittaa sopivasti käyttäen havaittavan lajin koko määrää ilman, että siten vaikutetaan analyysin perusteena olevien analysoitavien aineiden reaktioista syntyneisiin diffundoituvien tuotteiden määrään.

35 Kun analyysitulos on saatu havaittavana muutoksena.

28 75677 niin se mitataan tavallisesti viemällä koe-elementti vyöhykkeen lävitse, joka on varustettu sopivalla heijastus-, transmittio- tai fluoresenssifotometrilla. Tällainen laite toimii siten, että se suuntaa energiasädekimpun, kuten 5 eräässä toteutuksessa valon kantaja-aineen lävitse. Valo heijastuu elementistä takaisin havaitsemisvälineeseen tai kulkee elementin lävitse havaitsemisvälineeseen, kun kyseessä on transmittio-havaitseminen. Edullisessa suoritustavassa analyysitulos havaitaan elementin alueella, joka 10 on tlysin siinä alueessa, jossa tulos tuotetaan. Heijastus-spektrofotometrin käyttö saattaa joissakin tapauksissa olla edullista, jotta voitaisiin tehokkaasti välttää mahdollisten jäännösten, kuten verisolujen optinen häirintä tai virtsan kerroksille muodostaman sakan tai tyypillisen virt-15 san värin optinen häirintä. Haluttaessa voidaan myös käyttää tavanomaista fluoresenssispektrofotometriatekniikkaa. Lisäksi voidaan käyttää transmissiotekniikkaa sellaisten reaktiotuotteiden havaitsemiseen tai määrittämiseen, joita on muodostunut säteilyenergian, kuten ultraviolettisätei-20 lyn, näkyvän tai infrapunaisen säteilyn vaikutuksesta elementin yhteen pintaan, jolloin tämän energian "ulostulo" mitataan yksikön vastakkaisella pinnalla. Yleensä tällaisessa mittauksessa käytetään sähkömagneettista säteilyä aaltopituudella noin 200-900 nm, vaikkakin mitä tahansa 25 säteilyä, jonka elementti päästää lävitseen ja jolla voidaan kvantitatiivisesti määrittää muodostunut tuote, voidaan käyttää. Analyysin kontrolloimiseen voidaan käyttää erilaisia kalibrointimenetelmiä. Esimerkiksi kokeiltavaa ligandia sisältävän standardiliuoksen näyte viedään alu-30 eelle lähelle aluetta, johon näytetippa vietiin, jotta analyysissä voitaisiin käyttää tulosten differenssiin perustuvaa mittausta.

Esimerkit

Seuraavat esimerkit kuvaavat kokeita, joita suori-35 tettiin keksinnön kehitystyön yhteydessä. Niiden valaistessa edullisia suoritusmuotoja niitä ei voida kuitenkaan 29 7 5 6 7 7 pitää keksinnön suojapiiriä rajoittavina.

A. Prosteettisella ryhmällä merkitty immunokoelaite

Esimerkki I

Mallisysteemi 5 Erilaisten GB-patenttijulkaisussa nro 2 023 607 ku vattujen prosteettisella ryhmällä merkittyjen homogeenisten immunokoereagenssisysteemien sisällyttämistä kuivaan koelaitteeseen kokeiltiin valmistamalla mallisysteemi. Malli-systeemissä käytetty vastaava ligandi oli N-(2,4-dinitro-10 fenyyli)- £-aminokapronihappo (tästä lähtien käytetään nimitystä "DNP"). Reagenssit, joihin sisältyivät systeemin immu-nokemialliset komponentit, käsittivät DNP:n vasta-aineen, DNP:n ja flaviiniadeniinidinukleotidin konjugaatin (josta tästä lähtien käytetään nimitystä "DNP-FAD") ja apoglukoo-15 sioksidaasin.

Systeemi suunniteltiin siten, että DNP-vaste näkyi värinä, joka aiheutui apoglukoosioksidaasin aktivoitumisesta DNP-FAD-konjugaatin vaikutuksesta. DNP-FAD, jota vasta-aine ei sido, on suorassa suhteessa DNP-konsentraatioon.

20 Se voidaan havaita kyvystä yhtyä apoglukoosioksidaasiin, jolloin muodostuu aktiivista glukoosioksidaasientsyymiä. Systeemiin sisältyi siten apoentsyymin, vasta-aineen ja konjugaatin lisäksi havaittavan vasteen saamiseksi glukoosiok-sidaasisysteemi, joka sisälsi glukoosia, 3,31,5,5'-tetra-25 metyylibentsidiiniä (TMB) ja piparjuuriperoksidaasia. Apoentsyymin aktivoituessa glukoosioksidaasiksi muodostuu sininen väri, joka aiheutuu glukoosin hapettumisesta vetyperoksidiksi ja sitä seuraavasta TMB:n muuttumisesta peroksidaa-sin läsnäollessa siniseen, hapettuneeseen tilaan.

30 1. Apoentsyymin valmistus

Apoentfcyymi valmistettiin erittäin puhtaasta glukoo-sioksidaasista (Miles Laboratories, Inc., luettelo nro 31-619). 10,5 ml entsyymiliuosta (1000 yksikköä/ml) sekoitettiin dekantterissa 4,5 ml:aan glyserolia, ja seos jäähdytet-35 tiin 0-4°C:seen. Seoksen pH säädettiin 10-%:sella ^SO^- 75677 30 vesiliuoksella arvoon 1,4. pH:n säätö suoritettiin koko ajan sekoittaen ja jäähdyttäen jäähauteessa. Sekoittamista jatkettiin vielä 2 tuntia, jonka jälkeen liuos kaadettiin Sephadex G-50 (medium) verkkoutettua geelisuodatus-5 ainetta sisältävään kolonniin (1,5 x 43 cm). Sephadex oli ennen entsyymiliuoksen lisäämistä tasapainotettu 30-tila-vuus-% glyserolia sisältävällä liuoksella, jonka pH oli 1,4. Entsyymiliuoksen lisäämisen jälkeen käytettiin apoent-syymin eluointiin samaa 30-% glyserolia sisältävää liuos-10 ta. Effluentista kerättiin fraktioita, joiden UV-absorbans-si tutkittiin aaltopituudella 280 nm. Fraktiot, joissa esiintyi absorbanssia tällä aaltopituudella, yhdistettiin puskuriliuokseen, joka sisälsi 50 mg aktiivihiiltä ja 25 mg dekstraania (Pharmacia Company nro T-70). Puskuri koostui 15 1-molaarisesta tris(hydroksimetyyli)aminometaanin vesiliuoksesta, johon oli lisätty glutamiinihappoa pH:n säätämiseksi arvoon 7,0. Saadun effluenttiliuoksen pH säädettiin sitten arvoon 7 kyllästetyllä tris(hydroksimetyyli)aminometaanin liuoksella. Lopullista liuosta sekoitettiin jäähauteessa 20 tunnin ajan. Apoentsyymiliuos lingottiin, ja supernatantti suodatettiin Millipore-suotimilla 0,5 ^um ja 0,22 ^um (Mil-lipore Corporation).

2. DNP-FAD-konjugaatin valmistus

Konjugaatti valmistettiin seuraavasti: Trayer'in et 25 ai. (Biochem. J., 139 (1974), 609-623) menetelmällä syntetisoitiin N^-(trifluoriasetamidoheksyyli)adenosiini-5'-mono-fosfaatti 56 mg (0,1 mmol) sitä liuotettiin noin 10 ml:aan vettä, ja liuokseen lisättiin 25 ^ul tri-n-butyyliamiinia (0,1 mmol). Vesi haihdutettiin vakuumissa, jäännös liuotet-30 tiin 10 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia, joka sitten haihdutettiin vakuumissa. Liuottaminen kuivaan dimetyyliform-amidiin ja liuottimen haihduttaminen suoritettiin vielä kolme kertaa. Lopullinen jäännös liuotettiin 10 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia. Liuokseen lisättiin 80 mg N,N'-35 karbonyylidi-imidatsolia (0,5 mmol), ja seos sai reagoida 31 75677 1/5 tuntia. Sitten lisättiin 15 ,ul vettä ja liuotin haih- / g dutettiin vakuumissa. Jäännöksenä saatu N -(trifluoriaset-amidoheksyyli)adenosiini-5'-monofosfaatti-imidatsolidi liuotettiin 10 ml:aan dimetyyliformamidia.

5 47 mg (0,1 mmol) Johnson'in et ai. (Anal.Biochem., 86 (1978), 526-530) menetelmällä puhdistettua riboflaviini-5'-monofosfaattia liuotettiin noin 10 ml:aan vettä, ja liuos lisättiin tipoittain 20 ml:aan asetonia, joka sisälsi 43 /Ui (0,1 mmol) tri-n-oktyyliamiinia. Ennen lisäyksen päättymistä 10 saatiin sakka. Liuotin poistettiin kiertohaihduttimessa, kunnes riboflaviini-5'-monofosfaatti liukeni. Sitten lisättiin 5 ml asetonia ja 5-10 ml dimetyyliformamidia ja seos haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 15-20 mitään kuivaa dimetyyliformamidia, ja liuos haihdutettiin kuiviin.

15 Sama toistettiin kolme kertaa. Jäännös liuotettiin 5 mlraan dimetyyliformamidia, ja liuos yhdistettiin edellä saadun 10 ml:n kanssa imidatsolidin dimetyyliformamidiliuosta. Reaktioseos sai seistä huoneen lämpötilassa yön yli, sitten liuotin poistettiin. Jäännös liuotettiin 50 ml:aan vettä 20 ja vietiin DEAE-selluloosaa (Whatman DE 23; Whatman, Inc., Clifton, NJ) bikarbonaattimuodossa sisältävään kolonniin (2,5 x 25 cm). Kromatogrammi kehitettiin veden (21) ja Q,3-m ammoniumbikarbonaattiliuoksen (2 1) lineaarisella gra-dientilla, jolloin koottiin 23 ml:n fraktioita. Ohutkerros-25 kromatografia silikageeli 60 F254:llä (E. Merck, Darmstadt, Saksan Liittotasavalta) osoitti fraktioiden 68-73 sisältävän vahvasti keltaisia (Rp 0,75) ja heikommin keltaisia (Rp 0,36) yhdisteitä. Nämä fraktiot yhdistettiin, absorp-tiospektrissä oli maksimit kohdissa 267 nm, 373 nm ja 450 nm. 30 Yhdistetystä liuoksesta poistettiin liuotin ja jään nös liuotettiin noin 5 ml:aan vettä. Tämän liuoksen pH säädettiin 5-m NaOH-liuoksella arvoon 11,0, ja liuos sai sitten seistä huoneen lämpötilassa 9 tuntia. Ohutkerroskro-matografia osoitti tällöin komponentin Rp 0,75 hävinneen 35 ja että tilalle oli muodostunut uusi keltainen yhdiste Rp 0,37. Reaktioseoksen pH säädettiin kloorivetyhapolla arvoon 75677 32 8,0 ja seos vietiin bikarbonaattimuodossa olevaa DEAE-sel-luloosaa sisältävään kolonniin (2,5 x 20 cm). Kromatogram-mi kehitettiin veden (1 1) ja 0,2-m ammoniumbikarbonaatti-liuoksen (1 1) lineaarisella gradientilla. Kolonnista saa-5 tu keltainen effluentti koottiin yhteen ja liuotin haihdutettiin. Jäännös adsorboitiin 2 g:lie silikageeliä, joka sitten asetettiin kolonnin yläosaan, joka sisälsi 50 g eta-noli/l-m trietyyliammoniumbikarbonaattiliuosseoksella (pH 7,8) (tilavuussuhde 8:2) tasapainotettua silikageeliä. Kro-10 matogrammi kehitettiin samalla liuottimella, keltainen komponentti, jonka Rp oli 0,37, koottiin ja haihdutettiin. Flä-viini-N6-6-N-aminoheksyyliadeniinidinukleotidin /josta tästä lähtien käytetään nimitystä N6(aminoheksyyli)FAD/ saanto oli 10 % (määritetty absorbanssin 450 nm perusteella).

