JPH02147862A - 抗原の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は検体中の抗原の定量法に関する。さらに詳しく
は、本発明は、補欠分子族をリポソームに封入した抗体
または抗原感作リポソームを用い、リポソームを特異的
に破壊し、リポソームから流出した補欠分子族と、これ
に特異的に結合するアポ酵素との結合物を生成させ、そ
の酵素活性を測定することにより、抗原を定量する免疫
分析法に関する。

（従来の技術および課題） 近年、癌マーカーを中心に微量物質の測定が重要になっ
てきている。このような微景物質の測定は、高い特異性
、感度等が必要であり、抗原抗体反応を利用した方法が
最も適しており、特に、標識物質を用いた方法が感度面
で優れているため、広く用いられてきている。

標識物質としてはラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質
等があるが、ラジオアイソトープは放射能処理、特殊な
施設等が必要であり、酵素、蛍光物質を用いるエンザイ
ム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）法やフルオレッセンス・
イムノアッセイ（ＦＩＡ）法が主流になりつつある。

また、ＥＩＡ法やＥＩＡ法には操作上、抗原抗体反応し
た標識物質と未反応の標識物質の分離（Ｂ／Ｆ分離）が
必要な不均一法（ヘテロジーニアス法）と、Ｂ／Ｆ分離
を必要としない均一法（ホモジーニアス法）とがあり、
ヘテロジーニアス法は感度面では優れているが、操作が
煩雑である。

一方、ホモジーニアス法は操作が簡便で、迅速化が可能
であり、エンザイム・マルチブライド・イムノアッセイ
・テクニック（ＥＭＩＴ）法やアソシエイテッド・エン
ザイム・センシティブ・テクニック（ＡＥＳＴ）法等が
実用化されているが、ＥＭＩＴ法は高分子の測定が困難
であり、ＡＥＳＴ法は安定性等に問題がある。

他方、ホモジーニアス系にリポソームを用いた方法とし
て、抗原感作リポソームを用いた方法がワイ・インモリ
ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｙ
、　　Ｉｓｈｉｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

１　＋＋＋ｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄ）７５．３５１
−３６０（１９８４）等で報告されているが、この方法
は抗原を感作するため不安定な抗原には適応できない等
の問題がある。また、抗体感作リポソームを用いた方法
は特開昭５６−１３２５６４号、特開昭６１−２５０５
５８号および特開昭６１−２６９０７０号に報告されて
いるが、特開昭５６−１３２５６４号では、主に酵素を
封入物質としているので、リポソーム表面に酵素が吸着
したり、酵素がリポソームの組成の一部になり、活性基
がリポソーム表面に現れる等のためにリポソームが破壊
しなくてもある程度の酵素活性を示し、測定系に応用し
たときにブランク値が高くなる（このようなリポソーム
への結合等を非特異吸着と称する）等の問題がある。特
開昭６１−２５０５５８号では蛍光物質を封入した測定
系に関し、最初に抗体感作リポソームと検体を反応させ
ることで感度の高い測定を行なっている。また、特開昭
６１−２６９０７０号では、蛍光物質を用い、さらにフ
リーの抗体（抗原に対する抗体液そのままのものまたは
希釈液）で抗原をサンドイッチ型にすることで補体作用
を促進し、高い感度を得ている。しかし、これらの方法
は蛍光測定が主で一般的な比色法に応用することはでき
ない。

また、特開昭６１−２５０５５８号等にはニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のような補酵素が
封入物質の１例として記載されているが、それをどのよ
うに測定するのかについては記載がない。ＮＡＤをＮＡ
ＤＨにして測定するのが一般的であるが、それでは微里
物質を定量する場合の感度が低すぎる。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、リポソームを用いた方法で比色法に応用
でき、かつ、ブランク値が低く、より高感度で抗原を測
定できる方法としては、封入物質として低分子等を、ま
た、検出系は酵素様活性を示す系が望ましいと考え、鋭
意研究した。その結果、補欠分子族を封入物質とし、そ
れに特異的に結合して酵素活性を示すアポ酵素を検出系
に添加することで、封入物質を多量に封入でき、かつ、
酵素活性を測定することにより高感度に比色法等で抗原
を測定できることを見出した。

