JP3654732B2

JP3654732B2 - 免疫測定法

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Publication number: JP3654732B2
Application number: JP03022797A
Authority: JP
Inventors: 美枝松本; 広志黒田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1997-02-14
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2017-02-14
Also published as: JPH10227795A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中の測定対象物質の量を測定するための免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、癌マーカーを中心に微量物質の測定が重要になってきている。このような微量物質の測定は、高い特異性、感度等が必要であり、抗原抗体反応を利用した方法が最も適しており、特に標識物質を用いた方法が感度面で優れているため、広く用いられている。上記標識物質としては、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質等があるが、ラジオアイソトープは放射能処理、特殊な施設等が必要であり、酵素を用いるエンザイム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）法や蛍光物質を用いるフルオレッセンス・イムノアッセイ（ＦＩＡ）法が主流になりつつある。
【０００３】
また、ＥＩＡ法やＦＩＡ法には、操作上、抗原抗体反応した標識物質と未反応の標識物質の分離（Ｂ／Ｆ分離）が必要な不均一法（ヘテロジニアス法）と、Ｂ／Ｆ分離を必要としない均一法（ホモジーニアス法）とがあり、ヘテロジーニアス法は感度面では優れているが、操作が煩雑である。
【０００４】
一方、ホモジーニアス法は操作が簡便で、迅速化が可能であり、エンザイム・マルチプライド・イムノアッセイ・テクニック（ＥＭＩＴ）法やアソシエイテッド・エンザイム・センシティブ・テクニック（ＡＥＳＴ）法等が実用化されているが、ＥＭＩＴ法は高分子量物質の測定が困難であり、ＡＥＳＴ法は安定性に問題がある。
【０００５】
また、ホモジーニアス系にリポソームを用いた方法として、抗原感作リポソームを用いた方法が報告されているが、この方法は抗原をリポソームに感作するので不安定な抗原には適用できない等の問題がある。
【０００６】
また、抗体感作リポソームを用いた方法としては、特開昭56-132564 号公報、特開昭61-250558 号公報、特開昭61-269070 号公報などに報告されている。
【０００７】
しかしながら、特開昭56-132564 号公報のものでは、酵素を封入物質としているので、リポソーム表面に酵素が吸着したり、酵素がリポソームの組成の一部になり、活性基がリポソーム表面に現れる等のためにリポソームが破壊しなくてもある程度の酵素活性を示し、測定系に応用したときにブランク値が高くなる（このようなリポソームへの結合などを非特異吸着と称する）等の問題がある。
【０００８】
上記特開昭61-250558 号公報のものは、リポソーム上に被検物質に対する抗体の少なくとも一部が固定化され、さらに前記リポソーム内部には親水性の標識物質（蛍光性化合物、発光性化合物、吸光性化合物、糖類、イオン性化合物、酵素、補酵素、ラジカル化合物など）が封入されているリポソーム免疫分析用試薬を、前記被検物質を含有する試料にあらかじめ接触し反応させ、その後に被検物質に対する第２抗体及び補体を作用させることを特徴とする免疫分析方法であり、最初に抗体感作リポソームと被検物質を反応させることにより感度の高い測定を行っている。
【０００９】
また、上記特開昭61-269070 号公報のものは、マーカー（蛍光物質など）を封入したリポソームに抗体を結合させ、この抗体感作リポソーム及びフリーの抗体（抗原に対する抗体液そのままのもの又は希釈液）を検体とともに共存させて、検体中の抗原をリポソームに結合している抗体とフリーの抗体とでサンドイッチ型の抗原抗体複合体となし、この複合体の形成されたリポソームを補体により特異的に破壊してリポソームから流出するマーカーを測定し、この測定値を別途作成された標準検量線に照合させることを特徴とする、抗原の定量法であり、抗原をサンドイッチ型にすることで補体作用を促進し、高い感度を得ている。
