JP4896869B2 - 免疫測定法及びその試薬 - Google Patents

Description

本発明は、多糖類や蛋白質（たとえば糖化蛋白）等の高分子化合物だけでなく、ホルモンやペプチド等の低分子化合物を高感度に検出可能な目的とする抗原の免疫測定法及びその試薬組成物に関する。

ホルモンやペプチド等の低分子化合物の高感度検出法として有用なホモジニアス競合ＥＩＡ法のうち、アポ酵素の再活性化を利用した免疫測定法において、従来、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースオキシダーゼがアポ酵素として使用されている（特許文献１、非特許文献１〜３）。
しかし、非特許文献３においては、グルコースオキシダーゼを用いた方法におけるトリニトロトルエンの検出限界は５μｇ／ｌ（５ｎｇ／ｍｌ）であったと記載されているとおり、充分な感度が得られないため測定対象が限られるという問題があった。
また、基質として添加するグルコース以外に、被検体に由来するグルコースと遊離ＦＡＤなど、内因性の基質や補酵素とアポ酵素が反応し、非特異的に過酸化水素が発生して検出試薬と反応してしまう為、ブランクが変化する等の問題もあった。
特開昭５５−２９９７号公報 Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８１，６５８−６６５ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８３，４１３−４２５ Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，Ｖｏｌ．３６１，１７４−１７８

本発明の目的は、反応特異性が高く、感度が高い新たな免疫測定法を提供することにある。

本発明者らは、アポ酵素の再活性化を用いた免疫測定法に、従来使用されていなかったアポＤ−アミノ酸オキシダーゼを適用し、生体内にほとんど存在しないＤ−アミノ酸を基質とすることによって、反応特異性が向上すること、またＤ−アミノ酸の種類を選択することによって測定法の感度をコントロールすることができる結果、目的とする抗原の被検体中の存在量に応じた測定が可能になることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
（１）被検体に目的とする抗原に対する特異的抗体、補酵素で標識した目的とする抗原、アポＤ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸及びオキシダーゼ系によって産生する過酸化水素を検出する試薬を同時または順次共存させることを特徴とするアポ酵素の再活性化を用いた目的とする抗原の免疫測定法；
（２）用いるＤ−アミノ酸の種類を選択することによって、測定感度を調節する（１）記載の免疫測定法；
（３）Ｄ−アミノ酸として、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇの各Ｄ体からなる群より選ばれる１以上のＤ−アミノ酸を使用する（１）又は（２）記載の免疫測定法を提供するものである。

また、本発明は、
（４）目的とする抗原に対する特異的抗体、補酵素で標識した目的とする抗原、アポＤ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸及びオキシダーゼ系によって産生する過酸化水素を検出する試薬を含有する免疫測定試薬組成物；
（５）用いるＤ−アミノ酸の種類を選択することによって、測定感度を調節した（４）記載の免疫測定試薬組成物；
（６）Ｄ−アミノ酸として、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇの各Ｄ体からなる群より選ばれる１以上のＤ−アミノ酸を使用した（４）又は（５）記載の免疫測定試薬組成物を提供するものである。

本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼによれば、基質がＤ−アミノ酸という生体内にはほとんど存在しないアミノ酸であることから、内因性基質の影響を受けず、高い反応特異性が得られる。また、Ｄ−アミノ酸の種類を選択することによって測定法の感度をコントロールすることができる。それ故、被検体中の目的とする抗原の存在量に応じた測定が可能となり、本発明方法は、特にホルモンやペプチド等の低分子化合物の測定に有用である。

ＦＡＤ標識テストステロンの構造式である。 過酸化水素を検出する試薬としてパーオキシダーゼと被酸化性発色剤を利用した場合の反応系のモデルを示す図である。 Ｄ−アミノ酸としてＤ−バリンを用いた場合の反応タイムコースを示す図である。 Ｄ−アミノ酸としてＤ−バリンを用いた場合の検量線を示す図である。 本発明方法により、テストステロンを測定した場合の検量線を示す図である。

