JP2713783B2

JP2713783B2 - 高感度測定法

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Publication number: JP2713783B2
Application number: JP31875689A
Authority: JP
Inventors: 昌人岡田; 佳典吉村; 峰登長谷
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1989-12-11
Publication date: 1998-02-16
Anticipated expiration: 2013-02-16
Also published as: JPH03180200A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はプトレッシン及び／またはカダベリンも極め
て感度よく定量する新規な方法に関するものであり、生
体内の各臓器の様子についての検査に対しても有効であ
り、例えば臨床検査などの医療の分野において広く利用
することができる。

［従来の技術］従来、プトレッシンやカダベリンの定量には高速液体
クロマトグラフ装置を用いる方法や酵素的比色定量法あ
るいは化学発光を利用する方法が用いられてきた。

［発明が解決しようとする課題］近年、分析化学の一つの命題ともいうべき微量試料を
精度よく測定する方法の開発が盛んに行われてきてお
り、医学上重要な代謝成分であるプトレッシンやカダベ
リンの極微量定量についてもその測定法の開発が望まれ
ていた。高感度測定法は蛍光測定、発光測定などの種々
の方法が開発されているが、検体が体液のような場合、
体液中に含まれる物質により盲検値が上昇したりクエン
チングによる誤差が生じやすい。高速液体クロマトグラ
フィーや酵素的比色定量法では定量限界はたかだか約１
μＭである。また化学発光法ではnM領域の測定が可能で
あるが、測定に特殊な装置が必要であるという欠点を有
していた。

一方、酵素サイクリング法の原理そのものは従来より
知られていた方法である（生化学実験講座５、酵素研究
法、上、121−135、日本化学会編、東京化学同人）がプ
トレッシンやカダベリンの微量分析に応用した技術とし
ては知られていなかった。

［課題を解決するための手段］本発明者らは、上記従来の欠点を解決すべく鋭意研究
した結果、プトレッシントランスアミナーゼを従来の酵
素的定量系に基質と共に添加し作用させることによって
酵素サイクリングを形成し、実際の測定対象である過酸
化水素とアンモニア及α−ケト酸を増幅発生させること
ができることを見出して、本発明を完成させるに至っ
た。

即ち、本発明はプトレッシン及び／またはカダベリン
に、プトレッシントランスアミナーゼとアミノ基供与体
及びポリアミンの酸化酵素を作用させて、酵素サイクリ
ング法による増幅反応を行い、生じたサイクリング反応
生成物を測定することを特徴とするプトレッシン及び／
またはカダベリンの高感度測定法である。

本発明に使用されるプトレッシントランスアミナーゼ
とはプトレッシンやカダベリンが酸化されて生成したω
−アミノアルキルアルデヒドにアミノ基を転移させ、プ
トレッシンやカダベリンを再生させる酵素をいい、酵素
サイクリング系を成立させるために必要な酵素である。
そのような酵素として、以下に示すように従来から知ら
れていたいくつかのプトレッシントランスアミナーゼが
ある。即ち、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、239巻、783頁（1964年）に記載のエシェリヒ
ア・コリーＢ由来のジアミン：α−ケトグルタル酸トラ
ンスアミナーゼやアグリカルチャラル・バイオロジカル
・ケミストリー、43巻、1043頁（1979年）に記載のシュ
ードモナス属細菌Ｆ−126由来のω−アミノ酸：ピルビ
ン酸トランスアミナーゼあるいはジャーナル・オブ・バ
クテリオロジー、128巻、722頁（1976年）に記載のシュ
ードモナス・アエルギノサ由来のγ−アミノ酪酸：α−
ケトグルタル酸トランスアミナーゼである。

これらのプトレッシントランスアミナーゼを使用する
こともできるが、酵素のKm値やpH安定性，熱安定性等の
点で優れている特願平１−45416号に記載のプトレッシ
ン：ピルビン酸トランスアミナーゼを用いる方が有利で
ある。

以下にプトレッシン：ピルビン酸トランスアミナーゼ
について詳しく述べる。

作用次式に示す通り、アミノ基供与体であるプトレッシン
とアミノ基受容体であるピルビン酸に作用して、４−ア
ミノブタナールとＬ−アラニンを生成するアミノ基転移
反応、及びその逆反応を触媒する。

