JPS61133864A - ヒト−ガン胎児性抗原（ｃｅａ）分析用試薬および分析方法 - Google Patents
ヒト−ガン胎児性抗原（ｃｅａ）分析用試薬および分析方法Info
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- JPS61133864A JPS61133864A JP25561584A JP25561584A JPS61133864A JP S61133864 A JPS61133864 A JP S61133864A JP 25561584 A JP25561584 A JP 25561584A JP 25561584 A JP25561584 A JP 25561584A JP S61133864 A JPS61133864 A JP S61133864A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明は、試料中に存在する微量のヒ） −ＣＥＡを定
量分析するための免疫分析用試薬および分析方法に関す
る。
量分析するための免疫分析用試薬および分析方法に関す
る。
近年、ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の
腫瘍マーカーが見出されるようになつ九例えばα−フェ
トプロティン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、
塩基性フェトプロティン（ＢＦＰ ）および膵ガン胎児
性抗原（ＰＯＡ）などがその代表例として挙げることが
できる。これらの腫瘍マーカーの濃度は正常人の場合、
非常に低い（例えば、ＣＥＡの場合：数ｍ ｇ ７ｍ
Ｌ以下）。一方、腫瘍患者の場合には正常人の１０倍程
度の値を示すことが多い。いずれにしても、膿瘍マーカ
ーの分析定量には、非常に問い検出感度が要求される。
腫瘍マーカーが見出されるようになつ九例えばα−フェ
トプロティン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、
塩基性フェトプロティン（ＢＦＰ ）および膵ガン胎児
性抗原（ＰＯＡ）などがその代表例として挙げることが
できる。これらの腫瘍マーカーの濃度は正常人の場合、
非常に低い（例えば、ＣＥＡの場合：数ｍ ｇ ７ｍ
Ｌ以下）。一方、腫瘍患者の場合には正常人の１０倍程
度の値を示すことが多い。いずれにしても、膿瘍マーカ
ーの分析定量には、非常に問い検出感度が要求される。
Ｊ’１
この要求を満すため１こ、従に報′、放射性物質で標識
化した抗原または抗体を用いる放射線免役分析法（ＲＩ
Ａ）か開発さ階こ。しかしながら、ＲＩＡは取扱いが面
倒で廃棄処理も問題になる。そこで、放射性物質の代り
に酵素や螢光物質など種々の物質で標識化した抗原ある
いは抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これら
においても遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離し
なければならないという欠点を有していた。また、Ｒｏ
ｓｅｎｔｈａｌｋ、Ｆ、Ｖａｒｇａｓ 、Ｍ、Ｇ、 ａ
ｎｄ Ｋｌａｓｓ Ｃ，Ｓ、 （１９７６）ＣＮｎ。
化した抗原または抗体を用いる放射線免役分析法（ＲＩ
Ａ）か開発さ階こ。しかしながら、ＲＩＡは取扱いが面
倒で廃棄処理も問題になる。そこで、放射性物質の代り
に酵素や螢光物質など種々の物質で標識化した抗原ある
いは抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これら
においても遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離し
なければならないという欠点を有していた。また、Ｒｏ
ｓｅｎｔｈａｌｋ、Ｆ、Ｖａｒｇａｓ 、Ｍ、Ｇ、 ａ
ｎｄ Ｋｌａｓｓ Ｃ，Ｓ、 （１９７６）ＣＮｎ。
Ｃｈｅｍ 、２２．１３ｇｇに発表されりＥＭ Ｉ Ｔ
法ハ、分離工程の不要な均一系で測定できる画期的な手
法であるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原あるい
は抗体には適用できない。
法ハ、分離工程の不要な均一系で測定できる画期的な手
法であるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原あるい
は抗体には適用できない。
ところで、Ｈａｘｂｙ 、 Ｊ 、Ａ 、 Ｋ１ｎ５ｋ
ｙ 、 Ｃ，Ｂ、ａｎｄＫｉｎｓｋｙ Ｓ、Ｃ，（１９
６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ６１ ３００で、
脂溶性の抗原を膜内に取り込みグルコースを封入したリ
ポソームを調製し、抗原抗体反応によるリポソームの破
壊に伴うグルコースの流出量を測定することｌこより、
抗体の定量を行う手法が発表された。しかしながら、腫
瘍マーカーを測定するため（こは、マーカー自身あるい
はこれらのマーカーに対する抗体、すなわちタンパク質
である免疫グロブリンをリポソーム上に担持させねばな
らない。ところが、現在まで、脂溶性のタンパク質を担
持したリポソームを用いることは可能であったが、親水
性のタンパク質を担持したリポソームを用いる抗原また
は抗体の免疫分析法は報告されていない。それは、親水
性のタンパク質をリポソームに担持せしめる技術が確立
されていなかったからである。
ｙ 、 Ｃ，Ｂ、ａｎｄＫｉｎｓｋｙ Ｓ、Ｃ，（１９
６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ６１ ３００で、
脂溶性の抗原を膜内に取り込みグルコースを封入したリ
ポソームを調製し、抗原抗体反応によるリポソームの破
壊に伴うグルコースの流出量を測定することｌこより、
抗体の定量を行う手法が発表された。しかしながら、腫
瘍マーカーを測定するため（こは、マーカー自身あるい
はこれらのマーカーに対する抗体、すなわちタンパク質
である免疫グロブリンをリポソーム上に担持させねばな
らない。ところが、現在まで、脂溶性のタンパク質を担
持したリポソームを用いることは可能であったが、親水
性のタンパク質を担持したリポソームを用いる抗原また
は抗体の免疫分析法は報告されていない。それは、親水
性のタンパク質をリポソームに担持せしめる技術が確立
されていなかったからである。
一方、特開昭５６−１３２５６４”免疫分析用生成物お
よび方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部
に酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方
法が開示されているが、そこでは、タンパク質の担持方
法としてクルクルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用
いる方法を提案している。本発明者らの研究によると、
このような架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、
一般に抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うリポソ
ームの破壊が引起されなくなることが判明し死文に、従
来の免疫分析技術は、総じて、分析時間に長時間を要し
、しかも大量の試料を自動的ｌこ測定することができな
いという欠点を有してい旭〔発明の目的〕 本発明は、試料中の微量なヒト−ＣＥＡを迅速。
よび方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部
に酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方
