JPH0970297A - Ｄ−アラニンの定量方法 - Google Patents
Ｄ−アラニンの定量方法Info
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- JPH0970297A JPH0970297A JP25015495A JP25015495A JPH0970297A JP H0970297 A JPH0970297 A JP H0970297A JP 25015495 A JP25015495 A JP 25015495A JP 25015495 A JP25015495 A JP 25015495A JP H0970297 A JPH0970297 A JP H0970297A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 検体にＤ−アミノ酸オキシダーゼを添加し
て、ピルビン酸を発生させ、生成したＮＡＤＨと乳酸デ
ヒドロゲナーゼを添加して、ピルビン酸を乳酸に、ＮＡ
ＤＨをＮＡＤに変換し、単位時間に消費されるＮＡＤＨ
を測定してＤ−アラニンを定量する方法において、測定
系に乳酸オキシダーゼを存在させて乳酸をピルビン酸に
変換するサイクリング反応を成立させることを特徴とす
るＤ−アラニンの定量方法。 【効果】 従来のＨＰＬＣ法に比べてより簡単に短時間
でＤ−アラニンを正確に測定できる。また、従来の酵素
法では不可能であった体液中のＤ−アラニンの測定が本
発明の測定方法により初めて可能になった。
て、ピルビン酸を発生させ、生成したＮＡＤＨと乳酸デ
ヒドロゲナーゼを添加して、ピルビン酸を乳酸に、ＮＡ
ＤＨをＮＡＤに変換し、単位時間に消費されるＮＡＤＨ
を測定してＤ−アラニンを定量する方法において、測定
系に乳酸オキシダーゼを存在させて乳酸をピルビン酸に
変換するサイクリング反応を成立させることを特徴とす
るＤ−アラニンの定量方法。 【効果】 従来のＨＰＬＣ法に比べてより簡単に短時間
でＤ−アラニンを正確に測定できる。また、従来の酵素
法では不可能であった体液中のＤ−アラニンの測定が本
発明の測定方法により初めて可能になった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＤ−アラニンの定量
方法、さらに詳しくいえば微量のＤ−アラニンを特異的
かつ高感度に測定できるＤ−アラニンの定量方法に関す
る。
方法、さらに詳しくいえば微量のＤ−アラニンを特異的
かつ高感度に測定できるＤ−アラニンの定量方法に関す
る。
【０００２】
【発明の背景】従来、天然のタンパク質はＬ−アミノ酸
から構成されていると言われてきたが、最近、微生物、
動物や植物に種々のＤ−アミノ酸が、結合状態あるいは
遊離の状態で存在していることが明らかになってきた
（化学，第３２巻，第７号，517-526頁 (1977年)）。さ
らに、遊離のＤ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン
の存在が、哺乳動物、例えばマウス組織、脳およびヒト
血漿中に検出定量されるようになってきた（生化学，第
６４巻，第１２号，1451-1453頁 (1992年)）。また、Ｄ
−アミノ酸とガン化との関係、ヒトの歯のエナメル質タ
ンパク中のＤ−アスパラギン酸と年齢の関係、さらには
結核罹病した動物血清中のＤ−アラニンについての報告
例がある。このように、Ｄ−アミノ酸が生体内に存在す
ることから、Ｄ−アミノ酸は生物学的に何らかの存在意
義をもつものと考えられる。
から構成されていると言われてきたが、最近、微生物、
動物や植物に種々のＤ−アミノ酸が、結合状態あるいは
遊離の状態で存在していることが明らかになってきた
（化学，第３２巻，第７号，517-526頁 (1977年)）。さ
らに、遊離のＤ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン
の存在が、哺乳動物、例えばマウス組織、脳およびヒト
血漿中に検出定量されるようになってきた（生化学，第
６４巻，第１２号，1451-1453頁 (1992年)）。また、Ｄ
−アミノ酸とガン化との関係、ヒトの歯のエナメル質タ
ンパク中のＤ−アスパラギン酸と年齢の関係、さらには
結核罹病した動物血清中のＤ−アラニンについての報告
例がある。このように、Ｄ−アミノ酸が生体内に存在す
ることから、Ｄ−アミノ酸は生物学的に何らかの存在意
義をもつものと考えられる。
【０００３】
【従来の技術】Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の分析
方法として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を用いる方法が知られている。例えば、キラルカラムを
用いる方法、キラル溶媒を用いる方法、アミノ酸の誘導
体を合成する方法が知られている（生化学，第６４巻，
第１２号，1451-1453頁 (1992年)）。ＨＰＬＣを用いる
方法は、カラムが高価であること、分析に時間がかかる
こと、特殊な技術を必要とし、操作が繁雑であることな
ど多くの問題点があるためＤ−アミノ酸の定量法として
は一般的ではない。
方法として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を用いる方法が知られている。例えば、キラルカラムを
用いる方法、キラル溶媒を用いる方法、アミノ酸の誘導
体を合成する方法が知られている（生化学，第６４巻，
第１２号，1451-1453頁 (1992年)）。ＨＰＬＣを用いる
方法は、カラムが高価であること、分析に時間がかかる
こと、特殊な技術を必要とし、操作が繁雑であることな
ど多くの問題点があるためＤ−アミノ酸の定量法として
は一般的ではない。
【０００４】一方、よく知られている酵素法によれば、
ＨＰＬＣ法の欠点を解決できると考えられる。例えば、
ベルグマイヤーのＤ−アミノ酸オキシダーゼ（以下Ｄ−
ＡＯＤと略する。）を用いる方法がある（Bergmeyer, M
ethods of Enzymatic Analysis 3rd.ed.,Vol.8, P.329-
335 (1985)）。この方法は、Ｄ−アミノ酸にＤ−ＡＯＤ
を作用させて、発生した過酸化水素量を発光法により測
