JP2698056B2 - Ｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素 - Google Patents
Ｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−ピログルタミン酸
と水とからＬ−グルタミン酸を生成する反応（本明細書
において、Ｌ−ピログルタミン酸開環反応と称する場合
がある）、及びその逆反応（本明細書において、Ｌ−グ
ルタミン酸閉環反応と称する場合がある）を触媒する酵
素及びその製造方法、並びに該酵素の使用に関する。
と水とからＬ−グルタミン酸を生成する反応（本明細書
において、Ｌ−ピログルタミン酸開環反応と称する場合
がある）、及びその逆反応（本明細書において、Ｌ−グ
ルタミン酸閉環反応と称する場合がある）を触媒する酵
素及びその製造方法、並びに該酵素の使用に関する。
【０００２】本発明の酵素は、Ｌ−ピログルタミン酸か
らのＬ−グルタミン酸の生成（例えば食品中のＬ−ピロ
グルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換することによる
食品の旨味の向上）、Ｌ−グルタミン酸からのＬ−ピロ
グルタミン酸生成、これらの反応を利用したＤ，Ｌ−グ
ルタミン酸からＤ−及びＬ−グルタミン酸の単離、試料
中のＬ−ピログルタミン酸の定量等において有用であ
る。
らのＬ−グルタミン酸の生成（例えば食品中のＬ−ピロ
グルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換することによる
食品の旨味の向上）、Ｌ−グルタミン酸からのＬ−ピロ
グルタミン酸生成、これらの反応を利用したＤ，Ｌ−グ
ルタミン酸からＤ−及びＬ−グルタミン酸の単離、試料
中のＬ−ピログルタミン酸の定量等において有用であ
る。
【０００３】
【従来の技術】ピログルタミン酸（５−オキソプロリ
ン）は１８８２年に発見されて以来（L.Haitinger et a
l, Monatsch Chem., ３, 228 (1882)) 、さまざまな研
究がされている。ピログルタミン酸は糖蜜や様々な野
菜、ビール、タバコ、尿、血漿、骨等に広く存在が知ら
れている。ピログルタミン酸は非常に毒性が少なく、様
々な分野で利用されている。例えば、化粧品の保湿剤と
して既に実用化されている。また、医学的分野では学習
能力の改善（F.Drago et al, Acta Ther., 13, 587(19
87)) 、アルコールによる記憶の欠落を防止する（E.Sin
foriani et al, Minerva Psichiatr., 26, 339 (1985))
、エタノールから肝臓を保護する (H.Gefforoy et al,
Parfuemerie und Kosmetik, 72, 94 (1991))他５０以
上ものさまざまな報告がある。
ン）は１８８２年に発見されて以来（L.Haitinger et a
l, Monatsch Chem., ３, 228 (1882)) 、さまざまな研
究がされている。ピログルタミン酸は糖蜜や様々な野
菜、ビール、タバコ、尿、血漿、骨等に広く存在が知ら
れている。ピログルタミン酸は非常に毒性が少なく、様
々な分野で利用されている。例えば、化粧品の保湿剤と
して既に実用化されている。また、医学的分野では学習
能力の改善（F.Drago et al, Acta Ther., 13, 587(19
87)) 、アルコールによる記憶の欠落を防止する（E.Sin
foriani et al, Minerva Psichiatr., 26, 339 (1985))
、エタノールから肝臓を保護する (H.Gefforoy et al,
Parfuemerie und Kosmetik, 72, 94 (1991))他５０以
上ものさまざまな報告がある。
【０００４】また、ピログルタミン酸は有用なカチオン
のキャリアーとしても有用である（Parfumerie und Kos
metik, 72, 94 (1991), Therapie 33 491 (1978))。ピ
ログルタミン酸の製造方法はＬ−グルタミン酸を酸性条
件下で１７５℃に加熱脱水すると一部ラセミ化したもの
が得られる。しかしながら、この製造法は加熱温度が１
７５℃と非常に高温で、更に酸性条件下であるため危険
が伴う。また、一部ラセミ化してしまうため、純粋なＬ
体を得るのは困難である。
のキャリアーとしても有用である（Parfumerie und Kos
metik, 72, 94 (1991), Therapie 33 491 (1978))。ピ
ログルタミン酸の製造方法はＬ−グルタミン酸を酸性条
件下で１７５℃に加熱脱水すると一部ラセミ化したもの
が得られる。しかしながら、この製造法は加熱温度が１
７５℃と非常に高温で、更に酸性条件下であるため危険
が伴う。また、一部ラセミ化してしまうため、純粋なＬ
体を得るのは困難である。
【０００５】ピログルタミン酸を生成する酵素は現在ま
でにＤ−グルタメイトサイクラーゼ（A.Meister et al,
Biochem.Z 338 217-229 (1963))、グルタミンシンセタ
ーゼ(A.Meister et al,Fed.Proc.21,1013(1962)) 、γ
−グルタミルサイクロトランスフェラーゼ (N.Taniguch
i et al,J.Biol.Chem.,253,1799-1806 (1978)) 、グル
タミル−ｔＲＮＡサイクロトランスフェラーゼ(M.R.Ber
nfield et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.33,843-849
(1968))等が知られているが、上述のＬ−ピログルタミ
ン酸を工業的に生産する目的には合わない。また、Ｌ−
グルタミン酸がさまざまな反応を阻害することも知られ
ている。例えば、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスア
ミナーゼ（ＧＯＴ）を用いたＬ−アスパラギン酸の定量
法ではＬ−グルタミン酸によりＧＯＴに阻害がかかり、
正確な測定が出来ない。
でにＤ−グルタメイトサイクラーゼ（A.Meister et al,
Biochem.Z 338 217-229 (1963))、グルタミンシンセタ
ーゼ(A.Meister et al,Fed.Proc.21,1013(1962)) 、γ
−グルタミルサイクロトランスフェラーゼ (N.Taniguch
i et al,J.Biol.Chem.,253,1799-1806 (1978)) 、グル
タミル−ｔＲＮＡサイクロトランスフェラーゼ(M.R.Ber
nfield et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.33,843-849
(1968))等が知られているが、上述のＬ−ピログルタミ
ン酸を工業的に生産する目的には合わない。また、Ｌ−
グルタミン酸がさまざまな反応を阻害することも知られ
ている。例えば、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスア
ミナーゼ（ＧＯＴ）を用いたＬ−アスパラギン酸の定量
法ではＬ−グルタミン酸によりＧＯＴに阻害がかかり、
正確な測定が出来ない。
【０００６】たんぱく質やペプチド中に含まれるグルタ
ミン酸（呈味成分）やグルタミンは食品の呈味上深く関
与しているアミノ酸である。これらのアミノ酸は味噌、
醤油、酒などの発酵食品の熟成において非酵素的に環化
し、無味のピログルタミン酸に転化される。従来、上述
したような問題を解決するために麹菌のグルタミナーゼ
の力価向上が行われているが、この方法はグルタミンを
グルタミン酸に転換することによりピログルタミン酸の
生成を抑えるものであり、生成してしまったピログルタ
ミン酸には作用しない。
ミン酸（呈味成分）やグルタミンは食品の呈味上深く関
与しているアミノ酸である。これらのアミノ酸は味噌、
醤油、酒などの発酵食品の熟成において非酵素的に環化
し、無味のピログルタミン酸に転化される。従来、上述
したような問題を解決するために麹菌のグルタミナーゼ
の力価向上が行われているが、この方法はグルタミンを
グルタミン酸に転換することによりピログルタミン酸の
生成を抑えるものであり、生成してしまったピログルタ
ミン酸には作用しない。
【０００７】また、現在までに知られているピログルタ
ミン酸開環酵素としては５−オキソプロリナーゼ（EC
3.5.2.9, J.Biol.Chem., 250, 6686-6692 (1975)) が
あるが、この酵素はいずれもＭｇ，Ｋなどの金属イオン
やＡＴＰに依存しており、ＡＴＰの再生などの問題か
ら、食品の旨味を向上させるには困難であるといえるも
のである。また、ピログルタミン酸の測定は従来ＨＰＬ
Ｃを用いたものが主流であり、簡便な測定方法がない。
上記の５−オキソプロリナーゼを用いた酵素法（特公昭
５９−３７９４７）が発明されたが、未だ実用化には至
っていない。
ミン酸開環酵素としては５−オキソプロリナーゼ（EC
