JPS61133864A - ヒト−ガン胎児性抗原(cea)分析用試薬および分析方法 - Google Patents
ヒト−ガン胎児性抗原(cea)分析用試薬および分析方法Info
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- JPS61133864A JPS61133864A JP25561584A JP25561584A JPS61133864A JP S61133864 A JPS61133864 A JP S61133864A JP 25561584 A JP25561584 A JP 25561584A JP 25561584 A JP25561584 A JP 25561584A JP S61133864 A JPS61133864 A JP S61133864A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明は、試料中に存在する微量のヒ) −CEAを定
量分析するための免疫分析用試薬および分析方法に関す
る。
量分析するための免疫分析用試薬および分析方法に関す
る。
近年、ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の
腫瘍マーカーが見出されるようになつ九例えばα−フェ
トプロティン(AFP)、ガン胎児性抗原(CEA)、
塩基性フェトプロティン(BFP )および膵ガン胎児
性抗原(POA)などがその代表例として挙げることが
できる。これらの腫瘍マーカーの濃度は正常人の場合、
非常に低い(例えば、CEAの場合:数m g 7m
L以下)。一方、腫瘍患者の場合には正常人の10倍程
度の値を示すことが多い。いずれにしても、膿瘍マーカ
ーの分析定量には、非常に問い検出感度が要求される。
腫瘍マーカーが見出されるようになつ九例えばα−フェ
トプロティン(AFP)、ガン胎児性抗原(CEA)、
塩基性フェトプロティン(BFP )および膵ガン胎児
性抗原(POA)などがその代表例として挙げることが
できる。これらの腫瘍マーカーの濃度は正常人の場合、
非常に低い(例えば、CEAの場合:数m g 7m
L以下)。一方、腫瘍患者の場合には正常人の10倍程
度の値を示すことが多い。いずれにしても、膿瘍マーカ
ーの分析定量には、非常に問い検出感度が要求される。
J’1
この要求を満すため1こ、従に報′、放射性物質で標識
化した抗原または抗体を用いる放射線免役分析法(RI
A)か開発さ階こ。しかしながら、RIAは取扱いが面
倒で廃棄処理も問題になる。そこで、放射性物質の代り
に酵素や螢光物質など種々の物質で標識化した抗原ある
いは抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これら
においても遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離し
なければならないという欠点を有していた。また、Ro
senthalk、F、Vargas 、M、G、 a
nd Klass C,S、 (1976)CNn。
化した抗原または抗体を用いる放射線免役分析法(RI
A)か開発さ階こ。しかしながら、RIAは取扱いが面
倒で廃棄処理も問題になる。そこで、放射性物質の代り
に酵素や螢光物質など種々の物質で標識化した抗原ある
いは抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これら
においても遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離し
なければならないという欠点を有していた。また、Ro
senthalk、F、Vargas 、M、G、 a
nd Klass C,S、 (1976)CNn。
Chem 、22.13ggに発表されりEM I T
法ハ、分離工程の不要な均一系で測定できる画期的な手
法であるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原あるい
は抗体には適用できない。
法ハ、分離工程の不要な均一系で測定できる画期的な手
法であるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原あるい
は抗体には適用できない。
ところで、Haxby 、 J 、A 、 K1n5k
y 、 C,B、andKinsky S、C,(19
68)Biochemistry、 61 300で、
脂溶性の抗原を膜内に取り込みグルコースを封入したリ
ポソームを調製し、抗原抗体反応によるリポソームの破
壊に伴うグルコースの流出量を測定することlこより、
抗体の定量を行う手法が発表された。しかしながら、腫
瘍マーカーを測定するため(こは、マーカー自身あるい
はこれらのマーカーに対する抗体、すなわちタンパク質
である免疫グロブリンをリポソーム上に担持させねばな
らない。ところが、現在まで、脂溶性のタンパク質を担
持したリポソームを用いることは可能であったが、親水
性のタンパク質を担持したリポソームを用いる抗原また
は抗体の免疫分析法は報告されていない。それは、親水
性のタンパク質をリポソームに担持せしめる技術が確立
されていなかったからである。
y 、 C,B、andKinsky S、C,(19
68)Biochemistry、 61 300で、
脂溶性の抗原を膜内に取り込みグルコースを封入したリ
ポソームを調製し、抗原抗体反応によるリポソームの破
壊に伴うグルコースの流出量を測定することlこより、
抗体の定量を行う手法が発表された。しかしながら、腫
瘍マーカーを測定するため(こは、マーカー自身あるい
はこれらのマーカーに対する抗体、すなわちタンパク質
である免疫グロブリンをリポソーム上に担持させねばな
らない。ところが、現在まで、脂溶性のタンパク質を担
持したリポソームを用いることは可能であったが、親水
性のタンパク質を担持したリポソームを用いる抗原また
は抗体の免疫分析法は報告されていない。それは、親水
性のタンパク質をリポソームに担持せしめる技術が確立
されていなかったからである。
一方、特開昭56−132564”免疫分析用生成物お
よび方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部
に酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方
法が開示されているが、そこでは、タンパク質の担持方
法としてクルクルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用
いる方法を提案している。本発明者らの研究によると、
このような架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、
一般に抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うリポソ
ームの破壊が引起されなくなることが判明し死文に、従
来の免疫分析技術は、総じて、分析時間に長時間を要し
、しかも大量の試料を自動的lこ測定することができな
いという欠点を有してい旭〔発明の目的〕 本発明は、試料中の微量なヒト−CEAを迅速。