法が開示されているが、そこでは、タンパク質の担持方
法としてクルクルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用
いる方法を提案している。本発明者らの研究によると、
このような架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、
一般に抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うリポソ
ームの破壊が引起されなくなることが判明し死文に、従
来の免疫分析技術は、総じて、分析時間に長時間を要し
、しかも大量の試料を自動的ｌこ測定することができな
いという欠点を有してい旭〔発明の目的〕 本発明は、試料中の微量なヒト−ＣＥＡを迅速。
簡便、高精度および高感度に分析するための免疫分析用
試薬および分析方法を提供することを目的とする。
試薬および分析方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究を重ね
た結果、補体活性１こより溶解作用を受けるリポソーム
上に、活性を低下させることなく、ヒ） −ＣＥＡまた
はヒト−ＣＥＡに対する抗体あるいは該抗体に対する抗
体を固定化することに成功し更に、リポソーム内に標識
物質を封入することにより、本発明の目的が達成される
ことを見出し、本発明を完成する１こ至った。
た結果、補体活性１こより溶解作用を受けるリポソーム
上に、活性を低下させることなく、ヒ） −ＣＥＡまた
はヒト−ＣＥＡに対する抗体あるいは該抗体に対する抗
体を固定化することに成功し更に、リポソーム内に標識
物質を封入することにより、本発明の目的が達成される
ことを見出し、本発明を完成する１こ至った。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の免疫分析用試薬におけるリポソームはリン脂質
及び糖脂質の少なくとも一方より構成され、さらにそれ
に加えてコレステロールを含有することがリポソームの
安定性の面からも好ましい。
及び糖脂質の少なくとも一方より構成され、さらにそれ
に加えてコレステロールを含有することがリポソームの
安定性の面からも好ましい。
例えば、リン脂質とコレステロールからリポソームを合
成する場合は、これらのモル比がリン脂質１に対してコ
レステロールが０．０５〜２０さらｌこ好ましくは１対
１前後にあるとき、安定なリポソ−ム外 の脂質を用いた場合も同様である。このときリン脂質中
の脂肪酸残基は、炭素原子数が１２〜１８であることが
好ましく、更には偶数であることがより好ましい。そし
てこのリポソーム内ｌこ封入される標識物質は、親水性
であって、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物
質でなければならない。かかる物質としては、例えば、
高濃度では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（
１０″Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカルボ゛キシ
フルオレセインのような螢光性化合物：リポソーム外で
酸化反応により発光するルミノールやルシフェリンのよ
うな発光性化合物二可視部あるいは紫外部に特異的な吸
収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）二酸化酵素
の作用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成
をもたらすグルコ−ス及びシュークロースなどの糖類：
テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオ
ン性化合物：アルカリ性フオスファターセ、グルコース
オキ／ダーゼのような酵素類、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）のような補酵素類二メチルビ
オロゲンを初めとするラジカル化合物などが望ましい。
成する場合は、これらのモル比がリン脂質１に対してコ
レステロールが０．０５〜２０さらｌこ好ましくは１対
１前後にあるとき、安定なリポソ−ム外 の脂質を用いた場合も同様である。このときリン脂質中
の脂肪酸残基は、炭素原子数が１２〜１８であることが
好ましく、更には偶数であることがより好ましい。そし
てこのリポソーム内ｌこ封入される標識物質は、親水性
であって、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物
質でなければならない。かかる物質としては、例えば、
高濃度では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（
１０″Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカルボ゛キシ
フルオレセインのような螢光性化合物：リポソーム外で
酸化反応により発光するルミノールやルシフェリンのよ
うな発光性化合物二可視部あるいは紫外部に特異的な吸
収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）二酸化酵素
の作用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成
をもたらすグルコ−ス及びシュークロースなどの糖類：
テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオ
ン性化合物：アルカリ性フオスファターセ、グルコース
オキ／ダーゼのような酵素類、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）のような補酵素類二メチルビ
オロゲンを初めとするラジカル化合物などが望ましい。
これらの化合物は、検出方法、感度及びリポソームの安
定性等の因子を勘案した上で、適宜に選択される。
定性等の因子を勘案した上で、適宜に選択される。
以上１こ説明した本発明のヒト−ＣＥＡ分析用試薬は、
例えば、次の如き方法で製造される。まず、所望の脂質
と架橋剤（これを用いた場合を架橋法という）とを溶媒
中で反応せしめ、リポソーム上に固定化されるヒト−Ｃ
ＥＡ又は抗ヒト−ＣＥＡ抗体の少なくとも一部あるいは
抗ヒト−ＣＥＡ抗体に対する抗体の少なくとも一部と結
合し得る官能基を肪質分子に導入する。次いで、得られ
た官能性脂質とコレステロール及び必要であれはさらに
他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解
させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁
面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の水
浴液を加え、智栓をして振とうしリポソームの懸ン蜀放
を得る。
例えば、次の如き方法で製造される。まず、所望の脂質
と架橋剤（これを用いた場合を架橋法という）とを溶媒
中で反応せしめ、リポソーム上に固定化されるヒト−Ｃ
ＥＡ又は抗ヒト−ＣＥＡ抗体の少なくとも一部あるいは
抗ヒト−ＣＥＡ抗体に対する抗体の少なくとも一部と結
合し得る官能基を肪質分子に導入する。次いで、得られ
た官能性脂質とコレステロール及び必要であれはさらに
他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解
させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁
面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の水
浴液を加え、智栓をして振とうしリポソームの懸ン蜀放
を得る。
一方、リポソームに固定化すべきヒト−ＣＥＡ又は抗ヒ
）、−ＣＥＡ抗体あるいは抗ヒト−ＣＥＡ抗体に対す°
る抗体と架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入
し、しかる後、必要であれば、該架橋基を還元する試薬
（例えばジチオトレイトール：ＤＴＴ）と更に反応させ
て、上述した修飾抗原又は抗体を得る。
）、−ＣＥＡ抗体あるいは抗ヒト−ＣＥＡ抗体に対す°
る抗体と架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入
し、しかる後、必要であれば、該架橋基を還元する試薬
（例えばジチオトレイトール：ＤＴＴ）と更に反応させ
て、上述した修飾抗原又は抗体を得る。
最後にリポソームと（δ飾抗原または抗体とを適当な緩
衝液中で反応せしめることにより本発明の免疫分析用試
薬が得られる。
衝液中で反応せしめることにより本発明の免疫分析用試
薬が得られる。
上記製造法に２ける架橋剤としては、例えば、Ｎ−ザク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ｓｐＤｐ）、Ｎ−ザクシンイミジル４−（Ｐ−マレ
イミドフェニル）７”チレート（ＳＭＰＢ） 、Ｎ−ザ
クシンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル）アセテ
ート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−ザクシンイミジル４−（Ｐ−マ
レイミドフェニル）プロピオネート（ＳＭＰＰ） 、Ｎ
−（γ−マレイミドブチリルオキシ）ザクシンイミド（
ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）
ザクシンイミド（ＥＭＣ８）及びジサクシンイミジルス
ペ゛レート（Ｄ８８）が挙げられる。
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ｓｐＤｐ）、Ｎ−ザクシンイミジル４−（Ｐ−マレ
イミドフェニル）７”チレート（ＳＭＰＢ） 、Ｎ−ザ
クシンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル）アセテ
ート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−ザクシンイミジル４−（Ｐ−マ
レイミドフェニル）プロピオネート（ＳＭＰＰ） 、Ｎ
−（γ−マレイミドブチリルオキシ）ザクシンイミド（
ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）
ザクシンイミド（ＥＭＣ８）及びジサクシンイミジルス
ペ゛レート（Ｄ８８）が挙げられる。
で示され、温和な条件下で反応して、第一アミノ基を有
する化合物どうしを結合する架橋剤である。
する化合物どうしを結合する架橋剤である。
ファルマシア社から市販されている。該架橋剤は、例え
ば、タンパク質抗原を５ＰＤＰで処理し、ジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）で還元した後、予め５ＰＤＰを作用さ
せたリポソームと反応させると、室温以下、数時間から
１日でリポソーム上に抗原を固定化することができる。
ば、タンパク質抗原を５ＰＤＰで処理し、ジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）で還元した後、予め５ＰＤＰを作用さ
せたリポソームと反応させると、室温以下、数時間から
１日でリポソーム上に抗原を固定化することができる。
ＳＭＦＢは、次式：
で示され、５ＰＤＰと同様な反応でタンパク質を固定化
できるが、最終生成物中に−８−８−結合を含まず（−
Ｓ−結合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定で
ある。
できるが、最終生成物中に−８−８−結合を含まず（−
Ｓ−結合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定で
ある。
一方、定量操作に用いる補体は格別限定されないが、通
常補体価の高いモルモット血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。本免
疫分析用試薬を用いてヒト−ＣＥＡを定量する際には、
この補体価が測定範囲及び検出限界を決定する重要な因
子となる。詳細は実施例で示すが、希望する測定条件を
得るためには補体価を種々変化させて検討せねはならな
い。
常補体価の高いモルモット血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。本免
疫分析用試薬を用いてヒト−ＣＥＡを定量する際には、
この補体価が測定範囲及び検出限界を決定する重要な因
子となる。詳細は実施例で示すが、希望する測定条件を
得るためには補体価を種々変化させて検討せねはならな
い。
なお、本発明のヒト−ＣＥＡ分析用試薬は、まず脂質と
ヒト−ＣＥＡ又は抗ヒト−ＣＥＡ抗体あるいは抗ヒト−
ＣＥＡ抗体に対する抗体とを、架橋剤を用いて結合せし
め、次いで得られた結合体を界面活性剤とともに水中に
加えてミセルを形成させ、しかる後、透析あるいはケル
口過等を用いて界面活性剤を除去することにより製造す
ることも可能である。
ヒト−ＣＥＡ又は抗ヒト−ＣＥＡ抗体あるいは抗ヒト−
ＣＥＡ抗体に対する抗体とを、架橋剤を用いて結合せし
め、次いで得られた結合体を界面活性剤とともに水中に
加えてミセルを形成させ、しかる後、透析あるいはケル
口過等を用いて界面活性剤を除去することにより製造す
ることも可能である。
本ヒ） −ＣＥＡ分析用試薬を用いてヒト−ＣＥＡを分
析するｔこは、リポソーム（こ固定化するものにより以
下の４種類の方法が適用できる。以下の方法ヒ） −Ｃ
ＥＡの濃度を定量するものである。ここでいう被検物質
とはその分析方法によって異なりヒト−ＣＥＡや抗ヒト
−ＣＥＡ抗体等よりなる。
析するｔこは、リポソーム（こ固定化するものにより以
下の４種類の方法が適用できる。以下の方法ヒ） −Ｃ
ＥＡの濃度を定量するものである。ここでいう被検物質
とはその分析方法によって異なりヒト−ＣＥＡや抗ヒト
−ＣＥＡ抗体等よりなる。
１）ヒト−ＣＥＡを固定化した場合：
予め既知濃度の一定量の抗ヒト−ＣＥＡ抗体を試料中の
ヒ）、 −ＣＥＡと反応させ、残存する抗体量をヒ１−
−ＣＥＡ固定化リポソーム及び補体で定量することによ
り試料中のヒＩ−−ＣＥＡ濃度を決定する（このような
方法をインヒビツションアツセイと呼ぶ）。また、この
時同時に抗体と試料及びヒト−ＣＥＡ固定化リポソーム
を混合し、競合的に抗体がリポソームと補体の存在下で
反応することにより試料中のヒ１−− ＣＥＡ濃度を定
量することも可能である（このような方法を競合法と呼
ぶ）。
ヒ）、 −ＣＥＡと反応させ、残存する抗体量をヒ１−
−ＣＥＡ固定化リポソーム及び補体で定量することによ
り試料中のヒＩ−−ＣＥＡ濃度を決定する（このような
方法をインヒビツションアツセイと呼ぶ）。また、この
時同時に抗体と試料及びヒト−ＣＥＡ固定化リポソーム
を混合し、競合的に抗体がリポソームと補体の存在下で
反応することにより試料中のヒ１−− ＣＥＡ濃度を定
量することも可能である（このような方法を競合法と呼
ぶ）。
２）抗ヒト−ＣＥＡ抗体を固定化した場合（１）：試料
を適轟に希釈して補体とともに抗ヒト−ＣＥＡ抗体固定
化リポソームと反応させるだけで試料中のヒト−ＣＥＡ
濃度を定量できる。しかしながら、後述のサンドインチ
