JP3023700B2

JP3023700B2 - Ｌ―リンゴ酸又はオギザロ酢酸の高感度定量法及び定量用組成物

Info

Publication number: JP3023700B2
Application number: JP2308384A
Authority: JP
Inventors: 成植田; 守高橋; 英生美崎; 茂生田
Original assignee: 旭化成工業株式会社
Priority date: 1990-11-14
Filing date: 1990-11-14
Publication date: 2000-03-21
Anticipated expiration: 2015-03-21
Also published as: JPH04179498A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸、特に臨床検
査、食品検査等におけるＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢
酸、あるいはＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸を反応生成
物とする物質の高感度定量法及び定量用組成物に関す
る。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕

血清等の生体試料中のオギザロ酢酸を測定することは
心疾患、肝疾患等の診断などにおいて、またＬ−リンゴ
酸を測定することは、食品検査などにおいて極めて重要
である。

従来、生体成分や食品成分におけるＬ−リンゴ酸やオ
ギザロ酢酸の測定には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MD
H）（EC1.1.1.37）が使用されている。

リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、次に示す可逆反応リンゴ酸＋NADオギザロ酢酸＋NADH₂ を触媒する酵素であり、クエン酸回路の酵素として自然
界に広く分布するものである。本酵素は臨床検査分野に
おいて、心疾患、肝疾患等の血清酵素診断法の草分け的
存在であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
（EC2.6.1.1）（慣用名GOT）活性測定時に共役酵素とし
て用いられている。すなわち、アスパラギン酸とα−ケ
トグルタル酸の存在下、GOTの作用により生成したオギ
ザロ酢酸をリンゴ酸デヒドロゲナーゼを用いて測定する
ものである。リンゴ酸デヒドロゲナーゼはその他にも様
々な生体成分や食品成分の分析に使用され、例えば血清
CO₂の定量やクエン酸の定量に使用する共役酵素や、ワ
イン中のＬ−リンゴ酸の定量に使用する酵素として用い
られている。

また一般に、酵素を用いて分析を行なう場合、測定し
ようとする対象物質を、分光学的に検出可能な過酸化水
素や還元型NAD（Ｐ）等に変換することが行われ、この
検出可能な物質の量は化学量論的に測定対象物と等しく
なる。現在、この検出可能な物質の量を測定する方法と
しては、分光分析器を用いる方法が最も普及している
が、これも感度上に限界があり、測定対象物の含量が少
ない場合適さないという欠点があった。

そこで、測定対象物の含量が少ない場合や、測定対象
物を含む被検体が少量の場合などは、分光分析よりも感
度の優れた蛍光分析や発光分析等が行われている。しか
しながら、これらの方法も臨床検査等の汎用検査におい
ては、機器の普及という点からあまり適したものではな
かった。

また、微量の物質を測定するその他の方法としては、
該物質が等量の補酵素等に変換できる場合、二種類の酵
素を用いて補酵素等を増幅する、いわゆる酵素サイクリ
ング法が知られている。例えば、NADサイクリング、CoA
サイクリング、ATPサイクリングなどがあるが、これら
の方法は臨床検査等のルーチン分析においては、操作が
煩雑なためほとんど用いられていないのが現状である。

高感度測定法がもたらす利点としては、測定対象物の
含量が少ない場合はもとより、測定に必要な検体量を減
らすことができるため、例えば血清のように種々の成分
を含むものを検体に用いる場合は、その測定系に及ぼさ
れる共存物質の影響を小さくすることができる。また、
ある限られた被検体量で検査できる項目数を増やすこと
も可能であり、更には検体が人血液である場合などは、
採血量を減らすことができるため、被採血者の心理的負
担を軽減することもできる。

一方、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以
下NAD類という）及びニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェート類（以下NADP類という）は還元型の
極大吸収波長が340nm付近にあり、これらのアナログで
あるチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以
下チオNAD類という）及びチオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート類（以下チオNADP類とい
う）は還元型の極大吸収波長が400nm付近にあり、それ
ぞれの還元型の極大吸収波長が異なることが知られてい
る。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において、本発明者らは鋭意研究を行った
結果、Ｌ−リンゴ酸を基質としてオギザロ酢酸を生成す
る酵素サイクリング反応を実施するに当り、酵素として
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.37）を使用し、２
種類の補酵素の一方にチオNADP類またはチオNAD類を使
用し、他方にNADP類またはNAD類を使用して、どちらか
一方の補酵素の変化量のみを定量すれば、Ｌ−リンゴ酸
又はオギザロ酢酸を高感度に定量できることを見出し、
更にこの方法によればＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸定
量を正確に行うことができることを見出し、本発明を完
成した。