NH₂（CH₂）₄NH₂＋CH₃COCOOH NH₂（CH₂）₃CHO＋CH₃CH（NH₂）COOH 基質特異性（１）アミノ基供与体プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミ
ンに対して作用し、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチンに対し
ては、作用を示さない。

（２）アミノ基受容体ピルビン酸、グルオキシル酸に対して作用し、α−ケ
トグルタル酸に対しては作用しない。

これらのアミノ基供与体及びアミノ基受容体に対する
作用の強さを、それぞれプトレッシン及びピルビン酸に
対する作用を100とした相対活性値で第１表に示す。

至適pH pH9.5〜10.5（第１図に示す） pH安定性 30℃で１時間保存した時、pH4.5〜13.0に
おいて90％以上の残存活性を有する。（第２図に示す）また、プトレッシン：ピルビン酸トランスアミナーゼ
が有するその他の理化学的性質は以下の通りである。

1.至適温度 PH10.5、30分間の反応において、55−60℃
である。（第３図に示す） 2.温度安定性 PH7.5、１時間の処理条件下において、7
0℃までの温度で90％以上の残存活性を有する。また、8
0℃、１時間の処理で完全に失活する。（第４図に示
す） 3.分子量 192,000±5,000（バイオシル TSK−250;東
ソー社製によるゲル濾過法で測定） 4.サブユニットの分子量 48,000±5,000（SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で測定） 5.サブユニットの数４個 6.Km値プトレッシンとピルビン酸を基質として、PH1
0.5、30℃の条件下で求めたプトレッシンに対するKm値
は0.2mMであり、ピルビン酸に対するKm値は1.0mMであ
る。

7.補酵素ピリドキサルリン酸 8.吸収スペクトル 280nm及び416nmに吸収極大を持つ。
（第５図に示す） 9.阻害剤種々の試薬及び金属イオンの濃度1mMでの酵
素に対する影響を第２表に示す。ヒドロキシルアミン、
フェニルヒドラジン、Ｄ−シクロセリンなどのピリドキ
サルリン酸を補酵素とする酵素阻害剤により強く阻害を
受ける。また、パラクロロメルクリ安息香酸、銀イオ
ン、水銀イオンにより強く阻害される。

プトレッシンピルビン酸トランスアミナーゼと従来
から知られている、プトレッシンに作用し得るトランス
アミナーゼの理化学的性質を比較した結果を第３表に示
す。

第３表における従来のトランスアミナーゼとは、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.）、239巻、783頁（1964年）に記載のエシェリ
ヒア・コリーＢ（Escherichiacoli B）由来のジアミ
ン：α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、アグリカ
ルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Bi
ol.Chem.）、43巻、1043頁（1979年）に記載のシュード
モナス（Pseudomonas）属細菌Ｆ−126由来のω−アミノ
酸：ピルビン酸トランスアミナーゼ、さらにジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、128巻、7
22頁（1976年）に記載のシュードモナス・アエルギノサ
（Pseudomonas aeruginosa）由来のγ−アミノ酪酸：α
−ケトグルタル酸トランスアミナーゼである。

第３表からわかるように、プトレッシン：ピルビン酸
トランスアミナーゼは、従来から知られていたプトレッ
シントランスアミナーゼとは基質特異性の異にする酵素
である。

また、常温で生育する放線菌であるストレプトミセス
属に属する微生物から得られたにも関わらず、70℃、１
時間の熱処理によっても90％以上の残存活性を有すると
いう高い耐熱性を持っている。また、pH4.5〜13.0の広
いpH範囲で安定であるという優れた性質を持っているこ
とも判明した。プトレッシン：ピルビン酸トランスアミ
ナーゼが以上のように耐熱性、pH安定性に優れているこ
とは、工業的にあるいは臨床検査分野にこの酵素を用い
る際に大変有用な性質である。

プトレッシン：ピルビン酸トランスアミナーゼの酵素
活性測定方法及び酵素活性の表示方法は以下の通りであ
る。

2mMのプトレッシン、2mMピルビン酸及び0.02％ｏ−ア
ミノベンズアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
5）2.0mlとプトレッシン：ピルビン酸トランスアミナー
ゼを含有する被検体0.2mlを混合し、30℃で30分間〜１
時間反応させた後、直ちに435nmにおける吸光度を測定
する。１分間当りの吸光度の増加量（Ａ）から以下の換
算式（１）を使用して被検体1.0ml当りのプトレッシ
ン：ピルビン酸トランスアミナーゼの酵素活性値を計算
する。酵素活性値は、１分間当り１μ moleの１−ピロ
リンを生成させる酵素量を１ユニット（μ mole/min）
として表示する。

