CN103674873A - 一种定量检测丝氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测丝氨酸的方法。丝氨酸样品经过胱硫醚裂解酶（CBL）作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通过测定生成丙酮酸的含量，定量得到样品中丝氨酸的含量。丙酮酸的含量的测定方法为乳酸脱氢酶法，丙酮酸和NADH在LD，pH7.4，作用下生成乳酸和NAD⁺，通过测定340nm波长处NADH下降速率，得到丙酮酸含量。本发明所提出的工艺操作简便、快速，有较为精密和准确的分析性能、抗干扰能力强，能适应绝大多数自动生化分析仪，易于实现自动化，是目前测定丝氨酸的优选方法。

Description

一种定量检测丝氨酸的方法

技术领域

本发明属于氨基酸检测领域，涉及胱硫醚裂解酶法对丝氨酸的定量分析，是试剂检测领域。

背景技术

丝氨酸是一种不带电荷的极性氨基酸，白色结晶体或结晶性粉末，呈六角形片或柱状晶，易溶于水和甲酸，难溶于乙醇。丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用，并且它有助于免疫血球素和抗体的产生，所以丝氨酸在维持健康的免疫系统方面扮演者重要的角色。丝氨酸是合成嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱的前体，可用于生化研究。丝氨酸广泛用于配置第三代复方氨基酸输液和营养增补剂，并用于合成多种丝氨酸衍生物，如心血管、抗癌、艾滋病新药及基因工程用保护氨基酸等。此外，丝氨酸具有稳定滴眼液pH值的作用，且滴眼后无刺激性。在化妆品行业中，丝氨酸是一种重要的自然保湿因子(NMF) 之一，它能有效保持皮肤角质层的水分，因此是很多高级化妆品中的关键添加剂。2012年12月，英国Beatson癌症研究所的研究人员在一项新研究中证实，丝氨酸是癌细胞相关的一种关键氨基酸，可显著削弱癌细胞的生长和增殖能力。

目前，国内外用来检测氨基酸含量的方法，通常有高效液相色谱法、氨基酸自动分析仪法和纸层析-茚三酮显色法。前两种方法或者仪器设备要求高或者衍生步骤繁琐，操作很不方便，而且对于样品多、工作量大的丝氨酸分离提取以及丝氨酸产生菌的筛选来说并不适用。纸层析-茚三酮显色法虽然操作方便、所用仪器较简单，但在氨基酸种类复杂的环境中，对丝氨酸的层析分离和定量分析不够准确。

丝氨酸在胱硫醚裂解酶（CBL）的作用下可以生成丙酮酸，丙酮酸测定的反应是乳酸测定的逆反应。在pH7.4条件下，平衡常数非常有利于逆反应（生成乳酸的方向）。通过测定340nm波长处NADH的下降速率，定量丙酮酸含量。此方法优点较多：顺向反应中以NAD⁺、乳酸为底物都比较稳定，过量乳酸对乳酸脱氢酶（LD）的抑制作用小于过量丙酮酸；逆向反应NADH的用量只有正向反应NAD⁺的3%，酶促反应速率快于正向反应，所以应用样品量少且可在短时间内完成测定。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种定量检测丝氨酸的方法。

定量检测丝氨酸的方法，丝氨酸样品经过胱硫醚裂解酶（CBL）作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通过测定生成丙酮酸的含量，定量得到样品中丝氨酸的含量。

优选地，所述的丙酮酸的含量的测定方法为乳酸脱氢酶法，丙酮酸和NADH在LD，pH7.4，作用下生成乳酸和NAD⁺，通过测定340nm 波长处NADH下降速率，得到丙酮酸含量。

优选地，，具体步骤如下：

    1）、配置相关试剂：

A、0.5mmol/L丝氨酸标准应用液，

B、R₁：20mmol/L HEPES缓冲液，33 KU/L LD，8.9KU/L CBL，pH 7.4，

C、R₂：50mmol/L Tris，0.416 mmol/L NADH，pH 7.4；

    2）、根据自动化分析仪的型号、性能设定参数，温度：37℃；波长：340nm；样品和标准品各25μL，5s后加R₁100μL，10s后加R₂50μL，每隔28s检测OD₃₄₀，分别测定样品管和标准管吸光度的下降速率；

   3）、计算                                                

， A_u是样品管吸光度的下降速率， A_s是标准管吸光度的下降速率。

本发明的有益效果

本发明是将丝氨酸样品经过胱硫醚裂解酶作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸。通过乳酸脱氢酶法测定生成丙酮酸的含量，从而定量丝氨酸。本发明所提出的工艺操作简便、快速，有较为精密和准确的分析性能、抗干扰能力强，能适应绝大多数自动生化分析仪，易于实现自动化，是目前测定丝氨酸的首选方法。

附图说明

图1为丝氨酸标准曲线。 

具体实施方式

下面结合实施例更具体地说明本发明的内容，应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为体积单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

一、本发明定量检测丝氨酸的方法

1）、配置相关试剂：

A、0.5mmol/L丝氨酸标准应用液，

B、R₁：20mmol/L HEPES缓冲液，33 KU/L LD，8.9KU/L CBL，pH 7.4，

C、R₂：50mmol/L Tris，0.416 mmol/L NADH，pH 7.4；

2）、根据自动化分析仪的型号、性能设定参数，温度：37℃；波长：340nm；样品和标准品各25μL，5s后加R₁100μL，10s后加R₂50μL，每隔28s检测OD₃₄₀，分别测定样品管和标准管吸光度的下降速率；

