JPH04349899A - イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、食品検査等
の分野に使用されるイソクエン酸またはα−ケトグルタ
ル酸の高感度な定量法、および定量用組成物に関する。 【０００２】 【従来の技術】イソクエン酸の分析はとくに食品分析に
おいて重要であり、例えばベーリンガー　　マンハイム
社よりその分析試薬がキットとして市販されている。そ
の方法は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを使用するも
のであり、補酵素ＮＡＤＰの存在下にイソクエン酸の酸
化的脱炭酸反応による還元型ＮＡＤＰの増加量を測定す
るものである。 【０００３】α−ケトグルタル酸の測定は、血液化学検
査における有機モノカルボン酸の定量検査法の１つとし
て重要である（検査点数早見表，２８９頁，１９９０年
社会保健研究所発行）。その測定には一般にグルタミン
酸デヒドロゲナーゼの逆反応が利用される。 【０００４】一般に、酵素を用いて分析を行なう場合、
測定しようとする対象物質を分光学的に検出可能な過酸
化水素や還元型ＮＡＤ（Ｐ）等に変換することが行なわ
れ、この場合、検出可能物質の量は化学量論的に測定対
象物と等しくなる。 【０００５】現在、この検出可能な物質を測定する方法
としては分光分析機を用いる方法が最も普及しているが
、これも感度に限界が有り、測定対象物の含量が少ない
場合は適さないという欠点があった。 【０００６】そこで、測定対象物の含量が少ない場合や
、測定対象物を含む被検体が少量である場合などは、分
光分析よりも感度の優れた蛍光分析や発光分析等が用い
られている。しかしながら、これらの方法も臨床検査等
の汎用検査においては、機器の普及という点からはあま
り適したものではなかった。 【０００７】また、微量の物質を測定するその他の方法
としては、当該物質が等量の補酵素などに変換できる場
合は、２種類の酵素を用いて補酵素を増幅する、いわゆ
る酵素サイクリング法が行なわれている。例えば、ＮＡ
Ｄサイクリング法、ＣｏＡサイクリング法、ＡＴＰサイ
クリング法等が用いられているが、これらの方法はいず
れも臨床検査等のルーチン分析においては、操作が煩雑
すぎるために殆んど実用されていない。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】前記測定の感度を向上
させることが可能ならば、測定対象物の含量が少ない場
合はもとより、測定に必要な検体量を減らすことができ
るため、例えば血清のように種々の成分を含むものを被
検体に用いる場合には、共存物質によるその測定系に及
ぼす影響を小さくすることができる。また、ある限られ
た被検体量で検査できる項目数を増やすことも可能であ
り、更には検体が人血液である場合などは、採血量を減
らすことができるため、被採血者への心理的な負担を軽
減することもできる。このように、検出感度を高くする
ことは、臨床検査においては血液という貴重な検体を用
いることや微量成分を測定する必要性から考えて、必然
の要求である。 【０００９】前述のごとく、従来のイソクエン酸または
α−ケトグルタル酸の定量法は、いまだ満足のいくもの
ではなく、簡便でかつ高感度の測定法の開発が望まれて
いた。 【００１０】したがって、本発明の第一の目的は、高感
度かつ精度良好で、しかも簡便なイソクエン酸またはα
−ケトグルタル酸の定量法を提供することにある。 【００１１】更に、本発明の第二の目的は、前記イソク
エン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法に好適
に供される組成物を提供することにある。 【００１２】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、イソクエン酸またはα
−ケトグルタル酸の定量において、チオＮＡＤ類および
チオＮＡＤＰ類からなる群（以下チオ型補酵素というこ
ともある）より選ばれる１つと、ＮＡＤ類およびＮＡＤ
Ｐ類からなる群（以下非チオ型補酵素ということもある
）より選ばれる１つの補酵素に作用するイソクエン酸デ
ヒドロゲナーゼ、およびチオ型補酵素と非チオ型補酵素
との２種類を用いることにより、良好な酵素サイクリン
グ反応をなし得ることを見い出し、更に還元型チオ型補
酵素と還元型非チオ型補酵素との吸収波長がそれぞれ４
００ｎｍ付近、３４０ｎｍ付近と異なることに着目し、
吸光度測定の際、他物質の吸収波長の混雑が回避可能な
酵素サイクリング反応を実施でき、その結果高感度測定
が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った
。 【００１３】すなわち、本発明は、イソクエン酸および
α−ケトグルタル酸からなる群より選ばれる１種の被検
成分を含有する被検体に、次の成分（１）〜（４）（１
）チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選
ばれる１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる１つとを補酵素とし、少なくともイソクエン
酸を基質としてα−ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生
成する可逆反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（
２）Ａ１　 （３）Ｂ１　 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔１〕【００
１４】 【化２】 【００１５】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、またＡ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のと
きは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を
示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表わされる
サイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化す
るＡ２またはＢ１の量を測定することを特徴とするイソ
クエン酸またはα−ケトグルタル酸の定量法を提供する
ものである。 【００１６】更に、本発明は前記（１）、（２）、（３
）及び（４）を含有することを特徴とするイソクエン酸
またはα−ケトグルタル酸の定量用組成物を提供するも