法に比べ標識物質の遊出率が若干低い。
を適轟に希釈して補体とともに抗ヒト−ＣＥＡ抗体固定
化リポソームと反応させるだけで試料中のヒト−ＣＥＡ
濃度を定量できる。しかしながら、後述のサンドインチ
法に比べ標識物質の遊出率が若干低い。
３）抗ヒト−ＣＥＡ抗体を固定化した場合（■）：２）
と同様だが、補体や抗ヒト−ＣＥＡ抗体を固定化したリ
ポソームに加えてさらに同時にフリーの抗体も混合する
。試料中のヒト−ＣＥＡを抗体で挟みこむ所からサンド
イッチアッセイと呼ぶ。上記の方法に比べ、標識物質の
遊出率が高くなる。
と同様だが、補体や抗ヒト−ＣＥＡ抗体を固定化したリ
ポソームに加えてさらに同時にフリーの抗体も混合する
。試料中のヒト−ＣＥＡを抗体で挟みこむ所からサンド
イッチアッセイと呼ぶ。上記の方法に比べ、標識物質の
遊出率が高くなる。
なお、この場合には抗体のＦａｂ部分のみを固定化して
もよい。
もよい。
４）抗ヒ） −ＣＥＡ抗体に対する抗体を固定化した場
合： 例えば、ヒト−ＣＥＡに対する抗体をウサギで作成した
場合、ウサギの免疫グロブリンに対する抗体をヤギのよ
うな異種動物で得る。このような抗体をリポソームに固
定化し、３）と同様に反応を行う。この方法をダブル抗
体法という。このようにして調製したリポソームは、ウ
サギに免疫した他の試料にも適用できる。なお、この場
合（こも上記３）と同様に抗体のＦａｂ部分のみを固定
化してもよい。
合： 例えば、ヒト−ＣＥＡに対する抗体をウサギで作成した
場合、ウサギの免疫グロブリンに対する抗体をヤギのよ
うな異種動物で得る。このような抗体をリポソームに固
定化し、３）と同様に反応を行う。この方法をダブル抗
体法という。このようにして調製したリポソームは、ウ
サギに免疫した他の試料にも適用できる。なお、この場
合（こも上記３）と同様に抗体のＦａｂ部分のみを固定
化してもよい。
本発明のヒト−ＣＥＡ分析用試薬および分析方法を用い
ることにより、均−系でしかも短時間のうちに、高感度
、高精度に試料中のヒト−ＣＥＡ濃度が決定できる。
ることにより、均−系でしかも短時間のうちに、高感度
、高精度に試料中のヒト−ＣＥＡ濃度が決定できる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
実施例１゜
ヒト−ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）を固定化したリポソー
ムを用いるヒト−ＣＥＡの測定（インヒビツションアツ
セイ） （５）試薬およびヒト−ＣＥＡ固定化リポソームの調製
（１）試 薬 ジパルミトイルホスファチジルコン（Ｌ）ＰＰＣ）。
ムを用いるヒト−ＣＥＡの測定（インヒビツションアツ
セイ） （５）試薬およびヒト−ＣＥＡ固定化リポソームの調製
（１）試 薬 ジパルミトイルホスファチジルコン（Ｌ）ＰＰＣ）。
コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＰＰＢ）およびジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）はシグマ社製のものを用いた。Ｎ−サクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（８Ｐ
ＤＰ）およびセファデックスＧ−２５フアインはファル
マシア社より購入した。他の試薬は市販品（特級）を精
製せずに使用した。なお、水は全てイオン交換水を用い
た。
ールアミン（ＤＰＰＢ）およびジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）はシグマ社製のものを用いた。Ｎ−サクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（８Ｐ
ＤＰ）およびセファデックスＧ−２５フアインはファル
マシア社より購入した。他の試薬は市販品（特級）を精
製せずに使用した。なお、水は全てイオン交換水を用い
た。
（２）ヒト−ＣＥＡ固定化リポソームの調製ａ）ＤＰＰ
Ｅ−ジチオピリジネート（ＤＰＰＢ−ＤＴＰ）の調整 密栓付三角フラスコに７０ ｍｇｃ７） ＤＰＰＥヲ分
取し、２５ ｍｔのクロロホルム／メタノール（５：１
）溶液に溶解し、６０μｔのトリエタノールアミン及び
５０ｍｇの５ＰＤＰを添加後窒素置換した。室温で１時
間反応させた後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除
去した。
Ｅ−ジチオピリジネート（ＤＰＰＢ−ＤＴＰ）の調整 密栓付三角フラスコに７０ ｍｇｃ７） ＤＰＰＥヲ分
取し、２５ ｍｔのクロロホルム／メタノール（５：１
）溶液に溶解し、６０μｔのトリエタノールアミン及び
５０ｍｇの５ＰＤＰを添加後窒素置換した。室温で１時
間反応させた後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除
去した。
乾燥物を５ｍＬのクロロホルム／メタノール（１０：１
）に溶解させ、シリカゲル力ラムを用いて精製した。生
成物画分を回収し、エバポレーターで約５ｍＡまで濃縮
した。収率は８０〜９５％であった。保存は窒素封入下
−２０℃で行った。
）に溶解させ、シリカゲル力ラムを用いて精製した。生
成物画分を回収し、エバポレーターで約５ｍＡまで濃縮
した。収率は８０〜９５％であった。保存は窒素封入下
−２０℃で行った。
ｂ）リポソームの調製
使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１ ） ｉこ溶解シた。まず、５ｍ
ＭＤＰＰＣ（２００μＡ）、１０ｍＭコレステロ ／Ｌ
’（１００μｔ）及び１ｍＭ ＤＰＰＥＤＴＰ（ｓｏμ
ｔ）を１０ｍＡ（７）ナス塑７ラス：＋に入れ、更ｌこ
２ ｍ ｚのクロロホルムを加えて良く混合した。水浴
中（約５０℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒
を除去した。再び２ ｍ ｔのクロロホルムを添加し、
十分攪拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒
を蒸発させた。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁
面に薄膜が形成された。フラスコをデシケータ−中に移
し真空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した
。次に、１００μｔの０．２Ｍカルボキシフルオレセイ
ン（以下、ＣＦとする：イーストマン・コダック社製、
ｐ）ｉ７゜４）を添加し、フラスコ内部を窒素で置換し
た後に密栓して、６０℃程度の水浴中ｌこ約１分間浸面
した。続いて、Ｖｏｒｔｅｘ ミキサーを用い、壁面
の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振と
うした。この操作により、リポソーム懸濁液が調製され
た。
／メタノール（２／１ ） ｉこ溶解シた。まず、５ｍ
ＭＤＰＰＣ（２００μＡ）、１０ｍＭコレステロ ／Ｌ
’（１００μｔ）及び１ｍＭ ＤＰＰＥＤＴＰ（ｓｏμ
ｔ）を１０ｍＡ（７）ナス塑７ラス：＋に入れ、更ｌこ
２ ｍ ｚのクロロホルムを加えて良く混合した。水浴
中（約５０℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒
を除去した。再び２ ｍ ｔのクロロホルムを添加し、
十分攪拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒
を蒸発させた。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁
面に薄膜が形成された。フラスコをデシケータ−中に移
