CN101210908B - 气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率 - Google Patents
气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101210908B CN101210908B CN2006101558167A CN200610155816A CN101210908B CN 101210908 B CN101210908 B CN 101210908B CN 2006101558167 A CN2006101558167 A CN 2006101558167A CN 200610155816 A CN200610155816 A CN 200610155816A CN 101210908 B CN101210908 B CN 101210908B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- soil
- nitrogen
- isotope
- pedotheque
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 76
- 239000002689 soil Substances 0.000 title claims abstract description 51
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 title claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 62
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 35
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 31
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 20
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims abstract description 20
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 2-propanol Substances CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 23
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 20
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 7
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 claims description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 6
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 6
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 6
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 239000001307 helium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 150000001455 metallic ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 claims description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 3
- 238000010926 purge Methods 0.000 claims description 3
- 239000012495 reaction gas Substances 0.000 claims description 3
- SNDPXSYFESPGGJ-SCSAIBSYSA-N D-2-aminopentanoic acid Chemical class CCC[C@@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 2
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 abstract description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 abstract 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 abstract 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 238000004172 nitrogen cycle Methods 0.000 abstract 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 60
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 60
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- -1 amino acid enantiomers Chemical class 0.000 description 8
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241001411320 Eriogonum inflatum Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- ZXKXJHAOUFHNAS-FVGYRXGTSA-N (S)-fenfluramine hydrochloride Chemical compound [Cl-].CC[NH2+][C@@H](C)CC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZXKXJHAOUFHNAS-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004411 aluminium Substances 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000000451 chemical ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003822 preparative gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及土壤氮素循环，具体地说是气相色谱-质谱联用测定土壤水解氨基酸手性异构体同位素富集速率的方法，1)选取同位素丰度为50％-100％的碳、氮化合物进行稳定同位素添加样品培养实验；2)将土壤样品分别利用过量的HCl水解，水解液采用阳离子交换树脂分离获取土壤中的水解氨基酸，将提取液蒸干后，干燥的样品利用五氟丙酸酐—异丙醇酯法衍生；3)衍生物利用气相色谱分离、质谱测定获取每一种氨基酸手性异构体的质谱峰面积及其同位素峰面积；4)无论是无机15N还是葡萄糖13C加入所引起的氨基酸手性异构体同位素相对丰度的变化均可用APE来表示：采用APE和培养时间的比值即可表示NH4 +或NO3 -合成氨基酸氮及葡萄糖合成氨基酸碳的速率。
Description
技术领域
本发明涉及土壤氮素循环研究，具体地说是气相色谱-质谱联用测定土壤水解氨基酸手性异构体同位素富集速率的方法。
背景技术
土壤氨基酸数量最早利用土壤有机氮形态分析中酸水解-蒸馏法方法测定(鲁如坤，土壤农业化学分析方法，pp152-156，中国农业科技出版社，1999)，但仅能计算氨基酸总量；采用气相色谱法可使15种氨基酸手性异构体有效分离并逐一定量，但其数量特征是静态的，体现的是多种因素综合后的氨基酸的积累，无法反映氨基酸手性异构体的动态变化(W.Amelung，X.Zhang.2001.Determination of amino acid enantiomers in soils.Soil Biology& Biochemistry 33：553-562)。气相色谱-燃烧-同位素比例质谱可区分氨基酸手性异构体的天然同位素丰度变化，但同位素区分程度较小且无法调控，不适用于土壤养分的循环转化研究，而且测定成本很高，容易对仪器产生同位素污染，同时在样品处理过程引起的同位素歧视比例偏差无法克服定量校正(Amelung，W.，Brodowski，S.，2002.In vitro quantification ofhydrolysis-induced racemization of amino acid enantiomers in environmentalsamples using deuterium labeling and electron-impact ionization massspectrometry.Analytical Chemistry 74，3239-3246)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素比例的方法，其可有效区分土壤中原有氨基酸和利用活性底物新合成的部分，同时可计算氨基酸的合成速率。由于底物为高丰度碳或氮同位素，新合成的氨基酸同位素丰度相对较高，可利用通常的气相色谱-质谱法进行定量分析，土壤中氨基酸手性异构体质谱峰及同位素峰的相对比例变化，计算各种氨基酸手性异构体的同位素碳、氮的富集速率。和目前应用的同位素比例质谱仪测定相比，使用方便，测定成本低，重现性好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率，
1)选取丰度为50％-100％的碳、氮同位素进行稳定同位素添加样品培养实验，将15-氮素+葡萄糖混合物和氮素+U-13C-葡萄糖混合物加入土壤样品中进行实验，氮素形态可为NH4 +或NO3 -，加入量为0.05-2mg N/g土；葡萄糖加入量为0.5-5mg C/g土；以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤样品做对比；
2)将土壤样品分别利用过量的HCl水解，水解液采用阳离子交换树脂分离获取土壤中的水解氨基酸，将提取液蒸干后，所得干燥利用五氟丙酸酐—异丙醇酯法衍生；
3)衍生物利用气相色谱分离、质谱测定获取每一种氨基酸手性异构体的质谱峰面积及其同位素峰面积；
4)无论是无机15N还是葡萄糖13C加入所引起的氨基酸手性异构体同位素相对丰度的变化均可用原子百分超(APE)来表示：
APE＝(Re-Rc)/[1+(Re-Rc)]*100 (1)
对于15N来说，Re＝A(F+b)/AF，其中A(F+b)为同位素峰面积，AF为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；b为待测氨基酸所含有的氨基数目，b＝1-3；采用APE和培养时间的比值即可表示NH4 +或NO3 -合成氨基酸氮的速率；
对于13C来说，Re＝A(F+n)/AF，其中A(F+b)为同位素峰面积，AF为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；n代表该氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原子数，n＝2-9；采用APE和培养时间的比值即可表示葡萄糖合成氨基酸碳的速率；
Rc则为在同一次测定中，对比土壤样品中相应的同位素比例值；
若待测氨基酸有多个碎片峰，将各碎片同位素比例进行加权平均计算后即未末氨基酸同位素比例。
