CA1301037C - Procede analytique pour la determination d'un coenzyme reduit - Google Patents

Abstract

A B S T R C T On met l'échantillon analytique contenant le coenzyme à déterminer, notamment NADH ou NADPH, en présence d'un composé aromatique fluoré. En présence d'oxygène et de peroxydase, ce composé fluoré libère des ions fluorure à une vitesse proportionnelle à la quantité présente de coenzyme à déterminer. On dose les ions F- ainsi formés ce qui conduit au résultat recherché.

Description

:~3~ 3'7 PROCEDE ANALYTIQUE P~UR LA DETERMINA~ION D'UN CC~NZYME REDUIT
La présente invention se rapporte au damaine des analyses bio-lcgiques et, plus particulièrement à la aétermination de co-enzymes dont la molécule contient de la nicotinamide, notamment NADH, NADPH
~ et APADH.
On sait que les abbréviations ci-dessus désignent les corps sui-vants:
~ DH = forme réduite du NAD (ou NAD+) (nicotinamide-adenine-di-nucleotide), appelé aussi co-enzyme I ou DPN (aiphosphopyridi-ne nucléotide) , NADPH = forme réduite du NADP (nicotinami~e-adenine-dinucleo-tide phosphate) appelé ausi co-enzyme II ou TPN (triphosphopy-ridine nucléotide) APADH = forme réduite ae l'APAD (acétylpyriaine-adenine-dinucléo-tide).
~ La structure du NAD est composée successivement d'un groupe 3- amiao-pyridinium fixé en position 1- d'une unité ribose, elle-même reliée par sa position -5- à un groupe diphosphate fixé en -5'- d'une se-conde unité ribose laquelle comporte en ~ un groupe adenine.
La conversion réversible au NAD en NADH est schématisée comme suit (R désignant la chaîne ribose-diphosphate-ribose-adenine):
+ 2 H ~ ~ C~
R R
NAD~ NADH
Les co-enzymes à nicotinamide jouent un rôle dans un grana nombre ,, ~
3~37 de réactions enzymatiques biochimiq~es utilisées comme tests clini-ques. Parmi celles-ci, on peut citer notamment l'oxydation aes ~ -hy-droxyacides en acides cétoniques correspondants en présence d'une déshydrcgénase appropriée. A ti~re d'exemple on peut citer l'oxyda-tion de l'acide lactique ou des lactates en acide pyruvique l a c t a t e CH3--CHOH~OOOH+ NAD > CH3CO-COCE + N~DH
déshydrogenase De manière analogue le glucose-6-phosphate est oxydé en présence de NADP et de glucose-6-phosphate deshydrogénase (G6PDH) en glucono-~lac-tone-6-phospbate et NADPH. Le dosage du NADP ou du NADPH dans une telle réaction revêt une grande i~portance car, indirectement, il permet de déterminer le glucose dans les fluides biologiques, celui-ci étant, auparavant, transformé en glucose-6-phospnate en présence d'ATP
(adenosine triphosphate) et d'hexokinase.
Par ailleurs, le NADH agit comme facteur co-enzymatique dans le conversion par les sels d'ammonium du 2-oxoglutarate en L-gluta-mate en présence de GLDH (~luta~ate deshydrogénase) ce qui permet, par aétermination du NADH restant (ou au NAD~ formé), de aoser l'am-monium du milieu réactionnel. Cette réaction est applicable pour le dosage de l'urée dans les fluides biologiques, celle-ci fournissant, en présence ~'uréase, le NH3 impliqué en tant qu'ion NH4 dans la con-version susindiquée.
On trouvera description d'autres applications liées à la ae-term m ation aes ~acteurs NAD+, NADH et APADH dans les documents sui-vants: EP-A-29 104 (MILES); FR-A-2 299 644 (ARZO).
La aétenmination des co-enzymes ci-dessus, suivant 1'un ou 1'au-tre de leurs états d'cxydoréduction revêtant une grande Lmportance~
de ncmbreuses techniques ont été proposées à cet effet.
Ainsi, le NAD et le NADH ayant aes absorptions différentes dans l' W, on peut doser une forme en présence de l'autre par spectropho-tométrie. On peut, par ailleurs, amplifier la sensibilité aes déter-minations spectrophotom~triques par u~ilisation conjointe de co~pc, sés rédox colorés, par exemple des composés de tetrazolium qui, en présence de ~ADH ou de N~DPH et d'un accepteur d'électrons comme le ~;
_ 3 _ ~ ~lU3~
méthosulphate de phénazine, donne aes sels de formazan fortement co-lorés. (Voir par exemple le document EP-A-114 ~67). On peut égale-ment utiliser des techniques fluorimétriques telles que décrites, par exemple, dans le document FR-A-~ 266 644.
On peut également procéder par voie électrochimique tel que dé-crit dans le document J 56 035 050 où on oxyde le NADH ou le NADPH
par du bleu de Meldola, puis on oxyae électrochimiquement la forme réduite de ce colorant et on mesure le courant d'oxydation.
On a récemment préconisé (EP-A-29 i04) ce faire intervenir la réaction suivante:
hydroxylase NADH ~ou NADP~) + ~2 ~ NAD (ou NADP) ~ H~O~
pseudosubstrat Le percxyde d'hydrogène ainsi li~éré est ensuite dosé par les moyens habituels, par exemple par son action, catalysée par la peroxydase, sur un indicateur rédox, la forme oxydée de celui-ci étant dosée par colorimétrie.
Le document EP-A-124.909 décrit un procédé similaire mais sim-plifié, car ne faisant intervenir comme enzyme que la peroxy~ase seu-le. Le procedé consiste à faire réagir le coenzyme avec la peroxy-dase en présence ~'ions métAlliques tels que Mn+2 ou Co+2 ce qui en-gendre la formation quantitative de peroxyde d'hydrogène, ce dernier étant alors dosé comme ci-dessus par les moyens habituels, par exemr ple par colorimétrie, notamment le système co~prenant la 4-aminoanti-pyrine ccmme coupleur et un co~osé phénolique ou une amine arcna-tique comme chrcm~phore. En l'ab6ence d'ions métalliques (voir p.5, paragraphe 1 ~e ce document) la formation de H2O2 n'est pas quanti-tative et, en conséquence, la réaction n'a pas d'application analy-tique.
~ uoique les techniques colorimétriques soient très séduisantes, elles ne sont appliquables qu'en milieu non coloré et optiquement transparent ce qui est loin ~'être le cas de la plupart des fluides biologiques à analyser. Par ailleurs, elle est relativement compli-quée à appliquer et ne présente en général pas la sensibilité des techniques électr ~étriques. A ce sujet, la présente requérante a ~301~37 récemment aivulgué (voir EP-A-20 ~23) que dans l'analyse ~e H~02 en-gendré par oxydation du glucose en présence de glucose oxidase, la technique consistant à ~aire agir cet H202 sur un compcsé aromati-que fluoré en presence de peroxyoase de manière à libérer des ions fluorure, ceux-ci etant ensuite déterminés électrométriquement au mDyen d'une électrode spécifique de ces ions, conduit à d'excellents résultats tant ~u point de vue ~e la sensibilité que de la précision des mesures.
Il devenait dès lors tentant ae ccmbiner la réaction de forma-tion ae H202 décrite dans le document EP-A-124.909 avec la détermi-nation fluorométrique de H2o2 décrite dans le document EP~A-20623.
Or, c'est avec surprise qu'on a constaté qu'une telle combinaison n'est pas directement possible en raison des observations suivantes:
(1) En présence d'ions métalliques en concentration telle que celle préoonisée dans le document EP-A-124.909 (5 mmole/l; p.9, li-gne 6), l'activité de la peroxydase est normalement inhibée en ce qui concerne son action catalytique sur la scission ae la liaison C-F et il est nécessaire de neutraliser cet effet inhibiteur par ad-jonction d'un activateur, tel que la 4-aminoantipyrine.