し真空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した
。次に、１００μｔの０．２Ｍカルボキシフルオレセイ
ン（以下、ＣＦとする：イーストマン・コダック社製、
ｐ）ｉ７゜４）を添加し、フラスコ内部を窒素で置換し
た後に密栓して、６０℃程度の水浴中ｌこ約１分間浸面
した。続いて、Ｖｏｒｔｅｘ ミキサーを用い、壁面
の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振と
うした。この操作により、リポソーム懸濁液が調製され
た。
ゼラチン−ベロナール緩衝液（以下、ＧＶＢと略記）を
少量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心チューブに
移した。４℃、１５．００Ｏｒｐｍで２０分間遠心し、
遊離のＣＦを除去した。上清か透明になるまでＧＶＢ
を用いてこの操作を繰り返した。最後に２ ｍ ｔのＧ
ＶＢ−及び５μｔの１０％ＮａＮ、を加え、Ｖｏｒｔ、
ｅｘミキサーで懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫に保存し
た。
少量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心チューブに
移した。４℃、１５．００Ｏｒｐｍで２０分間遠心し、
遊離のＣＦを除去した。上清か透明になるまでＧＶＢ
を用いてこの操作を繰り返した。最後に２ ｍ ｔのＧ
ＶＢ−及び５μｔの１０％ＮａＮ、を加え、Ｖｏｒｔ、
ｅｘミキサーで懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫に保存し
た。
Ｃ）ヒ トーＣＥＡの修飾
Ｉｍｇのヒト−ＣＥＡ （Ｄａｋｏ 社製）を１ ｍ
ｔの０．ＯＩＭＨＥＰＢ８緩衝液（＋）Ｈ７，４ｓ 、
ｏ、ｓ ５％Ｎａ Ｃ！、含Ｍ）に溶解し、窒素で置
換した後５μＬの１０ｍＭ ５ＰＤＰ （ｘ タンー＃
ｆｌｊ液） ヲ加え、十分攪拌してそのまま室温で３０
分間反応させた。反応後、反応液を予め生理食塩水で飽
和させたセファデックスＧ−２５フアイン（ファルマシ
ア製）のゲルを充填したカラム（ゲル体積：約ｉｓｍｔ
）に展開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４，５、０，８
５％ＮａＣｔ含有）で溶出させた。最初のタンパク質フ
ラクション（約２ｍｚ）に更に２ ｍ Ｌの酢酸緩衝液
を加え、窒素置換後、ジチオトレイトール（約３０ｍｇ
）を添加した。十分に攪拌して２０分間室温で反応させ
た。反応後、予め０．０１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液で飽和さ
せたセファデックスＧ−２５フアインのゲルを充填しで
あるカラム（ゲル体積：約３０ｍｔ ）に反応液を展開
し、前記ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。最初のタンパク
質フラクション（約２ｍＡ）を集め、窒素置換後、使用
するまで冷蔵庫に保存した。
ｔの０．ＯＩＭＨＥＰＢ８緩衝液（＋）Ｈ７，４ｓ 、
ｏ、ｓ ５％Ｎａ Ｃ！、含Ｍ）に溶解し、窒素で置
換した後５μＬの１０ｍＭ ５ＰＤＰ （ｘ タンー＃
ｆｌｊ液） ヲ加え、十分攪拌してそのまま室温で３０
分間反応させた。反応後、反応液を予め生理食塩水で飽
和させたセファデックスＧ−２５フアイン（ファルマシ
ア製）のゲルを充填したカラム（ゲル体積：約ｉｓｍｔ
）に展開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４，５、０，８
５％ＮａＣｔ含有）で溶出させた。最初のタンパク質フ
ラクション（約２ｍｚ）に更に２ ｍ Ｌの酢酸緩衝液
を加え、窒素置換後、ジチオトレイトール（約３０ｍｇ
）を添加した。十分に攪拌して２０分間室温で反応させ
た。反応後、予め０．０１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液で飽和さ
せたセファデックスＧ−２５フアインのゲルを充填しで
あるカラム（ゲル体積：約３０ｍｔ ）に反応液を展開
し、前記ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。最初のタンパク
質フラクション（約２ｍＡ）を集め、窒素置換後、使用
するまで冷蔵庫に保存した。
ｄ）ヒトー’ＣＥＡ固定化リポソームの調製前述のよう
にして調製したリポソーム懸濁液と等量の修飾ヒト−Ｃ
ＥＡ溶液を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆっくり
振とうしながら１晩反応させた。前記ＨＥＰＥＳ緩衝液
、次いでＧＶＢ−で洗浄して、未反応のヒト−ＣＥＡを
除去した。反応に用いたリポソーム懸濁液の量に相当す
るＧＶＢ−及び５μ乙の１０％Ｎａ Ｎ ３を最後に添
加し、懸濁・窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存し
た。
にして調製したリポソーム懸濁液と等量の修飾ヒト−Ｃ
ＥＡ溶液を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆっくり
振とうしながら１晩反応させた。前記ＨＥＰＥＳ緩衝液
、次いでＧＶＢ−で洗浄して、未反応のヒト−ＣＥＡを
除去した。反応に用いたリポソーム懸濁液の量に相当す
るＧＶＢ−及び５μ乙の１０％Ｎａ Ｎ ３を最後に添
加し、懸濁・窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存し
た。
（３）ヒトーＣＥＡ固定化リポソームを用し）た抗ヒト
−ＣＥＡ抗体の測定 ヌンク社製のＵｆｉプレート（９６穴）に適当量のＧＶ
Ｂ”（０，１ｍＭ ＭｇＣＬ！及びＯ，Ｑ ３ ｍＭ
ＣａＣＬ。
−ＣＥＡ抗体の測定 ヌンク社製のＵｆｉプレート（９６穴）に適当量のＧＶ
Ｂ”（０，１ｍＭ ＭｇＣＬ！及びＯ，Ｑ ３ ｍＭ
ＣａＣＬ。
を含有しているＧＶＢ ）で希釈した抗ヒト−ＣＥＡ
抗体（原液濃度： ２ｍｇ／ｍｌ）を２’５μｔずつ注
入した。次いで、上記ヒト−ＣＥＡ固定化１ノボ゛ノー
ム懸濁液をＧＶＢ２＋で１００倍（こ希釈し、５μＬず
つ各ウェル（Ｗｅｌｌ）に分注した。最後に、適当にＧ
ＶＢ２＋ｃ希釈した補体（モルモ′ント血清）を２５μ
ｔずつ添加した。反応は３７℃恒温度下で１，５時間行
った。反応後、各ｗｅｌｌｌこ１００、、．４のＱ、０
１Ｍ ＥＤＴＡ −ヘロｆ−ＪＬｔｔ＆衝ｔＬを加えて
反応を停止し、プレート用螢光分光光度計（コロナ電子
社製、 ＭＴＰ 〜１２Ｆ ） テ各Ｗｅｌｌの螢光を
測定した（Ｐ：ｘ：４９Ｑｎｍ、Ｅｍ：５２０ｎｍ’）
。
抗体（原液濃度： ２ｍｇ／ｍｌ）を２’５μｔずつ注
入した。次いで、上記ヒト−ＣＥＡ固定化１ノボ゛ノー
ム懸濁液をＧＶＢ２＋で１００倍（こ希釈し、５μＬず
つ各ウェル（Ｗｅｌｌ）に分注した。最後に、適当にＧ
ＶＢ２＋ｃ希釈した補体（モルモ′ント血清）を２５μ
ｔずつ添加した。反応は３７℃恒温度下で１，５時間行
った。反応後、各ｗｅｌｌｌこ１００、、．４のＱ、０
１Ｍ ＥＤＴＡ −ヘロｆ−ＪＬｔｔ＆衝ｔＬを加えて
反応を停止し、プレート用螢光分光光度計（コロナ電子
社製、 ＭＴＰ 〜１２Ｆ ） テ各Ｗｅｌｌの螢光を
測定した（Ｐ：ｘ：４９Ｑｎｍ、Ｅｍ：５２０ｎｍ’）
。
なお、測定値は、抗体及び補体の代わりｌこ１０％ Ｔ
ｒ ｉ ｔｏｎＸ −１００（Ｒａｈｍ Ｊｋ、 Ｈａ
ａｓ社ｍ＞及びＧＶＢを２５μｔずつ添加したＷｅｌｌ
の螢光と、抗体の代わりに２５μｔのＧＶＢ２＋を添加
したものの差を１、 Ｏ０％とした相対値で表示した。
