JP3151097B2 - チラミンの高感度定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は被検体中のチラミンの高
感度定量方法、詳しくは酵素サイクリング反応によるチ
ラミンの簡便かつ精度の高い高感度定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内等に存在するチラミンはカテコー
ルアミン類の代謝産物であり、生体の生理状態を知る上
で重要な生理活性アミンである。従って、チラミンを測
定することによって、カテコールアミン類の代謝および
生理学的作用の研究上で重要な知見を得ることが出来
る。

【０００３】チラミンの定量方法としては、従来からペ
ーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーあ
るいは高速液体クロマトグラフィーによる方法が一般的
である。これらの方法の中で感度が高く、信頼性の高い
とされる定量法は高速液体クロマトグラフィー法であ
る。この方法では、チラミンはアミノ酸分析と全く同じ
原理によって分離定量される。例えば、充填剤としてイ
オン交換樹脂を使用する高速液体クロマトグラフィーの
場合、樹脂に吸着されたチラミンを展開液のイオン強度
あるいはｐＨを変化させて分離を行い、分離されたチラ
ミンをニンヒドリン反応による吸光度測定あるいはｏ−
フタルアルデヒドとの反応による蛍光測定などの方法で
検出して定量される。

【０００４】一方、これらのクロマトフラフィー法以外
の原理を使う方法として、チラミンに対して特異的に作
用を示し、ｐ−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、
アンモニア、及び過酸化水素を生成せしめるアグリカル
チャラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ
ｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、２９巻、１１７頁
（１９６５年）に記載の細菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）由来のチラミン酸化酵素を使用する酵素
法によるチラミンの定量法が考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】チラミンを定量する方
法として従来から一般的に用いられていた高速液体クロ
マトグラフィー法は、ペーパークロマトフラフィー法あ
るいは薄層クロマトグラフィー法に比べれば感度および
精度が高い定量法であるが、分析精度は同時再現性およ
び日差再現性で２％以下にするのは困難である。また高
価な高速液体クロマトフラフィー装置本体が必要であ
り、その充填カラムの保守・交換および展開液の高いイ
オン強度による送液ポンプ付近の腐食等、多くの問題点
および課題をかかえている。

【０００６】一方、アグリカルチャラル・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．）、２９巻、１１７頁 （１９６５年）に記載の細
菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のチラ
ミン酸化酵素を使用する酵素法によるチラミンの定量法
は、上記課題を解決する簡便かつ精度の高い定量法とし
て期待されたが、試料中のチラミン濃度が１０μＭ以下
の場合は、感度が足りず測定不能である難点を有してい
た。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、かかる従
来の定量方法における課題を解決すべく簡便かつ高感度
なチラミンの定量方法を鋭意研究した。その結果、本発
明者らが見いだした新規酵素であるベンジルアミントラ
ンスアミナーゼが以外にもチラミンに対しても活性を発
現することを見いだした。更にこのベンジルアミントラ
ンスアミナーゼとチラミン酸化酵素とを組み合わること
により酵素サイクリングを形成せしめることによって高
感度に試料中のチラミンを定量できることが判り、本発
明を完成させるに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、被検体にベンジルア
ミントランスアミナーゼ、アミノ基供与体、及びチラミ
ン酸化酵素を作用させて酵素サイクリング法による増幅
反応を行い、生じる増幅反応生成物を定量することを特
徴とするチラミンの高感度定量方法である。

【０００９】本発明における酵素サイクリングの反応式
を次式に示す。

【００１０】

【化１】

【００１１】上式に従って酵素サイクリングの反応原理
を説明する。被検体中のチラミンは先ずチラミン酸化酵
素(Tyramine oxidase)によりｐ−ヒドロキシフェニルア
セトアルデヒドに変換され、同時に過酸化水素及びアン
モニアが生成する。次いで変換されたｐ−ヒドロキシフ
ェニルアセトアルデヒドがアミノ基供与体の存在下にベ
ンジルアミントランスアミナーゼ(Benzylamine transam
inase)の触媒作用により元のチラミンに変換され、同時
にα−ケト酸が生成する。この一連の反応が繰り返され
ることにより、過酸化水素、アンモニア、及びα−ケト
酸が増幅生成し蓄積される。これらの増幅反応生成物の
中の少なくとも一つの生成物を定量することにより被検
体中のチラミン量を定量することが可能となる。尚、上
記反応式中では、アミノ基供与体としてＬ−アラニンを
使用しα−ケト酸としてピルビン酸が生成し、また増幅
蓄積される過酸化水素を４−アミノアンチピリン（略
称：４−ＡＡ）／Ｎ−エチル−Ｎ−（−２−ヒドロキシ
−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム
（略称：ＴＯＯＳ）／ペルオキシダーゼ法による色素の
生成で検出する反応を示してある。

