JP4807920B2 - 総ホモシステイン測定方法 - Google Patents
総ホモシステイン測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4807920B2 JP4807920B2 JP2002507046A JP2002507046A JP4807920B2 JP 4807920 B2 JP4807920 B2 JP 4807920B2 JP 2002507046 A JP2002507046 A JP 2002507046A JP 2002507046 A JP2002507046 A JP 2002507046A JP 4807920 B2 JP4807920 B2 JP 4807920B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- homocysteine
- reagent
- converting enzyme
- methionine
- measuring
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6812—Assays for specific amino acids
- G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
技術分野
本発明は、ホモシステインの測定方法に関する。
背景技術
メチオニン代謝の中間代謝物の１つであるホモシステインは、血管内皮細胞傷害作用を有し、他の因子とは独立した動脈硬化性疾患の危険因子であることが報告されている。ホモシステイン代謝酵素の欠損により引き起こされる強度の高ホモシステイン血症（ホモシスチン尿症）のほかに、遺伝子異常による代謝酵素活性の低下、腎不全、加齢、喫煙、運動不足などによっても、中等度の高ホモシステイン血症を呈することが明らかになっている（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４４：８（Ｂ），１９９８）。また、これらの高ホモシステイン血症は、ビタミンＢ６・葉酸などの摂取により改善することも報告されている（ＪＡＭＡ ２７０：６９３，１９９３）。したがって、新生児マススクリーニングだけでなく、成人の動脈硬化性疾患の予防やビタミン欠乏症の発見のためにも、簡便で多数の検体を処理できる方法が要求されている。
血中のホモシステインの大部分（９９％）は、酸化型のジスルフィド化合物（蛋白結合型、ホモシスチン、システイン−ホモシステイン結合型など）として存在している（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４４，８（Ｂ），１９９８）。総ホモシステインは、これら酸化型および還元型ホモシステインの総量を意味し、通常その測定のためには、試料をまず還元剤により還元型ホモシステインに変換する必要がある。
ホモシステインの測定には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法および免疫法が主として用いられている。前者で用いられるＨＰＬＣ装置は、臨床検査の現場では一般的とは言えず、加えてその操作には時間、労力、費用を必要とする。また、後者は、自動化されているものの（Ｓｈｉｐｃｈａｎｄｌｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４１，７，９９１−９９４，１９９５）、酵素反応によるホモシステインからＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインへの変換工程と免疫法によるその検出工程との組み合わせにより達成されるため、専用の装置を必要とする。
免疫法による測定方法は、特表平９−５１２６３４号および特開平１０−１１４７９７号にも提案されている。特表平９−５１２６３４号の方法は、ホモシステインを化学修飾して抗原性を高めることにより免疫学的に測定する方法であり、工程数が多く煩雑である。また、特開平１０−１１４７９７号は、ホモシステインを測定する方法を開示しているが、この方法はアルブミンに結合したホモシステインのみを直接測定する方法であり、総ホモシステイン量を測定する方法ではない。この方法では、全体の７０％程度のホモシステインしか測定できない。
一方、生化学法による測定方法は、日本特許第２８７０７０４号、米国特許第５９９８１９１号、および米国特許第５８８５７６７号に記載されている。日本特許第２８７０７０４号の方法は、還元剤で処理した検体中のホモシステインを、アデノシンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素と接触させ、残存する混合物中のアデノシン量を評価することを特徴とする。しかし、この方法は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素阻害剤を用いないので、カイネティックモードによる測定が必要である。さらに、総ホモシステイン測定のために必須の工程である還元処理に用いられる還元剤の存在下では、生成する過酸化水素を、通常用いられる酸化系発色剤に導くことはできないという問題点がある。このため、汎用の自動分析装置に応用することはできない。しかし、この特許明細書にはこれらの問題を回避する方法は何ら述べられていない。
特表２０００−５０２２６２号、米国特許第５９９８１９１号、および米国特許第５８８５７６７号に記載の方法は、ホモシステインに、ホモシステインデスルフラーゼ、ホモシステナーゼ、またはメチオニン−γ−リアーゼを作用させ、生成する硫化水素、アンモニア、または２−オキソ酪酸を検出することを特徴としている。しかし、工程数が多いこと、硫化水素の検出に有害な重金属である鉛イオンを使用すること、あるいは通常の生体試料ではホモシステインより含量の多い構造類似物質であるシステインやメチオニンの影響を受けることなどの問題点を有する。
このように、従来の方法は、特殊装置を必要とし、操作が煩雑であり、そして感度・特異性が不十分であるなどの問題点があり、微量濃度のホモシステインを、迅速、簡便かつ感度よく測定する方法は未だに確立されていない。
発明の開示
したがって、本発明の目的は、生体試料などに含まれるホモシステインを迅速、簡便かつ感度よく測定することができる新規測定方法、ならびにこの測定方法に用いるためのキットを提供することである。
本発明者らは、残存するホモシステイン補助基質、生成したホモシステイン変換酵素生成物またはそれらの酵素反応生成物を、（ｉ）ＳＨ試薬の存在下で酸化して過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させることによって、または（ｉｉ）Ｄ−アミノ酸変換酵素を作用させてオキソ酸および／またはアンモニアを生成させ、生成したオキソ酸および／またはアンモニアを検出または測定することによって、検出または測定することに成功し、本発明を完成させた。本発明のホモシステインの測定方法により、生体試料、特に血液、尿などの体液中のホモシステインを迅速かつ簡便に検出および測定できる。
本発明は、試料中のホモシステインを検出または測定するための方法であって、
（ａ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程、
（ｂ）還元されたホモシステインに、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質を作用させ、ホモシステイン変換酵素生成物を生じさせる工程、および
（ｃ）残存するホモシステイン補助基質、生成したホモシステイン変換酵素生成物またはそれらの酵素反応生成物を、（ｉ）ＳＨ試薬の存在下で酸化して過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させることによって、または（ｉｉ）Ｄ−アミノ酸変換酵素を作用させてオキソ酸および／またはアンモニアを生成させ、生成したオキソ酸および／またはアンモニアを検出または測定することによって、検出または測定する工程、
を含む方法に関する。
好ましい実施態様においては、前記工程（ｂ）のホモシステイン変換酵素が、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素であり、そして前記工程（ｂ）および（ｃ）のホモシステイン補助基質がアデノシンである。
好ましい実施態様においては、前記アデノシンを検出または測定する工程（ｃ）が、アデノシンデアミナーゼ、リン酸、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびキサンチンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を、パーオキシダーゼおよび酸化系発色剤により発色させて検出または測定する工程である。
より好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、さらにウリカーゼを作用させる工程を含む。
他の好ましい実施態様においては、前記工程（ｂ）のホモシステイン変換酵素は、ホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素であり、そして前記工程（ｂ）および（ｃ）のホモシステイン補助基質は、メチル供与体である。
好ましい実施態様においては、前記メチル転移酵素は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼであり、そして前記メチル供与体は、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムである。
より好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記ホモシステイン変換酵素生成物が、Ｄ−メチオニンであり、そして該Ｄ−メチオニンが、Ｄ−アミノ酸変換酵素を作用させることによって測定される。
より好ましい実施態様においては、前記Ｄ−アミノ酸変換酵素がＤ−アミノ酸オキシダーゼである。
好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素が、パーオキシダーゼおよび酸化系発色剤により発色させて検出または測定される。
好ましい実施態様においては、前記ＳＨ試薬がマレイミド誘導体である。
別の好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記生成したオキソ酸および／またはアンモニアに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたは増加するＮＡＤ（Ｐ）の変化を検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを作用させて生成するオキソ酸および／またはアンモニアを検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを作用させて生成するオキソ酸および／またはアンモニアに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたは増加するＮＡＤ（Ｐ）の変化を検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素がロイシン脱水素酵素であり、そして前記生成したオキソ酸に、アンモニアおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加して該ロイシン脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化を検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素が乳酸脱水素酵素であり、そして前記生成したオキソ酸に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加して該乳酸脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化を検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素がグルタミン酸脱水素酵素であり、そして前記生成したアンモニアに、２−オキソグルタル酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加して該グルタミン酸脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化を検出または測定する。
より好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素が乳酸脱水素酵素およびグルタミン酸脱水素酵素であり、２−オキソグルタル酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加して該乳酸脱水素酵素およびグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化を検出または測定する。
さらに好ましい実施態様においては、前記工程（ａ）および（ｂ）が同時に行われる。
また、本発明は、チオール化合物、ホモシステイン変換酵素、ホモシステイン補助基質、ＳＨ試薬、および酸化系発色剤を含む、ホモシステイン測定用試薬キットに関する。
好ましい実施態様においては、前記ＳＨ試薬がチオール化合物、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質とは別の容器に含まれる。
好ましい実施態様においては、前記ホモシステイン変換酵素がホモシステイン補助基質とは別の容器に含まれる。
さらに好ましい実施態様においては、前記ホモシステイン変換酵素がＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素であり、そして前記ホモシステイン補助基質がアデノシンである。
さらに好ましい実施態様においては、アデノシンデアミナーゼ、リン酸、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびパーオキシダーゼを含む。
別の好ましい実施態様においては、前記アデノシンデアミナーゼが、チオール化合物、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンとは別の容器に含まれる。
好ましい実施態様においては、さらにウリカーゼが含まれる。
本発明はまた、チオール化合物、ホモシステイン変換酵素、ホモシステイン補助基質、Ｄ−アミノ酸変換酵素を含む、ホモシステイン測定用試薬キットに関する。
好ましい実施態様においては、さらにＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする脱水素酵素およびその補助基質としてアンモニウム塩または２−オキソ酸を含む。
さらに好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素がロイシン脱水素酵素であり、該酵素の補助基質がアンモニウム塩である。
別のさらに好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素がグルタミン酸脱水素酵素であり、該酵素の補助基質が２−オキソグルタル酸である。
好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素が乳酸脱水素酵素である。
他の好ましい実施態様においては、前記ホモシステイン変換酵素がホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素であり、そして前記ホモシステイン補助基質がメチル供与体である。
好ましい実施態様においては、前記メチル転移酵素は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼであり、そして前記メチル供与体は、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムである。
好ましい実施態様においては、前記Ｄ−アミノ酸変換酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼである。
好ましい実施態様においては、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが、チオール化合物、およびホモシステインメチルトランスフェラーゼとは別の容器に含まれる。
また、好ましい実施態様においては、前記ＳＨ試薬がマレイミド誘導体である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法は、チオール化合物で還元処理した試料中のホモシステインに、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質を作用させた後、ＳＨ試薬存在下でホモシステイン変換酵素生成物または残存するホモシステイン補助基質を測定することを特徴とする。好ましくは、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを用い、残存するアデノシンをＳＨ試薬の存在下で酸化系発色剤を用いて測定する。より好ましい形態としては、本発明の方法は、被検試料中のホモシステインをチオール化合物処理により還元型に変換すると同時にＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを作用させてＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを生成させる工程（以下第一工程と記す）、およびＳＨ試薬の存在下で、残存するアデノシンを、酸化系発色剤を用いて測定する工程（以下第二工程と記す）を含む。
あるいは、本発明の方法は、試料中のホモシステインに、メチル供与体存在下、メチル転移酵素を作用させた後、生成するＤ−アミノ酸誘導体またはＤ−アミノ酸類似体を測定することも特徴とする。メチル供与体としては、例えば、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、Ｓ−アデノシル−Ｄ−メチオニン、Ｄ−エチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。好ましくは、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを使用することができる。
本発明の測定原理を、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、（Ａ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを用いる場合の測定原理を図１に基づいて、そして（Ｂ）メチル転移酵素およびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いる場合の測定原理を図２に基づいて説明する。
（Ａ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを用いる場合（ＳＡＨａｓｅ法）の測定原理
図１の第一工程においては、還元処理したホモシステインを、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンと反応させる。この工程では、酵素反応の平衡はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを合成する方向に向いており、アデノシンはホモシステインとともに消費される。次いで、第二工程において、残存するアデノシンに、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼなどを作用させて過酸化水素を生じさせ、さらにパーオキシダーゼおよび酸化系発色剤によって発色させて測定する。図からもわかるように、第一工程におけるアデノシンの消費量が、ホモシステインの量に比例する。第二工程の際に、以下に詳述するように、第一工程で使用したＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素の阻害剤として、およびチオール化合物のブロック剤として、ＳＨ試薬を加えることにより、感度よく測定することができる。さらに、第二工程において、ウリカーゼを加えることにより、過酸化水素の発生が増加し、さらに感度のよい測定が可能になる。
ホモシステイン測定においてＳＨ試薬を用いる例は、特表平９−５１２６３４号および米国特許第６０２０２０６号に記載されている。前者は、既に述べたように、ホモシステインを化学的に修飾してその免疫原性を増進させ、これを免疫学的に検出する方法であり、その修飾剤としてＳＨ化合物が挙げられている。後者は、ホモシステインをホモシステインチオラクトンに変換し、チオール基を保護した後、サンプル中に含まれるシステインなどのチオール基を有する他の化合物をＳＨ試薬で除き、その後チオラクトンを開環させ、ホモシステインを測定する方法である。いずれの方法も、本発明の方法とは全く測定原理が異なり、また、ＳＨ試薬の使用目的も全く異なっている。また、遊離脂肪酸測定において、酸化系発色剤による測定への補助基質ＣｏＡの妨害を回避するために、ＳＨ試薬が使用されている例がある（特開昭５５−６４８００号および特開昭５７−８７９７号）が、測定項目が異なっており、本発明の方法においてＳＨ試薬が有効であるかどうかは予測することはできない。
ＳＨ試薬については、生化学辞典（第３版、ｐ．１８２、東京化学同人、１９９８年）にも記載されるとおり、エルマン試薬などの酸化剤、ｐ−メクリル安息香酸などのメルカプト形成剤、ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミドなどのアルキル化剤が挙げられる。好ましくはアルキル化剤を、さらに好ましくはマレイミド化合物を、もっとも好ましくはＮ−エチルマレイミドを使用することができる。
本発明の方法に供される被検試料としては、ホモシステインを含むと考えられる試料であればいずれでもよい。また、ホモシステインの存在様式としては、還元型ホモシステインのみならず、蛋白結合型、ホモシステイン２量体、ホモシステイン−システイン２量体などジスルフィド結合で他の分子に結合した酸化型ホモシステインのいずれでもよい。例えば、血清、血漿、血液、尿、およびそれらの希釈物などが挙げられる。
本発明の方法で用いられるチオール化合物は特に限定されず、例えば、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオエリスリトール、チオグリコール酸などが挙げられる。チオール化合物の濃度は、酸化型ホモシステインを還元型ホモシステインに変換できる範囲であればいずれでもよく、好ましくはチオール基として０．１ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上の濃度であればよい。
チオール化合物による還元工程に続いてまたは同時に、本発明の方法の第一工程として、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質、好ましくはＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを作用させて、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを生成させる。
残存するホモシステイン補助基質の量、好ましくはアデノシンの量は、本発明の方法の測定原理からも明らかなように、測定すべきホモシステインの量に依存する。詳細には、試料として水または緩衝液を用いる反応、すなわち、ホモシステインを含まない反応において、第一工程終了前から第二工程終了時までの吸光度変化が０．０００５から４、好ましくは０．００１から２、さらに好ましくは０．００５から１となるようにアデノシンの量を設定する。
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素は、合成反応とその逆の加水分解反応の両反応を触媒する酵素であり、反応の平衡は合成方向に著しく傾いているが、生体内では生成物がすみやかに代謝されるために加水分解系として働いている（酵素ハンドブック、５２９頁、朝倉書店（１９８２年））。この酵素は、ウサギ、ルピナス種子、ウシ、ラット、酵母、細菌などの様々な起源から分離されており、起源は特に限定されない。遺伝子組換えで得られる酵素も同様に使用できる。用いる濃度は、好ましくは０．０１Ｕ／ｍＬから１００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１Ｕ／ｍＬから２０Ｕ／ｍＬである。
この酵素標品としては、アデノシンデアミナーゼなどのアデノシンに作用する酵素の混入ができるだけ少ないものが望ましい。しかし、商業的に入手可能な標品の中には、わずかであるがアデノシンデアミナーゼの混入が認められるものもある。この場合には、精製して使用することでその影響を回避することができる。もしくは同じ酵素（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素）標品を含む試薬と含まない試薬との反応性の違いを測定することにより混入酵素の影響を回避することができる。
さらに、混入アデノシンデアミナーゼ活性を抑えるために阻害剤を使用することもできる。阻害剤としては、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素に対して強く作用しないものであれば使用可能であるが、以下に述べる第二工程での酵素反応を考慮し、特にアデノシンデアミナーゼ反応の初速度に影響が少ないとされるコホルマイシン、デオキシコホルマイシン、１，６−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチルプリンリボチド（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９：２２３，５３０３−５３０９，１９８０）などが望ましい。阻害剤を使用する場合には、第二工程において過剰量のアデノシンデアミナーゼを使用することが望ましい。