15 10 ml:aan 0,21-m natriumbikarbonaatin vesiliuosta, joka sisälsi 0,06 mmoolia Nb(aminoheksyyli)FAD:ia, lisättiin sekoittaen tipoittain 17 ^ul (0,13 mmol) 2,4-dinitro-fluoribentseeniä 1 ml:ssa absoluuttista etanolia. Reaktio-seosta sekoitettiin pimeässä 6 tuntia, sitten siihen lisät-20 tiin 10 ^,ul (0,08 mmol) 2,4-difluoribentseeniä liuotettuna 0,5 ml:aan etanolia. Reaktioseosta sekoitettiin yön yli. Ohutkerroskromatografialla silikageelillä (silikageeli 60, F-254, E.Merck) liuotinsysteemissä etanoli/trietyyliammo-niumbikarbonaatti (pH 7,5)(7:3) todettiin (aminoheksyyli)-25 FAD:in reagoineen täydellisesti.

Reaktioseos suodatettiin Whatman nro 1 paperilla ja suodos vietiin Sephadex LH-20 sisältävään kolonniin (2,5 x 56 cm), joka oli tasapainotettu 0,3-m ammoniumbikarbonaa-tilla. Kromatogrammi kehitettiin samalla liuottimella, jol-30 loin saatiin erillisinä piikkeinä useita keltaisia aineita. Välillä 470-560 ml 0,3-m ammoniumbikarbonaattiliuoksella eluoitunut liuos oli ainoa, joka aktivoi apoglukoosioksidaa-sin. Edellä kuvatulla tavalla suoritetulla ohutkerroskromatografialla tämä materiaali saatiin jaettua kahdeksi kel-35 täiseksi fluoresoivaksi täpläksi (Rp = 0,84 ja 0,89). Optisessa absorptiospektrissä oli maksimit kohdissa 265, 370 33 7 5 6 7 7 ja 455 nm. Tämän tuotteen näyte saatettiin reagoimaan käärmeenmyrkky-fosfodiesteraasivalmisteen (Croteus ada-matoces) kanssa (valmistaja: Worthington Biochemical Corp.). Ohutkerroskromatografia osoitti, että reaktiotuotteet oli-5 vat riboflaviini-5'-monofosfaatti ja N^(2,4-dinitrofenyyli-aminoheksyyli)adenosiini-5'-monofosfaatti. Täplien vahvuudesta voitiin päätellä, että täplä, jonka Rp oli 0,87, oli entsyymin hajottaman materiaalin täplä. 3 vuorokaudessa ei hajoaminen ollut täydellistä.

10 3. Koelaitteen valmistus

Koelaite valmistettiin sisällyttämällä aineosat kahdella kastamisella paperiperusaineeseen. Ensimmäinen imey-tys suoritettiin kastamalla 2-mmolaariseen TMG-asetöniliuokseen. Eaton & Dikeman 205 suodatinpaperin palaset (4x4 15 cm) kastettiin TMB-liuokseen (ensimmäinen kastaminen), poistettiin liuoksesta ja kuivattiin kiertoilmauunissa 90°C:ssa 1-2 minuuttia.

Toinen kastamisliuos valmistettiin yhdistämällä seu-raavat aineosat mainitussa järjestyksessä: V ) 2Q Vesipitoinen puskuri (pH 6,4) ' 0,4 ml

Glukoosi (1-m) 0,2 ml

Piparjuuriperoksidaasi (153 yks/mg: 1,25 mg/ml) 0,2 ml Polyvinyylialkoholi (Monsanto 20-30; 10 g/100 ml vettä) 0,2 ml

Naudan seerumialbumiini (Miles Laboratories, 25 Inc.; 20 mg/ml vettä) 0,05 ml

Apoglukoosioksidaasi (5,0 nanomoolia FAD-sitomiskohtia/ml) 0,4 ml y v j

Osittain puhdistettu DNP:n vasta-aine 0,56 ml X )

Puskuri sisältää vesiliuoksena 10,8 g tris(hydroksi-30 metyyli)aminometaania, 9,7 g glutamiinihappoa ja 1,6 g sitruunahappoa 1QQ ml:ssa liuosta.

xx^Osittain puhdistettu vasta-aine valmistettiin DNP-anti-seerumista (Miles Laboratories, Inc.). Immunoglobuliini-35 fraktio eristettiin saostamalla ammoniumsulfaatilla Living-ston'in ("Methods in Enzymology", voi. XXXIV, W.B. Jakoby 34 75677 ja M Wilchek/ 3 painos, sivu 725; Academic Press, New York, 1974) kuvaamalla menetelmällä. Tällä menetelmällä saatu lopullinen sakka liuotettiin 50 mmolaariseen kalium-fosfaattiin (pH 6,8) sellaiseksi tilavuudeksi, joka vastasi 5 alkuperäistä seerumia. Tämä liuos dialysoitiin yön yli 4°C: ssa samaa puskuria (50-mmolaarinen kaliumfosfaatti, 500 ti-lavuusosaa) vastaan.

Ennen käyttöä kokeessa edellä valmistettu apoentsyy-miliuos dialysoitiin 20-mmolaarista trisglutamaattipuskuria 10 vastaan (pH 7,0), joka sisälsi 10 paino-% mannitolia.

Tätä toista kastamisliuosta käytettiin sitten aikaisemmin TMBillä impregnoidun paperin impregnoimiseen. TMB-pitoinen paperi kastettiin toiseen kastamisliuokseen, poistettiin liuoksesta ja kuivattiin kiertoilmauunissa 90°C:ssa 15 6 minuuttia.

Koelaitteet valmistettiin kiinnittämällä kuivatun paperin 5 x 5 cm kokoiset palat kaksiakselisesti orientoituneiden polystyreeniliuskojen (0,5 x 8,3 cm) toiseen päähän. Kiinnittäminen suoritettiin käyttäen kaksipuolista 2Q teippiä ("Duble-Stick"; 3M Company).

Reagenssisysteemi valmistettiin lopulliseen muotoonsa saattamalla edellä valmistettu laite kosketuksiin 1-^u-molaaristen DNP-FAD-konjugaattivesiliuosten kanssa. Kaikki laitteen kokeilussa käytetyt liuokset sisälsivät tämän 25 määrän konjugaattia ja vaihtelevan määrän ligandia, DNP, tai ei lainkaan ligandia, Näin valmistettiin 4 koeliuosta:

Koe liuos_Sisältö_____

1 1 /UM DNP-FAD

30 2 1 ,uM DNP-FAD ja 1 ,uM DNP-kapro- ' ' aattia 3 1 /UM DNP-FAD ja 4 ,uM DNP-kapro- ' ' aattia 4 1 ,uM DNP-FAD ja lQ.uM DNP-kapro- ' * aattia 75677 35 4. Kokeen arviointi

Koelaitteiden suorituskyvyn kokeilussa jokainen niistä kastettiin 15 ^,ul:lla edellä olevia liuoksia. Koe-liuoksen kanssa kosketuksissa oltuaan jokaista laitetta 5 inkuboitiin 6 minuuttia kannellisessa petrimaljassa, jonka pohjalla oli kostutettu suodatinpaperipalanen. Petrimal ja toimi kosteuskammiona.

Edellä kuvatulla tavalla valmistetun ja inkuboidun koelaitteen suorituskyky analysoitiin instrumentilla "Rapid 10 Scannes". Tämä laite on skannaus-reflektanssispektrofotomet-ri, johon liittyy PDP-12 laskin, valmistaja Digital Equipment Corporation. Tätä instrumenttia käytetään näkyvällä reflektanssi-spektrin alueella olevaan nopeaan mittaukseen. Laskin pystyy varastoimaan spektrin tulokset ja laskutulok- 15 set. Reagenssiliuskojen suorituksen mittaamisella Rapid Scanner-laitteella on visuaaliseen havaintoon verrattuna seuraavat edut: 1) Valolähde ja näytteen ulkoiset olosuhteet pysyvät muuttumattomina. Silmämäärin arvioitaessa valolähde voi 2Q vaihdella, jolloin vaihteluja voi esiintyä sekä aaltopituuksissa että valolähteen asemassa tarkasteltaviin liuskoihin nähden.

2) Rapid Scanner-laitteen detektoriominaisuudet pysyvät muuttumattomina. Silmämääräisessä tarkastelussa detek- 25 tori (so. havaintoja tekevän henkilön silmät) vaihtelee eri henkilöillä ja eri päivinä.

3) Rapid Scanner-laitteella saadaan tarkemmat kvantitatiiviset havaintotulokset kuin ihmissilmin, jölloin tuloksia voidaan verrata toisiinsa objektiivisemmin kuin visu- 30 aalisten havaintojen ollessa kysymyksessä.

Rapid Scanner-laite on firmassa Ames Company Division of Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana USA suunniteltu, ja tarkempia tietoja rakenteesta ja suorituskyvystä saadaan tästä firmasta.

35 Koelaitteet, joihin oli lisätty neljää eri liuosta, analysoitiin Rapid-Scanner-laitteella. Saadut spektrit on 75677 36 esitetty kuviossa 1. Kuvion 1 neljä käyrää kuvaavat ref-lektanssi-%:a aaltopituuden funktiona. Erityisen mielenkiintoinen on liuskojen suoritus aaltopituudella 600 nm. joka on hapetetun TMB:n sinivärin maksimiabsorption aalto-5 pituus.Heijastus-% alenee ligandin konsentraation kasvaessa, mikä osoittaa laitteen kykyä kvantitatiivisesti analysoida liuoksia, joiden DNP-kaproaattikonsentraatiot vaih-televat. Lisäksi eri ligandiliuoksilla saadut värierot olivat riittävän suuria, joten myös silmämäärin voitiin havai-10 ta värin riippuvuus ligandin konsentraatiosta._ Tämä koe osoittaa, että vasta-aine ja apoentsyymi voivat samanaikaisesti kilpailla vastaavasta konjugaatista, tässä tapauksessa DNP—FADzsta ilman määrättyä reagenssien lisäysjärjestystä. Lisäksi koe osoittaa, että käytännössä 15 immunokemiallisen koesysteemin reagenssit voidaan sekoittaa ja varastoida kauan ennen itse kokeen suorittamista.