【００１２】本発明でいう被検体とは、定量対象である
チラミンを含む尿、血液、血清、血漿、培養物、培養
液、もしくは細胞内液等の液体またはそれらの抽出液を
言う。

【００１３】本発明におけるアミノ基供与体とは、用い
るベンジルアミントランスアミナーゼの基質特異性によ
り決定されるものであり、該酵素の基質になるものであ
れば特に限定されない。該アミノ基供与体を具体的に例
示すると、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン
等である。

【００１４】本発明に使用するベンジルアミントランス
アミナーゼは、１モルのチラミンと１モルのα-ケト酸
に対して作用し、１モルのｐ−ヒドロキシフェニルアセ
トアルデヒドと１モルのアミノ基供与体を生成するもの
であり、またその逆反応として、１モルのｐ−ヒドロキ
シフェニルアセトアルデヒドと１モルのアミノ基供与体
に対して作用し、１モルのチラミンと１モルのα-ケト
酸を生成するものであれば特に限定されず、かかる特性
を有する酵素が制限なく使用される。

【００１５】本発明においてはベンジルアミントランス
アミナーゼの上記逆反応を利用して酵素サイクリングを
形成させ定量に利用するものである。

【００１６】このベンジルアミントランスアミナーゼの
作用を次式に示す。

【００１７】

【化２】

【００１８】このような酵素を例示すれば、エンテロバ
クター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コマモナス（Ｃｏｍａ
ｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）属、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ
ｓ）属、スピリロスポラ（Ｓｐｉｒｉｌｌｏｓｐｏｒ
ａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、
あるいはネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒ
ａ）属等由来の微生物起源のベンジルアミントランスア
ミナーゼが挙げられる。

【００１９】また、本発明に使用するベンジルアミント
ランスアミナーゼはチラミンに対して強く作用し、β−
アラニン、プトレッシン等生体に存在すると思われるア
ミン類、ポリアミン類に対して作用しにくい性質を有す
るものが望ましい。そのような基質特異性の面でチラミ
ンの定量に有利な性質を持つベンジルアミントランスア
ミナーゼとしては、例えば特願平４−３２７８２７号公
報に記載のバチルス・ブレビス Ｂ−１７５（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｂ−１７５，微工研菌寄第１
３３１２号）由来のベンジルアミントランスアミナーゼ
が挙げられる。

【００２０】本発明において用いるチラミン酸化酵素
は、１モルのチラミンを酸化して１モルのｐ−ヒドロキ
シフェニルアセトアルデヒドと１モルの過酸化水素及び
１モルのアンモニア生成する反応を触媒する酵素であれ
ば特に限定されず、かかる特性を有する酵素が制限なく
使用される。また、本発明に使用するチラミン酸化酵素
は、チラミンに対して強く作用し、β−アラニン、プト
レッシン等生体内に存在するアミン類、ポリアミン類に
対して作用しにくい酵素が望ましい。このような基質特
異性の面でチラミンの定量に有利な性質を持つチラミン
酸化酵素を例示すると、メソッズ・イン・エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、第１７Ｂ巻、７２２−７２６頁（１９７１年）に
記載のサルシナ・ルテア（Ｓａｒｃｉｎａ ｌｕｔｅ
ａ、現在の菌名：Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ
ＩＦＯ−１２７０８）由来のチラミン酸化酵素、アル
スロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）
由来のチラミン酸化酵素（旭化成社製、製品名：ＴＹＲ
ＡＭＩＮＥ ＯＸＩＤＡＳＥ「ＴＯＤ」）等の微生物起
源のもの等が挙げられる。