のである。 【００１７】本発明に使用されるイソクエン酸デヒドロ
ゲナーゼは、少なくとも 　　イソクエン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）＋＝α−ケトグルタル
酸＋ＣＯ２＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋なる反応を触媒する
ものであり、チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からな
る群より選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類か
らなる群より選ばれる１つを補酵素とするものならいず
れも使用できる。 【００１８】具体的には、ＥＣ　１．１．１．４１　お
よびＥＣ　１．１．１．４２　の酵素が挙げられる。こ
れらのうち、ＥＣ　１．１．１．４１の酵素は補酵素（
チオ）ＮＡＤ類に特異的であり、種々の動物組織、酵母
、アセトバクター　　ペルオキシダンス（Ａｃｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ　ｐｅｒｏｘｙｄａｎｓ）、アスペルギルス
　　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、
ニュウロスポラ　　クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　
ｃｒａｓｓａ　）およびエンドウ豆ミトコンドリアなど
に存在する。 【００１９】本酵素はミトコンドリアに多く存在するア
ロステリック酵素であり、ＡＤＰで活性化され、またＴ
ＣＡサイクルの活性を調節するという生化学上きわめて
重要な作用を有する（臨床酵素ハンドブック，１２８頁
，講談社，１９８２年）。 【００２０】また、ＥＣ　１．１．１．４２　の酵素は
補酵素（チオ）ＮＡＤＰ類に特異的であり、微生物から
動植物までの細胞質とミトコンドリア中に存在する。こ
のうち、大腸菌由来の酵素は、ＮＡＤＰに対する活性を
１００％とするとき、アセチルＮＡＤＰに３８％、チオ
ＮＡＤＰに２％作用する（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．　Ａｃｔａ．　２５８，ｐ２７〜３９，１９７
２）。酵母由来、ブタ心由来の酵素は、ベーリンガー　
　マンハイム社、シグマ社等より市販されている。ベー
リンガー　　マンハイム社のブタ心由来酵素は、ＮＡＤ
Ｐに対する活性を１００％とするとき、チオＮＡＤに対
し２．４％であった。 【００２１】本発明においては、基質であるイソクエン
酸に対して反応性を有し、α−ケトグルタル酸と二酸化
炭素を生成するものであれば、上述の酵素以外の他の起
源の酵素も使用することができ、その補酵素に対する特
異性は適宜、補酵素と基質とを用いて確認することがで
きる。 【００２２】また、本発明において、Ａ１及びＢ２の補
酵素はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、Ｎ
ＡＤ類を示すが、このうちチオＮＡＤＰ類またはチオＮ
ＡＤ類としては、例えばチオニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）、チオニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェート
；およびチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
チオＮＡＤ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドが挙げられる。また、ＮＡＤＰ類またはＮＡ
Ｄ類としては、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンア
デニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ
）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホ
スフェート、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオ
チドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）；およびニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチル
ピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、
アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮ
ＡＤ）が挙げられる。なおこれら補酵素の還元型は、各
々チオＮＡＤＰＨ類、チオＮＡＤＨ類、ＮＡＤＰＨ類、
ＮＡＤＨ類として表示する。 【００２３】本発明においてはＡ１およびＢ１において
例えばＡ１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ類であることが必要であり、Ａ１およびＢ
１の関係において１つのチオ型補酵素を使用する。 【００２４】また定量に用いるイソクエン酸デヒドロゲ
ナーゼが（チオ）ＮＡＤ類のみを補酵素とする場合は、
上述のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いるイソ
クエン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤＰ類のみを
補酵素とする場合は、上述のチオＮＡＤＰ類およびＮＡ
ＤＰ類より、更に用いるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ
が（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を共に補
酵素にする場合は上述のチオＮＡＤ類およびチオＮＡＤ
Ｐ類と上述のＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類より適宜選択し
、それらの酸化型、還元型を適宜用いればよい。 【００２５】成分（４）としては、例えばα−ケトグル
タル酸を定量する場合における二酸化炭素が挙げられる
。二酸化炭素は、炭酸として供給するのが好ましく、か
かる炭酸としては例えばＨＣＯ３−イオンまたはＣＯ３
２−イオンを放出し得るものであればよく、生体体液中