3.5.2.9, J.Biol.Chem., 250, 6686-6692 (1975)) が
あるが、この酵素はいずれもＭｇ，Ｋなどの金属イオン
やＡＴＰに依存しており、ＡＴＰの再生などの問題か
ら、食品の旨味を向上させるには困難であるといえるも
のである。また、ピログルタミン酸の測定は従来ＨＰＬ
Ｃを用いたものが主流であり、簡便な測定方法がない。
上記の５−オキソプロリナーゼを用いた酵素法（特公昭
５９−３７９４７）が発明されたが、未だ実用化には至
っていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、Ｌ
−ピログルタミン酸を加水分解してＬ−グルタミン酸に
開環する反応及びＬ−グルタミン酸を脱水縮合により閉
環してＬ−ピログルタミン酸を生成せしめる反応（可逆
反応）を触媒する新規な酵素、及びその製造方法、並び
に該酵素の種々の用途を提供しようとするものである。
−ピログルタミン酸を加水分解してＬ−グルタミン酸に
開環する反応及びＬ−グルタミン酸を脱水縮合により閉
環してＬ−ピログルタミン酸を生成せしめる反応（可逆
反応）を触媒する新規な酵素、及びその製造方法、並び
に該酵素の種々の用途を提供しようとするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の酵素は次の性質
を有するＬ−グルタミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互
変換酵素、すなわち可逆的加水分解酵素である。 （１）作用：Ｌ−ピログルタミン酸と水とからＬ−グル
タミン酸を生成する反応（Ｌ−ピログルタミン酸開環反
応）、及びこの逆反応（Ｌ−グルタミン酸閉環反応）を
触媒する；
を有するＬ−グルタミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互
変換酵素、すなわち可逆的加水分解酵素である。 （１）作用：Ｌ−ピログルタミン酸と水とからＬ−グル
タミン酸を生成する反応（Ｌ−ピログルタミン酸開環反
応）、及びこの逆反応（Ｌ−グルタミン酸閉環反応）を
触媒する；
【００１０】（２）基質特異性： Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：Ｌ−ピログルタミン酸
に作用し、Ｄ−ピログルタミン酸、プロリン及びヒドロ
キシプロリンには作用しない； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：Ｌ−グルタミン酸に作用
し、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラ
ギン酸、Ｄ−アスパラギン酸及びＬ−アスパラギンには
作用しない；
に作用し、Ｄ−ピログルタミン酸、プロリン及びヒドロ
キシプロリンには作用しない； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：Ｌ−グルタミン酸に作用
し、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラ
ギン酸、Ｄ−アスパラギン酸及びＬ−アスパラギンには
作用しない；
【００１１】（３）至適pH及び安定pH範囲： Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：至適pHは３０℃にて３
０分間の反応においては７．２〜７．４であり、３０℃
にて３０分間の処理条件ではpH６．５〜１０．５の範囲
内で安定である； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：至適pHは３０℃にて３０分
間の反応において約８．０であり、３０℃にて３０分間
の処理条件ではpH６．５〜１０．５の範囲内で安定であ
る；
０分間の反応においては７．２〜７．４であり、３０℃
にて３０分間の処理条件ではpH６．５〜１０．５の範囲
内で安定である； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：至適pHは３０℃にて３０分
間の反応において約８．０であり、３０℃にて３０分間
の処理条件ではpH６．５〜１０．５の範囲内で安定であ
る；
【００１２】（４）温度安定性： Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：pH７．４にて３０分間
の条件下では５５℃まで安定である； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：pH８．０にて３０分間の条
件下では５５℃まで安定である； （５）至適温度： Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：４５℃〜５０℃に至適
作用温度を有する； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：約４５℃に至適作用温度を
有する；
の条件下では５５℃まで安定である； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：pH８．０にて３０分間の条
件下では５５℃まで安定である； （５）至適温度： Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：４５℃〜５０℃に至適
作用温度を有する； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：約４５℃に至適作用温度を
有する；
【００１３】（６）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動及びゲル濾過法により測定した分子量約
４７，０００を有する； （７）等電点：４．８〜５．１である； （８）ＡＴＰ、及び金属塩、例えばＭｇ，Ｋ等に対して
非依存性である。
ドゲル電気泳動及びゲル濾過法により測定した分子量約
４７，０００を有する； （７）等電点：４．８〜５．１である； （８）ＡＴＰ、及び金属塩、例えばＭｇ，Ｋ等に対して
非依存性である。
【００１４】本発明の酵素は、アルカリゲネス(Alcalig
enes) 属に属し、前記の酵素を生産する能力を有するも
のであればいずれも使用することができる。アルカリゲ
ネスに属し、容易に入手可能な菌株としては、アルカリ
ゲネス・フェイカリス (Alcaligenes faecalis) ＩＦＯ
１３１１１、アルカリゲネス sp.ＩＡＭ１０１５、アル
カリゲネス・デニトロフィカンス(Alcaligenes denitro
ficons) ＪＣＭ５４９０等を挙げることができる。
enes) 属に属し、前記の酵素を生産する能力を有するも
のであればいずれも使用することができる。アルカリゲ
ネスに属し、容易に入手可能な菌株としては、アルカリ
ゲネス・フェイカリス (Alcaligenes faecalis) ＩＦＯ
１３１１１、アルカリゲネス sp.ＩＡＭ１０１５、アル
カリゲネス・デニトロフィカンス(Alcaligenes denitro
ficons) ＪＣＭ５４９０等を挙げることができる。
【００１５】本発明において使用する好ましい菌株の１
例として、本発明者らにより土壌から新しく分離された
菌株アルカリゲネス・フェカリス (Alcaligenes faecal
is)Ｎ−３８Ａを挙げることができる。この微生物は、
工業技術院生命工学工学技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１
４９１９として寄託されている。アルカリゲネス・フェ
カリスＮ−３８Ａは次の性質を有する。
例として、本発明者らにより土壌から新しく分離された
菌株アルカリゲネス・フェカリス (Alcaligenes faecal
is)Ｎ−３８Ａを挙げることができる。この微生物は、
工業技術院生命工学工学技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１
４９１９として寄託されている。アルカリゲネス・フェ
カリスＮ−３８Ａは次の性質を有する。
【００１６】
【表１】
【００１７】本菌は表１に示すような特徴、すなわち、
グラム陰性の好気性桿菌、周鞭毛を有し、色素は生産せ
ず、オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性、亜硝酸を還元
し、各種炭素源の利用パターン等により、BERGEY'S MAN
UAL OF Systematic Bacteriology Vol.1 (1984) ではA.
faecalisと同定される。そこで、A.faecalisの Type st
rain（ＩＦＯ−１３１１１）と、Ｎ−３８Ａ株とを比較
検討を行った。その結果を次の表２に示す。
グラム陰性の好気性桿菌、周鞭毛を有し、色素は生産せ
ず、オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性、亜硝酸を還元
し、各種炭素源の利用パターン等により、BERGEY'S MAN
UAL OF Systematic Bacteriology Vol.1 (1984) ではA.