(2) En l'absence d'ions métalliques, ou tout au moins en pré-sence de très faibles auantitës ae ceux-ci (d'un ordre de gran~eur inférieur de 1000 aux quantités précQnisées dans le document EP-A-124,909, ou moins~ c'est-à-dire dans aes conditions où il a été ad-mis que H2O2 ne se forme pas quantitativement), on a découvert avec surprise que les c oenzymes NADH ou NAD~H pouvaient bel et bien être dosés quantitativement par la réaction de scission ae la liaison C-~en fluorure en présence de peroxydase (et ceci sans apport d'anti-pyrine dont la présence, dans ce cas, a, bien au contraire, un ef-fet inhibiteurj. Il s'agit donc là d'un type de réaction nouveau ne faisant pas intervenir la formation quantitative intermédiaire d'eau oxygénée comme dans l'art antérieur. Cet état de choses a ~'ailleurs été confirmé par adjonction au milieu d'analyse d'une enz~e telle que la catalase qui provogue la consommation de H202 au fur et à me-sure de sa formation. Ainsi, l'adjonction de catalase au milieu réac-tionnel préconisé par le ~ocument EP-A-124.909 (~Mn+2~ ~10-~M) pro-voque une chute d'effic2cité en ce sui concerne la scission de la liaison carbone-fluor ae l'or~re ae 70% alors que dans un milieu ~or-13~1~37 responaant, mais a 10-5M de Mn+~, l'effet ae la catalase est négli-geable.
Les découvertes ayant fait l'objet des considérations ci-des-5US ont donc permis l'application d'une technique nouvelle et impré-vue à la aétermination des co-enzymes a nicotir~nide en général. Cet-te technique a donné lieu au procédé de la présente invention tel que défini à la revendication 1 annexée. Un des avantages de ce pro-cédé est la faculté de doser les co-enzymes en présence de réactifs inhibiteurs de la formation d'~o2. Par substances à activité pero-xidasique, on entend comprendre toutes les substances ayant aes pro-priétés catalytiques similaires à celles de la peroxydase, notamment l'hémcglobine et ses dérivés (voir BOYER et al., "m e Enzymes" 8 (19~3) Academic Press).
Bien entendu, pour la détermination de l'ion fluorure libéré
par ce procédé on aura, de préférence, recours à une méthode élec-trométrique telle que divulguée dans le document EP-A-20 623. Cepen-dant, toute autre technique de détermination du fluorure pcurrait également convenir.
Le principe général du présent procedé peut être décrit briè-vement comme suit: le systeme de base de l'invention consiste à ajou-ter a un milieu tampon contenant le co-enzyme réduit à doser un excès d'un ccmposé fluoré aromatique et de perr~xydase puis d'agiter ce mi-lieu en présence d'air. Il se produit alors une scission ae la liai-son F-C du composé fluoré et libération correspondante d'ions F- a une vitesse réactionnelle proportionnelle à la quantité de co-enzy-me présent. On notera qu'il existe également un facteur de stoechio-métrie entre cette quantité d'ions florure likérés et la quantité
de co-enzyme à doser; cependant, au point ae vue analytique, cette relation est moins intéressante car la réaction, de vive au départr se ralentit ~ortement par la suite et il n'est pas pratique de pro-céder à des mesures du type "end-point". On pourrait cependant pré-voir des analyses à "temps fixé" en prooedant à un aosage des réac-tants après un temps donné, toujours le même dans une série d'ana-lyses du même type. Cepenaant, en général, il est préférable de pro-céder aux mesures de vitesses de libération aes ions F- dans des c~n-ditions bien standardisées afin d'assurer une bonne reproductibili-té aes mesures; notamment, la mesure des pentes des courbes de vi-~301~37 tesse (qui bien entendu dépenaent ae certains param.ètres rëaction-nels aussi bien que de la concentration de la substance à mesurer) se fera avantageusement après un certain temps de latence ~incuba-tion), ce temps étant conservé fixe pour une série d'essais compa-ratifs. On notera cependant que le temps ~e latence peut etre légè-rement différent d'une analyse à l'autre, la vitesse maximale étant d'autant plus tôt atteinte que la concentration en NADH est plus granr de. Comme tampons, on peut utiliser les tampons usuels à pH de 5 a 7,5, notamment acétate, "tris", caccdylate, etc... On préfère ce dernier car il permet une rapide stabilisation de réFonse de l'élec-trode à fluor. Par ailleurs, on a remarqué que la vitesse réaction-nelle (la scission de la liaison C-F) dépend de la concentration du tampQn en diméthylarsinate. De préférence, le tampon cacodylate pré-sente une moLarité de 0,05 ~1 à 0,5 M.
La déterm mation ae la concentration des ions F' libérés sera effectuée de préférence au moyen d'une électrode sensible aux ions F- mais inerte aux autres types d'ions. Comme type d'électrode, on peut favorablement utiliser une électrode sélective des ions F- de type 96-09 provenant de ORION RESEAR~H INC. Cambridge, ~ass. USA.