ｒ ｉ ｔｏｎＸ −１００（Ｒａｈｍ Ｊｋ、 Ｈａ
ａｓ社ｍ＞及びＧＶＢを２５μｔずつ添加したＷｅｌｌ
の螢光と、抗体の代わりに２５μｔのＧＶＢ２＋を添加
したものの差を１、 Ｏ０％とした相対値で表示した。
４００倍希釈（補体価：ｏ、ｓＣＨヵ）の補体を用いた
場合の結果をＭ１図に示した。
場合の結果をＭ１図に示した。
この特性図かられかるように５Ｘ１０−１．０（ｍｇｌ
ｍｔ）の範囲の抗ヒ）、 ＣＥＡ抗体の濃度が測定で
きることがわかった。
ｍｔ）の範囲の抗ヒ）、 ＣＥＡ抗体の濃度が測定で
きることがわかった。
（４）インヒビツションアツセイによるヒト−ＣＥＡの
測定 上記（３）で示したように、ヒト−ＣＥＡ固定化リボす
ノームと抗ヒト−ＣＥＡ抗体との反応（こ伴うＣＦ遊出
率は約５ Ｘ １０ ｍｇ／ｍｌ未溝の抗体濃度で低下
してくる。そこで５μｔの試料（１ｘｉＯ〜ｌＸ９−９
ｍ ｇ ／ ｍ ｔのヒトーＣＥＡ含有）と２５μｔの
抗体希釈液（５Ｘ１０ ｍｇｌｍｔ）を３７℃で予め
３０分間インキュベートし、次いでＧｖＢ２＋で１００
倍−こ希釈したヒト−ＣＥＡ固定化リポソーム（５μｔ
）及び４００倍希釈補体（２５μｔ）を添加し、更に３
７℃で１時間反応を続けた。（３）と同様にして求めた
ヒトーＣＥＡ濃度とＣＦの相対遊出率との関係を第２図
に示す。この特性図から明らかなように、５Ｘ１０ 〜
５Ｘ１０−’ｍｇ／ｍｌの濃度範囲でヒト−ＣＥＡが測
定できた。
測定 上記（３）で示したように、ヒト−ＣＥＡ固定化リボす
ノームと抗ヒト−ＣＥＡ抗体との反応（こ伴うＣＦ遊出
率は約５ Ｘ １０ ｍｇ／ｍｌ未溝の抗体濃度で低下
してくる。そこで５μｔの試料（１ｘｉＯ〜ｌＸ９−９
ｍ ｇ ／ ｍ ｔのヒトーＣＥＡ含有）と２５μｔの
抗体希釈液（５Ｘ１０ ｍｇｌｍｔ）を３７℃で予め
３０分間インキュベートし、次いでＧｖＢ２＋で１００
倍−こ希釈したヒト−ＣＥＡ固定化リポソーム（５μｔ
）及び４００倍希釈補体（２５μｔ）を添加し、更に３
７℃で１時間反応を続けた。（３）と同様にして求めた
ヒトーＣＥＡ濃度とＣＦの相対遊出率との関係を第２図
に示す。この特性図から明らかなように、５Ｘ１０ 〜
５Ｘ１０−’ｍｇ／ｍｌの濃度範囲でヒト−ＣＥＡが測
定できた。
実施例２
抗ヒト−σ汰抗体を固定化したリポソームを用いるヒト
−ＣＥＡの測定 実施例１と同様にしてウサギ抗ヒト−ＣＦＡ抗体（Ｄａ
ｋｏ社竪）をリポソーム上に固定化した。ヒト−ＣＥＡ
ｃｒ）希釈液（ＩＸＩＯ〜ｌＸｌ０ ｍｇ／ｍｌ含
有）２５μｔと１００倍希釈の抗ヒト−ＣＫＡ抗体リポ
ソーム５μを及び１００倍希釈補体（２ＣＨ，。）２５
μｔを混合し、３７℃で１時間反応させた。第３図にそ
の時の相対ＣＦ遊出率を示す。１０〜１０ ｍｇｌｍｔ
の濃度範囲でヒｈ −ＣＥＡが測定できた。なお、以下
特に断わらない限り、抗体としてはウサギ由来のものを
使用した。
−ＣＥＡの測定 実施例１と同様にしてウサギ抗ヒト−ＣＦＡ抗体（Ｄａ
ｋｏ社竪）をリポソーム上に固定化した。ヒト−ＣＥＡ
ｃｒ）希釈液（ＩＸＩＯ〜ｌＸｌ０ ｍｇ／ｍｌ含
有）２５μｔと１００倍希釈の抗ヒト−ＣＫＡ抗体リポ
ソーム５μを及び１００倍希釈補体（２ＣＨ，。）２５
μｔを混合し、３７℃で１時間反応させた。第３図にそ
の時の相対ＣＦ遊出率を示す。１０〜１０ ｍｇｌｍｔ
の濃度範囲でヒｈ −ＣＥＡが測定できた。なお、以下
特に断わらない限り、抗体としてはウサギ由来のものを
使用した。
実施例３゜
抗ヒト−ＣＥＡ抗体を固定化したリポソームを用いるヒ
ト−ＣＥＡの測定（サンドイッチアッセイ）実施例２に
おいて、反応時１こ更に１０ｒｎｇ／ｒＭのウサギ抗ヒ
ト−σ■抗体を２５μＬずつ添加した。
ト−ＣＥＡの測定（サンドイッチアッセイ）実施例２に
おいて、反応時１こ更に１０ｒｎｇ／ｒＭのウサギ抗ヒ
ト−σ■抗体を２５μＬずつ添加した。
その結果を第４図に示す。実施例２とほぼ同程度の測定
範囲であるが、相対ＣＦ遊出率が約３０％増大した。
範囲であるが、相対ＣＦ遊出率が約３０％増大した。
なお、ウサギ抗ヒト−ＣＥＡ抗体をリポソーム上に固定
化する代りに、ヤギ抗ヒト−ＣＥＡ抗体あるいはこれを
Ｆａｂ化したものを用いると、補体に対するバックグラ
ウンドが著しく低くなることが示された。
化する代りに、ヤギ抗ヒト−ＣＥＡ抗体あるいはこれを
Ｆａｂ化したものを用いると、補体に対するバックグラ
ウンドが著しく低くなることが示された。
実施例４゜
ヤギ抗つサギーＩｇＧ抗体を固定化したリポソームを用
いるヒト−ＣＥＡの測定（タプル抗体法）ヤギ抗つサギ
ーＩｇＧ抗体を実施例１と同様にしてリポソーム上（こ
固定化した。このリポソームを用い、実施例３と同様に
してウサギ抗ヒ） −ＣＦＡ抗体と反応させることによ
りヒト−ＣＥＡを測定した。結果を第５図に示す。１０
〜５ ｘ １０ ｒｎｇ／ｍ／、の範囲内でヒト−Ｃ
ＥＡが測定できた。このリポソーム４ｉＳヒ） −ＣＥ
Ａ以外にも、免疫動物をウサギにすれｇｆ、広範囲の物
質の測定に利用できる。
いるヒト−ＣＥＡの測定（タプル抗体法）ヤギ抗つサギ
ーＩｇＧ抗体を実施例１と同様にしてリポソーム上（こ
固定化した。このリポソームを用い、実施例３と同様に
してウサギ抗ヒ） −ＣＦＡ抗体と反応させることによ
りヒト−ＣＥＡを測定した。結果を第５図に示す。１０
〜５ ｘ １０ ｒｎｇ／ｍ／、の範囲内でヒト−Ｃ
ＥＡが測定できた。このリポソーム４ｉＳヒ） −ＣＥ
Ａ以外にも、免疫動物をウサギにすれｇｆ、広範囲の物
質の測定に利用できる。
実施例５゜
抗ヒ１−− ＣＥＡ抗体固定化リポソームとヒト−ＣＰ
Ａとの反応に及ぼすリポソーム中のＤＰＰＥ−ＤＴＰ
含有率の影響 実施例１と同様にして、リポソーム中のＤＰＰＥ−ＤＴ
Ｐ含有量を変化させて抗ヒト−ＣＥＡ抗体リポソームを
調製した。３ Ｘ １０ ｍｇｌｍｔのヒト−ＣＥＡを
用い、実施例２と同様にしてヒト−ＣＥＡを測定した。
Ａとの反応に及ぼすリポソーム中のＤＰＰＥ−ＤＴＰ
含有率の影響 実施例１と同様にして、リポソーム中のＤＰＰＥ−ＤＴ
Ｐ含有量を変化させて抗ヒト−ＣＥＡ抗体リポソームを
調製した。３ Ｘ １０ ｍｇｌｍｔのヒト−ＣＥＡを
用い、実施例２と同様にしてヒト−ＣＥＡを測定した。
結果を第６図（こ示す。ＤＰＰＥ−ＤＴＰを含んでいな
いリポソームの場合には、全（ＣＦの遊出は認められな
かった。ＤＰＰＣに対しＤＰＰＥ−ＤＴＰメモル％（Ｄ
ＰＰＣ：コレステロール＝１ ： １ ）までは相対Ｃ
Ｆ遊出箪は増加するが、それ以上２０モルチまでは殆ど
増加はぼ一定だった。しかしながら２０モルチをこえた
場合、抗原抗体反応によらない自然なＣＦの遊出が著し
く保存に対し不安定であることが確認された。以上のこ
とから、ＤＰＰＥ−ＤＴＰ含有率として、ＤＰＰＣに対
し０．０１〜２０モルチが望ましいと決定した。
いリポソームの場合には、全（ＣＦの遊出は認められな
かった。ＤＰＰＣに対しＤＰＰＥ−ＤＴＰメモル％（Ｄ
ＰＰＣ：コレステロール＝１ ： １ ）までは相対Ｃ
Ｆ遊出箪は増加するが、それ以上２０モルチまでは殆ど
増加はぼ一定だった。しかしながら２０モルチをこえた
場合、抗原抗体反応によらない自然なＣＦの遊出が著し
く保存に対し不安定であることが確認された。以上のこ
とから、ＤＰＰＥ−ＤＴＰ含有率として、ＤＰＰＣに対
し０．０１〜２０モルチが望ましいと決定した。
実施例６゜
リポソームの安定性に及ぼすコレステロールの添加効果
実施例１と同様にしてＤＰＰＣに対し種々のコレステロ
ール含有率のリポソーム（抗原抗体は固定化せず）を調
製した。ＤＰＰＥ−ＤＴＰ含有率はＤＰＰＣに対し５モ
ルチとした。調製直後及び１週間４℃で保存後ｌこ遠心
し、上清の螢光強度を比較した。
ール含有率のリポソーム（抗原抗体は固定化せず）を調
製した。ＤＰＰＥ−ＤＴＰ含有率はＤＰＰＣに対し５モ
ルチとした。調製直後及び１週間４℃で保存後ｌこ遠心
し、上清の螢光強度を比較した。