本発明に用いられるアポＤ−アミノ酸オキシダーゼは、１９６０年代にその存在と機能が解明されており、Ｄ−アミノ酸を特異的に酸化するＤ−アミノ酸オキシダーゼのアポ体である。アポＤ−アミノ酸オキシダーゼとしては、ブタ腎臓から抽出・精製されたものが知られており好適に使用できる。例えば、ＣＡＬＺＹＭＥ社より市販されているものが使用できる他、当該酵素を遺伝子組換え技術により得たものでも良い。また、微生物に由来するものの例としては、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を発現させた株（文献：Ａ，Ｉｓｏａｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ.８０，Ｎｏ．１，２２−３２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ５，２００２））、また、Ｆｕｓａｒｉｕｍｅ ｑｕｉｓｅｔｉ由来のもの（文献：Ｔ，Ｅｓａｋｉら、Ｆｌａｖｉｎｓ ａｎｄ Ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９３）等が知られている。

前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼの補酵素は、フラビンジヌクレオチドであり、より具体的にはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である。抗原を補酵素で標識するには、例えば前記非特許文献３記載の方法、Ｄ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．の方法（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，ｐｐ６５８−６６５（１９８１））、Ｔ．Ｊ．Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．の方法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，ｐｐ１４９９−１５０４（１９８１））、及び特開昭５５−２９９６号等に記載された方法に準じて作成することができる。図１にＦＡＤ標識した抗原の例としてテストステロン−３−ＣＭＯのＦＡＤ標識体を示す。
また、補酵素と抗原との結合部位は、抗体と該抗原の結合反応を阻害しない部位を選択するのが好ましい。

抗原としては、低分子蛋白質、ホルモン、ペプチド、ビタミンや薬剤等の低分子化合物が挙げられる。具体的には、低分子蛋白質としてインシュリン、レニン、ホルモンとしては、甲状腺関係ではトリヨードサイロニン（Ｔ３）、血清総サイロキシン（Ｔ４）などが、副腎皮質関係では１７−ＯＨＣＳ（ヒドロキシコルチコイド）、コルチゾール、アルドステロン、コルチコステロン、１８−ＯＨ−デオキシコルチコステロン（１８−ＯＨ−ＤＯＣ）、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、アンドロステンジオン、プレグネノロンなどが、性腺・胎盤関係ではエストロゲン３分画（エストロン、エストラジオール、エストリオール）、ＨＣＧ、プロゲステロン、プレグナンジオール、テストステロン、５αジヒドロテストステロンなどが、ペプチド・アミノ酸系としては、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、サイクリックＡＭＰ、サイクリックＣＭＰ、エンドセリン−１、ヒスタミン、カルニチン分画などがそれぞれ挙げられる。また、ペプチドとしてはＢＮＰなど、ビタミンとしては、葉酸、ビタミンＡ、β−カロチン、ビタミンＢ群、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、１，２５−（ＯＨ）_２ビタミンＤ、ビタミンＥ、ニコチン酸（ナイアシン）などが挙げられる。骨代謝関係物質としては、オステオカルシン、尿中デオキシピリジノリンなどがある。薬物としては、フェノバルビタール、プリミドン、フェニトイン、カルバマゼピン、バルプロ酸、ゾニサミド、トリメタジオン、クロナゼパム、ニトラゼパム、ジアゼパム、アセタゾールアミドなどの抗てんかん剤、ハロペリドール、ブロムペリドールなどの精神神経用剤、ジゴキシン、ジギトキシンなどの強心剤、リドカイン、キニジン、プロカインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、アプリンジン、プロプラノロールなどの不整脈用剤、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バンコマイシン、アミカシンなどの抗生物質製剤、その他アセトアミノフェン、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、テオフィリン、リバビリンなどがそれぞれ挙げられる。

またこれらの抗原を含む被検体としては、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、精液、及び膣分泌液の他、粘膜、粘膜細胞、骨髄、及び毛髪などから抽出・分泌されたものが挙げられる。

抗体としては、目的とする抗原を含む被検体に対する特異的抗体であればよく、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。目的とする抗原がホルモンやペプチド等の低分子化合物である場合には、当該抗原に高分子、例えばＢＳＡ（牛血清アルブミン）やｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）を結合させて免疫して抗体を取得する方法や、ファージディスプレイ法など必要に応じた手法を選択できる。

Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの基質となるＤ−アミノ酸としては、各種のＤ−アミノ酸が使用でき、ペプチドを構成するアミノ酸のＤ体が好ましい。具体的には、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ等のアミノ酸の各Ｄ体が挙げられる。用いるＤ−アミノ酸の種類を適宜選択することにより、目的とする抗原の被験対中の存在量に応じて測定法の感度を調整できる。

オキシダーゼ系によって産生する過酸化水素を検出する試薬としては、電極法用の試薬や比色法用の試薬から適宜選択できる。電極法用の試薬は、過酸化水素を電極で検知するための試薬であり、パーオキシダーゼを含む。一方、比色法用の試薬は、過酸化水素に対応する量の色素量の増減を吸光度計で測定するための試薬であり、パーオキシダーゼと色素を含む。比色法用の試薬としては、一般的にパーオキシダーゼと被酸化性発色剤を利用した方法が知られており、好適に用いることができる。例えば、自動分析測定装置に適用する測定系としては、トリンダー系の発色試薬が良く使われているが、１分子発色剤のＴＰＭ−ＰＳ、ＴＭＢＺ−ＰＳなども利用できる。また、前記のような比色測定のほか、蛍光や発光測定に導き測定することができる。なお、抗体をメンブラン上に固定して置き、同様な反応系を使えば、ＰＯＣＴ試薬としても利用することができる。オキシダーゼ系によって産生する過酸化水素を検出する試薬としてパーオキシダーゼと被酸化性発色剤を利用した場合の反応系のモデルを図２に示す。

図２において、まず、ＦＡＤ標識した抗原を抗体と結合させる。そこに、親和性の差を利用して抗原を競合させるとＦＡＤ標識抗原が遊離し、そのＦＡＤ部分がアポＤ−アミノ酸オキシダーゼと結合する。アポＤ−アミノ酸オキシダーゼは、ＦＡＤ標識抗原が結合することによって酵素活性を示し、それによって基質のＤ−アミノ酸が酸化されて過酸化水素が発生する。以下、パーオキシダーゼによる過酸化水素を利用した反応が進行し、被酸化性発色剤が発色することで、最終的にその発色度を測定することで抗原濃度の測定が可能となる。

本発明の免疫測定法は、前記の成分及び試薬を同時に反応させてもよいし、順次共存させることにより反応させてもよい。反応温度は５〜４０℃程度でよく、反応にあたっては種々の緩衝液、例えばＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｇｏｏｄ’ｓ緩衝液など、いずれも適用可能であるが、試薬組成物の性質に合わせて選択して、使用することができる。測定法の例としては、検体とＦＡＤ標識した目的とする抗原を混合し、該抗原に対する特異的抗体と接触させた後、遊離のＦＡＤ標識した目的とする抗原とアポＤ−アミノ酸オキシダーゼを反応させ、ＦＡＤで活性化したＤ−アミノ酸オキシダーゼによりＤ−アミノ酸から過酸化水素を発生させ、それをパーオキシダーゼ及び被酸化性発色剤を含む検出系に導き反応させ、生じる吸光度変化を分光光度計を用いて測定すればよい。自動分析装置などで順次反応させる場合には、（１）検体、（２）ＦＡＤ標識した目的とする抗原、目的とする抗原に対する抗体及び被酸化性発色剤を含む試薬（Ｒ１）、（３）アポＤ−アミノ酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼを含む試薬（Ｒ２）の順序に従って混合させ、反応させるのが好ましい。

本発明の免疫測定法は、ホモジニアス競合ＥＩＡ法とするのが好ましく、自動分析測定装置に適用可能である。例えば、日立７１７０形自動分析装置の場合、測定波長は用いる被酸化性発色剤に応じて適宜設定し、検体量１５μｌ、試薬分注量（Ｒ１）１５０μｌ、試薬分注量（Ｒ２）７５μｌに設定し、エンドポイント測定法の２ポイントエンドモードで、測光ポイントを１６−３４として測定すれば良い。但し、前記の検体量や試薬分注量は、これに限られるものではなく、その試薬組成により、適宜設定することができる。