【００２１】本発明におけるチラミン酸化酵素とベンジ
ルアミントランスアミナーゼによる酵素サイクリングに
よる増幅反応生成物とは、前述の酵素サイクリング反応
によって増幅生成される化合物のことであり、過酸化水
素、アンモニア及びα−ケト酸を指す。

【００２２】酵素サイクリング反応によって増幅生成す
るα−ケト酸は、反応に用いるベンジルアミントランス
アミナーゼの基質特異性により決定されるアミノ基供与
体に依存し、用いるアミノ基供与体のアミノ基がカルボ
ニル基に置換された構造を持つ化合物である。例示する
と、アミノ基供与体がＬ−アラニンの場合はα−ケト酸
としてピルビン酸が生成し、前者がグリシンの場合は後
者はグリオキサル酸が、前者がＬ−グルタミン酸の場合
は後者はα−ケトグルタル酸が各々生成する。

【００２３】被検体にベンジルアミントランスアミナー
ゼとチラミン酸化酵素を作用させる条件としては、従来
から知られている酵素の作用条件から適宜選択して採用
すればよいが、一般には、使用するベンジルアミントラ
ンスアミナーゼとチラミン酸化酵素の至適ｐＨ、至適温
度の付近で行い、酵素の活性が最大に発現される条件が
望ましい。

【００２４】反応液量は、通常０．１〜１０ｍｌの範囲
で行われる。

【００２５】ｐＨ条件としては、通常４．０〜１０．５
の範囲が採用されるが、好ましくは６．５〜８．０の範
囲が好適であり、これらの範囲のｐＨを維持するために
通常緩衝液を用いる。該緩衝液の種類は特に限定され
ず、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、あるいはグッド緩衝液等の公知の緩衝液を用いるこ
とができる。これらの緩衝液の濃度は特に限定されない
が、例えば２〜５００ｍＭの範囲が好適に用いられる。

【００２６】温度条件としては、１５〜６０℃の範囲が
一般的であるが、実用面を考慮するならば特に３０〜４
０℃の範囲が好適である。

【００２７】また、本発明で定量に使用するベンジルア
ミントランスアミナーゼとチラミン酸化酵素の量は、酵
素の活性、反応条件、測定対象となるチラミンの濃度等
によって異なり、一概に限定できないが、好ましくは設
定されたチラミン濃度において、増幅反応生成物が所定
の時間内に増幅され、検出、定量されるに充分蓄積され
る酵素量が良い。そのようなベンジルアミントランスア
ミナーゼ量及びチラミン酸化酵素量としては、通常各々
０．１〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で使用されるが、１〜５
０Ｕ／ｍｌの範囲が好適である。

【００２８】この酵素サイクリング反応に用いるアミノ
基供与体の使用量は、使用するベンジルアミントランス
アミナーゼのＫｍ値の５〜２００倍の濃度が好適であ
る。具体的には０．１〜５００ｍＭの濃度範囲がよい。

【００２９】本発明による酵素サイクリング反応は、ア
ミノ基供与体、チラミン、ベンジルアミントランスアミ
ナーゼ、チラミン酸化酵素の４成分が同時に存在しては
じめて反応が逐次的に進行する。従って、通常はこの４
つの成分の内２または３成分を含んだ試液を調製し、反
応設定した条件に達した後、残りの１または２成分を加
えることでサイクリング反応を開始させ、定量に供する
手段が採用される。最後に加える成分は限定されない
が、酵素であるベンジルアミントランスアミナーゼまた
はチラミン酸化酵素、もしくは両酵素を最後に加えるの
が一般的である。

【００３０】チラミンの定量を行う際の酵素サイクリン
グ反応の反応時間は、反応条件、測定対象となるチラミ
ンの濃度等によって異なり、一概に限定できないが、好
ましくは設定された条件において、酵素サイクリング反
応生成物が増幅され、その反応を確認できるに充分な時
間であることが望ましい。そのような反応時間としては
１分〜５時間の範囲が通常採用されるが、特に２分〜３
０分の範囲が好適である。