のＨＣＯ３−イオンやＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｎａ
２ＣＯ３　、Ｋ２ＣＯ３を使用すればよい。 【００２６】本発明は定量法により、被検体液中にもと
もと含有されているイソクエン酸またはα−ケトグルタ
ル酸を測定できるが、またこれらを遊離・生成する酵素
系における基質やその酵素活性を測定できる。更に、前
記イソクエン酸、またはα−ケトグルタル酸を遊離・生
成する酵素系と連結しうる単一、もしくは複数工程から
なる酵素中の基質やその酵素活性をも測定できる。これ
ら酵素系は、特に限定されないが、例えば以下に示す反
応系が挙げられる。 【００２７】（１）クエン酸とアコニット酸ヒドラダー
ゼ（ＥＣ　４．２．１．３）との酵素反応系。この系に
おいて、遊離・生成するイソクエン酸を定量することに
よりクエン酸を定量、またはアコニット酸ヒドラダーゼ
の活性測定をすることができる。 クエン酸→ｃｉｓ−アコニット酸＋Ｈ２Ｏ→イソクエン
酸【００２８】（２）α−ケトグルタラミン酸とω−ア
ミダーゼ（ＥＣ　３．５．１．３）との酵素反応系。こ
の系において、遊離・生成するα−ケトグルタル酸を定
量することにより、α−ケトグルタラミン酸の定量また
はω−アミダーゼの活性測定をすることができる。 　　α−ケトグルタラミン酸＋Ｈ２Ｏ→アンモニア＋α
−ケトグルタル酸【００２９】（３）Ｄ−グルタミン酸
、酸素およびＤ−グルタミン酸オキシダーゼ（ＥＣ　１
．４．３．７）の酵素反応系。この系において、遊離・
生成するα−ケトグルタル酸を定量することにより、Ｄ
−グルタミン酸の定量またはＤ−グルタミン酸オキシダ
ーゼの活性測定をすることができる。 　　　　Ｄ−グルタミン酸＋Ｈ２Ｏ＋Ｏ２→α−ケトグ
ルタル酸＋アンモニア＋Ｈ２Ｏ２　【００３０】（４）
スクシニル−ＣｏＡ、二酸化炭素、還元型フェレドキシ
ンおよび２−オキソグルタル酸シンターゼ（ＥＣ　１．
２．７．３）の酵素反応系。この系において、遊離・生
成するα−ケトグルタル酸を定量することにより、スク
シニル−ＣｏＡ、二酸化炭素、還元型フェレドキシンの
定量または２−オキソグルタル酸シンターゼの活性測定
をすることができる。 スクシニル−ＣｏＡ＋ＣＯ２＋還元型フェレドキシン→
ＣｏＡ＋α−ケトグルタル酸＋酸化型フェレドキシン【
００３１】（５）Ｌ−グルタミン酸、ピルビン酸、およ
びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ　２．６．
１．２）の酵素反応系。この系において、遊離・生成す
るα−ケトグルタル酸を定量することによりＬ−グルタ
ミン酸またはピルビン酸の定量あるいはアラニンアミノ
トランスフェラーゼの活性測定をすることができる。 　　　　Ｌ−グルタル酸＋ピルビン酸→Ｌ−アラニン＋
α−ケトグルタル酸【００３２】本発明の定量用組成物
においては、Ａ１およびＢ１、更に成分（４）の被検成
分以外のサイクリング反応を形成せしめる成分の濃度は
０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ま
しく、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの量は１〜１００
０ｕ／ｍｌ、特に２〜４００ｕ／ｍｌが好ましいが、そ
の量は被検体の種類等により適宜決定することができ、
これ以上の量を用いることもできる。 【００３３】本発明における、Ａ１およびＢ１、更に成
分（４）の被検成分以外のサイクリング反応を形成せし
める成分量は被検体中のイソクエン酸またはα−ケトグ
ルタル酸のうちの１種の被検成分と比較して過剰量であ
ること、かつイソクエン酸デヒドロゲナーゼのＡ１、Ｂ
１および成分（４）それぞれに対するＫｍ値と比較して
過剰量であることが必要であり、特に被検成分の２０〜
１００００倍モルが好ましい。 【００３４】被検成分として存在する成分以外のサイク
リング反応系を形成せしめる成分（４）としては、例え
ば被検成分がα−ケトグルタル酸の場合は二酸化炭素で
あり、被検成分がイソクエン酸の場合は特に必要ないが
、二酸化炭素又はα−ケトグルタル酸を添加してもよい
。 【００３５】また、本発明定量法はイソクエン酸デヒド
ロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ
類を共に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチ
オＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せ、
またはチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類と
の組合せを選んだときには、更にイソクエン酸に作用せ
ず、Ｂ２→Ｂ１の反応を形成する第二のデヒドロゲナー
ゼを使用し、更に該第二のデヒドロゲナーゼの基質を作
用せしめることにより、Ｂ１とＢ２の間にＢ１の再生の
ための反応系を付与せしめることによりサイクリング反
応を形成せしめ得る。 【００３６】すなわち、イソクエン酸およびα−ケトグ
ルタル酸からなる群より選ばれる１種の被検成分を含有
する被検体に、次の成分（１）〜（５）（１）チオＮＡ
ＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選ばれる１つ
と、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる
１つとを補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質と
してα−ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可逆
反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（２）Ａ１ （３）Ｂ１または／およびＢ２ （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 （５）イソクエン酸に作用せず、Ｂ２→Ｂ１の反応を形
成する第二のデヒドロゲナーゼ、および該第二のデヒド
ロゲナーゼの基質 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔２〕【００
３７】 【化３】 【００３８】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、またＡ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のと