続く第二工程では、ホモシステイン変換酵素生成物または残存するホモシステイン補助基質を測定する。好ましくは、まず、残存するアデノシンをアデノシンデアミナーゼの作用によりイノシンへ変換する。これにより、上記の第一工程におけるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素反応の基質が減少するので、すなわちその逆反応の生成物が減少するので、反応の平衡は加水分解に向かう。この工程においてＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素活性が残存すれば、第一工程の逆反応、すなわちＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解反応も同時に起こり、最終的にはホモシステイン測定感度の低下につながる。そこで、この反応を防ぐためにＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素阻害剤を添加することが望ましい。この酵素の阻害剤としては、ＳＨ試薬（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８０，５１７−５２３，１９７７）およびいくつかのアデノシン誘導体（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １４３，３７７−３８３，１９８７）が知られている。本発明の方法では、他の反応系に大きな支障を及ぼさない限りいずれの阻害剤でも用いることができる。また、これらの阻害剤は組み合わせて使用することもできる。
生成したイノシンは、リン酸、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、および必要に応じてウリカーゼと接触させることにより過酸化水素を発生させて、パーオキシダーゼにより通常の酸化系発色剤を発色させることができる。この方法は、臨床化学の分野では一般的に用いられる既知の方法であるが、第一工程で用いるチオール化合物の還元作用によりその発色が著しく妨害されるため、第二工程では、チオール化合物のブロック剤であるＳＨ試薬の添加が必須となる。したがって、第二工程におけるＳＨ試薬の添加は、第一工程で用いたＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素が第二工程において逆反応（加水分解反応）を触媒することを阻止すると共に、チオール化合物による酸化系発色剤の発色妨害を防止する効果を有する。第二工程におけるＳＨ試薬の濃度は、検体の還元処理に用いたチオール化合物のチオール基を酸化系発色剤による定量が妨害されない程度にブロックできる範囲であればいずれでもよく、好ましくは０．１ｍＭから１００ｍＭの範囲で使用できる。より好ましくは１ｍＭから３０ｍＭで用いられるが、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を阻害する効果も発揮させるために、用いたチオール化合物に比べて過剰量のＳＨ試薬を使用することが望ましい。
酸化系発色剤としては、種々のトリンダー試薬をカップラー試薬と組み合わせて利用できる。この方法はトリンダー法とも呼ばれ、臨床化学分析の分野では一般に用いられており、ここでは詳細に説明しないが、好ましくはカップラー試薬として４−アミノアンチピリンを、トリンダー試薬としてＡＤＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン］、ＤＡＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン］、ＨＤＡＯＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン］、ＭＡＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン」、ＴＯＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン］等が用いられる。また、カップラー試薬を必要としない、Ｏ−トリジン、Ｏ−ジアニシジン、ＤＡ−６７［１０−（カルボシキメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、和光純薬工業（株）製］、ＴＰＭ−ＰＳ［Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウム塩、同仁化学研究所］などのロイコ型発色試薬も同様に用いることができる。特に、ＤＡ−６７、ＴＰＭ−ＰＳは、上記トリンダー試薬と比べてモル吸光係数が大きいため、より感度よく測定することができる。
第二工程におけるイノシン以降の反応中間物質が試料中に含まれている可能性があるので、その測定値への影響を回避することを目的として、第一工程中でプリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびその補助基質であるリン酸、キサンチンオキシダーゼ、ならびに必要に応じてウリカーゼによって過酸化水素を発生させることができる。生じた過酸化水素は第一工程中に含まれる還元剤の作用により消失するが、さらに、カタラーゼを用いて水と酸素に分解させるか、あるいは、パーオキシダーゼを用いてトリンダー試薬またはカップラー試薬の一方と反応させて無色の複合体を生成することが好ましい。
本発明の方法は、これまでに説明したＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を含む試薬のみでもホモシステインの測定は可能であるが、測定の精度をさらに高めるために、この酵素を含まない試薬も同時に測定することにより、試料中に含まれるアデノシンなどの影響を回避することができる。すなわち、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を含まない試薬で測定した値は、あらかじめ試薬に含まれるアデノシンの量と試料に含まれるアデノシンの量との総和（総アデノシン）量を示す。一方、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を含む試薬は、上記の総アデノシン量から第一工程で消費されたアデノシンを差し引いた量を示す。こうして得られた２つの測定値の差は、消費されたアデノシンの量、すなわちホモシステインの量を示す。
（Ｂ）メチル転移酵素およびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いる場合（メチルトランスフェラーゼ法（以下、ＭＴａｓｅ法））の測定原理
次に、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、それぞれ、ホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素およびメチル供与体のＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いる場合、すなわち、試料中のホモシステインに、メチル転移酵素およびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを作用させた後、生成するＤ−メチオニンを測定する場合の測定原理を、図２に基づいて説明する。
（１）ＭＴａｓｅ法Ｉ
メチル転移酵素としては、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムおよびＬ−ホモシステインに作用し、Ｄ−メチオニンおよびＬ−メチオニンの生成を触媒するものであればどのようなものでもよく、例えば、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１０］、５−メチルテトラヒドロ葉酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１３］、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１４］が挙げられる。好ましくは、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１０］が使用される。ホモシステインメチルトランスフェラーゼの系統名は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：Ｌ−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼであり、メチル受容体のＬ−ホモシステインおよびメチル供与体のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを基質とし、Ｌ−メチオニンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを産生する酵素である（酵素ハンドブック、朝倉書店、１９８２年）。また、Ｓ．Ｋ．Ｓｈａｐｉｒｏにより、この酵素は、メチル供与体として、Ｓ−メチル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−メチオニンメチルスルホニウム）、またはＳ−アデノシル−Ｄ−メチオニンも利用することが報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２９，４０５−４０９，１９５８）。
さらに、同報告によれば、放射性同位元素でのラベル実験の結果から、メチオニンは、Ｓ−アデノシルメチオニンのメチル基がホモシステインへ転移することにより生成され、Ｓ−アデノシルメチオニンのリボースと硫黄原子との結合が開裂するためではないことも明らかにされている。したがって、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンをメチル供与体とした場合には、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインが、Ｌ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とした場合には２分子のＬ−メチオニンが、Ｓ−アデノシル−Ｄ−メチオニンをメチル供与体とした場合にはＬ−メチオニンとＳ−アデノシル−Ｄ−ホモシステインが生成する。いずれの場合にも、Ｌ−メチオニンが生成されるため、これを測定することによってもホモシステインの定量は可能である。
しかしながら、一般的に生体試料中のＬ−メチオニンは、ホモシステインに比べて多量（血漿で３〜５倍）に含まれるため、上記測定原理によりホモシステインを定量するためには、あらかじめホモシステインに影響のない方法でＬ−メチオニンを消去し、次いでホモシステインメチルトランスフェラーゼ反応で生成するＬ−メチオニンを特異的に測定する必要があるなど煩雑な操作が必要であり、好ましくない。一方、Ｇ．Ｇｒｕｅ−Ｓｏｒｅｎｓｅｎらによりホモシステインメチルトランスフェラーゼは、特異性は低いもののＤ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とし、Ｄ−メチオニンを生成することが報告されている（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １０９１−７（１９８４））。そこで、この反応を利用し、通常の生体試料中にはほとんど存在しないＤ−メチオニンを生成させ、次にこれを測定することによりホモシステインを特異的に定量する方法を確立した。
使用するホモシステインメチルトランスフェラーゼは、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とするものであればどのような由来のものでも使用できる。例えば、細菌、酵母、ラット等に由来する酵素が使用できる。
Ｄ−メチオニンの定量法は、特に限定されないが、Ｄ−アミノ酸変換酵素を用いて酵素的に測定する方法が好ましい。より好ましくは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ［ＥＣ １．４．３．３］が利用される。本発明者らは、Ｄ−アミノ酸の１つであるＤ−メチオニンメチルスルホニウムが、意外なことにほとんどＤ−アミノ酸オキシダーゼの基質にならないことを明らかにした。このように、Ｄ−アミノ酸変換酵素がＤ−メチオニンメチルスルホニウムには作用しないか、または作用してもＤ−メチオニンに対するよりも反応性が十分に低いものであれば、ホモシステインメチルトランスフェラーゼでの反応後に残存しているＤ−メチオニンメチルスルホニウムを反応系外に除くことなく、生成したＤ−メチオニンを測定することができる。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ以外にも、同様の性質を有するＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３６］、Ｄ−アミノ酸脱水素酵素［ＥＣ １．４．９９．１］なども利用できる（図２）。
図２に示すように、Ｄ−メチオニンにＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させた場合には、過酸化水素が生成するため、これを上述のようにＳＨ試薬の存在下で通常用いられる酸化系発色剤に導き比色定量することができる。また、Ｄ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させた場合には、生成するコエンザイムＡをアシルコエンザイムＡシンセターゼ［ＥＣ ６．２．１．３］およびアシルコエンザイムＡ酸化酵素［ＥＣ １．３．３．６］を用いて過酸化水素に導き、これを同様にして定量することができる。
（２）ＭＴａｓｅ法ＩＩ
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸脱水素酵素を作用させた場合には、アンモニアおよび４−メチルチオ−２−オキソ酪酸が生成する。これらの生成物を測定することによっても定量は可能である。
アンモニアは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）もしくはその誘導体（以下、本明細書ではＮＡＤ（Ｐ）Ｈという）、２−オキソグルタル酸、およびグルタミン酸脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．２］、［ＥＣ １．４．１．３］、または［ＥＣ １．４．１．４］）を作用させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を３４０ｎｍの吸光度変化を測定することによって定量できる。あるいは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰもしくはその誘導体（以下、本明細書では、ＮＡＤ（Ｐ）という）の増加を測定してもよい。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの誘導体としては、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（または３−アセチルピリジンジヌクレオチドリン酸）などが挙げられる。アンモニアの定量には、上記グルタミン酸脱水素酵素以外に、ロイシン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．９］）、アラニン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．１］）、セリン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．７］）、バリン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．８］）、グリシン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．１０］）など、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とし、アンモニアを利用して還元的アミノ化反応を触媒し得る脱水素酵素であればいずれも利用できる。これらの脱水素酵素の補助基質としては、アンモニウム塩、２−オキソ酸などが用いられ得る。２−オキソ酸としては、上記２−オキソグルタル酸以外に、ピルビン酸、２−オキソ酪酸、２−オキソイソカプロン酸、２−オキソイソ吉草酸、２−オキソ吉草酸、２−オキソカプロン酸、グリオキシル酸、ヒドロキシピルビン酸などが挙げられる。
また、アンモニアは、ネスラー試薬、ｐＨ指示薬、電極法等を利用しても定量可能である。
４−メチルチオ−２−オキソ酪酸は、ＮＡＤＨ、アンモニア、およびロイシン脱水素酵素［ＥＣ １．４．１．９］を作用させ、上記アンモニアの場合と同様に、例えば、ＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍの吸光度変化を測定することによって定量できる。４−メチルチオ−２−オキソ酪酸がロイシン脱水素酵素の基質となることは知られている（Ｇ．Ｌｉｖｅｓｅｙら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６６，２８２−２８８，１９８８）。４−メチルチオ−２−オキソ酪酸の定量には、上記ロイシン脱水素酵素以外に、乳酸脱水素酵素（［ＥＣ １．１．１．２７］）など、４−メチルチオ−２−オキソ酪酸を還元し得る脱水素酵素であればいずれも利用できる。
４−メチルチオ−２−オキソ酪酸またはアンモニアをＮＡＤ（Ｐ）Ｈの３４０ｎｍの吸光度変化によって定量する系に導くための方法は、還元剤の影響を受けにくいことが知られており、そのため、ＳＨ試薬を使用する必要がない（池田ら，臨床検査，４１，９８９−９９３，１９９７）。還元剤の共存下で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ定量系に導いている例としては、血中クレアチンキナーゼ測定法が挙げられる（臨床化学，１９，１８９−２０８，１９９０）。
また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼによってアンモニアまたは４−メチルチオ−２−オキソ酪酸を生成させる測定系においては、生成物の１つである過酸化水素をカタラーゼによって消去して、その影響を除くことも可能である。
本発明の方法は、用手法、自動分析法を問わず適用できる。例えば、２試薬系の汎用自動分析装置を利用する場合は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ反応を進める第一工程とＤ−メチオニンを検出する第二工程とに分けることによって、容易に生体試料中のホモシステインを測定することができる。
本発明の方法によるホモシステイン定量では、試料中のＤ−アミノ酸が正誤差を与えるが、通常の生体試料中のＤ−アミノ酸の量は非常に少ない。しかし、ある種の疾患によりＤ−アミノ酸の量が上昇することも報告されている。したがって、その影響を回避するために、ホモシステインメチルトランスフェラーゼを含まない以外は全く同様に調製した試薬で測定し、その値を同酵素添加検体の測定値から差し引くことによって、正確にホモシステインの量を測定することができる。
また、ＮＡＤＨの吸光度を測定する場合には、まず、試料に還元反応および第二工程のための試薬を加えて反応させ、次いで第一工程のホモシステインメチルトランスフェラーゼを含む試薬を加えて反応させて、それぞれの反応終了時の吸光度の差を求めることによって、Ｄ−アミノ酸など内因性物質の影響を回避したホモシステインの定量が可能である。
また、本発明では、（ａ）ホモシステインを還元するためのチオール化合物、（ｂ）還元型ホモシステインと反応させるため（第一工程）のホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質、ならびに（ｃ）残存するホモシステイン補助基質または生成したホモシステイン変換酵素生成物を測定するため（第二工程）の（ｉ）ＳＨ試薬および酸化系発色剤または（ｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする脱水素酵素および該酵素の特性に応じた補助基質または発色剤を含む、試料中のホモシステインを測定するためのキットが提供される。還元工程と第一工程とを同時に行うために、（ａ）および（ｂ）を一緒に含んでいてもよい。特に、（ｃ）（ｉｉ）を用いる場合は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を一緒に含んでいてもよい。また、上記（Ａ）の場合のように、試料に含まれているイノシン以降の反応中間物質の測定値への影響を回避することを目的として、第一工程用の試薬中に、あらかじめプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リン酸、キサンチンオキシダーゼ、カタラーゼ、ならびに必要に応じてウリカーゼを含んでいてもよい。さらにカタラーゼの代わりに、もしくはそれに加えて、パーオキシダーゼおよびトリンダー試薬またはカップラー試薬の一方を含んでいてもよい。
実施例
（実施例１）ウシ小腸由来アデノシンデアミナーゼおよびイノシン測定系酵素に及ぼすＮ−エチルマレイミドの影響
ＳＨ試薬としてＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を用いる場合の、第二工程への影響を検討した。
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭアデノシン、０．４Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（東洋紡績（株）製）、３Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ（東洋紡績（株）製）、１１Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ（東洋紡績（株）製）、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、および１ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）を混合し、３７℃で５分間インキュベーションした。次いで、０．００１Ｕ／ｍＬ小腸由来アデノシンデアミナーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）を添加し、５４０ｎｍの吸光度変化を分光光度計（（株）島津製作所製ＵＶ−２２００型）を用いて測定した。直線的に変化する部分の吸光度は、１分間あたり０．０６７６であった。続いて、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドを添加した後に同様に測定したところ、１分間あたりの吸光度変化は０．０６５６であった。したがって、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）は、ウシ小腸由来アデノシンデアミナーゼおよびイノシン測定系にほとんど影響しないことが明らかになった。
（実施例２）ウシ膵由来アデノシンデアミナーゼに及ぼすＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の影響
ウシ小腸由来アデノシンデアミナーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）の代わりにウシ膵由来アデノシンデアミナーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）を用いる以外は、実施例１と同様に行った。その結果、Ｎ−エチルマレイミド添加前の１分間の吸光度変化が０．０７５１に対し、添加後は０．０７２１であり、Ｎ−エチルマレイミドは、ウシ膵由来アデノシンデアミナーゼに対してもほとんど影響しないことが明らかになった。
（実施例３）酸化系発色剤を用いたホモシステイン測定系における還元剤による発色妨害およびＳＨ試薬によるその防止
測定は日立７１７０自動分析装置（（株）日立製作所製）を用いて、反応温度３７℃、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで実施した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．００９ｍＭアデノシン、０．８Ｕ／ｍＬ Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素、１．５Ｕ／ｍＬウリカーゼ、４．３Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ、６．４Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、２．９ｍＭ ４−アミノアンチピリン、２．３ｍＭジチオスレイトール、および０．２％トリトンＸ−１００を含む試薬１を１８０μＬ添加し、約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．３Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼ、１．３Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、１．８ｍＭ ＴＯＯＳ、１７ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、および０．１％トリトンＸ−１００を含む試薬２を１８０μＬ添加して、さらに約５分間反応させた。これと並行して、試薬２にＮ−エチルマレイミドを含まない以外は全く同様の操作を実施し、両者の反応過程を比較した。結果を図３に示す。
