JPS6199867A - 免疫分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔゛発明の技術分野〕 本発明は免疫分析用試薬に関し、更に詳しくは試料中に
存在する特定の抗原又鉱抗体を定量分析するための免疫
分析用試薬に関する。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

近年、ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の
１膿瘍マーカーが見出されるようになった。

例エニα−フ１ドブロチイン（ＡＦＰ）％　ガン胎児性
抗原（（ＪＡ）、塩基性フェトプロティン（１３ＦＰ）
および枡ガン胎児性抗原（ＰＯＡ　）などがその代表例
とし′Ｃ挙げることがで鰺る。これらの１瘍マーカーの
６［［正常人の場合、非常に低い（例えｄ、・・ＡＦｔ
’の場合：　１０　ｎ　ｇ　／ａｌ以下）。一方、腫瘍
患者の場合には正常人の１０倍程度の値を示すことが多
い。

いずれＫしても、唾瘍マーカーの分析定菫には、非常に
高い検出感度が曹求される。

仁の要求を満たすためＫ　、従来は、放射性物質で標識
化した抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（几Ｉ
Ａ）が開発された。しかしながら、ＲＩＡは取扱いが面
倒で廃棄処理も間ＭＫなる。そこで放射性物質の代りに
酵素や螢光物質など聞々の物質で標識化した抗原あるい
は抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これらに
おいても遊離抗体と結合抗体を何ら力）の方法で分離し
なければならないという欠点を有していたつまた。　Ｒ
ｏ＠ｅｎｌＬｔａｌＡ　、Ｆ、　ｖａｒｇａｓ、Ｍ　、
　Ｇ　、　ａｎｄ　　Ｋ１１ｓｓ　　に、８．　　（１
９７６）ＣＩＩｎ　。

Ｃｈｅ＋ｎ、　２２．１８９９　Ｋ発表すしたｂＭｔ’
ｒ法！−１，分１工程の不要な均−系で測定できる画期
的な手法であるが、原理的に高分子情のタンパク質抗原
あるいは抗体忙は適用できないっ ところで、　Ｈ＊ｘｂｙ、Ｊ、Ａ、Ｋ１ｎ５ｋｙ、Ｃ，
Ｂ、ａｎｄ　Ｋ１ｎ５ｋｙ８、Ｃ，（１９６８）　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６１３００で、　Ｑｉ溶件の抗
原を膜内に取り込みグルコースを封入したリポソームを
ｍ１ｌｌＬ、抗原抗体反応によるリポソームの破壊罠伴
うグルコースの流出唆を測定することによシ、抗泳の定
量を行う手法が発表されたつしかしながら、との手法を
用いて傾逼マーカーを測定するためＫは、マーカー自身
あるいはこれらのマーカーに対する抗体、すなわちタン
パク質である免疫グロブリンをリポソーム上に担持させ
ねばならない。ところが、現在まで、り旨溶性のタンパ
ク質を担持したリポソームを用いることは可能であった
が、親水性のタンパク質を担持したリボゾームを用いる
抗原または抗体の免疫分析法は報告されていない。それ
は、親水性のタンパク質をリポソームに担持せしめる技
術が確立されていな泰うたからである。

一方、特開昭５６−１３２５６４″′免疫分析用生成物
および方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内
部忙酵素を対人したリポソームを用いて免疫分析を行う
方法が開示されているが、そこでは。

タンパク質の担持方法としてグルタルアルデヒド等の二
官能性架橋試薬を用いる方法を提案し゛ている。本発明
者らの研究によると、このような架橋試薬で抗体をリポ
ソームに担持すると、一般に抗体の活性が低下し、抗原
抗体反応に伴うリポソームの破壊が引起されなくなるこ
とが判明した。

更に、これらのような従来の免疫分析技術は。

総じて、分析時間に長時間を要し、しかも大量の試料を
自動的に測定することができないという欠点を有してい
たり 〔発明の目的〕 本発明は、被検物質の抗原や抗体と特異的に反応するこ
とＫより被検物質の定量分析が高い精度で行、をえる免
疫分析用試薬を提供する仁とを目的とする。