Esimerkki II

Yhdistetty immunokoelaite Tässä kokeessa pyrittiin parantamaan esimerkin I mal-20 lisysteemiä sisällyttämällä konjugaatti suoraan kantaja- elementtiin ennen kokeen suorittamista ja siten tuottamalla yhdistetty homogeeninen immunokoelaite.

Buckey S-22 paperin pala (3,75 x 6,25 cm) kastettiin ensimmäiseen kastamisliuokseen, joka oli 5-mmolaarinen TMB-25 liuos asetonissa, joka sisälsi 0,1 g/100 ml emulgointiainet-ta (GAF ON-870, General Aniline & Film Corp.). Tämä viimeksi mainittu ensimmäisen kastamisliuoksen komponentti on polyetyleenioksidipolymeeri, jonka päätteissä on pitkäket-juiset rasva-alkoholit. Polymeerin etyleenioksidi/rasva-30 alkoholimoolisuhde on 30:1. Paperi kuivattiin 50°C:ssa minuutin ajan.

Kuivaamisen jälkeen paperi kastettiin toiseen kastamisliuokseen, joka oli valmistettu seuraavista aineosista: 37 75677

Vesipitoinen puskuri (1-ra trisglutamaatti, pH 6,4) 0,4 ml

Glukoosi (1,0-m) 0,2 ml

Piparj uuriperoksidaasi 5 (153 yks/mg, 1,25 mg/ml) 0,2 ml

Polyvinyylialkoholi (Monsanto 20-30; 10 g/100 ml vettä) 0,2 ml

Naudan seerumialbumiini (Miles Laboratories, Inc; 20 mg/ml vettä) 0,05 ml 10 Apoglukoosioksidaasi (50 nanomoolia FAD-sitomiskohtia/ml) 0,08 ml

Osittain puhdistettu DNP:n vasta-aine (katso esim. I) 0,27 ml

Tislattu vesi 0,6 ml 15

Paperi kuivattiin 50°C:ssa 12 minuuttia, sitten se kastettiin kolmanteen kastamisliuokseen, joka oli valmistettu sekoittamalla 250 ^ul 80-^,umolaarista DNP-FAD-kon-jugaatin vesiliuosta n-propanolin (9,75 ml) kanssa, jol-20 loin saatiin 2-^umolaarinen DNP-FAD-kastamisliuos. Kolmannen impregnoinnin jälkeen paperi kuivattiin 50°C:ssa 4 minuuttia.

Valmistettiin koelaitteita kolminkertaisesti impregnoidun paperin 0,5 x 0,5 cm palasista liittämällä palaset 25 kaksiakselisesti orientoituneen polystyreenin liuskojen (0,5 x 8,3 cm) toiseen päähän. Kiinnittäminen suoritettiin kaksipuolisella teipillä "Double-Stick" (3M Company).

Näitä koelaitteita kokeiltiin erilaisia DNP-konsent-raatiota sisältävillä liuoksilla kastamalla koelaitteet liu-30 oksiin ja inkuboimalla sitten 3 minuuttia ja analysoimalla liuskat Rapid-Scanner-laitteella (katso esim. I) valon ref-lektanssin mittaamiseksi. Aaltopituudella 600 nm saadut tulokset nähdään graafisena esityksenä kuviossa 2, jossa K/S on esitetty DNP-konsentraation funktiona. K/S määritellään 35 seuraavasti: κ (ι-r) 2 7 5 6 7 7 38 jossa K on vakio, S on käytetyn heijastusvälineen sironta-kerroin, ja R on koeliuskasta saadun reflektanssin osuus.

^ Tämä kaava esittää yksinkertaistetussa muodossa Kubelka-Munk yhtälön (Gustav Kortiim, "Reflectance Spectroscopy", sivut 106-111, Springer-Verlag, New York (1969)).

Rapid Scanner-laitteella saatuja tuloksia käytettiin myös suorituskyvyn arviointiin laskemalla värieroyksiköt ^ ( < E), jotka on esitetty taulukossa A. < E on arvo, joka on suhteellinen värinmuodostukseen tuloksena koelaitteen apoentsyymin ja DNP-FAD-konjugaatin läsnäolosta yhdessä indikaattorin, peroksidaasin ja glukoosin kanssa. Rapid-Scan-ner-laitteella saatuja kolmiherätearvoja on käytetty E:n ^ laskemiseen sopimuksen mukaisesti, joka on kuvattu julkaisussa "Supplement nro 2 to Commission Internationale de L'Eclairage (Paris), Publication nro 15, Colorimetry, (E.-1.3.1), 1971".

^ Taulukko A

DNP-kaproaattitasojen välinen visuaalinen erottaminen DNP-kaproaatti

(^uM) E

25 0-1 10,5 1- 2 3,2 2- 4 4,5 4-8 5,2 30 Tulokset osoittavat, että kiinteässä tilassa oleva täysin yhdistetty homogeeninen immunokoelaite on käyttökelpoinen.

Esimerkki III

Kantajaperusaineessa olevan apoentsyymin parannettu 35 pysyvyys

Pyrkimyksenä oli kokeilla kantajaperusaineessa, ku- 39 7 5 6 7 7 ten paperissa olevan apoglukoosioksidaasin stabiloimista ja siten koelaitteen reaktiivisuuden, herkkyyden ja varastoinnin parantamista. Reagenssiliuskoja valmistettiin muuten samalla tavalla kuin esimerkissä I paitsi, että vasta-5 aine jätettiin pois. Käytettiin kahden kastamisen systeemiä kastamalla Eaton & Dikeman 2Q5 paperinpalat (4x4 cm) ensin TMB-asetoniin, kuivaamalla ja kastamalla ne sitten toiseen liuokseen, joka sisälsi muut reagenssisysteemin aineosat, jotka tarvitaan sen tekemiseksi herkäksi konjugaatin 10 suhteen. Tällä tavalla valmistettuja laitteita kuumarasi-tettiin ja niihin lisättiin konjugaattia naudan seerumial-bumiinin (BSA) ja polyvinyylialkoholin (PVA) vaikutuksen tutkimiseksi apoentsyymin pysyvyyteen.

Eaton & Dikeman 205 suodatinpaperin (4x4 cm) pala-15 set impregnoitiin 2 ml:11a 3,3*,5,51-tetrametyylibentsidii-nin (TMB) 2-mmolaarista liuosta asetonissa. Paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 90°C:ssa 1-2 minuuttia. Valmistettiin toinen kastamisliuos, joka sisälsi trisglutamaatti-sitraat-tipuskuria (pH 6,4) konsentraationa 0,33-m (katso esim. I), 20 glukoosia konsentraationa 0,1-m, 19 yks/ml piperjuuriperok-sidaasia, glukoosioksidaasiapoentsyymiä (1,3 nmoolia FAD-si-tomiskohtia/ml), naudanseerumialbumiinia (BSA) 0,5 mg/ml ja polyvinyylialkoholia (PVA) 10 mg/ml. TMB-impregnoidut paperit kastettiin sitten hetkeksi toiseen kastamisliuokseen 25 ja kuivattiin kiertoilmauunissa 90°C:ssa noin 7 minuuttia.

Valmistettiin koelaitteita kaksiakselisesti orientoituneista polystyreeniliuskoista (noin 0,5 x 8,3 cm) kiinnittämällä niiden toiseen päähän impregnoidut, kuivatut paperinpalat (0,5 x 0,5 cm). Kiinnittäminen suoritettiin kaksi-30 puolisella teipillä Double-Stick (3M Company). Tällä tavoin valmistettuja koeliuskoja säilytettiin ruskeissa pulloissa 4°C:ssa silikageelikuivausaineen kanssa ennen kuumarasitus-kokeita.

Sekä sellaiset liuskat, jotka sisälsivät BSAsta ja 35 PVA:ta että sellaiset, jotka eivät sisältäneet niitä, saatettiin kuumarasituskokeeseen säilyttämällä niitä 3 vrk sul- 75677 40 jetuissa, kuivausainetta sisältävissä pulloissa 50°C:ssa. Rasituskokeen jälkeen liuskojen suorituskyky arvioitiin pipetoimalla niille 15 ^,ul 4-yumolaarista DNP-FAD-liuosta ja inkuboimalla 6 minuuttia kannella suljetussa pe-rimal-5 jassa, jossa oli märkä suodatinpaperipalanen. Kuumakäsit-telemättömät liuskat ympättiin samalla tavalla kuin edellä ja inkuboitiin 2 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen liuskat analysoitiin esimerkissä I kuvatulla tavalla Rapid Scanner-laitteella. Rapid Scanner tulos ilmoitettiin värieroyksik-1Q köinä ( < E) reagoimattomien liuskojen suhteen, so. sellaisten liuskojen suhteen, jotka oli kastettu DNP-FAD-konjugaa-tin sijasta vain tislattuun veteen. Rapid-Scanner analyysin tulokset nähdään taulukossa B.

15 Taulukko B

BSA/PVA E E

_Ras itt amaton_Kuumar as i te 11 u

Ei sisällä 2,2 2,1 BSA+PVA 19,9 13,6 20

Taulukon B tulokset osoittavat, että ilman BSA- ja PVA-lisäystä liuskoilla saatu vaste heikkenee merkitsevästi, kun sensijaan BSA:n ja PVA:n läsnäollessa saadaan 6,5-9-kertainen värierotuksen paraneminen. Lisäksi BSA 25 ja PVA parantavat merkitsevästi liuskojen stabiliteettia kuumarasituskokeessa. Tämän kokeen tulokset osoittavat siten erittäin selvästi stabilointiaineilla saavutettavat edut valmistettaessa kiinteässä muodossa olevia apoentsyy-miin perustuvia immunokoelaitteitä.

30 Esimerkki IV

Mallisysteemin soveltaminen teofylliinikokeeseen Kokeen tarkoituksena oli esimerkeissä I-III kuvattujen mallisysteemien soveltaminen kliinistä merkitystä omaavaan teofylliinikokeeseen. Teofylliini /1,3-dimetyyliksan-35 tiini; katsoi The Merck Index, 9. painos sivu 1196 (1976)/ on astman hoidossa käytettävä lääkeaine. Useimpien potilai- 41 75677 den seerumikonsentraation terapeuttinen alue on 10-20 ^ug/ml, ja veren tasoilla yli 35 ^ug/ml ilmaantuu jokseenkin poikkeuksetta myrkytysoireita. Koelaite valmistettiin samoin kuin edellisissä esimerkeissä käyttäen 5 kuitenkin konjugaattina FAD:ia kovalenttisesti sidottuna teofylliiniin ja vasta-aineena osittain puhdistettua teo-fylliinin vasta-ainetta.

1. Konjugaatin synteesi

Konjugaattimolekyylin valmistus, jossa FAD sidot-10 tiin kovalenttisesti teofylliiniin, suoritettiin seuraavasti : 1,3-dimetyyli-l,6,7,8-tet4ahydropyrido/l,2-e/puriini- 2,4,9-(3H)-trionia (0,9 mg/3,62 ^umol) /valmistus kuvattu Cook, C.E., Twine, M.E., Meyers, M., Amerson, E., Kepler, J.A. ja Taylor, G.F., Res , Comraun. Chem. Path. Pharmacol.