図３からも明らかなように、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）が存在しない状態では発色は著しく妨害され、測定は全く不可能であることがわかる（○）。一方、ＳＨ試薬であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）が共存する場合には、その影響を受けることなく発色した（●）。
（実施例４）ホモシスチン標品を試料とした場合の用量依存性
測定は上記日立７１７０自動分析装置を用いて、反応温度３７℃、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで実施した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）および０、１５．６２５、３１．２５、６２．５、および１２５μＭホモシスチン（ホモシステインとして０〜２５０μＭ）を含む試料２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．７Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、２．７Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ、１０Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、０．００９ｍＭアデノシン、１．８ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１．８ｍＭジチオスレイトール、０．４Ｕ／ｍＬ Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素、および０．５％トリトンＸ−１００を含む試薬１を１８０μＬ添加し、約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭ ＴＯＯＳ、６ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、および０．２Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼを含む試薬２を１８０μＬ添加し、さらに約５分間反応させた。日立７１７０の測定ポイント１６から３４の吸光度変化を求めた。その結果を図４に示す。図４から明らかなようにホモシステイン濃度が１２５μＭまで吸光度変化量と直線関係が認められ、ホモシステインの測定が可能であることがわかった。
（実施例５）血清試料中のホモシステイン測定（ＳＡＨａｓｅ法）
測定は、日立７１７０自動分析装置を用いて、反応温度３７℃、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ、３試薬系で実施した。正常コントロール血清セラクリアＨＥにホモシスチンを０、２．５、５、１０、２０、３０、４０、および５０μＭ（ホモシステイン換算値０〜１００μＭ）添加した試料２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、７ｍＭジチオスレイトール、０．０２８ｍＭアデノシン、および０．３％トリトンＸ−１００を含む試薬１を５０μＬ添加した。続いて約８０秒後に、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２Ｕ／ｍＬウリカーゼ、１．６Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、５．９Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ、２２Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、４ｍＭ ４−アミノアンチピリン、０．５ｍＭジチオスレイトール、１．１Ｕ／ｍＬ Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素、および０．１％トリトンＸ−１００を含む試薬２を１３０μＬ添加し、約８分間反応させ、アデノシルホモシステインを生成させるとともに、試料に含まれているイノシン以降の反応中間物質の測定値へ影響を回避した。さらに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１．８ｍＭ ＴＯＯＳ、１７ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、０．２３Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼ、および０．１％トリトンＸ−１００を含む試薬３を１８０μＬ添加し、さらに約５分間反応させた。試薬３添加直前（日立７１７０測定ポイント３３）と添加約５分後（日立７１７０測定ポイント５０）との吸光度を測定し、その変化量を求めた。
これと同時に、検体ブランクを測定した。Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素（以下、ＳＡＨａｓｅということがある）が添加された試薬２（以下、ＳＡＨａｓｅ添加試薬という）の代わりに、試薬２からＳＡＨａｓｅを除いた試薬（以下、ＳＡＨ無添加試薬という）を用いること以外は、同じ操作を行った。すでに述べた通り、ＳＡＨａｓｅ標品中にはアデノシンデアミナーゼがわずかに混在するために、その影響を回避する必要がある。そこで、同時に、試料として１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いることにより、ＳＡＨａｓｅ添加試薬のブランクおよびＳＡＨａｓｅ無添加試薬のブランクをそれぞれ測定し、その比を混在するアデノシンデアミナーゼの影響に対する補正係数とした。
図５に、ＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値、ＳＡＨａｓｅ添加試薬での実測値に補正係数を乗じることにより補正した値（以下、ＳＡＨａｓｅ添加試薬の補正値）、およびＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値からＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値を差し引いた値をホモシステイン添加量に対してプロットした結果を示す。ＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値はホモシステインの添加量に関係なく一定の値を示す（Ａ：○）のに対し、ＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値は、ホモシステインの添加量に依存して減少する（Ｂ：●）。従って、ＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値からＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値を差し引いた値はホモシステイン添加量に依存することがわかる（Ａ−Ｂ：▲）。一方、試料として３１．２５μＭホモシスチン（ホモシステイン換算値６２．５μＭ）を含むリン酸緩衝液を用い、試薬２としてＳＡＨａｓｅ添加試薬およびＳＡＨａｓｅ無添加試薬をそれぞれ用いて同様にして測定した後補正し、ＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値からＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値を差し引いた値（吸光度差）を求め、吸光度差あたりのホモシステイン量を表すファクターを算出した。上記血清ベースの試料のＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値からＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値を差し引いた値（図５のＡ−Ｂ：▲）にファクターを乗じて各試料中のホモシステイン量を算出し、ホモシステイン添加量に対してプロットした結果を図６に示す（●）。
図６から明らかなように、試料中に含まれているイノシン以降の反応中間物質および内因性アデノシンなどの測定値への影響を回避して、血清ベースの試料においても約８０μＭまで血清総ホモシステインの測定が可能であることがわかった。
（実施例６）ホモシステイン測定系（ＳＡＨａｓｅ法）に及ぼすシステインおよびメチオニンの影響
ホモシスチンを２７μＭ（ホモシステイン換算 ５４μＭ）添加した正常コントロール血清セラクリアＨＥ、ならびにこれにメチオニンおよびシステインを同時にそれぞれ５００および１０００μＭ添加した試料を用いること以外は、実施例５と同様に測定した。図７に示すように、ホモシステインの測定において１０００μＭまではシステインおよびメチオニンの影響を認めずに正確に測定できることが明らかである。
（実施例７）本発明の方法（ＳＡＨａｓｅ法）による測定と従来のＨＰＬＣ法による測定との相関性の検討
血清試料５３サンプルについて、ＳＡＨａｓｅ法によってホモシステインを測定した。スタンダードとして、５２．３μＭホモシステインを含むコントロール血清セラクリアＨＥ、発色試薬としてＤＡ−６７、測定波長として主波長６６０ｎｍ、副波長７５０ｎｍを用いて測定する以外は、実施例５の方法に準じて行った。すなわち、まず、血清試料１０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、７ｍＭ ＤＴＴ、０．０１５ｍＭアデノシンおよび０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬１を５０μＬ添加した。続いて、約８０秒後に、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２Ｕ／ｍＬウリカーゼ、１．６Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、６Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ、１５０Ｕ／ｍＬカタラーゼ、０．８４ｍＭ ＤＡ−６７、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１．１Ｕ／ｍＬ ＳＡＨａｓｅ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬２を、１３０μＬ添加し、約８分間反応させた。さらに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１１Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、１７ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、０．２３Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬３を、１８０μＬ添加し、さらに約５分間反応させた。測定ポイントおよびキャリブレーションは、実施例５の方法と同様に行った。
一方、同試料のホモシステイン測定を、ＨＰＬＣ法でも実施した（（株）ＳＲＬ委託）。
横軸にＨＰＬＣ法による測定値を、縦軸に本発明の方法（ＳＡＨａｓｅ法）による測定値をプロットした結果を、図８に示す。図８から明らかなように、非常に良好な相関関係が得られ、試料中のホモシステインが本発明の方法により正確に測定できることがわかる。
（実施例８）ホモシステインメチルトランスフェラーゼの調製
Ｓ．Ｋ．Ｓｈａｐｉｒｏの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７ Ｐｔ．Ｂ，４００−４０５，１９７１）を一部改変して、以下のようにホモシステインメチルトランスフェラーゼ酵素液を調製した。
まず、２５０ｇのパン酵母（オリエンタル酵母製）を１２５ｍｌの蒸留水に懸濁し、３７℃まで加温後、撹拌しながら１６．３ｇの炭酸水素ナトリウムおよび４４ｍｌのトルエンを添加した。３７℃で撹拌を続けながら９０分間インキュベートした後、同容量の氷冷した蒸留水を添加して急冷した。この溶液を７０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清をペーパータオルで濾過し、濾液をさらに９０００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、上清を回収した。
次に、氷冷下で撹拌しながら最終濃度が０．５％となるようにＬ−メチオニンを添加し、そのまま約６０分間かけて溶解させた。液温を３℃以下に保持し、撹拌しながら、約−２０℃に冷却したエタノールを２０ｍＬ／分の速度で添加した。エタノールの濃度が約２５％に達した時点で、食塩−氷を用いて冷却槽を−１０℃以下として冷却を開始した。続いて最終濃度が５３％になるまで同様にエタノールを添加後、−２０℃で１６時間静置した。９０００ｒｐｍ、−１０℃で６０分間遠心分離した。上清を回収し、食塩−氷で−１０℃以下に冷却しながら、最終濃度７０％まで同じ条件でエタノールを添加した。添加後、１時間静置し、９０００ｒｐｍ、−１０℃で９０分間遠心分離した。
得られた沈澱を約７ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した。溶解液を同じ緩衝液に対して２回透析した後、遠心濃縮器（セントリプレップ−１０、アミコン製）で約１．５ｍＬに濃縮し、酵素液とした。
次に、得られた酵素液のホモシステインメチルトランスフェラーゼ酵素活性を以下のように測定した。６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０％酵素液、１ｍＭジチオスレイトール、０．２ｍＭホモシスチン（シグマ−アルドリッチ製、Ｈ−６０１０）、および０．４ｍＭヨウ化Ｌ−メチオニンメチルスルホニウム（アクロス製、２７７９４−０２５０）または臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム（アクロス製、２９９３９−００１０）を混合し、３７℃で２時間反応させた。薄層板（薄層クロマトグラフィー用プレート）に約８μＬずつスポットし、９５％エタノール−２８％アンモニア水（７７：２３、ｖ／ｖ）で展開後、ニンヒドリン発色させた。その結果、Ｌ−メチオニンメチルスルホニウムまたはＤ−メチオニンメチルスルホニウムのいずれを基質とした場合も、反応生成物にはメチオニンが含まれることを確認した。一方、メチル受容体であるホモシステインを反応系から除いた場合には、メチオニンは生成されないことを確認した。
以上から、得られた酵素液は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ活性を有すること、およびこの酵素液は、Ｌ−メチオニンメチルスルホニウムのみならず、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをもメチル供与体として利用し得ることを確認した。
（実施例９）Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応性
Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応性を、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように測定した。１．３ｍＭ Ｄ−メチオニンを含む試料１０μＬに、９２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１．３ｍＭ ４−アミノアンチピリン、および３．３Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼを含む試薬１を２００μＬ添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、６９ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５．２ｍＭ ＴＯＯＳ、２．６Ｕ／ｍＬブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）、および２．６ｍＭフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を含む試薬２を５０μＬ添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。吸光度変化を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。また、１．３ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを含む試料ならびにＤ−メチオニンおよび臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをそれぞれ１．３ｍＭ含む試料を全く同様に測定した。反応のタイムコースを、図９に示す。ブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ−メチオニン（●）に比較してＤ−メチオニンメチルスルホニウム（△）とはほとんど反応しなかった。また、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム存在下においても、Ｄ−メチオニンとの反応性が変わらないことも分かった（▲）。
（実施例１０）Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するカビ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応性
ブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの代わりにカビ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（フサリウム属、池田糖化工業製）を用いること以外は、実施例９と全く同様に行った。反応のタイムコースを、図１０に示す。カビ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼについても、Ｄ−メチオニン（●）に比較してＤ−メチオニンメチルスルホニウム（△）とはほとんど反応しないことが明らかとなった。また、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム存在下においても、Ｄ−メチオニンとの反応性が変わらないことも分かった（▲）。
（実施例１１）還元剤共存下で酸化系発色剤を用いるＤ−メチオニン測定系におけるＮ−エチルマレイミドの効果
次いで、Ｄ−メチオニン測定を、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように行った。すなわち、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する０、０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、および１ｍＭのＤ−メチオニン２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＴＯＯＳ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬１を２００μＬ添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、４ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、１７．６Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、１ｍＭ ＦＡＤ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬２を５０μＬ添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ）変化を測定した。次に、試薬１に２．８ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を添加する以外は全く同様に試薬を調製して、ＮＥＭ添加の場合について同様に測定した。
図１１に示すように、ＮＥＭ無添加試薬で測定した場合（○）には、試料中に含まれるジチオスレイトールのため、Ｄ−メチオニンが全く測定されなかったが、ＮＥＭ添加試薬で測定した場合（●）は、直線的な用量依存性が認められ、Ｄ−メチオニンを測定することができることが分かった。
（実施例１２）本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）におけるホモシステイン標品での用量依存性の検討
０、１００、および２００μＭホモシスチン（ホモシステイン換算値０、２００および４００μＭ）、８６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０％酵素液、４ｍＭジチオスレイトール、および１．５ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを、３７℃で９０分間反応させた。
反応液中のＤ−メチオニン量の測定を、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように実施した。検体（反応液）３０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＴＯＯＳ、および１．７ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含む試薬１を２００μＬ添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、４ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、１７．６Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、および０．２ｍＭ ＦＡＤを含む試薬２を５０μＬ添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ）変化を測定した。その結果を、横軸をホモシスチン濃度、縦軸を吸光度変化（×１００００）として図１２に示した。
図１２から明らかなように、ホモシスチンの用量依存的に吸光度変化の増大が認められた（●）。一方、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを添加しない場合（△）および酵素を添加しない場合（□）には、用量依存性は観察できなかった。
（実施例１３）本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）における血清ホモシステインの用量依存性の検討
正常コントロール血清セラクリアＨＥ（アズウェル社）にホモシスチンを０、１０、２０、３０、４０、および５０μＭ（ホモシステイン換算値０〜１００μＭ）添加した試料１００μＬに、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、３０％酵素液、１５ｍＭジチオスレイトール、および３ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを含む処理液５０μＬを添加して混合し、３７℃で９０分間反応させた。
反応液中のＤ−メチオニン量の測定を、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように実施した。検体（反応液）２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＴＯＯＳ、２．８ｍＭ ＮＥＭおよび０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬１を２００μＬ添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、４ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、１７．６Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、１ｍＭ ＦＡＤ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬２を５０μＬ添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ）変化を求めた。その結果を、横軸を添加ホモシスチン濃度、縦軸を各検体の吸光度変化（×１００００）からホモシスチン無添加検体の吸光度変化（×１００００）を差し引いた値として図１３に示した。
図１３から明らかなように、血清検体においてもホモシスチン添加量に対して用量依存性が認められた（●）。一方、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを添加しない場合（○）には、このような用量依存性は観察されなかった。以上の結果から、検体中のホモシステインの定量が可能であることが明らかである。
（実施例１４）高感度発色剤による測定
Ｄ−メチオニン定量のための発色剤をＴＯＯＳ、４−アミノアンチピリン系から、高感度発色剤であるＴＰＭ−ＰＳに変更する以外は、実施例１３と全く同様に行った。すなわち、Ｄ−メチオニン定量試薬の試薬１からＴＯＯＳを除き、そして試薬２から４−アミノアンチピリンを除いて代わりにＴＭＰ−ＰＳを２ｍＭ添加したものを測定に用いた。図１４に示すように、ＴＭＰ−ＰＳを用いた方が、ＴＯＯＳ、４−アミノアンチピリン系に比べて高感度で測定することが可能であることが分かった。