土壤样品的培养，称取8-12克粒径为1-2mm风干土于塑料瓶中，加入P含量为8-20mg的KH2PO4和适量蒸馏水，使土壤湿度为风干土重的20-25％；覆盖保水透气膜，于室温下预培养7-14天，预培养结束后设置以下三个处理：部分样品每周加入15-氮素(N)+葡萄糖混合物，另一部分样品每周加入氮素+U-13C-葡萄糖混合物，以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤样品做对比；培养2-14周，每周加入底物的同时，利用称重法补水，保持土壤水分恒定，将所取样品风干，磨细过0.25mm筛待测。
所述土壤样品分别利用过量的HCl水解，水解液采用阳离子交换树脂分离获取土壤中的水解氨基酸过程为，
1)准确称取0.5g土壤样品至水解瓶中，加入10ml 6mol/lHCl后旋紧瓶盖，于105℃下水解12小时；水解结束并冷却至室温后，向水解物中加入200μl的80μg/ml正缬氨酸为内标；
2)将水解物利用定量滤纸过滤，滤渣弃去，滤液在旋转蒸发仪上蒸发至干，操作温度35-45℃；将蒸发瓶中残渣溶于4ml 0.05mol/l HCl中，将溶液转移至阳离子交换树脂纯化柱中进行纯化；
纯化过程如下：将溶液转移至样品纯化柱后，加入4ml 0.01mol/l HCl润洗旋转蒸发瓶，润洗液一并转移至纯化柱中；树脂用0.1mol/l草酸淋洗以除去土壤中金属离子；然后，向树脂柱中先后加入5ml 0.01mol/l HCl和5ml去离子水，并将淋洗液弃去；利用25ml 2.5mol/l NH3·H2O洗脱氨基酸，将各次洗脱液用干净的旋转蒸发瓶接收，然后利用旋转蒸发仪于30-45℃下蒸发至干，干燥后样品进行下一步处理。
所述气相色谱条件为，手性毛细管柱载气为高纯氮气，柱流速+补偿气流速＝25ml/min，进样口温度为200℃，分流比为40∶1；升温程序如下：初温80℃，保持4分钟，然后以40℃/min升至110℃，保持1分钟；以1℃/min升至118℃，保持3分钟；以7℃/min升至160℃，保持2.5分钟；以10℃/min升至200℃，保持20分钟，一次测定时间为40分钟；
所述质谱条件为，气相色谱质谱接口温度为250℃，高纯氦气为载气，化学电离源温度为180℃，电子能量为70ev；甲烷为反应气，流速为1.5ml/min；信号采集设为全扫描模式，质荷比范围50-500。
本发明具有如下优点：
本发明培养过程易于调控，可随时取样并测定土壤氨基酸手性异构体的动态转变化情况；培养过程中同位素丰度的变化易于测定，没有同位素歧视效应，计算方法简便；能够跟踪了解同位素碳、氮在氨基酸手性异异构体的分子中的分布，从而有效地研究土壤氨基酸手性异构体的动态变化，是土壤氮素循环研究中一种非常重要的方法。
附图说明
图1为利用N+葡萄糖的对照培养土壤样品中的丙氨酸质谱图；
图2利用15N+葡萄糖培养土壤样品中的丙氨酸质谱图；
图3利用N+13C葡萄糖培养土壤样品中的丙氨酸质谱图。
具体实施方式
实施例1
1.稳定同位素添加土壤样品培养
称取8克风干土(＜2mm)于塑料瓶中，加入KH2PO4(P含量为8mg)和适量蒸馏水，使土壤湿度为风干土重的20％。覆盖保水透气膜，于室温下(25℃)预培养一周。预培养结束后设置以下两个处理：部分样品每周加入15N标记氮素+葡萄糖混合物，另一部分样品每周加入氮素+U-13C-葡萄糖混合物。氮素形态可为NH4 +或NO3 -，加入量为0.1mg N/g土；葡萄糖加入量为1mg C/g土。每周加入底物的同时，利用称重法补水，保持土壤水分基本恒定。培养过程中保持温度恒定。定期取样。将所取样品风干，均匀取出部分样品(四分法)磨细过0.25mm筛待测。
2.土壤样品前处理
2.1土壤样品水解和纯化
准确称取0.5g土壤样品至水解瓶中，加入10ml 6mol/lHCl后旋紧瓶盖，于105℃下水解12小时。水解结束并冷却至室温后，向水解物中加入200μl浓度为80μg/ml的正缬氨酸为内标。
将水解物利用定量滤纸过滤，滤渣弃去，滤液在旋转蒸发仪上蒸发至干，操作温度35-45℃。将蒸发瓶中残渣溶于4ml 0.05mol/l HCl中，将溶液转移至聚丙烯样品纯化柱中进行纯化。该柱容积为25ml(长30cm，内径1.2cm)，柱内填装3克Dowex 50W X8(100-200目)阳离子交换树脂，每次使用前先用25ml 2mol/l NaOH预淋洗，然后加入25ml 2mol/lHCl，最后用去离子水淋洗，直到淋洗液pH接近中性为止。
纯化过程如下：将溶液转移至样品纯化柱后，加入4ml 0.01mol/l HCl润洗旋转蒸发瓶，润洗液一并转移至纯化柱中。树脂用0.1mol/l草酸(用浓NH3·H2O调节pH至1.6-1.8)淋洗五次以除去土壤中铁、铝等金属离子，每次用量5ml。然后，向树脂柱中先后加入5ml 0.01mol/l HCl和5ml去离子水，并将淋洗液弃去。
利用25ml 2.5mol/l NH3·H2O洗脱氨基酸，每次用5ml，将各次洗脱液用干净的旋转蒸发瓶接收，然后利用旋转蒸发仪蒸发至干(30-45℃)，将干燥后样品进行下一步处理。
2.2样品衍生
将干燥后样品用2ml 0.1mol/l HCl溶解(溶液pH须小于2，否则用1mol/了HCl调节至所需范围)，并等体积润洗一次，内容物均转移至2ml聚丙烯离心管中。在4200xg条件下离心15分钟，将上清液倒入5ml反应瓶中，上口覆封口膜，于乙醇浴(-18℃)中冷冻3小时以上，然后进行8小时真空干燥。
向干燥后样品中加入400μl 4mol/l HCl-异丙醇溶液(将乙酰氯和异丙醇等以体积比1∶2.5在0℃甲醇浴中混合，实验前现用现配)，旋紧反应瓶瓶塞。瓶塞应带有聚四氟乙烯隔层，同时上面用金属板加固。样品溶液在110℃下加热30分钟，冷却至室温后，将上清液转移至1ml反应瓶中，用N2将多余试剂吹干，即得到相应氨基酸异丙醇酯。然后向瓶中加入130μl二氯甲烷和130μl五氟丙酸酐，在110℃下加热10分钟。冷却至室温后，用N2将多余试剂吹干，将干燥后的五氟丙酸氨基酸异丙醇酯溶于150μl二氯甲烷，震荡并平衡半小时后将上清液移至色谱内插管瓶中即可利用气相色谱测定。
以上土壤样品前处理条件引自参考文献：W.Amelung，X.Zhang.2001.Determination of amino acid enantiomers in soils.Soil Biology & Biochemistry33：553-562.