〔発明の概要〕 本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究を重ね
た紡果、補体１６性によシ溶解作用を受ける適鳴な脂質
組成及び構成比を有するリポソーム上に、活性を低下さ
せることなく、諸料中の抗原又は抗体に対応する抗体又
は抗原を適尚量固定化することに成功し、更に、リポソ
ーム内に標識物質を封入し追歯な補体価を選択すること
によシ、本発明の目的が達成されることを見出し１本発
明を完成するに至った。

以下１本発明を更に詳細に説明するっ 本分析方法による定量が可能な被検物質は、腫傷マーカ
ー（１１Ｊ述のｈｙｐ　、　ＢＦＰ　、　ｃｇＡ、及び
ＰＯＡ等）免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥｌ、ＩｇＧ
及びＩｇＭ等）ホルモン（インタ２す／、Ｔ３及びＴ４
岬）及び薬物等の抗原、あるいはそれらに対応する抗体
であって、広範囲に亘るつ 又、リポソーム土建固定化される抗原又は抗体は親水性
であることが必要である。しかしながら固定化された抗
原又唸抗体と抗原抗体反応を起こす被検物質は、親水性
でなくともよいっ本発明の試薬においては、抗原又は抗
体は、架橋剤によって、リポソーム上に原子間の共有結
合で固定化されている。

リポソーム内に封入される標識物質は、親水性で心って
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならないつかかる物質としては、例えば、高湊度で
は自己消光により螢光状示さないが、低濃度（３０Ｍ以
下）で卯常をて強ｉ螢光を発するカルボキシフルオレセ
インのよウナ螢光性化合物茎すボノーム外で酸化反応に
よシ発光するルミノールやルシフェリンのような発光性
化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有す
る吸光性化合物（水溶性色素等）寡酸化酵素の作用によ
シ分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたらす
グルコース及びシェークソースなどの糖類；テトラペン
チルアンモニウムのような比較的大きなイナン性化合物
；ニコチンアミドアデニンジ文クレオチド’　（ＮＡＤ
）のような補＃素類；メチルビオロゲンを初めとするラ
ジカル化合物などが望ましい。そして、これらの化合物
は、検出方法、感度及びリポソームの安定性等の因子を
勘案した上に、適宜に選択される。

以上に説明した本発明の免疫分析用試薬は、例えば、次
の如き方法で製造される。まず、所望のリン脂質及びｍ
脂質の少くとも一方と架橋剤（これを用いた場合を架橋
法という）とを溶媒中で反応せしめ、リポソーム上に固
定化される抗原又は抗体と結合し得る官能基を脂質分子
に導入する。

次いで、得られた官能性脂質とコレステロール及び必要
であれば他の脂質の適尚量をフラスコ導入れ、溶媒を加
えて溶解させた後、溶媒を留去し。

吸引乾燥する。ここでコレステロールを用いたのはよシ
安定性を増したリポソームを得るためであり、その比率
唸用いたリン脂質及び糖脂質に対して】０〜５００モル
チであることが望ましい。しかる後、壁面に薄膜が形成
されたフラスコ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密
栓をして振とうし、リポソームのＳ濁液を得る。

一方、リポソームに固足化すべき抗原又は抗体と架橋剤
とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、
必要であれば、核架橋基を還元する試％（例えばジチオ
トレイトール；　ＤＴＴ）と更に反応させて、修飾抗原
又は抗体を得る。

ＪＩｋ後Ｋ　ＩＪボッ・−ムと修飾抗原★たは抗体とを
゛適当な緩衝液中で反応せしめる仁とはよシ、本発明の
免疫分析用試薬が得られろ。この際、測定対象物の檀＠
によシ修飾抗原あるｈ＃ｉ抗体の感作濃度を適当に変化
させることが重要である。なお、被検物質が腫瘍マーカ
ーあるい唸免疫グロブリン等の時（では、場合に応じて
酵素的に分解した抗体をリポソームに感作させて用いる
ことも可能である。