すなわち、本発明は被検体に、チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくともＬ−リンゴ酸を基質としてオ
ギザロ酢酸を生成する可逆反応をなすリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ、 A₁、 B₁、を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式（Ｉ）（式中、A₁はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A₂はA₁の還元型生成物を示し、B₁はA₁がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A₁がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B₂はB₁の酸化型生成物を
示す）で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によ
って変化するA₂又はB₁の量を測定することを特徴とする
Ｌ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸の高感度定量法、並びに
上記、及びを含有することを特徴とするＬ−リン
ゴ酸又はオギザロ酢酸定量用組成物を提供するものであ
る。

本発明において、A₁及びB₂はチオNADP類、チオNAD
類、NADP類又はNAD類を示すが、このうちチオNADP類又
はチオNAD類としては例えば、チオニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドホスフェート（チオNADP）、チオニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェー
ト；及びチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（チオNAD）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドが挙げられる。また、NADP類又はNAD類とし
ては例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スフェート（NADP）、アセチルピリジンアデニンジヌク
レオチドホスフェート（アセチルNADP）、アセチルピリ
ジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェート、ニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェート
（デアミノNADP）；及びニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NAD）、アセチルピリジンアデニンジヌクレ
オチド（アセチルNAD）、アセチルピリジンヒポキサン
チンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチド（デアミノNAD）が挙げられる。

本発明においてはA₁及びB₂のいずれか一方がチオNAD
類又はチオNADP類であることが必要である。

また、定量に用いるリンゴ酸デヒドロゲナーゼが（チ
オ）NAD類のみを補酵素とする場合は上述のチオNAD類と
NAD類より、（チオ）NADP類のみを補酵素とする場合は
上述のチオNADP類とNADP類より、また用いるリンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼが（チオ）NAD類及び（チオ）NADP類を
共に補酵素とする場合は上述のチオNAD類及びチオNADP
類と上述のNAD類及びNADP類より適宜選択して用いれば
よい。

本発明において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとしては
上記要件を具備するものであれば何れのものでも使用で
きる。その具体例は、（チオ）NAD類を補酵素とするも
のとしては、臨床酵素ハンドブック（講談社）p705記載
の、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis）、ニ
ュウロスポラクラサ（Neurospora crassa）、ウシ心
臓（細胞質画分）、ウシ心臓（ミトコンドリア画分）、
ブタ心臓（ミトコンドリア画分）由来のもの及びThermu
s flavua（シグマ社製）、バチルスエスピー（Bacill
us sp.）（東洋醸造社製）由来のものなどが挙げられ
る。これらのうち、高等動物由来のものは細胞内で極在
性を異にするミトコンドリア及び細胞質由来の２種のア
イソザイムが存在することが知られている。また、特に
哺乳類では心臓に多く含有され、また骨格筋、肝、脳、
腎などほとんどの臓器に含まれる。また、（チオ）NADP
類を補酵素とするものとしては、臨床酵素ハンドブック
（講談社）p708記載の、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC
1.1.1.82）が挙げられる。この酵素は植物の葉の葉肉プ
ロロプラストに存在し、光感受性であるが、インビトロ
ではジチオスレイトールの添加で完全に光照射時の活性
を示す。更にまた（チオ）NAD類及び（チオ）NADP類の
両者を補酵素とするものとしては、サッカロミセスバ
イリ（Saccharomyces bailii）由来のリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ（Arch.Microbiol.131（３）,266−270（198
2））が挙げられる。これらの酵素は単独あるいは適宜
２種以上を組み合わせて用いることができる。

本発明の高感度定量法を用いれば、被検体中にもとも
と含有されているＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸を測定
することができるが、また、Ｌ−リンゴ酸又はオギザロ
酢酸を遊離、生成する酵素系における基質やその酵素活
性営を測定することもできる。更に、本発明の高感度定
量法を用いれば、上記のようなＬ−リンゴ酸又はオギザ
ロ酢酸を遊離、生成する酵素系と連結し得る単一の、若
しくは複数の工程からなる酵素系における基質やその酵
素活性をも測定することができる。これらの酵素系は、
特に限定されるものではないが、例えば以下に示す種々
の反応系が挙げられる。