（実施例１５）本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）による測定と従来のＨＰＬＣ法による測定との相関性の検討
血清試料３５サンプルについて、ＭＴａｓｅ法によってホモシステインを測定した。試薬ブランクとして生理食塩水を、スタンダードとして５０μＭホモシステインを含む生理食塩水を用いた。試料１００μＬに、９．６Ｕ／Ｌホモシステインメチルトランスフェラーゼ、１５ｍＭ ＤＴＴ、１．５ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、および０．５ｍＭ臭化亜鉛を含む３５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０μＬを添加し、３７℃で９０分間反応させた。なお、ホモシステインメチルトランスフェラーゼの１Ｕは、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とし、ホモシステインをメチル受容体として用いたとき、１分間あたり１μｍｏｌのＤ−メチオニン合成を触媒する酵素量である。同じ試料について、ホモシステインメチルメチルトランスフェラーゼを含まない試薬で同様に反応させた。次に、１８ｍＭ ＮＥＭを含む反応停止液１５０μＬを加えた。反応液中のＤ−メチオニン量の測定は、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように実施した。反応液３０μＬに、０．４８ｍＭ ＴＯＯＳを含む９６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０μＬを添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、０．７ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１．４Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、４．４Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、および１ｍＭ ＦＡＤを含む９０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μＬを添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ）変化を求めた。ホモシステインメチルトランスフェラーゼ添加試薬での吸光度変化から同酵素無添加試薬での吸光度変化（サンプルブランク）を差し引いた値を用いて試料中のホモシステイン量を算出した。
一方、同試料のホモシステイン測定を、ＨＰＬＣ法でも実施した（（株）ＳＲＬ委託）。
横軸にＨＰＬＣ法による測定値を、縦軸に本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）による測定値をプロットした結果を、図１５に示す。図１５から明らかなように、非常に良好な相関関係が得られ、試料中のホモシステインが本発明の方法により正確に測定できることがわかる。
（実施例１６）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびロイシン脱水素酵素を用いたＤ−メチオニン測定系における用量依存性の確認および還元剤ＤＴＴの影響
日立７１７０自動分析装置を用いて、Ｄ−メチオニンを以下のように測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に０、２５、５０、１００、２００、および４００μＭのＤ−メチオニンを含む試料３０μＬに、５０ｍＭ ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸；同仁化学研究所製）（ｐＨ８．５）、９９０ｍＭ塩化アンモニウム（ナカライ製）、３．４Ｕ／ｍＬロイシン脱水素酵素（和光純薬製）、３２Ｕ／ｍＬカタラーゼ（ロシュ製）、および０．１６ｍＭ ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母製）を含む試薬１を１８０μＬ添加し、３７℃にて約５分間反応させた。続いて、５０ｍＭ ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）、９９０ｍＭ塩化アンモニウム、５Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ブタ腎臓由来、キッコーマン製）、および０．１ｍｇ／ｍＬ ＦＡＤを含む試薬２を４０μＬ添加し、さらに３７℃にて約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４におけるＮＡＤＨの吸光度（主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍ）の変化を測定した。次に、試薬１に、１０ｍＭ ＤＴＴを添加する以外は、全く同様に試薬を調製して、ＤＴＴ添加の場合について同様に測定した。
結果を図１６に示す。横軸は添加Ｄ−メチオニン濃度を、縦軸は３４０ｎｍ（副波長４０５ｎｍ）における吸光度の変化量を示す。
図１６に示すように、ＤＴＴを含まない場合（△）、この測定系において添加Ｄ−メチオニン量に対して直線的な用量依存的な吸光度変化が認められ、Ｄ−メチオニンが定量できることがわかった。また、ＤＴＴを含む場合（○）においても、Ｄ−メチオニンの測定には、ＤＴＴが影響しないことも確認された。
（実施例１７）ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびロイシン脱水素酵素を用いたホモシステイン測定系（ＭＴａｓｅ法ＩＩ）における用量依存性の確認
日立７１７０自動分析装置を用いて、ホモシステインを以下のように測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に０、１２．５、２５、５０、および１００μＭのホモシスチン（ホモシステイン換算値：０、２５、５０、１００、および２００μＭ）を含む試料３０μＬに、５０ｍＭ ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）、９９０ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／ｍＬホモシステインメチルトランスフェラーゼ（酵母由来、大関株式会社より入手）、０．６ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、５Ｕ／ｍＬロイシン脱水素酵素（和光純薬製）、３２Ｕ／ｍＬカタラーゼ、および０．１６ｍＭ ＮＡＤＨを含む試薬１を１８０μＬ添加し、３７℃にて約５分間反応させた。続いて、５０ｍＭ ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）、９９０ｍＭ塩化アンモニウム、７．５Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン製）、および０．１ｍｇ／ｍＬ ＦＡＤを含む試薬２を４０μＬ添加し、さらに３７℃にて約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４におけるＮＡＤＨの吸光度（主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍ）の変化を測定した。次に、試料として正常コントロール血清セラクリアＨＥにホモシスチンを０、１２．５、２５、５０、および１００μＭ添加したものを使用する以外は、上記と全く同様に測定した。
結果を図１７に示す。横軸は添加ホモシステイン濃度を、縦軸は３４０ｎｍ（副波長４０５ｎｍ）における吸光度の変化量を示す。
図１７に示すように、ホモシステイン標品（●）および血清検体（▲）のいずれにおいても、ホモシステイン添加量に対して用量依存的な吸光度変化が認められ、この測定系においてもホモシステイン定量が可能であることが明らかとなった。
（実施例１８）ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびグルタミン酸脱水素酵素を用いたホモシステイン測定系（ＭＴａｓｅ法ＩＩ）における用量依存性の確認
日立７１７０自動分析装置を用いて、ホモシステインを以下のように測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に０、１２．５、２５、５０、および１００μＭのホモシスチン（ホモシステイン換算値：０、２５、５０、１００、および２００μＭ）を含む試料３０μＬに、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．６ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、２Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン製）、０．０３ｍｇ／ｍＬ ＦＡＤ、３２Ｕ／ｍＬカタラーゼ、８Ｕ／ｍＬグルタミン酸脱水素酵素（東洋紡績製）、８ｍＭ ２−オキソグルタル酸（ナカライ製）、および０．１６ｍＭ ＮＡＤＨを含む試薬１を１８０μＬ添加し、３７℃にて約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）および２．１Ｕ／ｍＬホモシステインメチルトランスフェラーゼ（酵母由来、大関株式会社より入手）を含む試薬２を４０μＬ添加し、さらに３７℃にて約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４におけるＮＡＤＨの吸光度（主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍ）の変化を測定した。次に、試料として正常コントロール血清セラクリアＨＥにホモシスチンを０、１２．５、２５、５０、および１００μＭ添加したものを使用する以外は、上記と全く同様に測定した。
結果を図１８に示す。横軸は添加ホモシステイン濃度を、縦軸は３４０ｎｍ（副波長４０５ｎｍ）における吸光度の変化量を示す。
図１８に示すように、ホモシステイン標品（●）および血清検体（▲）のいずれにおいても、ホモシステイン添加量に対して用量依存的な吸光度変化が認められ、この測定系においてもホモシステイン定量が可能であることが明らかとなった。
（実施例１９）乳酸脱水素酵素による４−メチルチオ−２−オキソ酪酸の定量性の確認
日立７１７０自動分析装置を用いて、４−メチルチオ−２−オキソ酪酸を以下のように測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に０、５０、１００、２００、および４００μＭの４−メチルチオ−２−オキソ酪酸（アルドリッチ製）を含む試料３０μＬに、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）および０．１６ｍＭ ＮＡＤＨを含む試薬１を１８０μＬ添加し、３７℃にて約５分間反応させた。続いて、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）および６５Ｕ／ｍＬ乳酸脱水素酵素（ブタ心臓由来、オリエンタル酵母製）を含む試薬２を４０μＬ添加し、さらに３７℃にて約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４におけるＮＡＤＨの吸光度（主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍ）の変化を測定した。
結果を図１９に示す。横軸は４−メチルチオ−２−オキソ酪酸濃度を、縦軸は３４０ｎｍ（副波長４０５ｎｍ）における吸光度の変化量を示す。
図１９に示すように、４−メチルチオ−２−オキソ酪酸量に対して用量依存的な吸光度変化が認められ、乳酸脱水素酵素が４−メチルチオ−２−オキソ酪酸を基質とすることが明らかとなり、実施例１７および１８のロイシン脱水素酵素およびグルタミン酸脱水素酵素の代わりに乳酸脱水素酵素を用いる測定系においても、ホモシステイン定量が可能であることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明によって、生体試料、特に血液、尿などの体液中のホモシステインを、迅速かつ簡便に、感度よく検出および定量することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
図１は、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを用いる場合の反応概略図である。
図２は、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、ホモシステイントランスフェラーゼおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いる場合の反応概略図である。
図３は、酸化系発色剤を用いたホモシステイン測定系における発色のＳＨ試薬添加による効果を示すグラフである。
図４は、ホモシスチン標品を試料とした場合の用量依存性を示すグラフである。
図５は、血清試料中のホモシステイン測定において、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素添加試薬および無添加試薬の場合の吸光度を示すグラフである。
図６は、血清試料中のホモシステインを測定した結果を示すグラフである。
図７は、ホモシステイン測定系に及ぼすシステインおよびメチオニンの影響を示すグラフである。
図８は、本発明の方法（ＳＡＨａｓｅ法）および従来のＨＰＬＣ法による血清試料中のホモシステインの測定値の相関性を示すグラフである。
図９は、Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するブタ腎臓由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応タイムコースを示すグラフである。
図１０は、Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するカビ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応タイムコースを示すグラフである。
図１１は、還元剤存在下で酸化系発色剤を用いるＤ−メチオニン測定系におけるＳＨ試薬の効果を示すグラフである。
図１２は、ホモシスチン標品を試料とした場合の用量依存性を示すグラフである。
図１３は、血清試料中のホモシステイン測定において、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム添加および無添加の場合の吸光度を示すグラフである。
図１４は、血清試料中のホモシステインを高感度発色剤によって測定した結果を示すグラフである。
図１５は、本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）および従来のＨＰＬＣ法による血清試料中のホモシステインの測定値の相関性を示すグラフである。
図１６は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびロイシン脱水素酵素を用いたＤ−メチオニン測定系における用量依存性を示すグラフである。
図１７は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびロイシン脱水素酵素を用いたホモシステイン測定系（本発明の方法：ＭＴａｓｅ法ＩＩ）における用量依存性を示すグラフである。
図１８は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびグルタミン脱水素酵素を用いたホモシステイン測定系（本発明の方法：ＭＴａｓｅ法ＩＩ）における用量依存性を示すグラフである。
図１９は、乳酸脱水素酵素を用いた４−メチルチオ−２−オキソ酪酸測定系における用量依存性を示すグラフである。
本発明は、ホモシステインの測定方法に関する。
背景技術
メチオニン代謝の中間代謝物の１つであるホモシステインは、血管内皮細胞傷害作用を有し、他の因子とは独立した動脈硬化性疾患の危険因子であることが報告されている。ホモシステイン代謝酵素の欠損により引き起こされる強度の高ホモシステイン血症（ホモシスチン尿症）のほかに、遺伝子異常による代謝酵素活性の低下、腎不全、加齢、喫煙、運動不足などによっても、中等度の高ホモシステイン血症を呈することが明らかになっている（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４４：８（Ｂ），１９９８）。また、これらの高ホモシステイン血症は、ビタミンＢ６・葉酸などの摂取により改善することも報告されている（ＪＡＭＡ ２７０：６９３，１９９３）。したがって、新生児マススクリーニングだけでなく、成人の動脈硬化性疾患の予防やビタミン欠乏症の発見のためにも、簡便で多数の検体を処理できる方法が要求されている。
血中のホモシステインの大部分（９９％）は、酸化型のジスルフィド化合物（蛋白結合型、ホモシスチン、システイン−ホモシステイン結合型など）として存在している（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４４，８（Ｂ），１９９８）。総ホモシステインは、これら酸化型および還元型ホモシステインの総量を意味し、通常その測定のためには、試料をまず還元剤により還元型ホモシステインに変換する必要がある。
ホモシステインの測定には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法および免疫法が主として用いられている。前者で用いられるＨＰＬＣ装置は、臨床検査の現場では一般的とは言えず、加えてその操作には時間、労力、費用を必要とする。また、後者は、自動化されているものの（Ｓｈｉｐｃｈａｎｄｌｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４１，７，９９１−９９４，１９９５）、酵素反応によるホモシステインからＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインへの変換工程と免疫法によるその検出工程との組み合わせにより達成されるため、専用の装置を必要とする。
免疫法による測定方法は、特表平９−５１２６３４号および特開平１０−１１４７９７号にも提案されている。特表平９−５１２６３４号の方法は、ホモシステインを化学修飾して抗原性を高めることにより免疫学的に測定する方法であり、工程数が多く煩雑である。また、特開平１０−１１４７９７号は、ホモシステインを測定する方法を開示しているが、この方法はアルブミンに結合したホモシステインのみを直接測定する方法であり、総ホモシステイン量を測定する方法ではない。この方法では、全体の７０％程度のホモシステインしか測定できない。
一方、生化学法による測定方法は、日本特許第２８７０７０４号、米国特許第５９９８１９１号、および米国特許第５８８５７６７号に記載されている。日本特許第２８７０７０４号の方法は、還元剤で処理した検体中のホモシステインを、アデノシンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素と接触させ、残存する混合物中のアデノシン量を評価することを特徴とする。しかし、この方法は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素阻害剤を用いないので、カイネティックモードによる測定が必要である。さらに、総ホモシステイン測定のために必須の工程である還元処理に用いられる還元剤の存在下では、生成する過酸化水素を、通常用いられる酸化系発色剤に導くことはできないという問題点がある。このため、汎用の自動分析装置に応用することはできない。しかし、この特許明細書にはこれらの問題を回避する方法は何ら述べられていない。
特表２０００−５０２２６２号、米国特許第５９９８１９１号、および米国特許第５８８５７６７号に記載の方法は、ホモシステインに、ホモシステインデスルフラーゼ、ホモシステナーゼ、またはメチオニン−γ−リアーゼを作用させ、生成する硫化水素、アンモニア、または２−オキソ酪酸を検出することを特徴としている。しかし、工程数が多いこと、硫化水素の検出に有害な重金属である鉛イオンを使用すること、あるいは通常の生体試料ではホモシステインより含量の多い構造類似物質であるシステインやメチオニンの影響を受けることなどの問題点を有する。
このように、従来の方法は、特殊装置を必要とし、操作が煩雑であり、そして感度・特異性が不十分であるなどの問題点があり、微量濃度のホモシステインを、迅速、簡便かつ感度よく測定する方法は未だに確立されていない。
発明の開示
したがって、本発明の目的は、生体試料などに含まれるホモシステインを迅速、簡便かつ感度よく測定することができる新規測定方法、ならびにこの測定方法に用いるためのキットを提供することである。
本発明者らは、残存するホモシステイン補助基質、生成したホモシステイン変換酵素生成物またはそれらの酵素反応生成物を、（ｉ）ＳＨ試薬の存在下で酸化して過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させることによって、または（ｉｉ）Ｄ−アミノ酸変換酵素を作用させてオキソ酸および／またはアンモニアを生成させ、生成したオキソ酸および／またはアンモニアを検出または測定することによって、検出または測定することに成功し、本発明を完成させた。本発明のホモシステインの測定方法により、生体試料、特に血液、尿などの体液中のホモシステインを迅速かつ簡便に検出および測定できる。
本発明は、試料中のホモシステインを検出または測定するための方法であって、
（ａ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程、
（ｂ）還元されたホモシステインに、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質を作用させ、ホモシステイン変換酵素生成物を生じさせる工程、および
（ｃ）残存するホモシステイン補助基質、生成したホモシステイン変換酵素生成物またはそれらの酵素反応生成物を、（ｉ）ＳＨ試薬の存在下で酸化して過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させることによって、または（ｉｉ）Ｄ−アミノ酸変換酵素を作用させてオキソ酸および／またはアンモニアを生成させ、生成したオキソ酸および／またはアンモニアを検出または測定することによって、検出または測定する工程、
を含む方法に関する。
好ましい実施態様においては、前記工程（ｂ）のホモシステイン変換酵素が、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素であり、そして前記工程（ｂ）および（ｃ）のホモシステイン補助基質がアデノシンである。
好ましい実施態様においては、前記アデノシンを検出または測定する工程（ｃ）が、アデノシンデアミナーゼ、リン酸、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびキサンチンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を、パーオキシダーゼおよび酸化系発色剤により発色させて検出または測定する工程である。
より好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、さらにウリカーゼを作用させる工程を含む。
他の好ましい実施態様においては、前記工程（ｂ）のホモシステイン変換酵素は、ホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素であり、そして前記工程（ｂ）および（ｃ）のホモシステイン補助基質は、メチル供与体である。
好ましい実施態様においては、前記メチル転移酵素は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼであり、そして前記メチル供与体は、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムである。
より好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記ホモシステイン変換酵素生成物が、Ｄ−メチオニンであり、そして該Ｄ−メチオニンが、Ｄ−アミノ酸変換酵素を作用させることによって測定される。
より好ましい実施態様においては、前記Ｄ−アミノ酸変換酵素がＤ−アミノ酸オキシダーゼである。
好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素が、パーオキシダーゼおよび酸化系発色剤により発色させて検出または測定される。
好ましい実施態様においては、前記ＳＨ試薬がマレイミド誘導体である。
別の好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記生成したオキソ酸および／またはアンモニアに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたは増加するＮＡＤ（Ｐ）の変化を検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを作用させて生成するオキソ酸および／またはアンモニアを検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記工程（ｃ）において、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを作用させて生成するオキソ酸および／またはアンモニアに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたは増加するＮＡＤ（Ｐ）の変化を検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素がロイシン脱水素酵素であり、そして前記生成したオキソ酸に、アンモニアおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加して該ロイシン脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化を検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素が乳酸脱水素酵素であり、そして前記生成したオキソ酸に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加して該乳酸脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化を検出または測定する。
