JPH0224563A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、試料中に存在する特定の抗原または抗体を定
量分析するための免疫則定法の改良に関する。

（従来の技術・発明が解決しようとする課題〕試料中に
存在する特定の抗原または抗体の定量分析法としては、
たとえばラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、エンザ
イムイムノアッセイ法（ＥＩＡ法）等がある。

ｔＡ法は定量的ではあるが、放射性同位元素を用いるの
で使用場所が制限され、また設備が大損りとなる。ＥＩ
Ａ法は操作が煩雑である。また、上記いずれの測定法と
も分析に数時間から数十時間を要するという問題点があ
る。

これに対してマイクロカプセルを用い、補体による溶解
作用を利用した免疫測定法は、簡便にしかも短時間（２
０分間〜２時間）の内に定量出来るという利点を存する
。具体的にはマイクロカプセルとして内部に定量可能な
マーカー物質を封入し、表面に抗体または抗原を結合し
かつ、補体活性により溶解作用を受けるものを用い、抗
原または抗体濃度の定量を行なう、まず、上記マイクロ
カプセルに検体であるヒト血清または血漿を接触させる
。仮にマイクロカプセルに結合した抗体または抗原に対
応する抗原または抗体が検体中に含まれている場合、特
異的に抗原抗体反応が起こり、更に二次抗体を反応させ
ると結合した抗原または抗体に対し二次抗体が結合する
。この二次抗体の結合したマイクロカプセルは補体活性
による溶解作用を受けて、そこに包含されているマーカ
ー物質が溶出される。この溶出されたマーカー物質を定
量し、検体中の抗原または抗体の定量が行われる。尚、
検体中にマイクロカプセルに結合した抗体または抗原に
対する抗原または抗体が含まれていない場合には二次抗
体は結合しないので、補体活性によるマイクロカプセル
の溶解は生起せず、マーカー物質の？客用も起こらない
。

しかしながらこの測定法では各々の抗原または抗体に対
応してそれぞれ異なった二次抗体が必要であり、測定項
目に応じた二次抗体を各々用意しなければならないため
操作が煩雑であった。また、二次抗体がポリクローナル
抗体である場合、ロフトにより抗体価、抗体分子の分布
にばらつきがあり一定品質の保持が困難であった。更に
抗原によってはウサギ、ヤギ、モルモットなど動物種を
変えてもポリクローナル抗体の調製が困難なものもあっ
た。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記の実情に濫み種々研究を重ねた結果、
二次抗体に対する抗体（三次抗体）を併用すると上記問
題点を解決できることを見いだしさらに研究を重ねて本
発明を完成するに至った。

即ち、本発明は次の通りである。

（１）同一抗原または抗体を認識する２種類の抗体また
は抗原の内の一方の抗体（一次抗体）または抗原を結合
させたマイクロカプセルに検体中の抗原または抗体を反
応させ、次に他方の抗体（二次抗体）の添加時あるいは
添加後、更に抗体（三次抗体）および補体を添加して該
マイクロカプセルを破壊し、該マイクロカプセル内に包
含されているマーカー物質を溶出せしめ、該物質を測定
することを特徴とする免疫測定法に関する。

（２）同一抗原または抗体を認識する一次抗体および二
次抗体、ならびに補体取り込み能を有し二次抗体に特異
的に反応する三次抗体を使用することを特徴とする上記
（１）記載の免疫測定法。

（３）Ｆｃ部位を除去した一次抗体と、当該一次抗体と
同一抗体ではあるがＦｃ部位を除去していない二次抗体
およびＦｃ部位に特異的に反応する三次抗体を用いるこ
とを特徴とする上記（２）記載の免疫測定法。

（４）同一動物種由来のサブクラスを異にする一次抗体
および二次抗体ならびにサブクラス特異的に二次抗体に
反応する三次抗体を用いる上記（２）記載の免疫測定法
。

（５）由来する動物種を異にする一次抗体と二次抗体、
および二次抗体に特異的に反応する三次抗体を用いるこ
とを特徴とする上記（２）記載の免疫測定法。

（６）二次抗体と二次抗体特異的な三次抗体とをあらか
しめ反応させた免疫複合体を使用することを特徴とする
上記（２）記載の免疫測定法。

（７）　　二次抗体と三次抗体とを三次抗体の補体取り
込み能を…なわぬ条件で化学結合させた複合体を使用す
ることを特徴とする上記（２）記載の免疫測定法。

（８）マイクロカプセルがリポソームであることを特徴
とする上記（１）記載の免疫測定法。

本発明によれば、二次抗体を作用させると同時に、ある
いは一定時間経過後に三次抗体を作用させるものであり
、これによって二次抗体に起因する上記した種々の問題
点を解決することが出来る。