faecalisと同定される。そこで、A.faecalisの Type st
rain（ＩＦＯ−１３１１１）と、Ｎ−３８Ａ株とを比較
検討を行った。その結果を次の表２に示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】その結果、３８Ａ株はA.faecalis（ＩＦＯ
−１３１１１）と同じ性質（５頁）を示したことによ
り、A.faecalisと同定した。本発明の微生物を培養する
場合、培地は炭素源としてはシュークロース、グルコー
ス、可溶性デンプンなどの糖質、酢酸、クエン酸、りん
ご酸などの有機酸、炭化水素などが使用可能であり、窒
素源としては肉エキス、ペプトン、ピログルタミン酸及
び硫安、アンモニアなどの有機及び無機窒素源を用い
る。さらに、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム
などのリン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム
等のマグネシウム塩、鉄、マンガン、亜鉛、カルシウム
等の金属イオン及び各々の菌株の生育に必要な微量物質
等を適当量添加したものが使用される。
−１３１１１）と同じ性質（５頁）を示したことによ
り、A.faecalisと同定した。本発明の微生物を培養する
場合、培地は炭素源としてはシュークロース、グルコー
ス、可溶性デンプンなどの糖質、酢酸、クエン酸、りん
ご酸などの有機酸、炭化水素などが使用可能であり、窒
素源としては肉エキス、ペプトン、ピログルタミン酸及
び硫安、アンモニアなどの有機及び無機窒素源を用い
る。さらに、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム
などのリン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム
等のマグネシウム塩、鉄、マンガン、亜鉛、カルシウム
等の金属イオン及び各々の菌株の生育に必要な微量物質
等を適当量添加したものが使用される。
【００２０】培養は振盪培養又は通気撹拌培養等の条件
下で実施される。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは
２５〜３７℃、pHは５．０〜８．０、好ましくはpH７．
０〜８．０で行う。培養時間は通常１２〜４８時間であ
る。上記方法で培養した菌体及び培養上清にはＬ−グル
タミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素が生産さ
れている。この酵素の精製は、硫安塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過
法もしくはそれらを組み合わせに付して分離、採取する
ことにより精製される。
下で実施される。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは
２５〜３７℃、pHは５．０〜８．０、好ましくはpH７．
０〜８．０で行う。培養時間は通常１２〜４８時間であ
る。上記方法で培養した菌体及び培養上清にはＬ−グル
タミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素が生産さ
れている。この酵素の精製は、硫安塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過
法もしくはそれらを組み合わせに付して分離、採取する
ことにより精製される。
【００２１】なお、Ｌ−グルタミン酸閉環酵素の活性測
定法ならびに活性表示法は以下の通りである。即ち、
０．１２Ｍ Ｌ−グルタミン酸０．５ml、０．４Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（pH８．０）、酵素液５０μｌを混合し、
３０℃、３０分間放置する。その後、１００℃、１０分
間熱処理を行い酵素を失活させた後、Shim-pack ＳＣＲ
−１０１Ｈ（島津製）を用いたＨＰＬＣにより生成した
ピログルタミン酸の定量を行った。また、酵素活性の単
位は前述の条件下で１分間に１μmol のピログルタミン
酸を生成するのに要する酵素量を１単位として表示す
る。
定法ならびに活性表示法は以下の通りである。即ち、
０．１２Ｍ Ｌ−グルタミン酸０．５ml、０．４Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（pH８．０）、酵素液５０μｌを混合し、
３０℃、３０分間放置する。その後、１００℃、１０分
間熱処理を行い酵素を失活させた後、Shim-pack ＳＣＲ
−１０１Ｈ（島津製）を用いたＨＰＬＣにより生成した
ピログルタミン酸の定量を行った。また、酵素活性の単
位は前述の条件下で１分間に１μmol のピログルタミン
酸を生成するのに要する酵素量を１単位として表示す
る。
【００２２】また、ピログルタミン酸開環酵素の活性測
定法ならびに活性表示法は以下の通りである。即ち、タ
イタープレート上で酵素液１０μｌ、０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液（pH７．４）４０μｌ、１．０％Ｌ−ピログル
タミン酸（pH７．０）５０μｌを混合し、３０℃、３０
分間放置する。反応液に７．５mM ＮＡＤ、１．２mMＩ
ＮＴ、１．５Ｕデイアフォラーゼ、１％トリトンＸ−１
００を含む０．２Ｍトリエタノールアミン緩衝液（pH
８．６）６Ｕグルタミン酸脱水素酵素を加え、室温で１
５分放置する。その後、４９２nmの吸光度を測定するこ
とによって生成したグルタミン酸を定量する。また、酵
素活性の単位は前述の条件下で１分間に１μmol のグル
タミン酸を生成するのに要する酵素量を１単位として表
示する。
定法ならびに活性表示法は以下の通りである。即ち、タ
イタープレート上で酵素液１０μｌ、０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液（pH７．４）４０μｌ、１．０％Ｌ−ピログル
タミン酸（pH７．０）５０μｌを混合し、３０℃、３０
分間放置する。反応液に７．５mM ＮＡＤ、１．２mMＩ
ＮＴ、１．５Ｕデイアフォラーゼ、１％トリトンＸ−１
００を含む０．２Ｍトリエタノールアミン緩衝液（pH
８．６）６Ｕグルタミン酸脱水素酵素を加え、室温で１
５分放置する。その後、４９２nmの吸光度を測定するこ
とによって生成したグルタミン酸を定量する。また、酵
素活性の単位は前述の条件下で１分間に１μmol のグル
タミン酸を生成するのに要する酵素量を１単位として表
示する。
【００２３】本発明の酵素は、Ｌ−ピログルタミン酸か
らＬ−グルタミン酸を生成するために使用することがで
きる。従って本発明は、本発明の酵素をＬ−ピログルタ
ミン酸に作用せしめることを特徴とするＬ−グルタミン
酸の製造又は生成方法を提供する。この方法は、例え
ば、食品中に生成した、又は含まれている、Ｌ−ピログ
ルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換することにより食
品の旨味を改善するために用いることができる。
らＬ−グルタミン酸を生成するために使用することがで
きる。従って本発明は、本発明の酵素をＬ−ピログルタ
ミン酸に作用せしめることを特徴とするＬ−グルタミン
酸の製造又は生成方法を提供する。この方法は、例え
ば、食品中に生成した、又は含まれている、Ｌ−ピログ
ルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換することにより食
品の旨味を改善するために用いることができる。
【００２４】Ｌ−グルタミン酸を含有する飲食品中で
は、このＬ−グルタミン酸が環化して、旨味のないＬ−
ピログルタミン酸に変化している場合がある。この様な
場合には、このＬ−ピログルタミン酸を本発明の酵素に
よりＬ−グルタミン酸に変換することにより旨味の回
復、又は増強を行うことができる。この方法は、例えば
飲食物に単に本発明の酵素を添加すればよい。酵素の添
加量は、飲食品の種類、Ｌ−ピログルタミン酸の濃度等
により異る。
は、このＬ−グルタミン酸が環化して、旨味のないＬ−
ピログルタミン酸に変化している場合がある。この様な
場合には、このＬ−ピログルタミン酸を本発明の酵素に
よりＬ−グルタミン酸に変換することにより旨味の回
復、又は増強を行うことができる。この方法は、例えば
飲食物に単に本発明の酵素を添加すればよい。酵素の添
加量は、飲食品の種類、Ｌ−ピログルタミン酸の濃度等
により異る。
【００２５】上記の方法はまた、Ｌ−グルタミン酸製品
の製造のためにも使用することができる。この方法は、
Ｌ−ピログルタミン酸を含有する反応媒体に本発明の酵
素を作用させることにより実施される。基質としてのＬ
−ピログルタミン酸の濃度は０．１％〜２０％（ｗ／
ｖ）程度が好ましい。反応媒体としては、本発明の酵素
の反応に悪影響を与えない任意の媒体、例えば水、水性
緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
等が使用され、pHは好ましくは７〜８、例えば約７．５
である。反応時間は、例えば０．５〜２４時間である。
の製造のためにも使用することができる。この方法は、
Ｌ−ピログルタミン酸を含有する反応媒体に本発明の酵
素を作用させることにより実施される。基質としてのＬ
−ピログルタミン酸の濃度は０．１％〜２０％（ｗ／
