JP3034988B2 - イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents
イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法および定量用組成物Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、食品検査等
の分野に使用されるイソクエン酸またはα−ケトグルタ
ル酸の高感度な定量法、および定量用組成物に関する。
の分野に使用されるイソクエン酸またはα−ケトグルタ
ル酸の高感度な定量法、および定量用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】イソクエン酸の分析はとくに食品分析に
おいて重要であり、例えばベーリンガー マンハイム社
よりその分析試薬がキットとして市販されている。その
方法は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを使用するもの
であり、補酵素NADPの存在下にイソクエン酸の酸化的脱
炭酸反応による還元型NADPの増加量を測定するものであ
る。
おいて重要であり、例えばベーリンガー マンハイム社
よりその分析試薬がキットとして市販されている。その
方法は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを使用するもの
であり、補酵素NADPの存在下にイソクエン酸の酸化的脱
炭酸反応による還元型NADPの増加量を測定するものであ
る。
【０００３】α−ケトグルタル酸の測定は、血液化学検
査における有機モノカルボン酸の定量検査法の１つとし
て重要である（検査点数早見表，289頁，1990年社会保
健研究所発行）。その測定には一般にグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼの逆反応が利用される。
査における有機モノカルボン酸の定量検査法の１つとし
て重要である（検査点数早見表，289頁，1990年社会保
健研究所発行）。その測定には一般にグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼの逆反応が利用される。
【０００４】一般に、酵素を用いて分析を行なう場合、
測定しようとする対象物質を分光学的に検出可能な過酸
化水素や還元型NAD(P)等に変換することが行なわれ、こ
の場合、検出可能物質の量は化学量論的に測定対象物と
等しくなる。
測定しようとする対象物質を分光学的に検出可能な過酸
化水素や還元型NAD(P)等に変換することが行なわれ、こ
の場合、検出可能物質の量は化学量論的に測定対象物と
等しくなる。
【０００５】現在、この検出可能な物質を測定する方法
としては分光分析機を用いる方法が最も普及している
が、これも感度に限界が有り、測定対象物の含量が少な
い場合は適さないという欠点があった。
としては分光分析機を用いる方法が最も普及している
が、これも感度に限界が有り、測定対象物の含量が少な
い場合は適さないという欠点があった。
【０００６】そこで、測定対象物の含量が少ない場合
や、測定対象物を含む被検体が少量である場合などは、
分光分析よりも感度の優れた蛍光分析や発光分析等が用
いられている。しかしながら、これらの方法も臨床検査
等の汎用検査においては、機器の普及という点からはあ
まり適したものではなかった。
や、測定対象物を含む被検体が少量である場合などは、
分光分析よりも感度の優れた蛍光分析や発光分析等が用
いられている。しかしながら、これらの方法も臨床検査
等の汎用検査においては、機器の普及という点からはあ
まり適したものではなかった。
【０００７】また、微量の物質を測定するその他の方法
としては、当該物質が等量の補酵素などに変換できる場
合は、２種類の酵素を用いて補酵素を増幅する、いわゆ
る酵素サイクリング法が行なわれている。例えば、NAD
サイクリング法、CoAサイクリング法、ATPサイクリング
法等が用いられているが、これらの方法はいずれも臨床
検査等のルーチン分析においては、操作が煩雑すぎるた
めに殆んど実用されていない。
としては、当該物質が等量の補酵素などに変換できる場
合は、２種類の酵素を用いて補酵素を増幅する、いわゆ
る酵素サイクリング法が行なわれている。例えば、NAD
サイクリング法、CoAサイクリング法、ATPサイクリング
法等が用いられているが、これらの方法はいずれも臨床
検査等のルーチン分析においては、操作が煩雑すぎるた
めに殆んど実用されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】前記測定の感度を向上
させることが可能ならば、測定対象物の含量が少ない場
合はもとより、測定に必要な検体量を減らすことができ
るため、例えば血清のように種々の成分を含むものを被
検体に用いる場合には、共存物質によるその測定系に及
ぼす影響を小さくすることができる。また、ある限られ
た被検体量で検査できる項目数を増やすことも可能であ
り、更には検体が人血液である場合などは、採血量を減
らすことができるため、被採血者への心理的な負担を軽
減することもできる。このように、検出感度を高くする
ことは、臨床検査においては血液という貴重な検体を用
いることや微量成分を測定する必要性から考えて、必然
の要求である。
させることが可能ならば、測定対象物の含量が少ない場
合はもとより、測定に必要な検体量を減らすことができ
るため、例えば血清のように種々の成分を含むものを被
検体に用いる場合には、共存物質によるその測定系に及
ぼす影響を小さくすることができる。また、ある限られ
た被検体量で検査できる項目数を増やすことも可能であ
り、更には検体が人血液である場合などは、採血量を減
らすことができるため、被採血者への心理的な負担を軽
減することもできる。このように、検出感度を高くする
ことは、臨床検査においては血液という貴重な検体を用
いることや微量成分を測定する必要性から考えて、必然
の要求である。
【０００９】前述のごとく、従来のイソクエン酸または
α−ケトグルタル酸の定量法は、いまだ満足のいくもの
ではなく、簡便でかつ高感度の測定法の開発が望まれて
いた。
α−ケトグルタル酸の定量法は、いまだ満足のいくもの
ではなく、簡便でかつ高感度の測定法の開発が望まれて
いた。
【００１０】したがって、本発明の第一の目的は、高感
度かつ精度良好で、しかも簡便なイソクエン酸またはα
−ケトグルタル酸の定量法を提供することにある。
度かつ精度良好で、しかも簡便なイソクエン酸またはα
−ケトグルタル酸の定量法を提供することにある。
【００１１】更に、本発明の第二の目的は、前記イソク
エン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法に好適
に供される組成物を提供することにある。
エン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法に好適
に供される組成物を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、イソクエン酸またはα
−ケトグルタル酸の定量において、チオNAD類およびチ
オNADP類からなる群（以下チオ型補酵素ということもあ
る）より選ばれる１つと、NAD類およびNADP類からなる
群（以下非チオ型補酵素ということもある）より選ばれ
る１つの補酵素に作用するイソクエン酸デヒドロゲナー
ゼ、およびチオ型補酵素と非チオ型補酵素との２種類を
用いることにより、良好な酵素サイクリング反応をなし
得ることを見い出し、更に還元型チオ型補酵素と還元型
非チオ型補酵素との吸収波長がそれぞれ400nm付近、340
nm付近と異なることに着目し、吸光度測定の際、他物質
の吸収波長の混雑が回避可能な酵素サイクリング反応を
実施でき、その結果高感度測定が可能であることを見出
し、本発明を完成するに至った。
を解決すべく鋭意検討した結果、イソクエン酸またはα
−ケトグルタル酸の定量において、チオNAD類およびチ
オNADP類からなる群（以下チオ型補酵素ということもあ
る）より選ばれる１つと、NAD類およびNADP類からなる
群（以下非チオ型補酵素ということもある）より選ばれ
る１つの補酵素に作用するイソクエン酸デヒドロゲナー
ゼ、およびチオ型補酵素と非チオ型補酵素との２種類を
用いることにより、良好な酵素サイクリング反応をなし
得ることを見い出し、更に還元型チオ型補酵素と還元型
非チオ型補酵素との吸収波長がそれぞれ400nm付近、340
nm付近と異なることに着目し、吸光度測定の際、他物質
の吸収波長の混雑が回避可能な酵素サイクリング反応を
実施でき、その結果高感度測定が可能であることを見出
し、本発明を完成するに至った。
【００１３】すなわち、本発明は、イソクエン酸および
α−ケトグルタル酸からなる群より選ばれる１種の被検
成分を含有する被検体に、次の成分（１）〜（４） （１）チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ば
れる１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれ
る１つとを補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質
としてα−ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可
逆反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ1 （３）Ｂ1 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔１〕
α−ケトグルタル酸からなる群より選ばれる１種の被検
成分を含有する被検体に、次の成分（１）〜（４） （１）チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ば
れる１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれ
る１つとを補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質
としてα−ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可
逆反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ1 （３）Ｂ1 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔１〕
【００１４】
【化２】
【００１５】（式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NA
DP類またはNAD類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示
し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、またＡ1がNADP類また
はNAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD
類を示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示す）で表わされ
るサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化
するＡ2またはＢ1の量を測定することを特徴とするイソ
クエン酸またはα−ケトグルタル酸の定量法を提供する
ものである。
DP類またはNAD類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示
し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、またＡ1がNADP類また
はNAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD
類を示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示す）で表わされ
るサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化
するＡ2またはＢ1の量を測定することを特徴とするイソ
クエン酸またはα−ケトグルタル酸の定量法を提供する
ものである。
【００１６】更に、本発明は前記（１）、（２）、
（３）及び（４）を含有することを特徴とするイソクエ
ン酸またはα−ケトグルタル酸の定量用組成物を提供す
るものである。
（３）及び（４）を含有することを特徴とするイソクエ
ン酸またはα−ケトグルタル酸の定量用組成物を提供す
るものである。
【００１７】本発明に使用されるイソクエン酸デヒドロ
ゲナーゼは、少なくとも イソクエン酸＋NAD(P)+＝α−ケトグルタル酸＋CO2＋NAD(P)H＋H+ なる反応を触媒するものであり、チオNADP類およびチオ
NAD類からなる群より選ばれる１つと、NADP類およびNAD
類からなる群より選ばれる１つを補酵素とするものなら
いずれも使用できる。
ゲナーゼは、少なくとも イソクエン酸＋NAD(P)+＝α−ケトグルタル酸＋CO2＋NAD(P)H＋H+ なる反応を触媒するものであり、チオNADP類およびチオ
NAD類からなる群より選ばれる１つと、NADP類およびNAD
類からなる群より選ばれる１つを補酵素とするものなら
いずれも使用できる。
【００１８】具体的には、EC 1.1.1.41 およびEC 1.1.
1.42 の酵素が挙げられる。これらのうち、EC 1.1.1.41
の酵素は補酵素（チオ）NAD類に特異的であり、種々の
動物組織、酵母、アセトバクター ペルオキシダンス
（Acetobacter peroxydans）、アスペルギルス ニガー
（Aspergillus niger）、ニュウロスポラ クラッサ（N
eurospora crassa ）およびエンドウ豆ミトコンドリア
などに存在する。
1.42 の酵素が挙げられる。これらのうち、EC 1.1.1.41
の酵素は補酵素（チオ）NAD類に特異的であり、種々の
動物組織、酵母、アセトバクター ペルオキシダンス
（Acetobacter peroxydans）、アスペルギルス ニガー
（Aspergillus niger）、ニュウロスポラ クラッサ（N
eurospora crassa ）およびエンドウ豆ミトコンドリア
などに存在する。
【００１９】本酵素はミトコンドリアに多く存在するア
ロステリック酵素であり、ADPで活性化され、またTCAサ
イクルの活性を調節するという生化学上きわめて重要な
作用を有する（臨床酵素ハンドブック，128頁，講談
社，1982年）。
ロステリック酵素であり、ADPで活性化され、またTCAサ
イクルの活性を調節するという生化学上きわめて重要な
作用を有する（臨床酵素ハンドブック，128頁，講談
社，1982年）。
【００２０】また、EC 1.1.1.42 の酵素は補酵素（チ
オ）NADP類に特異的であり、微生物から動植物までの細
胞質とミトコンドリア中に存在する。このうち、大腸菌
由来の酵素は、NADPに対する活性を100％とするとき、
アセチルNADPに３８％、チオNADPに２％作用する（Bioc
hem. Biophys. Acta. 258,ｐ２７〜３９，1972）。酵母
由来、ブタ心由来の酵素は、ベーリンガー マンハイム
社、シグマ社等より市販されている。ベーリンガー マ
ンハイム社のブタ心由来酵素は、NADPに対する活性を10
0％とするとき、チオNADPに対し2.4％であった。
オ）NADP類に特異的であり、微生物から動植物までの細
胞質とミトコンドリア中に存在する。このうち、大腸菌
由来の酵素は、NADPに対する活性を100％とするとき、
アセチルNADPに３８％、チオNADPに２％作用する（Bioc
hem. Biophys. Acta. 258,ｐ２７〜３９，1972）。酵母
由来、ブタ心由来の酵素は、ベーリンガー マンハイム
社、シグマ社等より市販されている。ベーリンガー マ
ンハイム社のブタ心由来酵素は、NADPに対する活性を10
0％とするとき、チオNADPに対し2.4％であった。
【００２１】本発明においては、基質であるイソクエン
酸に対して反応性を有し、α−ケトグルタル酸と二酸化
炭素を生成するものであれば、上述の酵素以外の他の起
源の酵素も使用することができ、その補酵素に対する特
異性は適宜、補酵素と基質とを用いて確認することがで
きる。
酸に対して反応性を有し、α−ケトグルタル酸と二酸化
炭素を生成するものであれば、上述の酵素以外の他の起
源の酵素も使用することができ、その補酵素に対する特
異性は適宜、補酵素と基質とを用いて確認することがで
きる。
【００２２】また、本発明において、Ａ1及びＢ2の補酵
素はチオNADP類、チオNAD類、NADP類、NAD類を示すが、
このうちチオNADP類またはチオNAD類としては、例えば
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（チオNADP）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドホスフェート；およびチオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる。ま
た、NADP類またはNAD類としては、例えばニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（NADP）、アセ
チルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（ア
セチルNADP）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌク
レオチドホスフェート、ニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチドホスフェート（デアミノNADP）；および
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）、アセ
チルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルNA
D）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチ
ド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デ
アミノNAD）が挙げられる。なおこれら補酵素の還元型
は、各々チオNADPH類、チオNADH類、NADPH類、NADH類と
して表示する。
素はチオNADP類、チオNAD類、NADP類、NAD類を示すが、
このうちチオNADP類またはチオNAD類としては、例えば
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（チオNADP）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドホスフェート；およびチオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる。ま
た、NADP類またはNAD類としては、例えばニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（NADP）、アセ
チルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（ア
セチルNADP）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌク
レオチドホスフェート、ニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチドホスフェート（デアミノNADP）；および
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）、アセ
チルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルNA
D）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチ
ド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デ
アミノNAD）が挙げられる。なおこれら補酵素の還元型
は、各々チオNADPH類、チオNADH類、NADPH類、NADH類と
して表示する。
【００２３】本発明においてはＡ1およびＢ1において例
えばＡ1がチオNAD(P)類である場合、Ｂ1はNAD(P)H類で
あることが必要であり、Ａ1およびＢ1の関係において１
つのチオ型補酵素を使用する。
えばＡ1がチオNAD(P)類である場合、Ｂ1はNAD(P)H類で
あることが必要であり、Ａ1およびＢ1の関係において１
つのチオ型補酵素を使用する。
【００２４】また定量に用いるイソクエン酸デヒドロゲ
ナーゼが（チオ）NAD類のみを補酵素とする場合は、上
述のチオNAD類とNAD類より、また、用いるイソクエン酸
デヒドロゲナーゼが（チオ）NADP類のみを補酵素とする
場合は、上述のチオNADP類およびNADP類より、更に用い
るイソクエン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）NAD類およ
び（チオ）NADP類を共に補酵素にする場合は上述のチオ
NAD類およびチオNADP類と上述のNAD類およびNADP類より
適宜選択し、それらの酸化型、還元型を適宜用いればよ
い。
ナーゼが（チオ）NAD類のみを補酵素とする場合は、上
述のチオNAD類とNAD類より、また、用いるイソクエン酸
デヒドロゲナーゼが（チオ）NADP類のみを補酵素とする
場合は、上述のチオNADP類およびNADP類より、更に用い
るイソクエン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）NAD類およ
び（チオ）NADP類を共に補酵素にする場合は上述のチオ
NAD類およびチオNADP類と上述のNAD類およびNADP類より
適宜選択し、それらの酸化型、還元型を適宜用いればよ
い。
【００２５】成分（４）としては、例えばα−ケトグル
タル酸を定量する場合における二酸化炭素が挙げられ
る。二酸化炭素は、炭酸として供給するのが好ましく、
かかる炭酸としては例えばHCO3 -イオンまたはCO3 2-イオ
ンを放出し得るものであればよく、生体体液中のHCO3 -
イオンやNaHCO3、KHCO3、Na2CO3 、K2CO3を使用すれば
よい。
タル酸を定量する場合における二酸化炭素が挙げられ
る。二酸化炭素は、炭酸として供給するのが好ましく、
かかる炭酸としては例えばHCO3 -イオンまたはCO3 2-イオ
ンを放出し得るものであればよく、生体体液中のHCO3 -
イオンやNaHCO3、KHCO3、Na2CO3 、K2CO3を使用すれば
よい。
【００２６】本発明の定量法により、被検体液中にもと
もと含有されているイソクエン酸またはα−ケトグルタ
ル酸を測定できるが、またこれらを遊離・生成する酵素
系における基質やその酵素活性を測定できる。更に、前
記イソクエン酸、またはα−ケトグルタル酸を遊離・生
成する酵素系と連結しうる単一、もしくは複数工程から
なる酵素中の基質やその酵素活性をも測定できる。これ
ら酵素系は、特に限定されないが、例えば以下に示す反
応系が挙げられる。
もと含有されているイソクエン酸またはα−ケトグルタ
ル酸を測定できるが、またこれらを遊離・生成する酵素
系における基質やその酵素活性を測定できる。更に、前
記イソクエン酸、またはα−ケトグルタル酸を遊離・生
成する酵素系と連結しうる単一、もしくは複数工程から
なる酵素中の基質やその酵素活性をも測定できる。これ
ら酵素系は、特に限定されないが、例えば以下に示す反
応系が挙げられる。
【００２７】（１）クエン酸とアコニット酸ヒドラダー
ゼ（EC 4.2.1.3）との酵素反応系。この系において、遊
離・生成するイソクエン酸を定量することによりクエン
酸を定量、またはアコニット酸ヒドラダーゼの活性測定
をすることができる。 クエン酸→cis−アコニット酸＋H2O→イソクエン酸
ゼ（EC 4.2.1.3）との酵素反応系。この系において、遊
離・生成するイソクエン酸を定量することによりクエン
酸を定量、またはアコニット酸ヒドラダーゼの活性測定
をすることができる。 クエン酸→cis−アコニット酸＋H2O→イソクエン酸
【００２８】（２）α−ケトグルタラミン酸とω−アミ
ダーゼ（EC 3.5.1.3）との酵素反応系。この系におい
て、遊離・生成するα−ケトグルタル酸を定量すること
により、α−ケトグルタラミン酸の定量またはω−アミ
ダーゼの活性測定をすることができる。 α−ケトグルタラミン酸＋H2O→アンモニア＋α−ケトグルタル酸
ダーゼ（EC 3.5.1.3）との酵素反応系。この系におい
て、遊離・生成するα−ケトグルタル酸を定量すること
により、α−ケトグルタラミン酸の定量またはω−アミ
ダーゼの活性測定をすることができる。 α−ケトグルタラミン酸＋H2O→アンモニア＋α−ケトグルタル酸
【００２９】（３）Ｄ−グルタミン酸、酸素およびＤ−
グルタミン酸オキシダーゼ（EC 1.4.3.7）の酵素反応
系。この系において、遊離・生成するα−ケトグルタル
酸を定量することにより、Ｄ−グルタミン酸の定量また
はＤ−グルタミン酸オキシダーゼの活性測定をすること
ができる。 Ｄ−グルタミン酸＋H2O＋O2→α−ケトグルタル酸＋アンモニア＋H2O2
グルタミン酸オキシダーゼ（EC 1.4.3.7）の酵素反応
系。この系において、遊離・生成するα−ケトグルタル
酸を定量することにより、Ｄ−グルタミン酸の定量また
はＤ−グルタミン酸オキシダーゼの活性測定をすること
ができる。 Ｄ−グルタミン酸＋H2O＋O2→α−ケトグルタル酸＋アンモニア＋H2O2
【００３０】（４）スクシニル-CoA、二酸化炭素、還元
型フェレドキシンおよび２−オキソグルタル酸シンター
ゼ（EC 1.2.7.3）の酵素反応系。この系において、遊離
・生成するα−ケトグルタル酸を定量することにより、
スクシニル-CoA、二酸化炭素、還元型フェレドキシンの
定量または２−オキソグルタル酸シンターゼの活性測定
をすることができる。 スクシニル-CoA＋CO2＋還元型フェレドキシン →CoA＋α−ケトグルタル酸＋酸化型フェレドキシン
型フェレドキシンおよび２−オキソグルタル酸シンター
ゼ（EC 1.2.7.3）の酵素反応系。この系において、遊離
・生成するα−ケトグルタル酸を定量することにより、
スクシニル-CoA、二酸化炭素、還元型フェレドキシンの
定量または２−オキソグルタル酸シンターゼの活性測定
をすることができる。 スクシニル-CoA＋CO2＋還元型フェレドキシン →CoA＋α−ケトグルタル酸＋酸化型フェレドキシン
【００３１】（５）Ｌ−グルタミン酸、ピルビン酸、お
よびアラニンアミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.2）
の酵素反応系。この系において、遊離・生成するα−ケ
トグルタル酸を定量することによりＬ−グルタミン酸ま
たはピルビン酸の定量あるいはアラニンアミノトランス
フェラーゼの活性測定をすることができる。 Ｌ−グルタル酸＋ピルビン酸→Ｌ−アラニン＋α−ケトグルタル酸
よびアラニンアミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.2）
の酵素反応系。この系において、遊離・生成するα−ケ
トグルタル酸を定量することによりＬ−グルタミン酸ま
たはピルビン酸の定量あるいはアラニンアミノトランス
フェラーゼの活性測定をすることができる。 Ｌ−グルタル酸＋ピルビン酸→Ｌ−アラニン＋α−ケトグルタル酸
【００３２】本発明の定量用組成物においては、Ａ1お
よびＢ1、更に成分（４）の被検成分以外のサイクリン
グ反応を形成せしめる成分の濃度は0.02〜100mM、特に
0.05〜２０mMが好ましく、イソクエン酸デヒドロゲナー
ゼの量は１〜1000u/ml、特に２〜400u/mlが好ましい
が、その量は被検体の種類等により適宜決定することが
でき、これ以上の量を用いることもできる。
よびＢ1、更に成分（４）の被検成分以外のサイクリン
グ反応を形成せしめる成分の濃度は0.02〜100mM、特に
0.05〜２０mMが好ましく、イソクエン酸デヒドロゲナー
ゼの量は１〜1000u/ml、特に２〜400u/mlが好ましい
が、その量は被検体の種類等により適宜決定することが
でき、これ以上の量を用いることもできる。
【００３３】本発明における、Ａ1およびＢ1、更に成分
（４）の被検成分以外のサイクリング反応を形成せしめ
る成分量は被検体中のイソクエン酸またはα−ケトグル
タル酸のうちの１種の被検成分と比較して過剰量である
こと、かつイソクエン酸デヒドロゲナーゼのＡ1、Ｂ1お
よび成分（４）それぞれに対するKm値と比較して過剰量
であることが必要であり、特に被検成分の２０〜10000
倍モルが好ましい。
（４）の被検成分以外のサイクリング反応を形成せしめ
る成分量は被検体中のイソクエン酸またはα−ケトグル
タル酸のうちの１種の被検成分と比較して過剰量である
こと、かつイソクエン酸デヒドロゲナーゼのＡ1、Ｂ1お
よび成分（４）それぞれに対するKm値と比較して過剰量
であることが必要であり、特に被検成分の２０〜10000
倍モルが好ましい。
【００３４】被検成分として存在する成分以外のサイク
リング反応系を形成せしめる成分（４）としては、例え
ば被検成分がα−ケトグルタル酸の場合は二酸化炭素で
あり、被検成分がイソクエン酸の場合は特に必要ない
が、二酸化炭素又はα−ケトグルタル酸のどちらか一方
を添加してもよい。
リング反応系を形成せしめる成分（４）としては、例え
ば被検成分がα−ケトグルタル酸の場合は二酸化炭素で
あり、被検成分がイソクエン酸の場合は特に必要ない
が、二酸化炭素又はα−ケトグルタル酸のどちらか一方
を添加してもよい。
【００３５】また、本発明定量法はイソクエン酸デヒド
ロゲナーゼが（チオ）NAD類および（チオ）NADP類を共
に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチオNAD
類とNAD類もしくはNADP類との組合せ、またはチオNADP
類とNAD類もしくはNADP類との組合せを選んだときに
は、更にイソクエン酸に作用せず、Ｂ2→Ｂ1の反応を形
成する第二のデヒドロゲナーゼを使用し、更に該第二の
デヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることにより、Ｂ
1とＢ2の間にＢ1の再生のための反応系を付与せしめる
ことによりサイクリング反応を形成せしめ得る。
ロゲナーゼが（チオ）NAD類および（チオ）NADP類を共
に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチオNAD
類とNAD類もしくはNADP類との組合せ、またはチオNADP
類とNAD類もしくはNADP類との組合せを選んだときに
は、更にイソクエン酸に作用せず、Ｂ2→Ｂ1の反応を形
成する第二のデヒドロゲナーゼを使用し、更に該第二の
デヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることにより、Ｂ
1とＢ2の間にＢ1の再生のための反応系を付与せしめる
ことによりサイクリング反応を形成せしめ得る。
【００３６】すなわち、イソクエン酸およびα−ケトグ
ルタル酸からなる群より選ばれる１種の被検成分を含有
する被検体に、次の成分（１）〜（５） （１）チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ば
れる１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれ
る１つとを補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質
としてα−ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可
逆反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ1 （３）Ｂ1または／およびＢ2 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 （５）イソクエン酸に作用せず、Ｂ2→Ｂ1の反応を形成
する第二のデヒドロゲナーゼ、および該第二のデヒドロ
ゲナーゼの基質 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔２〕
ルタル酸からなる群より選ばれる１種の被検成分を含有
する被検体に、次の成分（１）〜（５） （１）チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ば
れる１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれ
る１つとを補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質
としてα−ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可
逆反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ1 （３）Ｂ1または／およびＢ2 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 （５）イソクエン酸に作用せず、Ｂ2→Ｂ1の反応を形成
する第二のデヒドロゲナーゼ、および該第二のデヒドロ
ゲナーゼの基質 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔２〕
【００３７】
【化３】
【００３８】（式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NA
DP類またはNAD類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示
し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、またＡ1がNADP類また
はNAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD
類を示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示し、Ｂ2→Ｂ1は
Ｂ2を補酵素としてＢ1を生成する酵素反応を示す）で表
わされるサイクリング反応を形成せしめることによりイ
ソクエン酸またはα−ケトグルタル酸を定量する。
DP類またはNAD類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示
し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、またＡ1がNADP類また
はNAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD
類を示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示し、Ｂ2→Ｂ1は
Ｂ2を補酵素としてＢ1を生成する酵素反応を示す）で表
わされるサイクリング反応を形成せしめることによりイ
ソクエン酸またはα−ケトグルタル酸を定量する。
【００３９】この場合、第二のデヒドロゲナーゼは、こ
の測定系において実質的にＡ1に作用しないものである
か、あるいは実質的にＡ1に作用し得ない条件を設定し
て使用されることが好ましく、例えばＡ1を本質的に補
酵素として利用しない第二のデヒドロゲナーゼを選択す
る組合せ、Ａ1とＢ2の量的関係により第二のデヒドロゲ
ナーゼが実質的にＡ1に作用しない条件を選択する組合
せ等が例示される。定量の際には反応により生成したＡ
2の量を測定する。
の測定系において実質的にＡ1に作用しないものである
か、あるいは実質的にＡ1に作用し得ない条件を設定し
て使用されることが好ましく、例えばＡ1を本質的に補
酵素として利用しない第二のデヒドロゲナーゼを選択す
る組合せ、Ａ1とＢ2の量的関係により第二のデヒドロゲ
ナーゼが実質的にＡ1に作用しない条件を選択する組合
せ等が例示される。定量の際には反応により生成したＡ
2の量を測定する。
【００４０】前記の成分（５）を用いる定量用組成物に