よび方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部
に酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方
法が開示されているが、そこでは、タンパク質の担持方
法としてクルクルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用
いる方法を提案している。本発明者らの研究によると、
このような架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、
一般に抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うリポソ
ームの破壊が引起されなくなることが判明し死文に、従
来の免疫分析技術は、総じて、分析時間に長時間を要し
、しかも大量の試料を自動的lこ測定することができな
いという欠点を有してい旭〔発明の目的〕 本発明は、試料中の微量なヒト−CEAを迅速。
簡便、高精度および高感度に分析するための免疫分析用
試薬および分析方法を提供することを目的とする。
試薬および分析方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究を重ね
た結果、補体活性1こより溶解作用を受けるリポソーム
上に、活性を低下させることなく、ヒ) −CEAまた
はヒト−CEAに対する抗体あるいは該抗体に対する抗
体を固定化することに成功し更に、リポソーム内に標識
物質を封入することにより、本発明の目的が達成される
ことを見出し、本発明を完成する1こ至った。
た結果、補体活性1こより溶解作用を受けるリポソーム
上に、活性を低下させることなく、ヒ) −CEAまた
はヒト−CEAに対する抗体あるいは該抗体に対する抗
体を固定化することに成功し更に、リポソーム内に標識
物質を封入することにより、本発明の目的が達成される
ことを見出し、本発明を完成する1こ至った。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の免疫分析用試薬におけるリポソームはリン脂質
及び糖脂質の少なくとも一方より構成され、さらにそれ
に加えてコレステロールを含有することがリポソームの
安定性の面からも好ましい。
及び糖脂質の少なくとも一方より構成され、さらにそれ
に加えてコレステロールを含有することがリポソームの
安定性の面からも好ましい。
例えば、リン脂質とコレステロールからリポソームを合
成する場合は、これらのモル比がリン脂質1に対してコ
レステロールが0.05〜20さらlこ好ましくは1対
1前後にあるとき、安定なリポソ−ム外 の脂質を用いた場合も同様である。このときリン脂質中
の脂肪酸残基は、炭素原子数が12〜18であることが
好ましく、更には偶数であることがより好ましい。そし
てこのリポソーム内lこ封入される標識物質は、親水性
であって、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物
質でなければならない。かかる物質としては、例えば、
高濃度では自己消光により螢光は示さないが、低濃度(
10″M以下)で非常に強い螢光を発するカルボ゛キシ
フルオレセインのような螢光性化合物:リポソーム外で
酸化反応により発光するルミノールやルシフェリンのよ
うな発光性化合物二可視部あるいは紫外部に特異的な吸
収帯を有する吸光性化合物(水溶性色素等)二酸化酵素
の作用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成
をもたらすグルコ−ス及びシュークロースなどの糖類:
テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオ
ン性化合物:アルカリ性フオスファターセ、グルコース
オキ/ダーゼのような酵素類、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド(NAD)のような補酵素類二メチルビ
オロゲンを初めとするラジカル化合物などが望ましい。
成する場合は、これらのモル比がリン脂質1に対してコ
レステロールが0.05〜20さらlこ好ましくは1対
1前後にあるとき、安定なリポソ−ム外 の脂質を用いた場合も同様である。このときリン脂質中
の脂肪酸残基は、炭素原子数が12〜18であることが
好ましく、更には偶数であることがより好ましい。そし
てこのリポソーム内lこ封入される標識物質は、親水性
であって、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物
質でなければならない。かかる物質としては、例えば、
高濃度では自己消光により螢光は示さないが、低濃度(
10″M以下)で非常に強い螢光を発するカルボ゛キシ
フルオレセインのような螢光性化合物:リポソーム外で
酸化反応により発光するルミノールやルシフェリンのよ
うな発光性化合物二可視部あるいは紫外部に特異的な吸
収帯を有する吸光性化合物(水溶性色素等)二酸化酵素
の作用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成
をもたらすグルコ−ス及びシュークロースなどの糖類:
テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオ
ン性化合物:アルカリ性フオスファターセ、グルコース
オキ/ダーゼのような酵素類、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド(NAD)のような補酵素類二メチルビ
オロゲンを初めとするラジカル化合物などが望ましい。
これらの化合物は、検出方法、感度及びリポソームの安
定性等の因子を勘案した上で、適宜に選択される。
定性等の因子を勘案した上で、適宜に選択される。
以上1こ説明した本発明のヒト−CEA分析用試薬は、
例えば、次の如き方法で製造される。まず、所望の脂質
と架橋剤(これを用いた場合を架橋法という)とを溶媒
中で反応せしめ、リポソーム上に固定化されるヒト−C
EA又は抗ヒト−CEA抗体の少なくとも一部あるいは
抗ヒト−CEA抗体に対する抗体の少なくとも一部と結
合し得る官能基を肪質分子に導入する。次いで、得られ
た官能性脂質とコレステロール及び必要であれはさらに
他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解
させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁
面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の水
浴液を加え、智栓をして振とうしリポソームの懸ン蜀放
を得る。
例えば、次の如き方法で製造される。まず、所望の脂質
と架橋剤(これを用いた場合を架橋法という)とを溶媒
中で反応せしめ、リポソーム上に固定化されるヒト−C
EA又は抗ヒト−CEA抗体の少なくとも一部あるいは
抗ヒト−CEA抗体に対する抗体の少なくとも一部と結
合し得る官能基を肪質分子に導入する。次いで、得られ
た官能性脂質とコレステロール及び必要であれはさらに
他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解
させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁
面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の水
浴液を加え、智栓をして振とうしリポソームの懸ン蜀放
を得る。
一方、リポソームに固定化すべきヒト−CEA又は抗ヒ
)、−CEA抗体あるいは抗ヒト−CEA抗体に対す°
る抗体と架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入
し、しかる後、必要であれば、該架橋基を還元する試薬
(例えばジチオトレイトール:DTT)と更に反応させ
て、上述した修飾抗原又は抗体を得る。
)、−CEA抗体あるいは抗ヒト−CEA抗体に対す°
る抗体と架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入
し、しかる後、必要であれば、該架橋基を還元する試薬
(例えばジチオトレイトール:DTT)と更に反応させ
て、上述した修飾抗原又は抗体を得る。
最後にリポソームと(δ飾抗原または抗体とを適当な緩
衝液中で反応せしめることにより本発明の免疫分析用試
薬が得られる。
衝液中で反応せしめることにより本発明の免疫分析用試
薬が得られる。
上記製造法に2ける架橋剤としては、例えば、N−ザク
シンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネー
ト(spDp)、N−ザクシンイミジル4−(P−マレ
イミドフェニル)7”チレート(SMPB) 、N−ザ
クシンイミジル4−(P−マレイミドフェニル)アセテ
ート(SMPA)、N−ザクシンイミジル4−(P−マ
レイミドフェニル)プロピオネート(SMPP) 、N
−(γ−マレイミドブチリルオキシ)ザクシンイミド(
GMBS)、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)
ザクシンイミド(EMC8)及びジサクシンイミジルス
ペ゛レート(D88)が挙げられる。
シンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネー
ト(spDp)、N−ザクシンイミジル4−(P−マレ
イミドフェニル)7”チレート(SMPB) 、N−ザ
クシンイミジル4−(P−マレイミドフェニル)アセテ
ート(SMPA)、N−ザクシンイミジル4−(P−マ
レイミドフェニル)プロピオネート(SMPP) 、N
−(γ−マレイミドブチリルオキシ)ザクシンイミド(
GMBS)、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)
ザクシンイミド(EMC8)及びジサクシンイミジルス
ペ゛レート(D88)が挙げられる。
で示され、温和な条件下で反応して、第一アミノ基を有
する化合物どうしを結合する架橋剤である。
する化合物どうしを結合する架橋剤である。
ファルマシア社から市販されている。該架橋剤は、例え
ば、タンパク質抗原を5PDPで処理し、ジチオトレイ
トール(DTT)で還元した後、予め5PDPを作用さ
せたリポソームと反応させると、室温以下、数時間から
1日でリポソーム上に抗原を固定化することができる。
ば、タンパク質抗原を5PDPで処理し、ジチオトレイ
トール(DTT)で還元した後、予め5PDPを作用さ
せたリポソームと反応させると、室温以下、数時間から
1日でリポソーム上に抗原を固定化することができる。
SMFBは、次式:
で示され、5PDPと同様な反応でタンパク質を固定化
できるが、最終生成物中に−8−8−結合を含まず(−
S−結合のみ)、血清などの還元的雰囲気下でも安定で
ある。
できるが、最終生成物中に−8−8−結合を含まず(−
S−結合のみ)、血清などの還元的雰囲気下でも安定で
ある。
一方、定量操作に用いる補体は格別限定されないが、通
常補体価の高いモルモット血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。本免
疫分析用試薬を用いてヒト−CEAを定量する際には、
この補体価が測定範囲及び検出限界を決定する重要な因
子となる。詳細は実施例で示すが、希望する測定条件を
得るためには補体価を種々変化させて検討せねはならな
い。
常補体価の高いモルモット血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。本免
疫分析用試薬を用いてヒト−CEAを定量する際には、
この補体価が測定範囲及び検出限界を決定する重要な因
子となる。詳細は実施例で示すが、希望する測定条件を
得るためには補体価を種々変化させて検討せねはならな
い。
なお、本発明のヒト−CEA分析用試薬は、まず脂質と
ヒト−CEA又は抗ヒト−CEA抗体あるいは抗ヒト−
CEA抗体に対する抗体とを、架橋剤を用いて結合せし
め、次いで得られた結合体を界面活性剤とともに水中に
加えてミセルを形成させ、しかる後、透析あるいはケル
口過等を用いて界面活性剤を除去することにより製造す
ることも可能である。
ヒト−CEA又は抗ヒト−CEA抗体あるいは抗ヒト−
CEA抗体に対する抗体とを、架橋剤を用いて結合せし
め、次いで得られた結合体を界面活性剤とともに水中に
加えてミセルを形成させ、しかる後、透析あるいはケル
口過等を用いて界面活性剤を除去することにより製造す
ることも可能である。
本ヒ) −CEA分析用試薬を用いてヒト−CEAを分
析するtこは、リポソーム(こ固定化するものにより以
下の4種類の方法が適用できる。以下の方法ヒ) −C
EAの濃度を定量するものである。ここでいう被検物質
とはその分析方法によって異なりヒト−CEAや抗ヒト
−CEA抗体等よりなる。
析するtこは、リポソーム(こ固定化するものにより以
下の4種類の方法が適用できる。以下の方法ヒ) −C
EAの濃度を定量するものである。ここでいう被検物質
とはその分析方法によって異なりヒト−CEAや抗ヒト
−CEA抗体等よりなる。
1)ヒト−CEAを固定化した場合:
予め既知濃度の一定量の抗ヒト−CEA抗体を試料中の
ヒ)、 −CEAと反応させ、残存する抗体量をヒ1−
−CEA固定化リポソーム及び補体で定量することによ
り試料中のヒI−−CEA濃度を決定する(このような
方法をインヒビツションアツセイと呼ぶ)。また、この
時同時に抗体と試料及びヒト−CEA固定化リポソーム
を混合し、競合的に抗体がリポソームと補体の存在下で
反応することにより試料中のヒ1−− CEA濃度を定
量することも可能である(このような方法を競合法と呼
ぶ)。
ヒ)、 −CEAと反応させ、残存する抗体量をヒ1−
−CEA固定化リポソーム及び補体で定量することによ
り試料中のヒI−−CEA濃度を決定する(このような
方法をインヒビツションアツセイと呼ぶ)。また、この
時同時に抗体と試料及びヒト−CEA固定化リポソーム
を混合し、競合的に抗体がリポソームと補体の存在下で
反応することにより試料中のヒ1−− CEA濃度を定
量することも可能である(このような方法を競合法と呼
ぶ)。
2)抗ヒト−CEA抗体を固定化した場合(1):試料
を適轟に希釈して補体とともに抗ヒト−CEA抗体固定
化リポソームと反応させるだけで試料中のヒト−CEA