Cependant, d'autres électroaes peuvent également convenir. On trou-vera tous les détails relatifs à l'utilisation de telles electroaes pour le dosage des ions F- aans le dacument précité EP-A-20 623.
Il est bien entendu que le présent procédé s'applique egalement a la déterminatian de tous constituants additionnels susceptible de réagir quantitativement en présence des co-enzymes à nicotinamide (sous forme réduite ou axyaée) et, par là, d'entraîner une variation (mesurable par le présent procédé) de la forme reduite existant dans le milieu.
Ainsi, lors~ue le present milieu réactionnel est mis en oeuvre dans la détermination de systèmes précurseurs, c'est-à-dire ceux où
la formation quantitative ae co-enzyme dépe~d d'une ou plusieurs trans-formations successives d'une substance à mesurer, la technique à ap-pliquer est tout à fait similaire à celle décrite ci-dessus; en ef-fet, et c'est l'a un des avantages significatifs de l'invention, la détection et la mesure électrochimique des ions fluorures est indif-férente a la présence, dans le milieu réactionnel, de ncmbreux au-tres facteurs et substances dissous. Aussi, le présent procedé est-il ~31:~1(J37 directement applicable à la mRsure du glucose et de l'urée suivant aes schëmas similaires à ceux cités dans l'introduction.
Ainsi, pour la aétermination du glucose, on fera d'abora inter-venir sa transformation en glucose-6-phosphate en présence d'ATP et d'hexokinase (ou ~'une autre enzyme de propriétés similaires); puis on ajoutera une quantité connue de NADP et on mesurera, suivant le prccessus précité, le NADPH formé lors de la transformation du gluco-se-6-phosphate en glucono- ~-lactone-~-phosphate en présence de GbPDH.
Au dé~art de la réaction, le milieu réactionnel ne contient pas de NADH, ce dernier apparaissant au cours du processus enzymati~ue. En fait, les deux réactions, celle catalysée par l'hexokinase et cel-le catalysée par la G6, se déroulent simultanément en présence de NAD+ et d'Al~. La formation de NADH est donc mesurée, en continu, depuis le début de la réaction.
Des considérations voisines s'appliquent à tous les autres cas de réaction biochimique faisant intervenir les présents coren2ymes soit à titre de produits de départ, soit à titre ae produits réaction-nels. C'est ainsi le cas du dosage de l'urée.
~ un échantillon de celle-ci, prélevé dans un fluide biologi-que, par exemple l'urine ou le plasma sanguin et mélangé à un tam-pan approprié, on ajoute un excès d'uréase, a'~xoglutarate et de GLDH
accompagnés du composé fluoré e~ a'une quantité exactement connue ae NADH (en excès, elle aussi, mais cependant du même ordre ae gran-deur que celle de l'urée à mesurer pour ne pas se heurter à des pro-blèmes de disproportions). Puis, après avoir attendu un temps déter-mihé pour que s'effectue la transformation du NADH en NAD~, on in-troduit l'électroae à ions F- dans le mélange et met celui-ci en agi-tation à l'air; puis, on ajoute une quantité catalytique de peroxy-dase (POD) et on mesure la variation du potentiel de l'électrcde au cours du temps, cette mesure permettant de doser la quantité de N~DH
non utilisée dans la réaction et, donc, d'en déduire la quantité
d'urée de l'échantillon analytique.
On a fourni en détail dans le docu~ent EP-A-20 623 la t~chni-que opératoire impliquant l'électrcde à fluor ainsi que les consi-dérations physicochimiques relatives à l'interprétation des résul-tats.
~ n bref, pour déterminer la vitesse de liberation des ions F-- 8 - 1301~37 consécutive à la réaction a'un échantillon inconnu, on se réfère de préférence à une courbe étalon. On peut obtenir une courbe d ' étalon-nage en dosant, ccmme décrit plus haut, une série d'échantillons a concentration connues de co-enzyme. On enregistre, pour chaque échan-tillon, la vitesse de libération des F- et on mesure la pente aes courbes de cinétique à un mcment (qui est bien entendu le même pour chaque échantillon) où les courbes de vitesse sont à peu près aes droites. Puis on reporte graphiquement ces valeurs de pente en fonc-tion aes concentrations en co-enzyme, de manière à établir une cour-be de référence standard. Les paramètres électrometriques mesurés à utiliser pour La préparation des c ~ bes de cinétiques peuvent être les lectures de tensions du système électrométrique utilisé conjoin-tement avec l'électrode à fluor (mV) ou, mieux, les valeurs corres-pondantes de ~F-] calculables par l'équation de Nernst, laquelle, aans ce cas, a la forme suivante:
E = E' - S.Log tF-]