まず、オギザロ酢酸を遊離、生成する酵素系を例示す
る。

（１）クエン酸とクエン酸リアーゼ（EC4.1.3.6）の酵
素反応系。これにおいて遊離、生成するオギザロ酢酸を
定量することにより、クエン酸の定量又はクエン酸リア
ーゼの活性測定をすることができる。

クエン酸→オギザロ酢酸＋酢酸（２）ホスホエノールピルピン酸、二酸化炭素とホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼ（EC4.1.1.31）の
酵素反応系。これにおいて遊離、生成するオギザロ酢酸
を定量することにより、ホスホエノールピルビン酸、二
酸化炭素の定量又はホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼの活性測定をすることができる。

ホスホエノールピルビン酸＋CO₂＋H₂O →オギザロ酢酸＋リン酸（３）（２）のCO₂がシュウ酸とシュウ酸デカルボキシ
ラーゼ（EC4.1.1.2）の酵素反応系によって遊離、生成
する酵素反応系。これにおいて最終的に遊離、生成する
オギザロ酢酸を定量することにより、シュウ酸の定量又
はシュウ酸デカルボキシラーゼの活性測定をすることが
できる。

シュウ酸→ギ酸＋CO₂ （４）（２）のCO₂がシュウ酸とシュウ酸オキシダーゼ
（EC1.2.3.4）の酵素反応系によって遊離、生成する酵
素反応系。これにおいて最終的に遊離、生成するオギザ
ロ酢酸を定量することにより、シュウ酸の定量又はシュ
ウ酸オキシダーゼの活性測定をすることができる。

シュウ酸＋O₂→2CO₂＋H₂O₂ （５）（２）のCO₂がイソクエン酸、NAD（Ｐ）とイソク
エン酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.41,EC1.1.1.42）の
酵素反応系によって遊離、生成する酵素反応系。これに
おいて最終的に遊離、生成するオギザロ酢酸を定量する
ことにより、イソクエン酸の定量又はイソクエン酸デヒ
ドロゲナーゼの活性測定をすることができる。

イソクエン酸＋NAP（Ｐ） →α−ケトダルタル酸＋CO₂＋NAD（Ｐ）H₂ （６）（２）のCO₂が尿酸とウリカーゼ（EC1.7.3.3）の
酵素反応系によって遊離、生成する酵素反応系。これに
おいて最終的に遊離、生成するオギザロ酢酸を定量する
ことにより、尿酸の定量又はウリカーゼの活性測定をす
ることができる。

尿酸＋O₂＋2H₂O →アラントイン＋CO₂＋H₂O₂ （７）Ｌ−アスパラギン酸、α−ケトグルタル酸とアス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ（EC2.6.1.1）（G
OT）の酵素反応系。これにおいて遊離、生成するオギザ
ロ酢酸を定量することにより、Ｌ−アスパラギン酸、α
−ケトグルタル酸の定量又はアスパラギン酸アミノトラ
ンスフェラーゼの活性測定をすることができる。

Ｌ−アスパラギン酸＋α−ケトグルタル酸 →オギザロ酢酸＋Ｌ−グルタミン酸（８）（７）のα−ケトグルタル酸が（５）の酵素反応
系によって遊離、生成する酵素反応系。これにおいて最
終的に遊離、生成するオギザロ酢酸を定量することによ
り、イソクエン酸の定量又はイソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼの活性測定をすることができる。

また、Ｌ−リンゴ酸を遊離、生成する酵素反応系を例
示する。

（９）フマル酸とフマラーゼ（EC4.2.1.2）の酵素反応
系。これにおいて遊離、生成するＬ−リンゴ酸を定量す
ることにより、フマル酸の定量又はフマラーゼの活性測
定をすることができる。

フマル酸＋H₂O→Ｌ−リンゴ酸（10）グリオキシル酸、アセチルCoAとリンゴ酸シンタ
ーゼ（EC4.1.3.2）の酵素反応系。これにおいて遊離、
生成するＬ−リンゴ酸を定量することにより、グリオキ
シル酸、アセチルCoAの定量又はリンゴ酸シンターゼの
活性測定をすることができる。