【００１０】
しかし、特開昭61-250558 号公報、特開昭61-269070 号公報に開示された方法は蛍光測定が主であり、汎用の分光光度計が使用できず一般的な比色法に応用することはできないので、汎用性、簡便性にやや欠ける。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題点を解決するものであり、その目的は、リポソームを用いた免疫測定法において、検出に比色法を適用できるために、汎用性が高く、簡便であり、かつ、感度が十分高い免疫測定法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、リポソームを用いた免疫測定法において、検出に比色法が適用でき、かつ、感度が十分高く検体中の測定対象物質を測定できる方法として、封入物質として不溶性担体（特にラテックス）を用い、反応系中に遊離された不溶性担体の濁度（吸光度）を比色法で検出する系が望ましいと考え、鋭意研究した。その結果、特に、表面が親水性を示すラテックス粒子を封入物質とすることにより、比色法により検体中の測定対象物質を測定できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明はリポソーム内に不溶性担体（特にラテックス）を内包した抗体又は抗原感作リポソームを用いる検体中の測定対象物質の定量方法を提供するものである。
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本発明の請求項１記載の免疫測定法は、検体中の測定対象物質に対する抗原又は抗体、或いは該測定対象物質が結合され、抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質が内包されたリポソームと、検体とを共存させて、抗原抗体反応によりリポソームから遊離されるマーカー物質を検出し、測定対象物質の量を測定する免疫測定法であって、上記マーカー物質が不溶性担体であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の請求項２記載の免疫測定法は、不溶性担体がラテックス粒子である請求項１記載の免疫測定法である。
【００１６】
本発明の請求項３記載の免疫測定法は、ラテックス粒子が親水性の表面をもつラテックス粒子である請求項２記載の免疫測定法である。
【００１７】
本発明の免疫測定試薬は、請求項１記載のリポソームの膜溶解によってリポソームから遊離された不溶性担体を検出することによる、検体中の測定対象物質の量を測定するための免疫測定試薬である。
【００１８】
まず、本発明の免疫測定法について説明する。
【００１９】
本発明に於いて使用されるリポソームの主たる膜構成成分としては、通常のリポソーム調製において膜構成成分として用いられるものがすべて挙げられ、特に限定されない。例えば、リン脂質を含むヒツジ赤血球のクロロホルム抽出画分（Biochemistry,8,p4149,(1969) 等）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、卵黄ホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン等のリン脂質；ガングリオシド糖脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質等の糖脂質；コレステロール類；天然レシチン（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）；これらの一種又は二種以上の混合系等、通常知られている組成のものは全て使用できる。
【００２０】
また、リポソーム内に内包されるマーカー物質は、比色法でその濃度を測定できる不溶性担体であれば特に限定されないが、粒径の比較的小さい微粒子が好ましく、例えば、ラテックス粒子、酸化チタン粒子、磁性体粒子などが挙げられ、入手の容易さ、使用し易さ、安定性などの点から、ラテックス粒子が特に好ましい。
【００２１】