15 13, 497-505, (1979)/ lisättiin 0,2 ml:aan dimetyylisulfok- sidia, joka sisälsi 2,4 ^umoolia N^-(aminoheksyyli)-FAD:ia.

4 tunnin kuluttua lisättiin vielä 1,8 mg (7,3 ^umol) tri-onia. Liuosta sekoitettiin yön yli, liuotin haihdutettiin vakuumissa (0,1 mmHg) ja jäännös kromatografoitiin Sepha-20 dex LH-20 sisältävässä kolonnissa,joka oli tasapainotettu 0,3-m trietyyliammoniumbikarbonaatilla, pH 7,8. Raakatuote efluentti, joka eluoitui välillä 216-246 ml, koottiin ja kromatografoitiin 20 x 20 cm x 100 ^um silikageelilevyllä käyttäen etanoli/l-m trietyyliammoniumbikarbonaattia, pH 25 7,8 (tilavuussuhde 8:2). Haluttua tuotetta sisältävä vyö hyke raaputettiin levyltä, uutettiin 1-m trietyyliammonium-bikarbonaattipuskurilla (pH 7,8), suodatettiin ja konsentroitiin. Lopullinen puhdistus suoritettiin kromatografoi-malla Sephadex LH-20:llä, joka oli tasapainotettu 0,3-m 30 puskurilla, jolloin saatiin 1,26 yUmoolia (saanto 53 %) teofylliini-FAD:ia, kuten absorbanssi aaltopituudella 450 nm osoitti.

Näin valmistetulla konjugaatilla on edellä otsikolla "Entsyymin prosteettinen ryhmä merkintäaineena” varustetus- 35 sa kappaleessa esitetty kaava, jossa ryhmällä -R-L on rakenne: 0

II

HN-N'CH3

—fCH^HCO (CH2) N X

CH, 75677 42 2. Koelaitteen valmistus

Teofylliinikokeeseen tarkoitettuja reagenssilius-koja valmistettiin käyttäen tätä teofylliini-FAD-konju-gaattia. Buckey S-22 paperin kappaleita (4x4 cm) impreg-5 noitiin ensimmäisellä kastamisliuoksella, joka koostui 5-mmolaarisesta TMBzstä asetonissa, joka sisälsi 0,1 g/100 ml emulgointiainetta ON-870 (General Aniline and Film Corporation) . Kastamisen jälkeen ensimmäiseen liuokseen impregnoidut paperin kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa minuutin 10 ajan. Kuivaamisen jälkeen paperit impregnoitiin toisella kastamisliuoksella. Toisena kastamisliuoksena oli 0,33-m puskuri, joka kuvattiin esimerkissä 1 (pH 6,4), joka oli Q/l-molaarinen glukoosin suhteen ja sisälsi 19 yks/ml pi-parjuuriperoksidaasia sekä glukoosioksidaasiapoentsyymiä 15 (1,0 nmoolia FAD-sitomiskohtia/ml), osittain puhdistettua teofylliinin vasta-ainetta (0,14 ml kastamisliuoksen ml:aa kohti), 0,5 mg/ml härän seerumialbumiinia ja 0,5 g polyvi-nyylialkoholia 100 ml:aa kohti. Teofylliinin antiseerumi koottiin teofylliini-immunogeenikonjugaatilla immunoiduis-20 ta kaniineista Cook*in et ai. /Res.Comm.Chem.Path.Pharmacol. 13:497-505 (1976)/ kuvaamalla menetelmällä. Seerumi puhdistettiin osittain samoin kuin esimerkissä I. Kuivatut paperit kastettiin lyhyesti toiseen kastamisliuokseen ja kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa 12 minuuttia.

25 Kahteen kertaan impregnoidut paperit impregnoitiin sitten kolmannella liuoksella, joka sisälsi 0,5-^umolaari-sena liuoksena asetonissa FAD-teofylliinikonjugaattia. Paperit kuivattiin minuutin ajan 5Q°C:ssa kiertoilmauunissa.

Valmistettiin koelaitteita kolme kertaa impregnoi-30 dun paperin kappaleista (0,5 x 0,5 cm) kiinnittämällä ne polystyreeniliuskoille (Q,5 x 8,3 cm) kaksipuolisella teipillä Double-Stick (3M Company).

Kokeiden suorittamiseksi valmistetuilla koelaitteilla valmistettiin veteen teofylliiniliuoksia, joiden konsentraa-35 tiot vaihtelivat välillä 0-8 ^um. Laitteet kastettiin näihin 43 7 5 6 7 7 liuoksiin ja 2 minuutin inkuboinnin jälkeen analysoitiin Rapid Scanner'illä esimerkissä I kuvatulla tavalla. Annos-vastekäyrä nähdään kuviossa 3, jossa K/S on esitetty teofyl-liinikonsentraation funktiona.

5 Käyristä nähdään, että eri teofylliinimäärillä liuok sissa saadaan selvästi havaittavia värieroja ja että värin muutokset osoittavat kulloinkin teofylliinin konsentraation.

Esimerkki V

Mallisysteemin sovellutus fenytoilnikokeeseen 10 Samoin kuin esimerkissä IV pyrittiin esimerkkien I-III mallisysteemi soveltamaan kliinisesti merkittävään analyysiin, fenytoiinin määrittämiseen. Kokeessa osoitettiin homogeenisen, prosteettista ryhmää merkintäaineena käyttävän immunokokeen soveltuvuus kuivana reagenssiliuskana fenytoi-15 niinin toteamiseen. Kuten edellisissä esimerkeissä kantaja-perusaineessa saattoi tapahtua samanaikaisesti prosteetti-sella ryhmällä merkityn fenytoiinin ja analysoitavan näytteen (fenytoiini) välinen kilpailu sitoutumisesta fenytoiinin vasta-aineeseen.

2Q 1. Fenytoiini-FAD-konjugaatin synteesi 14,7 mg:aan (40,0 yumol) 5-(2'-karboksibutyylioksi-fenyyli-5-fenyylihydantoiinia 1,8 mlrssa molekyyliseuloilla kuivattua dimetyyliformamidia (DMF) lisättiin argonkehässä 0,10 ml (40,0 ^umol) 400-^umolaarista isobutyylikloorifor-25 miaatin liuosta DMFrssä. Reaktioseosta sekoitettiin tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Reaktioseokseen lisättiin sit- g ten 10,0 yumoolia N (aminoheksyyli)-FAD:ia 2,0 ml:ssa molekyyliseuloilla kuivattua dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja sitten 0,05 ml 400-^,umolaarista trie tyyli amiinin liuosta 30 DMF:ssä. Seosta sekoitettiin 19 tuntia huoneen lämpötilassa, sitten seos laimennettiin vedellä 45Q mlrksi ja johdettiin peristalttisen pumpun avulla Whatman DE-52 selluloosa-anio-ninvaihtohartsia (bikarbonaattimuoto) sisältävään kolonniin (1,5 x 30 cm). Kolonni eluoitiin veden (1,5 1) ja 0,3-m 35 trietyyliammoniumbikarbonaatin vesiliuoksen (1,5 1) gradien-tilla. Koottiin noin 16 ml:n fraktioita, joista fraktioissa « 75677 70-88 todettiin apoglukoosioksidaasiaktiviteetin perusteella olevan haluttua tuotetta. Nämä fraktiot yhdistettiin, ja liuoksen pH säädettiin arvoon 7. Tuotetta saatiin 4,78 ^umoolia (47,8 %:n saanto) määritettynä liuoksen ab-5 sorbanssin perusteella aaltopituudella 450 nm käyttäen FAD: in nmolaarisen liuoksen ekstinktiokorrointa (E^q = 11,3) määrityksen perustana.

2. Koelaitteen valmistus

Koelaitteet valmistettiin kastamalla paperinpala 1Q peräkkäin kolmeen liuokseen, joista jokainen sisälsi erilaisia immunokoesysteemin komponentteja, joiden oletettiin antavan positiivisen tuloksen fenytoiniinin läsnäollessa, ja kuivaamalla paperi aina kastamisten välillä. Paperinpala (5x5 cm) (S-22, Buckeye Cellulose Corp. Memphis, TN) 15 kastettiin 5-mmolaariseen TMB:n asetoniliuokseen, joka sisälsi 0,1 % (paino/tilav.) emulgointiainetta ON-879 (General Aniline & Film Corp.). 1 minuutin kuivaamisen jälkeen 50°C:ssa paperi kastettiin toiseen vesiliuokseen, joka sisälsi trisglutamaattipuskuria, pH 6,4 (0,2-m), glukoosia 20 (0,1-m) piparjuuriperoksidaasia (19 yks/ml), apoglukoosiok- sidaasia (1,0 nmoolia FAD-sitomiskohtia/ml), 0,5 mg/ml naudan seerumialbumiinia, 0,5 g/100 ml polyvinyylialkoholia (katso esimerkki III) ja antifenytoiiniseerumia (0,14 ml anti seerumi a/ml) . Antiseerumi saatiin muodostumaan o-kaproyyli-25 difenyylihydantoiinia vastaan samoin kuin esimerkissä IV.

Paperi kuivattiin 50°C:ssa kiertoilmauunissa 12 minuuttia ja impregnoitiin sitten kastamalla kolmanteen liuokseen, joka sisälsi FAD-fenytoiinikonjugaattia (0,5-yUm) n-propanolissa ja 0,1 g/100 ml polymeeriä Gafquat 734, joka 30 on kvaternäärisiä amiiniryhmiä sisältävä polymeeri (General Aniline & Film Corp.).

3-4 minuutin kuivaamisen jälkeen 50°C:ssa impregnoidusta paperista valmistettiin koeliuskoja kiinnittämällä 0,5 x 0,5 cm suuruisia kappaleita reagenssia sisältävää 35 paperia kaksiakselisesti orientoituneen polystyreenilius-kan (0,5 x 8,3 cm) toiseen päähän. Kiinnittäminen suoritet- 45 7 5 6 7 7 tiin kaksipuolisella teipillä Double-Stick (3M Company).

Näiden koelaitteiden käyttökelpoisuuden määräämiseksi fenytoiinin analyysiin niille vietiin fenytoiinia sisältäviä 0-8-^umolaarisia koeliuoksia ja 2 minuutin ku-5 luttua tulos luettiin Rapid Scanner-laitteella. Kuviossa 4 nähdään K/S:n muutos fenytoiinikonsentraatioilla 0, 0,5-, 1-, 2-, 4- ja 8-yUm vedessä.

Kuvion 4 tuloksista havaitaan, että koelaite osoittaa hyvin fenytoiinin läsnäolon ja määrittää helposti sen 10 erilaiset konsentraatiot.

Esimerkki VI

Yhdistetyn mallisysteemin käyttö fluoresenssi-immunokoelaitteessa

Esimerkin II yhdistetyn mallisysteemin soveltuvuut-15 ta fluoresenssi-immunokokeeseen kokeiltiin seuraavasti.