3.土壤氨基酸手性异构体气相色谱-质谱测定
3.1气相色谱条件
手性毛细管柱：30m*0.25mm*0.12μm，载气为高纯氮气，柱流速+补偿气流速＝25ml/min，进样口温度为200℃，分流比为40∶1。升温程序如下：初温80℃，保持4分钟，然后以40℃/min升至110℃，保持1分钟；以1℃/min升至118℃，保持3分钟；以7℃/min升至160℃，保持2.5分钟；以10℃/min升至200℃，保持20分钟，一次测定时间为40分钟。
3.2质谱条件
气相色谱质谱接口温度为250℃，高纯氦气(He)为载气。化学电离源(CI)温度为180℃，电子能量为70ev；甲烷(CH4)为反应气，流速为1.5ml/min；信号采集设为全扫描模式，质荷比范围50-500。
4.同位素富集比例评价与计算
4.1氨基酸手性异构体同位素富集评价方法
如图1-3所示，对于利用N+葡萄糖培养的对照样品来说，其质谱碎片主要表明12C、14N等所形成的离子结构特征，在主要碎片峰区域的小峰的相对丰度(小峰面积占母峰面积的比例)主要由13C、15N等的天然丰度和仪器自身背景值所决定，因而具有很好的稳定性，数值相对较小。
当土壤样品中加入的无机15N被同化利用合成氨基酸手性异构体后，新合成的氨基酸的氨基位含有15N，而土壤中原有的氨基酸氨基位则为14N(比例占99％以上)。由于中性和酸性氨基酸只含有一个氨基，对于碎片峰F来说，在相邻的位置上(F+1)的丰度就会有所增加；碱性氨基酸含有两个或两个以上的氨基，对于碎片峰F来说，(F+b)的丰度有所增加，b代表氨基酸所含有的氨基数目。因而同位素氮合成氨基酸氮的速率可以用(F+b)/F的相对丰度比例的变化来评价，b＝1-3。
当土壤样品中加入U-13C-葡萄糖+氮素时，新合成的氨基酸的碳骨架全部由13C组成。对于碎片峰F来说，(F+n)的丰度就会有所增加，n代表该氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原子数，(F+n)与F丰度的比值变化用以评价利用葡萄糖合成氨基酸碳的速率，n＝2-9。
4.2氨基酸手性异构体同位素富集计算方法
无论是无机15N还是葡萄糖13C加入所引起的氨基酸手性异构体同位素相对丰度的变化均可用原子百分超(APE)来表示：
APE＝(Re-Rc)/[1+(Re-Rc)]*100 (1)
对于15N富集比例的计算来说，Re＝A(F+b)/AF，其中A(F+b)为同位素峰面积，AF为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；b为待测氨基酸所含有的氨基数目，b＝1-3；Rc为在同一次测定中，对比土壤样品中相应的同位素比例值；采用APE和培养时间的比值即可表示NH4 +或NO3 -合成氨基酸氮的速率；
对于13C来说，Re＝A(F+n)/AF，其中A(F+n)为同位素峰面积，AF为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；n代表该氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原子数，n＝2-9；Rc为在同一次测定中，对比土壤样品中相应的同位素比例值；采用APE和培养时间的比值即可表示葡萄糖合成氨基酸碳的速率；
若待测氨基酸有多个碎片峰，将各碎片同位素比例进行加权平均计算后即为氨基酸同位素比例。
采用上述方法将取自公主岭的黑土培养4周后，称取0.5克样品经水解、纯化、衍生后利用气相色谱-质谱测定。在针对L-丙氨酸(含有1个N原子和3个碳原子)的同位素富集速率进行计算时，步骤如下：
在对比土壤样品中，质荷比(m/z)为190(F)的碎片所对应的峰面积为9987，质谱峰191所对应的峰面积为1020，其他小峰因面积极小可当作零处理。则Rc(F+1)190＝1020/9987＝0.10，其他则为零。同理，m/z为236的碎片所对应的峰面积为19906，质谱峰237所对应的峰面积为2005，则Rc(F+1)236＝2005/19906＝0.10。
对于已富集了15N的丙氨酸来说，质荷比为190(F)的碎片所对应的峰面积仍约为9987，但质谱峰191所对应的峰面积增加为3050，则Re(F+1)＝3050/9987＝0.31，根据公式(1)，则APE(15N)190＝(0.31-0.10)/[1+(0.31-0.10)]*100＝17.36；同理，m/z为236的碎片所对应的峰面积仍为19906，但同位素峰237面积增加至6105，根据公式(1)，可计算APE(15N)236＝16.38；由于m/z 236丰度与m/z 190丰度比为19906/9987＝2，则可得APE(15N)＝17.36*1/3+16.38*2/3＝16.71。利用15N合成氨基酸氮的速率为＝16.71/4＝4.18原子百分超/周
对于已富集了13C的丙氨酸来说，质荷比为190(F)的碎片所对应的峰面积仍约为9987，由于该碎片含有2个骨架碳原子，m/z192所对应的峰面积增加到2680，则Re(F+2)＝2680/9987＝0.27，根据公式(1)，利用葡萄糖合成氨基酸碳的比例是：APE(13C)190＝(0.27-0)/[1+(0.27-0)]*100＝21.16；同理，同理，m/z为236的碎片所对应的峰面积为19906，由于该碎片含有3个骨架碳原子，质谱峰239对应的峰面积为5275，则Re(F+3)＝5275/19906＝0.26，APE(13C)236＝(0.26-0)/[1+(0.26-0)]*100＝20.94，加权平均后，APE(13C)＝21.16*1/3+20.94*2/3＝21.05。利用13C合成氨基酸碳的速率＝21.05/4＝5.26原子百分超/周。
Claims (4)
1.气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率的方法，其特征在于：
1)选取丰度为50％-100％的碳、氮同位素进行稳定同位素添加样品培养实验，将15-氮素+葡萄糖混合物和氮素+U-13C-葡萄糖混合物加入土壤样品中进行实验，氮素形态可为NH4 +或NO3 -，加入量为0.05-2mgN/g土；葡萄糖加入量为0.5-5mgC/g土；以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤样品做对比；