ｖ）程度が好ましい。反応媒体としては、本発明の酵素
の反応に悪影響を与えない任意の媒体、例えば水、水性
緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
等が使用され、pHは好ましくは７〜８、例えば約７．５
である。反応時間は、例えば０．５〜２４時間である。
【００２６】本発明の酵素はまた、Ｌ−グルタミン酸か
らＬ−ピログルタミン酸を生成せしめるために使用する
ことができる。従って本発明は、本発明の酵素をＬ−グ
ルタミン酸に作用せしめることを特徴とする、Ｌ−ピロ
グルタミン酸の製造方法を提供する。Ｌ−グルタミン酸
を含有する反応媒体に本発明の酵素を作用せしめること
により実施される。反応媒体としては、本発明の酵素の
反応に悪影響を与えない任意の媒体、例えば水、水性緩
衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等
を使用することができる。基質としてのＬ−グルタミン
酸の濃度は、例えば０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）程度で
ある。反応媒体のpHはおよそ７〜９、例えば約８であ
り、反応時間は例えば０．５〜２４時間である。
らＬ−ピログルタミン酸を生成せしめるために使用する
ことができる。従って本発明は、本発明の酵素をＬ−グ
ルタミン酸に作用せしめることを特徴とする、Ｌ−ピロ
グルタミン酸の製造方法を提供する。Ｌ−グルタミン酸
を含有する反応媒体に本発明の酵素を作用せしめること
により実施される。反応媒体としては、本発明の酵素の
反応に悪影響を与えない任意の媒体、例えば水、水性緩
衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等
を使用することができる。基質としてのＬ−グルタミン
酸の濃度は、例えば０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）程度で
ある。反応媒体のpHはおよそ７〜９、例えば約８であ
り、反応時間は例えば０．５〜２４時間である。
【００２７】上記の反応は、一例として、グルタミン酸
のラセミ体を分割するために用いることができる。例え
ば、グルタミン酸のラセミ体に本発明の酵素を作用せし
めることにより、Ｌ−グルタミン酸のみを特異的にＬ−
ピログルタミン酸に変換し、Ｄ−グルタミン酸とＬ−ピ
ログルタミン酸とを常法に従って単離し、次にＬ−ピロ
グルタミン酸をＬ−グルタミン酸に開環すればよい。他
の方法として、グルタミン酸のラセミ体をピログルタミ
ン酸に変換した後、これに本発明の酵素を作用せしめる
ことによりＬ−ピログルタミン酸のみを特異的にＬ−グ
ルタミン酸に開環し、次にＤ−ピログルタミン酸とＬ−
グルタミン酸とを分離すればよい。上記の方法によりグ
ルタミン酸のラセミ体からＬ−グルタミン酸が得られる
のと同様にして、Ｄ−グルタミン酸を得ることもでき
る。
のラセミ体を分割するために用いることができる。例え
ば、グルタミン酸のラセミ体に本発明の酵素を作用せし
めることにより、Ｌ−グルタミン酸のみを特異的にＬ−
ピログルタミン酸に変換し、Ｄ−グルタミン酸とＬ−ピ
ログルタミン酸とを常法に従って単離し、次にＬ−ピロ
グルタミン酸をＬ−グルタミン酸に開環すればよい。他
の方法として、グルタミン酸のラセミ体をピログルタミ
ン酸に変換した後、これに本発明の酵素を作用せしめる
ことによりＬ−ピログルタミン酸のみを特異的にＬ−グ
ルタミン酸に開環し、次にＤ−ピログルタミン酸とＬ−
グルタミン酸とを分離すればよい。上記の方法によりグ
ルタミン酸のラセミ体からＬ−グルタミン酸が得られる
のと同様にして、Ｄ−グルタミン酸を得ることもでき
る。
【００２８】本発明の酵素はまた、種々の分析方法にお
いて使用することができる。その態様の１つとして、本
発明は、ピログルタミン酸を含有すると予想される試料
に本発明の酵素を作用せしめることにより試料中のＬ−
ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換し、次にこ
のＬ−グルタミン酸を常法に従って測定することを特徴
とするＬ−ピログルタミン酸の測定方法を提供する。Ｌ
−グルタミン酸の測定方法は古くから種々知られてい
る。酵素を使用する一例として、例えば試料中のＬ−グ
ルタミン酸にグルタミン酸オキシダーゼを作用させてα
−ケトグルタール酸、ＮＨ3 及びＨ2 Ｏ2 を生成せしめ
た後、このＨ2 Ｏ2 にＮ−ヒドロキシスルホプロピル誘
導体（ＤＡＯＳ）と４−アミノアンチピリンの存在下で
パーオキシダーゼを作用せしめることにより発色させる
方法がある。
いて使用することができる。その態様の１つとして、本
発明は、ピログルタミン酸を含有すると予想される試料
に本発明の酵素を作用せしめることにより試料中のＬ−
ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換し、次にこ
のＬ−グルタミン酸を常法に従って測定することを特徴
とするＬ−ピログルタミン酸の測定方法を提供する。Ｌ
−グルタミン酸の測定方法は古くから種々知られてい
る。酵素を使用する一例として、例えば試料中のＬ−グ
ルタミン酸にグルタミン酸オキシダーゼを作用させてα
−ケトグルタール酸、ＮＨ3 及びＨ2 Ｏ2 を生成せしめ
た後、このＨ2 Ｏ2 にＮ−ヒドロキシスルホプロピル誘
導体（ＤＡＯＳ）と４−アミノアンチピリンの存在下で
パーオキシダーゼを作用せしめることにより発色させる
方法がある。
【００２９】本発明によれば、Ｌ−ピログルタミン酸を
含有する被験試料に本発明の酵素を作用せしめることに
より該Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換
せしめ、こうして生成したＬ−グルタミン酸を常法に従
って測定すれば、試料中のＬ−ピログルタミン酸の量を
知ることができる。この場合、例えばＬ−グルタミン酸
の測定のために上記の酵素法を用いれば、Ｌ−グルタミ
ン酸をグルタミン酸オキシダーゼにより酸化する反応は
不可逆的に進行するから、Ｌ−ピログルタミン酸は定量
的にＬ−グルタミン酸に変換され、試料中のＬ−ピログ
ルタミン酸を定量測定することができる。上記のＬ−ピ
ログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換する反応は、
例えば、Ｌ−グルタミン酸の測定と同じ条件下で行うこ
とができる。
含有する被験試料に本発明の酵素を作用せしめることに
より該Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換
せしめ、こうして生成したＬ−グルタミン酸を常法に従
って測定すれば、試料中のＬ−ピログルタミン酸の量を
知ることができる。この場合、例えばＬ−グルタミン酸
の測定のために上記の酵素法を用いれば、Ｌ−グルタミ
ン酸をグルタミン酸オキシダーゼにより酸化する反応は
不可逆的に進行するから、Ｌ−ピログルタミン酸は定量
的にＬ−グルタミン酸に変換され、試料中のＬ−ピログ
ルタミン酸を定量測定することができる。上記のＬ−ピ
ログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換する反応は、
例えば、Ｌ−グルタミン酸の測定と同じ条件下で行うこ
とができる。
【００３０】上記の方法は、例えば、Ｌ−グルタミン酸
とＬ−ピログルタミン酸の両者を含有する被験試料中の
Ｌ−グルタミン酸とＬ−ピログルタミン酸の分別測定、
及び両者の合計量の測定のために応用することができ
る。従って本発明は、Ｌ−ピログルタミン酸及びＬ−グ
ルタミン酸を含有すると予想される試料に本願発明の酵
素を作用せしめることにより該Ｌ−ピログルタミン酸を
Ｌ−グルタミン酸に変換し、次にＬ−グルタミン酸の全
量を測定することを特徴とする、Ｌ−ピログルタミン酸
とＬ−グルタミン酸の合計量を測定する方法を提供す
る。
とＬ−ピログルタミン酸の両者を含有する被験試料中の
Ｌ−グルタミン酸とＬ−ピログルタミン酸の分別測定、
及び両者の合計量の測定のために応用することができ
る。従って本発明は、Ｌ−ピログルタミン酸及びＬ−グ
ルタミン酸を含有すると予想される試料に本願発明の酵
素を作用せしめることにより該Ｌ−ピログルタミン酸を
Ｌ−グルタミン酸に変換し、次にＬ−グルタミン酸の全
量を測定することを特徴とする、Ｌ−ピログルタミン酸
とＬ−グルタミン酸の合計量を測定する方法を提供す
る。
【００３１】上記の方法はまた、例えばＬ−グルタミン
酸とＬ−ピログルタミン酸の両者を含有する被験試料中
のＬ−ピログルタミン酸とＬ−グルタミン酸とを分別測
定するために用いることができる。従って本発明は、Ｌ
−ピログルタミン酸及びＬ−グルタミン酸を含有する被
験試料中のＬ−グルタミン酸を測定して測定値Ａを求
め、次に測定反応系に本発明の酵素を添加することによ
りＬ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換せし
め、そして再度Ｌ−グルタミン酸を測定して測定値Ｂを
求め、測定値ＢとＡとの差を用いてＬ−ピログルタミン
酸の測定値を得ることを特徴とする方法を提供する。
酸とＬ−ピログルタミン酸の両者を含有する被験試料中
のＬ−ピログルタミン酸とＬ−グルタミン酸とを分別測
定するために用いることができる。従って本発明は、Ｌ
−ピログルタミン酸及びＬ−グルタミン酸を含有する被