グリオキシル酸＋アセチルCoA＋H₂O₂ →Ｌ−リンゴ酸＋CoA 本発明における、A₁及びB₁の量は被検体中のＬ−リン
ゴ酸とオギザロ酢酸の合計量に比較して過剰量であり、
またリンゴ酸デヒドロゲナーゼのA₁及びB₁それぞれに対
するKm値に比較しても過剰量であることが必要であり、
特にＬ−リンゴ酸とオギザロ酢酸の合計量の20〜10000
倍モルが好ましい。

本発明のＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸定量用組成物
においては、A₁及びB₁の濃度は0.02〜100mM、特に0.05
〜20mMが好ましく、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの濃度は
５〜1000U/ml、特に20〜400U/mlが好ましいが、その量
は被検体の種類等により適宜決定することができ、これ
以上の量を用いることもできる。

また、本発明定量法はリンゴ酸デヒドロゲナーゼが単
独であるいは２種以上の組み合わせによって（チオ）NA
D類及び（チオ）NADP類を共に補酵素とする場合におい
て、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もしくはNADP類と
の組み合わせ、またはチオNADP類とNAD類もしくはNADP
類との組み合わせを選んだときは、更に被検体に成分
のＬ−リンゴ酸に作用せず、B₂→B₁の反応を形成する第
２のデヒドロゲナーゼ及び該第２のデヒドロゲナーゼの
基質を作用せしめることにより、後記反応式（II）の如
く、B₁とB₂との間にB₁の再生のための反応系を付与せし
めることによりＬ−リンゴ酸のサイクリング反応も形成
し得る。この場合、定量の際には反応により生成したA₂
の量を測定する。

（式中、A₁はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A₂はA₁の還元型生成物を示し、B₁はA₁がチオNA
DP類又はチオAND類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A₁がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B₂はB₁の酸化型生成物を
示し、B₂→B₁はB₂を補酵素としてB₁を生成する酵素反応
を示す）すなわち、第２のデヒドロゲナーゼはB₁の再生の為に
補助的に添加するものであり、これによってB₁の使用量
を少なくすることが可能となり、特にB₁が高価な場合に
は有効である。また、B₁の代わりにB₂あるいはB₁とB₂の
混合物を用いて反応を行ってもよい。この場合、B₁又は
／及びB₂の使用量は特に限定されるものではないが、一
般的にはA₁の1/10モル以下が好ましい。

この成分を用いるＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸定
量用組成物において、A₁の濃度は0.02〜100mM、特に0.0
5〜20mMが好ましく、B₂又は／及びB₁の濃度は0.05〜500
0μＭ、特に５〜500μＭが好ましく、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼの濃度は５〜1000U/ml、特に20〜500U/mlが好
ましく、第２のデヒドロゲナーゼはB₂に対するKm値（mM
単位）の20倍量（U/ml単位）以上になるように調整すれ
ばよく、例えば１〜100U/mlが好ましく、また第２のデ
ヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.05〜20mMが好
ましい。これらの量は被検体の種類等により適宜決定す
ることができ、これ以上の量を用いることもできる。

第２のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例え
ば、B₂がNAD類またはチオNAD類のときは、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.1）とエタノール、グリセロ
ールデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.6）（E.Coli由来）と
グリセロール、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（EC1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロ
ール−３−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロ
ゲナーゼ（EC1.1.1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.
Coli由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、
B₂がNADP類またはチオNADP類のときは、グルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.49）（酵母由来）
とグルコース−６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼ（EC1.1.1.42）（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエ
ン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（EC1.2.1.17）
（Pseudomonas oxalaticus由来）とCoAとグリオキシル
酸、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.44）
（ラット肝、ビール酵母、E.Coli由来）と６−ホスホ−
Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼ（EC1.2.1.13）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセ
ロアルデヒド−３−リン酸とリン酸、ベンズアルデヒド
デヒドロゲナーゼ（EC1.2.1.7）（Pseudomonas fluores
cens由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。