2)将土壤样品分别利用过量的HCl水解，水解液采用阳离子交换树脂分离获取土壤中的水解氨基酸，将提取液蒸干后，所得干燥样品利用五氟丙酸酐-异丙醇酯法衍生；
3)衍生物利用气相色谱分离、质谱测定获取每一种氨基酸手性异构体的质谱峰面积及其同位素峰面积；
4)无论是无机15N还是葡萄糖13C加入所引起的氨基酸手性异构体同位素相对丰度的变化均可用原子百分超APE来表示：
APE＝(Re-Rc)/[1+(Re-Rc)]*100
对于15N来说，Re＝A(F+b)/AF，其中A(F+b)为同位素峰面积，AF为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；b为待测氨基酸所含有的氨基数目，b＝1-3；采用APE和培养时间的比值即可表示NH4 +或NO3 -合成氨基酸氮的速率；
对于13C来说，Re＝A(F+n)/AF，其中A(F+n)为同位素峰面积，AF为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；n代表该氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原子数，n＝2-9；采用APE和培养时间的比值即可表示葡萄糖合成氨基酸碳的速率；
Rc则为在同一次测定中，对比土壤样品中相应的同位素比例值；
若待测氨基酸有多个碎片峰，将各碎片同位素比例进行加权平均计算后即为氨基酸同位素比例。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：土壤样品的培养，称取8-12克粒径为1-2mm风干土于塑料瓶中，加入P含量为8-20mg的KH2PO4和适量蒸馏水，使土壤湿度为风干土重的20-25％；覆盖保水透气膜，于室温下预培养7-14天，预培养结束后设置以下三个处理：部分样品每周加入15-氮素(N)+葡萄糖混合物，另一部分样品每周加入氮素+U-13C-葡萄糖混合物，以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤样品做对比；培养2-14周，每周加入底物的同时，利用称重法补水，保持土壤水分恒定，将所取样品风干，磨细过0.25mm筛待测。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述土壤样品分别利用过量的HCl水解，水解液采用阳离子交换树脂分离获取土壤中的水解氨基酸过程为，1)准确称取0.5g土壤样品至水解瓶中，加入10ml 6mol/l HCl后旋紧瓶盖，于105℃下水解12小时；水解结束并冷却至室温后，向水解物中加入200μl的80μg/ml正缬氨酸为内标；
2)将水解物利用定量滤纸过滤，滤渣弃去，滤液在旋转蒸发仪上蒸发至干，操作温度35-45℃；将蒸发瓶中残渣溶于4ml 0.05mol/l HCl中，将溶液转移至阳离子交换树脂纯化柱中进行纯化；
纯化过程如下：将溶液转移至样品纯化柱后，加入4ml 0.01mol/l HCl润洗旋转蒸发瓶，润洗液一并转移至纯化柱中；树脂用0.1mol/l草酸淋洗以除去土壤中金属离子；然后，向树脂柱中先后加入5ml 0.01mol/l HCl和5ml去离子水，并将淋洗液弃去；利用25ml 2.5mol/l NH3·H2O洗脱氨基酸，将各次洗脱液用干净的旋转蒸发瓶接收，然后利用旋转蒸发仪于30-45℃下蒸发至干，干燥后样品进行下一步处理。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述气相色谱条件为，手性毛细管柱载气为高纯氮气，柱流速+补偿气流速＝25ml/min，进样口温度为200℃，分流比为40∶1；升温程序如下：初温80℃，保持4分钟，然后以40℃/min升至110℃，保持1分钟；以1℃/min升至118℃，保持3分钟；以7℃/min升至160℃，保持2.5分钟；以10℃/min升至200℃，保持20分钟，一次测定时间为40分钟；
所述质谱条件为，气相色谱质谱接口温度为250℃，高纯氦气为载气，化学电离源温度为180℃，电子能量为70ev；甲烷为反应气，流速为1.5ml/min；信号采集设为全扫描模式，质荷比范围50-500。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006101558167A CN101210908B (zh) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | 气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006101558167A CN101210908B (zh) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | 气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101210908A CN101210908A (zh) | 2008-07-02 |
| CN101210908B true CN101210908B (zh) | 2011-08-10 |
Family
ID=39611073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2006101558167A Expired - Fee Related CN101210908B (zh) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | 气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101210908B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101825561B (zh) * | 2009-03-04 | 2011-08-03 | 中国石油天然气股份有限公司 | 一种阻燃剂双酚a双(磷酸二苯酯)中间体中残留三氯氧磷的定量分析方法 |