定するものであり、かなり微量のＤ−アミノ酸を測定す
ることが可能である。しかし、高感度のため、測定時に
存在するＤ−アミノ酸以外の共雑物の影響を大きく受け
る。また、Ｄ−ＡＯＤは基質特異性が低いので、体液中
のＤ−アラニンのみを測定するには、工夫が必要となる
（北村ら編，臨床酵素ハンドブック，68-69頁，講談社
発行（1982年）、以下文献１という。）。
ＨＰＬＣ法の欠点を解決できると考えられる。例えば、
ベルグマイヤーのＤ−アミノ酸オキシダーゼ（以下Ｄ−
ＡＯＤと略する。）を用いる方法がある（Bergmeyer, M
ethods of Enzymatic Analysis 3rd.ed.,Vol.8, P.329-
335 (1985)）。この方法は、Ｄ−アミノ酸にＤ−ＡＯＤ
を作用させて、発生した過酸化水素量を発光法により測
定するものであり、かなり微量のＤ−アミノ酸を測定す
ることが可能である。しかし、高感度のため、測定時に
存在するＤ−アミノ酸以外の共雑物の影響を大きく受け
る。また、Ｄ−ＡＯＤは基質特異性が低いので、体液中
のＤ−アラニンのみを測定するには、工夫が必要となる
（北村ら編，臨床酵素ハンドブック，68-69頁，講談社
発行（1982年）、以下文献１という。）。
【０００５】そこで、Ｄ−アラニンにＤ−ＡＯＤが作用
して生じるピルビン酸を測定する方法が提案されている
（Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis 3rd.e
d., Vol.8, P.336-340 (1985)、以下文献２とい
う。）。文献２の方法によればＤ−アラニンを特異的に
測定することが可能であるが、生体サンプル、例えばヒ
トの血清中に存在するＤ−アラニンは非常に微量（正常
値は６μｍｏｌ／リットル以下）であるのに対し、ピル
ビン酸が１００μｍｏｌ／リットル程度存在しているた
め（日本生化学会編，生化学データハンドブック，1549
頁，東京化学同人発行(1981年)）、このピルビン酸の分
離操作なしにＤ−アラニンを測定することは不可能であ
り、また多量の検体が必要となる。さらに、文献２での
Ｄ−アラニンの検出限界は、８９μｍｏｌ／リットルと
されているが、これでは正常値が６μｍｏｌ／リットル
以下である生体サンプル中のＤ−アラニンを直接検出
し、測定することはできない。
して生じるピルビン酸を測定する方法が提案されている
（Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis 3rd.e
d., Vol.8, P.336-340 (1985)、以下文献２とい
う。）。文献２の方法によればＤ−アラニンを特異的に
測定することが可能であるが、生体サンプル、例えばヒ
トの血清中に存在するＤ−アラニンは非常に微量（正常
値は６μｍｏｌ／リットル以下）であるのに対し、ピル
ビン酸が１００μｍｏｌ／リットル程度存在しているた
め（日本生化学会編，生化学データハンドブック，1549
頁，東京化学同人発行(1981年)）、このピルビン酸の分
離操作なしにＤ−アラニンを測定することは不可能であ
り、また多量の検体が必要となる。さらに、文献２での
Ｄ−アラニンの検出限界は、８９μｍｏｌ／リットルと
されているが、これでは正常値が６μｍｏｌ／リットル
以下である生体サンプル中のＤ−アラニンを直接検出
し、測定することはできない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、Ｄ−アラニンの臨床的意義を明らかにするために有
用と考えられるＤ−アラニンの定量法を提供することに
ある。さらに詳しくいえば、検体中の共雑物の影響を受
ける上に感度が低いために、体液中のＤ−アラニンを直
接、検出・測定することが困難であった従来の酵素法に
よるＤ−アラニンの測定法を改良し、例えば尿、血液な
どの検体中に存在するピルビン酸などを分離するための
操作を必要とせずに、直接Ｄ−アラニンを短時間に定量
できる方法を提供することにある。
は、Ｄ−アラニンの臨床的意義を明らかにするために有
用と考えられるＤ−アラニンの定量法を提供することに
ある。さらに詳しくいえば、検体中の共雑物の影響を受
ける上に感度が低いために、体液中のＤ−アラニンを直
接、検出・測定することが困難であった従来の酵素法に
よるＤ−アラニンの測定法を改良し、例えば尿、血液な
どの検体中に存在するピルビン酸などを分離するための
操作を必要とせずに、直接Ｄ−アラニンを短時間に定量
できる方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、検体にＤ−ＡＯＤ
を作用させてピルビン酸を発生させたのち、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドの還元型（ＮＡＤＨ）と乳
酸デヒドロゲナーゼを添加しピルビン酸を乳酸に、ＮＡ
ＤＨをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ）に変換して、単位時間に消費されるＮＡＤＨを測定
する系に、さらに乳酸オキシダーゼを存在させてピルビ
ン酸と乳酸の間でサイクリング反応を成立させ感度を増
幅させることにより、検体中のＤ−アラニンを特異的か
つ高感度に測定できることを見出し、また検体中に存在
するピルビン酸や乳酸を効率的に除去できる方法をも見
出し、本発明を完成した。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、検体にＤ−ＡＯＤ
を作用させてピルビン酸を発生させたのち、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドの還元型（ＮＡＤＨ）と乳
酸デヒドロゲナーゼを添加しピルビン酸を乳酸に、ＮＡ
ＤＨをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ）に変換して、単位時間に消費されるＮＡＤＨを測定
する系に、さらに乳酸オキシダーゼを存在させてピルビ
ン酸と乳酸の間でサイクリング反応を成立させ感度を増
幅させることにより、検体中のＤ−アラニンを特異的か
つ高感度に測定できることを見出し、また検体中に存在
するピルビン酸や乳酸を効率的に除去できる方法をも見