好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素がグルタミン酸脱水素酵素であり、そして前記生成したアンモニアに、２−オキソグルタル酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加して該グルタミン酸脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化を検出または測定する。
より好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素が乳酸脱水素酵素およびグルタミン酸脱水素酵素であり、２−オキソグルタル酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加して該乳酸脱水素酵素およびグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化を検出または測定する。
さらに好ましい実施態様においては、前記工程（ａ）および（ｂ）が同時に行われる。
また、本発明は、チオール化合物、ホモシステイン変換酵素、ホモシステイン補助基質、ＳＨ試薬、および酸化系発色剤を含む、ホモシステイン測定用試薬キットに関する。
好ましい実施態様においては、前記ＳＨ試薬がチオール化合物、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質とは別の容器に含まれる。
好ましい実施態様においては、前記ホモシステイン変換酵素がホモシステイン補助基質とは別の容器に含まれる。
さらに好ましい実施態様においては、前記ホモシステイン変換酵素がＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素であり、そして前記ホモシステイン補助基質がアデノシンである。
さらに好ましい実施態様においては、アデノシンデアミナーゼ、リン酸、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびパーオキシダーゼを含む。
別の好ましい実施態様においては、前記アデノシンデアミナーゼが、チオール化合物、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンとは別の容器に含まれる。
好ましい実施態様においては、さらにウリカーゼが含まれる。
本発明はまた、チオール化合物、ホモシステイン変換酵素、ホモシステイン補助基質、Ｄ−アミノ酸変換酵素を含む、ホモシステイン測定用試薬キットに関する。
好ましい実施態様においては、さらにＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする脱水素酵素およびその補助基質としてアンモニウム塩または２−オキソ酸を含む。
さらに好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素がロイシン脱水素酵素であり、該酵素の補助基質がアンモニウム塩である。
別のさらに好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素がグルタミン酸脱水素酵素であり、該酵素の補助基質が２−オキソグルタル酸である。
好ましい実施態様においては、前記脱水素酵素が乳酸脱水素酵素である。
他の好ましい実施態様においては、前記ホモシステイン変換酵素がホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素であり、そして前記ホモシステイン補助基質がメチル供与体である。
好ましい実施態様においては、前記メチル転移酵素は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼであり、そして前記メチル供与体は、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムである。
好ましい実施態様においては、前記Ｄ−アミノ酸変換酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼである。
好ましい実施態様においては、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが、チオール化合物、およびホモシステインメチルトランスフェラーゼとは別の容器に含まれる。
また、好ましい実施態様においては、前記ＳＨ試薬がマレイミド誘導体である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法は、チオール化合物で還元処理した試料中のホモシステインに、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質を作用させた後、ＳＨ試薬存在下でホモシステイン変換酵素生成物または残存するホモシステイン補助基質を測定することを特徴とする。好ましくは、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを用い、残存するアデノシンをＳＨ試薬の存在下で酸化系発色剤を用いて測定する。より好ましい形態としては、本発明の方法は、被検試料中のホモシステインをチオール化合物処理により還元型に変換すると同時にＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを作用させてＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを生成させる工程（以下第一工程と記す）、およびＳＨ試薬の存在下で、残存するアデノシンを、酸化系発色剤を用いて測定する工程（以下第二工程と記す）を含む。
あるいは、本発明の方法は、試料中のホモシステインに、メチル供与体存在下、メチル転移酵素を作用させた後、生成するＤ−アミノ酸誘導体またはＤ−アミノ酸類似体を測定することも特徴とする。メチル供与体としては、例えば、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、Ｓ−アデノシル−Ｄ−メチオニン、Ｄ−エチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。好ましくは、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを使用することができる。
本発明の測定原理を、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、（Ａ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを用いる場合の測定原理を図１に基づいて、そして（Ｂ）メチル転移酵素およびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いる場合の測定原理を図２に基づいて説明する。
（Ａ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを用いる場合（ＳＡＨａｓｅ法）の測定原理
図１の第一工程においては、還元処理したホモシステインを、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンと反応させる。この工程では、酵素反応の平衡はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを合成する方向に向いており、アデノシンはホモシステインとともに消費される。次いで、第二工程において、残存するアデノシンに、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼなどを作用させて過酸化水素を生じさせ、さらにパーオキシダーゼおよび酸化系発色剤によって発色させて測定する。図からもわかるように、第一工程におけるアデノシンの消費量が、ホモシステインの量に比例する。第二工程の際に、以下に詳述するように、第一工程で使用したＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素の阻害剤として、およびチオール化合物のブロック剤として、ＳＨ試薬を加えることにより、感度よく測定することができる。さらに、第二工程において、ウリカーゼを加えることにより、過酸化水素の発生が増加し、さらに感度のよい測定が可能になる。
ホモシステイン測定においてＳＨ試薬を用いる例は、特表平９−５１２６３４号および米国特許第６０２０２０６号に記載されている。前者は、既に述べたように、ホモシステインを化学的に修飾してその免疫原性を増進させ、これを免疫学的に検出する方法であり、その修飾剤としてＳＨ化合物が挙げられている。後者は、ホモシステインをホモシステインチオラクトンに変換し、チオール基を保護した後、サンプル中に含まれるシステインなどのチオール基を有する他の化合物をＳＨ試薬で除き、その後チオラクトンを開環させ、ホモシステインを測定する方法である。いずれの方法も、本発明の方法とは全く測定原理が異なり、また、ＳＨ試薬の使用目的も全く異なっている。また、遊離脂肪酸測定において、酸化系発色剤による測定への補助基質ＣｏＡの妨害を回避するために、ＳＨ試薬が使用されている例がある（特開昭５５−６４８００号および特開昭５７−８７９７号）が、測定項目が異なっており、本発明の方法においてＳＨ試薬が有効であるかどうかは予測することはできない。
ＳＨ試薬については、生化学辞典（第３版、ｐ．１８２、東京化学同人、１９９８年）にも記載されるとおり、エルマン試薬などの酸化剤、ｐ−メクリル安息香酸などのメルカプト形成剤、ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミドなどのアルキル化剤が挙げられる。好ましくはアルキル化剤を、さらに好ましくはマレイミド化合物を、もっとも好ましくはＮ−エチルマレイミドを使用することができる。
本発明の方法に供される被検試料としては、ホモシステインを含むと考えられる試料であればいずれでもよい。また、ホモシステインの存在様式としては、還元型ホモシステインのみならず、蛋白結合型、ホモシステイン２量体、ホモシステイン−システイン２量体などジスルフィド結合で他の分子に結合した酸化型ホモシステインのいずれでもよい。例えば、血清、血漿、血液、尿、およびそれらの希釈物などが挙げられる。
本発明の方法で用いられるチオール化合物は特に限定されず、例えば、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオエリスリトール、チオグリコール酸などが挙げられる。チオール化合物の濃度は、酸化型ホモシステインを還元型ホモシステインに変換できる範囲であればいずれでもよく、好ましくはチオール基として０．１ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上の濃度であればよい。
チオール化合物による還元工程に続いてまたは同時に、本発明の方法の第一工程として、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質、好ましくはＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを作用させて、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを生成させる。
残存するホモシステイン補助基質の量、好ましくはアデノシンの量は、本発明の方法の測定原理からも明らかなように、測定すべきホモシステインの量に依存する。詳細には、試料として水または緩衝液を用いる反応、すなわち、ホモシステインを含まない反応において、第一工程終了前から第二工程終了時までの吸光度変化が０．０００５から４、好ましくは０．００１から２、さらに好ましくは０．００５から１となるようにアデノシンの量を設定する。
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素は、合成反応とその逆の加水分解反応の両反応を触媒する酵素であり、反応の平衡は合成方向に著しく傾いているが、生体内では生成物がすみやかに代謝されるために加水分解系として働いている（酵素ハンドブック、５２９頁、朝倉書店（１９８２年））。この酵素は、ウサギ、ルピナス種子、ウシ、ラット、酵母、細菌などの様々な起源から分離されており、起源は特に限定されない。遺伝子組換えで得られる酵素も同様に使用できる。用いる濃度は、好ましくは０．０１Ｕ／ｍＬから１００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１Ｕ／ｍＬから２０Ｕ／ｍＬである。
この酵素標品としては、アデノシンデアミナーゼなどのアデノシンに作用する酵素の混入ができるだけ少ないものが望ましい。しかし、商業的に入手可能な標品の中には、わずかであるがアデノシンデアミナーゼの混入が認められるものもある。この場合には、精製して使用することでその影響を回避することができる。もしくは同じ酵素（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素）標品を含む試薬と含まない試薬との反応性の違いを測定することにより混入酵素の影響を回避することができる。
さらに、混入アデノシンデアミナーゼ活性を抑えるために阻害剤を使用することもできる。阻害剤としては、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素に対して強く作用しないものであれば使用可能であるが、以下に述べる第二工程での酵素反応を考慮し、特にアデノシンデアミナーゼ反応の初速度に影響が少ないとされるコホルマイシン、デオキシコホルマイシン、１，６−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチルプリンリボチド（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９：２２３，５３０３−５３０９，１９８０）などが望ましい。阻害剤を使用する場合には、第二工程において過剰量のアデノシンデアミナーゼを使用することが望ましい。
続く第二工程では、ホモシステイン変換酵素生成物または残存するホモシステイン補助基質を測定する。好ましくは、まず、残存するアデノシンをアデノシンデアミナーゼの作用によりイノシンへ変換する。これにより、上記の第一工程におけるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素反応の基質が減少するので、すなわちその逆反応の生成物が減少するので、反応の平衡は加水分解に向かう。この工程においてＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素活性が残存すれば、第一工程の逆反応、すなわちＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解反応も同時に起こり、最終的にはホモシステイン測定感度の低下につながる。そこで、この反応を防ぐためにＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素阻害剤を添加することが望ましい。この酵素の阻害剤としては、ＳＨ試薬（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８０，５１７−５２３，１９７７）およびいくつかのアデノシン誘導体（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １４３，３７７−３８３，１９８７）が知られている。本発明の方法では、他の反応系に大きな支障を及ぼさない限りいずれの阻害剤でも用いることができる。また、これらの阻害剤は組み合わせて使用することもできる。
生成したイノシンは、リン酸、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、および必要に応じてウリカーゼと接触させることにより過酸化水素を発生させて、パーオキシダーゼにより通常の酸化系発色剤を発色させることができる。この方法は、臨床化学の分野では一般的に用いられる既知の方法であるが、第一工程で用いるチオール化合物の還元作用によりその発色が著しく妨害されるため、第二工程では、チオール化合物のブロック剤であるＳＨ試薬の添加が必須となる。したがって、第二工程におけるＳＨ試薬の添加は、第一工程で用いたＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素が第二工程において逆反応（加水分解反応）を触媒することを阻止すると共に、チオール化合物による酸化系発色剤の発色妨害を防止する効果を有する。第二工程におけるＳＨ試薬の濃度は、検体の還元処理に用いたチオール化合物のチオール基を酸化系発色剤による定量が妨害されない程度にブロックできる範囲であればいずれでもよく、好ましくは０．１ｍＭから１００ｍＭの範囲で使用できる。より好ましくは１ｍＭから３０ｍＭで用いられるが、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を阻害する効果も発揮させるために、用いたチオール化合物に比べて過剰量のＳＨ試薬を使用することが望ましい。
酸化系発色剤としては、種々のトリンダー試薬をカップラー試薬と組み合わせて利用できる。この方法はトリンダー法とも呼ばれ、臨床化学分析の分野では一般に用いられており、ここでは詳細に説明しないが、好ましくはカップラー試薬として４−アミノアンチピリンを、トリンダー試薬としてＡＤＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン］、ＤＡＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン］、ＨＤＡＯＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン］、ＭＡＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン」、ＴＯＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン］等が用いられる。また、カップラー試薬を必要としない、Ｏ−トリジン、Ｏ−ジアニシジン、ＤＡ−６７［１０−（カルボシキメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、和光純薬工業（株）製］、ＴＰＭ−ＰＳ［Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウム塩、同仁化学研究所］などのロイコ型発色試薬も同様に用いることができる。特に、ＤＡ−６７、ＴＰＭ−ＰＳは、上記トリンダー試薬と比べてモル吸光係数が大きいため、より感度よく測定することができる。
第二工程におけるイノシン以降の反応中間物質が試料中に含まれている可能性があるので、その測定値への影響を回避することを目的として、第一工程中でプリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびその補助基質であるリン酸、キサンチンオキシダーゼ、ならびに必要に応じてウリカーゼによって過酸化水素を発生させることができる。生じた過酸化水素は第一工程中に含まれる還元剤の作用により消失するが、さらに、カタラーゼを用いて水と酸素に分解させるか、あるいは、パーオキシダーゼを用いてトリンダー試薬またはカップラー試薬の一方と反応させて無色の複合体を生成することが好ましい。
本発明の方法は、これまでに説明したＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を含む試薬のみでもホモシステインの測定は可能であるが、測定の精度をさらに高めるために、この酵素を含まない試薬も同時に測定することにより、試料中に含まれるアデノシンなどの影響を回避することができる。すなわち、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を含まない試薬で測定した値は、あらかじめ試薬に含まれるアデノシンの量と試料に含まれるアデノシンの量との総和（総アデノシン）量を示す。一方、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を含む試薬は、上記の総アデノシン量から第一工程で消費されたアデノシンを差し引いた量を示す。こうして得られた２つの測定値の差は、消費されたアデノシンの量、すなわちホモシステインの量を示す。
（Ｂ）メチル転移酵素およびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いる場合（メチルトランスフェラーゼ法（以下、ＭＴａｓｅ法））の測定原理
次に、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、それぞれ、ホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素およびメチル供与体のＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いる場合、すなわち、試料中のホモシステインに、メチル転移酵素およびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを作用させた後、生成するＤ−メチオニンを測定する場合の測定原理を、図２に基づいて説明する。
（１）ＭＴａｓｅ法Ｉ
メチル転移酵素としては、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムおよびＬ−ホモシステインに作用し、Ｄ−メチオニンおよびＬ−メチオニンの生成を触媒するものであればどのようなものでもよく、例えば、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１０］、５−メチルテトラヒドロ葉酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１３］、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１４］が挙げられる。好ましくは、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１０］が使用される。ホモシステインメチルトランスフェラーゼの系統名は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：Ｌ−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼであり、メチル受容体のＬ−ホモシステインおよびメチル供与体のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを基質とし、Ｌ−メチオニンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを産生する酵素である（酵素ハンドブック、朝倉書店、１９８２年）。また、Ｓ．Ｋ．Ｓｈａｐｉｒｏにより、この酵素は、メチル供与体として、Ｓ−メチル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−メチオニンメチルスルホニウム）、またはＳ−アデノシル−Ｄ−メチオニンも利用することが報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２９，４０５−４０９，１９５８）。
さらに、同報告によれば、放射性同位元素でのラベル実験の結果から、メチオニンは、Ｓ−アデノシルメチオニンのメチル基がホモシステインへ転移することにより生成され、Ｓ−アデノシルメチオニンのリボースと硫黄原子との結合が開裂するためではないことも明らかにされている。したがって、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンをメチル供与体とした場合には、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインが、Ｌ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とした場合には２分子のＬ−メチオニンが、Ｓ−アデノシル−Ｄ−メチオニンをメチル供与体とした場合にはＬ−メチオニンとＳ−アデノシル−Ｄ−ホモシステインが生成する。いずれの場合にも、Ｌ−メチオニンが生成されるため、これを測定することによってもホモシステインの定量は可能である。
しかしながら、一般的に生体試料中のＬ−メチオニンは、ホモシステインに比べて多量（血漿で３〜５倍）に含まれるため、上記測定原理によりホモシステインを定量するためには、あらかじめホモシステインに影響のない方法でＬ−メチオニンを消去し、次いでホモシステインメチルトランスフェラーゼ反応で生成するＬ−メチオニンを特異的に測定する必要があるなど煩雑な操作が必要であり、好ましくない。一方、Ｇ．Ｇｒｕｅ−Ｓｏｒｅｎｓｅｎらによりホモシステインメチルトランスフェラーゼは、特異性は低いもののＤ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とし、Ｄ−メチオニンを生成することが報告されている（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １０９１−７（１９８４））。そこで、この反応を利用し、通常の生体試料中にはほとんど存在しないＤ−メチオニンを生成させ、次にこれを測定することによりホモシステインを特異的に定量する方法を確立した。