上記製造法にかける架橋剤としでは、例えば。

Ｎ−サクシソイζジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピ十ネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−サクシノイミジル４−（
ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（８ＭＰＢ）、　
Ｎ−サクシンイ電ジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
アセテート（８ＭＰＡ）　、Ｎ−サクシノ（ｔジル４−
（９−マレイミドフェニル）プｏ　ヒｔ＄　−）　（８
ＭＰＰ）　、　Ｎ　−（ｒ−マｖイ電ドブチリルオキシ
）サクシンイ電ド（ＧＭＢＳ）　、Ｎ　−（ε−マレイ
ミドカプロイルオキシ）サクシンイで示され、ｉ和を条
件下で反応して、第一アミノ基を有する化合物どうしを
結合する架橋剤であ抄ファルマシア社から市販されて匹
る。感作させるり／バク質抗原をこの８Ｐｌ）Ｐで処理
し、ジチオトレイトール（１）Ｔ′ｒ）で還元した後、
予め５ＰＤＰを作用させたリポソームと反応させると、
室龜以下。

数時間から１日でリポソーム上に抗原を感作することが
で睡るっ ８ＭＦＢは、次式： 、００、・ −５，１い、＋□ で示され、８ＰＤＰと同様な反応でタンパク質を固定化
できるが、最終生成物中に−５−８−結合を含まず（−
８−結合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定で
ある。

このようにして得られた免疫分析用試薬は、補体の存在
下で試料と接触すること罠よりリポソームが破壊され、
内部に封入されていた標識物質が流出する。この流出し
た標識物質を定量すること罠よって試料の定１１５）折
を行なう。この定量操作に用いられる補体とし°Ｃは、
格別限定されないが通常補体の活性すなわち補体価の高
いモルモット血清が用いられる。しかし、場合に応じて
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよいっ又１
本免反汗析用試薬を用いて抗原あるいは抗体を定量する
際には、この補体価が測定範囲及び検出限界を決定する
のに重要であり、この補体価を種々変化させて望ましい
測定条件を得る。

なお、本発明の免疫分析用試薬は、まず脂質と抗原又は
抗体とを、架橋剤を用いて結合せしめ。

次いで得られた結合体を界面活性剤とともに水中に加え
てギセルを形成させ、しかる後、透析あるいはゲル口過
等を用いて界面活性剤を除去することにより製造するこ
とも可能である。

〔発明の効果］ 本発明に係る免疫分析用試薬を用いることＫより、均−
系の反応で広範囲に亘る抗原あるいは抗体の定量分析が
高い検出感度で精度良く行なえる。

〔発明の実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は１本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

実施例１ 本実施例では、免疫グロブリンｏ　（ＩｇＧ）を感作し
たリポソームを調製しそれを用いて抗ヒト−ＩｇＧ抗体
の測定を行な−１た。用いた試薬のうち。

シハルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ’）。

コレステロール、ジパル電トイルホスツァチシルエタノ
ールアミン（１３ＰＰＦ；）及びジチオトレイトール（
１）ＴＴ　）はシグマ社製のものを用いた。１４−サク
シンイきジル３−（２−ピリジルジチｔ）プロピオネー
ト（、’３ＰＤＰ）及びセファデックスＧ−５フアイン
はファルマシア社より購入した。池の試薬は市販品（特
級）をＮｌ製せずに使用した。なお、水はイオン父換水
を用いた。

そしてまずＤＰＰＥ−ジチオピリジネート（ｎｐｐｎ−
Ｄ’ｒＰ）の調製をし九っ密栓付三角フラスコＫ　７０
ｍｇのＤＰＰＢを分取し、５μｊのクロロホルム／メタ
ノール（５：１）溶液に／８Ｉ１４Ｌ、、ｓｏ、１のト
リエタノ−ルアξン及びＦ＋ＯｍｇαＰｉ）Ｐを添加後
窒素置換した。

室温で１時間反応させた後、ロータリーエバポレーター
で溶媒を除去した。その乾燥物を５−のクロロホルム／
メタノール（１０：　ｌ　）　Ｋｉ！解サセすシリカゲ
ルカラムを用いて！／ＩＮした。生成物画分を回収１７
、エバポレーターで約５μｄまで濃縮した。