出し、本発明を完成した。
【０００８】
【発明の構成】すなわち、本発明は、（１）検体にＤ−
アミノ酸オキシダーゼを添加して、ピルビン酸を発生さ
せ、生成したピルビン酸にＮＡＤＨと乳酸デヒドロゲナ
ーゼを添加して、ピルビン酸を乳酸に、ＮＡＤＨをＮＡ
Ｄに変換し、さらに測定系に乳酸オキシダーゼを存在さ
せ、乳酸をピルビン酸に変換して乳酸とピルビン酸との
間でサイクリング反応を成立させて単位時間に消費され
るＮＡＤＨを測定することを特徴とするＤ−アラニンの
定量方法、（２）検体中の乳酸およびピルビン酸を前処
理で除去したのち、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを添加し
てピルビン酸を発生させる前記１に記載のＤ−アラニン
の定量方法、
アミノ酸オキシダーゼを添加して、ピルビン酸を発生さ
せ、生成したピルビン酸にＮＡＤＨと乳酸デヒドロゲナ
ーゼを添加して、ピルビン酸を乳酸に、ＮＡＤＨをＮＡ
Ｄに変換し、さらに測定系に乳酸オキシダーゼを存在さ
せ、乳酸をピルビン酸に変換して乳酸とピルビン酸との
間でサイクリング反応を成立させて単位時間に消費され
るＮＡＤＨを測定することを特徴とするＤ−アラニンの
定量方法、（２）検体中の乳酸およびピルビン酸を前処
理で除去したのち、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを添加し
てピルビン酸を発生させる前記１に記載のＤ−アラニン
の定量方法、
【０００９】（３） (i) 検体に乳酸オキシダーゼとピ
ルビン酸デヒドロゲナーゼあるいはピルビン酸オキシダ
ーゼを反応させて、検体中の乳酸およびピルビン酸を除
去したのち、(ii)Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを添加し
て、ピルビン酸を発生させ、ＮＡＤＨと乳酸デヒドロゲ
ナーゼを添加して(iii) ピルビン酸を乳酸に、(iv)ＮＡ
ＤＨをＮＡＤに変換し、さらに前記反応 (i)で用いた乳
酸オキシダーゼとともに(v)乳酸をピルビン酸に変換し
て乳酸とピルビン酸との間でサイクリング反応を成立さ
せて、単位時間に消費されるＮＡＤＨを測定することを
特徴とするＤ−アラニンの定量方法、
ルビン酸デヒドロゲナーゼあるいはピルビン酸オキシダ
ーゼを反応させて、検体中の乳酸およびピルビン酸を除
去したのち、(ii)Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを添加し
て、ピルビン酸を発生させ、ＮＡＤＨと乳酸デヒドロゲ
ナーゼを添加して(iii) ピルビン酸を乳酸に、(iv)ＮＡ
ＤＨをＮＡＤに変換し、さらに前記反応 (i)で用いた乳
酸オキシダーゼとともに(v)乳酸をピルビン酸に変換し
て乳酸とピルビン酸との間でサイクリング反応を成立さ
せて、単位時間に消費されるＮＡＤＨを測定することを
特徴とするＤ−アラニンの定量方法、
【００１０】（４）反応(i) において、カタラーゼを存
在させる前記（３）記載の定量方法、（５）反応(i) を
酸性側で行ない、反応(ii)〜(v)をアルカリ性側で行な
う前記（３）記載の定量方法、および（６）反応(i) を
ｐＨ５〜７で、反応(ii)〜(v)をｐＨ７〜９で行なう前
記（５）記載の定量方法に関する。
在させる前記（３）記載の定量方法、（５）反応(i) を
酸性側で行ない、反応(ii)〜(v)をアルカリ性側で行な
う前記（３）記載の定量方法、および（６）反応(i) を
ｐＨ５〜７で、反応(ii)〜(v)をｐＨ７〜９で行なう前
記（５）記載の定量方法に関する。
【００１１】本発明のＤ−アラニンの定量方法の特徴
は、Ｄ−アラニンにＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用さ
せて発生するピルビン酸を測定する系において、ピルビ
ン酸と乳酸との間でサイクリング反応を成立させて感度
を増幅するところにある。さらに、本発明では検体中の
乳酸およびピルビン酸を前処理で除去することにより、
これら共雑物の影響を避けることができる。検体中に共
雑物として存在する乳酸およびピルビン酸の影響は、検
体中のＤ−アラニンをイオン交換樹脂に吸着させて単離
すること、あるいは公知の酵素反応を利用して乳酸およ
びピルビン酸を除去することにより避けることができる
が、前者の方法は操作が繁雑であるため、特に後者の方
法が好ましい。
は、Ｄ−アラニンにＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用さ
せて発生するピルビン酸を測定する系において、ピルビ
ン酸と乳酸との間でサイクリング反応を成立させて感度
を増幅するところにある。さらに、本発明では検体中の
乳酸およびピルビン酸を前処理で除去することにより、
これら共雑物の影響を避けることができる。検体中に共
雑物として存在する乳酸およびピルビン酸の影響は、検
体中のＤ−アラニンをイオン交換樹脂に吸着させて単離
すること、あるいは公知の酵素反応を利用して乳酸およ
びピルビン酸を除去することにより避けることができる
が、前者の方法は操作が繁雑であるため、特に後者の方
法が好ましい。
【００１２】酵素反応を利用する前処理方法としては、
検体に乳酸オキシダーゼ（以下、ＬＯＸと略する。）お
よびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＰＹＤと略す
る。）またはピルビン酸オキシダーゼ（以下、ＰＯＰと
略する。）を添加することにより、効率的に検体中の乳
酸およびピルビン酸を除去できる。すなわち、検体中の
乳酸をＬＯＸの作用により、ピルビン酸へ交換し、検体
中にもともと存在していたピルビン酸および生成された
ピルビン酸をＰＹＤまたはＰＯＰの作用によりアセチル
リン酸に変換することにより、検体から乳酸およびピル
ビン酸を除去できる。この反応を下記反応式Ａに示す。
検体に乳酸オキシダーゼ（以下、ＬＯＸと略する。）お
よびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＰＹＤと略す
る。）またはピルビン酸オキシダーゼ（以下、ＰＯＰと
略する。）を添加することにより、効率的に検体中の乳
酸およびピルビン酸を除去できる。すなわち、検体中の