きは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を
示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ｂ２→Ｂ１は
Ｂ２を補酵素としてＢ１を生成する酵素反応を示す）で
表わされるサイクリング反応を形成せしめることにより
イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸を定量する。 【００３９】この場合、第二のデヒドロゲナーゼは、こ
の測定系において実質的にＡ１に作用しないものである
か、あるいは実質的にＡ１に作用し得ない条件を設定し
て使用されることが好ましく、例えばＡ１を本質的に補
酵素として利用しない第二のデヒドロゲナーゼを選択す
る組合せ、Ａ１とＢ２の量的関係により第二のデヒドロ
ゲナーゼが実質的にＡ１に作用しない条件を選択する組
合せ等が例示される。定量の際には反応により生成した
Ａ２の量を測定する。 【００４０】前記の成分（５）を用いる定量用組成物に
おいて、Ａ１および成分（４）の濃度は０．０２〜１０
０ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ｂ２また
は／およびＢ１の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に
５〜５００μＭが好ましく、イソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼの濃度は１〜１０００ｕ／ｍｌ、特に２〜４００ｕ
／ｍｌが好ましく、第二のデヒドロゲナーゼはＢ２に対
するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ／ｍｌ単位）以
上になるように調製すればよく、例えば１〜１００ｕ／
ｍｌが好ましく、また第二のデヒドロゲナーゼの基質は
過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましい。これら
の量は被検体の種類等により適宜決定することができ、
これ以上の量を用いることもできる。 【００４１】第二のデヒドロゲナーゼはＢ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ１が高価
な場合は有効である。また、Ｂ１の代わりにＢ２あるい
はＢ１とＢ２の混合物を用いて反応を行なってもよい。 この場合、Ｂ１または／およびＢ２の使用量は特に限定
されるものではないが、一般的にはＡ１の１／１０モル
以下、好ましくは１／１００モル以下である。 【００４２】第二のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ｂ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類の
ときは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．
１．１）とエタノール、グリセロールデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ　１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とグリ
セロール、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．
１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸
、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１
．１．１．８）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール
−３−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ　１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、
酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とＤ−グリセロアルデヒドリ
ン酸とリン酸、Ｂ２がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類
のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（
ＥＣ　１．１．１．４９）（酵母由来）とグルコース−
６−リン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１
．２．１．１７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｘａｌ
ａｔｉｃｕｓ由来）とＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホ
グルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．４４
）（ラット肝、ビール酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と６−
ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．２．１．１３）（植物葉緑
体由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン
酸等が挙げられる。 【００４３】本発明の前記定量法はイソクエン酸デヒド
ロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ
類を共に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチ
オＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せ、
またはチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類と
の組合せを選んだときには、更にイソクエン酸に作用せ
ず、Ａ２→Ａ１の反応を形成する第三のデヒドロゲナー
ゼを使用し、更に該第三のデヒドロゲナーゼの基質を作
用せしめることにより、Ａ１とＡ２との間にＡ１の再生
の為の反応系を付与せしめることによりサイクリング反
応を形成し得る。 【００４４】すなわち、イソクエン酸およびα−ケトグ