【００３１】酵素サイクリング反応の停止が必要であれ
ば、予定された時間の後に反応停止試薬を添加すること
によって反応の停止は達成される。反応停止試薬として
は、例えばチラミン酸化酵素およびベンジルアミントラ
ンスアミナーゼの阻害剤である塩化銀等が用いられる。

【００３２】本発明によるチラミンの高感度定量方法で
は、酵素サイクリング反応による増幅反応生成物である
過酸化水素、アンモニア及びα−ケト酸のうち少なくと
もいずれか一つを検知、定量すれば良い。これらの酵素
サイクリングによる増幅反応生成物はいずれも従来から
知られている方法で定量することができる。

【００３３】定量対象増幅反応生成物がアンモニア、あ
るいはα−ケト酸であるα−ケトグルタル酸の場合はＬ
−グルタミン酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＨを用いる酵
素法等で、α−ケト酸がピルビン酸の場合はＬ−乳酸デ
ヒドロゲナーゼとＮＡＤＨを用いる酵素法等で、オキザ
ロ酢酸の場合はオキザロ酢酸デカルボキシラーゼを用い
る酵素法等で定量することができる。

【００３４】定量対象増幅反応生成物が過酸化水素の場
合は、従来から知られている４−アミノアンチピリン−
ペルオキシダーゼ法によって容易に定量することが可能
である。過酸化水素の定量に化学発光法を用いることで
更に高感度な測定法とすることも可能である。

【００３５】いずれを定量する場合でも、既知濃度のチ
ラミン溶液の希釈系列を作り、かかる希釈系列の溶液に
対してあらかじめベンジルアミントランスアミナーゼと
チラミン酸化酵素を作用させ、増幅反応生成物である過
酸化水素、アンモニア及びα−ケト酸のいずれか一つあ
るいは複数を上記の方法で定量し、チラミン量と増幅反
応生成物量との検量線を作成する。次いで、被検体につ
いて同様の方法で増幅生成物量を得て、事前に得られた
検量線からその被検体中のチラミン量を求めることがで
きる。

【００３６】また、被検体中のチラミン量が約１ｍＭ以
下であるときは、基質であるチラミン量と酵素サイクリ
ング反応による増幅反応生成物の生成速度とが比例関係
にあることから、増幅反応生成物生成速度から被検体中
のチラミン量を求めることができる。すなわち、既知濃
度のチラミン溶液の希釈系列を作り、かかる希釈系列の
溶液に対してベンジルアミントランスアミナーゼとチラ
ミン酸化酵素を作用させ、増幅反応生成物である過酸化
水素、アンモニア及びα−ケト酸のいずれか一つあるい
は複数の生成速度を前記の方法で測定し、チラミン量と
増幅反応生成物生成速度との検量線を作成する。次い
で、被検体について同様の方法で増幅生成物生成速度を
得て、前に得られた検量線からその被検体中のチラミン
量を求めることができる。

【００３７】

【作用】本発明に基づくチラミンの高感度定量方法は、
基質となるチラミンをアミノ基供与体の存在下にベンジ
ルアミントランスアミナーゼ及びチラミン酸化酵素の作
用を利用して酵素サイクリングを形成させ、該酵素サイ
クリング反応の結果増幅生成される増幅反応生成物を定
量することを特徴とする。

【００３８】

【発明の効果】本発明によるチラミンの高感度定量方法
は、従来行われていたペーパークロマトグラフィー法の
不正確さや煩雑な操作、高速液体クロマトグラフィー法
の煩雑な保守を行うことなくチラミンを高感度に定量す
ることができる。また、従来のチラミン酸化酵素を用い
る測定法に比較して、酵素サイクリングを行うことで約
１０〜５００倍の高い感度を得ることができる。従っ
て、被検体中のチラミン量が非常に少ない場合でも定量
可能である。この結果、日常の作業としてチラミンの定
量が簡便かつ短時間に、しかも高感度に精度良く実施出
来るようになった。