使用するホモシステインメチルトランスフェラーゼは、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とするものであればどのような由来のものでも使用できる。例えば、細菌、酵母、ラット等に由来する酵素が使用できる。
Ｄ−メチオニンの定量法は、特に限定されないが、Ｄ−アミノ酸変換酵素を用いて酵素的に測定する方法が好ましい。より好ましくは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ［ＥＣ １．４．３．３］が利用される。本発明者らは、Ｄ−アミノ酸の１つであるＤ−メチオニンメチルスルホニウムが、意外なことにほとんどＤ−アミノ酸オキシダーゼの基質にならないことを明らかにした。このように、Ｄ−アミノ酸変換酵素がＤ−メチオニンメチルスルホニウムには作用しないか、または作用してもＤ−メチオニンに対するよりも反応性が十分に低いものであれば、ホモシステインメチルトランスフェラーゼでの反応後に残存しているＤ−メチオニンメチルスルホニウムを反応系外に除くことなく、生成したＤ−メチオニンを測定することができる。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ以外にも、同様の性質を有するＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３６］、Ｄ−アミノ酸脱水素酵素［ＥＣ １．４．９９．１］なども利用できる（図２）。
図２に示すように、Ｄ−メチオニンにＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させた場合には、過酸化水素が生成するため、これを上述のようにＳＨ試薬の存在下で通常用いられる酸化系発色剤に導き比色定量することができる。また、Ｄ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させた場合には、生成するコエンザイムＡをアシルコエンザイムＡシンセターゼ［ＥＣ ６．２．１．３］およびアシルコエンザイムＡ酸化酵素［ＥＣ １．３．３．６］を用いて過酸化水素に導き、これを同様にして定量することができる。
（２）ＭＴａｓｅ法ＩＩ
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸脱水素酵素を作用させた場合には、アンモニアおよび４−メチルチオ−２−オキソ酪酸が生成する。これらの生成物を測定することによっても定量は可能である。
アンモニアは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）もしくはその誘導体（以下、本明細書ではＮＡＤ（Ｐ）Ｈという）、２−オキソグルタル酸、およびグルタミン酸脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．２］、［ＥＣ １．４．１．３］、または［ＥＣ １．４．１．４］）を作用させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を３４０ｎｍの吸光度変化を測定することによって定量できる。あるいは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰもしくはその誘導体（以下、本明細書では、ＮＡＤ（Ｐ）という）の増加を測定してもよい。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの誘導体としては、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（または３−アセチルピリジンジヌクレオチドリン酸）などが挙げられる。アンモニアの定量には、上記グルタミン酸脱水素酵素以外に、ロイシン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．９］）、アラニン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．１］）、セリン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．７］）、バリン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．８］）、グリシン脱水素酵素（［ＥＣ １．４．１．１０］）など、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とし、アンモニアを利用して還元的アミノ化反応を触媒し得る脱水素酵素であればいずれも利用できる。これらの脱水素酵素の補助基質としては、アンモニウム塩、２−オキソ酸などが用いられ得る。２−オキソ酸としては、上記２−オキソグルタル酸以外に、ピルビン酸、２−オキソ酪酸、２−オキソイソカプロン酸、２−オキソイソ吉草酸、２−オキソ吉草酸、２−オキソカプロン酸、グリオキシル酸、ヒドロキシピルビン酸などが挙げられる。
また、アンモニアは、ネスラー試薬、ｐＨ指示薬、電極法等を利用しても定量可能である。
４−メチルチオ−２−オキソ酪酸は、ＮＡＤＨ、アンモニア、およびロイシン脱水素酵素［ＥＣ １．４．１．９］を作用させ、上記アンモニアの場合と同様に、例えば、ＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍの吸光度変化を測定することによって定量できる。４−メチルチオ−２−オキソ酪酸がロイシン脱水素酵素の基質となることは知られている（Ｇ．Ｌｉｖｅｓｅｙら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６６，２８２−２８８，１９８８）。４−メチルチオ−２−オキソ酪酸の定量には、上記ロイシン脱水素酵素以外に、乳酸脱水素酵素（［ＥＣ １．１．１．２７］）など、４−メチルチオ−２−オキソ酪酸を還元し得る脱水素酵素であればいずれも利用できる。
４−メチルチオ−２−オキソ酪酸またはアンモニアをＮＡＤ（Ｐ）Ｈの３４０ｎｍの吸光度変化によって定量する系に導くための方法は、還元剤の影響を受けにくいことが知られており、そのため、ＳＨ試薬を使用する必要がない（池田ら，臨床検査，４１，９８９−９９３，１９９７）。還元剤の共存下で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ定量系に導いている例としては、血中クレアチンキナーゼ測定法が挙げられる（臨床化学，１９，１８９−２０８，１９９０）。
また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼによってアンモニアまたは４−メチルチオ−２−オキソ酪酸を生成させる測定系においては、生成物の１つである過酸化水素をカタラーゼによって消去して、その影響を除くことも可能である。
本発明の方法は、用手法、自動分析法を問わず適用できる。例えば、２試薬系の汎用自動分析装置を利用する場合は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ反応を進める第一工程とＤ−メチオニンを検出する第二工程とに分けることによって、容易に生体試料中のホモシステインを測定することができる。
本発明の方法によるホモシステイン定量では、試料中のＤ−アミノ酸が正誤差を与えるが、通常の生体試料中のＤ−アミノ酸の量は非常に少ない。しかし、ある種の疾患によりＤ−アミノ酸の量が上昇することも報告されている。したがって、その影響を回避するために、ホモシステインメチルトランスフェラーゼを含まない以外は全く同様に調製した試薬で測定し、その値を同酵素添加検体の測定値から差し引くことによって、正確にホモシステインの量を測定することができる。
また、ＮＡＤＨの吸光度を測定する場合には、まず、試料に還元反応および第二工程のための試薬を加えて反応させ、次いで第一工程のホモシステインメチルトランスフェラーゼを含む試薬を加えて反応させて、それぞれの反応終了時の吸光度の差を求めることによって、Ｄ−アミノ酸など内因性物質の影響を回避したホモシステインの定量が可能である。
また、本発明では、（ａ）ホモシステインを還元するためのチオール化合物、（ｂ）還元型ホモシステインと反応させるため（第一工程）のホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質、ならびに（ｃ）残存するホモシステイン補助基質または生成したホモシステイン変換酵素生成物を測定するため（第二工程）の（ｉ）ＳＨ試薬および酸化系発色剤または（ｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする脱水素酵素および該酵素の特性に応じた補助基質または発色剤を含む、試料中のホモシステインを測定するためのキットが提供される。還元工程と第一工程とを同時に行うために、（ａ）および（ｂ）を一緒に含んでいてもよい。特に、（ｃ）（ｉｉ）を用いる場合は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を一緒に含んでいてもよい。また、上記（Ａ）の場合のように、試料に含まれているイノシン以降の反応中間物質の測定値への影響を回避することを目的として、第一工程用の試薬中に、あらかじめプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リン酸、キサンチンオキシダーゼ、カタラーゼ、ならびに必要に応じてウリカーゼを含んでいてもよい。さらにカタラーゼの代わりに、もしくはそれに加えて、パーオキシダーゼおよびトリンダー試薬またはカップラー試薬の一方を含んでいてもよい。
実施例
（実施例１）ウシ小腸由来アデノシンデアミナーゼおよびイノシン測定系酵素に及ぼすＮ−エチルマレイミドの影響
ＳＨ試薬としてＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を用いる場合の、第二工程への影響を検討した。
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭアデノシン、０．４Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（東洋紡績（株）製）、３Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ（東洋紡績（株）製）、１１Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ（東洋紡績（株）製）、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、および１ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）を混合し、３７℃で５分間インキュベーションした。次いで、０．００１Ｕ／ｍＬ小腸由来アデノシンデアミナーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）を添加し、５４０ｎｍの吸光度変化を分光光度計（（株）島津製作所製ＵＶ−２２００型）を用いて測定した。直線的に変化する部分の吸光度は、１分間あたり０．０６７６であった。続いて、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドを添加した後に同様に測定したところ、１分間あたりの吸光度変化は０．０６５６であった。したがって、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）は、ウシ小腸由来アデノシンデアミナーゼおよびイノシン測定系にほとんど影響しないことが明らかになった。
（実施例２）ウシ膵由来アデノシンデアミナーゼに及ぼすＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の影響
ウシ小腸由来アデノシンデアミナーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）の代わりにウシ膵由来アデノシンデアミナーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）を用いる以外は、実施例１と同様に行った。その結果、Ｎ−エチルマレイミド添加前の１分間の吸光度変化が０．０７５１に対し、添加後は０．０７２１であり、Ｎ−エチルマレイミドは、ウシ膵由来アデノシンデアミナーゼに対してもほとんど影響しないことが明らかになった。
（実施例３）酸化系発色剤を用いたホモシステイン測定系における還元剤による発色妨害およびＳＨ試薬によるその防止
測定は日立７１７０自動分析装置（（株）日立製作所製）を用いて、反応温度３７℃、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで実施した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．００９ｍＭアデノシン、０．８Ｕ／ｍＬ Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素、１．５Ｕ／ｍＬウリカーゼ、４．３Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ、６．４Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、２．９ｍＭ ４−アミノアンチピリン、２．３ｍＭジチオスレイトール、および０．２％トリトンＸ−１００を含む試薬１を１８０μＬ添加し、約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．３Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼ、１．３Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、１．８ｍＭ ＴＯＯＳ、１７ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、および０．１％トリトンＸ−１００を含む試薬２を１８０μＬ添加して、さらに約５分間反応させた。これと並行して、試薬２にＮ−エチルマレイミドを含まない以外は全く同様の操作を実施し、両者の反応過程を比較した。結果を図３に示す。
図３からも明らかなように、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）が存在しない状態では発色は著しく妨害され、測定は全く不可能であることがわかる（○）。一方、ＳＨ試薬であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）が共存する場合には、その影響を受けることなく発色した（●）。
（実施例４）ホモシスチン標品を試料とした場合の用量依存性
測定は上記日立７１７０自動分析装置を用いて、反応温度３７℃、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで実施した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）および０、１５．６２５、３１．２５、６２．５、および１２５μＭホモシスチン（ホモシステインとして０〜２５０μＭ）を含む試料２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．７Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、２．７Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ、１０Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、０．００９ｍＭアデノシン、１．８ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１．８ｍＭジチオスレイトール、０．４Ｕ／ｍＬ Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素、および０．５％トリトンＸ−１００を含む試薬１を１８０μＬ添加し、約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭ ＴＯＯＳ、６ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、および０．２Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼを含む試薬２を１８０μＬ添加し、さらに約５分間反応させた。日立７１７０の測定ポイント１６から３４の吸光度変化を求めた。その結果を図４に示す。図４から明らかなようにホモシステイン濃度が１２５μＭまで吸光度変化量と直線関係が認められ、ホモシステインの測定が可能であることがわかった。
（実施例５）血清試料中のホモシステイン測定（ＳＡＨａｓｅ法）
測定は、日立７１７０自動分析装置を用いて、反応温度３７℃、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ、３試薬系で実施した。正常コントロール血清セラクリアＨＥにホモシスチンを０、２．５、５、１０、２０、３０、４０、および５０μＭ（ホモシステイン換算値０〜１００μＭ）添加した試料２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、７ｍＭジチオスレイトール、０．０２８ｍＭアデノシン、および０．３％トリトンＸ−１００を含む試薬１を５０μＬ添加した。続いて約８０秒後に、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２Ｕ／ｍＬウリカーゼ、１．６Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、５．９Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ、２２Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、４ｍＭ ４−アミノアンチピリン、０．５ｍＭジチオスレイトール、１．１Ｕ／ｍＬ Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素、および０．１％トリトンＸ−１００を含む試薬２を１３０μＬ添加し、約８分間反応させ、アデノシルホモシステインを生成させるとともに、試料に含まれているイノシン以降の反応中間物質の測定値へ影響を回避した。さらに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１．８ｍＭ ＴＯＯＳ、１７ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、０．２３Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼ、および０．１％トリトンＸ−１００を含む試薬３を１８０μＬ添加し、さらに約５分間反応させた。試薬３添加直前（日立７１７０測定ポイント３３）と添加約５分後（日立７１７０測定ポイント５０）との吸光度を測定し、その変化量を求めた。
これと同時に、検体ブランクを測定した。Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素（以下、ＳＡＨａｓｅということがある）が添加された試薬２（以下、ＳＡＨａｓｅ添加試薬という）の代わりに、試薬２からＳＡＨａｓｅを除いた試薬（以下、ＳＡＨ無添加試薬という）を用いること以外は、同じ操作を行った。すでに述べた通り、ＳＡＨａｓｅ標品中にはアデノシンデアミナーゼがわずかに混在するために、その影響を回避する必要がある。そこで、同時に、試料として１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いることにより、ＳＡＨａｓｅ添加試薬のブランクおよびＳＡＨａｓｅ無添加試薬のブランクをそれぞれ測定し、その比を混在するアデノシンデアミナーゼの影響に対する補正係数とした。
図５に、ＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値、ＳＡＨａｓｅ添加試薬での実測値に補正係数を乗じることにより補正した値（以下、ＳＡＨａｓｅ添加試薬の補正値）、およびＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値からＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値を差し引いた値をホモシステイン添加量に対してプロットした結果を示す。ＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値はホモシステインの添加量に関係なく一定の値を示す（Ａ：○）のに対し、ＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値は、ホモシステインの添加量に依存して減少する（Ｂ：●）。従って、ＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値からＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値を差し引いた値はホモシステイン添加量に依存することがわかる（Ａ−Ｂ：▲）。一方、試料として３１．２５μＭホモシスチン（ホモシステイン換算値６２．５μＭ）を含むリン酸緩衝液を用い、試薬２としてＳＡＨａｓｅ添加試薬およびＳＡＨａｓｅ無添加試薬をそれぞれ用いて同様にして測定した後補正し、ＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値からＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値を差し引いた値（吸光度差）を求め、吸光度差あたりのホモシステイン量を表すファクターを算出した。上記血清ベースの試料のＳＡＨａｓｅ無添加試薬での実測値からＳＡＨａｓｅ添加試薬での補正値を差し引いた値（図５のＡ−Ｂ：▲）にファクターを乗じて各試料中のホモシステイン量を算出し、ホモシステイン添加量に対してプロットした結果を図６に示す（●）。
図６から明らかなように、試料中に含まれているイノシン以降の反応中間物質および内因性アデノシンなどの測定値への影響を回避して、血清ベースの試料においても約８０μＭまで血清総ホモシステインの測定が可能であることがわかった。
（実施例６）ホモシステイン測定系（ＳＡＨａｓｅ法）に及ぼすシステインおよびメチオニンの影響
ホモシスチンを２７μＭ（ホモシステイン換算 ５４μＭ）添加した正常コントロール血清セラクリアＨＥ、ならびにこれにメチオニンおよびシステインを同時にそれぞれ５００および１０００μＭ添加した試料を用いること以外は、実施例５と同様に測定した。図７に示すように、ホモシステインの測定において１０００μＭまではシステインおよびメチオニンの影響を認めずに正確に測定できることが明らかである。
（実施例７）本発明の方法（ＳＡＨａｓｅ法）による測定と従来のＨＰＬＣ法による測定との相関性の検討
血清試料５３サンプルについて、ＳＡＨａｓｅ法によってホモシステインを測定した。スタンダードとして、５２．３μＭホモシステインを含むコントロール血清セラクリアＨＥ、発色試薬としてＤＡ−６７、測定波長として主波長６６０ｎｍ、副波長７５０ｎｍを用いて測定する以外は、実施例５の方法に準じて行った。すなわち、まず、血清試料１０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、７ｍＭ ＤＴＴ、０．０１５ｍＭアデノシンおよび０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬１を５０μＬ添加した。続いて、約８０秒後に、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２Ｕ／ｍＬウリカーゼ、１．６Ｕ／ｍＬプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、６Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ、１５０Ｕ／ｍＬカタラーゼ、０．８４ｍＭ ＤＡ−６７、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１．１Ｕ／ｍＬ ＳＡＨａｓｅ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬２を、１３０μＬ添加し、約８分間反応させた。さらに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１１Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、１７ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、０．２３Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬３を、１８０μＬ添加し、さらに約５分間反応させた。測定ポイントおよびキャリブレーションは、実施例５の方法と同様に行った。
一方、同試料のホモシステイン測定を、ＨＰＬＣ法でも実施した（（株）ＳＲＬ委託）。
横軸にＨＰＬＣ法による測定値を、縦軸に本発明の方法（ＳＡＨａｓｅ法）による測定値をプロットした結果を、図８に示す。図８から明らかなように、非常に良好な相関関係が得られ、試料中のホモシステインが本発明の方法により正確に測定できることがわかる。
（実施例８）ホモシステインメチルトランスフェラーゼの調製