すなわち、本発明は酵素の構造、特に補欠分子族とアポ
酵素の関係を利用し、リポソーム内に補欠分子族を封入
した抗体または抗原感作リポソームを用いる検体中の抗
原の定量方法を提供するものであり、その第１の態様は
、抗体感作リポソームを用いた抗原の定量方法であって
、検体にリポソームを加え反応させた後、フリーの抗体
、補体およびアポ酵素を加え、抗原抗体結合リポソーム
を形成させ、補体によりリポソームを特異的に破壊させ
、流出する補欠分子族をアポ酵素と結合させ、この結合
物の活性を測定することで検体中の抗原を定量できる。

第２の態様は、抗原感作リポソームを用いた抗原の定量
方法であって、検体にリポソームおよび一定虫の抗体を
加え反応させた後、補体およびアポ酵素を加え、抗原抗
体結合リポソームを形成させ、補体によりリポソームを
特異的に破壊させ、流出する補欠分子族をアポ酵素と結
合させ、この結合物の活性を測定することで検体中の抗
原を定量できる。

本発明に使用するリポソームは菊地寛、井上圭三、（＋
９８３）細胞工学、２．１１３６−１１５０に報告され
ているような常法に従って調製できる。

リポソーム内に封入する物質は補欠分子族であり、低分
子のものが好ましい。このような物質の例としては、補
酵素フラビンアデニンジヌクレオチド（ＰＡＤ）、フラ
ビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ビオチンが挙げられ
、特にＦ’ＡＤが有利である。

リポソームへの抗体または抗原の結合は、フランシス・
ジエイ・マーチンら、バイオケミストリー（Ｆｒａｎｃ
ｉｓ　Ｊ　、Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０．４２２９−４２３８（１９８
１）、フランシス・ジェイ・マーチンら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｆ　ｒａｎｃｉ
ｓ　Ｊ　。

Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、　）２５７．２８６−２８８（１９８２）に
報告されている架橋法を用いて結合させることができる
。架橋剤は前者ではＮ−サクシンイミジル３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）のようなジ
チオピリジル基を、後者ではＮ−サクシンイミジル４−
（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラード（ＳＭＰＢ）の
ようなマレイミド基を用いてリポソームとタンパク等を
結合させているが、他に、Ｎ−（γマレイミドブチリル
オキシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（δ−マレ
イミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（ＥＭＣ３）
等を架橋剤として用いることもできる。

リポソームに感作させる抗体はポリクローナル抗体でも
モノクローナル抗体でも良いが、好ましくはモノクロー
ナル抗体が有利である。また、免疫グロブリンそのもの
でも良いが、Ｐ　ａｂ’分画のほう°が有利である。

抗原としては、ＡＦＰＳＣＥＡ等の癌マーカーＩｇＥ、
ＩｇＧ等の免疫プロプリン、インスリン、Ｔ３等のホル
モン、ウィルス、各種薬物が挙げられる。

フリーの抗体および抗原感作リポソームに反応させる抗
体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗
体どちらでも良″いが、補体作用を促進させる家兎ポリ
クローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体を用い
るのが有利である。

アポ酵素とは、それ自身では活性をほとんど示さないが
、補欠分子族と特異的に結合しホロ酵素になると活性を
示す酵素である。例えば、補酵素がＦＡＤの場合はアポ
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯＤ）、アポグルコー
スオキシダーゼ、アポグルタチオンレダクターゼ、アポ
リボアミドデヒドロゲナーゼ、アポフラボトキシン、ア
ポキサンチンオキシダーゼ等、ＦＭＮの場合はアポＬ−
アミノ酸オキシダーゼ、アポ旧黄色酵素等、ビオチンの
場合はアビジンが挙げられる。通常、アポ酵素はホロ酵
素を塩濃度の高い緩衝液で透析したり、強酸性で処理す
る等により得ることができる（丸屋文治ら、酵素ハンド
ブック（１９Ｂ２）、１１６頁等）。