おいて、Ａ1および成分（４）の濃度は0.02〜100mM、特
に0.05〜２０mMが好ましく、Ｂ2または／およびＢ1の濃
度は0.05〜5000μM、特に５〜500μMが好ましく、イソ
クエン酸デヒドロゲナーゼの濃度は１〜1000u/ml、特に
２〜400u/mlが好ましく、第二のデヒドロゲナーゼはＢ2
に対するKm値（mM単位）の２０倍量（u/ml単位）以上に
なるように調製すればよく、例えば１〜100u/mlが好ま
しく、また第二のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例
えば0.05〜２０mMが好ましい。これらの量は被検体の種
類等により適宜決定することができ、これ以上の量を用
いることもできる。
おいて、Ａ1および成分（４）の濃度は0.02〜100mM、特
に0.05〜２０mMが好ましく、Ｂ2または／およびＢ1の濃
度は0.05〜5000μM、特に５〜500μMが好ましく、イソ
クエン酸デヒドロゲナーゼの濃度は１〜1000u/ml、特に
２〜400u/mlが好ましく、第二のデヒドロゲナーゼはＢ2
に対するKm値（mM単位）の２０倍量（u/ml単位）以上に
なるように調製すればよく、例えば１〜100u/mlが好ま
しく、また第二のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例
えば0.05〜２０mMが好ましい。これらの量は被検体の種
類等により適宜決定することができ、これ以上の量を用
いることもできる。
【００４１】第二のデヒドロゲナーゼはＢ1の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ1の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ1が高価
な場合は有効である。また、Ｂ1の代わりにＢ2あるいは
Ｂ1とＢ2の混合物を用いて反応を行なってもよい。この
場合、Ｂ1または／およびＢ2の使用量は特に限定される
ものではないが、一般的にはＡ1の１／１０モル以下、
好ましくは1/100モル以下である。
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ1の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ1が高価
な場合は有効である。また、Ｂ1の代わりにＢ2あるいは
Ｂ1とＢ2の混合物を用いて反応を行なってもよい。この
場合、Ｂ1または／およびＢ2の使用量は特に限定される
ものではないが、一般的にはＡ1の１／１０モル以下、
好ましくは1/100モル以下である。
【００４２】第二のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ｂ2がNAD類またはチオNAD類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とエタ
ノール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.6）
（E.coli由来）とグリセロール、リンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ（EC 1.1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ
−リンゴ酸、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（EC 1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロー
ル−３−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼ（EC 1.1.1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.c
oli由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、
Ｂ2がNADP類またはチオNADP類のときは、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（酵母由
来）とグルコース−６−リン酸、グリオキシル酸デヒド
ロゲナーゼ（EC 1.2.1.17）（Pseudomonas oxalaticus
由来）とCoAとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.1.1.44）（ラット肝、ビール酵
母、E.coli由来）と６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリ
セロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.1
3）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３
−リン酸とリン酸等が挙げられる。
しては、例えば、Ｂ2がNAD類またはチオNAD類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とエタ
ノール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.6）
（E.coli由来）とグリセロール、リンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ（EC 1.1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ
−リンゴ酸、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（EC 1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロー
ル−３−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼ（EC 1.1.1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.c
oli由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、
Ｂ2がNADP類またはチオNADP類のときは、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（酵母由
来）とグルコース−６−リン酸、グリオキシル酸デヒド
ロゲナーゼ（EC 1.2.1.17）（Pseudomonas oxalaticus
由来）とCoAとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.1.1.44）（ラット肝、ビール酵
母、E.coli由来）と６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリ
セロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.1
3）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３
−リン酸とリン酸等が挙げられる。
【００４３】本発明の前記定量法はイソクエン酸デヒド
ロゲナーゼが（チオ）NAD類および（チオ）NADP類を共
に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチオNAD
類とNAD類もしくはNADP類との組合せ、またはチオNADP
類とNAD類もしくはNADP類との組合せを選んだときに
は、更にイソクエン酸に作用せず、Ａ2→Ａ1の反応を形
成する第三のデヒドロゲナーゼを使用し、更に該第三の
デヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることにより、Ａ
1とＡ2との間にＡ1の再生の為の反応系を付与せしめる
ことによりサイクリング反応を形成し得る。
ロゲナーゼが（チオ）NAD類および（チオ）NADP類を共
に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチオNAD
類とNAD類もしくはNADP類との組合せ、またはチオNADP
類とNAD類もしくはNADP類との組合せを選んだときに
は、更にイソクエン酸に作用せず、Ａ2→Ａ1の反応を形
成する第三のデヒドロゲナーゼを使用し、更に該第三の
デヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることにより、Ａ
1とＡ2との間にＡ1の再生の為の反応系を付与せしめる
ことによりサイクリング反応を形成し得る。
【００４４】すなわち、イソクエン酸およびα−ケトグ
ルタル酸からなる群より選ばれる１種の被検成分を含有
する被検体に、次の成分（１）〜（４）および（６） （１）チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ば
れる１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれ
る１つとを補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質
としてα−ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可
逆反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ1または／およびＡ2 （３）Ｂ1 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 （６）イソクエン酸に作用せず、Ａ2→Ａ1の反応を形成
する第三のデヒドロゲナーゼ、および該第三のデヒドロ
ゲナーゼの基質を含有する試薬を作用せしめ、下記反応
式〔３〕
ルタル酸からなる群より選ばれる１種の被検成分を含有
する被検体に、次の成分（１）〜（４）および（６） （１）チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ば
れる１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれ
る１つとを補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質
としてα−ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可
逆反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ1または／およびＡ2 （３）Ｂ1 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 （６）イソクエン酸に作用せず、Ａ2→Ａ1の反応を形成
する第三のデヒドロゲナーゼ、および該第三のデヒドロ
ゲナーゼの基質を含有する試薬を作用せしめ、下記反応
式〔３〕
【００４５】
【化４】
【００４６】（式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NA
DP類またはNAD類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示
し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、またＡ1がNADP類また
はNAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD
類を示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示し、Ａ2→Ａ1は
Ａ2を補酵素としてＡ1を生成する酵素反応を示す）で表
わされるサイクリング反応を形成せしめることによりイ
ソクエン酸または、α−ケトグルタル酸を定量する。
DP類またはNAD類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示
し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、またＡ1がNADP類また
はNAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD
類を示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示し、Ａ2→Ａ1は
Ａ2を補酵素としてＡ1を生成する酵素反応を示す）で表
わされるサイクリング反応を形成せしめることによりイ
ソクエン酸または、α−ケトグルタル酸を定量する。
【００４７】この場合、第三のデヒドロゲナーゼは、こ
の測定系において実質的にＢ1に作用し得ないものであ
るか、あるいは実質的にＢ1に作用し得ない条件を設定
して使用されることが好ましく、例えばＢ1を本質的に
補酵素として利用しない酵素を選択する組合せ、Ｂ1と
Ａ2の量的関係により第三のデヒドロゲナーゼが実質的
にＢ1に作用しない条件を選択する組合せ等が例示され
る。定量の際にはＢ1の消費量を測定する。
の測定系において実質的にＢ1に作用し得ないものであ
るか、あるいは実質的にＢ1に作用し得ない条件を設定
して使用されることが好ましく、例えばＢ1を本質的に
補酵素として利用しない酵素を選択する組合せ、Ｂ1と
Ａ2の量的関係により第三のデヒドロゲナーゼが実質的
にＢ1に作用しない条件を選択する組合せ等が例示され
る。定量の際にはＢ1の消費量を測定する。
【００４８】前記成分（６）を用いる定量用組成物にお
いて、Ｂ1および成分（４）の濃度は0.02〜100mM、特に
0.05〜２０mMが好ましく、Ａ2または／およびＡ1の濃度
は0.05〜5000μM、特に５〜500μMが好ましく、イソク
エン酸デヒドロゲナーゼの濃度は１〜1000u/ml、特に２
〜400u/mlが好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはＡ2に
対するKm値（mM単位）の２０倍量量（u/ml単位）以上に
なるように調製すればよく、例えば１〜100u/mlが好ま
しく、また第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例
えば0.05〜２０mMが好ましい。これらの量は被検体の種
類等により適宜決定することができ、これ以上の量を用
いることもできる。
いて、Ｂ1および成分（４）の濃度は0.02〜100mM、特に
0.05〜２０mMが好ましく、Ａ2または／およびＡ1の濃度
は0.05〜5000μM、特に５〜500μMが好ましく、イソク
エン酸デヒドロゲナーゼの濃度は１〜1000u/ml、特に２
〜400u/mlが好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはＡ2に
対するKm値（mM単位）の２０倍量量（u/ml単位）以上に
なるように調製すればよく、例えば１〜100u/mlが好ま
しく、また第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例
えば0.05〜２０mMが好ましい。これらの量は被検体の種
類等により適宜決定することができ、これ以上の量を用
いることもできる。
【００４９】第三のデヒドロゲナーゼはＡ1の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＡ1の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＡ1が高価
な場合には有効である。また、Ａ1の代わりにＡ2あるい
はＡ1とＡ2の混合物を用いて反応を行なってもよい。こ
の場合、Ａ1または／およびＡ2の使用量は特に限定され
るものではないが、一般的にはＢ1の１／１０モル以
下、好ましくは1/100モル以下である。
めに補助的に添加するものであり、これによってＡ1の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＡ1が高価
な場合には有効である。また、Ａ1の代わりにＡ2あるい
はＡ1とＡ2の混合物を用いて反応を行なってもよい。こ
の場合、Ａ1または／およびＡ2の使用量は特に限定され
るものではないが、一般的にはＢ1の１／１０モル以
下、好ましくは1/100モル以下である。
【００５０】第三のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ａ1がNAD類またはチオNAD類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とアセ
トアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（EC 1.
1.1.6）（E.coli由来）とジヒドロキシアセトン、Ｌ−
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.
1.8）（ウサギ筋肉由来）とジヒドロキシアセトンリン
酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.37）（ブタ
心筋、ウシ心筋由来）とオギザロ酢酸、グリセロアルデ
ヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.12）（ウサギ
骨格筋、肝、酵母、E.coli由来）と１，３−ジホスホ−
Ｄ−グリセリン酸、Ａ1がNADP類またはチオNADP類のと
きは、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC
1.2.1.13）（植物葉緑体由来）と１，３−ジホスホ−
Ｄ−グリセリン酸等が挙げられる。
しては、例えば、Ａ1がNAD類またはチオNAD類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とアセ
トアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（EC 1.
1.1.6）（E.coli由来）とジヒドロキシアセトン、Ｌ−
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.