験試料中のＬ−グルタミン酸を測定して測定値Ａを求
め、次に測定反応系に本発明の酵素を添加することによ
りＬ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換せし
め、そして再度Ｌ−グルタミン酸を測定して測定値Ｂを
求め、測定値ＢとＡとの差を用いてＬ−ピログルタミン
酸の測定値を得ることを特徴とする方法を提供する。
【００３２】上記いずれの測定法においても、Ｌ−グル
タミン酸の測定法としては、任意の常用の測定法を用い
ることができ、測定条件としては、常用のＬ−グルタミ
ン酸の測定のための条件を用いることができる。本発明
はさらに、Ｌ−グルタミン酸の存在により妨害されるお
それのある測定方法の精度の向上のためにも使用するこ
とができる。従って本発明は、Ｌ−グルタミン酸の存在
により妨害されるおそれのある測定方法において、測定
反応系に本発明の酵素を添加することによりＬ−グルタ
ミン酸を消滅又は減少せしめることにより、前記測定の
精度を向上せしめることを特徴とする方法を提供する。
タミン酸の測定法としては、任意の常用の測定法を用い
ることができ、測定条件としては、常用のＬ−グルタミ
ン酸の測定のための条件を用いることができる。本発明
はさらに、Ｌ−グルタミン酸の存在により妨害されるお
それのある測定方法の精度の向上のためにも使用するこ
とができる。従って本発明は、Ｌ−グルタミン酸の存在
により妨害されるおそれのある測定方法において、測定
反応系に本発明の酵素を添加することによりＬ−グルタ
ミン酸を消滅又は減少せしめることにより、前記測定の
精度を向上せしめることを特徴とする方法を提供する。
【００３３】具体例として、Ｌ−アスパラギン酸の測定
方法として、被験対象としてのＬ−アスパラギン酸とα
−ケトグルタル酸とをグルタミン酸オキザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（ＧＯＴ）により反応せしめてオキザロ酢
酸とＬ−グルタミン酸とを生成せしめ、次にこのオキザ
ロ酢酸によりＮＡＤＨをＬ−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
（Ｌ−ＭＤＨ）の存在下でＮＡＤ+ に酸化し、ＮＡＤＨ
からＮＡＤ+ への変換を吸光度の変化により測定する方
法がある。
方法として、被験対象としてのＬ−アスパラギン酸とα
−ケトグルタル酸とをグルタミン酸オキザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（ＧＯＴ）により反応せしめてオキザロ酢
酸とＬ−グルタミン酸とを生成せしめ、次にこのオキザ
ロ酢酸によりＮＡＤＨをＬ−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
（Ｌ−ＭＤＨ）の存在下でＮＡＤ+ に酸化し、ＮＡＤＨ
からＮＡＤ+ への変換を吸光度の変化により測定する方
法がある。
【００３４】この測定法において、ＧＯＴによる反応は
可逆反応であるため、この反応により生成するＬ−グル
タミン酸がＬ−アスパラギン酸からオキザロ酢酸への反
応の進行を妨げる結果となり、Ｌ−アスパラギン酸の定
量的測定が妨害される。しかしながら、この測定反応系
に本発明の酵素を添加して、生成するＬ−グルタミン酸
をＬ−ピログルタミン酸に変換することによりＬ−グル
タミン酸による妨害が緩和され、Ｌ−アスパラギン酸の
定量測定の精度が向上する。
可逆反応であるため、この反応により生成するＬ−グル
タミン酸がＬ−アスパラギン酸からオキザロ酢酸への反
応の進行を妨げる結果となり、Ｌ−アスパラギン酸の定
量的測定が妨害される。しかしながら、この測定反応系
に本発明の酵素を添加して、生成するＬ−グルタミン酸
をＬ−ピログルタミン酸に変換することによりＬ−グル
タミン酸による妨害が緩和され、Ｌ−アスパラギン酸の
定量測定の精度が向上する。
【００３５】上記の原理はまた、Ｌ−アスパラギン酸を
測定しようとする被験試料中にはじめから高濃度のグル
タミン酸が含まれているために、Ｌ−アスパラギン酸の
測定が妨害される場合に、この妨害を除去してＬ−アス
パラギン酸の定量測定の精度を向上させるためにも応用
できる。
測定しようとする被験試料中にはじめから高濃度のグル
タミン酸が含まれているために、Ｌ−アスパラギン酸の
測定が妨害される場合に、この妨害を除去してＬ−アス
パラギン酸の定量測定の精度を向上させるためにも応用
できる。
【００３６】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例１ ．酵素の製造 種菌としてアルカリゲネス・フェイカリスＮ−３８Ａを
使用した。肉エキス３ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／
Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ及びアデカノール０．１５ｇ／
Ｌ（pH７．０）を含有する培地８mlを内径２２mmの試験
管に入れ、１２０℃にて１５分殺菌した。
説明する。実施例１ ．酵素の製造 種菌としてアルカリゲネス・フェイカリスＮ−３８Ａを
使用した。肉エキス３ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／
Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ及びアデカノール０．１５ｇ／
Ｌ（pH７．０）を含有する培地８mlを内径２２mmの試験
管に入れ、１２０℃にて１５分殺菌した。
【００３７】上記培地に前記菌株を１白金耳接種し、３
０℃で１６時間振盪した。培養終了後、培養液０．５ml
を上記培地１００mlの入った５００ml容坂口フラスコ３
本に接種し、３０℃、１６時間振盪培養した。培養終了
後、培養液の全てを３０Ｌ容ジャーファーメンター中の
本培養液２０Ｌに接種した。本培養は３０℃、２００rp
m ／分、通気量１Ｌ／培地１Ｌ・１分間で１６時間実施
した。
０℃で１６時間振盪した。培養終了後、培養液０．５ml
を上記培地１００mlの入った５００ml容坂口フラスコ３
本に接種し、３０℃、１６時間振盪培養した。培養終了
後、培養液の全てを３０Ｌ容ジャーファーメンター中の
本培養液２０Ｌに接種した。本培養は３０℃、２００rp
m ／分、通気量１Ｌ／培地１Ｌ・１分間で１６時間実施
した。
【００３８】培養終了液２０Ｌから酵素を採取するた
め、該液を遠心分離（１２，０００rpm 連続遠心４℃）
して菌体（湿重量２８５ｇ）を得、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（pH８．０）にて洗浄した後、同緩衝液２
Ｌに懸濁し、ダイノミルにより菌体を破砕した。この破
砕液を遠心分離（９，０００rpm 、１０分、４℃）し、
無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に硫酸アンモニ
ウムを添加して４０〜８０％飽和硫安沈澱画分を得た。
この沈澱を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）１Ｌ
に溶解し、０．００５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）
に対して透析した。
め、該液を遠心分離（１２，０００rpm 連続遠心４℃）
して菌体（湿重量２８５ｇ）を得、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（pH８．０）にて洗浄した後、同緩衝液２
Ｌに懸濁し、ダイノミルにより菌体を破砕した。この破
砕液を遠心分離（９，０００rpm 、１０分、４℃）し、
無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に硫酸アンモニ
ウムを添加して４０〜８０％飽和硫安沈澱画分を得た。
この沈澱を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）１Ｌ
に溶解し、０．００５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）
に対して透析した。
【００３９】透析内液に硫酸アンモニウムを２０％飽和
になるように添加し、２０％飽和硫酸アンモニウムを含
む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化さ
せたフェニルトヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液
で洗い、２０→０％飽和硫酸アンモニウムグラジェント
で溶出させた。活性画分を０．００５Ｍトリス塩酸緩衝
液（pH８．０）に対して透析した。透析内液を０．０５
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化したＤＥＡＥ
トヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液で洗い、０→
０．５Ｍ ＮａＣｌグラジェントで溶出させた。活性画
分を０．００５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）に対し
て透析した。
になるように添加し、２０％飽和硫酸アンモニウムを含
む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化さ
せたフェニルトヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液
で洗い、２０→０％飽和硫酸アンモニウムグラジェント
で溶出させた。活性画分を０．００５Ｍトリス塩酸緩衝
液（pH８．０）に対して透析した。透析内液を０．０５
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化したＤＥＡＥ
トヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液で洗い、０→
０．５Ｍ ＮａＣｌグラジェントで溶出させた。活性画
分を０．００５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）に対し
て透析した。
【００４０】透析内液を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
（pH８．０）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ
に吸着させ、同緩衝液で洗い、０→０．３Ｍ ＮａＣｌ
グラジェントで溶出した。活性画分を０．００５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（pH８．０）に対して透析した。透析内液
を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化さ
せたブチルトヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液で
洗い、２０→０％飽和硫酸アンモニウムグラジェントで
溶出させた。活性画分を０．００５Ｍトリス塩酸緩衝液
（pH７．０）に対して透析した。
（pH８．０）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ
に吸着させ、同緩衝液で洗い、０→０．３Ｍ ＮａＣｌ
グラジェントで溶出した。活性画分を０．００５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（pH８．０）に対して透析した。透析内液
を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化さ
せたブチルトヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液で
洗い、２０→０％飽和硫酸アンモニウムグラジェントで
溶出させた。活性画分を０．００５Ｍトリス塩酸緩衝液
（pH７．０）に対して透析した。
【００４１】透析内液を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
（pH７．０）で平衡化させたＤＥＡＥトヨパール６５０
Ｍに吸着させ、同緩衝液で洗い、０→０．２５Ｍ Ｎａ
Ｃｌグラジェントで溶出させた。活性画分を０．００５
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）に対して透析した。透
析内液をセファデックスＧ−１００によりゲル濾過を行
った。以上の操作により、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ゲル濃度７．５％、pH８．８）において単
一な酵素標品１０．３mgが得られた。活性収率は１６．
６％であり、Ｌ−ピログルタミン酸開環反応の比活性は
２，１５０Ｕ／mgであった。また、Ｌ−グルタミン酸閉
環反応の比活性は４０，９００Ｕ／mgであった。
（pH７．０）で平衡化させたＤＥＡＥトヨパール６５０
Ｍに吸着させ、同緩衝液で洗い、０→０．２５Ｍ Ｎａ
Ｃｌグラジェントで溶出させた。活性画分を０．００５
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）に対して透析した。透
析内液をセファデックスＧ−１００によりゲル濾過を行
った。以上の操作により、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ゲル濃度７．５％、pH８．８）において単
一な酵素標品１０．３mgが得られた。活性収率は１６．
６％であり、Ｌ−ピログルタミン酸開環反応の比活性は
２，１５０Ｕ／mgであった。また、Ｌ−グルタミン酸閉
環反応の比活性は４０，９００Ｕ／mgであった。
【００４２】実施例２．アルカリゲネス・フェイカリス
Ｎ−３８Ａを内径２２mmの試験管中のＤＬ−ピログルタ
ミン酸１％、酵母エキス０．１％、リン酸第一カリウム
０．１％、リン酸第二カリウム０．１％、硫酸マグネシ
ウム７水和物０．０５％を含む培地（pH７．０）８mlに
植菌し、３０℃で４８時間振盪培養し、培養終了後、培
養液を遠心分離して菌体を集め、菌体を破砕し、Ｌ−ピ
ログルタミン酸開環反応の力価１．７Ｕ／mlの無細胞抽
出液５mlを得た。Ｌ−グルタミン酸閉環反応の力価は３
２．３Ｕ／mlであった。尚、酵素活性の測定はすでに述
べた方法に従った。
Ｎ−３８Ａを内径２２mmの試験管中のＤＬ−ピログルタ
ミン酸１％、酵母エキス０．１％、リン酸第一カリウム
０．１％、リン酸第二カリウム０．１％、硫酸マグネシ
ウム７水和物０．０５％を含む培地（pH７．０）８mlに
植菌し、３０℃で４８時間振盪培養し、培養終了後、培
養液を遠心分離して菌体を集め、菌体を破砕し、Ｌ−ピ
ログルタミン酸開環反応の力価１．７Ｕ／mlの無細胞抽
出液５mlを得た。Ｌ−グルタミン酸閉環反応の力価は３
２．３Ｕ／mlであった。尚、酵素活性の測定はすでに述
べた方法に従った。
【００４３】実施例３．アルカリゲネス・フェイカリス
ＩＦＯ１３１１１、アルカリゲネス属ＩＡＭ１０１５、
アルカリゲネス・デニトロフィカンスＪＣＭ５４９０を
実施例２で述べた培地成分を含む培地８mlに植菌し、実
施例１と同一条件で振盪培養し、それぞれ、Ｌ−ピログ
ルタミン酸開環反応の力価０．６６Ｕ／ml、０．００２
５Ｕ／ml、及び０．００１６Ｕ／mlの無細胞抽出液５ml
を得た。Ｌ−グルタミン酸閉環反応の力価は、それぞ
れ、１２．５Ｕ／ml、０．０４８Ｕ／ml、及び０．０３
０Ｕ／mlであった。
ＩＦＯ１３１１１、アルカリゲネス属ＩＡＭ１０１５、
アルカリゲネス・デニトロフィカンスＪＣＭ５４９０を
実施例２で述べた培地成分を含む培地８mlに植菌し、実
施例１と同一条件で振盪培養し、それぞれ、Ｌ−ピログ
ルタミン酸開環反応の力価０．６６Ｕ／ml、０．００２
５Ｕ／ml、及び０．００１６Ｕ／mlの無細胞抽出液５ml
を得た。Ｌ−グルタミン酸閉環反応の力価は、それぞ
れ、１２．５Ｕ／ml、０．０４８Ｕ／ml、及び０．０３
０Ｕ／mlであった。
【００４４】実施例４．（参考例） シュウドモナス・アルカリゲネスＩＦＯ１４１５９、シ
ュウドモナス・メドシナＩＦＯ１４１６２、シュウドモ
ナス・シュツゼリＩＦＯ１４１６５を実施例１で述べた
培地成分を含む培地８mlに植菌し、実施例２と同一条件
で振盪培養し、それぞれ、Ｌ−ピログルタミン酸開環反
応の力価０．０１２Ｕ／ml、０．００４３Ｕ／ml、及び
０．００７７Ｕ／mlの無細胞抽出液５mlを得た。Ｌ−グ
ルタミン酸閉環反応の力価は、それぞれ、０．２２８Ｕ
／ml、０．０８２Ｕ／ml、及び０．１４６Ｕ／mlであっ
た。
ュウドモナス・メドシナＩＦＯ１４１６２、シュウドモ
ナス・シュツゼリＩＦＯ１４１６５を実施例１で述べた
培地成分を含む培地８mlに植菌し、実施例２と同一条件
で振盪培養し、それぞれ、Ｌ−ピログルタミン酸開環反
応の力価０．０１２Ｕ／ml、０．００４３Ｕ／ml、及び
０．００７７Ｕ／mlの無細胞抽出液５mlを得た。Ｌ−グ
ルタミン酸閉環反応の力価は、それぞれ、０．２２８Ｕ
／ml、０．０８２Ｕ／ml、及び０．１４６Ｕ／mlであっ
た。
【００４５】実施例５．Ｌ−グルタミン酸３０５nmol、
実施例１で得た酵素６６ngを含む２０mMトリス塩酸緩衝
液（pH８．０）１０mlを混合し、３０℃で放置し、ピロ
グルタミン酸の製造を行った。その結果、２９５nmolの
ピログルタミン酸（収率９６．７％）が生成した。
実施例１で得た酵素６６ngを含む２０mMトリス塩酸緩衝
液（pH８．０）１０mlを混合し、３０℃で放置し、ピロ
グルタミン酸の製造を行った。その結果、２９５nmolの
ピログルタミン酸（収率９６．７％）が生成した。
【００４６】実施例６．本発明の酵素がＬ−グルタミン
酸閉環反応によりＬ−グルタミン酸のみを消去すること
を利用して、種々に利用できる１例を示す。Ｌ−アスパ
ラギン酸がグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナー
ゼ（ＧＯＴ）とリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ＭＤ
Ｈ）の２種類の酵素によって酵素法で測定できることは
既知の事実である（ベーリンガーマンハイム社のカタロ
グ）。その反応式を以下に示す。
酸閉環反応によりＬ−グルタミン酸のみを消去すること
を利用して、種々に利用できる１例を示す。Ｌ−アスパ
ラギン酸がグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナー
ゼ（ＧＯＴ）とリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ＭＤ
Ｈ）の２種類の酵素によって酵素法で測定できることは