補体としてはモルモット血清等を希釈したものを用いる
のが好ましい。

なお、リポソーム内に封入する物質としては、補欠分子
族のごとく、酵素の活性発現に関与する因子であって、
酵素発現因子と結合したとき酵素活性を示す物質（以下
活性化因子とする）であればよ（、好ましくは低分子の
物質、例えば、酵素サブユニットの一方、アロステリッ
ク酵素のエフェクターも使用可能である。この場合の酵
素発現因子は酵素サブユニットの他方、アロステリック
酵素で、このもの自身では活性をほとんど示さないが、
活性化因子と結合すると活性を示す。

本発明における補欠分子族とアポ酵素の結合物の活性測
定は、適宜な基質、例えば、結合物がＤアミノ酸オキシ
ダーゼの場合はＤ−アラニン、グルコースオキシダーゼ
の場合はＤ−グルコースをＴＯＯ８１４−アミノアンチ
ピリン、ペルオキシダーゼ等と共に適当量反応系に加え
、比色法等の常法によって行なう。

かくして、本発明の方法は、ヒトの血清、血漿、尿等の
検体中の抗原の定量に用いることができる。

本発明の第１の態様である抗体感作リポソームを用いる
方法を実施するに際しては、例えば、リポソームのリン
カ旨質濃度は０．０１〜２　、　Ｏｍｇ／ｄｌ、好まし
くは０．１〜０　、７　Ｒ９／ｄＩ程度とする。検体量
は適宜選択できるが、通常、検体１〜２０μａに対し、
リポソーム１〜２００μσ、好ましくは、５〜１００μ
Ｑ程度の割合とする。リポソームと検体との反応は１〜
３０分間、好ましくは、１〜１５分間程度行なわせる。

　　− リポソームと検体を反応させた後、１〜５０００倍、好
ましくは、５０〜１０００倍に希釈したアポ酵素、１〜
４００００倍、好ましくは、２０〜１００００倍に希釈
したフリーの抗体および補体として、例えば、補体価０
．０２〜２０　ＣＨａｏ−好ましくは、０．２〜２　Ｃ
Ｈ５゜のモルモット血清の混合液ｌＯ〜３００μρ、好
ましくは、１００〜２００μａを加え、１０〜６０分間
、好ましくは、１０〜３０分間反応させる。

ついで、基質として、例えば、Ｄ−アラニンの０．１〜
５．０％、好ましくは、０．５〜１．５％溶液またはＤ
−グルコースの０．０１〜５．０％、好ましくは、０．
３〜１．５％溶液を５０〜３００μＱ１好ましくは、１
００〜２００μＱ加え、１〜６０分間、好ましくは、ｌ
〜３０分間反応させ、発色させる。

反応後、発色藏の吸光度を測定し、予め、濃度既知の抗
原で同様に操作して作成した検量線から検体中の抗原濃
度を求める。

反応はいずれも１０〜４５℃、好ましくは、２５〜４０
℃で行ない、抗原抗体反応時のｐＨは５〜９、好ましく
は中性付近であり、酵素活性測定時はｐ１４５〜ＩＯ１
例えば、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの場合はｐＨ８〜９
．５、グルコースオキシダーゼの場合はｐＨ５〜８とす
ることが好ましい。

本発明の第２の態様である抗原感作リポソームを用いる
方法を実施するに際しては、例えば、１〜２０μρの検
体に、前記と同様なリン脂質濃度のリポソーム１〜２０
０μσ、好ましくは、５〜１００ＪＩＱおよび抗体１〜
２００μＣ１好ましくは、２０〜１００μｇを加え、１
〜３０分間、好ましくは、１〜１５分間反応させる。つ
いで、前記と同様のアポ酵素および補体の混合液２０〜
３００μり、好ましくは、５０〜２０６μｇを加え、１
０〜６０分間、好ましくは、１０〜３０分間反応さ仕る
。以下、前記と同様にして酵素活性を測定する。