乳酸をＬＯＸの作用により、ピルビン酸へ交換し、検体
中にもともと存在していたピルビン酸および生成された
ピルビン酸をＰＹＤまたはＰＯＰの作用によりアセチル
リン酸に変換することにより、検体から乳酸およびピル
ビン酸を除去できる。この反応を下記反応式Ａに示す。
【００１３】
【化１】 次にＤ−アラニン測定の反応ステップ（反応(ii)〜
(v)）で、Ｄ−ＡＯＤと乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、
ＬＤＨと略する。）とＮＡＤＨを添加することにより、
検体中のＤ−アラニンをＤ−ＡＯＤの作用によりピルビ
ン酸に変換（反応(ii)）し、そのピルビン酸がＬＤＨに
より乳酸に（反応(iii),(iv)）、そして生成された乳酸
がＬＯＸにより再びピルビン酸（反応(v）へと変換さ
れ、ピルビン酸と乳酸の間でサイクリング反応が成立す
る。これらの反応を下記反応式Ｂに示す。
(v)）で、Ｄ−ＡＯＤと乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、
ＬＤＨと略する。）とＮＡＤＨを添加することにより、
検体中のＤ−アラニンをＤ−ＡＯＤの作用によりピルビ
ン酸に変換（反応(ii)）し、そのピルビン酸がＬＤＨに
より乳酸に（反応(iii),(iv)）、そして生成された乳酸
がＬＯＸにより再びピルビン酸（反応(v）へと変換さ
れ、ピルビン酸と乳酸の間でサイクリング反応が成立す
る。これらの反応を下記反応式Ｂに示す。
【００１４】
【化２】 共役反応(iii)、(iv)で消費されるＮＡＤＨの量（単位
時間あたりの変化量）を測定することにより、微量のＤ
−アラニンが測定できる。
時間あたりの変化量）を測定することにより、微量のＤ
−アラニンが測定できる。
【００１５】前処理の乳酸およびピルビン酸の除去方法
は公知のいかなる方法でもよい。乳酸を除去するための
反応で使用したＬＯＸは、測定のための反応ステップで
のピルビン酸と乳酸とのサイクリング反応においてもそ
のまま利用される。また、ＬＯＸは測定のための反応ス
テップで加えてもいい。
は公知のいかなる方法でもよい。乳酸を除去するための
反応で使用したＬＯＸは、測定のための反応ステップで
のピルビン酸と乳酸とのサイクリング反応においてもそ
のまま利用される。また、ＬＯＸは測定のための反応ス
テップで加えてもいい。
【００１６】
【発明の実施の形態】乳酸およびピルビン酸の除去反応
の際、ＬＯＸおよびＰＹＤまたはＰＯＰを用いる場合は
やや酸性側で反応させ、次のＬＤＨおよびＬＯＸによる
サイクリング反応を行なう場合はややアルカリ性側で反
応させると、測定のためのステップでＰＹＤまたはＰＯ
Ｐは全く作用せず、したがってＤ−アラニンより生じた
ピルビン酸にＰＹＤまたはＰＯＰは全く影響を及ぼさな
い。
の際、ＬＯＸおよびＰＹＤまたはＰＯＰを用いる場合は
やや酸性側で反応させ、次のＬＤＨおよびＬＯＸによる
サイクリング反応を行なう場合はややアルカリ性側で反
応させると、測定のためのステップでＰＹＤまたはＰＯ
Ｐは全く作用せず、したがってＤ−アラニンより生じた
ピルビン酸にＰＹＤまたはＰＯＰは全く影響を及ぼさな
い。
【００１７】具体的反応条件としては、乳酸およびピル
ビン酸の除去反応 (i)でのｐＨを５〜７、Ｄ−アラニン
測定反応(ii)〜(v)でのｐＨを７〜９とすればよい。各
反応においては上記のｐＨを示すものであればどのよう
な緩衝液でも使用できる。ｐＨ５〜７を示す緩衝液とし
ては、例えばリン酸バッファーまたは２−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロ
キシエチル）イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタ
ン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イ
ミノ二酢酸（ＡＤＡ）等のグッドバッファーが挙げら
れ、また、ｐＨ７〜９を示す緩衝液としては、ホウ酸バ
ッファー、トリス塩酸バッファーまたはＮ−トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン
酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）等のグッ
ドバッファーが挙げられる。
ビン酸の除去反応 (i)でのｐＨを５〜７、Ｄ−アラニン
測定反応(ii)〜(v)でのｐＨを７〜９とすればよい。各
反応においては上記のｐＨを示すものであればどのよう
な緩衝液でも使用できる。ｐＨ５〜７を示す緩衝液とし
ては、例えばリン酸バッファーまたは２−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロ
キシエチル）イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタ
ン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イ
ミノ二酢酸（ＡＤＡ）等のグッドバッファーが挙げら
れ、また、ｐＨ７〜９を示す緩衝液としては、ホウ酸バ
ッファー、トリス塩酸バッファーまたはＮ−トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン
酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）等のグッ
ドバッファーが挙げられる。
【００１８】さらに本発明においては、乳酸およびピル
ビン酸の除去反応において、カタラーゼを存在させる
と、除去反応が大幅に促進され、ＰＹＤあるいはＰＯＰ
の添加量の低減および反応時間の短縮が可能になる。こ
れは除去反応で発生した過酸化水素が下記
ビン酸の除去反応において、カタラーゼを存在させる
と、除去反応が大幅に促進され、ＰＹＤあるいはＰＯＰ
の添加量の低減および反応時間の短縮が可能になる。こ
れは除去反応で発生した過酸化水素が下記
【化３】 の反応でカタラーゼにより除去され反応 (i)が促進され
ることによる。
ることによる。
【００１９】除去反応において、ＬＯＸ、ＰＹＤおよび
ＰＯＰを用いる場合、これらの反応時の濃度は、各々0.