上記ラテックス粒子としては、粒径が比較的一定であり、一定の品質、性能のものが工業的に大量生産され得る粒子が好ましい。例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステルなどのビニル系モノマーの単一重合体及び／又は共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体などのブタジエン系共重合体などの微粒子が挙げられる。通常、このようなラテックス表面は疎水性に富むため、このままではリポソームの材料であるリン脂質をその表面に吸着したり、又は粒子同士で自己凝集してしまう可能性が高くなる。そのため、親水性の表面をもつラテックス粒子が好ましい。親水性の表面をもつラテックス粒子を得るには、例えば、ウシ血清アルブミンなどの免疫学的に不活性なタンパク質でラテックス粒子表面を被覆し、親水性を付与する方法、又はラテックスを重合する際に、アクリルアミドなど親水性に富むモノマーを用い、親水性官能基を有するラテックスを得る方法などが挙げられる。
【００２２】
上記ラテックス粒子の粒径は、リポソームに内包され得る大きさであれば特に制限されないが、０．０１〜１μｍが好ましく、０．０５〜０．２μｍが特に好ましい。該粒径が０．０１μｍ未満であると、測定時に大きな濁度変化量を得るためには、大量のラテックスが必要となり、１μｍを超えると、リポソームに内包できる個数が激減し、やはり大きな濁度変化量を得ることが困難になる。リポソームに内包されるラテックスの最適濃度は、測定対象物質を測定する際に必要とされる感度によって適宜選択される。
【００２３】
本発明において、リポソームの調製方法としては、従来公知のリポソーム調製法を利用することができる。例えば、「ライフサイエンスにおけるリポソーム実験マニュアル」（寺田弘、吉村哲郎編著、p60-89、シュプリンガー・フェアラーク東京（株）、（1992年））に示されたVortex法、界面活性剤除去法、フレンチプレス法、超音波処理法のほか、逆相蒸発法（REV 法）、エタノール注入法、エーテル注入法、プレ−ベジクル（Pre-Vesicle ）法、Ca²⁺融合法、アニーリング（Annealing 法）、凍結融解融合法、凍結乾燥法、W/O/W エマルジョン法等の方法や、S.M.Grunerら（Biochemistry, 24 ,p2833 ,(1985))により報告されたStable Plurilamellar Vesicle法（SPLV法）等の方法が挙げられる。また、必要に応じてリポソームを濾過して粒径を整える操作を行っても良い。
【００２４】
また、ラテックス粒子などの不溶性担体をリポソームに内包させる方法としては、従来公知のリポソーム調製法を応用することができる。例えば、有機溶媒に溶解したリン脂質を容器に入れ減圧下にエバポレーター又は窒素ガスの吹き付けにより溶媒を除去して薄い脂質膜を形成させ、次に予め封入したいラテックスを懸濁させた適当な水溶液や緩衝液を加え振盪する方法や、ボルテックスミキサーで振盪撹拌する方法や、前述の方法で得たリポソームをラテックス懸濁液とともに超音波発振装置で超音波処理する方法、有機溶媒に溶解したリン脂質を急激にラテックス懸濁液を含む塩類溶液と混和する方法、などの種々の方法が挙げられる。
【００２５】
本発明に使用されるリポソームの粒径は、１００〜５０００ｎｍが好ましく、２００〜３０００ｎｍがより好ましく、５００〜１０００ｎｍが特に好ましい。この範囲においては、保存中に沈殿し難いので試薬としての安定性に優れ、しかも分光光度計等による濁度（吸光度）の測定の点からも好ましい。
【００２６】
リポソームへ抗原又は抗体を結合（感作）させる方法としては、フランシス・ジェイ・マーチンら〔Biochemistry,20,p4229,(1981)、J. Biol. Chem., 257 ,p286 ,(1982) 等〕に報告されている架橋法を用いて結合させることができる。架橋剤は、上記文献の前者のものではＮ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（SPDP）のようなジチオピリジル基を、上記文献の後者のものではＮ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（SMPB）のようなマレイミド基を用いてリポソームにタンパク等を結合させているが、他に、Ｎ−（γ- マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド（GMBS）、Ｎ−（δ−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（EMCS）等を架橋剤として用いることもできる。
【００２７】
リポソームに結合（感作）させる抗原又は抗体は測定対象物質（検体中の被検抗体又は抗原）に応じて適宜選択される。例えば、α−フェトプロテイン（AFP ）、癌胎児性抗原（CEA ）、β2-ミクログロブリン、カルボハイドレート・アンチゲン19-9（CA19-9）等の各種癌抗原に対する抗体；HBsAg 、HBcAg 、HTLV-I、HTLV-III等のウィルス関連の抗原又はこれらに対する抗体；更には血中のホルモンやIgG 等の血漿タンパクが挙げられる。
