JPS6166963A - 免疫分析用試薬 - Google Patents
免疫分析用試薬Info
- Publication number
- JPS6166963A JPS6166963A JP18883384A JP18883384A JPS6166963A JP S6166963 A JPS6166963 A JP S6166963A JP 18883384 A JP18883384 A JP 18883384A JP 18883384 A JP18883384 A JP 18883384A JP S6166963 A JPS6166963 A JP S6166963A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- liposome
- antigen
- reagent
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明は免疫分析用試薬に関し、更に詳しくは、試料中
に存在する特定の抗原又は抗体を定量分析するための免
疫分析用試薬に関する。
に存在する特定の抗原又は抗体を定量分析するための免
疫分析用試薬に関する。
近年ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の腫
瘍マーカーが見出されるようになった。
瘍マーカーが見出されるようになった。
例えばα−フェトプロティン（ＡＦＰ ） 、ガン胎児
性抗原（ＣＥＡ） 、塩基性フェトプロティン（Ｂｌ；
’Ｐ）婢 および辞ガン胎児性抗原（ＰＯＡ）などがその代表例と
して挙げることができる。これらの腫瘍マーカーの濃度
は正常人の場合、非常に低い（例えばＡＦＰの場合：
１０ ｎｌ／ｍｌ以下）。一方、腫瘍患者の場合には正
常人の１０倍程度の値を示すことが多い。いずれにして
も、腫瘍マーカーの分析定量には、非常に高い検出感度
が要求される。
性抗原（ＣＥＡ） 、塩基性フェトプロティン（Ｂｌ；
’Ｐ）婢 および辞ガン胎児性抗原（ＰＯＡ）などがその代表例と
して挙げることができる。これらの腫瘍マーカーの濃度
は正常人の場合、非常に低い（例えばＡＦＰの場合：
１０ ｎｌ／ｍｌ以下）。一方、腫瘍患者の場合には正
常人の１０倍程度の値を示すことが多い。いずれにして
も、腫瘍マーカーの分析定量には、非常に高い検出感度
が要求される。
この要求をａｔために、従来は、放射性物質で標識比し
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（ＲＩＡ）
が開発された。しかしながら、ＲＩＡは取扱いが面倒で
廃棄処理も問題になる。そこで、放射性物質の代りに酵
素や蛍光物質など種々の物質で標識比した抗原あるいは
抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これらにお
いても遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しなけ
ればならないという欠点を有していた。また、 Ｒｏｓ
ｅｎｔｈａｌＡ 、 Ｆ 、Ｖａｒｇａｓ 、Ｍ、０．
ａｎｄ Ｋｌａｓｓ Ｃ、Ｓ 、（１９７６）ＣＩｉ
ｎ、 Ｃｈｅｍ、 ２２．１８９９ に発表されたＥ
ＭＩＴ法は、分離工程の不要な均一系で測定できる画期
的な手法であるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原
あるいは抗体には適用できない。
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（ＲＩＡ）
が開発された。しかしながら、ＲＩＡは取扱いが面倒で
廃棄処理も問題になる。そこで、放射性物質の代りに酵
素や蛍光物質など種々の物質で標識比した抗原あるいは
抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これらにお
いても遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しなけ
ればならないという欠点を有していた。また、 Ｒｏｓ
ｅｎｔｈａｌＡ 、 Ｆ 、Ｖａｒｇａｓ 、Ｍ、０．
ａｎｄ Ｋｌａｓｓ Ｃ、Ｓ 、（１９７６）ＣＩｉ
ｎ、 Ｃｈｅｍ、 ２２．１８９９ に発表されたＥ
ＭＩＴ法は、分離工程の不要な均一系で測定できる画期
的な手法であるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原
あるいは抗体には適用できない。
ところで、Ｈａｘｂｙ、Ｊ 、Ａ、Ｋ１ｎ５ｋｙ、Ｃ，
Ｂ、 ａｎｄＫｌｎｓｋｙ Ｓ、Ｃ，（１９６８）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ６１３００で、脂溶性の抗原
を勝内に取り込みグルコースを封入したリポソームを調
製し、抗原抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグル
コースの流出量を測定することにより、抗体の定量を行
う手法が発表された。しかしながら、この手法では腫瘍
マーカーを測定するために、マーカー自身あるいはこれ
らのマーカーに対する抗体、すなわちタンパク質である
免疫グロブリンをリポソーム上に担持させねばならない
。
Ｂ、 ａｎｄＫｌｎｓｋｙ Ｓ、Ｃ，（１９６８）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ６１３００で、脂溶性の抗原
を勝内に取り込みグルコースを封入したリポソームを調
製し、抗原抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグル
コースの流出量を測定することにより、抗体の定量を行
う手法が発表された。しかしながら、この手法では腫瘍
マーカーを測定するために、マーカー自身あるいはこれ
らのマーカーに対する抗体、すなわちタンパク質である
免疫グロブリンをリポソーム上に担持させねばならない
。
また特開昭５６−１３２５６４”免疫分析用生成物およ
び方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部に
酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方法
が開示されているが、そこでは、タンパク質の担持方法
としてグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用い
る方法を提案している。本発明者らの研究ζこよると、
このような架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、
一般に抗体の活性が低下し、抗原折体反応に伴うリポソ
ームの破壊が引起されなくなることが判明した。
び方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部に
酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方法
が開示されているが、そこでは、タンパク質の担持方法
としてグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用い
る方法を提案している。本発明者らの研究ζこよると、
このような架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、
一般に抗体の活性が低下し、抗原折体反応に伴うリポソ
ームの破壊が引起されなくなることが判明した。
さらには、上述した方法等においてはリポソームの破壊
によって流出してくるグルコースや酵素の濃度を比色法
などで測定しなくては、抗原又は抗体の測定ができず反
応の系が複雑になってしまい、自動１ヒには不向であっ
た。そこで本発明者らは、たとえば先に出願した（特開
昭５８−２２４５０９）ように上述した方法にかえてリ
ポソーム上に親水性の抗原または抗体を固定ｆヒし、内
部ζこカルボキシルフルオレセインなどの蛍光性化合物
を封入したりぜソームによる測定を試みている。しかし
ながら、この場合に反応によって生じた蛍光の測光部は
機器として大型ｌこなりてしまう為、自動比の際に小型
で安価な機器は望めないなどの欠点があった。
によって流出してくるグルコースや酵素の濃度を比色法
などで測定しなくては、抗原又は抗体の測定ができず反
応の系が複雑になってしまい、自動１ヒには不向であっ
た。そこで本発明者らは、たとえば先に出願した（特開
昭５８−２２４５０９）ように上述した方法にかえてリ
ポソーム上に親水性の抗原または抗体を固定ｆヒし、内
部ζこカルボキシルフルオレセインなどの蛍光性化合物
を封入したりぜソームによる測定を試みている。しかし
ながら、この場合に反応によって生じた蛍光の測光部は
機器として大型ｌこなりてしまう為、自動比の際に小型
で安価な機器は望めないなどの欠点があった。
溶性染料を用いることにより、簡単な測光系で種々の抗
原及び抗体をより容易に定量分析できる免疫分析用試薬
を提供することを目的とする。
原及び抗体をより容易に定量分析できる免疫分析用試薬
を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成するべ（鋭意研究を重ね
た結果、補体活性により溶解作用を受けるリポソーム上
に、活性を低下させることなく試料中の抗原又は抗体に
対応する抗体又は抗原を固定ｆヒし、更に、前記リポソ
ーム内に水溶性金属指示薬又は水溶性染料よりなる標識
物質を封入することにより、本発明の目的が達成される
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
た結果、補体活性により溶解作用を受けるリポソーム上
に、活性を低下させることなく試料中の抗原又は抗体に
対応する抗体又は抗原を固定ｆヒし、更に、前記リポソ
ーム内に水溶性金属指示薬又は水溶性染料よりなる標識
物質を封入することにより、本発明の目的が達成される
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明の詳細な説明する。
本分析方法による定量が可能な被検物質は、腫瘍マーカ
ー（前述のＡＦＰ、ＢＦＰ、ＣＥＡ、及び２０人等）免
疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＦｉ、Ｉ＃Ｇ及びＩＩＩＭ
等）、ホルモン（インシ乳リンｓＴｍ及びＴ４等）及び
薬物等の抗原、あるいはそれらに対応する抗体であって
、広範囲に亘る。
ー（前述のＡＦＰ、ＢＦＰ、ＣＥＡ、及び２０人等）免
疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＦｉ、Ｉ＃Ｇ及びＩＩＩＭ
等）、ホルモン（インシ乳リンｓＴｍ及びＴ４等）及び
薬物等の抗原、あるいはそれらに対応する抗体であって
、広範囲に亘る。
本発明の免疫分析用試薬におけるリポソームとは、赤血
球ゴースト膜をも含む広義の意味を有する。かかるリポ
ソームは、従来から使用されているものであればいかな
るものであってもよいが、リン脂質又は糖脂質の少くと
も一方とフレステロールとから構成されるものが好まし
い。例えば、リン脂質とコレステロールからリボン−ム
ラ合成する場合は、これらの比が１；１前後にあるとき
、安定なリポソームが得られ易い。またリン脂質中の脂