螢光強度測定は実施例１に準じた。第７図に相対ＣＦ遊
出率の増加量を示す。ＤＰＰＣに対し、コレステロール
含有率が１．０モルチ未満の場合には、相対ＣＦ遊出率
が３０％以上増加した。これに対し１．０〜５０モルチ
の間では、徐々（こ相対ＣＦ遊出率の増加が減少し、５
０〜１５０モルチでは殆ど増加は認められなかった。こ
れとは逆に２００モルチをこえた場合には、かなり急激
に増加し九以上のことから、コレステロールの含有率と
しては、ＤＰＰＣに対し５〜２００モルチが望ましいと
決定した。
出率の増加量を示す。ＤＰＰＣに対し、コレステロール
含有率が１．０モルチ未満の場合には、相対ＣＦ遊出率
が３０％以上増加した。これに対し１．０〜５０モルチ
の間では、徐々（こ相対ＣＦ遊出率の増加が減少し、５
０〜１５０モルチでは殆ど増加は認められなかった。こ
れとは逆に２００モルチをこえた場合には、かなり急激
に増加し九以上のことから、コレステロールの含有率と
しては、ＤＰＰＣに対し５〜２００モルチが望ましいと
決定した。
実施例７゜
抗ヒト−ＣＥＡ抗体同定化リポソームとヒト−ＣＥＡと
の反応ｌこ及ぼす固定化時の抗ヒト−ＣＥＡ抗体の濃度
の影響 実施例２の系で、抗ヒト−ＣＦＡ抗体の濃度を変化させ
てリポソーム上ｌこ固定化し、ヒト−ＣＦＡとの反応性
について検討した結果を第８図に示す。
の反応ｌこ及ぼす固定化時の抗ヒト−ＣＥＡ抗体の濃度
の影響 実施例２の系で、抗ヒト−ＣＦＡ抗体の濃度を変化させ
てリポソーム上ｌこ固定化し、ヒト−ＣＦＡとの反応性
について検討した結果を第８図に示す。
固定化した抗体の濃度がリポソーム調製をこ使用したリ
ン脂質の０．５ ｍ Ｍ当りに換算して０．０１〜３０
ｍｇ／ｍｌ の範囲内の場合にヒト−ＣＥＡ（３ｘｌＯ
−’ｍ ｇ／ｍ Ｌ ）に良く応答した。しかしながら
３０ｍｇ／ｍ４以上の場合には反応によらない自然のＣ
Ｆ遊出が著しくヒトーＣＥＡ測定には不適当であること
が示された。そこでリン脂質０．５ｍＭ当り０．０１〜
３０ｍｇ／ｍｌの抗体量あるいは抗原量がリポソーム上
べの固定化の際には適当であることが明らかになった。
ン脂質の０．５ ｍ Ｍ当りに換算して０．０１〜３０
ｍｇ／ｍｌ の範囲内の場合にヒト−ＣＥＡ（３ｘｌＯ
−’ｍ ｇ／ｍ Ｌ ）に良く応答した。しかしながら
３０ｍｇ／ｍ４以上の場合には反応によらない自然のＣ
Ｆ遊出が著しくヒトーＣＥＡ測定には不適当であること
が示された。そこでリン脂質０．５ｍＭ当り０．０１〜
３０ｍｇ／ｍｌの抗体量あるいは抗原量がリポソーム上
べの固定化の際には適当であることが明らかになった。
実施例８゜
補体価の影響
実施例１で調製したヒト−ＣＥＡ固定化リポソームと１
０ ｍｇ／ｍｌの抗ヒト−ＣＥＡ抗体及び種々に希釈
した補体を反応させ、補体価の影響について検討した。
０ ｍｇ／ｍｌの抗ヒト−ＣＥＡ抗体及び種々に希釈
した補体を反応させ、補体価の影響について検討した。
第９図に結果を示す。補体価０． Ｉ ＣＨｓ。
以上でＣＦの遊出が認められた。これに対し、１０ＣＨ
ａ。をこえた場合では抗体を加えなくてもＣＦの遊出が
著しく抗体量の測定には不適であった。
ａ。をこえた場合では抗体を加えなくてもＣＦの遊出が
著しく抗体量の測定には不適であった。
従って、本発明においては、補体価として０．１〜１０
ＣＨｓ。の範囲が望ましいことが示された。
ＣＨｓ。の範囲が望ましいことが示された。
第１図は、ヒトーＣＥＡ固定化リポソームを用いて抗ヒ
ト−ＣＥＡ抗体を測定した際の抗体濃度と相対ＣＦ遊出
率との相関性を示した特性図、第２図はインヒビツショ
ンアツセイを行った際のヒトーＱ人濃度と相対遊出率と
の関係を示した特性図、第３図は抗ヒト−ＣＥＡ抗体固
定化リポソームを用いてヒト−ＣＥＡを測定した際のタ
イトレージョンカーブを示した特性図、第４図はサンド
イッチアッセイによるヒト−ＣＥＡの測？ｂた時の応答
曲線を示した特性図、第５図はヤギ抗つサキーＩｇＧ抗
体固定化リポソームを用いた場合のヒト−ＣＥＡに対す
る応答曲線を示した特性図、第６図は抗ヒト−ＣＥＡ抗
体固定化リボすノームとヒト−ＣＨｋとの反応に及ぼす
リポソーム中のＤＰＰＥ−ＤＴＰ含有率の影響を示した
特性図、第７図はリポソームの安定性に及ぼすコレステ
ロールの添加率の影響を示した特性図、第８図は抗ヒ）
−ＣＥＡ抗体固定化リポソームとヒト−ＣＥＡとの反
応に及ぼす固定化時の抗ヒト−ＣＥＡ抗体濃度の影響を
示した特性図、第９図はヒトーＣＥＡ固定化リポソーム
と抗ヒト−ＣＥＡ抗体との反応に及ぼす補体価の影響を
示した特性図である。 代理人 弁理士 則 近 憲 佑（ほか１名）第 １
図 ａｈ）−ＣＥＲ＋ＢＪ−７ｉ！ｊ （ｒｎＪＳ）第
２ 図 ヒト−ＣＥ／’？ 、、ｔｆｉ （ｎＷｙｎＪＬ）第
３図 ｈｉ ＣＨｆ’ｌ ｇ）Ｘ （ｒｒＬｆ／ｗｄｌυ
第 ４ 図 ｔ５” ｔ６Ｊｔｔｙｑｌｔ５’ ｔ６’ ｔ６
７ｔｔｓ”ヒト−にｘ、ｑ Ｘメ’ｒ−（ｒｒｖ／ｒ
ｎｉｌ ）第 ５ 図 ｂト−ｃｈｓ ＃ｌ （ｙｎ７１ｎＪｌ）第 ６
図 ρＦＰＬ−０７Ｆ賞榊イジＩ／尊 第 ７ 図 コＬスケロール盲介雫（ジし３） 第 ８ 図 ｏ、ｏｌ ｔ、ＯｔＤ ｔｏ。
ト−ＣＥＡ抗体を測定した際の抗体濃度と相対ＣＦ遊出
率との相関性を示した特性図、第２図はインヒビツショ
ンアツセイを行った際のヒトーＱ人濃度と相対遊出率と
の関係を示した特性図、第３図は抗ヒト−ＣＥＡ抗体固
定化リポソームを用いてヒト−ＣＥＡを測定した際のタ
イトレージョンカーブを示した特性図、第４図はサンド
イッチアッセイによるヒト−ＣＥＡの測？ｂた時の応答
曲線を示した特性図、第５図はヤギ抗つサキーＩｇＧ抗
体固定化リポソームを用いた場合のヒト−ＣＥＡに対す
る応答曲線を示した特性図、第６図は抗ヒト−ＣＥＡ抗
体固定化リボすノームとヒト−ＣＨｋとの反応に及ぼす
リポソーム中のＤＰＰＥ−ＤＴＰ含有率の影響を示した
特性図、第７図はリポソームの安定性に及ぼすコレステ
ロールの添加率の影響を示した特性図、第８図は抗ヒ）
−ＣＥＡ抗体固定化リポソームとヒト−ＣＥＡとの反
応に及ぼす固定化時の抗ヒト−ＣＥＡ抗体濃度の影響を
示した特性図、第９図はヒトーＣＥＡ固定化リポソーム
と抗ヒト−ＣＥＡ抗体との反応に及ぼす補体価の影響を
示した特性図である。 代理人 弁理士 則 近 憲 佑（ほか１名）第 １
図 ａｈ）−ＣＥＲ＋ＢＪ−７ｉ！ｊ （ｒｎＪＳ）第
２ 図 ヒト−ＣＥ／’？ 、、ｔｆｉ （ｎＷｙｎＪＬ）第
３図 ｈｉ ＣＨｆ’ｌ ｇ）Ｘ （ｒｒＬｆ／ｗｄｌυ
第 ４ 図 ｔ５” ｔ６Ｊｔｔｙｑｌｔ５’ ｔ６’ ｔ６
７ｔｔｓ”ヒト−にｘ、ｑ Ｘメ’ｒ−（ｒｒｖ／ｒ
ｎｉｌ ）第 ５ 図 ｂト−ｃｈｓ ＃ｌ （ｙｎ７１ｎＪｌ）第 ６
図 ρＦＰＬ−０７Ｆ賞榊イジＩ／尊 第 ７ 図 コＬスケロール盲介雫（ジし３） 第 ８ 図 ｏ、ｏｌ ｔ、ＯｔＤ ｔｏ。
Claims (8)
- （１）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れたヒト−ＣＥＡあるいは抗ヒト−ＣＥＡ抗体の少なく
とも一部あるいは抗ヒト−ＣＥＡ抗体に対する抗体の少
なくとも一部と、前記リポソーム内に封入された親水性
の標識物質とからなり、前記リポソームを構成するリン
脂質及び糖脂質のうち、前記架橋法において用いた架橋
剤と反応したリン脂質及び糖脂質の構成比が０．０１〜
２０モル％でありかつ 脂質換算で０．５ｍＭのリポソームに対して固定化され
る前記ヒト−ＣＥＡあるいは抗ヒト−ＣＥＡ抗体の少な
くとも一部あるいは抗ヒト−ＣＥＡ抗体に対する抗体の
少なくとも一部の濃度が０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌであ
ることを特徴とするヒト−ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）分