1.8）（ウサギ筋肉由来）とジヒドロキシアセトンリン
酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.37）（ブタ
心筋、ウシ心筋由来）とオギザロ酢酸、グリセロアルデ
ヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.12）（ウサギ
骨格筋、肝、酵母、E.coli由来）と１，３−ジホスホ−
Ｄ−グリセリン酸、Ａ1がNADP類またはチオNADP類のと
きは、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC
1.2.1.13）（植物葉緑体由来）と１，３−ジホスホ−
Ｄ−グリセリン酸等が挙げられる。
【００５１】かくして、調製された本発明の前記定量用
組成物によって被検体中のイソクエン酸またはα−ケト
グルタル酸を測定するには、上記成分（１）〜（４）、
（１）〜（５）、（１）〜（４）および（６）を含有す
る組成物に被検体0.001〜0.5mlを加え、約３７℃の温度
にて反応させ、反応開始一定時間後の２点間の数分ない
し数十分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３
分後と８分後の５分間における生成されたＡ2の量また
は消費されたＢ1の量を、それぞれの吸収波長に基づく
吸光度の変化によって測定すればよい。例えば、Ａ2が
チオNADH、Ｂ1がNADHの場合、Ａ2の生成を400nm付近の
吸光度の増加により測定するか、あるいはＢ 1の消費を3
40nm付近の吸光度の減少により測定し、既知濃度のイソ
クエン酸またはα−ケトグルタル酸を用いて測定したと
きの値と比較すれば、被検体液中のそれぞれの量をリア
ルタイムで求めることができる。
組成物によって被検体中のイソクエン酸またはα−ケト
グルタル酸を測定するには、上記成分（１）〜（４）、
（１）〜（５）、（１）〜（４）および（６）を含有す
る組成物に被検体0.001〜0.5mlを加え、約３７℃の温度
にて反応させ、反応開始一定時間後の２点間の数分ない
し数十分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３
分後と８分後の５分間における生成されたＡ2の量また
は消費されたＢ1の量を、それぞれの吸収波長に基づく
吸光度の変化によって測定すればよい。例えば、Ａ2が
チオNADH、Ｂ1がNADHの場合、Ａ2の生成を400nm付近の
吸光度の増加により測定するか、あるいはＢ 1の消費を3
40nm付近の吸光度の減少により測定し、既知濃度のイソ
クエン酸またはα−ケトグルタル酸を用いて測定したと
きの値と比較すれば、被検体液中のそれぞれの量をリア
ルタイムで求めることができる。
【００５２】また、被検体中にイソクエン酸とα−ケト
グルタル酸が共存している場合は、本発明の前記定量法
によれば、これらの合計量が定量される。個々の成分量
を定量するには、あらかじめ被検体をどちらかの成分の
みに作用する酵素で消去する等の前処理を施した後、前
記酵素サイクリング反応に導けばよい。
グルタル酸が共存している場合は、本発明の前記定量法
によれば、これらの合計量が定量される。個々の成分量
を定量するには、あらかじめ被検体をどちらかの成分の
みに作用する酵素で消去する等の前処理を施した後、前
記酵素サイクリング反応に導けばよい。
【００５３】また、本発明の前記定量法は、被検体液中
のイソクエン酸またはα−ケトグルタル酸そのものを酵
素サイクリング反応に導くものであり、被検液中の共存
物質の影響を受けにくいため、被検液のブランク測定を
省略することができ、レイトアッセイによる簡便な測定
をなし得る。
のイソクエン酸またはα−ケトグルタル酸そのものを酵
素サイクリング反応に導くものであり、被検液中の共存
物質の影響を受けにくいため、被検液のブランク測定を
省略することができ、レイトアッセイによる簡便な測定
をなし得る。
【００５４】尚、本発明においてはＡ2またはＢ1の測定
に当たり、吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を使
用して定量を行なうこともできる。また、被検体中のイ
ソクエン酸およびα−ケトグルタル酸は塩を形成してい
ても、本発明定量法を実施するうえで、何ら影響を及ぼ
さない。
に当たり、吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を使
用して定量を行なうこともできる。また、被検体中のイ
ソクエン酸およびα−ケトグルタル酸は塩を形成してい
ても、本発明定量法を実施するうえで、何ら影響を及ぼ
さない。
【００５５】
【実施例】以下に本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。
明するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。
【００５６】実施例１ イソクエン酸の定量 ＜試薬＞ ４０mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.1） １０mM 炭酸水素カリウム １mM チオNADP（シグマ社製） 0.5mM 還元型NADP（オリエンタル酵母社製） ２mM 塩化マグネシウム １０u/ml イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガ
ー マンハイム社製：ブタ心臓由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、２０、４０、６
０、８０、100μMのDL−イソクエン酸ナトリウム溶液
（和光純薬社製）をそれぞれ２０μｌ添加し、３７℃に
て反応を開始させた。反応開始後３分目と５分目の400n
mにおける吸光度を読み取りその差を求めた。濃度０を
試薬ブランクとし、それぞれのイソクエン酸ナトリウム
濃度のときの値からこの値を引き、その結果を図１に示
した。図１から明らかなように、イソクエン酸ナトリウ
ム量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
ー マンハイム社製：ブタ心臓由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、２０、４０、６
０、８０、100μMのDL−イソクエン酸ナトリウム溶液
（和光純薬社製）をそれぞれ２０μｌ添加し、３７℃に
て反応を開始させた。反応開始後３分目と５分目の400n
mにおける吸光度を読み取りその差を求めた。濃度０を
試薬ブランクとし、それぞれのイソクエン酸ナトリウム
濃度のときの値からこの値を引き、その結果を図１に示
した。図１から明らかなように、イソクエン酸ナトリウ
ム量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
【００５７】実施例２ イソクエン酸の定量 ＜試薬＞ ５０mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.1） １０mM 炭酸水素カリウム ３mM チオNAD（シグマ社製） １mM 還元型NADP（オリエンタル酵母社製） ４mM 塩化マグネシウム １mM AMP １０u/ml イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガ
ー マンハイム社製：ブタ心臓由来） ３４u/ml イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（NAD）（オ
リエンタル酵母社製：酵母由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、１０、２０、３
０、４０、５０μMのDL−イソクエン酸ナトリウム溶液
をそれぞれ２０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させ
た。反応開始後２分目と４分目の400nmにおける吸光度
を読み取りその差を求めた。濃度０を試薬ブランクと
し、それぞれのイソクエン酸ナトリウム濃度のときの値
からこの値を引き、その結果を図２に示した。図２から
明らかなように、イソクエン酸ナトリウム量に対する吸
光度変化量は良好な直線性を示した。
ー マンハイム社製：ブタ心臓由来） ３４u/ml イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（NAD）（オ
リエンタル酵母社製：酵母由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、１０、２０、３
０、４０、５０μMのDL−イソクエン酸ナトリウム溶液
をそれぞれ２０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させ
た。反応開始後２分目と４分目の400nmにおける吸光度
を読み取りその差を求めた。濃度０を試薬ブランクと
し、それぞれのイソクエン酸ナトリウム濃度のときの値
からこの値を引き、その結果を図２に示した。図２から
明らかなように、イソクエン酸ナトリウム量に対する吸
光度変化量は良好な直線性を示した。
【００５８】実施例３ α−ケトグルタル酸の定量 ＜試薬＞ ５０mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.1） １０mM 炭酸水素カリウム ３mM チオNAD（シグマ社製） １mM 還元型NADP（オリエンタル酵母社製） ４mM 塩化マグネシウム １mM AMP １０u/ml イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガ
ー マンハイム社製：ブタ心臓由来） ３４u/ml イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（NAD）（オ
リエンタル酵母社製：酵母由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、５、１０、１
５、２０、２５μMのα−ケトグルタル酸溶液をそれぞ
れ２０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応
開始後２分目と４分目の400nmにおける吸光度を読み取
りその差を求めた。濃度０を試薬ブランクとし、それぞ
れのα−ケトグルタル酸濃度のときの値からこの値を引
き、その結果を図３に示した。図３から明らかなよう
に、α−ケトグルタル酸量に対する吸光度変化量は良好
な直線性を示した。