1〜２０ｕ／ｍｌ、より好ましくは１〜２０ｕ／ｍｌと
する。 また、カタラーゼを加える場合には反応時の濃
度が0.1〜3000ｕ／ｍｌになるようにする。Ｄ−アラニ
ン測定に用いる酵素の反応時の濃度は、Ｄ−ＡＯＤが0.
1〜１０ｕ／ｍｌ、ＬＤＨが0.1〜５０ｕ／ｍｌである。
また、検出に用いるＮＡＤＨは反応時の濃度が0.02〜0.
8ｍＭになるように加える。さらに、ＬＯＸをこの測定
反応ステップで加える場合は、反応時の濃度は、0.1〜
２０ｕ／ｍｌが適当である。
ＰＯＰを用いる場合、これらの反応時の濃度は、各々0.
1〜２０ｕ／ｍｌ、より好ましくは１〜２０ｕ／ｍｌと
する。 また、カタラーゼを加える場合には反応時の濃
度が0.1〜3000ｕ／ｍｌになるようにする。Ｄ−アラニ
ン測定に用いる酵素の反応時の濃度は、Ｄ−ＡＯＤが0.
1〜１０ｕ／ｍｌ、ＬＤＨが0.1〜５０ｕ／ｍｌである。
また、検出に用いるＮＡＤＨは反応時の濃度が0.02〜0.
8ｍＭになるように加える。さらに、ＬＯＸをこの測定
反応ステップで加える場合は、反応時の濃度は、0.1〜
２０ｕ／ｍｌが適当である。
【００２０】本発明で用いる酵素は、その由来は問われ
ない。本発明におけるサイクリング反応の反応時間は約
５分間、リサイクルの回数は１０回以上が好ましい。本
発明によるＤ−アラニン定量のための測定操作は、用手
法は勿論のこと通常の自動分析装置を用いても行うこと
もできる。
ない。本発明におけるサイクリング反応の反応時間は約
５分間、リサイクルの回数は１０回以上が好ましい。本
発明によるＤ−アラニン定量のための測定操作は、用手
法は勿論のこと通常の自動分析装置を用いても行うこと
もできる。
【００２１】
【発明の効果】本発明は、Ｄ−アラニンにＤ−アミノ酸
オキシダーゼを作用させて生成するピルビン酸にＮＡＤ
Ｈと乳酸デヒドロゲナーゼを添加して、ピルビン酸を乳
酸に、ＮＡＤＨをＮＡＤに変換し、単位時間に消費され
るＮＡＤＨを測定してＤ−アラニンを測定する系に乳酸
オキシダーゼを存在させて乳酸をピルビン酸に変換する
サイクリング反応を成立させてＤ−アラニンの検出感度
を大幅に改善したものである。本発明によれば、従来の
ＨＰＬＣ法に比べて、より簡単に短時間でＤ−アラニン
を正確に測定できる。また、サイクリング反応なしの従
来の酵素法で測定できる量（文献２の検出限界は８９μ
ｍｏｌ／リットル、なお、文献１には検出限界の記載は
ないが、文献−２と全く同じ方法であり同程度の値と考
えられる。）に比べてはるかに少量（検出限界が２μｍ
ｏｌ／リットル）のＤ−アラニンの測定が可能であり、
従来の酵素法では測定が難しかった生体サンプル中のＤ
−アラニン（例えば、ヒトの血清での正常値は６μｍｏ
ｌ／ｌである。）を直接測定することができる。本発明
の定量方法によって、今後臨床医学検査におけるＤ−ア
ラニンの臨床意義が明確になることが期待できる。
オキシダーゼを作用させて生成するピルビン酸にＮＡＤ
Ｈと乳酸デヒドロゲナーゼを添加して、ピルビン酸を乳
酸に、ＮＡＤＨをＮＡＤに変換し、単位時間に消費され
るＮＡＤＨを測定してＤ−アラニンを測定する系に乳酸
オキシダーゼを存在させて乳酸をピルビン酸に変換する
サイクリング反応を成立させてＤ−アラニンの検出感度
を大幅に改善したものである。本発明によれば、従来の
ＨＰＬＣ法に比べて、より簡単に短時間でＤ−アラニン
を正確に測定できる。また、サイクリング反応なしの従
来の酵素法で測定できる量（文献２の検出限界は８９μ
ｍｏｌ／リットル、なお、文献１には検出限界の記載は
ないが、文献−２と全く同じ方法であり同程度の値と考
えられる。）に比べてはるかに少量（検出限界が２μｍ
ｏｌ／リットル）のＤ−アラニンの測定が可能であり、
従来の酵素法では測定が難しかった生体サンプル中のＤ
−アラニン（例えば、ヒトの血清での正常値は６μｍｏ
ｌ／ｌである。）を直接測定することができる。本発明
の定量方法によって、今後臨床医学検査におけるＤ−ア
ラニンの臨床意義が明確になることが期待できる。
【００２２】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明は下記の実施例により限定されるもので
はない。 実施例１：サイクル法によるピルビン酸溶液検体の測定 以下の試薬１および２を調製し、試料として既知濃度の
ピルビン酸溶液検体（１００μＭの溶液を１０段階に希
釈したもの）を用いて測定した。まず試料（５μｌ）
に、試薬１（２５０μｌ）を加え、３７℃で５分間予備
加熱し、さらに、試薬２（１２５μｌ）を加え、３７℃
で５分間反応させた後、３４０ｎｍでレートアッセイ法
によりピルビン酸を測定した。結果を図１に示す。
するが、本発明は下記の実施例により限定されるもので
はない。 実施例１：サイクル法によるピルビン酸溶液検体の測定 以下の試薬１および２を調製し、試料として既知濃度の
ピルビン酸溶液検体（１００μＭの溶液を１０段階に希
釈したもの）を用いて測定した。まず試料（５μｌ）
に、試薬１（２５０μｌ）を加え、３７℃で５分間予備
加熱し、さらに、試薬２（１２５μｌ）を加え、３７℃
で５分間反応させた後、３４０ｎｍでレートアッセイ法