Koelaite valmistettiin samoin kuin esimerkissä II käyttäen kuitenkin TMB:n sijasta p-hydroksifenyylietikkahappoa. Hapettamalla p-hydroksifenyylietikkahappo peroksidilla perok-sidaasin läsnäollessa saadaan fluorometrisesti havaittavis-2Q sa oleva tuote.

Laite valmistettiin seuraavasti: Buckey S-22 paperin palanen impregnoitiin seuraavalla liuoksella:

Tris-glutamaattipuskuri (1-m, pH 6,4) 0,8 ml 25 Glukoosi (1-m vesiliuos) 0,4 ml

Piparjuuriperoksidaasi (153 yks/mg, 1,25 mg/ral) - 0,4 ml

Polyvinyylialkoholi (5 g/100 ml) 0,4 ml

Naudan seerumialbumiini (20 mg/ml) 0,1 ml 30 Gafquat 734 (10 g/100 ml vettä katso esim. V) 0,2 ml

Apoglukoosioksidaasi (40 nmoolia FAD- sitomiskohtia/ml) 0,16 ml

Osittain puhdistettu DNP-vasta-aine (katso esim. I) 0,54 ml 35 p-hydroksifenyylietikkahappo (80-mmolaarinen vesiliuos) 0,04 ml

Tislattu vesi 0,96 ml 46 7 5 6 7 7

Impregnoinnin jälkeen paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa 22 minuuttia.

Kuivattu paperi impregnoitiin 2-yumolaarisella DNP-FAD-konjugaatin liuoksella n-propanolissa ja kuivat-5 tiin 50°C:ssa 5 minuuttia.

Kuivatun reagenssipaperin toiselle puolelle kiinnitettiin metallista Mylar-teippiä (3M Company). Paperi kiinnitettiin kaksiakselisesti orientoituneelle polystyreeni-kalvolle Double-Stick-teipillä, joka kiinnitettiin Mylar-10 kerrokseen. Saatu koelaite käsitti 0,5 x 1 cm suuruisen My-lar-taustaisen reagenssipaperipalasen kiinnitettynä 0,5 x 8,3 cm suuruiselle polystyreeniliuskalle.

Valmistettiin samalla tavalla vertailuksi kontrolli-laite impregnoimattomasta paperista, jonka taustana oli 15 Mylar ja joka oli kiinnitetty polystyreeniliuskalle.

Fluoresoivien liuskojen suorituskykyä tutkittiin valomonistimella. Kvartsikuitu-optinen laite oli tutkittavan laitteen tason suhteen 45°C:een kulmassa. Tämä kuituoptinen laite oli varustettu elohopealampulla ja virityssuo-20 dattimella, joka päästi lävitse aaltopituuden 314 nm. Tietyn laitteen fluoresenssi saatiin suoraan toisesta kuituoptisesta laitteesta, joka oli 45°:een kulmassa näytelait-teen tason suhteen ja joka oli varustettu interferenssi-liuottimella (420 nm). Tulokset luettiin millivoltteina 25 käyttäen valomonistinta.

Fluoresoivien koelaitteiden kokeilemiseksi pipetoi-tiin reagenssipaperille 30 ^.ul:n DNP-pitoisia koeliuoseriä ja papereita inkuboitiin 11 minuuttia huoneen lämpötilassa kosteuskammiossa. DNP-liuosten konsentraatiot vaihtelivat 30 0:sta 8-^umolaariseen. Fluoresenssin vahvuus mitattiin valomonistimella 0-, 1-, 2-, 4- ja 8-yUmolaarisista liuoksista. Koe toistettiin käyttäen kontrollilaitetta. Kuviossa 5 nähdään koelaitteilla saadut annos-vaste-tulokset. Kontrolli-laitteella saadut tulokset osoittivat, ettei kuviossa 5 35 esitettyihin tuloksiin vaikuttanut mikään analysoitavaan 47 7 5 6 7 7 DNP-näytteeseen sisältyvä fluoresoiva sisäinen tekijä.

Tämä koe osoittaa vakuuttavasti, että homogeenisen immunokoetekniikkaan perustuvaa kiinteäfaasilaitetta, jossa käytetään havaittavn vasteen saamisen fluoresenssia, 5 voidaan menestyksellä käyttää.

B. Entsyymi-substraattimerkittyjä immunokoelaitteita Esimerkki VII

Paperi-monikerroselementti Tässä esimerkissä kuvatussa kokeessa valmistettiin 10 integraalinen monikerroksinen analyysielementti, jonka kykyä kvantitatiivisesti määrittää fluorometrillä teofylliinin läsnäolo nestenäytteessä.

Antiseerumin valmistus

Teofylliinin antiseerumi valmistettiin menetelmällä, 15 joka on kuvattu US-patenttihakemuksessa sarja nro 87 819, haettu 1979-10-23, joka julkaisu liitetään tähän viitteenä. Konjugaatin valmistus

Galaktosyyli-umbelliferoni-teofylliini-konjugaatti valmistettiin samoin US-patenttihakemuksessa sarja nro 20 87 819 kuvatulla menetelmällä.

Elementin valmistus

Teofylliini-spesifisen elementin yhden kerroksen valmistukseen käytettiin liuosta, joka sisälsi seuraavat komponentit: 25

Komponentti___Määrä

Vesi 27 ^ul 0,1-m bicine-puskuri (pH 8,5) 20 "

Teofylliini antiseerumi 100 " 30 /6-galaktosidaasi (78 yks/ml) 3 " x) yksiköt on määritelty julkaisussa Clin. Chem. 23:1402 (1977) .

Whatman 31 ET paperin (Whatman, Inc. Clifton, N.J.) 35 3 x 1,2 cm palanen liitettiin kaksipuolisella teipillä poly- 48 75677 styreenialustalle (8,2 x 1,2 cm), ja Whatman 31 ET paperille pipetoitiin edellä valmistettua liuosta. Paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa 10 minuuttia.

Toinen liuos valmistettiin liuottamalla konjugaatti 5 50 ^uljaan vettä ja laimentamalla liuos lopulliseen kon- sentraatioon 14,4-^um. Näin valmistettua liuosta pipetoitiin 1,0 x 3,0 cm palaselle Whatman 54 paperia. Impregnoitu paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa 10 minuuttia. Toinen kerros kiinnitettiin kaksipuolisella teipillä ensim-10 mäisen paperikerroksen toiseen päähän.

Koeliuos

Teofylliinistä valmistettiin Q,05-m bicine-puskuriin (pH 8,5) liuokset jotka sisälsivät 0,5, 1,0, 2,5 5,0 ja 4Q ^ug/ml teofylliiniä.

15 Analyysimenetelmä

Edellä kuvatulla tavalla valmistetut alusta-aineelle kiinnitetyt analyysielementit pantiin jokainen mekaaniseen pitimeen, joka sopii sijoitettavaksi fluorometriin pystyasentoon. Juuri ennen elementin ja pitimen asettamista 20 fluorometriin konjugaattia sisältävälle valotettavalle kerrokselle pipetoitiin 250 ^ul yhtä edellä valmistetuista teo-fylliiniliuoksista.

Fluorometri oli säädetty siten, että se antoi viri-tysvalon aaltopituudella 405 nm, joka osui elementtiin 60°reen 25 kulmassa pinnan kohtisuorasta ja että emittoitu valo havaittiin aaltopituudella 450 nm. Fluoresenssin mittaus suoritettiin 30°:een kulmassa kohtisuoran suhteen.

Kullakin näytteellä saatu fluoresenssivaste mitattiin ensin aikana Q-2Q0 sekuntia ja lukemat otettiin 2Q0 30 sekunnin kuluttua.

Tulokset Tällä analyyttisellä menetelmällä saatiin lukemat suhteellisen fluoresenssin muodossa. Havaittua suhteellista fluoresenssia verrattiin käytetyssä teofylliininäytteessä 35 olevaan teofylliinimäärään. Fluoresenssivaste ajan funktiona on esitetty kuviossa 6. Fluoresenssi ajankohtana 200 sek 49 75677 piirrettiin teofylliinikonsentraation funktiona standardi-käyrän saamiseksi. (Kuvio 7).

Johtopäätökset

Saadut tulokset osoittivat, että integraalisella 5 analyysielementillä voitiin saada kvantitatiivisesti havaittava vaste kaikkien näytteiden teofylliinipitoisuudes-ta. Reaktion inhibiition aiheutti teofylliinin vasta-aineen läsnäolo. Lisäämällä reofylliinin konsentraatiota inhibii-tio voitettiin, ja tuloksena oli teofylliinin määrästä riip-10 puva fluoresoivan tuotteen lisääntynyt muodostuminen.

Esimerkki VIII

Kylmäkuivattu elementti Tässä esimerkissä kuvatussa kokeessa valmistettiin teofylliinin määrittämiseen yksikerroselementti käyttämällä 15 lämpötilakontrollia reagenssien määräaikaisen reaktion estämiseen.

Antiseerumin valmistus

Teofylliinin antiseerumi valmistettiin edellä naini-tussa US-patenttihakemuksessa sarja nro 87 819 kuvatulla 20 menetelmällä. Antiseerumi valmistettiin saostaroalla ammo-niumsulfaattiliuoksella (33 mg/100 ml), liuottamalla sakka 0,05-m bicine-puskuriin (pH 8,5) ja dialysoimalla liuos samaa puskuria vastaan (pH 8,5). Saatu teofylliinikonsentraat-ti sisälsi noin 200 yumoolia teofylliinisitomiskohtia/ml.

25 Konjugaatin valmistus

Galaktosyyli-umbelliferoni-teofylliinikonjugaatti valmistettiin edellä mainitussa US-patenttihakemuksessa sarja nro 87 819 kuvatulla tavalla.

Elementin valmistus 3Q Yksikerroksisen spesifisen teofylliinielementin valmistuksessa käytetty ensimmäinen liuos sisälsi seuraavat aineosat:

Aineosa_____Määrä 35 0,5-m bicine-puskuri (pH 8,5) 10 /Ui

Teofylliinin vasta-ainekonsentraatti 150 /Ul /9 -galaktosidaasi (88 yks/ml) 40 ^ul 50 7 5 6 7 7

Kooltaan 0,5 x 1,0 cm oleva Whatman 31 ET paperi (Whatman, Inc., Clifton, NJ) kiinnitettiin kaksipuolisella teipillä polystyreenialustalle (8,2 x Q,5 cm), ja paperille pipetoitiin 20 ^,ul edellä valmistettua liuosta.

5 Paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa 10 minuuttia ja esijäähdytettiin sitten alhaisessa ilman kosteudessa kuivajäällä 5 minuuttia.

6,13-mmolaarista teofylliini-umbelliferoni-galak-toosiliuosta dimetyylisulfoksidissa (DMSO) laimennettiin 10 0,Q77-mmolaariseksi vedellä, ja tätä liuosta vietiin edel lä kuvatulla tavalla käsitellyille papereille kullekin 20 yUl. Elementtejä kylmäkuivattiin yli yön.

Koeliuos

Teofylliinistä valmistettiin 0,05-m bicine-puskuriin 15 liuokset, joiden konsentraatiot olivat 0,0, 4,0, 16,0 ja 40 ^ug/ml.