析用試薬。 - （２）架橋法において使用される架橋剤が、Ｎ−サクシ
ンイミゾル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
、Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル
）ブチレート、Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｐ−マレイ
ミドフェニル）アセテート、Ｎ−サクシンイミジル４−
（Ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート、Ｎ−（γ
−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、Ｎ−（
ε−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド及び
ジサクシンイミジルスベレートより選ばれることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載のヒト−ガン胎児性抗
原（ＣＥＡ）分析試薬。 - （３）リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質に対し
て５〜２００モル％のコレステロールがリポソームに含
有されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載のヒト−ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）分析試薬。 - （４）標識物質が螢光化合物、発光性化合物、吸光性化
合物、糖類、イオン性化合物、酸素、補酵素またはラジ
カル化合物の中より選ばれることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載のヒト−ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）分
析用試薬。 - （５）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れたヒト−ＣＥＡと、前記リポソーム内に封入された親
水性の標識物質とからなり、前記リポソームを構成する
リン脂質及び糖脂質のうち、前記架橋法において用いた
架橋剤と反応したリン脂質及び糖脂質の構成比が０．０
１〜２０モル％でありかつ 脂質換算で０．５ｍＭのリポソームに対して固定化され
る前記ヒト−ＣＥＡの濃度が０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ
である分析用試薬及び補体を用いて、インヒビッション
アッセイあるいは競合法により分析することを特徴とす
るヒト−ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）分析方法。 - （６）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れた抗ヒト−ＣＥＡ抗体と、前記リポソーム内に封入さ
れた親水性の標識物質とからなり、前記リポソームを構
成するリン脂質及び糖脂質のうち、前記架橋法において
用いた架橋剤と反応したリン脂質及び糖脂質の構成比が
０．０１〜２０モル％であり、かつ 脂質換算で０．５ｍＭのリポソームに対して固定化され
る前記抗ヒト−ＣＥＡ抗体の濃度が０．０１〜１０ｍｇ
／ｍｌである分析用試薬及び補体を用いて、ヒト−ＣＥ
Ａを分析することを特徴とするヒト−ガン胎児性抗原（
ＣＥＡ）分析方法。 - （７）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れた抗ヒト−ＣＥＡ抗体あるいは前記抗ヒト−ＣＥＡ抗
体の一部と、前記リポソーム内に封入された親水性の標
識物質とからなり、 前記リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質のうち、
前記架橋法において用いた架橋剤と反応したリン脂質及
び糖脂質の構成比が０．０１〜２０モル％であり、かつ 脂質換算で０．５ｍＭのリポソームに対して固定化され
る前記抗ヒト−ＣＥＡ抗体あるいは抗ヒト−ＣＥＡ抗体
の一部の濃度が０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌである分析用
試薬及び補体を用いてサンドイッチアッセイによりヒト
−ＣＥＡを分析することを特徴とするヒト−ガン胎児性
抗原（ＣＥＡ）分析方法。 - （８）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方よりなるリ
ポソームと、架橋法により前記リポソーム上に固定化さ
れるヒト−ＣＥＡの免疫動物の抗体に対する異種動物の
抗体あるいはヒト−ＣＥＡの免疫動物の抗体に対する異
種動物の抗体の一部と、前記リポソーム内に封入された
親水性の標識物質とからなり、前記リポソームを構成す
るリン脂質及び糖脂質のうち、前記架橋法において用い
た架橋剤と反応したリン脂質及び糖脂質の構成比が０．
０１〜２０モル％であり、かつ 脂質換算で０．５ｍＭのリポソームに対して固定化され
る前記異種動物の抗体あるいは前記異種動物の抗体の一
部の濃度が０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌである分析用試薬
及び補体を用いてダブル抗体法によりヒト−ＣＥＡを分
析することを特徴とするヒト−ガン胎児性抗原（ＣＥＡ
）分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25561584A JPS61133864A (ja) | 1984-12-05 | 1984-12-05 | ヒト−ガン胎児性抗原（ｃｅａ）分析用試薬および分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25561584A JPS61133864A (ja) | 1984-12-05 | 1984-12-05 | ヒト−ガン胎児性抗原（ｃｅａ）分析用試薬および分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61133864A true JPS61133864A (ja) | 1986-06-21 |
Family
ID=17281202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25561584A Pending JPS61133864A (ja) | 1984-12-05 | 1984-12-05 | ヒト−ガン胎児性抗原（ｃｅａ）分析用試薬および分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61133864A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0242360A (ja) * | 1988-08-02 | 1990-02-13 | Nitsusui Seiyaku Kk | Ａｔｌ抗体測定試薬 |
-
1984
- 1984-12-05 JP JP25561584A patent/JPS61133864A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0242360A (ja) * | 1988-08-02 | 1990-02-13 | Nitsusui Seiyaku Kk | Ａｔｌ抗体測定試薬 |
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