肪酸残基は、炭素原子数が１２〜１８であることが好ま
しく、更には偶数であることがより好ましい。
球ゴースト膜をも含む広義の意味を有する。かかるリポ
ソームは、従来から使用されているものであればいかな
るものであってもよいが、リン脂質又は糖脂質の少くと
も一方とフレステロールとから構成されるものが好まし
い。例えば、リン脂質とコレステロールからリボン−ム
ラ合成する場合は、これらの比が１；１前後にあるとき
、安定なリポソームが得られ易い。またリン脂質中の脂
肪酸残基は、炭素原子数が１２〜１８であることが好ま
しく、更には偶数であることがより好ましい。
リポソーム上に固定ｒヒされる抗原又は抗体としては前
記のものが例示されるが、これらは親水性であることが
必要である。しかしながら、固定化された抗原又は抗体
と抗原抗体反応を起こす被検物質は、親水性でなくとも
よい。本発明の試薬において、抗原又は抗体はＮ−スク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオレー
ト等の架橋剤によって、リポソーム上に原子間の共有結
合で固定化されている。
記のものが例示されるが、これらは親水性であることが
必要である。しかしながら、固定化された抗原又は抗体
と抗原抗体反応を起こす被検物質は、親水性でなくとも
よい。本発明の試薬において、抗原又は抗体はＮ−スク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオレー
ト等の架橋剤によって、リポソーム上に原子間の共有結
合で固定化されている。
リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に簡単な手段で測定でき
る物質でなければならない。
、リポソーム外に溶出された際に簡単な手段で測定でき
る物質でなければならない。
かかる物質としては例えばキシレノールオレンジ（ＸＯ
）、メチルキシレノールブルー（ＭＸＢ）１、に岳１か
１ メチルチモールブルー（ＭＴＢ）、ケチχ≠七タールＩ
Ｉ、ピロカテコールバイオレット（ＰＶ）、エリオフロ
ームブラックＴ（ＢＴ）などの水溶性金属指示薬または
ローダミンＢ、オキザＺンレッドＸ、アシッドオレンジ
エなどの水溶性染料が適当である。
）、メチルキシレノールブルー（ＭＸＢ）１、に岳１か
１ メチルチモールブルー（ＭＴＢ）、ケチχ≠七タールＩ
Ｉ、ピロカテコールバイオレット（ＰＶ）、エリオフロ
ームブラックＴ（ＢＴ）などの水溶性金属指示薬または
ローダミンＢ、オキザＺンレッドＸ、アシッドオレンジ
エなどの水溶性染料が適当である。
これらの水溶性金属指示薬や水溶性染料はその種類によ
り各々固有の吸収ピークを有している。
り各々固有の吸収ピークを有している。
本発明に係る免疫分析用試薬は、試料中に含まれる被検
物質である抗体又は抗原と別に加えられた補体とともに
反応して、前記水溶性金属指示薬や水溶性染料をリポソ
ーム内より放出するが、この時に生ずる吸収ピークを分
光器等の簡単な測光装置によって測定することにより、
試料中に含まれる抗体又は抗原の定量分析が容易にでき
る。すなわち従来のようにカルボキシルフルオレセイン
等の蛍光性化合物を標識物質として用いた場合にはその
蛍光を測定するのに大型の測定機器等が必要であったが
、本発明の免疫分析用試薬の標識物質に用いた水溶性金
属指示薬や水溶性染料特有の吸収ピークの波長に固定し
て強度を測定すればよく測定のため装置はより簡略ｆヒ
され分析が容易になる。
物質である抗体又は抗原と別に加えられた補体とともに
反応して、前記水溶性金属指示薬や水溶性染料をリポソ
ーム内より放出するが、この時に生ずる吸収ピークを分
光器等の簡単な測光装置によって測定することにより、
試料中に含まれる抗体又は抗原の定量分析が容易にでき
る。すなわち従来のようにカルボキシルフルオレセイン
等の蛍光性化合物を標識物質として用いた場合にはその
蛍光を測定するのに大型の測定機器等が必要であったが
、本発明の免疫分析用試薬の標識物質に用いた水溶性金
属指示薬や水溶性染料特有の吸収ピークの波長に固定し
て強度を測定すればよく測定のため装置はより簡略ｆヒ
され分析が容易になる。
また、本発明に標識物質として用いる水溶性金属指示薬
及び水溶性染料の吸収ピークは、その周囲に金属イオン
が存在することによりあるいは存在する水素イオンの濃
度等により太き（移動するという特有の性質を持ってい
る。この性質を利用して試料溶液中に金属イオンあるい
は水素イオンを適宜存在させることにより、試料との反
応によってリポソームより放出された水溶性金属指示薬
あるいは水溶性染料が前記金属イオンあるいは水素イオ
ンと特有の反応をおこして従来の試料溶液の有していた
吸収ピークの波長域と充分な差を有した波長域にその吸
収ピークを移動させることができる。
及び水溶性染料の吸収ピークは、その周囲に金属イオン
が存在することによりあるいは存在する水素イオンの濃
度等により太き（移動するという特有の性質を持ってい
る。この性質を利用して試料溶液中に金属イオンあるい
は水素イオンを適宜存在させることにより、試料との反
応によってリポソームより放出された水溶性金属指示薬
あるいは水溶性染料が前記金属イオンあるいは水素イオ
ンと特有の反応をおこして従来の試料溶液の有していた
吸収ピークの波長域と充分な差を有した波長域にその吸
収ピークを移動させることができる。
本発明によって定量分析を行なうには、リポソームの反
応による標識物質の流出が全くない場合の溶液の吸収ピ
ークの大きさと、被検試料との反応により本免疫分析用
試薬のリポソームに含まれていた水溶性金属指示薬また
は水溶性染料がすべて放出された場合の吸収ピークの大