Analyysin suoritus

Edellä kuvatulla tavalla valmistetut ja alustalle kiinnitetyt analyyttiset elementit pantiin jokainen sopi-20 vaan mekaaniseen pitimeen, joka sopi asetettavaksi reflek-tanssifotometriin vaakasuoraan asentoon. Juuri ennen elementin ja pitimen asettamisesta reflektanssifotometriin kunkin elementin mittauspinnalle pipetoitiin 50 ^,ul yhtä edellä valmistetuista teofylliiniliuoksista. Fotometri oli 25 säädetty mittaamaan reflektanssimuutoksia aaltopituudella 400 nm.

Kunkin näytteen reflektanssi mitattiin ensin aikana 0-200 sek ja sitten otettiin lukemat 200 sekunnin kohdalla.

Tulokset 30 Edellä kuvatulla menetelmällä saadut koetulokset on esitetty graafisesti kuviossa 8. Ordinaatan yksiköt (K/S) on määritelty esimerkissä II.

Johtopäätös

Tulokset osoittavat, että integraalisella analyysi-35 elementillä saadaan kustakin kokeillusta näytteestä teo- fylliinikonsentraation kvantitatiivinen kromogeeninen vaste.

si 75677 Näissä olosuhteissa antiseerumin läsnäolo estää reaktion, ja tämä estyminen kumoutuu vähitellen teofyniinin kasvavan konsentraation vaikutuksesta.

Esimerkki IX

5 Useampikertaisella impregnoinnilla valmistettu elementti Tässä esimerkissä kuvatussa kokeessa valmistettiin yksi ainoa kerros, jonka kykyä kvantitatiivisesti määrittää teofylliini nestenäytteestä ja lukea tulos fluoremet-10 rilla kokeiltiin.

Antiseerumin valmistus

Teofylliinin antiseerumi valmistettiin edellä mainitussa US-patenttihakemuksessa sarja nro 87 819 kuvatulla menetelmällä.

15 Konjugaatin valmistus

Galaktosyyli-umbelliferoni-teofylliini-konjugaatti valmistettiin edellä mainitussa US-patenttihakemuksessa sarja nro 87 819 kuvatulla menetelmällä.

Elementin valmistus 20 Teofylliinispesifisen elementin valmistuksessa käy tetyt liuokset sisälsivät seuraavat aineosat:

Vesiliuos

Aineosa_Määrä

Teofylliiniantiseerumi 400 ^ul 25 Q,5~m bicine-puskuri, pH 8,5 160 "

Vesi 35 " y&-galaktosidaasi (132,7 yks/ml) 5 "

Orgaaninen liuos

Aineosa____ Määrä 30 Metyleenikloridi 1,00 ml

Konjugaatti (771-^uroolaarinen DMS0:ssa) 4,2 ^ul 1 x 1 cam Whatman 31 ET paperi laiminoitiin hopea-Mylarille (3M Co.) ja kiinnitettiin kaksipuolisella teipillä 8,3 x 1 cm:n polystyreenitukiaineelle, tämän jälkeen 35 edellä valmistettu vesiliuos pipetoitiin Whatman 31 ET paperille. Myös muita alla olevia heijastavia kerroksia, esi- 75677 52 merkiksi hopeoituja tai läpinäkymättömiä kerroksia voidaan käyttää. Paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C: ssa 15 minuuttia. Sitten vesiliuoksen kuivatun jäännöksen sisältävälle paperille pipetoitiin orgaaninen liuos ja 5 kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa 15 minuuttia.

Koeliuos

Teofylliiniä lisättiin veteen konsentraatioiksi 0,125, 0,25, 0,50, 1,00, 10,0, 20,0 ja 40,0 ^,ug/ml.

Analyysimenetelmä 10 Edellä kuvatulla tavalla valmistetut tukiaineelle kiinnitetyt analyysieleraentit pantiin mekaaniseen pitimeen, joka sopi asetettavaksi fluorometriin vaakasuoraan asentoon. Juuri ennen elementin ja pitimen sijoittamista fluorometriin elementin valotettavalle pinnalle pipetoitiin 70 ^,ul yhtä 15 edellä kuvatuista teofylliiniliuoksista.

Fluorometri oli säädetty antamaan viritysvalon aaltopituudella 404 nm, joka osui elementtiin 90°:een kulmassa, ja mittaamaan emittoitua valoa aaltopituudella 450 nm. Fluoresenssimittaus suoritettiin 90°reen kulmassa.

2Q Kunkin näytteen fluoresenssivaste mitattiin ensin aikana 0-6 minuuttia ja sitten 6 minuutin kohdalla.

Tulokset

Edellä kuvatulla menetelmällä saadut tulokset on esitetty graafisesti kuviossa 9. Ordinaatan yksiköt on il-25 moitettu millivoltteina.

Johtopäätös

Saaduista tuloksista nähdään, että analyysielementil-lä voidaan kvantitatiivisesti määrittää teofylliini kaikilla kokeilluilla konsentraatioilla.

30 Näissä olosuhteissa antiseerumi inhiboi reaktiota ja tämä inhibiitio voidaan asteittain voittaa lisäämällä teofylliinin konsentraatiota.

Esimerkki X

Palautuvaan kompleksinmuodostukseen perustuva 35 elementti Tässä esimerkissä kuvatuissa kokeissa valmistettiin 53 7 5 6 7 7 yksikerroselementtejä, joita kokeiltiin teofylliinin, karbamatsepiinin, tobramysiinin ja gentamisiinin kvantitatiivisiin määrityksiin fluorometrillä. Seuraavassa taulukossa on ilmoitettu näiden lääkkeiden terapeuttiset seeru-5 mikonsentraatiot ja minimimyrkyllisyystasot: Lääkeaine Terapeuttinen Myrkyllinen _alue_taso__

Teofylliini 10-20 ^g/ml 35 ^g/ml

Karbamatsepiini 4-12 " 15 "

Tobramysiini 5-10 " 12 "

Gentamisiini 5-10 " 12 "

Antiseerumien valmistus ^ Teofylliinin, karbamatsepiinin, tobramysiinin ja gentamisiinin antiseerumit valmistettiin menetelmillä, jotka on kuvattu edellä mainitussa US-patenttihakemuksessa sarja nro 87 819.

Konjugaatin valmistus 2q Galaktosyyli-umbelliferoni-teofylliini, galakto- syyli-umbelliferonikarbamatsepiini, galaktosyyli-umbelli-feroni-tobramysiini ja galaktosyyli-umbelliferoni-sisomi-siini (gentamisiinin analogi) valmistettiin edellä mainitussa US-patenttihakemuksessa sarja nro 87 819 kuvatulla 2g menetelmällä.

Elementin valmistus

Spesifisten teofylliinin, karbamatsepiinin, tobramysiinin ja gentamisiinin yksikerroselementtien valmistukseen käytettiin taulukossa C esitettyjen komponenttien liu-oksia.

54 7 5 6 7 7

•H

β

•H I

•rl ·Η UI

W -P 2 -H —

-H -P H 3 cd (O

g S 3 = NG W rH e: ro Φ \ rows -P g (N ® μ O \ σ> σ\ G <P o * r> 3 ft - CU Ή O (J\ ID 3 Ιί O m Ö CU rl rl —' g ij Tf n

H

g

H I

-H -H W

W -P S -H ^ >i -P H 3 (0 (0 gG 3= NG W H es 3 CP \ 3 w 3

Pg *»· P o \ r- en 3 CU O 'ί Φ 3 Λ -

0 <H O * O) 3 ro O rH TT

- Hcp h n ^gi m : i u cp i

W CP

o -p iH s ro X ro cp h a ui

JA g -H 3 = NW rH SE

3 ro -h -p \ ·· 3 ·“· Λ G -P VO O \ (Λ m 3 P -H G o cm m w - - cö ro -h CP o ·> en S o rt E-l ^ Qj ^ rl H ' ’ Q TT LT) 1 ~rt H n 3 w •H ·Ρ ··

•H -P O

Ή -P rH en

Ή G 3=2 rH SS

>1 CP N Q 3 Ή g \ ^ Λ O 3 o r> 2 - - CP Ή 0-3 O CO'S* h 11 H rl \ ^ in

rH

r-~ r>

rH

•H

— W

in ro - ro 0 | oo 3 •H "H -rl

•H -H -H -P G IS W

-p g p ro -ho. o p 3 -p ro u —· -p 3 prop ·Η x cp cp ro -P λ -h ro 3 cp en 3 p ή o w 3 cp g 3 ro α -H ·η M I X H Oi

g -P S 3 in W W I

0 300 * 3 «m

* < * * o a, >H

55 7 5 6 7 7

Whatman 31 ET paperin 1 x 1 cm suuruiset palaset laminoitiin hopea-Mylarin kanssa ja kiinnitettiin kaksipuolisella teipillä polystyreenitukiaineelle (8,3 x 1 cm). Paperikerroksille pipetoitiin sitten edellä mainittuja 5 liuoksia. Paperit kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa 15 minuuttia.

Koeliuokset

Teofylliiniä, karbamatsepiiniä, tobramysiiniä ja gen-tamisiinia lisättiin veteen liuoksien saamiseksi, joilla oli 10 alla esitetytkonsentraatioalueet: Lääkeaine_Konsentraatioalue

Theofylliini 0,4,0 ^ug/ml

Karbamatsepiini 0-0,4 " 15 Tobramysiini 0-0,6 "

Gentamisiini 0-2,0 "

Analyysimenetelmä

Valmistetut tukiaineille kiinnitetyt analyysiele-20 mentit pantiin kammioon, jossa voitiin pitää vakiokosteus. Ennen kammion sulkemista kullekin analyysielementin valotettavalle pinnalle pipetoitiin 70 ^ul yhtä edellä valmistettua lääkeaineliuosta.

Huoneen lämpötilassa 15 minuutin kuluttua kehitty-25 nyt fluoresenssi mitattiin fluorometrilla, joka oli varustettu mekaanisella pitimellä, joka soveltui analyysi-elementin pitämiseen vaakasuorassa asennossa. Fluorometri oli säädetty antamaan viritysvaloa 90°:seen kulmassa pinnan suhteen aaltopituudella 405 nm ja havaitsemaan emit-30 toitua valoa aaltopituudella 450°. Fluoresenssi-mittaus suoritettiin 90°:een kulmassa.

Tulokset

Edellä kuvatussa menetelmässä saadut tulokset on esitetty graafisesti kuvioissa 10, 11, 12 ja 13 teofyllii-35 nille, karbamatsepiinilie, tobramysiinille ja gentamisii-nille. Ordinaatan yksiköt on ilmaistu millivoltteina.

56 75677

Johtopäätös

Saadut tulokset osoittavat, että integraalisella analyysielementillä voidaan kvantitatiivisesti määrittää kunkin lääkeaineen konsentraatiot. Teofylliinin, karba-5 matsepiinin, tobräitiysiinin ja gentamisiinin konsentraatioi-den korottamisesta on tuloksena vastaavasti analyysielemen-tin fluoresenssin lisääntyminen. Edellä kuvatuissa kokeissa käytettyjen menetelmien ansiosta oli mahdollista sisällyttää kaikki komponentit yhteen ainoaan elementtiin.