ルタル酸からなる群より選ばれる１種の被検成分を含有
する被検体に、次の成分（１）〜（４）および（６）（
１）チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より
えらばれる１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
群より選ばれる１つとを補酵素とし、少なくともイソク
エン酸を基質としてα−ケトグルタル酸と二酸化炭素と
を生成する可逆反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナー
ゼ（２）Ａ１または／およびＡ２ （３）Ｂ１ （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
イクリング反応系を形成せしめる成分 （６）イソクエン酸に作用せず、Ａ２→Ａ１の反応を形
成する第三のデヒドロゲナーゼ、および該第三のデヒド
ロゲナーゼの基質 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔３〕【００
４５】 【化４】 【００４６】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、またＡ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のと
きは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を
示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ａ２→Ａ１は
Ａ２を補酵素としてＡ１を生成する酵素反応を示す）で
表わされるサイクリング反応を形成せしめることにより
イソクエン酸または、α−ケトグルタル酸を定量する。 【００４７】この場合、第三のデヒドロゲナーゼは、こ
の測定系において実質的にＢ１に作用し得ないものであ
るか、あるいは実質的にＢ１に作用し得ない条件を設定
して使用されることが好ましく、例えばＢ１を本質的に
補酵素として利用しない酵素を選択する組合せ、Ｂ１と
Ａ２の量的関係により第三のデヒドロゲナーゼが実質的
にＢ１に作用しない条件を選択する組合せ等が例示され
る。定量の際にはＢ１の消費量を測定する。 【００４８】前記成分（６）を用いる定量用組成物にお
いて、Ｂ１および成分（４）の濃度は０．０２〜１００
ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ａ２または
／およびＡ１の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に５
〜５００μＭが好ましく、イソクエン酸デヒドロゲナー
ゼの濃度は１〜１０００ｕ／ｍｌ、特に２〜４００ｕ／
ｍｌが好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはＡ２に対す
るＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量量（ｕ／ｍｌ単位）以
上になるように調製すればよく、例えば１〜１００ｕ／
ｍｌが好ましく、また第三のデヒドロゲナーゼの基質は
過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましい。これら
の量は被検体の種類等により適宜決定することができ、
これ以上の量を用いることもできる。 【００４９】第三のデヒドロゲナーゼはＡ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＡ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＡ１が高価
な場合には有効である。また、Ａ１の代わりにＡ２ある
いはＡ１とＡ２の混合物を用いて反応を行なってもよい
。この場合、Ａ１または／およびＡ２の使用量は特に限
定されるものではないが、一般的にはＢ１の１／１０モ
ル以下、好ましくは１／１００モル以下である。 【００５０】第三のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ａ１がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類の
ときは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．
１．１）とアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ　１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）
とジヒドロキシアセトン、Ｌ−グリセロール−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．８）（ウサギ
筋肉由来）とジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．３７）（ブタ心筋
、ウシ心筋由来）とオギザロ酢酸、グリセロアルデヒド
リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．１２）（
ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と１，３
−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、Ａ１がＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤＰ類のときは、グリセロアルデヒドリン酸
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．２．１．１３）（植物葉
緑体由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が
挙げられる。 【００５１】かくして、調製された本発明の前記定量用
組成物によって被検体中のイソクエン酸またはα−ケト
グルタル酸を測定するには、上記成分（１）〜（４）、
（１）〜（５）、（１）〜（４）および（６）を含有す
る組成物に被検体０．００１〜０．５ｍｌを加え、約３
７℃の温度にて反応させ、反応開始一定時間後の２点間
の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後の１分間
、または３分後と８分後の５分間における生成されたＡ
２の量または消費されたＢ１の量を、それぞれの吸収波