【００３９】

【実施例】以下実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。

【００４０】製造例１ １．０％グルコース、１．０％ポリペプトン、０．２％
酵母エキス、０．１％食塩、０．１％ベンジルアミン、
及び０．０２％消泡剤（エイノール）、ｐＨ７．０から
なる培地１，５００ｍｌを分注して滅菌（１２０℃、２
０分間）した５，０００ｍｌの三角フラスコにバチルス
・ブレビス Ｂ−１７５（微工研菌寄第１３３１２号）
を植菌した。２８℃で７２時間振とう培養を行った後こ
の培養液を、あらかじめ上記と同様の組成を有する培地
２０リットルを仕込み蒸気滅菌しておいたジャー・ファ
ーメンターに加えて本培養を行った。培養条件は２８
℃、攪拌回数１５０ｒｐｍ、通気速度２０ｌ／分で、７
０時間培養の後、培養液を遠心分離機にかけて菌体を採
取した。得られた菌体約１５０ｇ（湿菌体重量）を１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌに懸濁し、
その懸濁液を超音波破砕機により菌体破砕を行った。そ
の破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、上清液を
得た。この上清液中のベンジルアミントランスアミナー
ゼの総活性は５，１００ユニット、比活性は０．１４ユ
ニット／ｍｇ−タンパクであった。

【００４１】この上清液をあらかじめ２０ｍＭのリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
ス（商品名：ワットマン社製ＤＥ−５２）を充填したカ
ラム（７φｘ４０ｃｍ）に通して酵素を吸着させた。こ
のカラムを１０ｍＭの硫酸アンモニウムを含むリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）５，０００ｍｌで洗浄後、硫酸アン
モニウム濃度が１０ｍＭから２３０ｍＭである同様のリ
ン酸緩衝液の直線濃度勾配（総容量：１０リットル）に
て吸着されたタンパク質を溶出させ、ベンジルアミント
ランスアミナーゼ活性画分を回収した。本活性画分中の
ベンジルアミントランスアミナーゼの総活性は１，４０
０ユニット、比活性は１．２５ユニット／ｍｇ−タンパ
クであった。

【００４２】この活性画分を限外濾過装置を用いて、脱
塩及び濃縮した後、あらかじめ０．２Ｍの硫酸アンモニ
ウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡
化したセファクリルＳ−４００（ファルマシア社製）を
充填したカラム（６．５φｘ１２０ｃｍ）に通し、ゲル
濾過を行い活性画分を集めた。この活性画分中のベンジ
ルアミントランスアミナーゼの総活性は９７０ユニッ
ト、比活性は２．１ユニット／ｍｇ−タンパクであっ
た。

【００４３】得られた精製酵素を１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）にて適当に希釈して調整した酵素標品を
用いて本酵素の基質特異性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至
適温度、温度安定性を調べた。

【００４４】〔基質特異性〕０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）を０．７４ｍｌ、５０ｍＭのピルビン酸溶液
を０．１ｍｌ、５ｍＭのピリドキサールリン酸溶液を
０．０６ｍｌ、及び各種のアミノ基供与体となるアミン
類あるいはアミノ酸類の１００ｍＭ溶液を０．０５ｍｌ
からなる反応液に、酵素標品０．０５ｍｌ（０．０５ユ
ニット）を添加し、３０℃で３０分間反応させた。反応
液を沸騰した水浴に３０秒間浸して酵素を失活させた
後、遠心分離により沈澱物を除去し澄透溶液を得た。こ
の澄透液をアミノ酸分析機にインジェクションしてＬ−
アラニンを定量分析した。これらのアミノ基供与体に対
するベンジルアミントランスアミナーゼの作用の強さ
を、ベンジルアミンに対する作用を１００％とした相対
活性値で表示したものを表１に示す。

【００４５】 〔至適ｐＨ〕０．２Ｍ各種緩衝液（ｐＨ４．５〜６．
５：クエン酸緩衝液；ｐＨ６．０〜８．０：リン酸緩衝
液；ｐＨ７．５〜９．０：トリス−塩酸緩衝液；ｐＨ
９．０〜１１．５：グリシン−苛性ソーダ緩衝液）を
０．５ｍｌ、５ｍＭのピリドキサールリン酸溶液を０．
１ｍｌ、５０ｍＭのピルビン酸溶液を０．１ｍｌ、１０
０ｍＭのベンジルアミン塩酸溶液を０．０５ｍｌからな
る反応液に酵素標品０．１ｍｌ（０．０５ユニット）を
添加し、３７℃で５分間反応させ、２５０ｎｍにおける
ベンズアルデヒドの吸収の増加に基づいて酵素活性を求
めた。以上の操作の後、最大の酵素活性値を１００％と
した相対活性値を算出して図１を得た。図１より、本酵
素の至適ｐＨは７．５〜８．５の範囲にあることがわか
る。