によりピルビン酸を測定した。結果を図１に示す。
【００２３】
【表１】試薬１： ・リン酸バッファー（ｐＨ 6.0） 22.5ｍＭ ・乳酸オキシダーゼ １２Ｕ／ｍｌ
【００２４】
【表２】試薬２： ・ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ8.5 ） ４５ｍＭ ・ＮＡＤＨ 0.6ｍＭ ・乳酸デヒドロゲナーゼ ４８Ｕ／ｍｌ ・硫酸アンモニウム １５０ｍＭ
【００２５】比較例１：ピルビン酸の測定 以下の試薬３および４を調製し、既知濃度のピルビン酸
溶液検体（２ｍＭを５段階に希釈したもの）を用いて、
自動分析機日立7070型により測定した。試料（５μｌ）
に試薬３（２５０μｌ）および試薬４（１２５μｌ）を
加え、３７℃で５〜１０分間反応させた後、３４０ｎｍ
でエンド法により測定した。結果を図２に示す。
溶液検体（２ｍＭを５段階に希釈したもの）を用いて、
自動分析機日立7070型により測定した。試料（５μｌ）
に試薬３（２５０μｌ）および試薬４（１２５μｌ）を
加え、３７℃で５〜１０分間反応させた後、３４０ｎｍ
でエンド法により測定した。結果を図２に示す。
【００２６】
【表３】試薬３： ・リン酸バッファー（ｐＨ6.0 ） ５０ｍＭ ・ＮＡＤＨ 0.3ｍＭ
【００２７】
【表４】試薬４： ・リン酸バッファー（ｐＨ6.0 ） ５０ｍＭ ・乳酸デヒドロゲナーゼ ６Ｕ／ｍｌ ・硫酸アンモニウム １５０ｍＭ
【００２８】感度の比較：リサイクル率の算定 実施例１はレートアッセイ法、比較例１はエンド法によ
るため、このままでは比較ができないので、以下の方法
により、同一吸光度変化量を示す濃度を求め感度を比較
した。すなわち、レートアッセイ法（実施例１）の結果
を示す図１において所定濃度における吸光度変化測定値
（ｍＡｂｓ／ｍｉｎ）の５分間の吸光度変化量（ｍＡｂ
ｓ値）を算出し、エンド法（比較例１）の結果の図２に
ついて同じ吸光度変化量（ｍＡｂｓ値）に相当する濃度
を換算し、両方の濃度を比較した。図１と図２の比較か
らサイクリング反応を用いることにより約１００倍（リ
サイクル率１００％）の感度が向上したことがわかる。
るため、このままでは比較ができないので、以下の方法
により、同一吸光度変化量を示す濃度を求め感度を比較
した。すなわち、レートアッセイ法（実施例１）の結果
を示す図１において所定濃度における吸光度変化測定値
（ｍＡｂｓ／ｍｉｎ）の５分間の吸光度変化量（ｍＡｂ
ｓ値）を算出し、エンド法（比較例１）の結果の図２に
ついて同じ吸光度変化量（ｍＡｂｓ値）に相当する濃度
を換算し、両方の濃度を比較した。図１と図２の比較か
らサイクリング反応を用いることにより約１００倍（リ
サイクル率１００％）の感度が向上したことがわかる。
【００２９】実施例２：乳酸およびピルビン酸除去反応
におけるカタラーゼの効果 以下の試薬５および６を調製して、カタラーゼを添加し
た系と添加しない系で、試薬５中の乳酸（およびＬＯＸ
の作用で生成したピルビン酸）が除去されたか否かを測
定した。まず、試薬５（各種濃度の乳酸を含有する。ま
た、カタラーゼが添加していない場合と添加した場合が
ある。）を３７℃で３分間反応させて存在していた乳酸
および乳酸から変換されたピルビン酸を除去したのち、
試薬６を加えて、３７℃で反応させて、反応液の３４０
ｎｍにおける吸光度減少を測定した。試薬５中の乳酸お
よび変換されたピルビン酸が残存していることは３４０
ｎｍでの吸光度の減少から分かる。結果を図３に示す。
におけるカタラーゼの効果 以下の試薬５および６を調製して、カタラーゼを添加し
た系と添加しない系で、試薬５中の乳酸（およびＬＯＸ
の作用で生成したピルビン酸）が除去されたか否かを測
定した。まず、試薬５（各種濃度の乳酸を含有する。ま
た、カタラーゼが添加していない場合と添加した場合が
ある。）を３７℃で３分間反応させて存在していた乳酸
および乳酸から変換されたピルビン酸を除去したのち、
試薬６を加えて、３７℃で反応させて、反応液の３４０
ｎｍにおける吸光度減少を測定した。試薬５中の乳酸お
よび変換されたピルビン酸が残存していることは３４０
ｎｍでの吸光度の減少から分かる。結果を図３に示す。
【００３０】
【表５】 試薬５： ・リン酸バッファー（ｐＨ6.0 ） 0.5 Ｍ ４５μｌ ・チラミンピロホスフェート １０ｍＭ ３０μｌ ・塩化マグネシウム １００ｍＭ ７５μｌ ・ピルビン酸デヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／ｍｌ ４５μｌ ・乳酸オキシダーゼ １００Ｕ／ｍｌ １２０μｌ ・水 １ｍｌ ・乳酸 １０ｍＭ 各種(*1) ・カタラーゼ 1000 Ｕ／ｍｌ 各種(*1) ＊１：乳酸およびカタラーゼについては下記の組合せ〜で使用した。
【００３１】
【表６】 組合せ １０ｍＭ乳酸量（μｌ） 1000Ｕ／ｍｌカタラーゼ量（μｌ） ０ ０ ４０ ０ ４０ １０ ４０ ２０ ４０ ４０
【００３２】
【表７】 試薬６： ・ほう酸バッファー（ｐＨ8.5 ） 0.2Ｍ １７０μｌ ・ＮＡＤＨ １ｍＭ ３００μｌ ・乳酸デヒドロゲナーゼ ２０Ｕ／ｍｌ ３０μｌ
【００３３】試薬５で、１０ｍＭ乳酸のみを４０μｌ存