更にもと、本発明定量法はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
が単独であるいは２種以上の組み合わせによって（チ
オ）NAD類及び（チオ）NADP類を共に補酵素とする場合
において、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もしくはNA
DP類との組み合わせ、またはチオNADP類とNAD類もしく
はNADP類との組み合わせを選んだときは、更に被検体に
成分のＬ−リンゴ酸に作用せず、A₂→A₁の反応を形成
する第３のデヒドロゲナーゼ及び該第３のデヒドロゲナ
ーゼの基質を作用せしめることにより、後記反応式（II
I）の如く、A₁とA₂との間にA₁の再生のための反応系を
付与せしめることによりＬ−リンゴ酸のサイクリング反
応を形成し得る。この場合、定量の際にはB₁の消費量を
測定する。

（式中、A₁はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A₂はA₁の還元型生成物を示し、B₁はA₁がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A₁がNADP類はNAD類のときは還元型チオNADP類又
は還元型チオNAD類を示し、B₂はB₁の酸化型生成物を示
し、A₂→A₁はA₂を補酵素としてA₁を生成する酵素反応を
示す）すなわち、第３のデヒドロゲナーゼはA₁の再生の為に
補助的に添加するものであり、これによってA₁の使用量
を少なくすることが可能となり、特にA₁が高価な場合に
は有効である。また、A₁の代わりにA₂あるいはA₁とA₂の
混合物を用いて反応を行ってもよい。この場合、A₁又は
／及びA₂の使用量は特に限定されるものではないが、一
般的にはB₁の1/10モル以下が好ましい。

この成分を用いる胆汁酸定量用組成物において、B₁
の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜20mMが好ましく、A₂
又は／及びA₁の濃度は0.05〜5000μＭ、特に５〜500μ
Ｍが好ましく、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの濃度は５〜
1000U/ml、特に20〜500U/mlが好ましく、第３のデヒド
ロゲナーゼはA₂に対するKm値（mM単位）の20倍量（U/ml
単位）以上になるように調整すればよく、例えば１〜10
0U/mlが好ましく、また第３のデヒドロゲナーゼの基質
は過剰量、例えば0.05〜20mMが好ましい。これらの量は
被検体の種類等により適宜決定することができ、これ以
上の量を用いることもできる。

第３のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例え
ば、A₁がNAD類またはチオNAD類のときは、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.1）とアセトアルデヒド、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.6）（E.Coli由
来）とジヒドロキシアセトン、グリセロール−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）
とジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロアルデヒドリ
ン酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.12）（ウサギ骨格筋、
肝、酵母、E.Coli由来）と1,3−ジホスホ−Ｄ−グリセ
リン酸、A₁がNADP類またはチオANDP類のときは、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.49）（酵
母由来）とグルコノラクトン−６−リン酸、グリセロア
ルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC1.2.1.13）（植物
葉緑体由来）と1,3−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が
挙げられる。

本発明のＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸の定量用組成
物の調製にあたって、使用できるリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼに関しては、例えば補酵素としてNAD類（好ましく
はNAD）、チオNAD類（好ましくはチオNAD）、あるいはN
ADP類（好ましくはNADP）、チオNADP類（好ましくはチ
オNADP）を用いて、基質となるＬ−リンゴ酸又はオギザ
ロ酢酸に対する反応性を有するものであればよく、これ
ら補酵素と基質を用いることにより確認できるものであ
る。

反応液組成については、使用するリンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼの各補酵素間の相対活性等を考慮して２種の補酵
素を適宜選択し、その後正反応／逆反応の至適pHの間で
pH条件を酵素サイクリング反応が効率よく進行するよう
に設定し、あるいは更にそのpHにおける２種の補酵素の
比率を変化させ、最も効率的な補酵素比になるような条
件を設定すればよい。例えば、ブタ心臓由来のリンゴ酸
デヒドロゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）につ
いてみれば、補酵素にデアミノNAD、チオNADを用いた場
合のNADを用いた場合に対する相対活性は、40mMグリシ
ン−NaOH緩衝液（pH10.0）の時には、それぞれ76％及び
17％であった。また、これらの酵素は単独でも、適宜２
種以上を組合せて用いてもよい。