プトレッシン：ピルビン酸トランスアミナーゼの完全
に純化された酵素の比活性値は、約4.5ユニット/mg−タ
ンパクを示す。また、ドデシル硫酸ナトリウムの存在、
非存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法におい
て両者共に単一のタンパクバンドが観測される。

本発明におけるアミノ基供与体は、ω−アミノアルキ
ルアルデヒドからプトレッシンやカダベリンを再生させ
るために必要なプトレッシントランスアミナーゼの基質
であれば、酵素の作用に応じて如何なるものでも使用す
ることができる。具体的には、Ｌ−アラニン、グリシ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等が挙げら
れる。また、ω−アミノアルキルアルデヒドとは、４−
アミノブタナール及び５−アミノペンタナールであっ
て、水溶液中では１−ピロリン及び2,3,4,5,−テトラヒ
ドロピリジンと平衡状態にある。

本発明においてポリアミンの酸化酵素はプトレッシン
やカダベリンを酸化してω−アミノアルキルアルデヒド
と過酸化水素及びアンモニアを生成する反応を触媒する
酵素であれば、特に限定されず、かかる特性を有する公
知の酵素が特に制限なく使用される。例えば、ミクロコ
ッカス属，ノカルディア属，アスペルギルス属，シュー
ドモナス属等の微生物起源のプトレッシンオキシダー
ゼ、発芽大豆等の植物起源のプトレッシンオキシダー
ゼ、ブタ腎等の動物起源のジアミンオキシダーゼ等が挙
げられる。

また、サイクリング反応生成物とは、酵素サイクリン
グ反応によって増幅生成され得る化合物のことであり、
過酸化水素，アンモニア及びα−ケト酸を指す。α−ケ
ト酸としてはアミノ基供与体から生成したグリオキシル
酸かピルビン酸かオキザロ酢酸もしくはα−ケトグルタ
ル酸などが挙げれる。

上記本発明における反応の原理について例示すれば次
式の通りである。

なお、本発明により、プトレッシン及びカダベリンを
生成する化合物、或は４−アミノブタナール及び５−ア
ミノペンタナールはプトレッシン及びカダベリンに変換
され得るので、これらのω−アミノアルキルアルデヒド
を生成する化合物もまた高感度に測定するひとができ
る。そのような具体例として、スペルミジンにミクロコ
ッカス・ローゼウスやシュードモナス・フルオレッセン
ス由来のプトレッシンオキシダーゼを作用させて４−ア
ミノブタナールを生成し、次いで酵素サイクリング反応
を行う場合、或はスペルミジンやスペルミンにペニシリ
ウム・クリンゲナムやラット肝由来のポリアミンオキシ
ダーゼを作用させてプトレッシンを生成し、次いで酵素
サイクリングを行う場合等があげられる。

酵素サイクリング法によて増幅されたサイクリング生
成物はいずれも従来から知られている方法で定量するこ
とができる。例えば、アンモニア及びα−ケトグルタル
酸はＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼとNADHを用いる
酵素法等で，ピルビン酸はＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ法
等で，オキザロ酢酸はオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ
法等で定量できる。過酸化水素の定量は例えば、従来か
ら知られている４−アミノアンチピリン−ペルオキシダ
ーゼ法によって容易に行うことができる。サイクリング
反応生成物のうちで、過酸化水素を定量することは高感
度に測定できるという点で有利である。

また、増幅された過酸化水素を化学発光法で測定する
ことによって更に高感度な測定法とすることも可能であ
る。

上記のサイクリング反応についてその反応液量は通常
0.1〜5mlの範囲で行われる。被測定ポリアミンであるプ
トレッシンあるいはカダベリンの定量可能な最低濃度は
１〜10nM程度である。

プトレッシントランスアミナーゼの使用濃度は通常反
応液1ml当たり0.5〜50ユニツトの範囲である。

アミノ基供与体は通常５〜50mMの濃度範囲で使用され
る。

ポリアミンの酸化酵素の使用濃度は通常反応液1ml当
たり0.5〜50ユニツトの範囲である。

通常、これらの酵素及び試薬は同一溶液内に同時に存
在させて酵素サイクリング反応を形成させる。

上記の反応はプトレッシントランスアミナーゼとポリ
アミンの酸化酵素の両酵素が作用し得るpH範囲、温度範
囲で行われ、通常はpH6〜9,反応温度は25℃ 〜45℃である。