在させて反応させると（組合せの系）、３４０ｎｍで
の減少が大きく、試薬５中の乳酸および変換されたピル
ビン酸除去が不十分である。１０ｍＭ乳酸４０μｌに10
00Ｕ／ｍｌカタラーゼ２０μｌ存在させて反応させると
（組合せの系）、３４０ｎｍでの減少はみられず、乳
酸および変換されたピルビン酸が完全に除去されている
ことがわかる。すなわち、カタラーゼが乳酸およびピル
ビン酸除去反応を促進していることがわかる。
在させて反応させると（組合せの系）、３４０ｎｍで
の減少が大きく、試薬５中の乳酸および変換されたピル
ビン酸除去が不十分である。１０ｍＭ乳酸４０μｌに10
00Ｕ／ｍｌカタラーゼ２０μｌ存在させて反応させると
（組合せの系）、３４０ｎｍでの減少はみられず、乳
酸および変換されたピルビン酸が完全に除去されている
ことがわかる。すなわち、カタラーゼが乳酸およびピル
ビン酸除去反応を促進していることがわかる。
【００３４】実施例３：除去反応およびサイクリング反
応を組込んだ試薬によるＤ−アラニンの測定 以下の試薬７および８を調製し、試料として既知濃度の
Ｄ−アラニン溶液（１００μＭおよび２０μＭを１０段
階に希釈したもの）およびＤ−アラニンを添加したヒト
血清と尿（１０段階に希釈したもの）の４種類の検体に
ついて、自動分析機日立7070型により測定した。まず、
試薬７（２５０μｌ）に検体（５μｌ）を加え、３７℃
で５分間反応させたのち、試薬８（１２５μｌ）を加
え、３７℃で５分間反応させて、３４０ｎｍでレートア
ッセイ法によりＤ−アラニンを測定した。結果を図４、
５、６および７に示す。
応を組込んだ試薬によるＤ−アラニンの測定 以下の試薬７および８を調製し、試料として既知濃度の
Ｄ−アラニン溶液（１００μＭおよび２０μＭを１０段
階に希釈したもの）およびＤ−アラニンを添加したヒト
血清と尿（１０段階に希釈したもの）の４種類の検体に
ついて、自動分析機日立7070型により測定した。まず、
試薬７（２５０μｌ）に検体（５μｌ）を加え、３７℃
で５分間反応させたのち、試薬８（１２５μｌ）を加
え、３７℃で５分間反応させて、３４０ｎｍでレートア
ッセイ法によりＤ−アラニンを測定した。結果を図４、
５、６および７に示す。
【００３５】
【表８】試薬７： ・リン酸バッファー（ｐＨ6.0 ） 22.5ｍＭ ・チラミンピロホスフェート 0.3ｍＭ ・塩化マグネシウム 7.5ｍＭ ・ピルビン酸デヒドロゲナーゼ 2.25Ｕ／ｍｌ ・カタラーゼ ３０Ｕ／ｍｌ ・乳酸オキシダーゼ １２Ｕ／ｍｌ
【００３６】
【表９】 試薬８： ・トリス塩酸バッファー（ｐＨ8.5 ） ４５ｍＭ ・ＮＡＤＨ 0.6ｍＭ ・乳酸デヒドロゲナーゼ ４８Ｕ／ｍｌ ・Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ ３Ｕ／ｍｌ ・硫酸アンモニウム １５０ｍＭ
【００３７】図４からＤ−アラニン濃度と吸光度変化量
（ｍＡｂｓ／ｍｉｎ）との間には、直線性が得られてお
り、２０μｍｏｌ／リットルの１０倍希釈濃度である２
μｍｏｌ／リットルまで測定可能であることがわかる。
すなわち本発明の測定方法でのＤ−アラニンの検出限界
濃度は２μｍｏｌ／リットルである。また、図６および
図７から、血清、尿には、検体中のＤ−アラニンに比べ
て、１０〜１００倍もの乳酸やピルビン酸が存在する
が、これらは最初のステップで完全に除去され、次のス
テップでＤ−アラニンの存在量に比例した反応を示し、
高感度な測定が可能であることが確認された。
（ｍＡｂｓ／ｍｉｎ）との間には、直線性が得られてお
り、２０μｍｏｌ／リットルの１０倍希釈濃度である２
μｍｏｌ／リットルまで測定可能であることがわかる。
すなわち本発明の測定方法でのＤ−アラニンの検出限界
濃度は２μｍｏｌ／リットルである。また、図６および
図７から、血清、尿には、検体中のＤ−アラニンに比べ
て、１０〜１００倍もの乳酸やピルビン酸が存在する
が、これらは最初のステップで完全に除去され、次のス
テップでＤ−アラニンの存在量に比例した反応を示し、
高感度な測定が可能であることが確認された。
【図１】 サイクリング反応を用いた本発明の方法によ
るピルビン酸の検量線を表わす。
るピルビン酸の検量線を表わす。
【図２】 サイクリング反応を用いない比較例の方法に
よるピルビン酸の検量線を表わす。
よるピルビン酸の検量線を表わす。
【図３】 乳酸およびピルビン酸の除去反応によるカタ
ラーゼの効果を表わすグラフである。
ラーゼの効果を表わすグラフである。
【図４】 本発明の方法によるＤ−アラニン標品（２０
μＭ）の検量線を表わす。
μＭ）の検量線を表わす。
【図５】 本発明の方法によるＤ−アラニン標品（１０
０μＭ）の検量線を表わす。
０μＭ）の検量線を表わす。
【図６】 本発明の方法によるＤ−アラニン標品添加血
清の検量線を表わす。
清の検量線を表わす。
【図７】 本発明の方法によるＤ−アラニン標品添加尿
の検量線を表わす。
の検量線を表わす。
Claims (6)
- 【請求項１】 検体にＤ−アミノ酸オキシダーゼを添加
して、ピルビン酸を発生させ、生成したピルビン酸にＮ
ＡＤＨと乳酸デヒドロゲナーゼを添加して、ピルビン酸