斯くして、調製された本発明のＬ−リンゴ酸又はオギ
ザロ酢酸定量用組成物によって被検体中のＬ−リンゴ酸
又はオギザロ酢酸量を測定するには、上記成分〜、
〜、あるいは〜及びを含有する組成物に被検
体0.001〜0.5mlを加え、約25〜37℃の温度にて反応さ
せ、反応開始一定時間後の２点間の数分ないし数十分
間、例えば３分後と４分後の１分間又は３分後と８分後
の５分間における生成されたA₂の量又は消費されたB₁の
量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変化によっ
て測定すればよい。例えば、A₂がチオNADH、B₁がNADHの
場合、A₂の生成を400nmの吸光度の増加により測定する
か、あるいはB₁の消費を340nmの吸光度の減少により測
定し、既知濃度のＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸を用い
て測定したときの値と比較すれば、被検液中のＬ−リン
ゴ酸又はオギザロ酢酸量をリアルタイムで算出すること
ができる。また、本測定法においては、酵素サイクリン
グ反応を一定時間実施させた後、反応停止液を加えて酵
素サイクリング反応を停止させ、吸光度を測定すること
により被検液中のＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸の量を
測定することもできる。

また、本発明定量法は、被検液中のＬ−リンゴ酸又は
オギザロ酢酸そのものを酵素サイクリング反応に導くも
のであり、被検液中の共存物質の影響を受けにくいた
め、被検液のブランク測定を省略することができ、レイ
トアッセイによる簡便な測定を成し得る。

尚、本発明においてはA₂又はB₁の測定に当り、吸光度
測定の代りに他の公知の測定法を使用して定量を行うこ
ともできる。

〔発明の効果〕

上述の如く、本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵
素を用いるため測定誤差が生じず、また、酵素的サイク
リング反応を組合せることによって感度を増大させるこ
とができるため、少量の検体で迅速かつ正確に被検体中
のＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸を定量することができ
る。

〔実施例〕

次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本
発明はこれによって何ら限定されるものではない。

実施例１〈試薬〉 50Mmグリシン−NaOH緩衝液（pH10.0） 0.1mM NADH₂（オリエンタル酵母社製） 4mMチオNAD（シグマ社製） 5mM塩化マグネシウム 120U/mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー社製、ブタ心臓由来）〈操作〉上記試薬1mlをキュベットにとり、予め37℃にて加温
した。これに０、20、40、60、80、100μＭのＬ−リン
ゴ酸溶液をそれぞれ20μ添加し、37℃にて反応を開始
させた。反応開始後３分目と４分目の400nmにおける吸
光度を読みとり、その差を求めた。その結果を図１に示
す。図１から明らかなように、Ｌ−リンゴ酸量に対する
吸光度変化量は良好な直線性を示した。

実施例２〈試薬〉 50Mmグリシン−NaOH緩衝液（pH10.0） 0.08mM NADH₂（オリエンタル酵母社製） 4mMチオNAD（シグマ社製） 5mM塩化マグネシウム 80U/mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー社製、ブタ心臓由来）〈操作〉上記試薬1mlをキュベットにとり、予め37℃にて加温
した。これに０、10、20、30、40、50μＭのオギザロ酢
酸溶液をそれぞれ40μ添加し、37℃にて反応を開始さ
せた。反応開始後３分目と５分目の400nmにおける吸光
度を読みとり、その差を求めた。その結果を図２に示
す。図２から明らかなように、オギザロ酢酸量に対する
吸光度変化量は良好な直線性を示した。

実施例３ 50Mmグリシン−NaOH緩衝液（pH10.0） 0.08mM NADH₂（オリエンタル酵母社製） 4mMチオNAD（シグマ社製） 5mM塩化亜鉛 0.26U/mlクエン酸リアーゼ（ベーリンガー社製、アエロバクターアエロゲネ
ス由来） 60U/mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー社製、ブタ心臓由来）〈操作〉上記試薬1mlをキュベットにとり、予め25℃にて加温
した。これに０、40、80、120、160、200μＭのクエン
酸溶液をそれぞれ25μ添加し、25℃にて反応を開始さ
せた。反応開始後５分目と７分目の400nmにおける吸光
度を読みとり、その差を求めた。その結果を図３に示
す。図３から明らかなように、クエン酸量に対する吸光
度変化量は良好な直線性を示した。この結果は、クエン
酸リアーゼの作用でクエン酸より生成した成分の一つで
あるオギザロ酢酸が定量できたことを示している。