| CN108226139A (zh) * | 2018-02-26 | 2018-06-29 | 洛阳师范学院 | 一种拉曼光谱检测土壤氨基酸化合物中异构体的方法 |
| CN115015450B (zh) * | 2022-05-26 | 2024-05-14 | 贵州省烟草科学研究院 | 一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法 |
-
2006
- 2006-12-29 CN CN2006101558167A patent/CN101210908B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101210908A (zh) | 2008-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grigorean et al. | A mass spectrometry method for the determination of enantiomeric excess in mixtures of d, l-amino acids | |
| Greenberg et al. | Contribution of leaf and needle litter to whole ecosystem BVOC fluxes | |
| Pedersen et al. | Quantitative analysis of geraniol, nerol, linalool, and α-terpineol in wine | |
| Hao et al. | Stable isotope labeling assisted liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry for quantitative analysis of endogenous gibberellins | |
| CN106501427A (zh) | 一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法及同时定量检测方法 | |
| Liu et al. | A hierarchical framework for disentangling different controls on leaf wax δDn-alkane values in terrestrial higher plants | |
| CN101210908B (zh) | 气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率 | |
| CN108845046A (zh) | 一种浓香型白酒中有机酸稳定碳同位素的测定方法 | |
| CN113321611A (zh) | 一种同位素精神活性物质标记化合物及其制备方法和用途 | |
| CN105842377B (zh) | 一种白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法 | |
| Yi-Ping et al. | Determination of plant growth regulators in vegetable by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with isotop-coded derivatization | |
| Liu et al. | Inter-molecular variations of fatty acid δD in algae and submerged plants from the north-eastern Tibetan Plateau | |
| Ghashghaie et al. | Isotope ratio mass spectrometry technique to follow plant metabolism: principles and applications of 12C/13C isotopes | |
| CN108645928A (zh) | 一种酱香型白酒中有机酸稳定碳同位素的测定方法 | |
| CN108845047A (zh) | 一种董香型白酒中有机酸稳定碳同位素的测定方法 | |
| Pungor et al. | Continuous monitoring of fermentation outlet gas using a computer coupled MS | |
| CN108445102B (zh) | 一种高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法 | |
| CN112608270A (zh) | 一种同位素化合物及其制备方法和用途 | |
| White | A gas chromatographic method for the analysis of lipoic acid in biological samples | |
| CN105954428A (zh) | 牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法 | |
| CN113740459B (zh) | 一种生活饮用水中环氧氯丙烷的检测方法 | |
| CN106338559A (zh) | 一种氯消毒副产物二氯乙酰胺的气相色谱检测方法 | |
| CN103207256B (zh) | 坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的检测方法 | |
| CN103674873B (zh) | 一种定量检测丝氨酸的方法 | |
| CN100399022C (zh) | 植物根系分泌物低分子量有机酸的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110810 Termination date: 20111229 |