【００４６】〔ｐＨ安定性〕０．２Ｍ各種緩衝液（ｐＨ
４．５〜６．５：クエン酸緩衝液；ｐＨ６．５〜８．
０：リン酸緩衝液；ｐＨ７．５〜９．０：トリス−塩酸
緩衝液；ｐＨ８．０〜１０．５：グリシン−苛性ソーダ
緩衝液）０．９５ｍｌに０．０５ｍｌの酵素標品（０．
４ユニット）を混合し、３０℃で６０分間放置した後、
各溶液０．０２５ｍｌを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）０．５ｍｌ、５ｍＭピリドキサールリン酸溶液
０．１ｍｌ、５０ｍＭピルビン酸溶液０．１ｍｌ、１０
０ｍＭのベンジルアミン塩酸溶液０．０５ｍｌからなる
活性測定溶液に分注し混和し、３７℃で５分間反応さ
せ、２５０ｎｍにおけるベンズアルデヒドの吸収の増加
から、酵素活性を求めた。最大の酵素活性値を１００％
とした相対活性値を算出して図２を得た。図２から明ら
かなように、本酵素はｐＨ５．５〜８．５の範囲で安定
である。

【００４７】〔至適温度〕０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）０．５ｍｌ、５ｍＭピリドキサールリン酸溶液
０．１ｍｌ、５０ｍＭピルビン酸溶液０．１ｍｌ、１０
０ｍＭのベンジルアミン塩酸溶液０．０５ｍｌからなる
活性測定溶液に０．１ｍｌ（０．０５ユニット）を添加
し、２５，３０，３５，３７，４０，４５，５０，５
５，６０，６５，７０，７５，８０℃の各温度下におい
て、５分間反応させ、２５０ｎｍにおけるベンズアルデ
ヒドの吸収の増加から、酵素活性を求めた。最大の酵素
活性値を１００％とした相対活性値を算出して図３を得
た。図３より、本酵素の至適温度は５０℃であることが
わかる。

【００４８】〔温度安定性〕１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で希釈した酵素標品０．２ｍｌ（０．０４ユ
ニット）を２５，３０，３５，４０，４５，５０，５
５，６０，６５，７０℃の各温度で１０分間処理した。
この酵素溶液０．０５ｍｌを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）０．５ｍｌ、５ｍＭピリドキサールリン酸溶
液０．１ｍｌ、５０ｍＭピルビン酸溶液０．１ｍｌ、１
００ｍＭのベンジルアミン塩酸溶液０．０５ｍｌからな
る活性測定溶液に分注し混和し、３７℃で５分間反応さ
せ、２５０ｎｍにおけるベンズアルデヒドの吸収の増加
から、酵素活性を求めた。最大の酵素活性値を１００％
とした相対活性値を算出して図４を得た。図４から明ら
かなように、本酵素は５０℃までの温度において安定で
ある。

【００４９】実施例１ 製造例１において得られた精製ベンジルアミントランス
アミナーゼを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて
希釈し調製した酵素標品、旭化成社製のアルスロバクタ
ー属由来のチラミン酸化酵素（製品名：ＴＹＲＡＭＩＮ
Ｅ ＯＸＩＤＡＳＥ「ＴＯＤ」）、及び被検体として
１．０μｍｏｌｅ／Ｌのチラミン溶液を用いて酵素サイ
クリングを行わしめ、増幅反応生成物の一つである過酸
化水素の生成量と反応時間との関係を調べた。