【００２８】
上記抗体は、動物への免疫法や、モノクローナル抗体作製の通常技術によって製造される。また、抗体はそのまま結合させてもよく、また抗原認識部位を含む断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂）であってもよい。後述のフリーの抗体により抗原抗体複合体を形成するに当たっては、リポソームに共有結合させる抗体源として山羊のＩｇＧフラクション、山羊のＦａｂ’又は家兎のＦａｂ’を、またフリーの抗体源として家兎のＩｇＧフラクションを用いることができる。リポソームに共有結合させる抗体とフリーの抗体とが共にモノクローナル抗体であることもでき、又モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を組み合わせて用いることができる。リポソームに共有結合させる抗体源としてマウスモノクローナル抗体を用い、一方フリーの抗体源としてマウスモノクローナル抗体又は家兎ポリクローナル抗体を用いるのが有利である。リポソームに共有結合させるモノクローナル抗体とフリーのモノクローナル抗体とは、それぞれ異なる抗原決定部位を認識して結合する、互いに異なるモノクローナル抗体であるのが特に好ましい。
【００２９】
本発明において、検体中の測定対象物質に対する抗原又は抗体、或いは該測定対象物質が結合され、定量可能なマーカー物質が内包されたリポソームと、検体とを共存させて、抗原抗体反応によりリポソームからマーカー物質を遊離させるには、上記抗原抗体反応させた後、該反応系に補体を存在させることにより、リポソーム膜を溶解することにより行われる。上記補体としては、特に限定されず、例えばモルモット補体、ウサギ補体、マウス補体、ヒト補体が好適に使用される。
【００３０】
本発明の免疫測定法について、検体中の測定対象物質として抗原を定量する場合の一例について、手順に従って説明する。まず、上記のようにして得られた、不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソームと、検体を適当な緩衝剤中で混合し、抗原抗体反応を起こさせ、次いで、フリーの抗体（フリーの抗体とは、測定対象物質である抗原に対する抗体であり、かつ補体結合部位を有した抗体）及び補体を加え、検体中の抗原を感作リポソーム上の抗体とフリーの抗体とでサンドイッチして抗原抗体複合体を形成させ、この抗原抗体複合体が形成されたリポソームを補体により特異的に溶解させ、リポソームに内包されていた不溶性担体（ラテックス粒子）をリポソーム内から遊離させる。この遊離不溶性担体（ラテックス粒子）の量は、検体中の抗原の量を反映するので、この遊離不溶性担体（ラテックス粒子）の量を、例えば、光の透過光の減少（濁度の増加、吸光度の増加）として分光光度計又は自動分析装置（日立７０５、７０５０、７１５０、７３６、７０７０等）により測定し、例えば、予め作成した検量線との照合により、検体中の抗原の量を測定する。
【００３１】
上記反応において使用される、不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソーム液のリン脂質濃度は０．０１〜２．０ｍｇ／ｄｌが好ましく、０．１〜０．７ｍｇ／ｄｌがより好ましい。検体と不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソーム液との比率は、適宜選択できるが、通常、検体１〜２０μｌに対し、不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソーム液１〜２００μｌが好ましく、５〜１００μｌがより好ましい。
【００３２】
不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソーム液と検体を反応させた後、反応系に存在させる補体としては、通常、補体を含む動物血清を１〜４００００倍、好ましくは２０〜１００００倍に緩衝液で希釈したものが用いられる。使用量は、検体と不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソーム液との前記比率の反応液に対して、補体として、例えば、０．２〜２ＣＨ₅₀のモルモット血清を含む緩衝液であれば、１０〜３００μｌが好ましく、１００〜２００μｌがより好ましい。
【００３３】