反応温度およびｐＨも前記と同様である。

（実施例） つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ 封入物質の検討 ＤＡＯＤはＰＡＤとアポ酵素から構成され、高濃度緩衝
液で透析することにより簡単にＰＡＤとアポ酵素に解離
する。そこで、低分子であるＦＡＤをリポソームに封入
し、アポ酵素を検出系に加えた本発明法と従来法（補酵
素または酵素を封入しそれ自体の活性を測定する方法）
において測定感度および非特異吸着型について比較した
。従来法は補酵素としてＮＡＤ、酵素としてＤＡＯＤを
用いた。

（１）試薬の調製 （ａ）アポＤＡＯＤの調製 ＤＡＯＤ（硫安溶液に懸濁）を遠心分離（３００Ｏｒｐ
ｍ、１０分）し、沈澱物（Ｄ　Ａ　ＯＤを含む分画）を
得た。ついで、沈澱物をＯ，ＩＭ　ビロリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ＩＭ　　ＫＢｒ、３ｍＭ　　ＥＤＴＡ）ｐ）
１８　、５で溶解し、同様の緩衝液で４℃にて３日間透
析した。さらに、ｌ／６０Ｍピロリン酸ナトリウム緩衝
液（０，１％安息香酸ナトリウム）ｐＨ８゜３で４℃に
て１日間透析し、アポＤＡＯＤを得た。

得られたアポ酵素はＦＡＤがほぼ完全に取り除かれ、そ
れ自体では酵素活性をほとんど示さなかった。保存は冷
所で行なった。

（ｂ）リポソームの調製法 ３０１１１２ナス型フラスコに２２ｉｇ（約３０μｍｏ
りのＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）
とＩＯ，５ｘｇ（約３０μｍｏｌ）のコレステロールを
入れ、１０肩ρクロロホルムで溶解して混和した。

ロータリーエバポレータで溶媒を除去し、フラスコ壁面
に薄膜を形成させた。フラスコをデシケータに入れ、真
空ポンプで約２時間吸引し、溶媒を完全に除去した。つ
いで、フラスコに１．５３１１２の種々の封入物質液（
ＩＯｍＭ　　ＭＯＰＳＯ１１００ｍＭ　　ＮａＣＱＳｐ
Ｈ６，８）を加え、小さなガラスピーズ数個を入れ、窒
素でフラスコ内を置換して密栓した。５０℃で約３分間
加温し、ポルテックスミキサーで約５分間激しく振とう
（この操作を２回行い全量３ｘｆｆとした）し、さらに
、１０〜２０分間超音波照射（トミー精工：ＵＤ−２０
１）した。

ついで、遠心分離（３０００ｒｐｍ、　　１０分）し、
上清をセファロース４Ｂでゲル濾過（Ｉ　Ｏ＋ａＭ　Ｈ
ＥＰＥＳ、　　ｌ　ＯＯ＋ＩＩＭ　　ＮａＣｌ２、ｐＨ
７，４５で溶出）し、未封入の物質を除去し、各種物質
封入リポソームを得た。封入した物質の濃度はＦＡＤは
３０ｎＭＳＮＡＤは３０ｍＭ、ＤＡＯＤは約７５１０／
ｊ１１２であった。保存は窒素置換して冷所で行なった
。

２、封入物質の検討 得られたリポソームを適当に希釈し比較検討した。各リ
ポソームの希釈倍数はＰＡＤの場合、４０．８０．１６
０゛倍、ＮＡＤの場合、２．５．５．１０倍、ＤＡＯＤ
の場合、３．６．１２倍とした。

ＦＡＤ封入リポソームの場合は、リポソーム希釈液１５
０μ１２，５％トリト：／Ｘ−１００１５０μｅ１前記
（ＩＸａ）で得られたアポＤＡＯＤ（１５０〜６００倍
希釈）３００μｇを加え、３７°Ｃで３０分間反応させ
た。ついで、基質４００μＱを加え、３０℃で１０分間
反応させた後、５５０ｒ＋ｍの吸光度を測定した。また
、トリトンＸ−１００の代わりに緩衝液添加のものでら
行なった。希釈等に用いた緩衝液はｌ０ｍＭ　　ＭＯＰ
ＳＯ緩衝液（０゜１％ゼラチン、１００ｍＭ　　ＮａＣ
（２，１ｍＭ　　ＭｇＣ（ｂ、０．３ｍＭ　　ＣａＣ１
２ｚ、０．３％　Ｄ−アラニン、ＴＯＯ９、ペルオキシ
ダーゼ）ｐＨ６、８；基質は０．１５Ｍ　　ｈリス緩衝
液（０，７５％　Ｄアラニン、ＴＯＯ９，４−アミノア
ンチピリン、ペルオキシダーゼ）ｐＨ８、５であった。