きさとの差を求め、これらの相対的な尺度から定量を行
なう。
応による標識物質の流出が全くない場合の溶液の吸収ピ
ークの大きさと、被検試料との反応により本免疫分析用
試薬のリポソームに含まれていた水溶性金属指示薬また
は水溶性染料がすべて放出された場合の吸収ピークの大
きさとの差を求め、これらの相対的な尺度から定量を行
なう。
よって例１えば本来試料溶液が有している吸収ピークの
波長域が反応時におけるそれと重なりあう場合には前述
したような二つの吸収ピークの差が小さくなり測定の容
易性、測定精度の向上等が難しくなるが、前述したよう
に吸収ピークの波長域を移動させることにより吸収ピー
クの最大値はかわらなくともその基準となる濃度零の場
合のピーク値がより低くなるのでそれらの間の差が大き
くなる。よってその差を用いて定量分析を行なうこと）
、″・により、試料液に含まれた微量の抗原あるいは抗
体の分析等がより容易に精密に行なえる。この時水溶性
金属指示薬を用いる場合には金属イオンを、水溶性染料
を用いる場合には水素イオンをそれぞれ適宜組み合わせ
る。
波長域が反応時におけるそれと重なりあう場合には前述
したような二つの吸収ピークの差が小さくなり測定の容
易性、測定精度の向上等が難しくなるが、前述したよう
に吸収ピークの波長域を移動させることにより吸収ピー
クの最大値はかわらなくともその基準となる濃度零の場
合のピーク値がより低くなるのでそれらの間の差が大き
くなる。よってその差を用いて定量分析を行なうこと）
、″・により、試料液に含まれた微量の抗原あるいは抗
体の分析等がより容易に精密に行なえる。この時水溶性
金属指示薬を用いる場合には金属イオンを、水溶性染料
を用いる場合には水素イオンをそれぞれ適宜組み合わせ
る。
以上に説明した本発明の免疫分析用試薬は、例えば、次
の如き方法で製造される。まず、所望の脂質と架橋剤（
これを用いた場合を架橋法という）とを溶媒中で反応せ
しめ、リポソーム上に固定「ヒされる抗原又は抗体と結
合し得る官能基を脂質分子を導入する。次いで、得られ
た官能性脂質とコレスチロール及び必要であれば他の脂
質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解させた
後、Ｉ６媒を留去し、吸引乾燥する。しかる汝、壁面に
薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の水溶液
を加え、密栓をして振とうし、リポソームの懸濁液を得
る。一方、リポソーム１こ固定比すべき抗原又は抗体と
架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入し、しか
る後、必要であれば、前記架橋基を還元する試薬（例え
ばジチオトレイトール； ＤＴＴ）と更に反応させて、
修飾抗原又は抗体を得る。
の如き方法で製造される。まず、所望の脂質と架橋剤（
これを用いた場合を架橋法という）とを溶媒中で反応せ
しめ、リポソーム上に固定「ヒされる抗原又は抗体と結
合し得る官能基を脂質分子を導入する。次いで、得られ
た官能性脂質とコレスチロール及び必要であれば他の脂
質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解させた
後、Ｉ６媒を留去し、吸引乾燥する。しかる汝、壁面に
薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の水溶液
を加え、密栓をして振とうし、リポソームの懸濁液を得
る。一方、リポソーム１こ固定比すべき抗原又は抗体と
架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入し、しか
る後、必要であれば、前記架橋基を還元する試薬（例え
ばジチオトレイトール； ＤＴＴ）と更に反応させて、
修飾抗原又は抗体を得る。
最後にリポソームと修飾抗原または抗体とを適当な緩衝
液中で反応せしめることにより、本発明の免疫分析用試
薬が得られる。この際、測定対象物の揮類により修飾抗
原あるいは抗体の感作濃度を適当に変化させることが重
要である。
液中で反応せしめることにより、本発明の免疫分析用試
薬が得られる。この際、測定対象物の揮類により修飾抗
原あるいは抗体の感作濃度を適当に変化させることが重
要である。
さらに本発明の免疫分析用試薬は、まず脂質と抗１東又
は抗体とを、架橋剤を用いて結合せしめ、次いで得られ
た結合体を界面活性剤とともに水中に加えてミセルを形
成させ、しかる後、透析あるいはＫｊ４シ過等を用いて
界面活性剤を除去することにより製造することも可能で
ある。
は抗体とを、架橋剤を用いて結合せしめ、次いで得られ
た結合体を界面活性剤とともに水中に加えてミセルを形
成させ、しかる後、透析あるいはＫｊ４シ過等を用いて
界面活性剤を除去することにより製造することも可能で
ある。
又、本発明で用いる架橋法に使用する架橋剤としては、
Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート；Ｎ−ｘクシンイミジ１“ ル４−（ｐ−マレイミドフェニル）フチレート；寸 Ｎ−ｐクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
アセテート；Ｎ−Ｊｔクシンイミジル４− （ｐ−マレ
イミドフェニル）フロビオネート；Ｎ−（γ−マレイミ
ドブチリルオキシ）スクシンイミド；Ｎ−（ε−マレイ
ミドカプロイルオキシ）スクシンイミドの中より選ぶの
が望ましい。
Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート；Ｎ−ｘクシンイミジ１“ ル４−（ｐ−マレイミドフェニル）フチレート；寸 Ｎ−ｐクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