なお、二次抗体の添加は、補体添加前または補体添加と
同時である。

本発明で使用されるマイクロカプセルには特に制限はな
く、免疫測定法に使用するマイクロカプセルならば、補
体活性により溶解作用を受ける膜からなるものであれば
よい、好適にはヒト赤血球（特に、０型寿命球）やリポ
ソーム（特開昭６１−９９８６７号）が好適なものとし
てあげられる。

当該リポソームは、本発明の目的を達成しえる限り特に
制限はな（、たとえばリン脂質〔たとえば、レシチン（
ホスファチジルコリン）、ホスファチジルエタノールア
ミン、ホスファチジルイノシラトール、ホスファチジル
セリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸等が例
示される〕よりなるもの、リン脂質にさらに官能基脂質
、たとえばジチオスレイトール−ジパルミトイルホスフ
ァチジルエタノールアミン、Ｎ−［４−（ｐ−マレイミ
ドフェニル）ブチリルツージパルミトイルホスファチジ
ルエタノールアミン等、必要に応じて更にＩｌｌ、たと
えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチ
ン等を添加したもの等が例示され、その構造にも特に制
限はなく、たとえばマルチラメラベシクル（ＭＬＶ）、
スモールユニラメラヘシクル、ラージユニラメラベシク
ル、リバースフェーズエバボレーシジンベシクル等が例
示される。　マイクロカプセル内部に包含される定量可
能なマーカー物質としては、マーカー機能を有し、かつ
本発明の目的を達成し得るものであれば特に制限はなく
、たとえばカルポキシフルオレイセン（ＣＦ）のような
蛍光化合物、ルミノールやルシフェリンの様な発光性化
合物、特異的吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素
）等が好適に用いられる。

マイクロカプセルに感作させる抗体または抗原は被検目
的物（被検抗原または抗体）に応じて適宜選択される。

たとえば、ＡＦＰ（α−フェトプロティン）、がん胎児
性抗原（ＣＥＡ）　、β２ミクログロビン、カルボハイ
ドレート・アンチゲン１９−９　（ＣＡＩ　９−９）等
の各種癌抗原、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、Ａｎｔｉ　　
ＨＢｓ、ヒユーマン・Ｔセル・ロイケミア・ウィルス−
Ｉ型（ＨＴＬＶ−１）、ヒユーマン・Ｔセル・ロイケミ
ア・ウィルス−■型（ＨＴＬＶ−Ｉ［［）等のウィルス
関連の抗原抗体、更には血中の各種ホルモンやＩｇＧ等
の血漿タンパク質が好適に例示される。

抗体は動物への免疫、モノクローナル抗体の通常技術〔
「免疫学実験入門」、３５頁、（学会出版センター、昭
和５６年発行）、［モノクローナル抗体」、口Ｌ　（講
談社、昭和６１年発行）等参照］等によって製造される
。また、抗体はそのまま結合させてもよく、また抗原認
識部位を含む断片〔たとえば、Ｆａ　ｂ、Ｆａ　ｂ’　
、Ｆ（ａ　ｂ’Ｌ）であってもよい。

抗体または抗原のマイクロカプセルへの結合（感作）は
公知の方法に従って行えばよい。たとえば、Ｌｅｓｅｒ
ｍａｎ等の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２８８　６０４〜６
０６．１９８０）、Ｍａｒｔｉｎ等の方法（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、、　ｆｊｌ、４２２９〜４２３８．１
９８１）により行われる。

本発明において、抗原または抗体をマイクロカプセルに
結合させる際、架橋剤を使用することが好ましい。架橋
剤としては公知のもの、たとえばＮ−サクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ
）、Ｎ−ＣＴ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイ
ミド、グルタルアルデヒド等が使用される。

一次抗体、二次抗体ならびに三次抗体の関係は以下のよ
うになる。

一次抗体と二次抗体とは同一抗原を認識する。

また、マイクロカプセルに結合される抗原と二次抗体と
は同一抗体を認識する。Ｆｃ部位を除去した一次抗体と
同一抗体だがＦｃ部位を除去していない二次抗体との組
合せ、同一動物種由来のサブクラスを異にする一次抗体
と二次抗体との組合せ、由来する動物種を異にする一次
抗体と二次抗体との組合せなどが好ましい。

一方、三次抗体は補体取り込み能を有し、二次抗体に特
異的に反応する必要がある。

具体的な組合せとしては、 （１）Ｆｃ部位を除去した一次抗体と、当該一次抗体と
同一抗体ではあるがＦｃ部位を除去していない二次抗体
およびＦｃ部位に特異的に反応する三次抗体の組み合わ
せ。