ＤＡＯＤ封入リポソームの場合は、アポＤＡＯＤの代わ
りにＰＡＤを添加する以外はＦＡＤ封入リポソームと同
様の方法で行なった。

ＮＡＤ封入リポソームの場合は、リポソーム希釈液１５
０μρ、５％トリトンＸ−１００１５０μａ１緩衝液３
００μｇを加え、３７℃で３０分間反応させた。ついで
、基質４００μＱ加え、３０℃でＩＯ分反応させた後、
３４０ｎｍの吸光度を測定した。

また、トリトンｘ−ｔ　ｏ　ｏの代わりに緩衝液添加の
ものでも行なった。緩衝液は５５＋ｎＭ　　トリス緩衝
液（１００ｍＭ　　ＮａＣｌ２，０．１％ゼラチン、３
　、３　ｍＭ　　ＭｇＣ１２ｔ）ｐＨ７、８；基質はグ
ルコース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼであった。

リポソームへの非特異的吸着量はトリトンＸ−ｔ００を
加えた系の吸光度に対し、加えない系の吸光度の比が小
さいほど少なく、感度はトリトンｘ−ｔｏｏを加えた系
の吸光度から加えない系の吸光度を差引き、その差が大
きいほど高い感度を示す。

結果を第１表に示す。ＮＡＤは非特異吸着量は少ないが
、感度が低い。また、ＤＡＯＤは非特異吸着量が多い。

一方、本発明の方法は非特異吸着量が少なく、感度が高
い。リポソームのリン脂質濃度を一定にし、感度の比較
をすると、本発明の方法はＮＡＤおよびＤＡＯＤを封入
した従来法に比べて約６０倍の感度を示す。

実施例２ α−フェトプロティン（ＡＦＰ）の定量法ＰＡＤを封入
した抗体感作リポソームを用い、アポＤＡＯＤを検出系
に加える方法（本発明の第１の態様）でＡＦＰの測定を
行なった。また、抗ＡＦ’Ｐ・モノクローナル抗体をＰ
　ａｂ’の形でリポソームに感作した。アポＤＡＯＤの
調製は前記実施例１と同様に行なった。

（１）試薬の調製 （ａ）ＤＰＰＥ−ＤＴＰ（ジパルミトイルホスファチジ
ルエタノールアミンに架橋剤として５ＰＤＰを用いジチ
オピリジル基を導入したもの）の調製法 １４ｍｇ（約２０μｍｏりのＤＰＰＥとｆｏｘｇ（約３
０μｍｏｌ）の５ＰＤＰを６スρのクロロホルム−メタ
ノール（５：１）に溶解し、ｌＯμＱのトリエタノール
アミンを添加した後、窒素置換した。室温で１時間反応
させた後、■３．５酎のメタノール、１　、５　ｘ（ｌ
の精製水を加え、攪拌した後、水層分画を除去した。残
った有機層分画からロータリーエバポレーターで溶媒を
除去した。乾燥物をクロロホルムに溶解し、シリカゲル
カラムを用いて、クロロホルム、クロロホルム−メタノ
ール（９５：５）、クロロホルム−メタノール（８：２
）で溶出し、クロロホルム−メタノール（８：２）の溶
出液を回収し、ロータリーエバポレーターで約２ｘＱま
で濃縮しＤＰＰＥ−ＤＴＰを得た。得られたＤＰＰＥ−
ＤＴＰは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による確認
で１スポツトであり、回収率は７５〜９０％であった。