反応の時間はサイクリング反応生成物を検出可能なま
で充分に増幅生成させる時間の範囲で任意に設定できる
が、他の反応条件によって左右され、通常は10分〜５時
間の範囲である。

酵素サイクリング反応の停止は予定された時間の終わ
りに停止試薬を添加することによって行われ、停止試薬
としては1,8−ジアミノオクタンやピルビン酸等が用い
られる。

［効果］本発明のプトレッシン及び／またはカダベリンの高感
度測定方法は、簡便な操作で極微量のプトレッシン及び
／またはカダベリンを正確に定量することができる方法
を提供するものであり、臨床検査などの医療の分野に大
きく貢献することが期待される。例えば、血清中のポリ
アミン分析への応用等を可能にする。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、こ
れにより本発明を限定するものではない。

［実施例］製造例１ 0.5％グルコース、0.4％ポリペプトン、0.5％魚肉エ
キス、0.3％アセチルプトレッシン、0.2％食塩、0.02％
消泡剤から成る培地（pH7.5）１を５の三角フラス
コに入れ、120℃で20分間オートクレーブした後、28℃
下でこの培地にストレプトミセス・アベラニウムＲ−20
［微工研菌寄第5443号］を植菌した。28℃で24時間振
とう培養を行った後この培養液を、予め上記と同様の組
成を有する培地150を仕込み滅菌しておいたジャー・
ファーメンターに加えて本培養を行った。培養条件は28
℃、撹拌回転数300rpm、通気100/minで、18時間培養
の後、培養液を遠心分離機にかけて菌体を採取した。

得られた菌体の約2.7Kg（湿菌体重量）を40％エタノ
ールを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.5）12に懸濁し、
その懸濁液をダイノミル細胞破砕機に連続的に通過させ
て菌体破砕を行った。その破砕液を連続遠心分離機を使
用して遠心分離し、上清液を得た。この上清液中のプト
レッシン：ピルビン酸トランスアミナーゼの総活性は2
2,000ユニツト、比活性は0.072ユニツト/mg−タンパク
であった。

この上清液を、予め10mMのリン酸緩衝液（pH7.5）に
て平衡化した４のDEAE−セルロース（ワットマン社
製）に加え、１時間撹拌した後40mMの硫酸アンモニウム
を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.5）15で洗浄した。次
いで、0.5Mの食塩を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.5）５
で酵素成分を溶出させた。［総酵素活性＝15,400ユニ
ツト、比活性＝0.56ユニツト/mg−タンパク］この酵素溶液を限外濾過により脱塩した後、65℃で30
分間熱処理を行い、生じた沈澱を遠心分離により除い
た。［総酵素活性＝12,200ユニツト、比活性＝2.1ユニ
ツト/mg−タンパク］こうして得られた酵素液を、予め10mMリン酸緩衝液
（pH7.5）で平衡化しておいた１のDEAE−セルロース
のカラムに通し吸着させた。カラムを同様の緩衝液２
で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配によりプトレッシ
ン：ピルビン酸トランスアミナーゼを溶出させた。［総
酵素活性＝8,820ユニツト、比活性＝3.5ユニツト/mg−
タンパク］この溶出液を限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモ
ニウムを20％となるように添加し、次いで予め20％の硫
酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.5）で平
衡化しておいた0.1のブチルトヨパール650M（東ソー
社製）のカラムに通し、酵素を吸着させた。カラムを同
様のリン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモニウムの逆
直線濃度勾配によりプトレッシン：ピルビン酸トランス
アミナーゼを溶出させた。［総酵素活性＝7.430ユニツ
ト、比活性＝4.4ユニツト/mg−タンパク］得られた酵素溶液を限外濾過により濃縮した後、1.7
のセファクリルＳ−400（ファルマシア社製）を充填
したカラムに通しゲル濾過を行い活性画分を集めた。
［総酵素活性＝7,360ユニツト、比活性＝4.5ユニツト/m
g−タンパク］こうして得られた酵素の純度をドデシル硫酸ナトリウ
ム存在下、及び非存在下でのポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動によって調べた結果、両者共に一本のバンドの
みが観察され、純粋なプトレッシン：ピルビン酸トラン
スアミナーゼであることが確認された。