（２）同一動物種由来のサブクラスを異にする一次抗体
と二次抗体、およびサブクラス特異的に二次抗体に反応
する三次抗体の組み合わせ。

（３）由来する動物種を異にする一次抗体と二次抗体、
および二次抗体に特異的に反応する三次抗体の組み合わ
せ。

等があげられる。

本発明で使用される三次抗体は、一次抗体（マイクロカ
プセルに結合している抗体）、二次抗体の組合せに応じ
て適宜選択される。この組合せの代表例を表１に示すが
、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

表中、（１）の場合、抗原が多価であると一次抗体と二
次抗体とは同一のモノクローナル抗体でよいが、抗原が
多価ではない場合は認識するエピトープの異なる２種の
モノクローナル抗体を用いることになる。表中、（２）
、（３）の場合、一次抗体および二次抗体には、多価抗
原の場合同一エピトープを、そうでない場合異なるエピ
ト−プを認識する抗体を使用する。このうち（３）では
三次抗体はラットＩｇＧ全体のどの部分を認識するもの
でもよいため（１）、（２）と比べ反応性が高い。

三次抗体は二次抗体と同時、あるいは二次抗体を添加し
た後一定時間（好ましくは１０分間）経過後に作用させ
る。二次抗体と三次抗体とを同時に添加する場合、これ
らはあらかじめ混合しく理想的には１：１の割合）、免
疫複合体としたものを用いてもよい、また、三次抗体の
補体取り込み能を損なわない条件で二次抗体と三次抗体
とを化学結合させておいてもよく、この場合三次抗体の
条件としては特異的に二次抗体と反応しなくとも補体取
り込み能を有しているだけでよい。

〔効果］ 本発明の免疫測定法によれば一種類のポリクローナル抗
体を用意すればよいので免疫学的測定操作が面側であり
、試薬の品質維持も容易である。

また、抗原特異的なポリクローナル抗体の調製が困難な
ものにも適用できる。

〔実施例〕

実施例Ｉ　　ＡＦＰの測定 （１）ＡＦＰ測定用抗体感作リポソームの調製１里林料 次のものを使用した。

ＤＰＰＥ　（ジパルミトイルホスファチジルエタノール
アミン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコ
リン）、ＤＴＰ−ＤＰＰＥ　（ジチオピリジルプロピオ
ン酸アミド−ＤＰＰＢ、ＣＨＯＬ（コレステロール）、
ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、５ＰＤＰ　（Ｎ−サク
シンイミジル３−（２ピリジルジチオ）プロピオネート
）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ハイドロキシエチ
ルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液、
ｐＨ７，４）、ＣＦ（カルボキシフルオレセイン）、Ｑ
ＶＢ−（ゼラチンベロナール緩衝液、Ｃａ、Ｍｇ不含）
、ＧＶＢ″３（ゼラチンベロナール緩衝液、Ｃａ、Ｍｇ
含）、ＥＤＴＡ−ＧＶＢ−（ＥＤＴＡ加ゼラチンベロナ
ール緩衝液、Ｃａ、Ｍｇ不含）ＭＬヱ夏且裂 リポソームの脂質組成は次のようにした。即ち、ＤＰＰ
Ｃ：　ＣＨＯＬ　：　ＤＴＰ−ＤＰＰＥのモル比をｉ：
ｔ：ｏ、ｏｔｓｃモル比）とした。用いた脂質量はＤＰ
ＰＣが８μｍｏｌ　、ＣＨＯＬが８μｌ１ｏｌ、ＤＴＰ
−ＤＰＰＥが０．１２　μ１ｌｏｌである。２５ｍ１容
の梨型フラスコに脂質混合１（溶媒クロロホルム）を入
れ、ロータリーエバポレーターで溶媒をとばして薄膜を
作った後、デシケータ−に入れて、真空ポンプで１時間
吸引した。次に、梨型フラスコに０．１　ＭのＣＦ　（
ｐＨ７，４）を０．５ｍｌ注いでＶｏｒｔｅｘミキサー
で１０分間激しく撹拌した。懸濁液を小分は後遠心管に
移し、ＨＢＳを５ｍｌ加えて１５０００ｒｐｍで１０分
間遠心し１μｍｏｌを含むリポソームベレットを作った
。

財ｌｈｋ住 抗体は抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体をＦ（ａ
ｂ’）、化したもの（ＯＤ＝１０．０）を用いた。リポ
ソームペレットを３０ｍＭのＤＴＴ入りのＨＢＳ２ｍｌ
で懸濁し１．３７°Ｃの恒温水槽中で１時間加温した。