保存は窒素置換し、−２０℃で行なった。

（ｂ）ＦＡＤ封入リポソームの調製法 ３０ｗＱナス型フラスコに２２ｍｇ（約３０μｌｌ１ｏ
ｌ）のＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファデジルコリン
）と１０．５１９（約３０μｍｏｌ）のコレステロール
を入れ、ＩＯｘρのクロロホルムで溶解し、ＤＰＰＥ−
ＤＴＰをＤＰＰＣ：コレステロール：ＤＰＰＥ−ＤＴＰ
が１：ｌ：０．１（モル比）になるように加え、混和し
た。前記実施例！、（＋　）（ｂ）と同様にして、Ｆ’
ＡＤ封入リポソームを得た。保存は窒素置換し、冷所で
行なった。

（ｃ）抗体感作リポソームの調製法 ０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４、２で透析した１ｍ（２のマ
ウス抗ＡＦＰ・モノクローナル抗体（約２Ｈ／１１２）
に０　、８　ｍｇペプシンを加え、３７℃で約２０時間
加温してベブノン消化を行なった。溶液のｐ　Ｈを８．
０に調製し、沈澱物を溶解後、セファクリルＳ−２００
でゲル濾過（０，１Ｍリン酸緩衝液、Ｉ　ｍＭ　　Ｅ　
Ｄ　Ｔ　Ａ　　ｐＨ６、０で溶出）し、Ｆ（ａｂ’）を
分画を得た。

ついで、Ｐ（ａｂ″）、にジチオスレイトール（ＤＴＴ
）を終濃度２０ｍＭになるように加え、３０℃で９０分
間加温した。遠心分！（３０００ｒｐｍ、　２０分）し
、上清をセファデックスＧ−２５でゲル濾過（ｌ　Ｏｍ
Ｍ　　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　　ＮａＣ（ｐＨ７，４
５で溶出）し、Ｆ’　ａｂ’分画を得た。

ついで、０　、５　ｔｘ（ｌのＦ　ａｂ’溶液（約Ｉ　
Ｒ９／ｘ（２）に前記（Ｉ　Ｘｂ）で得られたＦ’ＡＤ
封入リポソーム液（リン脂質的５　ｍｙ）を加え、ゆっ
くり攪拌し、冷所で１日間反応させた。２０℃ｇの２５
ｍＭ　　メルカプトエチルアミン溶液を加え、室温で２
０分間反応させた。遠心分離（３０００ｒｐｍ、　　１
０分）し、上清をセファロース４Ｂでゲル濾過（１０ｍ
Ｍ　　ＭＯＰＳＯｌＩ　００ｍＭ　　ＮａＣＱ　　Ｏ，
１％ゼラチンｐＨ６、８で溶出）し、未反応のＦａｂ’
を除去し、抗体感作リポソームを得た。保存は冷所で行
なった。

（２）ＡＲＰの定量 あらかじめ既知濃度になるように１％ＢＳＡ（牛血清ア
ルブミン）で希釈したヒトＡＦＰをＵ型マイクロプレー
トのウェルにｌＯμρずつ分注した。

ついで、前記（＋　）（ｃ）で調製したリポソームを適
当量に希釈（リン脂質濃度：０．２〜０．５　ｍｇ／ｄ
ｉ）した液を５０μρずつ分注し、３７℃で１０分間反
応させた。家兎流ＡＦＰ・ポリクローナル抗体（６０〜
５００倍希釈）、モルモット血清（０，２〜２ＣＨｓｏ
）およびアポＤＡＯＤ（１５０〜６００倍希釈）を混和
した溶液１５０μｇを加え、３７℃で２０分間反応させ
た。さらに、基質１００μＣを加え、３７℃で３０分間
反応させた後、マイクロプレートリーダー（東ソー：Ｍ
ＰＲＡ４）で吸光度（主波長５５０ｎｍ、副波長６００
　ｎｍ）を測定した。