本発明の免疫測定試薬は前記成分を含有すればよく、溶液状態だけでなく、全成分あるいは一部成分が凍結乾燥品の形で供給され、溶解液で該凍結乾燥品を溶解して最終的に作製されても構わない。この際に該組成物は、凍結乾燥品に含有されていても溶解液の側に含有されていても更にその両者に含有されていても構わない。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。

実施例１
１）アポＤ−アミノ酸オキダーゼのＦＡＤを用いた活性化確認と基質特異性
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）、５ｍＭ Ｄ−アミノ酸を含む試薬１、１０Ｕ／ｍｌ アポＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＣＡＬＺＹＭＥ社製ＣＡＴＡＬＯＧ＃：１７６Ａ００２５）、５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼを含む試薬２及び検体としてＦＡＤ水溶液を用い、日立７１７０形自動分析装置にて、２ポイントエンドモードで検体：７μｌ、Ｒ１：１８０μｌ、Ｒ２：９０μｌ、測定波長７００ｎｍのパラメーターにより検討した。Ｄ−アミノ酸をＤ−バリンとした際の反応タイムコース（図３）及びその検量線（図４）を示す。

２）各種Ｄ−アミノ酸による反応性比較
１）で、アポ酵素を再構成して酵素活性を確認できたので、次にＤ−アミノ酸の種類のみを変更して測定を実施した。Ｄ−アミノ酸としては、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇの各Ｄ体を用いた。Ｄ−バリンの場合を１００として計算した前記各種Ｄ−アミノ酸の反応性％を表１にまとめた。

表１より、用いるＤ−アミノ酸の種類により、該酵素の基質に対する相対反応性に幅があることが判る。この性質を利用すれば測定の感度が調整できることが判明した。

実施例２
（テストステロン抗体を用いたテストステロンの測定）
試薬１としては、実施例１試薬中のアミノ酸として、Ｄ−バリン、Ｄ−チロシン、及びＤ−プロリンをそれぞれ用い、更に０．１１５μＭのＦＡＤ標識テストステロン、及びテストステロンに対する抗体（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ社製ｃｌｏｎｅ ｎｕｍｂｅｒ：Ａ５３０７０１４８Ｐ）を１ｍｇ／ｍｌを加えた試薬を用いた。試薬２は、実施例１と同一である。測定条件は、日立７１７０形自動分析装置にて、検体量１５μｌ、試薬分注量（Ｒ１）１５０μｌ、試薬分注量（Ｒ２）７５μｌに設定し、エンドポイント測定法の２ポイントエンドモードで、測光ポイントを１６−３４、測定波長７００ｎｍとし、測定した。検体をテストステロンとした場合の検量線を図５に示す。図５に示した如く良好な検量線が得られ、Ｄ−アミノ酸の種類を変更することで測定法の感度が調整できることが判る。

Claims (8)

1. 被検体に、目的とする抗原に対する特異的抗体、補酵素で標識した目的とする抗原、アポＤ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸及びオキシダーゼ系によって産生する過酸化水素を検出する試薬を同時または順次共存させることを特徴とするアポ酵素の再活性化を用いた目的とする抗原の免疫測定法。
2. 補酵素がフラビンジヌクレオチドである請求項１記載の免疫測定法。
3. 用いるＤ−アミノ酸の種類を選択することによって、測定感度を調節する請求項１又は２記載の免疫測定法。
4. Ｄ−アミノ酸として、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇの各Ｄ体からなる群より選ばれる１以上のＤ−アミノ酸を使用する請求項１〜３のいずれか１項記載の免疫測定法。
5. 目的とする抗原に対する特異的抗体、補酵素で標識した目的とする抗原、アポＤ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸及びオキシダーゼ系によって産生する過酸化水素を検出する試薬を含有する免疫測定試薬組成物。
6. 補酵素がフラビンジヌクレオチドである請求項５記載の免疫測定試薬組成物。
7. 用いるＤ−アミノ酸の種類を選択することによって、測定感度を調節した請求項５又は６記載の免疫測定試薬組成物。
8. Ｄ−アミノ酸として、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇの各Ｄ体からなる群より選ばれる１以上のＤ−アミノ酸を使用した請求項５〜７のいずれか１項記載の免疫測定試薬組成物。

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