上記反応において用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）緩衝液、グッド緩衝液、ベロナール緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、通常用いられる緩衝剤であればいずれも使用可能である。本発明の免疫測定法において用いられる免疫測定試薬に、必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ゼラチン等の蛋白質、糖、キレート、還元剤、防腐剤等の、通常この分野において使用される添加剤等を添加してもよい。
【００３４】
上記反応の温度は、いずれも１０〜４５℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましい。上記反応のｐＨは５〜９が好ましく、中性付近がより好ましい。
【００３５】
検体中の抗原測定の別の方法としては、検体に、不溶性担体（ラテックス粒子）内包測定対象物質（抗原）感作リポソーム及び該測定対象物質（抗原）に対する一定量の抗体を加え、検体中の測定対象物質（抗原）とリポソームに感作された測定対象物質（抗原）とを前記抗体に競合反応させた後、抗原抗体結合リポソームを形成させた後、補体を加え、補体によりリポソームを特異的に溶解させ、遊離した不溶性担体（ラテックス粒子）の量を、光の透過光の減少（濁度の増加、吸光度の増加）として測定し、予め作成した検量線との照合により、検体中の測定対象物質（抗原）の量を測定する、方法でもよい。すなわち、この方法は、検体中の測定対象物質として抗原が結合されたリポソームと、検体とを共存させて、抗原抗体反応によりリポソームから遊離されるマーカー物質を検出し、測定対象物質の量を測定する免疫測定法に相当する。
【００３６】
また、本発明の免疫測定法について、検体中の測定対象物質として抗体を定量する場合の一例について、手順に従って説明する。まず、上記のようにして得られた、不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗原感作リポソームと、検体を適当な緩衝剤中で混合し、抗原抗体反応を起こさせてリポソーム上に抗原抗体複合体を生成させ、次いで、補体を加え、この抗原抗体複合体が形成されたリポソームを補体により特異的に溶解させ、リポソームに内包されていた不溶性担体（ラテックス粒子）をリポソーム内から遊離させる。この遊離不溶性担体（ラテックス粒子）の量は、検体中の抗体の量を反映するので、この遊離不溶性担体（ラテックス粒子）の量を、例えば、光の透過光の減少（濁度の増加、吸光度の増加）として分光光度計又は自動分析装置（日立７０５、７０５０、７１５０、７３６、７０７０等）により測定し、例えば、予め作成した検量線との照合により、検体中の抗体の量を測定する。
【００３７】
本発明の免疫測定試薬は、請求項１記載のリポソームの膜溶解によってリポソームから遊離された不溶性担体を検出することによる、検体中の測定対象物質（抗原又は抗体）の量を測定するための免疫測定試薬であり、その詳細は、上記の免疫測定法の説明の中で用いられた試薬と同様である。
【００３８】
すなわち、本発明の免疫測定試薬の具体例としては、（１）検体中の測定対象物質に対する抗体が結合され、検体中の測定対象物質である抗原との抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソームからなる試薬；
（２）▲１▼検体中の測定対象物質に対する抗体が結合され、検体中の測定対象物質である抗原との抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソームと、▲２▼前記のフリーの抗体および補体が混合されたものとからなる試薬；
（３）▲１▼検体中の測定対象物質に対する抗体が結合され、検体中の測定対象物質である抗原との抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソームと、▲２▼上記のフリーの抗体と、▲３▼補体とからなる試薬；
【００３９】
（４）検体中の測定対象物質が結合され、該測定対象物質に対する抗体との抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソームからなる試薬；
（５）▲１▼検体中の測定対象物質が結合され、該測定対象物質に対する抗体との抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソームと、▲２▼上記測定対象物質に対する抗体および補体が混合されたものとからなる試薬；