où E est le voltage mesuré et E' est une constante prcpre du systè-me qu'on détermine expérlmentalement et qui englobe les facteurs d'ac-tivité et les potentiels de jonctions liquides. S est la "pente de Nernst" qui est une constante égalant environ 57,5 mV (dans le tampon cacodylate a pH 7.S) pour une variation de 10 unités ae la concen-tration des F-, cette dernière étant exprimée en moles/l. Si les va-leurs de [Fl calculées à partir de la relation ci-dessus sont utili-sées dans les graphiques de vitesse au lieu des valeurs en mV, on obtient des courbes se rapprochant plus ae lignes droites, dont la pente est plus facile à établir et qui Fermettent de aessiner des graphiques de référence plus précis.
Parmi les composés arcmatiques fluorés sur le ncyau convenant à la mise en oe uvre de la présente invention, on cite, plus parLi-culièrement, les 2-, 3- et 4-fluorophenols, le tetrafluorophénol, le pentafluorphénol et la p-fluoroaniline; on préfère utiliser le 4- et le 2-fluorophénol.
On notera par ailleurs que le taux minimum de co-enzyme détec-table et mesurable Far ce procédé peut être abaissé en ajout&nt une faible quantité d'ions manganèse II au milieu réactionnel. Cette aq-130~037 g aition n'est cependant valable que dans Les cas où la concentrationen co- enzyme est très faible et au voisinage ou en-dessous de lali-mite inférieure normalement accessible sans manganèse. Ainsi, l'ad-jonction de Mn+~ (concentration ae 2 x 10-6 à 10-4 ~i) est utile lors-que les quantités ae COrenzyme sont ae l'ordre 10-4 à 10-5 M. Dans un tel cas, on arrive à multiplier la vitesse pratique de la réac-tion par un facteur d'ordre 5. En présence de concentration plus éle-vée de co-enzyme, la présence d'ions Mn+2 s'acccmpagne d'un défaut de linéarité tendant à diminuer la précision de la mesure; en con-séquence, lorsque les concentations de co-enzyme à déterminer sont supérieures à 10-4, il peut être préférable de ne pas utiliser de manganèse.
Les exemples suivants, pour la meilleure compréhension desquels on se référera au dessin annexé, illustrent l'invention plus en dé-tail.
La fig. 1 est un graphique représentant la variation de la quan-tité de NAD~ en fonction de la vitesse de libération des ions F- à
pH 7,5.
La fig. 2 est un graphique similaire a celui de la fig. 1, mais se rapportant à l'analyse du glucose.
La fig. 3 est un graphique similaire à celui de la fig. 1, mais se rapportant à l'analyse de l'urée.
La fig. 4 est un graphique similaire à celui de la fig. 1 mais se rapportant à un pH de 5,5.
EXEMPL~ 1 Détermination du N~DH à pH 7,5 Pour cette aétermination suivant l'inventiQn, on travaille dans une solution tampon. De préférence, on utilise le tampon cacodylate clas-sique. Les tampons phosphates de pH 7-7,5 conviennent également mais, dans ce cas, la stabilisation de l'électrode de mesure (lorsqu'on détermine F- électro~étriquement) se fait plus difficilement et la calibration au moyen de solutions connues de haF est moins précise et reproductible. Le tampon "tris" entre 7 et 7,5 convient egalement.
a) Préparation au tamFon caccdylate: dans 800 ml d'eau deux fois - 1~301~7 -- ~.o --distillée, on a dissous 21,41 g de diméthylarsinate de soaium-trihy-drate (MER~X). On a ensuite ajouté 1 ml d'une solution 5 x 10-3M de chlorure de manganèse (II) et 2 ml d'une solution 10-3M de NaF. On a ensuite porté le p~ à exactement 7,5 par du HCl N et on a complé-té le niveau a 1 litre avec de l'eau deux fois distillée.
b) Milieu réactionnel pour l'analyse: on a dissous 0,il~ g de p-fluorophénol (EGA-CHEMIE) dans 100 ml àu tampon cacodylate (a) ci-dessus. Le p-fluorophénol contenant toujours une faible quanti-té de F-, la concentration d'ion fluorure dans le milieu (b) est de l'ordre de 3-5 x 10-6M.
c) Solution de peroxydase: on a utilisé de la peroxydase de rai-fort (EoEHRINGER; RZ 3,0; 250 U/mg); on en a dissous dans le tampon (a) ci-dessus une quantité convenable pour réaliser une solution à
environ 0,4 g/l ( 100 U/ml).
d) Solutions d'étalonnage de NADH: on a utilisé le sel disodi-que du N~DH (SIGMA) de poids moléculaire théorique 759 D. On en a dissous dans le tampon caccdylate (a) ae manière à réaliser une so-lution titrée de 38 g/l (5xlo-2M). Puis, par dilution au moyen au même tampon, on a préparé des solutions d'étalonnage à 3,75; ~,25 et 1,25 x 10-2M; 5 et 1.25 x 10-3M; et S x 10-4M.
e) Analyse: comme récipient laboratoire, on a utilisé un becher de 10 ml en polypropylène agité magnétiquement. Dans ce becher, on a placé 4,~ ml de milieu réactionnel (b), puis 0,1 ml de solution (c)~ la solution à concentration zero de NADH est constituée par le tampon (a) seul. On a plongé dans le milieu une électrode spécifi-quement sensible aux ions F- (type Orion 96-09; Orion RESEAR~H, Cambridge, Mass., USA ccmportant sa propre électrode de référence), celle-ci ét_nt reliée à un électr ~ètre de type habituel ( KEIT~LEY
Electro~eter, Cleveland, Ohio, U5A).
L'appareil étant enclanché, on a laisse le tout se stAhiliser