また、抗体感作リポソームの代わりに抗体の感作してい
ないリポソームおよび家兎流ＡＦＰ・ポリクローナル抗
体またはモルモット血清の代わりに緩衝液を加えたもの
でも同様に行なった。リポソーム、家兎流ＡＦ’Ｐ・ポ
リクローナル抗体、モルモット血清、アポＤＡＯＤの希
釈は１０ｍＭＭｏｐｓｏ緩衝液（０，１％ゼラチン、１
００ｍＭＮａＣｆ２，１ｍＭ　　ＭｇＣＱｔ、０．３ｍ
Ｍ　　ＣａＣ＆ｔ、０．３％　Ｄ−アラニン、ＴＯＯＳ
、ペルオキシダーゼ）ｐＨ６、８で行なった。基質は０
．１５Ｍトリス緩衝液（０，７５％Ｄ−アラニン、ＴＯ
ＯＳ。

４−アミノアンチピリン、ペルオキシダーゼ）ｐＨ８５
を用いた。

結果を添付の第１図に示す。第１図中、■はすべての試
薬を入れたもの、２はモルモット血清を除いたもの、３
は家兎流ＡＦＰ・ポリクローナル抗体を除いたもの、４
は抗体の感作していないリポソーム用いたものである。

■ではＡＰＰｉ１１度に依存し吸光度が増加し良好な検
量線を示すが、２．３および４ではＡＦＰ濃度に関係な
くほぼ一定の吸光度を示している。このことから、この
実施例の方法によりＡＦＰの測定が高感度に行なえるこ
とが明らかである。測定範囲は１０〜７００ｎｇ／ｘＱ
である。

実施例３ β、−ミクログロブリン（ＢＭＧ）の定量法実施例２と
同様にＦＡＤをリポソームに封入し、抗原（ＢＭＧ）を
感作させたリポソームを用い、アポＤＡＯＤを検出系に
加えた系でＢＭＧの定量を行なった（本発明の第２の態
様）。アポＤＡＯＤ調製は実施例１と、また、ＦＡＤ封
入リポソームの調製は実施例２と同様に行なった。

（＋）試薬の調製 抗原感作リポソームの調製法 １０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝′ｔＬ（１００ｍＭ　　Ｎａ
Ｃ１２）ｐＨ７，４５で透析したＩＪ１１２ＢＭＧ（約
０．６ｙｇ／ｊＩ（２）に３０μ（の１０ｍＭ５ＰＤＰ
（エタノールに溶解）を加え、室温で３０分間反応させ
た。セファデックス６−２５でゲル濾過（０，１Ｍ酢酸
緩衝液ｐｉ−１４，５で溶出）し、ジヂオピリノル化し
たＢＭＧ分画を得た。ついで、ＤＴＴを終濃度５０ｍＭ
になるように加え、室温で３０分間反応させた。

遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）した後、上清をセ
ファデックスＧ−２５でゲル濾過（１０ｍＭＨＥＰＥＳ
、Ｉ　００ｍＭ　　ＮａＣＱ　　ｐＨ７，４５で溶出）
し、ＢＭＧ−ＳＨを得た。

ｌｘＱ　　ＢＭＧ−５Ｈ（約０．３次９／酎）にＰＡＤ
封大封水リポソーム液ン脂質的３　ｍｇ）を加え、ゆっ
くり攪拌し、冷所で１日間反応させた。２０μｇの２５
＋＋＋Ｍ　　メルカプトエチルアミン溶液を加え、室温
で２０分間反応させた。遠心分離（ａ　ｏ　ｏ　。

ｒｐｍ、１０分）し、上清をセファロース４Ｂでゲル濾
過（ｌｏｍＭ　　ＭＯＰＳＯｌｌ　００＋ｎＭ　　Ｎａ
Ｃｆ２０．１％ゼラチン、ｐＨ６，８で溶出）し、未反
応のＢＭＧ−ＳＨを除去し、抗原感作リポソームを得た
。保存は冷所で行なった。