（６）▲１▼検体中の測定対象物質が結合され、該測定対象物質に対する抗体との抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソームと、▲２▼上記測定対象物質に対する抗体と、▲３▼補体とからなる試薬；
【００４０】
（７）検体中の測定対象物質に対する抗原が結合され、検体中の測定対象物質である抗体との抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソームからなる試薬；
（８）▲１▼検体中の測定対象物質に対する抗原が結合され、検体中の測定対象物質である抗体との抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソームと、▲２▼補体とからなる試薬；などが挙げられる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
次の実施例は、本発明によるＡＦＰ抗原検出用の免疫測定試薬及びその免疫測定法について説明するものである。実施例においては、次に挙げる試薬及び測定用検体を使用した。なお、後述の比較例においても特に指示のない限り、同名の試薬については同じものを使用した。
【００４２】
〔材料〕
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルフォスファチジルコリン
Ｃｈｏｌ：コレステロール
ＤＴＰ−ＤＰＰＥ：ジチオピリジル化ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン
ＴＥＳ：ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、塩化ナトリウムを精製水に溶解し、ＴＥＳ、塩化ナトリウムの終濃度がそれぞれ１０ｍＭ、１５０ｍＭとなるように溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調製したもの。
酢酸緩衝液：酢酸、塩化ナトリウムを精製水に溶解し、酢酸、塩化ナトリウムの終濃度がそれぞれ１０ｍＭ、１５０ｍＭとなるように溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨを４．５に調製したもの。
ＳＰＤＰ：Ｎ−ハイドロオキシスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
マウスモノクローナル抗ＡＦＰ抗体：１０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有ｐＨ７．５）に溶解したもの。
【００４３】
（１）ラテックス粒子内包リポソームの調製
ＤＰＰＣ５０μｍｏｌ、Ｃｈｏｌ５０μｍｏｌ、ＤＴＰ−ＤＰＰＥ２．５μｍｏｌのクロロホルム溶液を１００ｍｌ容ナス型フラスコに分注し、加温しながらエバポレーションしてクロロホルムを留去した。このとき脂質及びコレステロールはフラスコ内壁に薄膜を形成した。更に１時間以上減圧下にフラスコを置き、溶媒を完全に除去した。
【００４４】
その後、２ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）感作ラテックス懸濁液（固形分５重量％）、２ｇのガラスビーズを加え激しく撹拌して薄膜を剥がしとった。なお、ＢＳＡ感作ラテックスは以下のようにして調製した。すなわち平均粒径０．０８７μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％）１ｍｌに、ＢＳＡ１％（Ｗ／Ｖ）を含むＰＢＳ（等張リン酸緩衝液、ｐＨ６．５）２ｍｌを添加し、２５℃で１時間マグネチックスターラーで素早く撹拌を行った。遠心洗浄などにより、ラテックスに未吸着のＢＳＡを除去した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液にてラテックス濃度を５重量％に再調整した。超音波処理などによりラテックス懸濁液を分散処理したものを、ＢＳＡ感作ラテックス懸濁液として用いた。
【００４５】
ガラスビーズを除去した後、脂質懸濁液をエクストルーダーを用いて０．４μｍまでサイジングして粒径の均一なリポソーム（ラテックス粒子内包）を調製した。リポソームに封入されなかったラテックス粒子はゲル濾過などによって除去した。こうして得られたラテックス粒子内包リポソームの濃度をリン定量によって決定した。
【００４６】
（２）抗体への反応基の導入