ー マンハイム社製：ブタ心臓由来） ３４u/ml イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（NAD）（オ
リエンタル酵母社製：酵母由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、５、１０、１
５、２０、２５μMのα−ケトグルタル酸溶液をそれぞ
れ２０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応
開始後２分目と４分目の400nmにおける吸光度を読み取
りその差を求めた。濃度０を試薬ブランクとし、それぞ
れのα−ケトグルタル酸濃度のときの値からこの値を引
き、その結果を図３に示した。図３から明らかなよう
に、α−ケトグルタル酸量に対する吸光度変化量は良好
な直線性を示した。
【００５９】
【発明の効果】前述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生ずることな
く、また酵素サイクリング反応を組合せることにより、
測定感度を著しく増大させることが可能となる。その結
果、少量の検体の使用により簡便かつ精度よく被検体中
のイソクエン酸またはα−ケトグルタル酸を定量するこ
とができる。
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生ずることな
く、また酵素サイクリング反応を組合せることにより、
測定感度を著しく増大させることが可能となる。その結
果、少量の検体の使用により簡便かつ精度よく被検体中
のイソクエン酸またはα−ケトグルタル酸を定量するこ
とができる。
【図１】実施例１における、イソクエン酸ナトリウム量
に対する400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図
面である。
に対する400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図
面である。
【図２】実施例２における、イソクエン酸ナトリウム量
に対する400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図
面である。
に対する400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図
面である。
【図３】実施例３における、α−ケトグルタル酸量に対
する400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面で
ある。
する400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/66 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 イソクエン酸およびα−ケトグルタル酸
からなる群より選ばれる１種の被検成分を含有する被検
体に、次の成分（１）〜（４） （１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フェート類（以下チオNADP類という）およびチオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオNAD類と
いう）からなる群より選ばれる１つと、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフェート類（以下NADP類と
いう）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類
（以下NAD類という）からなる群より選ばれる１つとを
補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質としてα−
ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可逆反応をな
すイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ1 （３）Ｂ1 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔１〕 【化１】 （式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類またはNA
D類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示し、Ｂ1はＡ1
がチオNADP類またはチオNAD類のときは還元型NADP類ま
たは還元型NAD類を、またＡ1がNADP類またはNAD類のと
きは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類を示し、
Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示す）で表わされるサイクリ
ング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ2ま
たはＢ1の量を測定することを特徴とするイソクエン酸
またはα−ケトグルタル酸の定量法。 - 【請求項２】 NADP類が、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドホスフェート（NADP）、アセチルピリジンア
デニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルNADP）、
アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフ
ェートおよびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオ
チドホスフェート（デアミノNADP）からなる群より選ば
れるものである請求項１記載のイソクエン酸またはα−
ケトグルタル酸の定量法。 - 【請求項３】 NAD類が、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（NAD）、アセチルピリジンアデニンジヌク
レオチド（アセチルNAD）、アセチルピリジンヒポキサ
ンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポキサン
チンジヌクレオチド（デアミノNAD）からなる群より選
ばれるものである請求項１記載のイソクエン酸またはα
−ケトグルタル酸の定量法。 - 【請求項４】 チオNADP類が、チオニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドホスフェート（チオNADP）およびチ
オニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフ
ェートからなる群より選ばれるものである請求項１記載
のイソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の定量法。 - 【請求項５】 チオNAD類が、チオニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（チオNAD）およびチオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群より選ば
れるものである請求項１記載のイソクエン酸またはα−
ケトグルタル酸の定量法。 - 【請求項６】 下記成分（１）〜（４） （１）チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ば
れる１つと、NADP類およびNAD類より選ばれる１つとを
補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質としてα−
ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可逆反応をな
すイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ1 （３）Ｂ1 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 を含有することを特徴とするイソクエン酸またはα−ケ
トグルタル酸定量用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3125903A JP3034988B2 (ja) | 1991-05-29 | 1991-05-29 | イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3125903A JP3034988B2 (ja) | 1991-05-29 | 1991-05-29 | イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04349899A JPH04349899A (ja) | 1992-12-04 |
| JP3034988B2 true JP3034988B2 (ja) | 2000-04-17 |
Family
ID=14921765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3125903A Expired - Lifetime JP3034988B2 (ja) | 1991-05-29 | 1991-05-29 | イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3034988B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6487711B2 (ja) * | 2015-02-20 | 2019-03-20 | 旭化成ファーマ株式会社 | プリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた、オルトリン酸、アルカリホスファターゼ、及びピロリン酸等の新規な測定方法、並びに組成物 |
| CN109929908A (zh) * | 2017-12-15 | 2019-06-25 | 上海交通大学医学院 | α-酮戊二酸依赖型酶的酶活检测试剂盒及其应用 |
-
1991
- 1991-05-29 JP JP3125903A patent/JP3034988B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04349899A (ja) | 1992-12-04 |
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