既知の事実である（ベーリンガーマンハイム社のカタロ
グ）。その反応式を以下に示す。
【００４７】
【化１】
【００４８】この２段階の反応の内で、グルタミン酸オ
キザロ酢酸トランスアミナーゼが（ａ）の反応を右へ進
めるような平衡を有しておらず、また、グルタミン酸の
存在が右への反応を阻害する（生化学実験講座、アミノ
酸代謝と生体アミン（上）、ｐ．１６０）。そこで、グ
ルタミン酸を消去することによって、正確なＬ−アスパ
ラギン酸濃度を測定できる。食品などにおける高グルタ
ミン酸含有品はそのグルタミン酸が妨害することで、Ｌ
−アスパラギン酸の測定を正確なものにできていないこ
とをこの実施例に示す。
キザロ酢酸トランスアミナーゼが（ａ）の反応を右へ進
めるような平衡を有しておらず、また、グルタミン酸の
存在が右への反応を阻害する（生化学実験講座、アミノ
酸代謝と生体アミン（上）、ｐ．１６０）。そこで、グ
ルタミン酸を消去することによって、正確なＬ−アスパ
ラギン酸濃度を測定できる。食品などにおける高グルタ
ミン酸含有品はそのグルタミン酸が妨害することで、Ｌ
−アスパラギン酸の測定を正確なものにできていないこ
とをこの実施例に示す。
【００４９】０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（pH７．
４）中に、０．３mM ＮＡＤＨ、１mM α−ケトグルタ
ル酸、０．１mM Ｌ−アスパラギン酸、２０Ｕ／mlリン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
１．７μｇ／mlの本発明の酵素を溶解し、グルタミン酸
濃度を０から１０mMまで変化させて添加した。２５℃、
１０分間放置した後、３４０nmの吸光度を測定した。そ
の後、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（ベーリンガーマンハイム社製）を１．３Ｕ／mlの濃度
で添加し、２５℃、１０分間放置した後、再び、３４０
nmの吸光度を測定した。
４）中に、０．３mM ＮＡＤＨ、１mM α−ケトグルタ
ル酸、０．１mM Ｌ−アスパラギン酸、２０Ｕ／mlリン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
１．７μｇ／mlの本発明の酵素を溶解し、グルタミン酸
濃度を０から１０mMまで変化させて添加した。２５℃、
１０分間放置した後、３４０nmの吸光度を測定した。そ
の後、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（ベーリンガーマンハイム社製）を１．３Ｕ／mlの濃度
で添加し、２５℃、１０分間放置した後、再び、３４０
nmの吸光度を測定した。
【００５０】この２度の３４０nmの吸光度の差を、ＮＡ
ＤＨの分子吸光定数（６２２０Ｍ-1cm-1）から計算して
（６．２２で除す）アスパラギン酸濃度を測定した。ま
た、本発明の酵素を添加していないものを対照とした。
その結果を図１に示す。この様に、グルタミン酸の濃度
の上昇は、アスパラギン酸濃度の測定を妨害した。そし
て、本発明の酵素の添加によるグルタミン酸の消去は、
妨害消去に効果的であった。
ＤＨの分子吸光定数（６２２０Ｍ-1cm-1）から計算して
（６．２２で除す）アスパラギン酸濃度を測定した。ま
た、本発明の酵素を添加していないものを対照とした。
その結果を図１に示す。この様に、グルタミン酸の濃度
の上昇は、アスパラギン酸濃度の測定を妨害した。そし
て、本発明の酵素の添加によるグルタミン酸の消去は、
妨害消去に効果的であった。
【００５１】実施例７．次に、高濃度グルタミン酸存在
下のアスパラギン酸の本定量法が反応論的に、また、定
量的に進むことを示すために、次の実施例を示す。０．
１Ｍ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（pH７．４）中に、０．３
mM ＮＡＤＨ、１mM α−ケトグルタル酸、１０mMグル
タミン酸、２０Ｕ／mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベー
リンガーマンハイム社製）１．７μｇ／mlの本発明の酵
素を溶解し、アスパラギン酸濃度を０から０．２mMまで
変化させて添加した。２５℃、１０分間放置した後、３
４０nmの吸光度を測定した。
下のアスパラギン酸の本定量法が反応論的に、また、定
量的に進むことを示すために、次の実施例を示す。０．
１Ｍ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（pH７．４）中に、０．３
mM ＮＡＤＨ、１mM α−ケトグルタル酸、１０mMグル
タミン酸、２０Ｕ／mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ベー
リンガーマンハイム社製）１．７μｇ／mlの本発明の酵
素を溶解し、アスパラギン酸濃度を０から０．２mMまで
変化させて添加した。２５℃、１０分間放置した後、３
４０nmの吸光度を測定した。
【００５２】その後、グルタミン酸オキザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を１．３
Ｕ／mlの濃度で添加し、２５℃、１０分間放置した後、
再び、３４０nmの吸光度を測定した。この２度の３４０
nmの吸光度の差を、ＮＡＤＨの分子吸光定数（６２２０
Ｍ-1cm-1）から計算して（６．２２で除す）測定アスパ
ラギン酸濃度とした。また、本発明の酵素を添加してい
ないものを対照として示した。その結果を図２に示す。
本発明の酵素を添加して測定した場合は、測定濃度と
実際の添加したアスパラギン酸量を反応論的に正確に、
直線性良く測定できた。一方、本発明の酵素を添加しな
いで測定した対照は、実際のアスパラギン酸添加量に比
べて測定値は低い値を示した。
スアミナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を１．３
Ｕ／mlの濃度で添加し、２５℃、１０分間放置した後、
再び、３４０nmの吸光度を測定した。この２度の３４０
nmの吸光度の差を、ＮＡＤＨの分子吸光定数（６２２０
Ｍ-1cm-1）から計算して（６．２２で除す）測定アスパ
ラギン酸濃度とした。また、本発明の酵素を添加してい
ないものを対照として示した。その結果を図２に示す。
本発明の酵素を添加して測定した場合は、測定濃度と
実際の添加したアスパラギン酸量を反応論的に正確に、
直線性良く測定できた。一方、本発明の酵素を添加しな
いで測定した対照は、実際のアスパラギン酸添加量に比
べて測定値は低い値を示した。
【００５３】実施例８．Ｌ−グルタミン酸とＬ−ピログ
ルタミン酸と同時分別測定 グルタミン酸は旨味調味料として非常に有名な物質であ
り、古来、味噌醤油などの発酵食品ではその製造過程で
グルタミン酸の生成があり、味の良さにつながってい
る。しかしながら、グルタミン酸の生成の過程で非酵素
的に環化し、無味のピログルタミン酸が生成した場合、
旨味成分の少ない発酵食品ができあがってしまう。
ルタミン酸と同時分別測定 グルタミン酸は旨味調味料として非常に有名な物質であ
り、古来、味噌醤油などの発酵食品ではその製造過程で
グルタミン酸の生成があり、味の良さにつながってい
る。しかしながら、グルタミン酸の生成の過程で非酵素
的に環化し、無味のピログルタミン酸が生成した場合、
旨味成分の少ない発酵食品ができあがってしまう。
【００５４】そこで、ピログルタミン酸を測定すること
が重要である。現在、Ｌ−ピログルタミン酸の測定法と
して、ＡＴＰと５−オキソプロリナーゼを利用した報告
（特公昭５９−３７９４７）もあるがＨＰＬＣによる分
析が一般的である。ＨＰＬＣに比較して簡便に、多サン
プルの分析が可能である酵素法による分析は非常に有用
であり、また、本ピログルタミン酸開環酵素を利用すれ
ば下記の反応で、グルタミン酸との同時定量も可能であ
る。
が重要である。現在、Ｌ−ピログルタミン酸の測定法と
して、ＡＴＰと５−オキソプロリナーゼを利用した報告
（特公昭５９−３７９４７）もあるがＨＰＬＣによる分
析が一般的である。ＨＰＬＣに比較して簡便に、多サン
プルの分析が可能である酵素法による分析は非常に有用
であり、また、本ピログルタミン酸開環酵素を利用すれ
ば下記の反応で、グルタミン酸との同時定量も可能であ
る。
【００５５】
【化２】
【００５６】５０mMグッド緩衝液（pH７．１）中に０．
３５Ｕ／ml Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（生化学工
業社製）、１Ｕ／mlパーオキシダーゼ（生化学工業社
製）、０．８mM Ｎ−ヒドロキシスルフォプロピル誘導
体（ＤＡＯＳ、生化学工業社製）、０．８mM ４−アミ
ノアンチピリンを溶解した試薬３mlに２００μｌの５０
mg／ｌ Ｌ−グルタミン酸とピログルタミン酸量を０か
ら０．６７８mM間で変化させたサンプルを添加し、２５
℃、１０分間放置後、６００nmの吸光度（Ａ１）を測定
した。
３５Ｕ／ml Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（生化学工
業社製）、１Ｕ／mlパーオキシダーゼ（生化学工業社
製）、０．８mM Ｎ−ヒドロキシスルフォプロピル誘導
体（ＤＡＯＳ、生化学工業社製）、０．８mM ４−アミ
ノアンチピリンを溶解した試薬３mlに２００μｌの５０