Ｓ．Ｋ．Ｓｈａｐｉｒｏの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７ Ｐｔ．Ｂ，４００−４０５，１９７１）を一部改変して、以下のようにホモシステインメチルトランスフェラーゼ酵素液を調製した。
まず、２５０ｇのパン酵母（オリエンタル酵母製）を１２５ｍｌの蒸留水に懸濁し、３７℃まで加温後、撹拌しながら１６．３ｇの炭酸水素ナトリウムおよび４４ｍｌのトルエンを添加した。３７℃で撹拌を続けながら９０分間インキュベートした後、同容量の氷冷した蒸留水を添加して急冷した。この溶液を７０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清をペーパータオルで濾過し、濾液をさらに９０００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、上清を回収した。
次に、氷冷下で撹拌しながら最終濃度が０．５％となるようにＬ−メチオニンを添加し、そのまま約６０分間かけて溶解させた。液温を３℃以下に保持し、撹拌しながら、約−２０℃に冷却したエタノールを２０ｍＬ／分の速度で添加した。エタノールの濃度が約２５％に達した時点で、食塩−氷を用いて冷却槽を−１０℃以下として冷却を開始した。続いて最終濃度が５３％になるまで同様にエタノールを添加後、−２０℃で１６時間静置した。９０００ｒｐｍ、−１０℃で６０分間遠心分離した。上清を回収し、食塩−氷で−１０℃以下に冷却しながら、最終濃度７０％まで同じ条件でエタノールを添加した。添加後、１時間静置し、９０００ｒｐｍ、−１０℃で９０分間遠心分離した。
得られた沈澱を約７ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した。溶解液を同じ緩衝液に対して２回透析した後、遠心濃縮器（セントリプレップ−１０、アミコン製）で約１．５ｍＬに濃縮し、酵素液とした。
次に、得られた酵素液のホモシステインメチルトランスフェラーゼ酵素活性を以下のように測定した。６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０％酵素液、１ｍＭジチオスレイトール、０．２ｍＭホモシスチン（シグマ−アルドリッチ製、Ｈ−６０１０）、および０．４ｍＭヨウ化Ｌ−メチオニンメチルスルホニウム（アクロス製、２７７９４−０２５０）または臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム（アクロス製、２９９３９−００１０）を混合し、３７℃で２時間反応させた。薄層板（薄層クロマトグラフィー用プレート）に約８μＬずつスポットし、９５％エタノール−２８％アンモニア水（７７：２３、ｖ／ｖ）で展開後、ニンヒドリン発色させた。その結果、Ｌ−メチオニンメチルスルホニウムまたはＤ−メチオニンメチルスルホニウムのいずれを基質とした場合も、反応生成物にはメチオニンが含まれることを確認した。一方、メチル受容体であるホモシステインを反応系から除いた場合には、メチオニンは生成されないことを確認した。
以上から、得られた酵素液は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ活性を有すること、およびこの酵素液は、Ｌ−メチオニンメチルスルホニウムのみならず、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをもメチル供与体として利用し得ることを確認した。
（実施例９）Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応性
Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応性を、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように測定した。１．３ｍＭ Ｄ−メチオニンを含む試料１０μＬに、９２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１．３ｍＭ ４−アミノアンチピリン、および３．３Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼを含む試薬１を２００μＬ添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、６９ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５．２ｍＭ ＴＯＯＳ、２．６Ｕ／ｍＬブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）、および２．６ｍＭフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を含む試薬２を５０μＬ添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。吸光度変化を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。また、１．３ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを含む試料ならびにＤ−メチオニンおよび臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをそれぞれ１．３ｍＭ含む試料を全く同様に測定した。反応のタイムコースを、図９に示す。ブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ−メチオニン（●）に比較してＤ−メチオニンメチルスルホニウム（△）とはほとんど反応しなかった。また、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム存在下においても、Ｄ−メチオニンとの反応性が変わらないことも分かった（▲）。
（実施例１０）Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するカビ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応性
ブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの代わりにカビ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（フサリウム属、池田糖化工業製）を用いること以外は、実施例９と全く同様に行った。反応のタイムコースを、図１０に示す。カビ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼについても、Ｄ−メチオニン（●）に比較してＤ−メチオニンメチルスルホニウム（△）とはほとんど反応しないことが明らかとなった。また、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム存在下においても、Ｄ−メチオニンとの反応性が変わらないことも分かった（▲）。
（実施例１１）還元剤共存下で酸化系発色剤を用いるＤ−メチオニン測定系におけるＮ−エチルマレイミドの効果
次いで、Ｄ−メチオニン測定を、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように行った。すなわち、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する０、０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、および１ｍＭのＤ−メチオニン２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＴＯＯＳ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬１を２００μＬ添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、４ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、１７．６Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、１ｍＭ ＦＡＤ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬２を５０μＬ添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ）変化を測定した。次に、試薬１に２．８ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を添加する以外は全く同様に試薬を調製して、ＮＥＭ添加の場合について同様に測定した。
図１１に示すように、ＮＥＭ無添加試薬で測定した場合（○）には、試料中に含まれるジチオスレイトールのため、Ｄ−メチオニンが全く測定されなかったが、ＮＥＭ添加試薬で測定した場合（●）は、直線的な用量依存性が認められ、Ｄ−メチオニンを測定することができることが分かった。
（実施例１２）本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）におけるホモシステイン標品での用量依存性の検討
０、１００、および２００μＭホモシスチン（ホモシステイン換算値０、２００および４００μＭ）、８６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０％酵素液、４ｍＭジチオスレイトール、および１．５ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを、３７℃で９０分間反応させた。
反応液中のＤ−メチオニン量の測定を、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように実施した。検体（反応液）３０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＴＯＯＳ、および１．７ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含む試薬１を２００μＬ添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、４ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、１７．６Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、および０．２ｍＭ ＦＡＤを含む試薬２を５０μＬ添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ）変化を測定した。その結果を、横軸をホモシスチン濃度、縦軸を吸光度変化（×１００００）として図１２に示した。
図１２から明らかなように、ホモシスチンの用量依存的に吸光度変化の増大が認められた（●）。一方、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを添加しない場合（△）および酵素を添加しない場合（□）には、用量依存性は観察できなかった。
（実施例１３）本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）における血清ホモシステインの用量依存性の検討
正常コントロール血清セラクリアＨＥ（アズウェル社）にホモシスチンを０、１０、２０、３０、４０、および５０μＭ（ホモシステイン換算値０〜１００μＭ）添加した試料１００μＬに、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、３０％酵素液、１５ｍＭジチオスレイトール、および３ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを含む処理液５０μＬを添加して混合し、３７℃で９０分間反応させた。
反応液中のＤ−メチオニン量の測定を、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように実施した。検体（反応液）２０μＬに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＴＯＯＳ、２．８ｍＭ ＮＥＭおよび０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬１を２００μＬ添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、４ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、１７．６Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、１ｍＭ ＦＡＤ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む試薬２を５０μＬ添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ）変化を求めた。その結果を、横軸を添加ホモシスチン濃度、縦軸を各検体の吸光度変化（×１００００）からホモシスチン無添加検体の吸光度変化（×１００００）を差し引いた値として図１３に示した。
図１３から明らかなように、血清検体においてもホモシスチン添加量に対して用量依存性が認められた（●）。一方、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムを添加しない場合（○）には、このような用量依存性は観察されなかった。以上の結果から、検体中のホモシステインの定量が可能であることが明らかである。
（実施例１４）高感度発色剤による測定
Ｄ−メチオニン定量のための発色剤をＴＯＯＳ、４−アミノアンチピリン系から、高感度発色剤であるＴＰＭ−ＰＳに変更する以外は、実施例１３と全く同様に行った。すなわち、Ｄ−メチオニン定量試薬の試薬１からＴＯＯＳを除き、そして試薬２から４−アミノアンチピリンを除いて代わりにＴＭＰ−ＰＳを２ｍＭ添加したものを測定に用いた。図１４に示すように、ＴＭＰ−ＰＳを用いた方が、ＴＯＯＳ、４−アミノアンチピリン系に比べて高感度で測定することが可能であることが分かった。
（実施例１５）本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）による測定と従来のＨＰＬＣ法による測定との相関性の検討
血清試料３５サンプルについて、ＭＴａｓｅ法によってホモシステインを測定した。試薬ブランクとして生理食塩水を、スタンダードとして５０μＭホモシステインを含む生理食塩水を用いた。試料１００μＬに、９．６Ｕ／Ｌホモシステインメチルトランスフェラーゼ、１５ｍＭ ＤＴＴ、１．５ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、および０．５ｍＭ臭化亜鉛を含む３５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０μＬを添加し、３７℃で９０分間反応させた。なお、ホモシステインメチルトランスフェラーゼの１Ｕは、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とし、ホモシステインをメチル受容体として用いたとき、１分間あたり１μｍｏｌのＤ−メチオニン合成を触媒する酵素量である。同じ試料について、ホモシステインメチルメチルトランスフェラーゼを含まない試薬で同様に反応させた。次に、１８ｍＭ ＮＥＭを含む反応停止液１５０μＬを加えた。反応液中のＤ−メチオニン量の測定は、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のように実施した。反応液３０μＬに、０．４８ｍＭ ＴＯＯＳを含む９６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０μＬを添加し、３７℃で約５分間反応させた。続いて、０．７ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１．４Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、４．４Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、および１ｍＭ ＦＡＤを含む９０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μＬを添加し、さらに３７℃で約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍ）変化を求めた。ホモシステインメチルトランスフェラーゼ添加試薬での吸光度変化から同酵素無添加試薬での吸光度変化（サンプルブランク）を差し引いた値を用いて試料中のホモシステイン量を算出した。
一方、同試料のホモシステイン測定を、ＨＰＬＣ法でも実施した（（株）ＳＲＬ委託）。
横軸にＨＰＬＣ法による測定値を、縦軸に本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）による測定値をプロットした結果を、図１５に示す。図１５から明らかなように、非常に良好な相関関係が得られ、試料中のホモシステインが本発明の方法により正確に測定できることがわかる。
（実施例１６）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびロイシン脱水素酵素を用いたＤ−メチオニン測定系における用量依存性の確認および還元剤ＤＴＴの影響
日立７１７０自動分析装置を用いて、Ｄ−メチオニンを以下のように測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に０、２５、５０、１００、２００、および４００μＭのＤ−メチオニンを含む試料３０μＬに、５０ｍＭ ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸；同仁化学研究所製）（ｐＨ８．５）、９９０ｍＭ塩化アンモニウム（ナカライ製）、３．４Ｕ／ｍＬロイシン脱水素酵素（和光純薬製）、３２Ｕ／ｍＬカタラーゼ（ロシュ製）、および０．１６ｍＭ ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母製）を含む試薬１を１８０μＬ添加し、３７℃にて約５分間反応させた。続いて、５０ｍＭ ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）、９９０ｍＭ塩化アンモニウム、５Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ブタ腎臓由来、キッコーマン製）、および０．１ｍｇ／ｍＬ ＦＡＤを含む試薬２を４０μＬ添加し、さらに３７℃にて約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４におけるＮＡＤＨの吸光度（主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍ）の変化を測定した。次に、試薬１に、１０ｍＭ ＤＴＴを添加する以外は、全く同様に試薬を調製して、ＤＴＴ添加の場合について同様に測定した。
結果を図１６に示す。横軸は添加Ｄ−メチオニン濃度を、縦軸は３４０ｎｍ（副波長４０５ｎｍ）における吸光度の変化量を示す。
図１６に示すように、ＤＴＴを含まない場合（△）、この測定系において添加Ｄ−メチオニン量に対して直線的な用量依存的な吸光度変化が認められ、Ｄ−メチオニンが定量できることがわかった。また、ＤＴＴを含む場合（○）においても、Ｄ−メチオニンの測定には、ＤＴＴが影響しないことも確認された。
（実施例１７）ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびロイシン脱水素酵素を用いたホモシステイン測定系（ＭＴａｓｅ法ＩＩ）における用量依存性の確認
日立７１７０自動分析装置を用いて、ホモシステインを以下のように測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に０、１２．５、２５、５０、および１００μＭのホモシスチン（ホモシステイン換算値：０、２５、５０、１００、および２００μＭ）を含む試料３０μＬに、５０ｍＭ ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）、９９０ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／ｍＬホモシステインメチルトランスフェラーゼ（酵母由来、大関株式会社より入手）、０．６ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、５Ｕ／ｍＬロイシン脱水素酵素（和光純薬製）、３２Ｕ／ｍＬカタラーゼ、および０．１６ｍＭ ＮＡＤＨを含む試薬１を１８０μＬ添加し、３７℃にて約５分間反応させた。続いて、５０ｍＭ ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）、９９０ｍＭ塩化アンモニウム、７．５Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン製）、および０．１ｍｇ／ｍＬ ＦＡＤを含む試薬２を４０μＬ添加し、さらに３７℃にて約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４におけるＮＡＤＨの吸光度（主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍ）の変化を測定した。次に、試料として正常コントロール血清セラクリアＨＥにホモシスチンを０、１２．５、２５、５０、および１００μＭ添加したものを使用する以外は、上記と全く同様に測定した。
結果を図１７に示す。横軸は添加ホモシステイン濃度を、縦軸は３４０ｎｍ（副波長４０５ｎｍ）における吸光度の変化量を示す。
図１７に示すように、ホモシステイン標品（●）および血清検体（▲）のいずれにおいても、ホモシステイン添加量に対して用量依存的な吸光度変化が認められ、この測定系においてもホモシステイン定量が可能であることが明らかとなった。
（実施例１８）ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびグルタミン酸脱水素酵素を用いたホモシステイン測定系（ＭＴａｓｅ法ＩＩ）における用量依存性の確認
日立７１７０自動分析装置を用いて、ホモシステインを以下のように測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に０、１２．５、２５、５０、および１００μＭのホモシスチン（ホモシステイン換算値：０、２５、５０、１００、および２００μＭ）を含む試料３０μＬに、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．６ｍＭ臭化Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、２Ｕ／ｍＬ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン製）、０．０３ｍｇ／ｍＬ ＦＡＤ、３２Ｕ／ｍＬカタラーゼ、８Ｕ／ｍＬグルタミン酸脱水素酵素（東洋紡績製）、８ｍＭ ２−オキソグルタル酸（ナカライ製）、および０．１６ｍＭ ＮＡＤＨを含む試薬１を１８０μＬ添加し、３７℃にて約５分間反応させた。続いて、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）および２．１Ｕ／ｍＬホモシステインメチルトランスフェラーゼ（酵母由来、大関株式会社より入手）を含む試薬２を４０μＬ添加し、さらに３７℃にて約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４におけるＮＡＤＨの吸光度（主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍ）の変化を測定した。次に、試料として正常コントロール血清セラクリアＨＥにホモシスチンを０、１２．５、２５、５０、および１００μＭ添加したものを使用する以外は、上記と全く同様に測定した。
結果を図１８に示す。横軸は添加ホモシステイン濃度を、縦軸は３４０ｎｍ（副波長４０５ｎｍ）における吸光度の変化量を示す。
図１８に示すように、ホモシステイン標品（●）および血清検体（▲）のいずれにおいても、ホモシステイン添加量に対して用量依存的な吸光度変化が認められ、この測定系においてもホモシステイン定量が可能であることが明らかとなった。
（実施例１９）乳酸脱水素酵素による４−メチルチオ−２−オキソ酪酸の定量性の確認
日立７１７０自動分析装置を用いて、４−メチルチオ−２−オキソ酪酸を以下のように測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に０、５０、１００、２００、および４００μＭの４−メチルチオ−２−オキソ酪酸（アルドリッチ製）を含む試料３０μＬに、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）および０．１６ｍＭ ＮＡＤＨを含む試薬１を１８０μＬ添加し、３７℃にて約５分間反応させた。続いて、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）および６５Ｕ／ｍＬ乳酸脱水素酵素（ブタ心臓由来、オリエンタル酵母製）を含む試薬２を４０μＬ添加し、さらに３７℃にて約５分間反応させた。測定ポイント１６から３４におけるＮＡＤＨの吸光度（主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍ）の変化を測定した。
結果を図１９に示す。横軸は４−メチルチオ−２−オキソ酪酸濃度を、縦軸は３４０ｎｍ（副波長４０５ｎｍ）における吸光度の変化量を示す。