濃度を定量できる。しかしながら、後述のサンドインチ
法に比べ標識物質の遊出率が若干低い。
を適轟に希釈して補体とともに抗ヒト−CEA抗体固定
化リポソームと反応させるだけで試料中のヒト−CEA
濃度を定量できる。しかしながら、後述のサンドインチ
法に比べ標識物質の遊出率が若干低い。
3)抗ヒト−CEA抗体を固定化した場合(■):2)
と同様だが、補体や抗ヒト−CEA抗体を固定化したリ
ポソームに加えてさらに同時にフリーの抗体も混合する
。試料中のヒト−CEAを抗体で挟みこむ所からサンド
イッチアッセイと呼ぶ。上記の方法に比べ、標識物質の
遊出率が高くなる。
と同様だが、補体や抗ヒト−CEA抗体を固定化したリ
ポソームに加えてさらに同時にフリーの抗体も混合する
。試料中のヒト−CEAを抗体で挟みこむ所からサンド
イッチアッセイと呼ぶ。上記の方法に比べ、標識物質の
遊出率が高くなる。
なお、この場合には抗体のFab部分のみを固定化して
もよい。
もよい。
4)抗ヒ) −CEA抗体に対する抗体を固定化した場
合: 例えば、ヒト−CEAに対する抗体をウサギで作成した
場合、ウサギの免疫グロブリンに対する抗体をヤギのよ
うな異種動物で得る。このような抗体をリポソームに固
定化し、3)と同様に反応を行う。この方法をダブル抗
体法という。このようにして調製したリポソームは、ウ
サギに免疫した他の試料にも適用できる。なお、この場
合(こも上記3)と同様に抗体のFab部分のみを固定
化してもよい。
合: 例えば、ヒト−CEAに対する抗体をウサギで作成した
場合、ウサギの免疫グロブリンに対する抗体をヤギのよ
うな異種動物で得る。このような抗体をリポソームに固
定化し、3)と同様に反応を行う。この方法をダブル抗
体法という。このようにして調製したリポソームは、ウ
サギに免疫した他の試料にも適用できる。なお、この場
合(こも上記3)と同様に抗体のFab部分のみを固定
化してもよい。
本発明のヒト−CEA分析用試薬および分析方法を用い
ることにより、均−系でしかも短時間のうちに、高感度
、高精度に試料中のヒト−CEA濃度が決定できる。
ることにより、均−系でしかも短時間のうちに、高感度
、高精度に試料中のヒト−CEA濃度が決定できる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
実施例1゜
ヒト−ガン胎児性抗原(CEA)を固定化したリポソー
ムを用いるヒト−CEAの測定(インヒビツションアツ
セイ) (5)試薬およびヒト−CEA固定化リポソームの調製
(1)試 薬 ジパルミトイルホスファチジルコン(L)PPC)。
ムを用いるヒト−CEAの測定(インヒビツションアツ
セイ) (5)試薬およびヒト−CEA固定化リポソームの調製
(1)試 薬 ジパルミトイルホスファチジルコン(L)PPC)。
コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン(DPPB)およびジチオトレイトール(D
TT)はシグマ社製のものを用いた。N−サクシンイミ
ジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(8P
DP)およびセファデックスG−25フアインはファル
マシア社より購入した。他の試薬は市販品(特級)を精
製せずに使用した。なお、水は全てイオン交換水を用い
た。
ールアミン(DPPB)およびジチオトレイトール(D
TT)はシグマ社製のものを用いた。N−サクシンイミ
ジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(8P
DP)およびセファデックスG−25フアインはファル
マシア社より購入した。他の試薬は市販品(特級)を精
製せずに使用した。なお、水は全てイオン交換水を用い
た。
(2)ヒト−CEA固定化リポソームの調製a)DPP
E−ジチオピリジネート(DPPB−DTP)の調整 密栓付三角フラスコに70 mgc7) DPPEヲ分
取し、25 mtのクロロホルム/メタノール(5:1
)溶液に溶解し、60μtのトリエタノールアミン及び
50mgの5PDPを添加後窒素置換した。室温で1時
間反応させた後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除
去した。
E−ジチオピリジネート(DPPB−DTP)の調整 密栓付三角フラスコに70 mgc7) DPPEヲ分
取し、25 mtのクロロホルム/メタノール(5:1
)溶液に溶解し、60μtのトリエタノールアミン及び
50mgの5PDPを添加後窒素置換した。室温で1時
間反応させた後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除
去した。
乾燥物を5mLのクロロホルム/メタノール(10:1
)に溶解させ、シリカゲル力ラムを用いて精製した。生
成物画分を回収し、エバポレーターで約5mAまで濃縮
した。収率は80〜95%であった。保存は窒素封入下
−20℃で行った。
)に溶解させ、シリカゲル力ラムを用いて精製した。生
成物画分を回収し、エバポレーターで約5mAまで濃縮
した。収率は80〜95%であった。保存は窒素封入下
−20℃で行った。
b)リポソームの調製
使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
/メタノール(2/1 ) iこ溶解シた。まず、5m
MDPPC(200μA)、10mMコレステロ /L
’(100μt)及び1mM DPPEDTP(soμ
t)を10mA(7)ナス塑7ラス:+に入れ、更lこ
2 m zのクロロホルムを加えて良く混合した。水浴
中(約50℃)でロータリーエバポレーターにより溶媒
を除去した。再び2 m tのクロロホルムを添加し、
十分攪拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒
を蒸発させた。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁
面に薄膜が形成された。フラスコをデシケータ−中に移
し真空ポンプで約1時間吸引し、溶媒を完全に除去した
。次に、100μtの0.2Mカルボキシフルオレセイ
ン(以下、CFとする:イーストマン・コダック社製、
p)i7゜4)を添加し、フラスコ内部を窒素で置換し
た後に密栓して、60℃程度の水浴中lこ約1分間浸面
した。続いて、Vortex ミキサーを用い、壁面
の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振と
うした。この操作により、リポソーム懸濁液が調製され
た。
/メタノール(2/1 ) iこ溶解シた。まず、5m
MDPPC(200μA)、10mMコレステロ /L
’(100μt)及び1mM DPPEDTP(soμ
t)を10mA(7)ナス塑7ラス:+に入れ、更lこ
2 m zのクロロホルムを加えて良く混合した。水浴
中(約50℃)でロータリーエバポレーターにより溶媒
を除去した。再び2 m tのクロロホルムを添加し、
十分攪拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒
を蒸発させた。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁
面に薄膜が形成された。フラスコをデシケータ−中に移
し真空ポンプで約1時間吸引し、溶媒を完全に除去した
。次に、100μtの0.2Mカルボキシフルオレセイ
ン(以下、CFとする:イーストマン・コダック社製、
p)i7゜4)を添加し、フラスコ内部を窒素で置換し
た後に密栓して、60℃程度の水浴中lこ約1分間浸面
した。続いて、Vortex ミキサーを用い、壁面
の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振と
うした。この操作により、リポソーム懸濁液が調製され
た。
ゼラチン−ベロナール緩衝液(以下、GVBと略記)を
少量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心チューブに
移した。4℃、15.00Orpmで20分間遠心し、
遊離のCFを除去した。上清か透明になるまでGVB
を用いてこの操作を繰り返した。最後に2 m tのG
VB−及び5μtの10%NaN、を加え、Vort、
exミキサーで懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫に保存し
た。
少量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心チューブに
移した。4℃、15.00Orpmで20分間遠心し、
遊離のCFを除去した。上清か透明になるまでGVB
を用いてこの操作を繰り返した。最後に2 m tのG
VB−及び5μtの10%NaN、を加え、Vort、
exミキサーで懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫に保存し
た。
C)ヒ トーCEAの修飾
Imgのヒト−CEA (Dako 社製)を1 m
tの0.OIMHEPB8緩衝液(+)H7,4s 、
o、s 5%Na C!、含M)に溶解し、窒素で置
換した後5μLの10mM 5PDP (x タンー#
flj液) ヲ加え、十分攪拌してそのまま室温で30
分間反応させた。反応後、反応液を予め生理食塩水で飽
和させたセファデックスG−25フアイン(ファルマシ
ア製)のゲルを充填したカラム(ゲル体積:約ismt
)に展開し、0.1M酢酸緩衝液(PH4,5、0,8
5%NaCt含有)で溶出させた。最初のタンパク質フ
ラクション(約2mz)に更に2 m Lの酢酸緩衝液
を加え、窒素置換後、ジチオトレイトール(約30mg
)を添加した。十分に攪拌して20分間室温で反応させ
た。反応後、予め0.01MHEPES緩衝液で飽和さ
せたセファデックスG−25フアインのゲルを充填しで
あるカラム(ゲル体積:約30mt )に反応液を展開
し、前記HEPES緩衝液で溶出した。最初のタンパク
質フラクション(約2mA)を集め、窒素置換後、使用
するまで冷蔵庫に保存した。
tの0.OIMHEPB8緩衝液(+)H7,4s 、
o、s 5%Na C!、含M)に溶解し、窒素で置
換した後5μLの10mM 5PDP (x タンー#
flj液) ヲ加え、十分攪拌してそのまま室温で30
分間反応させた。反応後、反応液を予め生理食塩水で飽
和させたセファデックスG−25フアイン(ファルマシ
ア製)のゲルを充填したカラム(ゲル体積:約ismt
)に展開し、0.1M酢酸緩衝液(PH4,5、0,8
5%NaCt含有)で溶出させた。最初のタンパク質フ
ラクション(約2mz)に更に2 m Lの酢酸緩衝液
を加え、窒素置換後、ジチオトレイトール(約30mg
)を添加した。十分に攪拌して20分間室温で反応させ
た。反応後、予め0.01MHEPES緩衝液で飽和さ
せたセファデックスG−25フアインのゲルを充填しで
あるカラム(ゲル体積:約30mt )に反応液を展開
し、前記HEPES緩衝液で溶出した。最初のタンパク
質フラクション(約2mA)を集め、窒素置換後、使用
するまで冷蔵庫に保存した。
d)ヒトー’CEA固定化リポソームの調製前述のよう
にして調製したリポソーム懸濁液と等量の修飾ヒト−C
EA溶液を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆっくり
振とうしながら1晩反応させた。前記HEPES緩衝液
、次いでGVB−で洗浄して、未反応のヒト−CEAを
除去した。反応に用いたリポソーム懸濁液の量に相当す
るGVB−及び5μ乙の10%Na N 3を最後に添
加し、懸濁・窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存し
た。
にして調製したリポソーム懸濁液と等量の修飾ヒト−C
EA溶液を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆっくり
振とうしながら1晩反応させた。前記HEPES緩衝液
、次いでGVB−で洗浄して、未反応のヒト−CEAを
除去した。反応に用いたリポソーム懸濁液の量に相当す
るGVB−及び5μ乙の10%Na N 3を最後に添
加し、懸濁・窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存し
た。
(3)ヒトーCEA固定化リポソームを用し)た抗ヒト
−CEA抗体の測定 ヌンク社製のUfiプレート(96穴)に適当量のGV
B”(0,1mM MgCL!及びO,Q 3 mM
CaCL。
−CEA抗体の測定 ヌンク社製のUfiプレート(96穴)に適当量のGV
B”(0,1mM MgCL!及びO,Q 3 mM
CaCL。
を含有しているGVB )で希釈した抗ヒト−CEA
抗体(原液濃度: 2mg/ml)を2’5μtずつ注
入した。次いで、上記ヒト−CEA固定化1ノボ゛ノー
ム懸濁液をGVB2+で100倍(こ希釈し、5μLず
つ各ウェル(Well)に分注した。最後に、適当にG
VB2+c希釈した補体(モルモ′ント血清)を25μ
tずつ添加した。反応は37℃恒温度下で1,5時間行
った。反応後、各welllこ100、、.4のQ、0
1M EDTA −ヘロf−JLtt&衝tLを加えて
反応を停止し、プレート用螢光分光光度計(コロナ電子
社製、 MTP 〜12F ) テ各Wellの螢光を
測定した(P:x:49Qnm、Em:520nm’)
。
抗体(原液濃度: 2mg/ml)を2’5μtずつ注
入した。次いで、上記ヒト−CEA固定化1ノボ゛ノー
ム懸濁液をGVB2+で100倍(こ希釈し、5μLず
つ各ウェル(Well)に分注した。最後に、適当にG
VB2+c希釈した補体(モルモ′ント血清)を25μ
tずつ添加した。反応は37℃恒温度下で1,5時間行
った。反応後、各welllこ100、、.4のQ、0
1M EDTA −ヘロf−JLtt&衝tLを加えて
反応を停止し、プレート用螢光分光光度計(コロナ電子
社製、 MTP 〜12F ) テ各Wellの螢光を
測定した(P:x:49Qnm、Em:520nm’)
。
なお、測定値は、抗体及び補体の代わりlこ10% T
r i tonX −100(Rahm Jk、 Ha
as社m>及びGVBを25μtずつ添加したWell
の螢光と、抗体の代わりに25μtのGVB2+を添加
したものの差を1、 O0%とした相対値で表示した。
r i tonX −100(Rahm Jk、 Ha