マウスモノクローナル抗ＡＦＰ抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌに３０ｍＭＳＰＤＰ（エタノール溶解）３０μｌを加え、室温で３０分間反応させた。その後酢酸緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５でゲル濾過し、緩衝液の交換とともに未反応のＳＰＤＰを除去した。得られた抗体溶液にＤＴＴを終濃度１０ｍＭとなるように添加し室温で３０分間反応させた。その後、ＴＥＳで平衡化したセファデックスＧ−２５でゲル濾過し、緩衝液の交換とともにＤＴＴを除去した。得られた抗体溶液は、分光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し濃度を決定した。
【００４７】
（３）抗体結合リポソームの調製
（１）項で調製したラテックス粒子内包リポソーム（リン濃度１０ｍＭ）１ｍｌと、（２）項で調製した抗体溶液（濃度３ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを混合し、４℃で２日間反応させた。その後、ＴＥＳで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂでゲル濾過を行い、未反応の抗体を除去し、リポソーム分画を分取した。得られた抗体が共有結合したリポソーム（ラテックス粒子内包）についてリン定量を行い濃度を決定した後、リン濃度１０ｍＭになるようにＴＥＳで調製した。また、粒度分布測定機により粒径が０．３８〜０．４０μｍの範囲に分布することを確認した。
【００４８】
（４）ＡＦＰ抗原の測定
（３）項で調製した抗体が共有結合したリポソーム（ラテックス粒子内包）を、ＴＥＳでリン酸濃度１ｍＭとなるように希釈してリポソーム免疫測定試薬とした。測定機として日立７１５０型自動分析装置（日立製作所社製）を用いて、ＡＦＰ精製抗原を含む検体１０μｌ（濃度１０、２５、５０、２５０、５００、１０００又は１５００ｎｇ／ｍｌ）、リポソーム免疫測定試薬（Ｒ₁）１００μｌ、モルモット補体０．５ＣＨ₅₀及び抗ＡＦＰ抗体（家兎免疫血清ＩｇＧフラクション、７ｍｇ／ｍｌ）を含む酢酸緩衝液２００μｌ（Ｒ₂）を用い、測定主波長３４０ｎｍ、測定ポイント２８−５０の条件下でＡＦＰ抗原を測定した。その結果を表１及び図１に示した。図１において、縦軸は測定波長３４０ｎｍにおける吸光度変化量を１００００倍した値を示す。また横軸はＡＦＰ精製抗原の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。また、表１における吸光度変化量も測定波長３４０ｎｍにおける吸光度変化量を１００００倍した値を示した。
【００４９】
なお、上記測定の詳細な条件は以下の通りとした。ＡＦＰ精製抗原を含む検体１０μｌに、リポソーム免疫測定試薬（Ｒ₁）１００μｌを加え、３７℃で約８分インキュベートした。その後、モルモット補体及び抗ＡＦＰ抗体を含む酢酸緩衝液（Ｒ₂）２００μｌを添加し、Ｒ₂添加後２０秒後と６００秒後の吸光度の差を求めた。なお、この測定における日立７１５０型自動分析装置の設定条件を以下に示す。
【００５０】
検体量：血清１０μｌ
リポソーム免疫測定試薬（Ｒ₁）：１００μｌ
酢酸緩衝液（Ｒ₂）２００μｌ
反応温度：３７℃
測光ポイント：（２８）−（５０）
測定波長：３４０ｎｍ
【００５１】
【表１】

【００５２】
（比較例１）
実施例１の（１）項において、溶媒を除去したフラスコ内に、ラテックス懸濁液を添加するかわりに、以下の操作を行った。すなわち、残った脂質薄膜に標識物質溶液として自己消光性の蛍光物質である０．２Ｍカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）１５ｍｌを加え、激しく撹拌した。これを超音波破砕機などで十分分散処理することによって均一化し、蛍光物質内包リポソームを調製した。ついでリポソームに封入されなかったＣＦを除去するためにＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５にて分離した。次いで、ラテックス粒子内包リポソームの代わりに、蛍光物質内包リポソームを用いた他は、実施例１の（２）及び（３）項と同様にして、ＡＦＰ抗体が共有結合したリポソーム（蛍光物質内包）を得た。
【００５３】