3 minutes à température ambiante sous agitation puis on a ajouté
0,1 ml d'une des solutions standard de NADH (d). On a alors procé-dé à la mesure ~e la vitesse de liberation des ions F- pendant une péricde d'environ 3 min p_r la réaction précitée en enregistrant, au mcyen d'un recorder, le potentiel d'électroae correspondant. Par ailleurs, les données ainsi enregistrées sont transmises à un cal-culateur qui fournit la pente de la courbe de vitesse dans sa région 1301~3~
la plu5 linéaire (après 20 sec environ et pendant environ 30 sec à
1 mun., ces paramètres étant, bien entendu, gardés constants pour la phase totale d'étalonnage ainsi que pour les analyses de solutions inconnues faites par la suite).
Les valeurs trouvées (S), exprimées directement en/uMole àe F-libérés par min à partir de la formule précitée, figurent ci-dessous:
Concentration de NACA Pente de la courbe de vitesse (S) les) ~uM (F-)/min O ~
0,236 0,512 100 2,05 250 3,4g8 500 5,976 750 7,581 1000 ~,082 Le graphique obtenu grâce aux valeurs résumées ci-aessu~ est repr~-senté a la fig. 1.
Pour l'analyse ~e solutions inconnues de N~DH, on a pr wédé exac-tement comme décrit ci-dessus et, après avoir déterminé la valeur de la pente àe la courbe réactionnelle, on a obtenu la valeur recher-chée grâce au graphique étAlon de la fig. 1. Bien entendu, dans la pratique des analyses chimiques, ces résultats sont fournis direc-tement par ie calc1l1Ateur.
EXl~MPLE ~
Determination du ~ADH à pH 5,5 On a procédé comme aans l'Exemple 1 avec, cependant, les différen-ces suivantes:
~3Ql(~37 a) Le tampon cacodylate (O.lM) est identique à celui de l'Exem~
ple 1 à la différence près que son pH a été ajusté à 5,5 avec du HCl N.
b) Le milieu réactionnel contient 0,OlM ~e 4-fluorophénol 4FP.
c) Solution de peroxidase: solution à 300 U/ml (env. 1,2 g/l) d) Solution d'étalonnage: ces solutions sont calculées de maniè-re que 0,1 ml (prise) contienne, successivement, les quantités de NADH suivantes (en ~1): 0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, ~00.
L'analyse a été effectuée comme décri~ a l'Exemple 1. La réac-tion est cependant plus rapide et la pente effective de La courbe de vitesse est remarquablement constante, déjà 30 sec après l'addi-tion du NACH. Les résultats figurent ci-dessous ainsi qu'à la fig.