as社m>及びGVBを25μtずつ添加したWell
の螢光と、抗体の代わりに25μtのGVB2+を添加
したものの差を1、 O0%とした相対値で表示した。
400倍希釈(補体価:o、sCHヵ)の補体を用いた
場合の結果をM1図に示した。
場合の結果をM1図に示した。
この特性図かられかるように5X10−1.0(mgl
mt)の範囲の抗ヒ)、 CEA抗体の濃度が測定で
きることがわかった。
mt)の範囲の抗ヒ)、 CEA抗体の濃度が測定で
きることがわかった。
(4)インヒビツションアツセイによるヒト−CEAの
測定 上記(3)で示したように、ヒト−CEA固定化リボす
ノームと抗ヒト−CEA抗体との反応(こ伴うCF遊出
率は約5 X 10 mg/ml未溝の抗体濃度で低下
してくる。そこで5μtの試料(1xiO〜lX9−9
m g / m tのヒトーCEA含有)と25μtの
抗体希釈液(5X10 mglmt)を37℃で予め
30分間インキュベートし、次いでGvB2+で100
倍−こ希釈したヒト−CEA固定化リポソーム(5μt
)及び400倍希釈補体(25μt)を添加し、更に3
7℃で1時間反応を続けた。(3)と同様にして求めた
ヒトーCEA濃度とCFの相対遊出率との関係を第2図
に示す。この特性図から明らかなように、5X10 〜
5X10−’mg/mlの濃度範囲でヒト−CEAが測
定できた。
測定 上記(3)で示したように、ヒト−CEA固定化リボす
ノームと抗ヒト−CEA抗体との反応(こ伴うCF遊出
率は約5 X 10 mg/ml未溝の抗体濃度で低下
してくる。そこで5μtの試料(1xiO〜lX9−9
m g / m tのヒトーCEA含有)と25μtの
抗体希釈液(5X10 mglmt)を37℃で予め
30分間インキュベートし、次いでGvB2+で100
倍−こ希釈したヒト−CEA固定化リポソーム(5μt
)及び400倍希釈補体(25μt)を添加し、更に3
7℃で1時間反応を続けた。(3)と同様にして求めた
ヒトーCEA濃度とCFの相対遊出率との関係を第2図
に示す。この特性図から明らかなように、5X10 〜
5X10−’mg/mlの濃度範囲でヒト−CEAが測
定できた。
実施例2
抗ヒト−σ汰抗体を固定化したリポソームを用いるヒト
−CEAの測定 実施例1と同様にしてウサギ抗ヒト−CFA抗体(Da
ko社竪)をリポソーム上に固定化した。ヒト−CEA
cr)希釈液(IXIO〜lXl0 mg/ml含
有)25μtと100倍希釈の抗ヒト−CKA抗体リポ
ソーム5μを及び100倍希釈補体(2CH,。)25
μtを混合し、37℃で1時間反応させた。第3図にそ
の時の相対CF遊出率を示す。10〜10 mglmt
の濃度範囲でヒh −CEAが測定できた。なお、以下
特に断わらない限り、抗体としてはウサギ由来のものを
使用した。
−CEAの測定 実施例1と同様にしてウサギ抗ヒト−CFA抗体(Da
ko社竪)をリポソーム上に固定化した。ヒト−CEA
cr)希釈液(IXIO〜lXl0 mg/ml含
有)25μtと100倍希釈の抗ヒト−CKA抗体リポ
ソーム5μを及び100倍希釈補体(2CH,。)25
μtを混合し、37℃で1時間反応させた。第3図にそ
の時の相対CF遊出率を示す。10〜10 mglmt
の濃度範囲でヒh −CEAが測定できた。なお、以下
特に断わらない限り、抗体としてはウサギ由来のものを
使用した。
実施例3゜
抗ヒト−CEA抗体を固定化したリポソームを用いるヒ
ト−CEAの測定(サンドイッチアッセイ)実施例2に
おいて、反応時1こ更に10rng/rMのウサギ抗ヒ
ト−σ■抗体を25μLずつ添加した。
ト−CEAの測定(サンドイッチアッセイ)実施例2に
おいて、反応時1こ更に10rng/rMのウサギ抗ヒ
ト−σ■抗体を25μLずつ添加した。
その結果を第4図に示す。実施例2とほぼ同程度の測定
範囲であるが、相対CF遊出率が約30%増大した。
範囲であるが、相対CF遊出率が約30%増大した。
なお、ウサギ抗ヒト−CEA抗体をリポソーム上に固定
化する代りに、ヤギ抗ヒト−CEA抗体あるいはこれを
Fab化したものを用いると、補体に対するバックグラ
ウンドが著しく低くなることが示された。
化する代りに、ヤギ抗ヒト−CEA抗体あるいはこれを
Fab化したものを用いると、補体に対するバックグラ
ウンドが著しく低くなることが示された。
実施例4゜
ヤギ抗つサギーIgG抗体を固定化したリポソームを用
いるヒト−CEAの測定(タプル抗体法)ヤギ抗つサギ
ーIgG抗体を実施例1と同様にしてリポソーム上(こ
固定化した。このリポソームを用い、実施例3と同様に
してウサギ抗ヒ) −CFA抗体と反応させることによ
りヒト−CEAを測定した。結果を第5図に示す。10
〜5 x 10 rng/m/、の範囲内でヒト−C
EAが測定できた。このリポソーム4iSヒ) −CE
A以外にも、免疫動物をウサギにすれgf、広範囲の物
質の測定に利用できる。
いるヒト−CEAの測定(タプル抗体法)ヤギ抗つサギ
ーIgG抗体を実施例1と同様にしてリポソーム上(こ
固定化した。このリポソームを用い、実施例3と同様に
してウサギ抗ヒ) −CFA抗体と反応させることによ
りヒト−CEAを測定した。結果を第5図に示す。10
〜5 x 10 rng/m/、の範囲内でヒト−C
EAが測定できた。このリポソーム4iSヒ) −CE
A以外にも、免疫動物をウサギにすれgf、広範囲の物
質の測定に利用できる。
実施例5゜
抗ヒ1−− CEA抗体固定化リポソームとヒト−CP
Aとの反応に及ぼすリポソーム中のDPPE−DTP
含有率の影響 実施例1と同様にして、リポソーム中のDPPE−DT
P含有量を変化させて抗ヒト−CEA抗体リポソームを
調製した。3 X 10 mglmtのヒト−CEAを
用い、実施例2と同様にしてヒト−CEAを測定した。
Aとの反応に及ぼすリポソーム中のDPPE−DTP
含有率の影響 実施例1と同様にして、リポソーム中のDPPE−DT
P含有量を変化させて抗ヒト−CEA抗体リポソームを
調製した。3 X 10 mglmtのヒト−CEAを
用い、実施例2と同様にしてヒト−CEAを測定した。
結果を第6図(こ示す。DPPE−DTPを含んでいな
いリポソームの場合には、全(CFの遊出は認められな
かった。DPPCに対しDPPE−DTPメモル%(D
PPC:コレステロール=1 : 1 )までは相対C
F遊出箪は増加するが、それ以上20モルチまでは殆ど
増加はぼ一定だった。しかしながら20モルチをこえた
場合、抗原抗体反応によらない自然なCFの遊出が著し
く保存に対し不安定であることが確認された。以上のこ
とから、DPPE−DTP含有率として、DPPCに対
し0.01〜20モルチが望ましいと決定した。
いリポソームの場合には、全(CFの遊出は認められな
かった。DPPCに対しDPPE−DTPメモル%(D
PPC:コレステロール=1 : 1 )までは相対C
F遊出箪は増加するが、それ以上20モルチまでは殆ど
増加はぼ一定だった。しかしながら20モルチをこえた
場合、抗原抗体反応によらない自然なCFの遊出が著し
く保存に対し不安定であることが確認された。以上のこ
とから、DPPE−DTP含有率として、DPPCに対
し0.01〜20モルチが望ましいと決定した。
実施例6゜
リポソームの安定性に及ぼすコレステロールの添加効果
実施例1と同様にしてDPPCに対し種々のコレステロ