mg／ｌ Ｌ−グルタミン酸とピログルタミン酸量を０か
ら０．６７８mM間で変化させたサンプルを添加し、２５
℃、１０分間放置後、６００nmの吸光度（Ａ１）を測定
した。
【００５７】そして、１５μｌの本発明の酵素（３．２
９mg／ml）を添加し、２５℃、２時間放置した後、６０
０nmの吸光度（Ａ２）を測定した。その結果、吸光度
（Ａ１）からＬ−グルタミン酸量を、吸光度差（Ａ２−
Ａ１）からＬ−ピログルタミン酸量を測定できた。吸光
度差（Ａ２−Ａ１）とＬ−ピログルタミン酸量をプロッ
トしたグラフを図３に示す。吸光度差とＬ−ピログルタ
ミン酸量は良好な直線性を示しており、本酵素でのＬ−
ピログルタミン酸の定量は十分実用的であった。
９mg／ml）を添加し、２５℃、２時間放置した後、６０
０nmの吸光度（Ａ２）を測定した。その結果、吸光度
（Ａ１）からＬ−グルタミン酸量を、吸光度差（Ａ２−
Ａ１）からＬ−ピログルタミン酸量を測定できた。吸光
度差（Ａ２−Ａ１）とＬ−ピログルタミン酸量をプロッ
トしたグラフを図３に示す。吸光度差とＬ−ピログルタ
ミン酸量は良好な直線性を示しており、本酵素でのＬ−
ピログルタミン酸の定量は十分実用的であった。
【図１】図１は、ＧＯＴを使用するＬ−アスパラギン酸
の測定方法において、グルタミン酸の存在がＬ−アスパ
ラギン酸の定量を妨害すること、及びその妨害が本発明
の酵素の添加によって除去されることを示すグラフであ
る。
の測定方法において、グルタミン酸の存在がＬ−アスパ
ラギン酸の定量を妨害すること、及びその妨害が本発明
の酵素の添加によって除去されることを示すグラフであ
る。
【図２】図２は、ＧＯＴを用いるＬ−アスパラギン酸の
測定方法において、グルタミン酸の存在がＬ−アスパラ
ギン酸の測定値の低下をもたらし、その測定値の低下
が、本発明の酵素の添加により回復することを示すグラ
フである。
測定方法において、グルタミン酸の存在がＬ−アスパラ
ギン酸の測定値の低下をもたらし、その測定値の低下
が、本発明の酵素の添加により回復することを示すグラ
フである。
【図３】図３は、Ｌ−グルタミン酸とＬ−ピログルタミ
ン酸を含有する試料中のＬ−ピログルタミン酸を分別定
量した結果を示すグラフである。
ン酸を含有する試料中のＬ−ピログルタミン酸を分別定
量した結果を示すグラフである。
Claims (8)
- 【請求項１】 次の性質： （１）作用：Ｌ−ピログルタミン酸と水とからＬ−グル
タミン酸を生成する反応（Ｌ−ピログルタミン酸開環反
応）、及びこの逆反応（Ｌ−グルタミン酸閉環反応）を
触媒する； （２）基質特異性： Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：Ｌ−ピログルタミン酸
に作用し、Ｄ−ピログルタミン酸、プロリン及びヒドロ
キシプロリンには作用しない； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：Ｌ−グルタミン酸に作用
し、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラ
ギン酸、Ｄ−アスパラギン酸及びＬ−アスパラギンには
作用しない； （３）至適pH及び安定pH範囲： Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：至適pHは３０℃にて３
０分間の反応においては７．２〜７．４であり、３０℃
にて３０分間の処理条件ではpH６．５〜１０．５の範囲
内で安定である； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：至適pHは３０℃にて３０分
間の反応において約８．０であり、３０℃にて３０分間
の処理条件ではpH６．５〜１０．５の範囲内で安定であ
る； （４）温度安定性： Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：pH７．４にて３０分間
の条件下では５５℃まで安定である； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：pH８．０にて３０分間の条
件下では５５℃まで安定である； （５）至適温度： Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：４５℃〜５０℃に至適
作用温度を有する； Ｌ−グルタミン酸閉環反応：約４５℃に至適作用温度を
有する； （６）分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲル濾過
法により測定した分子量約４７，０００を有するＬ−グ
ルタミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＬ−グルタミン酸・Ｌ
−ピログルタミン酸相互変換酵素の製造方法において、
該酵素を生産する能力を有するアルカリゲネス属に属す
る微生物を培養し、該培養物から該酵素を採取すること
を特徴とする方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の酵素をＬ−ピログルタ
ミン酸に作用せしめることを特徴とする、Ｌ−グルタミ
ン酸の製造方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の酵素をＬ−グルタミン
酸に作用せしめることを特徴とする、Ｌ−ピログルタミ
ン酸の製造方法。 - 【請求項５】 請求項１に記載の酵素を、Ｌ−ピログル
タミン酸を含有すると予想される試料に作用せしめるこ
とによりＬ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変
換し、次にこのＬ−グルタミン酸を測定することを特徴
とする、Ｌ−ピログルタミン酸の測定方法。 - 【請求項６】 請求項１に記載の酵素を、Ｌ−ピログル
タミン酸及びＬ−グルタミン酸を含有すると予想される
試料に作用せしめることにより該Ｌ−ピログルタミン酸
をＬ−グルタミン酸に変換し、次にＬ−グルタミン酸を
測定することを特徴とする、Ｌ−ピログルタミン酸とＬ
−グルタミン酸の合計量を測定する方法。 - 【請求項７】 試料中のＬ−グルタミン酸を測定して測
定値Ａを求め、次に測定反応系に請求項１に記載のＬ−
グルタミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素を添
加することによりＬ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミ
ン酸に変換せしめ、そして再度Ｌ−グルタミン酸を測定
して測定値Ｂを求め、測定値ＢとＡとの差を用いてＬ−
ピログルタミン酸の測定値を得ることを特徴とする方
法。 - 【請求項８】 Ｌ−グルタミン酸の存在により妨害され
るおそれのある測定方法において、測定反応系に請求項
１に記載のＬ−グルタミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相
互変換酵素を添加することによりＬ−グルタミン酸を消
滅又は減少せしめることにより、前記測定の精度を向上
せしめることを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7155988A JP2698056B2 (ja) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | Ｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7155988A JP2698056B2 (ja) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | Ｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09250A JPH09250A (ja) | 1997-01-07 |
| JP2698056B2 true JP2698056B2 (ja) | 1998-01-19 |
Family
ID=15617901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7155988A Expired - Lifetime JP2698056B2 (ja) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | Ｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2698056B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6848651B2 (ja) * | 2017-04-27 | 2021-03-24 | 株式会社明電舎 | 無人搬送車 |
| WO2019018406A1 (en) | 2017-07-18 | 2019-01-24 | Agrimetis, Llc | METHODS OF PURIFYING L-GLUFOSINATE |
-
1995
- 1995-06-22 JP JP7155988A patent/JP2698056B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09250A (ja) | 1997-01-07 |
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