また、本酵素の分子量をバイオシルTSK−250（東ソー
社製）によるゲル濾過法により測定したところ、約192,
000と推定された。さらに、サブユニットの分子量をド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気
泳動法により測定したところ、約48,000と推定された。
該分子量及びサブユニットの分子量から、プトレッシ
ン：ピルビン酸トランスアミナーゼが４個のサブユニッ
トから構成されるオリゴマー酵素であることがわかる。

次に、こうして得られた精製酵素を20mMリン酸緩衝液
（pH7.5）により適当な濃度に希釈して調製した酵素標
品を用いて本酵素の至適pH、pH安定性、至適温度、温度
安定性、及び吸収スペクトルを調べた。

［至適pH］ 2mMプトレッシン、2mMピルビン酸を含む0.1M酢酸緩衝
液（pH3.2,4.4,5.7）または0.1Mリン酸緩衝液（pH5.0,
6.0,7.0,7.5）または0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン−塩酸緩衝液（pH7.0,8.2,9.2）または0.1
M炭酸緩衝液（pH9.0,9.4,10.6,11.7）または0.1M四ホウ
酸緩衝液（pH10.5,11.4,12.1,13.0）1.8mlに0.2mlの酵
素標品（0.002ユニツト）を添加混合し、30℃下で30分
間反応を行った。この反応溶液1.0mlに20％トリクロロ
酢酸水溶液を0.2ml加え、０℃下で20分間放置した。次
いで、0.02％ｏ−アミノベンズアルデヒドを含む0.5Mリ
ン酸緩衝液（pH7.5）1.0mlを加えて室温で30分間放置し
た後、435nmに於ける吸光度を測定し、それぞれの酵素
活性値を算出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値
を100％とした相対活性（Relative activity）を算出
し、グラフ化して第１図を得た。第１図により、本酵素
の至適pHは9.5〜10.5の範囲にあることがわかる。

［pH安定性］ 50mM酢酸緩衝液（pH3.5,4.5,5.5,5.9）または50mMリ
ン酸緩衝液（pH5.6,6.2,6.7,7.5,8.3）または50mMトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（pH
7.6,8.1,8.9）または50mMホウ酸緩衝液（pH8.2,9.3,9.
9）または50mM炭酸緩衝液（pH9.4,10.6,11.7）または50
mM四ホウ酸緩衝液（pH10.8,12.7,13.2,13.7）0.95mlと
酵素標品0.05ml（50ユニツト）を混合し、30℃で１時間
放置した後、各溶液0.02mlを20mlリン酸緩衝液（pH7.
5）1.98mlを混合した。この酵素溶液0.2mlを2mMプトレ
ッシン、2mMピルビン酸及び0.02％ｏ−アミノベンズア
ルデヒドを含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）2.0mlに
加えて、30℃で１時間反応させた後直ちに435nmにおけ
る吸光度を測定し、それぞれの酵素活性値を算出した。
以上の操作の後、最高の酵素活性値を100％とした相対
活性を算出し、グラフ化して第２図を得た。第２図から
明らかなように、本酵素はpH4.5〜13.0の範囲において9
0％以上の残存活性を有している。

［至適温度］ 25mMプトレッシン及び25mMピルビン酸を含む0.1M炭酸
緩衝液（pH10.5）1.8mlと0.2mlの酵素標品（0.013ユニ
ツト）を混合し、30,39,44,50,56,60,68,79℃の各温度
下において30分間反応させた。各反応溶液1mlに20％ト
リクロロ酢酸溶液0.2mlを加え、０℃下で20分間放置し
た。次いで、0.02％のｏ−アミノベンズアルデヒドを含
む0.5Mリン酸緩衝液（pH7.5）1.0mlを加えて室温で30分
間放置した後、435nmにおける吸光度を測定し、それぞ
れの酵素活性値を算出した。以上の操作の後、最高の酵
素活性値を100％とした相対活性を算出し、グラフ化し
て第３図を得た。第３図より、本酵素の至適温度が55〜
60℃であることがわかる。