ール含有率のリポソーム(抗原抗体は固定化せず)を調
製した。DPPE−DTP含有率はDPPCに対し5モ
ルチとした。調製直後及び1週間4℃で保存後lこ遠心
し、上清の螢光強度を比較した。
ール含有率のリポソーム(抗原抗体は固定化せず)を調
製した。DPPE−DTP含有率はDPPCに対し5モ
ルチとした。調製直後及び1週間4℃で保存後lこ遠心
し、上清の螢光強度を比較した。
螢光強度測定は実施例1に準じた。第7図に相対CF遊
出率の増加量を示す。DPPCに対し、コレステロール
含有率が1.0モルチ未満の場合には、相対CF遊出率
が30%以上増加した。これに対し1.0〜50モルチ
の間では、徐々(こ相対CF遊出率の増加が減少し、5
0〜150モルチでは殆ど増加は認められなかった。こ
れとは逆に200モルチをこえた場合には、かなり急激
に増加し九以上のことから、コレステロールの含有率と
しては、DPPCに対し5〜200モルチが望ましいと
決定した。
出率の増加量を示す。DPPCに対し、コレステロール
含有率が1.0モルチ未満の場合には、相対CF遊出率
が30%以上増加した。これに対し1.0〜50モルチ
の間では、徐々(こ相対CF遊出率の増加が減少し、5
0〜150モルチでは殆ど増加は認められなかった。こ
れとは逆に200モルチをこえた場合には、かなり急激
に増加し九以上のことから、コレステロールの含有率と
しては、DPPCに対し5〜200モルチが望ましいと
決定した。
実施例7゜
抗ヒト−CEA抗体同定化リポソームとヒト−CEAと
の反応lこ及ぼす固定化時の抗ヒト−CEA抗体の濃度
の影響 実施例2の系で、抗ヒト−CFA抗体の濃度を変化させ
てリポソーム上lこ固定化し、ヒト−CFAとの反応性
について検討した結果を第8図に示す。
の反応lこ及ぼす固定化時の抗ヒト−CEA抗体の濃度
の影響 実施例2の系で、抗ヒト−CFA抗体の濃度を変化させ
てリポソーム上lこ固定化し、ヒト−CFAとの反応性
について検討した結果を第8図に示す。
固定化した抗体の濃度がリポソーム調製をこ使用したリ
ン脂質の0.5 m M当りに換算して0.01〜30
mg/ml の範囲内の場合にヒト−CEA(3xlO
−’m g/m L )に良く応答した。しかしながら
30mg/m4以上の場合には反応によらない自然のC
F遊出が著しくヒトーCEA測定には不適当であること
が示された。そこでリン脂質0.5mM当り0.01〜
30mg/mlの抗体量あるいは抗原量がリポソーム上
べの固定化の際には適当であることが明らかになった。
ン脂質の0.5 m M当りに換算して0.01〜30
mg/ml の範囲内の場合にヒト−CEA(3xlO
−’m g/m L )に良く応答した。しかしながら
30mg/m4以上の場合には反応によらない自然のC
F遊出が著しくヒトーCEA測定には不適当であること
が示された。そこでリン脂質0.5mM当り0.01〜
30mg/mlの抗体量あるいは抗原量がリポソーム上
べの固定化の際には適当であることが明らかになった。
実施例8゜
補体価の影響
実施例1で調製したヒト−CEA固定化リポソームと1
0 mg/mlの抗ヒト−CEA抗体及び種々に希釈
した補体を反応させ、補体価の影響について検討した。
0 mg/mlの抗ヒト−CEA抗体及び種々に希釈
した補体を反応させ、補体価の影響について検討した。
第9図に結果を示す。補体価0. I CHs。
以上でCFの遊出が認められた。これに対し、10CH
a。をこえた場合では抗体を加えなくてもCFの遊出が
著しく抗体量の測定には不適であった。
a。をこえた場合では抗体を加えなくてもCFの遊出が
著しく抗体量の測定には不適であった。
従って、本発明においては、補体価として0.1〜10
CHs。の範囲が望ましいことが示された。
CHs。の範囲が望ましいことが示された。
第1図は、ヒトーCEA固定化リポソームを用いて抗ヒ
ト−CEA抗体を測定した際の抗体濃度と相対CF遊出
率との相関性を示した特性図、第2図はインヒビツショ
ンアツセイを行った際のヒトーQ人濃度と相対遊出率と
の関係を示した特性図、第3図は抗ヒト−CEA抗体固
定化リポソームを用いてヒト−CEAを測定した際のタ
イトレージョンカーブを示した特性図、第4図はサンド
イッチアッセイによるヒト−CEAの測?bた時の応答
曲線を示した特性図、第5図はヤギ抗つサキーIgG抗
体固定化リポソームを用いた場合のヒト−CEAに対す
る応答曲線を示した特性図、第6図は抗ヒト−CEA抗
体固定化リボすノームとヒト−CHkとの反応に及ぼす
リポソーム中のDPPE−DTP含有率の影響を示した
特性図、第7図はリポソームの安定性に及ぼすコレステ
ロールの添加率の影響を示した特性図、第8図は抗ヒ)
−CEA抗体固定化リポソームとヒト−CEAとの反
応に及ぼす固定化時の抗ヒト−CEA抗体濃度の影響を
示した特性図、第9図はヒトーCEA固定化リポソーム
と抗ヒト−CEA抗体との反応に及ぼす補体価の影響を
示した特性図である。 代理人 弁理士 則 近 憲 佑(ほか1名)第 1
図 ah)−CER+BJ−7i!j (rnJS)第
2 図 ヒト−CE/’? 、、tfi (nWynJL)第
3図 hi CHf’l g)X (rrLf/wdlυ
第 4 図 t5” t6Jttyqlt5’ t6’ t6
7tts”ヒト−にx、q Xメ’r−(rrv/r
nil )第 5 図 bト−chs #l (yn71nJl)第 6
図 ρFPL−07F賞榊イジI/尊 第 7 図 コLスケロール盲介雫(ジし3) 第 8 図 o、ol t、OtD to。
ト−CEA抗体を測定した際の抗体濃度と相対CF遊出
率との相関性を示した特性図、第2図はインヒビツショ
ンアツセイを行った際のヒトーQ人濃度と相対遊出率と
の関係を示した特性図、第3図は抗ヒト−CEA抗体固
定化リポソームを用いてヒト−CEAを測定した際のタ
イトレージョンカーブを示した特性図、第4図はサンド
イッチアッセイによるヒト−CEAの測?bた時の応答
曲線を示した特性図、第5図はヤギ抗つサキーIgG抗
体固定化リポソームを用いた場合のヒト−CEAに対す
る応答曲線を示した特性図、第6図は抗ヒト−CEA抗
体固定化リボすノームとヒト−CHkとの反応に及ぼす
リポソーム中のDPPE−DTP含有率の影響を示した
特性図、第7図はリポソームの安定性に及ぼすコレステ
ロールの添加率の影響を示した特性図、第8図は抗ヒ)
−CEA抗体固定化リポソームとヒト−CEAとの反
応に及ぼす固定化時の抗ヒト−CEA抗体濃度の影響を
示した特性図、第9図はヒトーCEA固定化リポソーム
と抗ヒト−CEA抗体との反応に及ぼす補体価の影響を
示した特性図である。 代理人 弁理士 則 近 憲 佑(ほか1名)第 1
図 ah)−CER+BJ−7i!j (rnJS)第
2 図 ヒト−CE/’? 、、tfi (nWynJL)第
3図 hi CHf’l g)X (rrLf/wdlυ
第 4 図 t5” t6Jttyqlt5’ t6’ t6
7tts”ヒト−にx、q Xメ’r−(rrv/r
nil )第 5 図 bト−chs #l (yn71nJl)第 6
図 ρFPL−07F賞榊イジI/尊 第 7 図 コLスケロール盲介雫(ジし3) 第 8 図 o、ol t、OtD to。
Claims (8)
- (1)リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れたヒト−CEAあるいは抗ヒト−CEA抗体の少なく
とも一部あるいは抗ヒト−CEA抗体に対する抗体の少
なくとも一部と、前記リポソーム内に封入された親水性
の標識物質とからなり、前記リポソームを構成するリン
脂質及び糖脂質のうち、前記架橋法において用いた架橋
剤と反応したリン脂質及び糖脂質の構成比が0.01〜
20モル%でありかつ 脂質換算で0.5mMのリポソームに対して固定化され
る前記ヒト−CEAあるいは抗ヒト−CEA抗体の少な
くとも一部あるいは抗ヒト−CEA抗体に対する抗体の
少なくとも一部の濃度が0.01〜10mg/mlであ
ることを特徴とするヒト−ガン胎児性抗原(CEA)分
析用試薬。 - (2)架橋法において使用される架橋剤が、N−サクシ
ンイミゾル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート
、N−サクシンイミジル4−(P−マレイミドフェニル
)ブチレート、N−サクシンイミジル4−(P−マレイ
ミドフェニル)アセテート、N−サクシンイミジル4−
(P−マレイミドフェニル)プロピオネート、N−(γ
−マレイミドブチリルオキシ)サクシンイミド、N−(
ε−マレイミドカプロイルオキシ)サクシンイミド及び
ジサクシンイミジルスベレートより選ばれることを特徴
とする特許請求の範囲第1項記載のヒト−ガン胎児性抗
原(CEA)分析試薬。 - (3)リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質に対し
て5〜200モル%のコレステロールがリポソームに含
有されていることを特徴とする特許請求の範囲第1項記
載のヒト−ガン胎児性抗原(CEA)分析試薬。 - (4)標識物質が螢光化合物、発光性化合物、吸光性化
合物、糖類、イオン性化合物、酸素、補酵素またはラジ
カル化合物の中より選ばれることを特徴とする特許請求
の範囲第1項記載のヒト−ガン胎児性抗原(CEA)分
析用試薬。 - (5)リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れたヒト−CEAと、前記リポソーム内に封入された親
水性の標識物質とからなり、前記リポソームを構成する
リン脂質及び糖脂質のうち、前記架橋法において用いた
架橋剤と反応したリン脂質及び糖脂質の構成比が0.0
1〜20モル%でありかつ 脂質換算で0.5mMのリポソームに対して固定化され
る前記ヒト−CEAの濃度が0.01〜10mg/ml
である分析用試薬及び補体を用いて、インヒビッション
アッセイあるいは競合法により分析することを特徴とす
るヒト−ガン胎児性抗原(CEA)分析方法。 - (6)リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れた抗ヒト−CEA抗体と、前記リポソーム内に封入さ
れた親水性の標識物質とからなり、前記リポソームを構
成するリン脂質及び糖脂質のうち、前記架橋法において
用いた架橋剤と反応したリン脂質及び糖脂質の構成比が
0.01〜20モル%であり、かつ 脂質換算で0.5mMのリポソームに対して固定化され
る前記抗ヒト−CEA抗体の濃度が0.01〜10mg
/mlである分析用試薬及び補体を用いて、ヒト−CE
Aを分析することを特徴とするヒト−ガン胎児性抗原(
CEA)分析方法。 - (7)リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れた抗ヒト−CEA抗体あるいは前記抗ヒト−CEA抗
体の一部と、前記リポソーム内に封入された親水性の標
識物質とからなり、 前記リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質のうち、
前記架橋法において用いた架橋剤と反応したリン脂質及
び糖脂質の構成比が0.01〜20モル%であり、かつ 脂質換算で0.5mMのリポソームに対して固定化され
る前記抗ヒト−CEA抗体あるいは抗ヒト−CEA抗体
の一部の濃度が0.01〜10mg/mlである分析用
試薬及び補体を用いてサンドイッチアッセイによりヒト
−CEAを分析することを特徴とするヒト−ガン胎児性
抗原(CEA)分析方法。 - (8)リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れるヒト−CEAの免疫動物の抗体に対する異種動物の
抗体あるいはヒト−CEAの免疫動物の抗体に対する異
種動物の抗体の一部と、前記リポソーム内に封入された
親水性の標識物質とからなり、前記リポソームを構成す
るリン脂質及び糖脂質のうち、前記架橋法において用い
た架橋剤と反応したリン脂質及び糖脂質の構成比が0.
01〜20モル%であり、かつ 脂質換算で0.5mMのリポソームに対して固定化され
る前記異種動物の抗体あるいは前記異種動物の抗体の一
部の濃度が0.01〜10mg/mlである分析用試薬
及び補体を用いてダブル抗体法によりヒト−CEAを分
析することを特徴とするヒト−ガン胎児性抗原(CEA
)分析方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25561584A JPS61133864A (ja) | 1984-12-05 | 1984-12-05 | ヒト−ガン胎児性抗原(cea)分析用試薬および分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25561584A JPS61133864A (ja) | 1984-12-05 | 1984-12-05 | ヒト−ガン胎児性抗原(cea)分析用試薬および分析方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61133864A true JPS61133864A (ja) | 1986-06-21 |
Family
ID=17281202
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25561584A Pending JPS61133864A (ja) | 1984-12-05 | 1984-12-05 | ヒト−ガン胎児性抗原(cea)分析用試薬および分析方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61133864A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0242360A (ja) * | 1988-08-02 | 1990-02-13 | Nitsusui Seiyaku Kk | Atl抗体測定試薬 |
-
1984
- 1984-12-05 JP JP25561584A patent/JPS61133864A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0242360A (ja) * | 1988-08-02 | 1990-02-13 | Nitsusui Seiyaku Kk | Atl抗体測定試薬 |
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