4.
Vltesse le) (~F~ /l/min O O
2,04 4,41 6,74 100 8,80 125 il,28 150 13,33 175 15,45 200 18,01 Détermination ~u glucose Cette détermination est effectuée selon le schéma suivant (voir No-tice: Test Glucose Rapide, ROC~E, DIAGNC6TICA):
D-Glucose I ATP HK ~ glucose-6-phosphate + ADP
Glucose-6-phosphate + NAD+ G6P-~H ~ D-Gluconate-6-phosphate + NAD~ + H+
ATP = adenosine triphosphate HK = hexokinase ADP = adenosine diphosphate G6P-D = glucose-6-phosphate deshydrogénase a) Tampon cacodyLate: Il s'agit du meme tampon qu'à l'exe~ple 1 pré-cédent.
b) Milieu réactionnel: Dans 24,5 ml de tam~on (a), on a dissous 1 dose de produit No 0711004 livré par la Scciété KCC~E et contenant:
ATP> 50 ~moles; NAD~ > 50~umo1es; HK > 7 U; G6P-~H > 8 U. On a ensui-te ajouté 0,5 ml de la solution (c) de peroxydase de l'exemple 1 et 28 mg de p-fluorophénol. On obtient ainsi une solution dans laquel-le les réactifs ont les conc~ntrations suivantes: ATP 2 x 10-3M; NAD~
~ x 10-3M; HX 0,28 U/ml; G6P-DH 0,32 U/ml.
c) Solution de glucose standara; on a utilisé aes solutions à 0,5;
1; ~; 3; 4 et 5 9/1 dans de l'acide benzoique aqueux à 0,1%.
Pour l'analyse, on a procédé comme décrit à l'exemple 1 en uti-lisant 4,9 ml du milieu réactionnel et 0,1 ml de la solution étAlon (c~ ajoutee après une prériode de stabilisation de 3 min. Les résul-tats obtenus figurent ci-dessous ainsi qu'à la fig~ 2.
La courbe representée à la fig. ~ a permis, par comparaison, de mettre en relation les valeurs de cinétique obtenues avec des so-lutions inconnues de glucose avec la concentration effective en glu-cose de ces solutions~
.
13C~1037 Concentration en glucose Vitesse ~oles) ~oles F-/l/min O O,Og 55,5 0,50 111 0,69 222 1,08 33~ 1,29 444 1,50 555 1,65 EX~~LE 4 ;
Détermination de l'urée.
Cette réaction est basée sur le schéma suivan~ (voir "Urea W Test de ROCHE DIAGN06TICA):
uréase urée + 2H20 ~ ~ 2NH3 + CO2 NH3 + H+ ~ NH4+
GLD~
NH4+ + 2-oxoglutarate + N~DH e~________ L-Glutamate + MAD+ + ~ O
GLDH = glutamate deshydrogenase (a) 1'ampon cacodylate: même tampon (a) qu'à l'exemple 1.
(b) Milieu réactionnel: dans 30 ml de tampon (a), on a dissous 1 do-se de mélange enzyme-substrat de produit No 0713228 livré par la Sc-ciété ROCHE (Reagent kit ~or the kinetic determination of urea in serum). Cette dose contient: urea~e > 25 U; 2-oxoglutarate 197~lmole;
NADH 6 ~umole. On a encore ajouté 33,7 m3 de p,fluorophénol et 0,~
ml de solution de GLDH ( ~50 U). Le milieu (b) con~ient donc les réac-~3(~ 37 tifs ci-dessus aux concentrations suivantes:
Urease 0,83 U/ml; 2-oxoglutarate 6,57 x 10-3M; NAD~ 2 x 10-4M;
~n~ 3,33 U/ml.
(c) Solution de peroxydase: il s'agit de la même solution à 100 U/ml décrite à l'exemple 1.
(d) Solution d'étalo Mage d'urée: on a préparé des solutions d'urée dans un tampon phosphate physiologique, pH 6,7 aux concentrations suivantes:
7,13; 4,99; 3,56; 1,426 x 10-3M
Pour l'analyse, on a procédé comme à l'exemple 1 en utilisant 3,~2 ml de milieu réactionnel (b) et 0,1 ml de la solution d'urée étalon.
On a a~ité le mélange des réactifs à llexception de la peroxydase (l'électroae étant mise en service) pendant 10 min, puis on a ajou-té 0,08 ml de la solution de proxydase. On a alors fait débuter la mesure et effectué le calcul des vitesses après un délai de 20 à 30 sec. Les résultats figurent ci-dessous ainsi que sur le graphi~ue de la fig. 3.
On notera que aans ce test, on aose le N~D~ qui apparalt au c ~ s de la réaction; c'est la raison pour l~quelle on prévoit un temps d'incubation de 10 min; on a constaté que l'analyse est touj ~ s va-lable quoique moins performante avec des temps a'incubation de seu-lement 3 min.
Concentration d'urée deQuantité d'urée Vitesse la solut. standard dans la mesure (10-3M) (X x 10-6Mole ~Imoles F-/ljmin) _ . _ _ _ , .. ...... . .. . .
O O O,gl 1,426 35,6 0,81 3,56 89 0,67 4,99 125 0,58 7,13 178 0,46 13()~837 Le graphique de la fig. 3 a été utilisé pour déterminer, par compa-raison, la concentration en urée d'échantillons inconnus, ceux-ci ayant été soumis à la procédure d'analyse décrite ci-dessus.
EXE~PLE 5 Détermination au NADH en Présence d'organofluorés divers.
(a) On a utilisé un tampon caccdylate identique au tanpon (a) de l'exemple 1.
(b) On a préparé une série de milieux réactionnels en prooédant co~
me aécrit pour la solutio~ (b) de l'exemple 1, de manière a réali-ser des solutions à 1o-2M dans le tampon (a) des organofluorés sui-vants: 4-fluor~phénol (4FP); 3-fluorophénol (3FP); 2-fluorcphénol 2FP); tetrafluorophénol (TFP); pentafluorophénol (PFP).
(c) On a utilise une solution de peroxydase identique a la solution (c) de l'exemple 1.
(a) Gn a utilisé une solution de NADH (voir solution (d) de l'exem-ple l) de 5 x l0-2~ dans le tampon (a).
On a procédé à l'analyse camme décrit à l'exemple 1 avec des quantités identiques de réactifs; milieu réactionnel (b) 4,8 ml; sc-lution (c) 0,i ml ~olution (d) 0,1 ml.
Les résultats des mesures de vitesses figurent ci-dessous:
Organofluoré
4FP 4,00 3FP l,00 2FP 2,65 ~ 0,71 PFP 2,62 On constate que c'est le 4FP qui donne le plus de sensibilité
à la mesure.
On a effectué des essais avec des solutions de peroxydase au-tres que la peroxydase de raifort; toutes ces solutions on été pc-l30la37 sitives. A ce sujet, on notera ew ore que la pureté d'une peroxyda-se telle que la peroxydase de raifort peut varier notablement sui-vant sa provenance. On traduit cette pureté par un nombre RZ (Rein-heit2ahl) rapporté à des mesures d'absorption optique A 403 nm RZ = r, __ A 275 nm RZ peut atteindre la valeur 3 pour les produits de pureté maximum.
A titre d'exemple, on donne ci~dessus, la valeur de RZ pour les pe-roxydases suivantes:
RZ
Peroxydase SIGMA 0,64 Peroxydase MILES LAB. 1,25 Pero~ydase EoEHRINGER, ~annheim 3,0 On notera encore que les procédures relatives a la mesure des autres co-enzymes a nicotinamide, notamment de NADPH et APADH dans les autres contextes ou ces co-enzymes sont impliques sont identiques a ce qui a été décrit ci-dessus.