［温度安定性］ 25mMリン酸緩衝液（pH7.5）で希釈した酵素標品（0.0
34ユニツト/ml）を4,30,40,50,60,70,75,80℃の各温度
で１時間放置した。この酵素溶液0.2mlを2mMプトレッシ
ン、2mMピルビン酸及び0.02％ｏ−アミノベンズアルデ
ヒドを含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）2.0mlに加え
て、30℃で１時間反応させた後直ちに435nmにおける吸
光度を測定し、それぞれの酵素活性値を算出した。以上
の操作の後、最高の酵素活性値を100％とした相対活性
を算出し、グラフ化して第４図を得た。第４図から明ら
かなように、本酵素は70℃までの温度において90％以上
の残存活性を有している。

［吸収スペクトル］精製酵素を20mMリン酸緩衝液（pH7.5）で希釈して調
製した酵素標品−（ａ）（180μg/ml）を用いて、紫外
部領域での吸収スペクトルを測定して第５図−（ａ）を
得た。同様にして調製した酵素標品−（ｂ）（910μg/m
l）を用いて、可視部領域での吸収スペクトルを測定し
て第５図−（ｂ）を得た。第５図より、本酵素が280n
m、416nmに吸収極大を有することがわかる。

実施例１種々の濃度のプトレッシン水溶液2.0mlに、100mMトリ
ス・塩酸緩衝液（pH8.0）,1.0mM2,4−ジクロロフェノー
ル,0.6mM4−アミノアンチピリン，ミクロコッカス・フ
ラビダス由来のプトレッシンオキシダーゼ（５ユニツ
ト），ストレプトミセス・アベラニウムＲ−20由来のプ
トレッシン：ピルビン酸トランスアミナーゼ（６ユニツ
ト），ペルオキシダーゼ（１ユニツト）及び15mM Ｌ−
アラニンから成るサイクリング液2.0mlを加え、37℃で3
0分間反応させた。20mM1,8−ジアミノオクタン溶液（10
0mMトリス・塩酸緩衝液,pH8.0）0.1mlを添加して反応を
停止させた後、510nmでの吸光度を測定することによっ
て増幅生成した過酸化水素を定量した。盲検としてプト
レッシン水溶液のかわりに水2.0mlを用いた。

その結果は第６図（Ａ）に示す通りであって、極めて
良好な直線が得られ、サイクリング反応が正確に行われ
ていることを示している。また、第６図はこの方法が非
常に高感度であることを示しており、その感度はサイク
リング反応を行わせなかった場合の約100倍であった。

実施例２種々の濃度のプトレッシン水溶液2.0mlのかわりに種
々の濃度のカダベリン水溶液2.0mlを用いた以外は、実
施例１と同様の操作を行って得られた結果は第６図
（Ｂ）に示す通りである。検量線は良好な直線であり、
測定感度はサイクリング反応が行わせなかった場合の約
25倍であった。

比較例１プトレッシン：ピルビン酸トランスアミナーゼを添加
しなかった以外は、実施例１及び実施例２と同様の操
作を行って得られた結果は第６図（Ｃ）及び（Ｄ）に示
す通りであって定量限界以下であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プトレッシン：ピルビン酸トランスアミナー
ゼのpH活性曲線（○ 酢酸緩衝液、△ リン酸緩衝液、
□ トリス−塩酸緩衝液、● 炭酸緩衝液、▲ 四ホウ
酸緩衝液）を示し、第２図は同じくpH安定性（○ 酢酸
緩衝液、△ リン酸緩衝液、□ トリス−塩酸緩衝液、 ● ホウ酸緩衝液、▲ 炭酸緩衝液、■ 四ホウ酸緩衝
液）であり、第３図は温度活性曲線を、第４図は温度安
定性を、第５図は（ａ）が紫外部領域での、（ｂ）が可
視部領域での吸収スペクトルをそれぞれ示すものであ
る。第６図は、（Ａ）が本発明によるプトレッシンを定
量した際の検量線を、（Ｂ）が本発明によるカダベリン
を定量した際の検量線を、（Ｃ）がサイクリング反応を
行わせずにプトレッシンを定量した際の結果を、（Ｄ）
がサイクリング反応を行わせずにカダベリンを定量した
際の結果をそれぞれ示すものである。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】プトレッシン及び／またはカダベリンに、
プトレッシントランスアミナーゼ，アミノ基供与体，及
びポリアミンの酸化酵素を作用させて酵素サイクリング
法による増幅反応を行い、生じたサイクリング反応生成
物を測定することを特徴とするプトレッシン及び／また
はカダベリンの高感度測定法。