アセテート；Ｎ−Ｊｔクシンイミジル４− （ｐ−マレ
イミドフェニル）フロビオネート；Ｎ−（γ−マレイミ
ドブチリルオキシ）スクシンイミド；Ｎ−（ε−マレイ
ミドカプロイルオキシ）スクシンイミドの中より選ぶの
が望ましい。
本発明の免疫分析用試薬では、内包する標識物質に水溶
性金属指示薬または水溶性染料を用いることにより、試
料中の種々の抗原または抗体の定量分析が、吸光蜜を測
定する簡単な測定系によって容易に行なえる。又、機器
による自動分析等にも適しており小型で精度のよい自動
分析装置を可能にする。
性金属指示薬または水溶性染料を用いることにより、試
料中の種々の抗原または抗体の定量分析が、吸光蜜を測
定する簡単な測定系によって容易に行なえる。又、機器
による自動分析等にも適しており小型で精度のよい自動
分析装置を可能にする。
（ｌυ
〔発明の実施例〕
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す６が、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
実施例１
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩＪＩＧ）を感作したリポソー
ムを用いる抗ヒト−ＩＪＦＧ抗体の測定（Ｉ）（ＡＪ試
薬及び感作リポソームの調製 （１）試薬 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）。
ムを用いる抗ヒト−ＩＪＦＧ抗体の測定（Ｉ）（ＡＪ試
薬及び感作リポソームの調製 （１）試薬 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）。
コレステロール、ジバルミトイルフオスファチジルエタ
ノールアミン（ＤＰＰＥ）及びジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ） はジグｉ社製のものを用いた。Ｎ−スクシン
イミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（
８ＰＤＰ）及びセファデックスＧ−２５フアインはファ
ルマシア社より購入した。他の試薬は市販品（特級）を
精製せずに使用した。なお、水はイオン交換水を用いた
。
ノールアミン（ＤＰＰＥ）及びジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ） はジグｉ社製のものを用いた。Ｎ−スクシン
イミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（
８ＰＤＰ）及びセファデックスＧ−２５フアインはファ
ルマシア社より購入した。他の試薬は市販品（特級）を
精製せずに使用した。なお、水はイオン交換水を用いた
。
（２）感作リポソームの調製
（１つ
ａ）ＤＰＰＥ−ジチオビリジネート（ＤＰＰＩＩ！ｉＪ
’）ＴＰ）の調製 密栓付三角フラスコに７０ｒｒｌＯ）ＤＰＰＥを分取し
、２５ｍ１のクロロホルム／メタノール（５：１）溶液
に醇解し６０ｍ１のトリエタノールアミン及び５０ｍ、
９の８ＰＤＰを添加後窒素置換した。寛温で１時間反応
させた後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した
。乾燥物を５ｍｌのクロロホルム／メタノール（１０：
１）に溶解させ、シリカゲルカラムを用いて精製した。
’）ＴＰ）の調製 密栓付三角フラスコに７０ｒｒｌＯ）ＤＰＰＥを分取し
、２５ｍ１のクロロホルム／メタノール（５：１）溶液
に醇解し６０ｍ１のトリエタノールアミン及び５０ｍ、
９の８ＰＤＰを添加後窒素置換した。寛温で１時間反応
させた後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した
。乾燥物を５ｍｌのクロロホルム／メタノール（１０：
１）に溶解させ、シリカゲルカラムを用いて精製した。
生成物画分を回収し、エバポレーターで約５ｍｌまで濃
縮した。収率は８０〜９５％であった。保存は窒素封入
下−２０℃で行った。
縮した。収率は８０〜９５％であった。保存は窒素封入
下−２０℃で行った。
ｈ）リポソームの調製
使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１ ）に溶解した。まず、５ ｍＭ
ＤＰＰＣ（２００μｊ）、１０ｍＭコレステロール（
１００μｌ）及び１ｍＭＤＰＰＥ−ＤＴＰ（ｓＯμＩり
を１０ｍ１のナス型フラスコに入れ、更に、２ｍｌのク
ロロホルムを加えて良く混合した。水浴中（約５０℃）
でロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。再
び２ｍどのクロロホルム’ｔＥ’ 添）Ｊｎ シ、十分
攪拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒を・
六発させた。この操作を数回繰り返すと、フラスロ９．
面に薄膜が形成された。
／メタノール（２／１ ）に溶解した。まず、５ ｍＭ
ＤＰＰＣ（２００μｊ）、１０ｍＭコレステロール（
１００μｌ）及び１ｍＭＤＰＰＥ−ＤＴＰ（ｓＯμＩり
を１０ｍ１のナス型フラスコに入れ、更に、２ｍｌのク
ロロホルムを加えて良く混合した。水浴中（約５０℃）
でロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。再
び２ｍどのクロロホルム’ｔＥ’ 添）Ｊｎ シ、十分
攪拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒を・
六発させた。この操作を数回繰り返すと、フラスロ９．
面に薄膜が形成された。
フラスコをデシケータ−中に移し真空ポンプで約１時間
吸引し、溶媒を完全に除去した。
吸引し、溶媒を完全に除去した。
矢に、１００１１１の０．２ＭＢＴＣ同仁化学研究所Ｐ
Ｈ７，４）を添加し、フラスコ内部を窒素で置換した
後に密栓して、６０’Ｃ程度の水浴巾約１分間浸漬した
。続いて、 Ｖｏｒｔｅｘ ミキサーを用Ｇ）、壁面の
脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく娠とう
した。この操作により ＋１ボソーム懸ｊ蜀液が調製さ
れた。ゼラチン−ベロナール緩衝液（以下、ＧＶＢ−÷
と略記）を少量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心
チューブに移した。４℃、１５．０００ｒｐｍ で２
０分間遠心し、遊離のＢＴを除去した。上溝が透明にな
るまでＧＶＢ−を用いてこの操作を繰り返した。最後に
２ｍｌのＧＶＢ−及び５ｔｔｌの１０％ＮａＮ、を加え
Ｖｏｒｔｅｘミキサーで懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫
に保存した。
Ｈ７，４）を添加し、フラスコ内部を窒素で置換した
後に密栓して、６０’Ｃ程度の水浴巾約１分間浸漬した
。続いて、 Ｖｏｒｔｅｘ ミキサーを用Ｇ）、壁面の
脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく娠とう
した。この操作により ＋１ボソーム懸ｊ蜀液が調製さ
れた。ゼラチン−ベロナール緩衝液（以下、ＧＶＢ−÷
と略記）を少量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心
チューブに移した。４℃、１５．０００ｒｐｍ で２
０分間遠心し、遊離のＢＴを除去した。上溝が透明にな
るまでＧＶＢ−を用いてこの操作を繰り返した。最後に
２ｍｌのＧＶＢ−及び５ｔｔｌの１０％ＮａＮ、を加え
Ｖｏｒｔｅｘミキサーで懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫
に保存した。
Ｃ）ヒト−ＩＩＧの修飾
５ｍ５’のヒト−ＩｙＧ（マイルズ社製）を２ｍｌの０
．０１ＭＨＢＰｇ８緩衝液（ｐＨ７，４５０，８５％Ｎ
ａ（ｌ 含有）に溶解し、窒素で置換した後、１０μ
ｌの１０ ｍｉ’ｓ ＰＤＰ （エタノール溶液）を加
え、十分攪拌してそのまま室温で３０分間反応させた。
．０１ＭＨＢＰｇ８緩衝液（ｐＨ７，４５０，８５％Ｎ
ａ（ｌ 含有）に溶解し、窒素で置換した後、１０μ
ｌの１０ ｍｉ’ｓ ＰＤＰ （エタノール溶液）を加
え、十分攪拌してそのまま室温で３０分間反応させた。
反応後、反応液を予め生理食塩水で飽和させたセファデ
ックスＧ−２５フアインのゲルを充填したカラム（ゲル
体積：約１５ｍＪ）に展開し、Ｏ０Ｆ加酸緩′衝液（ｐ
Ｈ４，５、０，８５％ＮａＣ１含有）で溶出させた。最
初のタンパク質フラクション（約２ｍＡ’）に更に２ｍ
ｌの酢酸緩衝液を加え、窒素置換後、ジチオトレイトー
ル（約３０ ｍ１１）を添加した。十分に攪拌して２０
分間室濡で反応させた。反応後、予め０．０１Ｍ ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液で飽和させたセファデックスＧ−２５フア
インのゲルを充填しであるカラム（ゲル体積：約３０ｍ
Ａ’）に反応液を展開し、前記ＨＥ Ｐ Ｅ ８緩衝液
で溶出した。最初のタンパク質フラクション（約２ｍｌ
）を集め、窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存し
た。
ックスＧ−２５フアインのゲルを充填したカラム（ゲル
体積：約１５ｍＪ）に展開し、Ｏ０Ｆ加酸緩′衝液（ｐ
Ｈ４，５、０，８５％ＮａＣ１含有）で溶出させた。最
初のタンパク質フラクション（約２ｍＡ’）に更に２ｍ
ｌの酢酸緩衝液を加え、窒素置換後、ジチオトレイトー
ル（約３０ ｍ１１）を添加した。十分に攪拌して２０
分間室濡で反応させた。反応後、予め０．０１Ｍ ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液で飽和させたセファデックスＧ−２５フア
インのゲルを充填しであるカラム（ゲル体積：約３０ｍ
Ａ’）に反応液を展開し、前記ＨＥ Ｐ Ｅ ８緩衝液
で溶出した。最初のタンパク質フラクション（約２ｍｌ
）を集め、窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存し
た。
ｄ）Ｉ９Ｇ感作リポソームの調製
前述のようにして調製したリポソーム懸濁液と等量の修
飾ＩｙＧ溶液を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆっ
くり振とうしながら１晩反応させた。帥記ＨＢＰＥＳ
緩衝液、次いでＧＶＢ″′″で洗浄して、未反応のＩＩ
Ｇを除去した。反応ｆこ用いたリポソーム懸濁液の量に
相当するＧＶＢ−及び５μ！の１０チＮａＮ１を最後に
添加し、懸濁−窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存
した。
飾ＩｙＧ溶液を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆっ
くり振とうしながら１晩反応させた。帥記ＨＢＰＥＳ
緩衝液、次いでＧＶＢ″′″で洗浄して、未反応のＩＩ
Ｇを除去した。反応ｆこ用いたリポソーム懸濁液の量に
相当するＧＶＢ−及び５μ！の１０チＮａＮ１を最後に
添加し、懸濁−窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存
した。
（３）ヒトーｉＧ感作リポソームを用いた抗ヒト−ＩＩ
Ｇの抗体測定 ｐＨ７，８０ＶＢ”（１ｍＭ ＭｆＣ１＠及びＯ，ｆＭ
ＣａＣｌ。
Ｇの抗体測定 ｐＨ７，８０ＶＢ”（１ｍＭ ＭｆＣ１＠及びＯ，ｆＭ
ＣａＣｌ。
及び０．１ｍＭＺｎＣＪ、を含有してＧ）るＧＶＢ−で
希釈した抗ヒト−■ｇＧ抗体（原液譲匣２ｍＩ／ｍＡり
を２５μｌずつセルに注入した。次いで上記感作リポソ
ーム懸濁液をＧＶＢ”十で１００倍に希釈し、５μｌず
つ各セルに分注した。
希釈した抗ヒト−■ｇＧ抗体（原液譲匣２ｍＩ／ｍＡり
を２５μｌずつセルに注入した。次いで上記感作リポソ
ーム懸濁液をＧＶＢ”十で１００倍に希釈し、５μｌず
つ各セルに分注した。
最後に適当にＧＶＢｔ＋で希釈 した補体（モルモット
血清）を２５μｌずつ添加して、３７℃で反応させ、５
５０１ｍの吸収波長でレート法にて測定した。
血清）を２５μｌずつ添加して、３７℃で反応させ、５
５０１ｍの吸収波長でレート法にて測定した。
なお測定値は抗体及び補体フ）代わりにＴｒｌｔｏｎＸ
−１００及Ｕ Ｇ Ｖ Ｂ ” ” ヲ２５ μｌ
スツ添７ＪＯＬ、 タ時の吸収と、抗体の代わりに２５
μｌのＧＶＢ１＋を添加したものの差を１００％とした
相対値で表示した６４００倍希釈（補体価：０．５ＣＨ
，。）の補体を用いた場合の結果を第１図に示した。こ
の第１図に示されているように抗ヒトーエｇＧ抗体がＩ
Ｆ”〜１０−・ｍｌ／ｍｌの範囲で測定できることが
わかった。
−１００及Ｕ Ｇ Ｖ Ｂ ” ” ヲ２５ μｌ
スツ添７ＪＯＬ、 タ時の吸収と、抗体の代わりに２５
μｌのＧＶＢ１＋を添加したものの差を１００％とした
相対値で表示した６４００倍希釈（補体価：０．５ＣＨ
，。）の補体を用いた場合の結果を第１図に示した。こ
の第１図に示されているように抗ヒトーエｇＧ抗体がＩ
Ｆ”〜１０−・ｍｌ／ｍｌの範囲で測定できることが
わかった。
実施例２
実施例１と同様な方法でＢＴの代りに０．２ＭＸ０（ｐ
Ｈ６，０）を封入した抗ヒト−エＩ！Ｇ抗体感作りボン
ームを調製した。
Ｈ６，０）を封入した抗ヒト−エＩ！Ｇ抗体感作りボン
ームを調製した。
このリボソームを用いてヒト−ＩｇＧの測定を以下のよ
うにして行なった。
うにして行なった。
ｐＨ７，８０ＶＢ” （０，１ｍＭ ＭＩ Ｃｌ＠及
び０．０３ｍＭ ＣａＣ１＠を含有しているＧＶＢ−）
で希釈したヒト−ＩＩＧ（原液＃度、５ｍｊｌ／ｒｒｌ
） を２５ｔｔｌずつセルに注入した。次いで上記
感作りボンーム懸濁液をＧＶＢ！”で５０倍に希釈し、
１０μｌずつ各セルに分注した。最後に適当にＧＶＢ！
＋で希釈した補体を２５μｌずつ添加して、３７℃で反
応させ、５時間ｖ１５８０ｎｍの吸収波長で測定した。
び０．０３ｍＭ ＣａＣ１＠を含有しているＧＶＢ−）
で希釈したヒト−ＩＩＧ（原液＃度、５ｍｊｌ／ｒｒｌ
） を２５ｔｔｌずつセルに注入した。次いで上記
感作りボンーム懸濁液をＧＶＢ！”で５０倍に希釈し、
１０μｌずつ各セルに分注した。最後に適当にＧＶＢ！
＋で希釈した補体を２５μｌずつ添加して、３７℃で反
応させ、５時間ｖ１５８０ｎｍの吸収波長で測定した。
なお、測定値は抗原及び補体の代わりにＴｒｌｔｏｎＸ
〜１ｏｏ及びＧＶ Ｂｌ＋を２５μｌずつ添加した時の
吸収と抗原の代わりに２５μノのＧＶＢ”＋を添加した
場合の結果を第２図に示した。第２図かられかるように
ヒト−ＩｙＧが１０−ａ〜１０１ｍ１ｉ／ｍｌの範囲で
測定できた。
〜１ｏｏ及びＧＶ Ｂｌ＋を２５μｌずつ添加した時の
吸収と抗原の代わりに２５μノのＧＶＢ”＋を添加した
場合の結果を第２図に示した。第２図かられかるように
ヒト−ＩｙＧが１０−ａ〜１０１ｍ１ｉ／ｍｌの範囲で
測定できた。
第１図はヒトーＩＩＧ感作リポソームを用いて抗ヒトー
エｇＧ抗体の測定を行なった場合の抗ヒト−１ｇＧ抗体
の濃度と相対吸光質との相関性を示す特性図、第２図は
抗ヒト−ＩＩＧ感作リポソームを用いてヒ）−Ｉ＃Ｇを
測定した場合のヒ）−Ｉ＃Ｇの濃度と相対吸光度との関
係を示した特性図である。 代理人弁理士 則 近 憲 佑（ばか１名）ＣΦ 第１図 担ヒト−ＩｇＧ ８体−Ｊ＄ｊｘ （ｍｆ ７ｒ
Ｌ１）第２図
エｇＧ抗体の測定を行なった場合の抗ヒト−１ｇＧ抗体
の濃度と相対吸光質との相関性を示す特性図、第２図は
抗ヒト−ＩＩＧ感作リポソームを用いてヒ）−Ｉ＃Ｇを
測定した場合のヒ）−Ｉ＃Ｇの濃度と相対吸光度との関
係を示した特性図である。 代理人弁理士 則 近 憲 佑（ばか１名）ＣΦ 第１図 担ヒト−ＩｇＧ ８体−Ｊ＄ｊｘ （ｍｆ ７ｒ
Ｌ１）第２図
Claims (2)
- （１）補体活性により溶解作用を受けるリポソームと、
架橋法により前記リポソームに感作された親水性の抗原
または抗体と、前記リポソーム内に封入された水溶性金
属指示薬または水溶性染料よりなる親水性の標識物質と
からなることを特徴とする免疫分析用試薬。 - （２）架橋法に使用する架橋剤を、Ｎ−サクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート；Ｎ−サ
クシンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル）ブチレ
ート；Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）アセテート；Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マ
レイミドフェニル）プロピオネート；Ｎ−（γ−マレイ