得られた抗体結合リポソーム（蛍光物質内包）を、その初期蛍光強度が適当なものになるように、０．５ｍＭＭｇＣｌ₂及び０．１５ｍＭＣａＣｌ₂を含み、かつモルモット補体０．５ＣＨ₅₀及び抗ＡＦＰ抗体（家兎免疫血清ＩｇＧフラクション、７ｍｇ／ｍｌ）を含むゼラチン−ベロナール緩衝液（以下ＧＶＢ）で１００倍程度希釈したもの３ｍｌに、検体として０．５ｍｌの段階希釈したＡＦＰ精製抗原（濃度１０、２５、５０、２５０、５００、１０００又は１５００ｎｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で６０分間放置して反応させた後、各試料の蛍光強度を分光蛍光光度計（島津製作所社製、ＲＦ−５４０）で測定した（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５１８ｎｍ）。なお、測定値は、ＡＦＰ精製抗原液の代わりにｎ−プロピルアルコールを添加したものの蛍光強度と、ＡＦＰ精製抗原液の代わりにＧＶＢを添加したものの蛍光強度との差を１００％としたときの各検体の蛍光強度を相対的に換算し標識物質遊離率（％）とした。結果を表２及び図２に示した。図２において、縦軸は標識物質の遊離率（％）を、横軸はＡＦＰ精製抗原の濃度を示す。
【００５４】
【表２】

【００５５】
表１及び図１からわかるように、本発明では低濃度から高濃度まで、広い測定レンジが得られることがわかる。また比較例に示すような従来タイプのリポソーム試薬では、（１）蛍光光度計など、汎用の分光光度計に比べて特別な測定装置を必要とする、（２）検量線を作成するための変化量が、遊離率（％）として表されるため、吸光度に比べてレンジが狭く、（吸光度０〜３５０００、遊離率０〜１００％）測定値の信頼性に劣る、などの欠点がある。これらは表２及び図２から明らかである。
【００５６】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載の免疫測定法の構成は、上記の通りであり、本発明の免疫測定法は、抗原又は抗体感作リポソーム内に不溶性担体を包含し、検体中の抗原又は抗体の量に応じて補体作用により遊離する不溶性担体量を測定するので、測定対象物質としての抗原又は抗体を高感度に、またレンジを広く測定できる。また、蛍光物質などを封入した場合と比較して、汎用の分光光度計が使用でき、操作が簡便で測定時間も短い。
【００５７】
本発明の請求項２記載の免疫測定法の構成は、上記の通りであり、不溶性担体として入手が容易であり、使用し易く、安定性に優れるラテックス粒子を用いるので、上記請求項１の効果の全てを奏すると共に、更に、測定対象物質としての抗原又は抗体を、より簡便に、より高感度に測定できる。
【００５８】
本発明の請求項３記載の免疫測定法の構成は、上記の通りであり、不溶性担体として親水処理された表面をもつラテックス粒子を用いるので、リポソームの材料であるリン脂質をその表面に吸着することなく、また、粒子同士で自己凝集してしまう可能性も低くなり、そのため、上記請求項１の効果の全てを奏すると共に、更に、測定対象物質としての抗原又は抗体を、より正確に、より高感度に測定できる。
【００５９】
本発明の免疫測定試薬の構成は、上記の通りであり、請求項１記載のリポソームの膜溶解によってリポソームから遊離された不溶性担体を検出することにより検体中の測定対象物質としての抗原又は抗体を定量するので、本発明の免疫測定試薬は、検出に比色法を適用できるために、汎用性が高く、簡便であり、かつ、感度が十分高い。
【００６０】
これらの効果のため、本発明の免疫測定法は、ＡＦＰ、ＣＲＰ、ＣＥＡ等の癌マーカー、ＩｇＥ、ＩｇＧ等の免疫グロブリン、インスリン、Ｔ３等のホルモン、ウィルス、薬物等の測定に広範囲に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】抗体感作リポソーム（ラテックス粒子内包）を用いたＡＦＰの定量における吸光度変化量とＡＦＰ濃度の関係をプロットしたグラフである。
【図２】抗体感作リポソーム（蛍光物質内包）を用いたＡＦＰの定量における標識物質の遊離率（％）とＡＦＰ濃度の関係をプロットしたグラフである。

Claims

検体中の測定対象物質に対する抗原又は抗体、或いは該測定対象物質が結合され、抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質が内包されたリポソームと、検体とを共存させて、抗原抗体反応によりリポソームから遊離されるマーカー物質を検出し、測定対象物質の量を測定する免疫測定法であって、上記マーカー物質が不溶性担体であることを特徴とする免疫測定法。
不溶性担体がラテックス粒子である請求項１記載の免疫測定法。
ラテックス粒子が親水性の表面をもつラテックス粒子である請求項２記載の免疫測定法。