長に基づく吸光度の変化によって測定すればよい。例え
ば、Ａ２がチオＮＡＤＨ、Ｂ１がＮＡＤＨの場合、Ａ２
の生成を４００ｎｍ付近の吸光度の増加により測定する
か、あるいはＢ１の消費を３４０ｎｍ付近の吸光度の減
少により測定し、既知濃度のイソクエン酸またはα−ケ
トグルタル酸を用いて測定したときの値と比較すれば、
被検体液中のそれぞれの量をリアルタイムで求めること
ができる。 【００５２】また、被検体中にイソクエン酸とα−ケト
グルタル酸が共存している場合は、本発明の前記定量法
によれば、これらの合計量が定量される。個々の成分量
を定量するには、あらかじめ被検体をどちらかの成分の
みに作用する酵素で消去する等の前処理を施した後、前
記酵素サイクリング反応に導けばよい。 【００５３】また、本発明の前記定量法は、被検体液中
のイソクエン酸またはα−ケトグルタル酸そのものを酵
素サイクリング反応に導くものであり、被検液中の共存
物質の影響を受けにくいため、被検液のブランク測定を
省略することができ、レイトアッセイによる簡便な測定
をなし得る。 【００５４】尚、本発明においてはＡ２またはＢ１の測
定に当たり、吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を
使用して定量を行なうこともできる。また、被検体中の
イソクエン酸およびα−ケトグルタル酸は塩を形成して
いても、本発明定量法を実施するうえで、何ら影響を及
ぼさない。 【００５５】 【実施例】以下に本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。 【００５６】実施例１　　　　イソクエン酸の定量＜試
薬＞ ４０ｍＭ　　　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）１
０ｍＭ　　　　炭酸水素カリウム １ｍＭ　　　　チオＮＡＤＰ（シグマ社製）０．５ｍＭ
　　　還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）２ｍＭ
　　　　塩化マグネシウム １０ｕ／ｍｌ　　イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ベー
リンガー　　マンハイム社製：ブタ心臓由来）＜操作＞ 上記試薬１ｍｌをキュベットにとり、０、２０、４０、
６０、８０、１００μＭのＤＬ−イソクエン酸ナトリウ
ム溶液（和光純薬社製）をそれぞれ２０μｌ添加し、３
７℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と５分目
の４００ｎｍにおける吸光度を読み取りその差を求めた
。濃度０を試薬ブランクとし、それぞれのイソクエン酸
ナトリウム濃度のときの値からこの値を引き、その結果
を図１に示した。図１から明らかなように、イソクエン
酸ナトリウム量に対する吸光度変化量は良好な直線性を
示した。 【００５７】実施例２　　　　イソクエン酸の定量＜試
薬＞ ５０ｍＭ　　　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）１
０ｍＭ　　　　炭酸水素カリウム ３ｍＭ　　　　チオＮＡＤ（シグマ社製）１ｍＭ　　　
　還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）４ｍＭ　　
　　塩化マグネシウム １ｍＭ　　　　ＡＭＰ １０ｕ／ｍｌ　　イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ベー
リンガー　　マンハイム社製：ブタ心臓由来）３４ｕ／
ｍｌ　　イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ）（オ
リエンタル酵母社製：酵母由来） ＜操作＞ 上記試薬１ｍｌをキュベットにとり、０、１０、２０、
３０、４０、５０μＭのＤＬ−イソクエン酸ナトリウム
溶液をそれぞれ２０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始
させた。反応開始後２分目と４分目の４００ｎｍにおけ
る吸光度を読み取りその差を求めた。濃度０を試薬ブラ
ンクとし、それぞれのイソクエン酸ナトリウム濃度のと
きの値からこの値を引き、その結果を図２に示した。図
２から明らかなように、イソクエン酸ナトリウム量に対
する吸光度変化量は良好な直線性を示した。 【００５８】実施例３　　　　α−ケトグルタル酸の定
量＜試薬＞ ５０ｍＭ　　　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）１
０ｍＭ　　　　炭酸水素カリウム ３ｍＭ　　　　チオＮＡＤ（シグマ社製）１ｍＭ　　　
　還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）４ｍＭ　　
　　塩化マグネシウム １ｍＭ　　　　ＡＭＰ １０ｕ／ｍｌ　　イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ベー
リンガー　　マンハイム社製：ブタ心臓由来）３４ｕ／
ｍｌ　　イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ）（オ
リエンタル酵母社製：酵母由来） ＜操作＞ 上記試薬１ｍｌをキュベットにとり、０、５、１０、１
５、２０、２５μＭのα−ケトグルタル酸溶液をそれぞ
れ２０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応
開始後２分目と４分目の４００ｎｍにおける吸光度を読
み取りその差を求めた。濃度０を試薬ブランクとし、そ
れぞれのα−ケトグルタル酸濃度のときの値からこの値
を引き、その結果を図３に示した。図３から明らかなよ
うに、α−ケトグルタル酸量に対する吸光度変化量は良
好な直線性を示した。 【００５９】 【発明の効果】前述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生ずることな
く、また酵素サイクリング反応を組合せることにより、
測定感度を著しく増大させることが可能となる。その結
果、少量の検体の使用により簡便かつ精度よく被検体中
のイソクエン酸またはα−ケトグルタル酸を定量するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１における、イソクエン酸ナトリウム量
に対する４００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示
す図面である。