収率は８０〜９５−であったっ保存は窒素封入下−加υ
で行ったっ ついでリポソームの調製を行なった。

使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１）に＃［した。マス５ｍＭ　ＤＰ
ＰＣ（２００，ａ／）、１０ｍＭ：ｒｖＸテ０−　ル（
１００ａｌ）及び１　ｍＭ　ＤＰＰＢ−ＤＴＰ　（Ｅ４
．ｃｔｌ？　）をｌｏｄのナス型フラスコに入れ、更に
２−のクロロホルムを加えて良く混合した。水浴中（約
（資）℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒ｔ−
線除去た。再び２　ｄのクロロホルムを添加し、十分攪
拌後、再度ロータリーエバポレーターによシ溶媒を蒸発
させた。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄
膜が形成された。フラスコをデシケータ−中に移し、真
空ポンプで約１時間吸゛引し、溶媒を完全に除去した０
次に、１００μＪ’／）０．２Ｍカルポギシフルオレセ
イン（イーストマン・コダック社製、　！’）１１７．
４；以下、ＣＦと略記）を添加し、フラスコ内部を窒素
で置換した後に密栓して、６００程度の水浴中に約１分
間Ｉ！！潰した。続いて、　Ｖｏｒｔｅｘミキ→トーを
用い、壁面の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを
激しく振とうした。この操作により、リボノーム懸濁液
がｖ４ＩＩ！！された。ゼラチン−ベロナール１１１１
１（以下、ＧＶＢ−と略記）を少量６加し、リポソーム
懸濁液を完全に遠心チ為−ブに移したつ４℃。

１５．０００ｒｐｍで加分間遠心し、遊離のＣＦを除去
した。上清が透明になるまで（ｆｆＢ−を用いてこの操
作を繰９返した。最後ｉＣ２ｒｎｌのＧＶＬ（’−及び
５μｌの１０　％　ＮａＮ５を加え、　Ｖｏｒｔｅｘミ
キサーで懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫に保存した。

次にと）　−ＩｇＧの修飾を行なったｏ　ｓｍｇのヒト
−ＩｇＧ　（マイルズ社製）を２屑ｌの０．０１　Ｍ　
ＨＢＰＥ８緩衝Ｗ　（ｐＨ７，４５０，８５４ＮａＣ１
含有）に溶ＭＬ、窒素で置換した後、１ｏｔｉｌの１０
ｍＭ　８ＰＤＰ（工ｉｔ　／　−ル溶液）を加え、十分
攪拌してそのまｔ室温で（資）分間反応させた。反応後
、反応液を予め生理食塩水で飽和させたセファデックス
（）−５フアインのゲルを充填したカラム（ゲル体ｎＩ
＝約１５＋＋＋７）に展開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
ｉ（４，５、０，８５％　ＮａＣ１含有）で溶出させた
。最初のタンパク′青フラクシ冒ン（約’１ｒｎｌ）に
更１ｃ　２　＃Ｉｔの酢酸緩衝液を加え、窒素置換後、
ジチオトレイトール（約（資）ｍｇ）を添加した。十分
に攪拌してＺ）分間室温で反応させた０反ファデックス
Ｇ−δファインのゲルを充填しであるカラム（ゲル体積
：約３０ゴ）Ｋ反応液を展開し前記１（ｇＰＢ８緩衝液
で溶出した。最初のタンパク質７ラクシ曹ン（約２４）
を集め、窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存した。

そして、前述のようにして！１１１１したリボゾーム懸
濁液とＩＩ：の修飾ヒ）−ＩｇＧＳ液を混合し、窒素置
換後密栓して室部でゆっくり侵とうし・ｔから１晩反応
させた。前記Ｈ，ＢＰＢ８緩衝液１次いでＧｖＢ−で洗
浄して、未反応のヒト−１，、Ｇを除去しもこうして得
られたヒトーＩｇＧ感作リポソームｋ。

反応に用いたり、ｆノームａ２ｑ液の殿にｍ尚するＧｖ
Ｂ−＆　Ｕ　５ｊｊ　ｌ　Ｏ１０％　ＮａＮ５　ヲｊｌ
ｉ後Ｋ　１４　ｊＪｒＪし、５ＩＦ４゜ｔｉ素置４Ａｉ
’ｈ　％使用すＳまで冷蔵庫に保存したつ上述したヒト
−１ｇＧ感ｆ゛トリボノームを用いた、抗ヒト−ＩＲＱ
抗体の測定を行なった。