を乳酸に、ＮＡＤＨをＮＡＤに変換し、さらに測定系に
乳酸オキシダーゼを存在させ、乳酸をピルビン酸に変換
して乳酸とピルビン酸との間でサイクリング反応を成立
させて単位時間に消費されるＮＡＤＨを測定することを
特徴とするＤ−アラニンの定量方法。 - 【請求項２】 検体中の乳酸およびピルビン酸を前処理
で除去したのち、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを添加して
ピルビン酸を発生させる請求項１に記載のＤ−アラニン
の定量方法。 - 【請求項３】 (i) 検体に乳酸オキシダーゼとピルビン
酸デヒドロゲナーゼあるいはピルビン酸オキシダーゼを
反応させて、検体中の乳酸およびピルビン酸を除去した
のち、(ii)Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを添加して、ピル
ビン酸を発生させ、ＮＡＤＨと乳酸デヒドロゲナーゼを
添加して(iii) ピルビン酸を乳酸に、(iv)ＮＡＤＨをＮ
ＡＤに変換し、さらに前記反応 (i)で用いた乳酸オキシ
ダーゼとともに (v)乳酸をピルビン酸に変換して乳酸と
ピルビン酸との間でサイクリング反応を成立させて、単
位時間に消費されるＮＡＤＨを測定することを特徴とす
るＤ−アラニンの定量方法。 - 【請求項４】 反応 (i)において、カタラーゼを存在さ
せる請求項３記載の定量方法。 - 【請求項５】 反応 (i)を酸性側で行ない、反応(ii)〜
(v)をアルカリ性側で行なう請求項３記載の定量方法。 - 【請求項６】 反応 (i)をｐＨ５〜７で、反応(ii)〜
(v)をｐＨ７〜９で行なう請求項５記載の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25015495A JPH0970297A (ja) | 1995-09-04 | 1995-09-04 | Ｄ−アラニンの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25015495A JPH0970297A (ja) | 1995-09-04 | 1995-09-04 | Ｄ−アラニンの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0970297A true JPH0970297A (ja) | 1997-03-18 |
Family
ID=17203632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25015495A Pending JPH0970297A (ja) | 1995-09-04 | 1995-09-04 | Ｄ−アラニンの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0970297A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006093224A1 (ja) * | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 免疫測定法及びその試薬 |
| JP2011087481A (ja) * | 2009-10-21 | 2011-05-06 | Nagoya Univ | Ｄ−アミノ酸測定法 |
| CN103674873A (zh) * | 2013-11-22 | 2014-03-26 | 杭州利安生物科技有限公司 | 一种定量检测丝氨酸的方法 |
-
1995
- 1995-09-04 JP JP25015495A patent/JPH0970297A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006093224A1 (ja) * | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 免疫測定法及びその試薬 |
| US7759072B2 (en) | 2005-03-03 | 2010-07-20 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Immunoassay method and reagent therefor |
| JP4896869B2 (ja) * | 2005-03-03 | 2012-03-14 | 積水メディカル株式会社 | 免疫測定法及びその試薬 |
| JP2011087481A (ja) * | 2009-10-21 | 2011-05-06 | Nagoya Univ | Ｄ−アミノ酸測定法 |
| CN103674873A (zh) * | 2013-11-22 | 2014-03-26 | 杭州利安生物科技有限公司 | 一种定量检测丝氨酸的方法 |
| CN103674873B (zh) * | 2013-11-22 | 2015-05-20 | 杭州利安生物科技有限公司 | 一种定量检测丝氨酸的方法 |
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