10 Esimerkki XI

Kalvomonikerroselementti Tässä esimerkissä kuvatussa kokeessa valmistettiin integraalinen kaksoiskerrosanalyysielementti käyttäen kahta kalvoa jotka sisälsivät substraattimerkityn fluoresens-15 si-immunokokeen komponentit. Elementtiä kokeiltiin teofylliinin kvantitatiivisessa määrityksessä "front face" fluo-rometrilla.

Antiseerumin ja konjugaatin valmistus

Antiseerumin ja konjugaatin valmistus suoritettiin 20 esimerkissä VII kuvatulla tavalla.

Elementin valmistus Käytettiin seuraavia perusliuoksia: 2-%:nen agaroosi (Miles no. 49-051) 0,05-m bicine-pusku-rissa (pH 8,5). Liuotus tapahtui kuumentamalla 100°C:seen, 25 sitten liuos jäähdytettiin termostaatissa 60°C:seen. 10-%:nen Triton X100.

/6-galaktosidaasi (86 yks/ml 0,5-m bicine-puskurissa, pH 8,5.

6,67-%:nen polyvinyylipyrrolidoni (Aldrich nro 85 647-9, 30 keskimääräinen molekyylipaino 360 QQ0) kloroformissa. Galaktosyyli-umbelliferoni-teofylliini (konjugaatti), 6,16-mmolaarinen dimetyylisulfoksidissa.

Teofylliiniantiseerumi ja ^β-galaktosIdaasi lisättiin agaroosiliuokseen 60°C:ssa, jolloin saatiin seuraava 35 koostumus: 57 7 5 6 7 7

Komponentti_ Määrä

Agaroosiliuos 0,25 ml

Teofylliiniantiseerumi 0,75 " β-galaktosidaasi 0,03 " 5 Triton X100 0,01 "

Antiseerumi kuumennettiin ennen lisäämistä 60°C: seen. Tavanomaisella spaattelilla levitettiin polyesteri-levylle (3M Co., tyyppi 2352) 2,5 cm leveä kalvo, joka kui-10 vuessaan muodosti 0,5 cm paksuisen kalvon. Geeliytynyt kalvo kuivattiin 10 minuuttia 47°C:ssa.

Ensimmäisen kalvon päälle levitettiin spaattelilla toinen kuivana 0,005 cm:n kalvo. Se sisälsi konjugaattia polyvinyylipyrrolidonin (PVP) kloroformi-liuoksessa. Sillä 15 oli seuraava koostumus:

Komponentti_ Määrä_ PVP:n kloroformiliuos 0,4 ml

Kloroformi 0,6 " 20 Konjugaattiliuos 0,015 ml

Kalvo kuivattiin huoneen lämpötilassa. Polyesteri-levy kiinnitettiin hopeoidulle Mylarille kaksipuolisella teipillä. Tämän materiaalin kappaleita (5,5 x 1 cm) kiinni-25 tettiin jälleen kaksipuolisella teipillä polystyreenikan-tajalle.

Koeliuos

Teofylliinistä valmistettiin 0,05-m bicine-pusku-riin (pH 8,5) liuokset, joiden konsentraatiot olivat 1, 2, 30 4, 8 ja 10 ^ug/ml.

Analyysimenetelmä 30 yUl yhtä koeliuoksista pantiin edellä kuvatulle analyysielementille ja fluoresenssi mitattiin 5 minuutin kuluttua. Mittaus suoritettiin esimerkissä X kuvatulla ta-35 valla.

75677 58

Tulokset

Saadut tulokset on esitetty graafisesti kuviossa 14. Fluoresenssi on esitetty mielivaltaisina yksikköinä teofylliinikonsentraation funktiona.

5 Johtopäätös

Tulokset osoittavat, että immunokokeen yhteensopimattomat reagenssit voidaan etukäteen koota analyysiele-menttiin monikerroskalvoksi, jossa ei tapahdu kokeen aineosien ennenaikaista reaktioita, ja jolla voidaan kvantita-10 tiivisesti määrittää näytteen lisäämisen jälkeen analysoitava aine.

C. Fluoresenssin sammuttamiseen perustuvat immuno-koelaltteet

Esimerkki XII

15 Tässä kokeessa valmistettiin yksikerroselementti, jolla kokeiltiin kvantitatiivista teofylliinin määrittämistä "front face" fluorometrillä suoritetulla suoraan fluoresenssin sammuttamiseen perustuvalla fluoroimuunokokeella.

Antiseerumin valmistus 20 Teofylliinin antiseerumi valmistettiin edellä maini tussa US-patenttihakemuksessa sarja nro 87 819 kuvatulla menetelmällä.

Konjugaatin valmistus

Umbelliferoni-teofylliini (konjugaatti) valmistet-25 tiin hydrolysoimalla galaktosyyli-umbelliferoni-teofylliini (GUT) ^-galaktosidaasilla. GUT valmistettiin edellä mainitussa US-patenttihakemuksessa sarja nro 87 819 kuvatulla menetelmällä.

Elementin valmistus 30 Teofylliinin spesifisen elementin valmistuksessa käy tettiin seuraavia liuoksia:

Vesiliuos

Komponentti Määrä

Teofylliiniantiseerumi 50 ^ul 35 Vesi 30 " 0,5-m bicine, pH 8,5 20 " 59 7 5 6 7 7

Orgaaninen liuos

Komponentti_Määrä_

Tolueeni 1,00 ml

Konjugaatti (0,16-mmolaarinen 5 tolueeniliuos) 4 ,ul 1 x 1 cm Whatman 31 ET paperi laminoitiin hopeoidun Mylarin kanssa ja kiinnitettiin kaksipuolisella teipillä 8,3 x 1 cm suuruiselle polystyreenipohjalle. Pape-10 rille pipetoitiin 20 ^ul edellä valmistettua vesiliuosta. Myös muunlaiset heijastavat hopeoidut tai läpikuultamat-tomat kerrokset sopivat alla oleviksi kerroksiksi. Paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 40°C:ssa 20 minuuttia. Vesi-liuoksen kuivatun jäännöksen sisältävälle paperille pipe-15 toitiin sitten 20 ^,ul orgaanista liuosta ja paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa 15 minuuttia.

Koeliuos

Teofylliinistä valmistettiin veteen liuokset, joiden konsentraatiot olivat 0,125, 0,25, 0,50, 1,00, 10,0, 20,0 20 ja 40,0 yug/ml.

Analyysimenetelmä

Edellä valmistettu ja tukiaineelle kiinnitetty ana-lyysielementti asetettiin mekaaniseen pitimeen, joka sopi vaaka-asentoon fluorometriin. Juuri ennen elementin ja pi-25 timen asettamista fluorometriin elementille pipetoitiin 70 yul yhtä edellä valmistetuista teofylliiniliuoksista.

Fluorometri oli säädetty antamaan viritysvaloa 90°C: seen kulmassa elementin pinnan suhteen aaltopituudella 405 nm ja mittaamaan emittoitua valoa aaltopituudella 450 nm. 30 Fluoresenssimittaus suoritettiin 9Q°:een kulmassa.

Fluoresenssi mitattiin 2 minuutin kuluttua.

Tulokset

Edellä kuvatussa kokeessa saadut tulokset on esitetty kuviossa 15. Ordinaatan yksiköt on ilmoitettu sammumis-%:na. 35 Johtopäätös

Analyysielementiliä saadut tulokset osoittavat, että 60 75677 analyysielementillä voidaan kvantitatiivisesti määrittää kaikista kokeilluista näytteistä teofylliinipitoisuus.

Näissä olosuhteissa fluoresenssi sammuu antiseerumin läsnäollessa ja sammuminen voidaan progressiivisesti estää 5 lisäämällä teofylliinikonsentraatiota.

D. Entsyymimerklttyjä immunokoelaitteita

Esimerkki XIII

Tässä esimerkissä kuvatussa kokeessa suoritettiin teofylliinin entsyymimerkitty homogeeninen immunokoe kaik-10 ki tarvittavat aineosat sisältävällä monikerroselementiliä.

Antiseerumi

Teofylliinin antiseerumi saatiin Syvä Company'n (Palo Aito, Kalifornia) toimittamasta EMIT R-aad teofylliinikoe-pakkauksesta.

15 Konjuqaatin valmistus G6PDH-teofylliini (konjugaatti) saatiin samoin EMIT-aad teofylliinikoepakkauksesta.

Elementin valmistus

Yksikerros-teofylliini-spesifisen elementin yhden 20 kerroksen valmistuksessa käytetty liuos oli reagenssi A:ksi (sisältää teofylliinin antiseerumia ja entsyymisubstraattia) nimitetty EMIT-aad teofylliinikoepakkauksen liuos (Syvä Company).

0,5 x 1,0 cm Whatman 54 paperi (Whatman, Inc., Clif-25 ton, NJ) kiinnitettiin kaksipuolisella teipillä polystyree-nialustalle (8,2 x 0,5 cm), ja paperille pipetoitiin 10 ^ul edellä olevaa liuosta. Paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 10 minuuttia.

Valmistettiin toinen liuos sekoittamalla yhtä suuret 30 tilavuusosat diaforaasi/p-jodinitrotetratsoliumvioletti(INT)-liuosta (1,5 mg diaforaasia ja 1 mg INT 2,5 ml:ssa 0,055-m tris(hydroksimetyyli)aminometaanipuskuria, pH 7,9) ja EMIT-aad koepakkaukseen kuuluvan reagenssin B liuosta (joka sisältää entsyymimerkittyä teofylliinikonjugaattia). Toista 35 liuosta pipetoitiin 20 ^ul 0,6 x 1,0 cm Whatman 54 paperille. Impregnoitu paperi kuivattiin kiertoilmauunissa 50°C:ssa 10 minuuttia.

ei 75677

Toinen kerros kiinnitettiin toisesta päästään ensimmäiseen kaksipuolisen teipin liuskalla.

Koeliuos

Teofylliiniä lisättiin veteen lopullisiksi liuos-5 konsentraatioiksi 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 ja 40 ^ug/ml.

Analyysimenetelmä

Edellä valmistetut polystyreenitukiaineelle kiinnitetyt analyysielementit pantiin kukin vaaka-asentoon ref-lektanssifotometrin mekaaniseen pitimeen. Juuri ennen ele- 10 mentin ja pitimen sijoittamista fotometriin pipetoitiin kunkin elementin valotettavalle pinnalle 50 ^ul edellä valmistettuja teofylliiniliuoksia. Fotometri oli säädetty seuraamaan reflektanssin muutosta aaltopituudella 50Q nm.

Kunkin elementin reflektanssi mitattiin ensin aikana 15 0-200 sekuntia, ja lukemat otettiin 200 sekunnin kuluttua 2 (K/S = (1-R) /2R, jossa R on reflektanssi).

Tulokset Tällä menetelmällä saadut tulokset on esitetty graafisesti kuviossa 16.