Déterm~lation ~e l'effet de la catalase On a travaillé de manière similaire à ce qui est décrit dans les kxem~
ples précédents et ajouté une quantité connue de solution àe NADH
à un milieu réacticnnel préparé dans un ta~pon "tris", p~ 7,4, 0,05 M.
Le p~emier milieu réactionnel (A) a été préparé de manière à conte-nir une concentration en ions métalliques correspondant à la àescrip-tion du dccument EP-A.124.909:
Mn+~ (sous forme de sulfate) 10-2 M
AAP (4-aminoantipyrine) 5 x 10-4 M
POD (peroxydase) 6 U/ml 130~3~

On a laissé incuber ce mélange et après un temps déterminé: 10 sec (cas Al) et 2 min (cas A2), on a ajouté une quantité de p-fluo-rophénol (FP) telle que la solution soit 10 m~ en ce réactif. On a alors enregistré la vitesse de libération de l'ion fluor comme dé-crit aux Exemples précédents.
On a répété ces essais dans des conditions identiques mais, cet-te fois, après avoir rajouté au milieu une quantité de catalase tel-le que celui-ci contienne 275 U/ml (cas ACl et AC2).
On a préparé un second milieu réactionnel (B) inspiré des con-ditions de la présente invention:
Mn++ 10-5 M
AAP --POD 2 U/ml On a procédé com~e ci-aessus avec la même quantité de p,fluorophe-nol ajouté après les mêmes temps de latence (Bl) et (B2) et, dans un deuxième essai, avec 275 U/ml de catalase (cas ECl t BC2).
Les vitesses de réaction obtenues (en unités arbitraires comt paratives) figurent ci-dessous:
Es _ Vitesse Catalase Al 7,1 non A2 7,6 non AC1 2,3 oui AC2 2,5 oui Bl 3,0 non B2 3,0 non ECl 3,0 oui EC2 2,7 oui On constate aonc que, contrairement à ce qui se produit dans les cas (A), c'est-à-dire forte diminution de la formation de H202 en pré-sence de catalase, cette dernière n'exerce qu'une influence négli-geable sur la marche de la réaction suivant l'invention.
130~
On notera par ailleurs que si, dans les cas Al et A2 on opère dans un milieu privé d'amino-antipyrine ~AAP) la vitesse réaction-nelle est fortement ralentie, ce qui indique que cette substance joue un rôle d'activateur; c'est exactement le contraire en ce qui con-cerne les cas B quoique, alors, la ~ifférence soit beaucoup moins nette. On peut donc dire que aans les conditions opératoires préco-nisees par le dccument EP-A-124 909, la determination directe au h202 par simple remplacement de la méthode colorimétrique traditionnel-le par la détermination fluorométrique du document EP~A-20623 ne don-ne pas les résultats escomptés par une telle juxtaposition. Pour l'ob-tention de résultats optimalisés, il faut travailler en présence d'un activateur tel que AAP et en l'absence de catalase où d'un quelcon-que autre facteur susceptible de conscmmer le H202 fonmé.
EXEMPL~ 7 Comparaisons entre le prooedé de l'invention et celui du dccument EP-A.124.909 On a procédé dans les conditicns générales de l'~xemple 6 en tampon "Tris" sur une prise de ~ x 10-4 M de NADH, en présence de 6 U/ml de POD, en faisant varier le pH, la conoentration en ions Mn+2 et en présence ou non de 4-aminoantipyrine. Les conditions opératoires et les rés~11tats sous forme des vitesses de réaction correspondan-tes (exprLmées en umole de F-/l/min) sont rassemblés ci-dessous.
13~ 37 Concentration pH 4~AAP ~F-) ~umole/l/min) Mn+2 (M) . . _ , ,, , ., _ _ _ 10-2 7,55 x 10-4 ~7 10-~ 7,5 0 0,27 10-5 7,55 x 10-4 0,04 10-5 7,5 0 5,3 10-5 5,55 x 10-4 7,2 10-5 5,5 0 54,2 ~ F-csais corresponaant à l'invention.
Ces résultats montrent clairement les avantages de l'invention re-lativement à la référence: sensibilité plus grande à pH 5,5; effet inhibiteur de la 4-am moantipyrine en présence d'un faible taux de manganèse, alors que c'est l'effet contraire qui se manifeste aux concentrations plus élevées de manganese (10-2M), c'est-a-dire dans les conditions où la formation de H202 prédomine.
E~E~LE 8 Performance conparative de divers co~posés aromatiques fluorés à
~H 5,5 On a prccédé Far analogie avec les Exemples 2 et 5 en utilisant les reactifs suivants:
a) Tampon cacodylate: comme à l'Exemple 2, 0,1 M, pH 5,5.
b) Milieu réactionnel: on dissout 0,425 mm3le ~u co~posé fl~o-ré cité ci-dessous dans environ 40 ml de tampon (a), on ajoute 0,2 ml de solution de NaF 10-3 M et on co0plète à 50 ml avec le ta~pon (a). Co wentration en F- = 4 x 10-6 M. Les cc~po_és fluorés suivants ont été utilisés:
bl 4-fluorcphénol (56 mg) 4-FP;
b2 4-fluoroaniline (55,5 n~) 4-FA;
b3 tetrafluorcphénol (83 mg) TFP;
:;
13~1037 b4 pentafluorophénol (92 ng) PFP.
c) Solution de MnC12 à 10-3 M dans de l'eau bidistillée.
à) Solution de peroxidase (POD) à ~0~ U/ml dans un tampon acé-tate 0,01 M à pH 5,5 (peroxydase SIGM~ à 100 U/m~) e) Solution de NADH 5 x 10-2 M dans un tampon "Tris" 0,05 M
à pH 7,5.
Pour la mesure, on a procédé ccmme suit: Dans un bécher de po-lyéthylène (10 ml) on a placé 4,85 ml de la solution (b), 0,05 ml de la solution (c) et 0,05 ml de la solution de peroxydase (d). On a plongé l'électrcde à fluor dans la solution agitée magnétiquement, on a laissé 1'appareil se stabiliser 1 min, puis on a ajouté 0,05 ml de la solution de NADH (e).
S'agissant dlune mesure de type comparatif, on s'est contenté
dans ce test de mesurer la quantité de F- libérée 1 minute après l'ad-jonction de la solution (e) (technique de mesure ~ite "à temps fi-xé") Les résultats réunis au tableau ci-dessous en fonction de la nature du composé fluoré utilisé mLntrent qu'a pH 5,5 c'est le PFP
~ui fcurnit les tests les plus sensibles.
Composé fluoré F' ~m) 4-FP 17,9 4-FA 9,1 TFP 57,7 PFP 62,7

Claims (11)

LES REALISATIONS DE L'INVENTION AU SUJET DESQUELLES UN DROIT
EXCLUSIF DE PROPRIETE OU DE PRIVILEGE EST REVENDIQUE SONT
DEFINIES COMME IL SUIT:

1. Procédé analytique pour la détermination d'un co-enzyme à
nicotinamide réduit, notamment NADH, NADPH et APADH, caractérisé par le fait qu'on met celui-ci en présence d'un composé aromatique à noyau fluoré, d'oxygène, d'une substance à activité peroxidasique, ledit co-enyme ayant alors la propriètè de provoquer la séparation de l'atome de fluor de celui-ci en fluorure, puis qu'on dose l'ion fluorure ainsi formé, la vitesse de formation de celui-ci étant quantitativement liée à la quantité originale de co-enzyme à
déterminer.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le milieu réactionnel comprend au moins un constituant additionnel réagissant en présence dudit co-enzyme à nicotinamide ou de la forme oxydée de celui-ci, la mise en oeuvre du procédé permettant de doser ce constituant additionnel.

3 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on dose électrométriquement les ions fluorures au moyen d'une électrode spécifique de ces ions.

4. Procédé suivant la revendication 3, caractéristé par le fait qu'on travaille dans un tampon à pH 5-7, 5.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait que le tampon est un tampon "tris" ou acétate.

6. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait qu'on travaille dans un tampon cacodylate de molarité de 0,05 M à 0,5 M, la vitesse de réaction dépendant de la concentration en diméthylarsinate de ce tampon.

7. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait qu'on ajoute au milieu d'analyse des ions Mn++ en concentration de 2 x 10-6 - 10-4M.

8. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on l'applique au dosage du glucose dans des échantillons de fluides biologiques, celui-ci réagissant avec l'ATP en présence d'hexokinase pour donner du glucose-6-phosphate et ce dernier étant oxydé par le NAD+ en présence de glucose-6-phosphate déshydrogenase en D-gluconate-6-phosphate avec formation correspondante de NADH en proportion directe du glucose à mesurer.

9. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on l'applique au dosage de l'urée dans les fluides biologiques, celle-ci fournissant de l'amoniaque par hydrolyse en présence d'uréase, cet amoniaque fournissant du L-glutamate par réaction avec le 2-oxoglutarate en présence de glutamate déshydrogenase et de NADH, la proportion consommée de celui-ci étant en raison directe de l'urée à
mesurer.

10. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme composé à noyau fluoré, un composé
choisi parmi les 2-, 3-, et 4-fluorophénols, le tetrafluorophénol, le pentafluorophénol et la 4-fluoroaniline.

11. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la substance à activité peroxidasique est choisie parmi l'enzyme peroxydase et l'hémoglobine et ses dérivés.