3）、计算

， A_u是样品管吸光度的下降速率， A_s是标准管吸光度的下降速率。

二、茚三酮法定量检测丝氨酸

1）、配制相关试剂：

A、1g/L的丝氨酸标准溶液，

B、展层剂：按照正丁醇：95%乙醇：冰醋酸：水=4：1：1：2比例配制，

C、0.1%茚三酮溶液，

D、层析液（0.1%茚三酮溶液-展层剂）：每10mL展层剂中加入2.5mL 0.1%茚三酮溶液，

E、洗脱液：按照“V（0.1%CuSO₄）：V（75%乙醇）=2：38比例配制，

F、待测样品：氨基酸混合液，含丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸等。

2）将预先配制的层析液倒入展开缸中静置20min，使缸内环境达到平衡，在距滤纸下端2cm处划一横线，用微量进样器分别取1g/L丝氨酸标准溶液5、10、15、20、25μL点样于横线上，待样液自然挥发干后倾斜放入展开缸中，待层析液上行至距折线1cm左右时取出滤纸，放入干燥箱中，在105℃条件下干燥5min。干燥后的滤纸上会呈现明显的氨基酸显色斑点，剪下氨基酸显色斑点，将其放置于带塞玻璃试管中（比色管），用4mL洗脱液洗脱35min，再倒入比色皿中静置24h（确保液体中的纸末全部沉淀），以洗脱液为对照样，在772E分光光度计上（波长570nm处）测定吸光度，以标准溶液的用量与吸光度做丝氨酸标准曲线，如图1所示。取氨基酸混合液，按照实验方法，进行3次比色测定，取平均值计算丝氨酸含量为13.05μg。

按本发明所述的实验方法检测得丝氨酸含量为4.94mmol/L，计算得12.98μg。结果相近，由此可知，此发明实验方法可行，且更方便快捷。

实施例1 丝氨酸高产菌株的产量测定

1.丝氨酸高产菌株的培养

种子摇瓶培养：将MPB活化的含SerB基因工程菌液5mL接入内盛有50mL种子培养液的三角瓶中，置于往复式摇床上，于30℃，260r/min下振动培养使菌体达到对数生长期。

发酵摇瓶培养：按接种量5%，500mL的三角瓶装液量为20mL，置于往复式摇床上，于30℃，260r/min下振动培养72h，取发酵液离心，取上清用于氨基酸检测。

2.丝氨酸浓度的测定

(1) 配置相关试剂：

0.5mmol/L丝氨酸标准应用液;

R₁：20mmol/L HEPES缓冲液，33 KU/L LD，8.9KU/L CBL，pH 7.4

R₂：50mmol/L Tris，0.416 mmol/L NADH，pH 7.4

(2) 根据自动化分析仪的型号、性能设定参数。温度：37℃；波长：340nm；样品（稀释100倍）和标准品各25μL，5s后加R₁100μL，10s后加R₂50μL，每隔28s检测OD₃₄₀， 分别测定样品管和标准管吸光度的下降速率。

(3) 计算总蛋白中丝氨酸的含量为0.156mol/L，可换算为16.4g/L。

实施例2  酶法合成丝氨酸反应液中的简易测定

1.  工程菌的培养和预处理

取甘油管保存的含glyA的基因工程菌悬液，按3%接种至3mL LB液体培养基中，37℃，260r/min下振动培养12h，随后转入100mL LB液体培养液中扩大培养14h。3600r/min离心5min，收集菌体。将菌体加少量蒸馏水制成菌悬液，于水浴超声仪中150V处理。

2.  酶法合成丝氨酸

正向酶活反应中含10mmol/L Gly、13.3 mmol/L HCHO、0.5 mmol/L PLP、6 mmol/L THFA、0.2 mol/L巯基乙醇、0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH8.0），加工程菌悬液使OD₆₀₀=0.2。37℃振荡反应30min，离心取上清。

3.  丝氨酸浓度的测定

参照实施例1，计算上清中丝氨酸的含量为0.2mol/L。

Claims (3)

1.一种定量检测丝氨酸的方法，其特征在于，丝氨酸样品经过胱硫醚裂解酶（CBL）作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通过测定生成丙酮酸的含量，定量得到样品中丝氨酸的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的丙酮酸的含量的测定方法为乳酸脱氢酶法，丙酮酸和NADH在LD，pH7.4，作用下生成乳酸和NAD⁺，通过测定340nm 波长处NADH下降速率，得到丙酮酸含量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

    1）、配置相关试剂：

A、0.5mmol/L丝氨酸标准应用液，

B、R₁：20mmol/L HEPES缓冲液，33 KU/L LD，8.9KU/L CBL，pH 7.4，

C、R₂：50mmol/L Tris，0.416 mmol/L NADH，pH 7.4；

    2）、根据自动化分析仪的型号、性能设定参数，温度：37℃；波长：340nm；样品和标准品各25μL，5s后加R₁100μL，10s后加R₂50μL，每隔28s检测OD₃₄₀，分别测定样品管和标准管吸光度的下降速率；

   3）、计算                                               

， A_u是样品管吸光度的下降速率， A_s是标准管吸光度的下降速率。

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