20 Johtopäätös

Tulokset osoittavat, että integraalisella analyysi-elementillä saadaan puolikvantitatiivisesti määritettyä kokeiltujen teofylliiniliuosten konsentraatiot.

Claims (18)

62 7 5 6 7 7

1. Koelaite ligandin määrittämiseksi nestenäyttees-tä homogeenisella immunokokeella, joka koelaite käsittää 5 (1) kiinteän kantajajäsenen, joka on absorbentti neste- näytteelle, ja (2) tähän kantajajäseneen sisällytetyn rea-genssikoostumuksen, joka sisältää (i) ligandin vasta-ainetta tai muuta luonnossa esiintyvää ligandin sitomisproteii-nia ja (ii) ligandin konjugaattia tai tämän analogia, jota 10 vasta-aine tai muu sitomisproteiini pystyy myös sitomaan, kovalenttisesti liittyneenä merkintäaineeseen, joka on todettavissa sähkömagneettisen signaalin avulla, joka signaali on erilainen silloin, kun merkitty konjugaatti on sitoutunut vasta-aineeseen tai muuhun sitomisproteiiniin, 15 kuin silloin, kun se ei ole siten sitoutunut, jolloin signaali on näytteessä olevan ligandimäärän funktio, tunnettu siitä, että kiinteään kantajajäseneen on sisällytetty mainittu vasta-aine tai muu sitomisproteiini ja mainittu merkitty konjugaatti oleellisesti toisiinsa si-20 toutumattomina ja että laite on tehty sisällyttämällä kan tajaan ensimmäisessä nesteessä toinen reagensseista, jotka ovat mainittu konjugaatti ja mainittu vasta-aine tai sitomisproteiini, ja kuivaamalla kantaja, ja sen jälkeen joko (A) sisällyttämällä kantajaan toinen mainituista rea-25 gensseista vettä sisältämättömässä nesteessä ja kuivaamalla kantaja tai (B) esijäähdyttämällä kantaja, sisällyttämällä kantajaan toinen reagensseista, jotka ovat mainittu konjugaatti ja vasta-aine tai sitomisproteiini, toisessa nesteessä, saattamalla kantaja lämpötilaan, jossa toinen 30 neste jäätyy, ja lyofilisoimalla kantaja. 63 75677

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että mainitut reagenssit sisältyvät mainittuun kantajajäseneen olennaisen tasaisesti jakautuneina.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen laite, 5 tunnettu siitä, että mainittu kantajajäsen on kangas-matriisi, joka koostuu luonnonkuiduista tai synteettisistä polymeerikuiduista.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen laite, tunnettu siitä, että mainittu kantajajäsen on poly- 10 meerikalvo tai -geeli.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen laite, tunnettu siitä, että mainittu merkintäaine on osallistuja entsymaattisessa reaktiossa, joka aikaansaa mainitun sähkömagneettisen signaalin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen laite, tunnet- t u siitä, että mainittu merkintäaine on entsyymin substraatti, joka entsyymi on osana mainittuun kantajajäseneen sisältyvää reagenssikoostumusta ja pystyy vaikuttamaan mainittuun substraattiin siten, että syntyy sähkömagneettisen signaa-

20 Iin avulla havaittava tuote.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen laite, tunnet-t u siitä, että mainittu merkintäaine on prosteettinen ryhmä, joka yhtyy apoentsyymiin muodostaen aktiivisen entsyymin, joka apoentsyymi on osana mainittuun kantajajäseneen 25 sisältyvää reagenssikoostumusta.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen laite, tunnet-t u siitä, että mainittu merkintäaine on flaviiniadeniini-dinukleotidi ja mainittu apoentsyymi on apoglukoosioksidaasi.

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen laite, tunnet- 30. u siitä, että mainittu merkintäaine on entsyymi tai entsyymin inhibiittori.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen laite, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi säteilyä heijastavan kerroksen ja tukikerroksen, jolloin reagenssit 35 on sisällytetty säteilyä läpäisevään reagenssikerrokseen ja säteilyä heijastava kerros on säteilyä läpäisemätön heijastava kerros, joka on (a) sijoitettu reagenssikerroksen ja 64 75677 tukikerroksen väliin; (b) ligandia, reagenssikerroksen rea-gensseja ja niiden välisten reaktioiden tuotteita läpäisemätön; ja (c) ligandin, reagenssikerroksen reagenssien ja niiden välisten reaktioiden tuotteiden suhteen inertti.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen laite, tun nettu siitä, säteilyä heijastava kerros sisältää säteilyä läpäisemättömän peilipinnan.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukainen laite, tunnettu siitä, että mainittu sähkömagneettinen 10 signaali on fluoresenssi.

13. Menetelmä ligandin määrittämiseksi tutkittavasta nestenäytteestä, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) mainittu näyte saatetaan kosketukseen koelaitteen 15 kanssa, joka koelaite käsittää (1) kiinteän kantajajäsenen, joka on absorbentti nestenäytteelle, ja (2) tähän kantaja-jäseneen sisällytetyn reagenssikoostumuksen, joka sisältää (i) ligandin vasta-ainetta tai muuta luonnossa esiintyvää ligandin, sitomisproteiinia ja (ii) ligandin konju-20 gaattia tai tämän analogia, jota vasta-aine tai muu sito-misproteiini pystyy myös sitomaan, kovalenttisesti liittyneenä merkintäaineeseen, joka on todettavissa sähkömagneettisen signaalin avulla, joka signaali on erilainen silloin, kun merkitty konjugaatti on sitoutunut vasta-aineeseen tai 25 muuhun sitomisproteiiniin, kuin silloin, kun se ei ole siten sitoutunut, jolloin signaali on näytteessä olevan li-gandimäärän funktio, ja b) mitataan syntyvä sähkömagneettinen signaali kanta-jajäseneltä erottamatta vasta-aineen tai sitomisproteiinin 30 sitomaa merkittyä konjugaattia fysikaalisesti konjugaatis- ta, joka jää sitoutumatta, tunnettu siitä, että kiinteän kantajajäseneen on sisällytetty mainittu vasta-aine tai muu sitomisproteiini ja mainittu merkitty konjugaatti oleellisesti toisiinsa sitoutumattomina ja että laite on 35 tehty sisällyttämällä kantajaan ensimmäisessä nesteessä toinen reagensseista, jotka ovat mainittu konjugaatti ja 65 7 5 6 7 7 mainittu vasta-aine tai sitomisproteiini, ja kuivaamalla kantaja, ja sen jälkeen joko (A) sisällyttämällä kantajaan toinen mainituista reagensseista vettä sisältämättömässä nesteessä ja kuivaamalla kantaja tai (B) esijäähdyttämäl-5 lä kantaja, sisällyttämällä kantajaan toinen reagensseis ta, jotka ovat mainittu konjugaatti ja vasta-aine tai sitomisproteiini, toisessa nesteessä, saattamalla kantaja lämpötilaan, jossa toinen neste jäätyy, ja lyofilisoimal-la kantaja.

14. Jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mukainen koe laite käytettäväksi tutkittavan nestenäytteen analysoinnissa.

15. Menetelmä nestenäytteessä olevan ligandin määrittämiseen käytettävän koelaitteen valmistamiseksi reagenssien useampikertaisella sisällyttämisellä kiinteään kantajajäse-15 neen, joka koelaite käsittää (1) kiinteän kantajajäsenen, joka on absorbentti nestenäytteelle, ja (2) tähän kantaja-jäseneen sisällytetyn reagenssikoostumuksen, joka sisältää (i) ligandin vasta-ainetta tai muuta luonnossa esiintyvää ligandin sitomisproteiinia ja (ii) ligandin konjugaattia 20 tai tämän analogia, jota vasta-aine tai muu sitomisproteiini pystyy myös sitomaan, kovalenttisesti liittyneenä merkintä-aineeseen, joka on todettavissa sähkömagneettisen signaalin avulla# joka signaali on erilainen silloin, kun merkitty konjugaatti on sitoltunut vasta-aineeseen tai muuhun sito-25 misproteiiniin, kuin silloin, kun se ei ole sitoutunut, jol loin signaali on näytteessä olevan ligandimäärän funktio, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: a) kantajaan sisällytetään ensimmäisessä nesteessä toinen reagensseista, jotka ovat mainittu merkitty konju- 30 gaatti ja mainittu sitomispartneri, ja sen jälkeen b) kantajaan sisällytetään vedettömässä nesteessä toinen mainituista reagensseista, jotka ovat merkitty konjugaatti ja sitomispartneri, ja kantaja kuivataan, jolloin merkittyä konjugaattia ja sitomispartneria ei viedä yhdessä sa- 35 maan ympäristöön, joten niiden välinen sitoutumisreaktio olennaisesti estyy ja kantajaan on siten sisällytetty mainittu vasta-aine tai muu sitomisproteiini ja mainittu mer-• kitty konjugaatti olennaisesti toisiinsavsitoutumattomina. 75677 66

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa a) kantajaan sisällytetään mainitun sitomispartnerin vesiliuos tai -suspensio ja kantaja kuivataan ja vaiheessa b) kantajaan sisällytetään mai- 5 nitun merkityn konjugaatin liuos orgaanisessa liuottimessa ja kantaja kuivataan.

17. Lyofilisointimenetelmä nestenäytteessä olevan ligandin määrittämiseen käytettävän koelaitteen valmistamiseksi, joka koelaite käsittää (1) kiinteän kantajajäsenen, joka 10 on absorbentti nestenäytteelle, ja (2) tähän kantajajäseneen sisällytetyn reagenssikoostumuksen, joka sisältää (i) ligan-din vasta-ainetta tai muuta luonnossa esiintyvää ligandin sitomisproteiinia ja (ii) ligandin konjugaattia tai tämän analogia, jota vasta-aine tai muu sitomisproteiini pystyy 15 myös sitomaan kovalenttisesti liittyneenä merkintäaineeseen, joka on todettavissa sähkömagneettisen signaalin avulla, joka signaali on erilainen silloin, kun merkitty konjugaatti on sitoutunut vasta-aineeseen tai muuhun sitomisproteiiniin, kuin silloin, kun se ei ole sitoutunut, jolloin signaali 20 on näytteessä olevan ligandimäärän funktio, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) kantajaan sisällytetään ensimmäisessä nesteessä joko mainittu merkitty konjugaatti tai mainittu sitornispartne-ri; 25 b) kantaja kuivataan; c) kantaja esijäähdytetään ja siihen sisällytetään toinen mainituista reagensseista eli merkitty konjugaatti tai sitomispartneri toisessa nesteessä; d) kantaja saatetaan lämpötilaan, jossa toinen neste 30 jäätyy; e) kantaja lyofilisoidaan, jolloin merkittyä konjugaattia ja sitomispartneria ei viedä yhdessä samaan ympäristöön merkittäväksi ajanjaksoksi, joten niiden välinen si-toutumisreaktio on olennaisesti estynyt ja kantajajäseneen 35 sisällytetään siten mainittu vasta-aine tai muu sitomisproteiini ja mainittu merkitty konjugaatti olennaisesti toisiinsa sitoutumattomina. 67 7 5 6 7 7

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekä ensimmäinen että toinen neste ovat vesipitoiset. 68 75677