図１９に示すように、４−メチルチオ−２−オキソ酪酸量に対して用量依存的な吸光度変化が認められ、乳酸脱水素酵素が４−メチルチオ−２−オキソ酪酸を基質とすることが明らかとなり、実施例１７および１８のロイシン脱水素酵素およびグルタミン酸脱水素酵素の代わりに乳酸脱水素酵素を用いる測定系においても、ホモシステイン定量が可能であることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明によって、生体試料、特に血液、尿などの体液中のホモシステインを、迅速かつ簡便に、感度よく検出および定量することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
図１は、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素およびアデノシンを用いる場合の反応概略図である。
図２は、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質として、ホモシステイントランスフェラーゼおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いる場合の反応概略図である。
図３は、酸化系発色剤を用いたホモシステイン測定系における発色のＳＨ試薬添加による効果を示すグラフである。
図４は、ホモシスチン標品を試料とした場合の用量依存性を示すグラフである。
図５は、血清試料中のホモシステイン測定において、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素添加試薬および無添加試薬の場合の吸光度を示すグラフである。
図６は、血清試料中のホモシステインを測定した結果を示すグラフである。
図７は、ホモシステイン測定系に及ぼすシステインおよびメチオニンの影響を示すグラフである。
図８は、本発明の方法（ＳＡＨａｓｅ法）および従来のＨＰＬＣ法による血清試料中のホモシステインの測定値の相関性を示すグラフである。
図９は、Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するブタ腎臓由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応タイムコースを示すグラフである。
図１０は、Ｄ−メチオニンおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムに対するカビ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応タイムコースを示すグラフである。
図１１は、還元剤存在下で酸化系発色剤を用いるＤ−メチオニン測定系におけるＳＨ試薬の効果を示すグラフである。
図１２は、ホモシスチン標品を試料とした場合の用量依存性を示すグラフである。
図１３は、血清試料中のホモシステイン測定において、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム添加および無添加の場合の吸光度を示すグラフである。
図１４は、血清試料中のホモシステインを高感度発色剤によって測定した結果を示すグラフである。
図１５は、本発明の方法（ＭＴａｓｅ法Ｉ）および従来のＨＰＬＣ法による血清試料中のホモシステインの測定値の相関性を示すグラフである。
図１６は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびロイシン脱水素酵素を用いたＤ−メチオニン測定系における用量依存性を示すグラフである。
図１７は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびロイシン脱水素酵素を用いたホモシステイン測定系（本発明の方法：ＭＴａｓｅ法ＩＩ）における用量依存性を示すグラフである。
図１８は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびグルタミン脱水素酵素を用いたホモシステイン測定系（本発明の方法：ＭＴａｓｅ法ＩＩ）における用量依存性を示すグラフである。
図１９は、乳酸脱水素酵素を用いた４−メチルチオ−２−オキソ酪酸測定系における用量依存性を示すグラフである。
Claims (13)
- 試料中のホモシステインを検出または測定するための方法であって、
（ａ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程、
（ｂ）還元されたホモシステインに、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質を作用させ、ホモシステイン変換酵素生成物を生じさせる工程、および
（ｃ）残存するホモシステイン補助基質、生成したホモシステイン変換酵素生成物またはそれらの酵素反応生成物を、（ｉ）ＳＨ試薬の存在下で酸化して過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させることによって、検出または測定する工程、
を含み、
該工程（ｂ）のホモシステイン変換酵素が、S-アデノシル-L-ホモシステイン加水分解酵素であり、そして該工程（ｂ）および（ｃ）のホモシステイン補助基質がアデノシンである、方法。 - 前記アデノシンを検出または測定する工程（ｃ）が、アデノシンデアミナーゼ、リン酸、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびキサンチンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を、パーオキシダーゼおよび酸化系発色剤により発色させて検出または測定する工程である、請求項１に記載の方法。
- 試料中のホモシステインを検出または測定するための方法であって、
（ａ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程、
（ｂ）還元されたホモシステインに、ホモシステイン変換酵素およびホモシステイン補助基質を作用させ、ホモシステイン変換酵素生成物を生じさせる工程、および
（ｃ）残存するホモシステイン補助基質、生成したホモシステイン変換酵素生成物またはそれらの酵素反応生成物を、（ｉｉ）D-アミノ酸変換酵素を作用させてオキソ酸および／またはアンモニアを生成させ、生成したオキソ酸および／またはアンモニアを検出または測定することによって、検出または測定する工程、
を含み、
該工程（ｂ）のホモシステイン変換酵素が、ホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素であり、そして該工程（ｂ）および（ｃ）のホモシステイン補助基質がメチル供与体である、方法。 - 前記メチル転移酵素が、ホモシステインメチルトランスフェラーゼであり、そして前記メチル供与体が、D-メチオニンメチルスルホニウムである、請求項３に記載の方法。
- 前記D-アミノ酸変換酵素がD-アミノ酸オキシダーゼである、請求項３または４に記載の方法。
- 前記工程（ｃ）において、前記生成した過酸化水素を、パーオキシダーゼおよび酸化系発色剤により発色させて検出または測定する、請求項３から５のいずれかに記載の方法。
- 前記工程（ｃ）において、前記生成したオキソ酸および／またはアンモニアに、NAD(P)Hを補酵素とする脱水素酵素を作用させ、減少するNAD(P)Hまたは増加するNAD(P)の変化を検出または測定する、請求項３から５のいずれかに記載の方法。
- チオール化合物、ホモシステイン変換酵素、ホモシステイン補助基質、ＳＨ試薬、および酸化系発色剤を含み、該ホモシステイン変換酵素がS-アデノシル-L-ホモシステイン加水分解酵素であり、そして該ホモシステイン補助基質がアデノシンである、ホモシステイン測定用試薬キット。
- さらに、アデノシンデアミナーゼ、リン酸、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびパーオキシダーゼを含む、請求項８に記載のキット。
- チオール化合物、ホモシステイン変換酵素、ホモシステイン補助基質、D-アミノ酸変換酵素を含み、該ホモシステイン変換酵素がホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素であり、そして該ホモシステイン補助基質がメチル供与体である、ホモシステイン測定用試薬キット。
- さらに、NAD(P)H、およびNAD(P)Hを補酵素とする脱水素酵素およびその補助基質としてアンモニウム塩または2-オキソ酸を含む、請求項１０に記載のキット。
- 前記メチル転移酵素が、ホモシステインメチルトランスフェラーゼであり、そして前記メチル供与体が、D-メチオニンメチルスルホニウムである、請求項１０または１１に記載のキット。
- 前記D-アミノ酸変換酵素がD-アミノ酸オキシダーゼである、請求項１０から１２のいずれかの項に記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002507046A JP4807920B2 (ja) | 2000-06-30 | 2001-06-29 | 総ホモシステイン測定方法 |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000198094 | 2000-06-30 | ||
| JP2000198094 | 2000-06-30 | ||
| JP2000280713 | 2000-09-14 | ||
| JP2000280713 | 2000-09-14 | ||
| PCT/JP2001/005679 WO2002002802A1 (fr) | 2000-06-30 | 2001-06-29 | Procede de mesure d'homocysteine totale |
| JP2002507046A JP4807920B2 (ja) | 2000-06-30 | 2001-06-29 | 総ホモシステイン測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP4807920B2 true JP4807920B2 (ja) | 2011-11-02 |
Family
ID=26595085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002507046A Expired - Fee Related JP4807920B2 (ja) | 2000-06-30 | 2001-06-29 | 総ホモシステイン測定方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6686172B2 (ja) |
| EP (2) | EP1849875B1 (ja) |
| JP (1) | JP4807920B2 (ja) |
| AT (2) | ATE377655T1 (ja) |
| DE (2) | DE60136665D1 (ja) |
| ES (1) | ES2295174T3 (ja) |
| WO (1) | WO2002002802A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0008784D0 (en) * | 2000-04-10 | 2000-05-31 | Axis Shield Plc | Assay |
| JP2004535066A (ja) | 2001-05-18 | 2004-11-18 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | ナノスケールワイヤ及び関連デバイス |
| WO2003044220A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-05-30 | Anticancer, Inc. | Total cysteine assay |
| JP2006149203A (ja) * | 2003-02-19 | 2006-06-15 | Alfresa Pharma Corp | ホモシステインの測定方法 |
| US7097968B2 (en) * | 2003-07-10 | 2006-08-29 | General Atomics | Methods and compositions for assaying homocysteine |
| US8476034B2 (en) | 2003-07-10 | 2013-07-02 | General Atomics | Methods and compositions for assaying homocysteine |
| US9216209B1 (en) | 2011-06-06 | 2015-12-22 | Kilmer S. McCully | Compositions and method for utilization of thioretinamide in therapy of degenerative diseases of aging |
| CN103954774B (zh) * | 2014-05-09 | 2016-02-03 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒 |
| US10705093B2 (en) * | 2014-07-25 | 2020-07-07 | Bloodworks | Determination of small-molecule thiols and disulfides: protein bound cys and total cysteine as biomarkers of oxidative stress |
| CN110938580A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-31 | 江南大学 | 一种提高d-酪氨酸生产效率的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08506478A (ja) * | 1992-01-22 | 1996-07-16 | アクシス バイオケミカルズ エイエス | ホモシステインアッセイ |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5564800A (en) | 1978-11-06 | 1980-05-15 | Nippon Shoji Kk | Method and reagent for determination of acyl coenzyme a |
| JPS578797A (en) | 1981-03-24 | 1982-01-18 | Nippon Shoji Kk | Method and reagent for quantitative determination of free fatty acid |
| US5478729A (en) | 1994-04-28 | 1995-12-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Immunoassay for homocysteine |
| GB9617683D0 (en) | 1996-08-23 | 1996-10-02 | Univ Glasgow | Homocysteine desulphurase |
| JPH10114797A (ja) | 1996-10-09 | 1998-05-06 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | ヒト血清アルブミン結合型ホモシステインの検出法 |
| WO1998059242A1 (en) | 1997-06-23 | 1998-12-30 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Homocysteine assay |
| US5985540A (en) | 1997-07-24 | 1999-11-16 | Anticancer, Inc. | High specificity homocysteine assays for biological samples |
| US5885767A (en) | 1998-05-22 | 1999-03-23 | Biocatalytics, Inc. | Methods and compositions for quantitating L-homocysteine and/or l-methionine in a solution |
| JP4233160B2 (ja) | 1998-12-07 | 2009-03-04 | 積水メディカル株式会社 | ホモシステインの定量法 |
| TW546475B (en) * | 1998-12-07 | 2003-08-11 | Daiichi Pure Chemicals Co Ltd | A method for quantifying hydrogen sulfide or sulfide ion and a method for quantifying homocysteine or cysteine by using the method |
| JP2001017198A (ja) * | 1999-07-01 | 2001-01-23 | Toyobo Co Ltd | ホモシステインの測定方法およびホモシステイン測定用試薬組成物 |
| JP3869601B2 (ja) | 1999-11-26 | 2007-01-17 | 株式会社トクヤマ | ホモシステインの測定方法 |
-
2001
- 2001-06-29 EP EP07015061A patent/EP1849875B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-29 AT AT01945735T patent/ATE377655T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-06-29 ES ES01945735T patent/ES2295174T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-29 DE DE60136665T patent/DE60136665D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-29 AT AT07015061T patent/ATE414786T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-06-29 DE DE60131281T patent/DE60131281T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-29 JP JP2002507046A patent/JP4807920B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-29 EP EP01945735A patent/EP1295947B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-29 WO PCT/JP2001/005679 patent/WO2002002802A1/ja active IP Right Grant
- 2001-06-29 US US10/069,847 patent/US6686172B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08506478A (ja) * | 1992-01-22 | 1996-07-16 | アクシス バイオケミカルズ エイエス | ホモシステインアッセイ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1295947B1 (en) | 2007-11-07 |
| EP1849875A2 (en) | 2007-10-31 |
| DE60131281D1 (de) | 2007-12-20 |
| DE60136665D1 (de) | 2009-01-02 |
| US6686172B2 (en) | 2004-02-03 |
| WO2002002802A1 (fr) | 2002-01-10 |
| ES2295174T3 (es) | 2008-04-16 |
| EP1295947A1 (en) | 2003-03-26 |
| EP1849875B1 (en) | 2008-11-19 |
| DE60131281T2 (de) | 2008-08-28 |
| ATE377655T1 (de) | 2007-11-15 |
| US20020123088A1 (en) | 2002-09-05 |
| EP1295947A4 (en) | 2006-06-21 |
| ATE414786T1 (de) | 2008-12-15 |
| EP1849875A3 (en) | 2007-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Munujos et al. | Assay of succinate dehydrogenase activity by a colorimetric-continuous method using iodonitrotetrazolium chloride as electron acceptor | |
| EP1644741B1 (en) | Methods and compositions for assaying homocysteine | |
| JPH0577399B2 (ja) | ||
| JP4807920B2 (ja) | 総ホモシステイン測定方法 | |
| WO1995004831A1 (fr) | Procede de determination des ions chlorure | |
| RU2184778C2 (ru) | Система восстановления конфермента, набор для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества и ферментативный способ определения концентрации анализируемого вещества | |
| JP4319545B2 (ja) | 総システインアッセイ | |
| JPH02104298A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| CN106244672A (zh) | 一种用于尿酸检测试剂的稳定剂 | |
| JP4008229B2 (ja) | 安定なホモシステイン測定用組成物およびこれを用いるホモシステインの測定方法 | |
| JP2000253898A (ja) | 物質または酵素の定量方法および定量試薬 | |
| JP7234923B2 (ja) | 測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法 | |
| JP2000232898A (ja) | 物質の定量方法および定量試薬 | |
| JP3034988B2 (ja) | イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP2515551B2 (ja) | 新規な過酸化水素の定量方法 | |
| EP0392021B1 (en) | Method for analyzing components | |
| JPS61173799A (ja) | 基質又は酵素活性の定量方法 | |
| JPS6219100A (ja) | 胆汁酸の定量法 | |
| US5840512A (en) | Method for measurement of ionized calcium | |
| Racek et al. | The use of N-ethylmaleimide in the calorimetric assay of activated creatine kinase with a tetrazolium | |
| JP3227486B2 (ja) | 銅の測定方法 | |
| JPS61155758A (ja) | クレアチニン及びクレアチンの同時定量方法並びにそのキツト | |
| JPH07108239B2 (ja) | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 | |
| JPS5934900A (ja) | 生体液中の成分の測定方法 | |
| JPH07265097A (ja) | 鉄の定量方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080509 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100929 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110215 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110412 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110809 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110816 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140826 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4807920 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |