JPS61250558A - 免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は、試料中に存在する微量の被検物質を特異的に
定量分析するリポソーム免疫分析用試薬を用いた免疫分
析方法に関する。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

近年、ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の
腫瘍マーカーが見出されるようになった。

例えばα−フェトプロティン（ＡＦＰ）　、ガン胎児性
抗原（Ｃ１）、塩基性フェトプロティン（ＲＦＰ　）お
よび膵ガン胎児性抗原ＣＰＯＡ）などがその代表例とし
て挙げることができる。これらの＠瘍マーカーの濃度は
正常人の場合、非常に低い（例えば、Ｃ瓢の場合二数ｎ
ｇ／ｍｌ以下）。一方、腫瘍患者の場合には正常人のｌ
Ｏ倍程度以上の値を示すことが多い。いずれにしても、
腫瘍マーカーの分析定食には、非常に高い検出感度が要
求される。

この要求を満すために、従来は、放射性物質で標識化し
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（ＲＩＡ）
が開発された。しかしながら、　ＲＩＡは取扱いが面倒
で廃棄処理も問題になる。そこで、放射性物質の代シに
酵素や螢光物質など種々の物質で標識化した抗原あるい
は抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これらに
おいても遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しな
ければならないという欠点を有していた。また、　Ｒｏ
ｓｅｎｔ−ｔｈａｌ　Ａ＠Ｆ、　Ｖａｒｇａｓ、　Ｍ、
Ｇ、　ａｎｄ　ｂｉａｓｓ　Ｃ，Ｓ、　（１９７６）Ｃ
Ｉｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　２２　、１８９９に発表された
ＥＭＩＴ法は。

分離工程の不要な均−系で測定できる画期的な手法であ
るが、原理的に高分子量のタンパク質抗原Ｓ、Ｃ９（１
９６８）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６１３００で、
脂溶性の抗原を膜内に取り込みグルコースを封入したリ
ポソームを調製し、抗原抗体反応によるリポソームの破
壊に伴うグルコースの流出数を測定することにより、抗
体の定量を行う手法が発表された。

しかしながら、腫瘍マーカーを測定するためには、マー
カー自身あるいはこれらのマーカーに対する抗体、すな
わちタンパク質である免疫グロブリンをリポソーム上に
担持させねばならない。ところが、現在まで、脂溶性の
タンパク質を担持したリポソームを用いることは可能で
あったが、親与 水性のタンパク質を担持したリボソーを用いる抗原また
は抗体の免疫分析法は報告されていない。

それは、親水性のタンパク質をリポソームに担持せしめ
る技術が確立されていなかったからである。

また、特開昭５６−１３２５６４号１免疫分析用生成物
および方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内
部に酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う
方法が開示されているが、そこでは、タンパク質の担持
方法としてグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を
用いる方法を提案している。本発明者らの研究によると
、このような架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると
、一般に抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うリポ
ソームの破壊が引起されなくなることが判明した。

更に、従来の免疫分析技術は、総じて、分析に長時間を
要し、しかも大量の試料を自動的に測定することができ
ないという欠点を有していた。

〔発明の目的〕

本発明は、試料中の微量な被検物質を高精度及び高感度
に分析するための免疫分析方法を提供することを目的と
する。

〔発明の概要〕

本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究を重ね
た結果、補体活性により溶解作用を受けるリポソーム上
に活性を低下させることなく被検物質に対する抗体の少
なくとも一部を固定化し。

さらにリポソーム内に標識物質を封入してなるリポソー
ム免疫分析用試薬を、予め一定時間、被検物質を含む試
料と反応させ、その後に被検物質に対する第２抗体及び
補体を作用させることにより本発明の目的が達成できる
ことを見出した。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明の免疫分析方法に用いるリポソーム免疫分析用試
薬におけるリポソームは、リン脂質及び糖脂質の少なく
とも一方とコレステロールとから構成される。これらの
構成比としてはリン脂質及び糖脂質に対してコレステロ
ールが１０〜５００モルチ含まれることが安定なリポソ
ームを得る上で好ましい。そして、リン脂質中の脂肪酸
残基は。

炭素原子数が１２〜１８であることが好ましく、更には
偶数であることがより好ましい。

リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により螢光は示さないが、低濃度（１０−３
Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシフルオレ
セインのような嘩光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフェリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグルコース及びシェークロースなどの糖類；テトラペ
ンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）
のような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラジ
カル化合物などが望ましい。これらの化合物は、検出方
法、感度及びリポソームの安定性等の因子を勘案した上
で、適宜に選択される。

本発明の免疫分析方法に用いられるリポソーム免疫分析
用試薬は、このようなリポソーム及び標識物質から例え
ば次の如き方法で製造される。まず、所望の脂質と架橋
剤とを溶媒中で反応させることにより、リポソーム上に
固定化される抗体あるいは抗体の一部と結合し得る官能
基を脂質分子に導入して官能性脂質とする。次いで、得
られた官能性脂質とコレストロール及び必要であれば他
の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解・
混合させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後
、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質
の水溶液を加え、密栓をして振とうし、リポソームの懸
濁液を得る。

一方、リポソームに固定化される抗体あるいは抗体の一
部は必要ならば架橋剤によシ架橋基を導入した後、還元
剤（例えばジチオトレイトφ；ＤＴ′Ｔ′）で処理して
修飾する。これら、リポソーム懸濁液と必要に応じて修
飾された抗体あるいは抗体の一部とを適当な緩衝液中で
反応せしめることにより、本発明の免疫分析法に用いる
リポソーム免疫分析用試薬が得られる。

上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−サク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−
ト　（ＳＰＤＰ）　、　Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ
−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＨ）％Ｎ−
サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセ
テート（ＳＭＰＡ）　、　Ｎ−サクシンイミジル４−（
ｐ−マレイミドフェニル）グロビオネート（ＳＭＰＰ）
　、Ｎ　−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシン
イミド（ＧＭＢＳ）　、　Ｎ　−（ε−マレイミドカブ
ｑイ］ルオキシ）サクシンイミド（ＥＭＣＳ）及びジサ
クシンイミジルスペレー）　（ＤＳＳ）が挙げられる。

例えば、５ＰＤＰは１次式： で示され、温和な条件下で反応して、第一アミノ基を有
する化合物どうしを結合する架橋剤である。

ＳＭＰＢは、次式： で示され％５ＰＤＰと同様な反応で抗体を固定化できる
が、最終生成物中に−５−８−結合を含ます（−８−結
合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定である。

本発明の免疫分析方法に用いる補体は格別限定されない
が５通常補体価の高いモルモット血清が好ましい。しか
し場合に応じてウサギ、マウス。

ヒト等の血清を使用してもよい。

また本発明で用いられる被検物質に対する第２抗体の動
物種は、特に限定されないが、補体を取り込み易いウサ
ギがより好ましいが、この第２抗体は補体結合部位を有
した形状でなければならない。一方、リポソーム上に固
定化される抗体は、酵素処理で補体結合部位を除去した
場合にはその抗体の動物種は特に限定されないが、除去
しない場合にはモルモット補体に対して安定なりギの抗
体が望ましい。

このようにして得られたリポソーム免疫分析用試薬を用
いて行なう本発明による免疫分析方法で定量が可能な被
検物質は、膿瘍マーカー（前述のＭ学、ＢＦＰ　、ＣＦ
Ａ、及びＰＯＡ等）免疫グロブリン（■鮎。

きる被検物質であって、その対象台床範囲に亘る。

これらの被検物質は、以下のような過程で定量分析が行
われる。

望 まず、被検物質が適壷希釈されて試料とされる。

この試料にリポソーム免疫分析用試薬を加えるととによ
り、被検物質に対する抗体の少なくとも一部分が固定化
された前記リポソーム免疫分析用試薬とさらに別に加え
られた被検物質に対する第２抗体とで被検物質が挾みこ
まれ、そこに補体が作用することで、リポソーム免疫分
析用試薬内に封入されていた標識物質が遊出する。この
標識物質の遊出は、被検物質の濃度に対応して生起する
ため、遊出した標識物質を測定することにより被検物質
の定量分析を行なうことができる。

そして実際の定量分析においては、あらかじめ既知の濃
度の被検物質を用いて検量線を作製しておき、これをも
とにして同じ条件で未知の濃度の憚１ 被検物質との反応によシ流出した標識物質を偏走して、
定量分析を行なう。

本発明者らは、このような分析過程において、あらかじ
めリポソーム免疫分析用試薬を充分に被検物質と反応さ
せた後に、第２抗体及び補体を加えることで分析用試薬
としての感度が飛躍的に数百倍も向上することを見出し
たＱでおる。

これより、リポソーム免疫分析用試薬と被検物質との反
応を充分に進行させないままで、！２２抗及び補体をリ
ポソーム免疫分析用試薬とほぼ同時に加えることにより
、標識物質を流出させて定量する方法では不可能であり
た微量な被検物質の検出定量が、本発明の分析方法によ
りはじめて可能になった。このリポソーム免疫分析用試
薬と被検物質との充分な反応に要する時間は、それぞれ
濃度被検物質の種類、リポソームの特性１反応条件、さ
らにはリポソーム免疫分析用試薬に固定化された抗体の
種類、純度、固定化形態等によって異なる。よって、個
々の場合に応じてあらかじめ特定の濃度に調製された被
検物質と同糧の物質を含む試料を用いて予備測定を行な
うことにより、リポソーム免疫分析用試薬と被検物質と
の最適反応時間等は適宜規定される。

〔発明の実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例１゜ 化したリポソーム免疫分析用試薬を用いたヒトエ囮の測
定を行なった。

まずヤギ抗−ヒ）ＩｇＧ抗体固定化リポソーム免疫分析
用試薬の調製をした。この時に用いた試薬はジパルミト
イルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロー
ル、シハルミトイルホスファチジルエタノールアミン（
ＤＰＰＥ）およびジチオトレイトール（ＤＴｒ）がシグ
マ社製であり、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオネート（５ＰＤＰ　）およびセファ
デックスＧ−２５フアインはファルマシア社製でｂった
。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに使用した。な
お、水は全てイオン交換水を用いた。

そして以下に示す工程により、リポソーム免疫分析用試
薬の調製を行なった。

ａ）ジチオピリジル−ＤＰＰＥ（ＤＴＰ−ＤＰＰＦ：Ｊ
）の調製密栓付三角フラスコに７０ｍｇのＤＰＰＥを分
取し、２５ｍ１のクロロホルム暑メタノール（５：１）
溶液に溶解し、６０μｌのトリエタノールアミン及（Ｊ
　５０ｍｇした。乾燥物を５ｍｌのクロロホルム／メタ
ノール（１０：１）に溶解させ、シリカゲルカラムを用
いて精製した。生成物画分を回収し、エバポレーターで
約５ｍｌまで濃縮した。収率は８０〜９５％であった。

保存は窒素封入下−２０℃で行った。

ｂ）リポソームの１Ｉｌｌ製 使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１　）に溶解した。まず。

５ｍＭＤＰＰＣ（２００ｐｇ　）、１０１ＴＬＭ　：２
レスチロール（１００μ／）及び１ｍＭ　ＤＴＰ−ＤＰ
ＰＥ（５０，ｇｌ）を１０ｍ１のナシ型フラスコに入れ
、更に２ｍｌのクロロホルムを加えて良く混合した。水
浴中（約５０℃）でロータリーエバポレーターによシ溶
媒を除去した。再び２ｍｌのクロロホルムを添加し、充
分攪拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒を
蒸発させた。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面
に薄膜が形成された。フラスコをデシケータ−中に移し
真空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。

次に、１００μｊの０．２　Ｍカルボキシフルオレセイ
ン（ＣＦ　；イーストマン・コダック社製、　ｐＨ７，
４）を添加し、フラスコ内部を窒素で置換した後に密栓
して、６０℃程度の水浴中に約１分間浸漬した。続いて
、　Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、壁面の脂質薄膜が完
全に消失するまでフラスコを激しく振とうした。この操
作により、リポソ４“ −ム懸濁液を調製された。ゼラチン−ベロナール緩衝液
（以下、ＧＶＢ−と略記）を少量添加し、リポソーム懸
濁液を完全に遠心チコープに移した。４’０　、１５．
ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心し、遊離のＣＦを除去した
。上清が透明になるまでＧＶＩｌｒを用いての操作を繰
り返した。最後に２ｍｌのＧＶＥ−及び５ｐｇの１０　
％　ＮａＮ３を加え、　Ｖｏｒｔｅｘミキサーで懸濁さ
せ、窒素封入後、冷蔵庫に保存した。

Ｃ）ヤギ抗−ヒトエｍｌ抗体の修飾 ２ｍｌのヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（約１５ｍｇ／ｍｌ）
に１０　ｐｉの１０ｍＭ　５ＰＤＰ　（エタノール溶液
）を加え、十分攪拌してそのまま室温で３０分間反応さ
せた。反応後１反応液を予め生理食塩水で飽和させたセ
ファデックスＧ−２５フアインのゲルを充填し九カラム
（ゲル体積：約１５ｍ１）に展開し、０．１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４，５、０，８５％　ＮａＣ１含有）溶出させ
た。最初のタンパク質７ラク７１ン（約２ｍ１）に更に
２ｍｌの酢酸緩衝液を加え、窒素置換後ジチオトレイト
ール（約３０ｍｇ）を添加した。充分に攪拌して２０分
間室温で反応させた。反応後、予め０．ＯＩ　Ｍ　ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液で飽和させたセファデックスＧ−２５フア
インのゲルを充填しであるカラム（ゲル体積：約３０ｍ
Ａりに反応液を展開し、前記ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出し
た。最初のタンパク質フラクション（約２ｍ１）を集め
、窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存した。

ｄ）ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体固定化すボンーム（免疫分
析用試薬）の調製 前述のようにして調製したリポソーム懸濁液と等量の修
飾抗体を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆっく抄振
とうじながら１晩反応させた。その後前記ＨＥＰＥＳ緩
衝液、次いでＧＶＢ−で洗浄して、未反応の抗体および
漏出したＣＦを除去した。こうして調製したヤギ抗−ヒ
トＩｇＧ抗体固定化すボノーム免疫分析用試薬に反応に
用いたリポソーム懸濁液の量に相当するＧＶＢ−および
１０μｌの１０１ＮａＮ３を添加し、懸濁・窒素置換後
、使用するまで冷蔵庫中に保存した。

このようにして調製したヤギ抗−ヒ）ＩｇＧ抗体固定化
リポソーム免疫分析用試薬を用いて以下のようにしてヒ
トＩｇＧの測定を行なった。

あらかじめ既知の濃度となるように適当量のＧＶＢ”　
（０，１ｍＭ　ｎｇｃｌ　２及び０．０３ｍＭ　ＣａＣ
ｌ２を含有したＧＶＢ　）で希釈したヒトＩｇＧを試料
とし、これを２５μＩｆつＵ型マイクロプレート（９６
穴：ヌンク社製）のｗｅ　１１に注入した。次いで、上
記の方法で調製したヤギ抗−ヒトエ鉛抗体固定化すポソ
ーム免疫分析用試薬を前記試料に５μｊずつ注入し３７
℃で３０分間接触反応させた。その後第２抗体としてウ
サギ抗−ヒトＩｇＧ抗体ＣＭｉ　ｌｅ　ｓ社製；４００
倍希釈）及び補体としてモルモット血清（０，５ＣＨ５
０）を各々２５　ｐｇずつ添加し３７℃で１時間作用さ
せた。

反応後、各ｗｅｌｌにＺｏｏμＪの０．ＯＩ　Ｍ　ＥＤ
ＴＡ−ベロナール緩衝液を加えて反応を停止し、プレー
ト用螢光分光光度計（コロナ電子社製、　ＭＴＰ−１２
Ｆ）で各ｗｅｌｌの螢光を測定した（ＥＸ：　４９０ｎ
ｍ、Ｅｍ：　５２０ｎｒｒ１）、なお、測定値は、第２
抗体及び補体の代わりにｌ　Ｏ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０及びＧＶＢ−を２５ａｌ及び５０μｌずり添加したｗ
ｅ　１１の螢光と、ヒ）ＩｇＧ。

代わりに２５μｌのＧＶＢ＋を添加したものの差を１０
０チとした相対遊出率で表示した。

結果を第１図の曲線ａに示す。図かられかるように１０
−３乃至１０−８（ｇ／ｍｌ　）の濃度範囲で標識物質
の遊出が認められた。そしてこの中で１０−６乃至１０
　　（ｇ／ｍｌの濃度範囲で特性を示した線を検量線と
して用いることにより、このような微量な範囲内での未
知の濃度の試料の定量分析が行なえることがわかる。す
なわち本発明の免疫分析方法は従来の分析方法と比較し
て非常な高感度化をはかることができた。

比較例　１ 実施例１と同様にして、あらかじめ既知の濃度となるよ
うに適当量の壷＋で希釈したヒトＩｇＧを試料とし、こ
れを２５μｌずつＵ凰マイクロプレートのｗｅｌｌに注
入した。

次いで実施例１で用いたのと同じ方法で調製したヤギ抗
ヒ）ＩｇＧ抗体固定化リポソーム免疫分析用試薬（ω１
で１００倍に希釈）を５μｊ１及び第２抗体であるウサ
ギ抗−ヒ）　ＩｇＧ抗体ＣＭｉｌｅｓ社製；　４００倍
希釈）を２５μｌ％さらに補体（モルモット血清；　０
．５　ＣＨ５０　）を２５μｌ５分間ですべて添加した
。反応は３７℃に保った中で１．５時間行なった。その
後実施例１と同様な処理を施し、同じ方法で相対遊出率
を測定した。結果を第１図の曲線すに示した１図かられ
かるようにおよそ１０　　乃至１０　　（ｇ／ｒｎ／）
の範囲で遊出が認められたが、実施例１の場合と比較す
ると定量できる濃度が１０−５乃至１０　程度とよし高
濃度側であり、測定可能な範囲もせまく、実施例１で示
したような低濃度における検出すなわち高感度性を有し
ていなかった。

実施例　２ 試料に１０−７　ｇ／ｍｌの濃度のヒトエｍｌを用いて
、実施例１では３０分間であった。第２抗体及び補体を
添加する前のリポソーム免疫分析用試薬と試料中の被検
物質との接触反応時間を増減して、その影響を調べた。

この時の反応温度は３７℃に保った。また反応後には、
第２抗体及び補体を添加し３７℃で１時間反応させた後
、実施例１と同様に処理して流出した標識物質の測定を
行なった。その結果を第２図に示す。図かられかるよう
に、１０−７ｇ／ｍｌという同一の被検物質濃度を有し
た試料の場合でも、第２抗体及び補体を添加する前の試
料とリポソーム免疫分析用試薬との反応時間の長短によ
シ標識物質の相対遊出率には非常な差が生じる。すなわ
ち被検物質を含有した試料にリポソーム免疫分析試薬及
び第２抗体と補体とを同時に加えた場合の相対遊出率が
およそ３％程度であるのに対して被検物質とリポソーム
免疫分析用試薬だけをあらかじめ接触反応させその後に
補体及び第２抗体を作用させた場合に、その被検物質と
リポソーム免疫分析用試薬との反応時間を１５分程度以
上とればおよそ２０倍近くの標識物質の流出が得られ、
これより大幅な精度の向上が得られる。

もちろん本実施例の場合においてリポソーム免疫分析用
試薬と被検物質との間での充分な反応に必要な時間がお
よそ１５分間だったのであり、被検物質の種類や用いる
リポソーム免疫分析用試薬の特性等によってこの時間は
適宜選択される。

実施例　３ 補体結合部位を除去することにより部分化したウサギ抗
−ヒ）　ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’）を固定化したリポソー
ム免疫分析用試薬を用いてヒ）　ＣＥＡの測定を行なっ
た。

（ａ）従来法（免疫実験操作法ｐＨ６６，１９７４）に
基いて、ウサギ抗−ヒ）　ＣＥＡ抗体ＣＤａｋｏ社製）
の補体結合部位をペプシン処理で除去することにより抗
体のＦ（ａｂ’）２を調製した。濃度は約２ｍｇ／ｍｌ
でめった。このＦ（ａｂ勺２を２ｍｌとりさらに２−メ
ルカグトエチルアミンを１０ｍｇ加えて、窒素雰囲気下
で３７℃に保ちながら９０分間反応させた。

反応後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ｆｉｎｅ　（ファ
ルマシア社製）カラムを用イテ０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ
緩衝液（ｐＨ７，４５）で溶出させて抗体のＦａｂ　’
を得た。この抗体のＦａｂ’約１００μｇを実施例１と
同様に調製したリポソーム懸濁液１ｍｌに混合し、１晩
室温で振とうすることにより部分化されたウサギ抗−ヒ
）　ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ勺を固定化したリポソーム免疫
分析用試薬を得た。

（ｂ）ヒトＣ以の測定 （ａ）で調製したリポソーム免疫分析用試薬を用いて、
実施例１で示したのと同様の方法でヒ）　ＣＥＡを測定
した。すなわち、あらかじめ既知の濃度となるように適
当量のＧＶＢ＋で希釈したヒトＣＥＡを試料とし、これ
を２５μｌずりＵ型マイクロプレートのｗｅｌｌに注入
した。次いで、上記部分化されたウサギ抗−ヒ）　ＣＥ
Ａ抗体（Ｆｉｂりを固定化したリポソーム免疫分析用試
薬をＧＶＢ＋で１００倍希釈して、前記試料に５μｌず
つ注入し３７℃で３０分間反応させた。その後第２抗体
としてウサギ−抗ヒ）　ＣＥＡ抗体ＣＤａｋｏ社製；　
１００倍希釈）及び補体としてモルモット血清（０，５
ＣＨ５０　）を各々２５μノずつ添加し、３７°Ｃで１
時間反応させた。反応後、実施例１と同様にして標識物
質であるカルボキシフルオレセインの相対遊出率を測定
した。結果を第３図に示す。図に明らかななうに、０．
１〜２０　ｎｇ／ｍｌの範囲でヒ）　ＣＩＡの定量が可
能なことが確認された。

〔発明の効果〕

本発明に係る免疫分析では、まず被検物質を含んだ試料
とリポソーム免疫分析用試薬とを充分に反応させた後に
、ざらに被検物質に対する第２抗体及び補体を作用させ
ることで、被検物質の定量における精度、感度を大幅に
向上できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の免疫分析方法における被検物質濃度
と標識物質の相対遊出率との関係（曲線ａ）及び本発明
の免疫分析方法によらない場合における被検物質濃度と
標識物質の相対遊出率との関係（曲線ｂ）を表した特性
図、第２図は、被検物質とリポソーム免疫分析用試薬と
の反応時間に対する標識物質の相対遊出率の変化を表し
た特性図、第３図は１本発明の免疫分析方法において他
のリポソーム免疫分析用試薬を用いた場合の被検物質濃
度と標識物質の相対遊出率との関係を表した特性図であ
る。 相袢遣虫牟 （呪） 第２図 〔嘔） 第８図

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とコレスト
   ロールとからなるリポソーム上に、架橋法により被検物
   質に対する抗体の少なくとも一部が固定化され、さらに
   前記リポソーム内部には親水性の標識物質が封入されて
   いるリポソーム免疫分析用試薬を、 前記被検物質を含有する試料にあらかじめ接触し反応さ
   せ、その後に被検物質に対する第２抗体及び補体を作用
   させることを特徴とする免疫分析方法。
2. （２）酵素処理により補体結合部位を除去した抗体が固
   定化されたリポソーム免疫分析用試薬を用いることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。
3. （３）第２抗体としてウサギ抗体を用いることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。
4. （４）架橋法に使用する架橋剤を、Ｎ−サクシンイミジ
   ル３−（２−ピトジルジチオ）プロピオネ−ト（ＳＰＤ
   Ｐ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
   ニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−サクシンイミジル
   ４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（ＳＭＰＡ
   ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニ
   ル）プロピオネート（ＳＭＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミ
   ドブチリルオキシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−
   （１−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（
   ＥＭＣＳ）の中より選んだことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の免疫分析方法。
5. （５）リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質に対し
   て１０〜５００モル％のコレステロールを含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。
6. （６）分析時に共に用いられる補体の活性（補体価）が
   ０．１〜１０ＣＨ＿５＿０であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。
7. （７）標識物質が螢光性化合物、発光性化合物、吸光性
   化合物、糖類、イオン性化合物、酵素、補酵素類または
   ラジカル化合物であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の免疫分析方法。