実施例４〈試薬〉 50Mmグリシン−NaOH緩衝液（pH10.0） 0.08mM NADH₂（オリエンタル酵母社製） 4mMチオNAD（シグマ社製） 5mM塩化亜鉛 0.52U/mlクエン酸リアーゼ（ベーリンガー社製、アエロバクターアエロゲネ
ス由来） 60U/mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー社製、ブタ心臓由来）〈操作〉上記試薬1mlをキュベットにとり、予め25℃にて加温
した。これを蒸留水、0.2mMクエン酸溶液と蒸留水
を1:1で混合したもの、正常人血清と蒸留水を1:1で混
合したもの、0.2mMクエン酸溶液と正常人血清を1:1で
混合したものそれぞれにつき50μ添加し、25℃にて反
応を開始させた。反応開始後５分目と７分目の400nmに
おける吸光度を読みとり、その差を求めた。の検体の
値を試薬ブランクとしてそれ以外の検体の値より差引
き、血清に加えたクエン酸の回収率を調べたところ、結
果は表１の如くであり、97.7％と良好であった。また、
本実施例に用いた血清中のクエン酸の濃度は111.6μＭ
と算出された。

実施例５〈試薬〉 50Mmグリシン−NaOH緩衝液（pH10.0） 0.1mM NADH₂（オリエンタル酵母社製） 5mMチオNAD（シグマ社製） 5mM塩化マグネシウム 0.5mMアセチルCoA 5mMホスホエノールピルビン酸 8U/mlホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
（東洋醸造社製、サーマスエスピー由来 80U/mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー社製、ブタ心臓由来）〈操作〉上記試薬1mlをキュベットにとり、予め37℃にて加温
した。これに０、40、80、120、160、200μＭの重炭酸
カリウム溶液をそれぞれ25μ添加し、37℃にて反応を
開始させた。反応開始後５分目と７分目の400nmにおけ
る吸光度を読みとり、その差を求めた。重炭酸カリウム
の濃度が０のときを試薬ブランクとし、その結果を図４
に示す。図４から明らかなように、重炭酸カリウム量に
対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１における、Ｌ−リンゴ酸量に対する400n
mにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。図２は実施例２における、オギザロ酢酸量に対する400n
mにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。図３は実施例３における、クエン酸量に対する400nmに
おけるレイトアッセイの結果を示す図面である。図４は実施例５における、重炭酸カリウム量に対する40
0nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 3/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】被検体に、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ート類（以下チオNADP類という）及びチオニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド類（以下チオNAD類という）
からなる群より選ばれる１つと、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェート類（以下NADP類という）
及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下NA
D類という）からなる群より選ばれる１つとを補酵素と
し、少なくともＬ−リンゴ酸を基質としてオギザロ酢酸
を生成する可逆反応をなすリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、 A₁、 B₁、を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式（式中、A₁はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A₂はA₁の還元型生成物を示し、B₁はA₁がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A₁がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B₂はB₁の酸化型生成物を
示す）で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によ
って変化するA₂又はB₁の量を測定することを特徴とする
Ｌ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸の高感度定量法。
【請求項２】チオNADP類がチオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（チオNADP）、チオニコチ
ンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェートか
らなる群より選ばれるものである請求項１記載のＬ−リ
ンゴ酸又はオギザロ酢酸の高感度定量法。
【請求項３】チオNAD類がチオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチドからなる群より選ばれるもの
である請求項１記載のＬ−リンゴ酸又はオギザロ酢酸の
高感度定量法。
【請求項４】NADP類が、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホスフェート（NADP）、アセチルピリジンアデ
ニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルNADP）、ア
セチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェ
ートおよびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
ドホスフェート（デアミノNADP）からなる群より選ばれ
るものである請求項１記載のＬ−リンゴ酸又はオギザロ
酢酸の高感度定量法。
【請求項５】NAD類がニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（NAD）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオ
チド（アセチルNAD）、アセチルピリジンヒポキサンチ
ンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチド（デアミノNAD）からなる群より選ばれ
るものである請求項１記載のＬ−リンゴ酸又はオギザロ
酢酸の高感度定量法。
【請求項６】次の成分〜チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくともＬ−リンゴ酸を基質としてオ
ギザロ酢酸を生成する可逆反応をなすリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ、 A₁、 B₁、を含有することを特徴とするＬ−リンゴ酸又はオギザロ
酢酸定量用組成物。