ミドブチリルオキシ）サクシンイミド；Ｎ−（ｅ−マレ
イミドカプロイルオキシ）サクシンイミドの中より選ん
だことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分
析用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18883384A JPS6166963A (ja) | 1984-09-11 | 1984-09-11 | 免疫分析用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18883384A JPS6166963A (ja) | 1984-09-11 | 1984-09-11 | 免疫分析用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6166963A true JPS6166963A (ja) | 1986-04-05 |
Family
ID=16230633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18883384A Pending JPS6166963A (ja) | 1984-09-11 | 1984-09-11 | 免疫分析用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6166963A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61176855A (ja) * | 1985-02-01 | 1986-08-08 | Hitachi Ltd | 免疫分析用試薬および免疫分析方法 |
| JPS63179253A (ja) * | 1987-01-20 | 1988-07-23 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫分析用試薬 |
-
1984
- 1984-09-11 JP JP18883384A patent/JPS6166963A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61176855A (ja) * | 1985-02-01 | 1986-08-08 | Hitachi Ltd | 免疫分析用試薬および免疫分析方法 |
| JPS63179253A (ja) * | 1987-01-20 | 1988-07-23 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫分析用試薬 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1331560C (en) | Non-metal colloidal particle immunoassay | |
| JPS61250558A (ja) | 免疫分析方法 | |
| JPS6166963A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JPH0346074B2 (ja) | ||
| JPS61250559A (ja) | 免疫分析方法 | |
| JPS63106561A (ja) | 免疫分析試薬 | |
| JPS60159652A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JPH0192661A (ja) | 免疫分析方法 | |
| JPS61250560A (ja) | 免疫分析方法 | |
| JP2604171B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JPS63120256A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JPS63246670A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JPH07113639B2 (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JP2553360B2 (ja) | 免疫分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬 | |
| JPS63158461A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| EP0301333A2 (en) | Liposome based homogeneous immunoassay for diagnostic tests | |
| JP2684204B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JP2652881B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JPH01240860A (ja) | 免疫分析方法 | |
| JPS61133863A (ja) | 免疫分析装置 | |
| JPS63204150A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JPS61133864A (ja) | ヒト−ガン胎児性抗原（ｃｅａ）分析用試薬および分析方法 | |
| JPS63179254A (ja) | 抗原定量方法 | |
| JPS63118658A (ja) | 免疫分析方法及び免疫分析用試薬 | |
| JPH05281233A (ja) | 免疫測定試薬 |