【図２】実施例２における、イソクエン酸ナトリウム量
に対する４００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示
す図面である。

【図３】実施例３における、α−ケトグルタル酸量に対
する４００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図
面である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　イソクエン酸およびα−ケトグルタル
   酸からなる群より選ばれる１種の被検成分を含有する被
   検体に、次の成分（１）〜（４） （１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
   フェート類（以下チオＮＡＤＰ類という）およびチオニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡ
   Ｄ類という）からなる群より選ばれる１つと、ニコチン
   アミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以下Ｎ
   ＡＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチド類（以下ＮＡＤ類という）からなる群より選ば
   れる１つとを補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基
   質としてα−ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する
   可逆反応をなすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ１　 （３）Ｂ１　 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
   イクリング反応系を形成せしめる成分 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔１〕【化１
   】 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
   Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
   を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
   類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
   またＡ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チ
   オＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２は
   Ｂ１の酸化型生成物を示す）で表わされるサイクリング
   反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２または
   Ｂ１の量を測定することを特徴とするイソクエン酸また
   はα−ケトグルタル酸の定量法。
2. 【請求項２】　　ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニ
   ンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチル
   ピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチ
   ルＮＡＤＰ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌク
   レオチドホスフェートおよびニコチンアミドヒポキサン
   チンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）
   からなる群より選ばれるものである請求項１記載のイソ
   クエン酸またはα−ケトグルタル酸の定量法。
3. 【請求項３】　　ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニン
   ジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジン
   ヒポキサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒ
   ポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からな
   る群より選ばれるものである請求項１記載のイソクエン
   酸またはα−ケトグルタル酸の定量法。
4. 【請求項４】　　チオＮＡＤＰ類が、チオニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ
   ）およびチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオ
   チドホスフェートからなる群より選ばれるものである請
   求項１記載のイソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の
   定量法。
5. 【請求項５】　　チオＮＡＤ類が、チオニコチンアミド
   アデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）およびチオニコ
   チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群よ
   り選ばれるものである請求項１記載のイソクエン酸また
   はα−ケトグルタル酸の定量法。
6. 【請求項６】　　下記成分（１）〜（４）（１）チオＮ
   ＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選ばれる１
   つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類より選ばれる１つとを
   補酵素とし、少なくともイソクエン酸を基質としてα−
   ケトグルタル酸と二酸化炭素とを生成する可逆反応をな
   すイソクエン酸デヒドロゲナーゼ （２）Ａ１　 （３）Ｂ１　 （４）必要に応じ被検成分として存在する成分以外のサ
   イクリング反応系を形成せしめる成分 を含有することを特徴とするイソクエン酸またはα−ケ
   トグルタル酸定量用組成物。