【００５０】光路幅１ｃｍのキュベット中に被検体とし
て用いる１．０μｍｏｌｅ／Ｌのチラミン塩酸溶液を
０．５ｍｌ、２００ｍＭのＬ−アラニン、０．３ｍＭの
ピリドキサルリン酸、１ｍＭのＮ−エチル−Ｎ−（−２
−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジ
ンナトリウム、１ｍＭの４−アミノアンチピリン、及び
１０Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼを含む１００ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ分注混和後、３０
℃下で２分間加温した。加温後、このキュベットに製造
例１にて得られた２Ｕ／ｍｌのベンジルアミントランス
アミナーゼ及び０．５Ｕ／ｍｌのチラミン酸化酵素を含
む酵素溶液を１００μｌを添加混和し、３０℃下で反応
させ、過酸化水素の増加量に相当する５５５ｎｍの吸光
度を測定し、反応時間と吸光度との関係を調べた。結果
を図５に示す。比較例として、酵素サイクリングを行わ
ない場合を、ベンジルアミントランスアミナーゼを加え
ない以外は実施例１と全く同じ条件、同じ操作を行って
吸光度を測定した。この比較例の結果（−ベンジルアミ
ントランスアミナーゼとして表示）も図５に示す。

【００５１】図５より、ベンジルアミントランスアミナ
ーゼを加えない場合に比べ、本発明による酵素サイクリ
ングを行なわしめる方法がチラミンを高感度に検出でき
ることが分かる。

【００５２】実施例２ 製造例１において得られた精製ベンジルアミントランス
アミナーゼを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて
希釈し調製した酵素標品と、旭化成社製のアルスロバク
ター属由来のチラミン酸化酵素（製品名：ＴＹＲＡＭＩ
ＮＥ ＯＸＩＤＡＳＥ「ＴＯＤ」）とを用いて、チラミ
ン濃度と増幅反応生成物の一つである過酸化水素の生成
量との相関を示す検量線を下記方法により作成した。

【００５３】光路幅１ｃｍのキュベット中に０，２０
０，４００，６００，８００，１０００，１２００ｎｍ
ｏｌｅ／Ｌ濃度の各チラミン塩酸溶液を０．５ｍｌ、及
び２００ｍＭのＬ−アラニン、０．３ｍＭのピリドキサ
ルリン酸、１ｍＭのＮ−エチル−Ｎ−（−２−ヒドロキ
シ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウ
ム、１ｍＭの４−アミノアンチピリン、及び１０Ｕ／ｍ
ｌのペルオキシダーゼを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）を０．５ｍｌを加え混和後、３０℃下で２分
間加温した。これらのキュベット各々に製造例１にて得
られた２Ｕ／ｍｌのベンジルアミントランスアミナーゼ
及び０．５Ｕ／ｍｌのチラミン酸化酵素を含む酵素溶液
を１００μｌを添加混和し、３０℃下で２０分間反応さ
せ、過酸化水素の増加量に相当する５５５ｎｍの吸光度
を測定し、チラミン濃度と吸光度との関係を示す検量線
を得た（図６）。比較例として、酵素サイクリングを行
わない場合を、ベンジルアミントランスアミナーゼを加
えない以外は実施例１と全く同じ条件、同じ操作を行っ
て吸光度を測定した。この比較例の結果（−ベンジルア
ミントランスアミナーゼとして表示）も図６に示す。

【００５４】図６より、チラミンの検量線の直線性がよ
く、本発明の方法がチラミンを高感度に検出でき、かつ
精度の高い定量法であることがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のベンジルアミントランスアミナーゼ
のｐＨ活性曲線を示す図である。

【図２】 同酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図３】 同酵素の温度活性曲線を示す図である。

【図４】 同酵素の温度安定性を示す図である。

【図５】 本発明に従って酵素サイクリングを行った場
合と酵素サイクリングを行わない場合（−ベンジルアミ
ントランスアミナーゼと表示）の反応曲線を示す。

【図６】 本発明に従って酵素サイクリングを行わしめ
たチラミン定量用検量線、及び比較例として酵素サイク
リングを行わなかった場合のチラミン定量用検量線であ
る。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検体にベンジルアミントランスアミナ
   ーゼ、アミノ基供与体、及びチラミン酸化酵素を作用さ
   せて酵素サイクリング法による増幅反応を行い、生じる
   増幅反応生成物を定量することを特徴とするチラミンの
   高感度定量方法。