しかる後懸濁液を遠心管に移し、５ｍｌのＨＢＳを加え
て１５０００　ｒ　ｐ　ｍで１０分間遠心した。この洗
浄操作を６回行った。Ｆ（ａｂ’）□１５０μ２に５Ｐ
ＤＰをモル比が１となるように加え、室温で３０分間静
置後、ＨＢＳで平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマ
シア社製）でゲル濾過した。蛍白のピーク画分０．５ｍ
ｌで還元済みのリポソームベレットを懸濁した。室温゛
で転倒撹拌を４０時間行い抗体感作リポソームを得た。

抗体感作リポソームの保存は０．０５％ＮａＮ、加ＧＶ
Ｂ−中で行った。

（２）血清ベースの反応 所定量のＡＦＰを添加した１０倍希釈正常ヒトブール血
清を検体とした。この血清はＧＶＢ−で希釈し６３°Ｃ
１５分間加熱処理したものである。

測定方法は次の通りである。

検体１０ｕＩ！と抗ＡＦＰマウスモノクローナル抗体怒
作リポソーム１０μ２および異なるエピトープをＦ２す
る抗ＡＦＰマウスモノクローナル抗体（サブタイプ’ｇ
Ｇｔｂ）１０μ２を混合し３７°Ｃ３１０分間反応させ
た０次に三次抗体として抗マウスＩｇＧｚｂポリクロー
ナルヤギ抗体２５μｌ、およびｌ０ｃＨ，。／１とした
モルモット補体２５μｌを加え、３７°Ｃ１３０分間反
応させた。最後にＥＤＴＡ−ＧＶＢ−溶液１００μｌを
加え反応を停止させた後、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波
長５３０　ｎｍで蛍光強度を測定した０モルモット補体
の代わりにエタノールを加えリポソームを完全溶解させ
た場合の蛍光強度を１００％として各々の溶解程度をパ
ーセントに換算した。その結果を第１図に示した。当該
結果から明らかなように本発明によって高い応答性が得
られた。

実施例２　　ＨＢｓＡｇの測定 （１）ＨＢｓＡｇ測定用抗体感作リポソームの調製実施
例１のＡＦＰ測定用抗体感作リポソームの調製と同様に
して調製した。リポソームへの怒作抗体としては、Ｆ（
ａｂ’）ｚ化抗ヒトＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗
体（ＯＤ＝１０．０）を用いた。

（２）血清ベースの反応 所定量のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを添加した１０倍希釈正常ヒ
トプール血清を検体とした。この血清はＧＶＢ−で希釈
し、６３°Ｃ１５分間加熱処理したものである。測定方
法は次の通りである。

検体１０μ２と抗ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇモノクローナル抗体
感作リポソーム１０μρおよびリポソームの抗体感作に
用いたものと同じ抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体１０
μ２を混合し３７゛Ｃ２１０分間反応させた０次に三次
抗体として抗マウスＦｃポリクローナルウサギ抗体２５
μ！、および１２ＣＨ，。７ｍ１としたモルモット補体
２５μ２を加え、３７°Ｃ１３０分間反応させた。最後
にＥＤＴＡ−ＧＶＢ溶液１００μ２を加え反応を停止さ
せた後、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５３０　ｎ　ｍ
で蛍光強度を測定した。モルモット補体の代わりにエタ
ノールを加えリポソームを完全溶解させた場合の蛍光強
度を１００％として各々の溶解程度をパーセントに換算
した。その結果を第２図に示した。ＨＢｓＡｇは多価抗
原なので一種類のモノクローナル抗体と汎用性のあるウ
サギポリクローナル抗体の組合せで、高い応答性が得ら
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法を用いた場合のＡＦＰに対する
反応曲線を示す。 第２図は、本発明の方法を用いた場合のＨＢｓＡｇに対
する反応曲線を示す。 ＲＦＰ（ｎｇ／ｒｎｌ） 第１図 一次抗体、二次抗体とともに三次抗体を使用した場合の
ＡＦＰに対する反応曲線０１−ＩＢｓＡ　（ｎｃｙｍＬ
） 第２図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 同一抗原または抗体を認識する２種類の抗体または抗原
   の内の一方の抗体（一次抗体）または抗原を結合させた
   マイクロカプセルに検体中の抗原または抗体を反応させ
   、次に他方の抗体（二次抗体）の添加時あるいは添加後
   、更に抗体（三次抗体）および補体を添加して該マイク
   ロカプセルを破壊し、該マイクロカプセル内に包含され
   ているマーカー物質を溶出せしめ、該物質を測定するこ
   とを特徴とする免疫測定法。