（２）ＢＭＧの定量 あらかじめ既知濃度になるように１％ＢＳＡで希釈した
ＢＭＧをＵ型マイクロプレートのウェルに１０μＱずつ
分注した。ついで、（１）で調製したリポソームを適当
量に希釈（４０，６０倍希釈）した液５０μＱ１家兎抗
ＢＭＧ・ポリクローナル抗体（２５０，５００倍希釈）
２０μｇを加え、３７℃で１０分間反応させた。モルモ
ット血清（０゜２〜２ＣＨ６゜）およびアポＤＡＯＤ（
１５０〜６００倍希釈）を混合した溶液１００μｇを加
え、３７℃で２０分間反応させた。さらに、基質を！０
０μｇ加え、３７℃で３０分間反応させた後、マイクロ
プレートリーダー（東ソー：ＭＰＲＡ４）で吸光度（主
波長５５０ｎｍ、副波長６００　ｎｍ）を測定した。リ
ポソーム、家兎流ＢＭＧ・ポリクローナル抗体、モルモ
ット血清、アポＤＡＯＤの希釈液および基質はＡＲＰの
定量法と同様のものを用いた。

結果を第２図に示す。第２図中、■はリポソーム４０倍
希釈・抗体２５０倍希釈のもの、２はリポソーム６０倍
希釈・抗体５００倍希釈のものである。ｌではＢＭＧ濃
度１５μｇ／ｘ（ｌまで、２では３μ９／ＩＩｇまでの
測定が可能である。

実施例４ ＢＭＧの定量２ 血清を希釈した系でＢＭＧの定量を行った。試薬等は実
施例３と同様のものを使用した。

（１）ＢＭＧの定量 血清（ＢＭＧａ度二６Ｍ９／ｌりをＩ％ＢＳＡで希釈し
、ＢＭＧｆｉ度０〜４００　ｎｇ／ｘ（ｌの溶液を調製
し、これを用いて検量線を作成し、血清中のＢＭ（４度
を定量した。血清は１％ＢＳＡで４０倍希釈、また、リ
ポソームは６０倍希釈、家兎流ＢＭＧ・ポリクローナル
抗体は７５００倍希釈して用いた。

以下実施例３と同様の方法で行なった。

検量線を第３図に示す。０〜２００　ｎｇ／ｒｘＱの濃
度範囲を充分測定できる検量線が得られる。第２表に血
清の測定値を示す。対照であるＲＩＡ法の測定値とほぼ
一致した値が得られる。

第２表 （μｇ／肩ｅ） （発明の効果） 本発明は、抗体または抗原感作リポソーム内に補欠分子
族を封入し、検出系に封入物質と特異的に結合して酵素
活性を示すアポ酵素を添加することにより、封入物質を
リポソーム内に多量に封入でき、かつ、抗原の量に応じ
て補体作用により流出する補欠分子族とアポ酵素の結合
物の酵素活性を測定することで抗原を高感度に測定がで
きる。

また、酵素を封入した場合と比較し、リポソームへの非
特異的吸着が少ないため、測定系でブランク値が低い。

さらに本発明法はＢ／Ｆ分離が不要であり操作が簡便で
測定時間も短い。

このため、本発明方法は、ＡＦＰ、ＣＥＡ等の癌マーカ
ー、ＩｇＥ、ＩｇＧ等の免疫グロブリン、インスリン、
Ｔ３等のホルモン、ウィルス、薬物等の広範囲の測定に
利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗体感作リポソームを用いたＡＲＰの定量にお
ける添加試薬の影響を調べた結果を示すグラフ、第２図
は抗原感作リポソームを用いたＢＭＧの定量における検
量線、第３図は血清中のＢＭＧの定量における検量線で
ある。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）補欠分子族を封入した抗体感作リポソームと検体
   を反応させた後、フリーの抗体、補体および補欠分子族
   と特異的に結合するアポ酵素を加えて補欠分子族とアポ
   酵素の結合物を生成させ、その活性を測定することを特
   徴とする検体中の抗原の定量方法。
2. （２）補欠分子族を封入した抗原感作リポソーム、検体
   および一定量の抗体を反応させた後、補欠分子族と特異
   的に結合するアポ酵素および補体を加えて補欠分子族と
   アポ酵素の結合物を生成させ、その活性を測定すること
   を特徴とする検体中の抗原の定量方法。