ヌ／り社製のＵｆｉプレート（９６穴）に適ａｔのＧｖ
Ｂ”　（ｏ、１ｍＭ　　八ｔｇｃ１２及び０．０３＋ｎ
Ｍ　Ｃ１（Ｊｚを含有Ｌ／　テ’ｖｓ　７１ＧＶ１ｒ）
　　ｆ　？ｈ　択シ；を抗ヒＦ　　’ＫＧ４１　体（原
液濃度：２ｍｇ／ｍｌ）を６μｊずつ注入したり次いで
、上記感作リボゾーム懸濁液をＧＶＢ２＋で１００倍に
希釈し、５μノずつ各ウェル（ｗｅ　ｌ　ｌ　）に分注
した。

最後に、適当にＧＶＢ２＋で希釈した補体（モルモット
血清）を６μＩずつ添加した。反応は３７　”Ｏ恒温度
下で１．５時間行った。反応後、各ｗｅｌｌに１００ａ
ｌの０．０１Ｍ　ＮＤ’ｒＡ−ベロナール緩衝液を加え
て反応を停止し、プレート用螢光分光光度計（コロナ電
子社製１ＭＴＰ−１２Ｆ）で各ｗｅｌ　ｌの螢光を測定
した（Ｅｘ：４９０ｎｍ、　Ｗｍ：５２０ｎｍ）ｑ　ｌ
ｋオ、１１定Ｍｔｔ、Ｋ体、ｔび補体の代わ抄に１０　
％　Ｔ’ｒｉ　ｔｏｎ　Ｘ　−１００及びｕｖｕ”を６
μＩずつ添加し九ｗａｌｌの螢光と、抗体の代わ如に２
ｓｓｌのＧＶＢ　　を添加したものの差を１００価とし
た相対値で表示した□４００倍希釈（（１体制目）、５
Ｃ１１，。）の補体を用いた場合の結果を第１図の峙性
図に示した。図で曲ｉｔ　ａは本願＠明による免疫分析
用試ＩＩ＆を用いて、試料中に含まれ九抗ヒ）−ＩｇＧ
抗体の濃度と反応により遊出Ｅ、たｌｌｌ１職物質の相
対遊出率との関係を表わしている。図かられかるように
両者の間には明確な相関関係があシ、これをもとにして
試料の定量分析が行なえることがわかる。これに対して
曲線すは先にあげた従来技術として開示されていたグル
タルアルデヒド（ＧＡ）全架橋試薬に用いて、　Ｉ）Ｐ
ＰＣ’、コレステロール、　ｏｐｐｇ−ＤＴＰの構成比
を１：１：０．０５の割合に調整したリポソームによる
同様の反応を示している０図かられかるようＫこのよう
な架橋試薬を用いたリポソームは、試料一度の変化に対
してリポソームが溶解して標識物質の流出する割合がほ
とんど変化せず、檀會な定量分析に用いることは不可能
であるヒとがわかる。

実施例２ 実施例１と同様な製法でさらにリポソーム中のＤＰＰＢ
−ＤＴＰ含有蓋を変化させてすなわち架橋剤と反応した
脂質の構成比を加えてヒ）　−ＩｇＧ感作リポソームを
１１製した。　２　Ｘ　１０−”ｔｎｇ／ａＪの抗ヒト
−ＩｇＧ抗体と４ｏｏ倍希択の補体（補体価：　ｏ、ｓ
ｃＨ，。）を作用させた時の感作リポソームからのＣＦ
遊出率を各感作リポソームにつｉて測定した。結果をｇ
２図に示す。

ＤＰＰ］１ｌ−Ｄ’ｌ’Ｐを含有していなｉ感作りポノ
ームの場合には全＜ＣＦの遊出は認められなかった。実
用上使用できるのは００１モル慢からでろり％ＤＰＰＩ
ニー　ＤＴＰ含有量を増加させて行くと、１モル饅まで
はＯＦ遊出率は増加するが、それ以上加えても殆どＣＦ
遊出率に変化はなかった。なお、（資）モル優以上ＤＰ
ＰＥ−Ｄ’ｒＰを含有しているリポソームの場合には、
自然なＣＦ遊山がＭ著に認められ、安定性に乏しいこと
が明らかになった。この実施例の結果より架橋剤と反応
したリン脂質及び糖脂質の構成比が０．０１〜３０モル
−〇範囲内にあることが必要であることがわかる。

実施例３ 実施例１におｉてヒト−ＩｇＧをＤＰＰＣ：コレスｆロ
ール：　ＤＰＰｇ−Ｄ’ｒＰ　＝１　：　１　：　０．
０５　Ｏ比’Ｈ４テ構成したリポソームに感作する際に
ヒトーＩｇＧ感作濃度を種々変化させ、抗ヒ）　−Ｉｇ
Ｇ抗体との反応性について検討した。抗体及び補体濃度
は実施例−２と同−ｆあった。実験結果を第３図に示す
〇ヒ）　−ＩｇＧを感作してｉないリポソームは全く抗
体とは反応しなかった。これに対し抗原を感作したリポ
ソームの場合には、その感作浸度すなわちリポソームの
形成に使用した脂質量から導かれる濃度に換算してｏ、
５ｍＭのリポソームに対して、感作した抗原の濃度が０
１０１ｍｇ／ｓ／から抗体に対する応答が現れ極大点を
経て２８ｍｇ／ａｌ　ｔで有効な反応が認められた。

実施例４ 実施例１でａｌｉ＃したヒ）　−ＩｇＧ感作リポソーム
を用い、　２Ｘ１０　　ｍｇ／１４の抗ヒト−ＴｇＧ抗
体との反応性を種々の補体価で検討し九〇第４図に示す
ように補体価が０．ＩＣＨ，。以上でＣＦの遊出が藷め
られた。ｌ０ＣＨ５Ｏｔ−ζえた場合には抗体を加えな
くても殆どのリポソームからＣＦが遊出してしまい、抗
体を検知することはで趣なかった。

上述したように、リポソームに組み込む架橋剤の濃度、
抗原感作濃度及び補体価を実施例１〜４に示した範囲の
中で適当に選択することにより被検物質及び濃度に応じ
た測定システムを組むことが可能である。

実施例５ 実施例１と同様にして抗ヒト−ＩｇＧ抗体感作リポソー
ムをｖ４製した。このリボゾームを用いヒト−ＩｇＧの
定量を行った。なお、補体価は２ＣＨ５゜とした。第５
図に結果を示す。抗原感作リポソームの場合と同様に抗
体感作リポソームを用いて抗原の定量も可能であるとと
が示された。

また同様にして、抗ヒ）　−ＣＢＩＡ抗体、抗ヒ）−α
−フェトプロティン抗体などを感作したリポソームによ
り各抗原が定量できたつ 実施例６ 実施例１と同様にしてヒ）−ＩｇＧを感作し標識物質と
して酵素を封入したリポソームを調製した。

抗ヒ）　−ＩｇＧ抗体を被検物質とした試料溶液は当初
２ｍｇ／ｍのものを順次希釈して用匹た。又、封入する
酵素としてはグルコースｔ＝ｒシターゼ（５係Ｗ！液）
を用いた。そして抗原抗体反応後リポソームよ）流出し
たグルコースオΦシターゼと酵素反目 応させるグルコースを最終濃度が５０Ｑ４ｇ）になるよ
うに゛試料溶液中に添加した。Ｉ分間３７’Ｏの条件で
リポソームと試料溶液とを反応させた後、酸素電極で溶
存酸素の減少量を測定した。その結果を第６図に示す。

ζζで杜基準として１０チＴｒｉｔｏｎＸ−１００を抗
体のかわりに用−て反らさせた場合を１００％にした相
対遊出率を用いた。、この図かられかるように標識物質
として酵素を用いた場合でも希釈倍率でおよそ１０’〜
１０５の範囲すなわち抗体浸度で２ＸｌＯ〜２ＸｌＯ（
ｍｇ／旬）の範囲で充分な測定感度が得られることが確
認された。

実施例７ 実施例１と同様にしてヒト−１，Ｇを感作し、標識物質
として発光性化合物を封入したリポソームをｖ４製した
０抗ヒ）−ＩπＧ抗体を被検物質とした試料溶液は当初
２ｍｇ／ｄのものを順次希釈して用−たつ又、封入する
発光性化合物にはルシフェリン溶液（０，１Ｍ　）を用
いた。そして抗原抗体反応後リポソームよシ流出したル
シフェリンと反応させるアデノシン５′−３リン酸（Ａ
ＴＰ）及びルシフェラーゼを最終ａ度がＡ’ｌ’Ｐ珪ｌ
Ｉｎ％りルシフェラー゛ゼはＯ，ｔＳになるように試料
溶液中に添加したりモして３７゛０で（資）分間反応さ
せた時の全発光量を測定した。その結果を第７図に示す
。ここでは基準としてｌＯ％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１０
０を抗体のされりに用いて反応させた場合を１００％に
した相対遊出率を用いたっこの図かられかるようにＭ４
Ｒ物質として発光物質を用いた場合でも希釈倍率でおよ
そ５ＸｌＯ’〜１０’の範囲すなわち抗体濃度で４×１
０〜２　Ｘ　＋ＯＣｍｇｌａｌ”）の範囲で充分な測定
感度が得られるととが確認された。

４、図閘の簡単な＃１．Ｅ１４ 第１図はヒト−ＩｇＧ感作リポソームを用いて抗ヒ）　
−ＩｇＧ抗体の測定を行った場合における抗ヒ）　−Ｉ
ｇＧ抗体の一度と標識物質の相対遊出率との関係を表す
特性図、′１Ｉｃ２図はリポソームの２重膜中のヒ）　
−ＩｇＧ感作Ｓ度と標識物質の相対遊出率との関係を表
・を特性図、Ｍｃ３図はヒ）　−Ｉｇ（）抗原感作ｌｖ
１度と標識物質の相対遊出率との関係を表す特性図、第
４図は補体価と標識物質の相対遊出率との関係を表す特
性図、第５図は抗と）　−ＩｇＧ感作リポソームを用い
てヒ）　−ＩｇＧを測定した場合におけるヒ）　−Ｉｇ
（Ｊ抗原の濃度と標識物質の相対遊出率との関係を表す
特性図、第６図は標識物質として＃素を封入したｅ　）
　−ＩｇＧ感作リボす−ムを用いた場合の抗ヒ）　−Ｉ
ｇＧ抗体希釈倍率と標識物質の相対遊出率との関係を表
す特性図、第７図は標識物質として発光性化合物を封入
したヒ）−ＩｇＧ感作リポソームを用いた場合の抗ヒ）
−ＩｇＧ抗体希釈倍率と標識物質の相対遊山率との関係
を表す特性図である。

第１図 士九ヒトー万沖４九体ｔｊ＝Ｘ　　＜　ｙｎｌ　／ｍｉ
＞第２図 幻　　　　　　ムρ　　　　　　ｆρ ｏｐｐｒ−ＤＴＰニド有（ヤ　（七フレ％→第８図 θ、θｌ　　　　θ、ｆ　　　　　／、ρ　　　　　ｌ
ρヒトーエクｑ廿び１匹作１＆ｊ１．＜−ツＺ、１゜第
４図 θ、／　　　　　　　　／、θ　　　　　　ｌθ補俸！
ｒｆＥ４（ＣＨ５ｏ） 第５図 ヒト、４ｇＧ”４すしｙ〒、其）１に１ζＥ、　　（７
７１乏グ／ｍｌｌン第６図 十九ヒトーＩ、＝９オ九七に５はゴ苦壊Ｖ第７図 ヤ℃ヒ’ｈ−ＸｇＣｒギυ傳ｊト保足督Ｐ！手　続　補
　正　書（方式） １、事件の表示 特願昭５９−２２０４６４号 ２、発明の名称 免疫分析用試薬 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 （３０７）株式会社　東芝 ４、代理人 〒１０５ 東京都港区芝浦−丁目１番１号 株式会社東芝　本社事務所内 （７３１７）弁理士　則近憲佑 ５、　補正命令の日付 昭和６０年２月２６日（発送日） ６、補正の対象　　　　　　　　　　　　　゛０明細簀
の発明の詳細な説明の欄 ７、　補正の内容 （１）願書に最初に添付した明細書の第、１．　ｐ、　
、夏及び第１１頁の浄書。　別紙のとおり（内容に変更
なし） （２）明細書の第４頁第４行目乃至紀６行目にｒＲｏｓ
ｅｎｔｈａｌ　Ａ、Ｆ、　Ｖａｒｇａｓ、　Ｍ、Ｇ、　
ａｎｄ　ＫｌａｓｓＣ，Ｓ、　（１９７６）　Ｃｌ１ｎ
、　Ｃｈｅｍ、　２２．　１８９９Ｊ　　とあるのを、
［り１）ニカル　ケｄストリ第２２巻第１８９９頁（１
９７６年）　（Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２２．１８９９
（１９７６）　、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ　Ａ、Ｆ、　Ｖａ
ｒｇａｓ、　Ｍ、Ｇ、　ａｎｄＫｌａｓｓ　Ｃ，Ｓ、月
と訂正する。

（３）明細書の第４頁第１Ｏ行目乃至第１１行目に［Ｈ
ａｘｂｙ、　Ｊ、Ａ、　Ｋ１ｎ５ｋｙ、Ｃ，Ｂ、　ａｎ
ｄ　Ｋ１ｎ５ｋｙ　Ｓ、Ｃ。

（１９６８）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６１　３０
０Ｊとあるのを。

［バイオケミストリ第６１巻第３００頁（１９６８年）
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　６１　３００　　（１
９６８）　Ｈａｘｂ７．　Ｊ、ＡＴＫｉｎｓｋｙ、　Ｃ
，Ｂ、　ａｎｄ　Ｋ１ｎ５ｋｙ　Ｓ、Ｃ０）　Ｊと訂正
する。

４−（１）−マレイミドフェニル）フチレート（８ＭＰ
Ｂ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）アセテート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−サクシンイξジル
４−（１）−マレイミドフェニル）フロビオネート（８
ＭＰＰ）、Ｎ−Ｃｒ−マレイミドブチリルオキシ）サク
シンイミド（ＧＭＢＳ）　、　Ｎ　−（ε−マレイミド
カプロイルオキシ）サクシンイで示され、温和な条件下
で反応して、第一アミノ基を有する化合物どうしを結合
する架橋剤でありファルマシア社から市販されている。

感作させるタンパク質抗原をとの８ＰＤＰで処理し、ジ
チオトレイトール（ＤＴＴ）で還元した後、予め８ＰＤ
Ｐを作用させたリポソームと反応させると、室温以下、
数時間から１日でリポソーム上に抗原を感作することが
できる。

８ＭＰＨは１次式： で示され、５ＰＤＰと同様な反応でタンパク質を固定化
できるが、最終生成物中に−８−８−結合を含まず（−
Ｓ−結合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定で
ある。

このようにして得られた免疫分析用試薬は、補体の存在
下で試料と接触することによりリポソームが破壊され、
内部に封入されていた標識物質が流出する。この流出し
た標識物質を定量することによって試料の定量分析を行
なう。この定量操作に用いられる補体としては、格別限
定されないが通常補体の活性すなわち補体価の高いモル
モット血清が用いられる。しかし、場合に応じてウサギ
、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。又、本免疫
分析用試薬を用いて抗原あるいは抗体を定量する際には
、この補体価が測定範囲及び検出限界を決定するのに重
要であり、この補体価を種々変化させて望ましい測定条
件を得る。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質の少くとも一方よりなるリポ
   ソームと、架橋法により前記リポソーム上に感作された
   親水性の抗原または少くとも一部分の抗体と、前記リポ
   ソーム内に封入された親水性の標識物質とからなり； 前記リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質のうち、
   前記架橋法において用いた架橋剤と反応したリン脂質及
   び糖脂質の構成比が０．０１〜３０モル％であり、かつ 脂質換算で０．５ｍＭのリポソームに対して感作される
   親水性の抗原または抗体の感作濃度が０．０１〜２０ｍ
   ｏ／ｍｌであることを特徴とする免疫分析用試薬。
2. （２）架橋法に使用する架橋剤を、Ｎ−サクシンイミジ
   ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
   Ｐ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
   ニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−サクシンイミジル
   ４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（ＳＭＰＡ
   ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニ
   ル）プロピオネート（ＳＭＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミ
   ドプチリルオキシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−
   （ε−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（
   ＥＭＣＳ）の中より選んだことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の免疫分析用試薬。
3. （３）リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質に対し
   て１０〜５００モル％のコレステロールを含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析用試薬。
4. （４）分析時に共に用いられる補体の活性（補体価）が
   ０．１〜１０ＣＨ＿５＿０であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の免疫分析用試薬。
5. （５）標識物質が螢光性化合物、発光性化合物、吸光性
   化合物、糖類、イオン性化合物、酵素、補酵素類または
   ラジカル化合物であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の免疫分析用試薬。